De los puntos calientes a los espacios calientes: acoplamiento fotónico-plasmónico en cascada para el análisis en profundidad basado en SERS de vesículas extracelulares pequeñas completas.

La creación de materiales capaces de sostener campos electromagnéticos (EM) intensos y espacialmente extendidos representa un desafío constante en la nanofotónica y en la ciencia de la interacción luz-materia. Las arquitecturas plasmónicas convencionales generan puntos calientes EM localizados al concentrar los campos en espacios inferiores a 15 nm, lo que produce mejoras de Raman superiores a 106 (Fig. 1A) (^[1]–^[5]). Si bien este confinamiento extremo del campo cercano permite la detección ultratrazas de moléculas individuales, restringe fundamentalmente el rango espacial de interacción y limita su aplicabilidad a objetivos a nanoescala dentro del volumen de detección efectivo (^[3], ^[6]). Esto hace que las arquitecturas convencionales sean ineficaces para sondear objetivos más grandes o estructuralmente heterogéneos, incluidos agregados de proteínas, vesículas de membrana y nanopartículas (NP) a escala de orgánulos o mayores.

Para abordar esta limitación espacial, los esfuerzos recientes se han centrado en ampliar las separaciones plasmónicas hasta 50 nm utilizando pozos cónicos de oro (Au) y plata (Ag), guías de onda cónicas y nanoestructuras de dímeros (^[7]–^[10]). Aunque estos enfoques extienden las dimensiones de los puntos calientes al redistribuir el campo EM, el aumento del tamaño de la separación debilita el acoplamiento del campo cercano, lo que reduce la intensidad del campo y limita los factores de mejora (EF) a niveles de 103 a 104, lo cual es insuficiente para una detección fiable o de alta sensibilidad (^[11]–^[13]). Más allá del ajuste plasmónico, los nanojets fotónicos, que son haces de luz estrechos y de alta intensidad generados en el lado sombreado de las microesferas dieléctricas, ofrecen una solución alternativa (^[14]–^[16]). Estos haces pueden enfocar la luz incidente en volúmenes subdifractivos con baja divergencia y mínima pérdida óptica, produciendo intensidades de campo EM locales elevadas a nivel submicrométrico. Estas estructuras de nanojet ofrecen un mecanismo alternativo para enfocar la luz incidente sin depender del confinamiento a nanoescala, pero sus capacidades de mejora de Raman siguen siendo modestas (~102), lo que inherentemente impide su uso como plataformas independientes para la detección de trazas (^[17], ^[18]).

Aquí, introducimos un mecanismo de acoplamiento de luz en cascada generalizable que acopla los modos fotónicos y plasmónicos para conectar la iluminación de campo lejano y la mejora del campo cercano localizada, y generar grandes y intensos "puntos calientes" EM que se extienden más allá de los 110 nm (Fig. 1B). El término "puntos calientes" se define como regiones EM con dimensiones laterales que superan los 100 nm y una mejora del campo de |E/E0| ≥ 5,6, lo que corresponde a una mejora de Raman de ~1000. Nuestro enfoque aprovecha una arquitectura de doble capa integrada verticalmente (DLA) en la que los nanojets fotónicos generados por una monocapa de microesferas dieléctricas se alinean para excitar las fuertes resonancias plasmónicas de superficie localizadas (LSPR) de una matriz de SiO2 recubierta de Au a nanoescala. Este mecanismo de acoplamiento en cascada produce zonas de mejora de alta intensidad y espacialmente extendidas, o puntos calientes, con dimensiones laterales >110 nm y factores de mejora analítica (AEF) >106, superando el confinamiento espacial intrínseco de los puntos calientes plasmónicos convencionales. Esto rompe eficazmente el antiguo compromiso entre el alcance espacial y la intensidad del campo. A través de simulaciones numéricas y la caracterización experimental, demostramos una amplificación de la señal de ~20 veces en comparación con las nanoestructuras de Au convencionales, lo que se logra gracias a los volúmenes de detección significativamente ampliados en nuestra plataforma DLA. Como prueba de concepto, aplicamos esta arquitectura a la detección directa, sin etiquetado, mediante dispersión Raman de superficie mejorada (SERS) de pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas de pacientes con cáncer colorrectal (CRC) con una distribución de tamaño de 80 a 200 nm, logrando una precisión de clasificación del 99,8%, superando a las plataformas SERS convencionales (8,6 veces en comparación con los puntos calientes plasmónicos convencionales. Esta estrategia de acoplamiento de luz en cascada que combina nanojets fotónicos con una matriz de nanoesferas plasmónicas para crear puntos calientes grandes e intensos dentro de la DLA es independiente de la geometría. Por lo tanto, es ajustable y adaptable a configuraciones de nanomateriales de Au o Ag adaptadas a diversas aplicaciones (fig. S2) (^[21], ^[22]). En conjunto, estos hallazgos respaldan nuestra hipótesis de que el acoplamiento fotónico-plasmónico en cascada ofrece una estrategia sólida para superar el antiguo compromiso entre la intensidad y el tamaño del punto caliente.

Caracterización de la DLA y validación de la mejora del campo EM

Para validar esto experimentalmente, fabricamos una arquitectura fotónica-plasmónica utilizando un proceso de múltiples pasos (fig. S3 y Materiales y métodos). Primero, preparamos la matriz de nanoesferas de Au plasmónicas mediante la pulverización catódica de Au sobre una matriz de nanoesferas de SiO2 preensamblada, empaquetadas estrechamente en una disposición hexagonal sobre un sustrato de silicio. Debido a la naturaleza de línea de visión del proceso de recubrimiento de Au en la pulverización catódica, la capa de Au es más gruesa en la parte superior de cada esfera de sílice y se estrecha gradualmente hacia los bordes (fig. S4). Luego, ensamblamos una monocapa de microesferas de SiO2 responsables de generar nanojets fotónicos en la parte superior de la matriz de nanoesferas de Au para permitir el acoplamiento en cascada entre los modos fotónicos y plasmónicos. La DLA representativa consta de una capa superior de 2 μm de microesferas de SiO2 ensambladas sobre una matriz de nanoesferas de SiO2 de 40 nm (refiriéndose a la posición más gruesa) recubierta de Au sobre 100 nm de NP de SiO2 (Fig. 3A y figs. S5 y S6). En particular, los espacios interparticulares entre las microesferas de SiO2 superiores son de ~350 nm, lo que permite que analitos relativamente grandes accedan a los puntos calientes entre las microesferas de SiO2 y la matriz de nanoesferas de Au subyacente para una mejora de la dispersión Raman de superficie mejorada (SERS) (recuadro de la Fig. 3A). Para optimizar los componentes de la DLA para una máxima mejora del campo EM, evaluamos sistemáticamente el campo EM y el rendimiento de SERS de estas DLA con diferentes parámetros (fig. S7). Si bien los tamaños de las esferas de SiO2 superior e inferior no muestran una tendencia consistente, la mejora de SERS aumenta con el espesor de Au hasta ~40 nm antes de disminuir, probablemente debido al aumento de la amortiguación plasmónica (fig. S8) (^[23], ^[24]). Entre todas las configuraciones probadas, la DLA mencionada anteriormente ofrece la respuesta SERS más fuerte (591 ± 17 cuentas) y se utiliza en experimentos posteriores.

Para destacar la sinergia del acoplamiento de luz en cascada fotónico-plasmónico, comparamos la mejora del rendimiento óptico y SERS utilizando 4-mercaptobencenotiol (4-MBT) en dos plataformas: (i) una matriz de oro monocapa y (ii) la plataforma DLA optimizada. El espectro de absorción experimental de la DLA exhibe un pico pronunciado a 778 nm, que coincide estrechamente con la longitud de onda de excitación (785 nm), lo que sugiere una interacción luz-materia mejorada debido al acoplamiento fotónico-plasmónico (Fig. 3B). En contraste, la matriz de oro monocapa exhibe solo un pico débil e indistinto cerca de 771 nm, lo que indica una resonancia plasmónica insignificante por sí sola. La aparición de un pico fuerte, alineado con la excitación, solo en la DLA implica que el acoplamiento entre los nanochorros fotónicos y la nano matriz de oro genera una resonancia híbrida que mejora la absorción y, en consecuencia, la mejora de SERS. Para visualizar la distribución espacial extendida de estas mejoras, realizamos un mapeo Raman de 4-MBT en un sustrato que contiene tanto regiones de DLA como de matriz de oro monocapa. La región de DLA muestra señales significativamente más fuertes, con las regiones de mejora localizada que se alinean estrechamente con las posiciones de las microesferas de SiO2 superiores (Fig. 3C-i). Cuantitativamente, la región de DLA exhibe intensidades de señal aproximadamente 22 veces mayores que la matriz de oro monocapa, lo que es consistente con su AEF estimado de ~3,5 × 106, que es >18 veces mayor que el de la matriz de oro monocapa (1,9 × 105) (Fig. 3C-ii y fig. S9A). Los resultados del mapeo Raman proporcionan evidencia directa del acoplamiento fotónico-plasmónico en cascada, por el cual los nanochorros fotónicos generados por las microesferas de SiO2 enfocan la luz de excitación en los sitios plasmónicos subyacentes para crear espacios calientes de alta intensidad. Este enfoque localizado amplifica significativamente la intensidad de excitación en la superficie plasmónica, lo que resulta en un campo cercano más fuerte y señales SERS notablemente mejoradas (^[25]). Además de proporcionar una alta intensidad de señal, la DLA exhibe una excelente reproducibilidad de la señal y homogeneidad espacial en condiciones de medición prácticas. Utilizando un objetivo de 50× [apertura numérica (NA) = 0,55], una configuración típica en aplicaciones reales, la DLA logra una desviación estándar relativa (RSD) baja del 5,2% en un área de 36 μm × 50 μm y una RSD inter-sustrato del 4,6% en 10 sustratos independientes (fig. S9, B y C). Si bien la modulación SERS periódica de las esferas de la capa superior está enmascarada en estas condiciones por el punto láser de ~1,74 μm, se vuelve observable con un objetivo de mayor NA y un tamaño de paso espectral más fino (~200 nm), lo que es consistente con la Fig. 3C. Para descartar los posibles efectos de las diferencias de altura entre la DLA y la matriz monocapa, comparamos sus respuestas SERS a diferentes profundidades de enfoque que van de -15 a +15 μm en relación con la superficie de las microesferas de SiO2 superiores (fig. S10**). La DLA supera constantemente a la matriz de oro monocapa en todas las profundidades de enfoque, lo que indica que el efecto de mejora observado refleja la eficiencia intrínseca de su arquitectura de espacio caliente en lugar de los efectos relacionados con el enfoque. En general, estos resultados demuestran la sinergia entre los nanochorros fotónicos y la resonancia plasmónica en la plataforma DLA para aumentar las señales SERS, superando a cualquiera de los componentes por sí solo.

Explorando la extensión espacial de los espacios calientes

Tras la validación del campo EM, determinamos cuantitativamente la extensión espacial de los espacios calientes EM en la DLA. Para lograr esto, adoptamos una estrategia de nanoreglas utilizando nanopartículas de polisitireno@SiO2 (PS@SiO2 NPs) de núcleo-cáscara, ya que la naturaleza subdifractiva de esta tarea excede los límites de resolución de la microscopía óptica convencional. Este enfoque está diseñado específicamente para estimar la profundidad de penetración del campo EM mejorado desde la superficie plasmónica, un parámetro esencial para aplicaciones que involucran recubrimientos dieléctricos gruesos o biomoléculas grandes. La capa de SiO2 ópticamente transparente actúa como un espaciador físico bien definido, que funciona como una regla a nanoescala al controlar con precisión la distancia entre el núcleo de PS Raman-activo y la superficie de la DLA, al tiempo que minimiza la atenuación de la señal o la interferencia dentro de la capa espaciadora (Fig. 4A) (^[26], ^[27]). Esta estrategia nos permite sondear la intensidad SERS y, por lo tanto, inferir la intensidad del campo EM local a diferentes distancias por encima de la superficie de Au.

Con este fin, sintetizamos nanoreglas PS@SiO2 con un núcleo de PS fijo de ~40 nm, que exhibe un modo de flexión de anillo fuerte y distinto a ~1001 cm−1 como un marcador SERS confiable. Los espesores de la capa de SiO2 (0, 10, 22, 35 y 65 nm) se ajustan con precisión para variar sistemáticamente la distancia núcleo-superficie (fig. S11 y Métodos). Estas nanoreglas se depositan sobre la DLA, cuyos grandes espacios intersticiales de ~350 nm son lo suficientemente anchos como para permitir que estas nanoreglas accedan a las regiones de espacio caliente para las mediciones SERS posteriores (fig. S12). Dado que la intensidad SERS es directamente proporcional a la cuarta potencia de la amplitud del campo EM (|E/E0|4), medir la intensidad SERS del núcleo de PS en diferentes espesores de la capa de sílice permite la reconstrucción de los perfiles de decaimiento EM para los espacios calientes convencionales y los espacios calientes (Materiales suplementarios) (^[20], ^[28]). Medimos las intensidades SERS de la DLA y una matriz de nanoesferas de Au monocapa a varios espesores de la capa de sílice para mapear el perfil de decaimiento EM y estimar el tamaño del punto caliente (Fig. 4B, i y ii). Para los espacios calientes, el perfil de decaimiento se deriva asumiendo una contribución fraccionaria del 50% de los espacios calientes grandes (f = 0,5) a la intensidad SERS total dentro de la DLA (Materiales suplementarios). Los datos SERS experimentales revelan que la intensidad SERS, y por lo tanto, la intensidad del campo EM, disminuye exponencialmente con el aumento del espesor de la capa de sílice en todas las plataformas. Utilizando el tamaño del punto caliente conocido (14 nm; de nuestras simulaciones numéricas) y el perfil EM establecido de los puntos calientes convencionales en la matriz de nanoesferas de Au monocapa, determinamos numéricamente el umbral del campo EM E/E0 que define el umbral del punto caliente o espacio caliente en 0,075. Aplicar este umbral al perfil EM de la DLA produce un tamaño de espacio caliente estimado de ~110 nm, aproximadamente 7,9 veces mayor que el de las plataformas plasmónicas convencionales (Fig. 4B-iii). El tamaño del espacio caliente determinado utilizando el método de la nanorrella es robusto con f = 0,5: variar f en ±40% (0,3 o 0,7) cambia el tamaño extraído en solo 2,7 y 6,8%, respectivamente, lo cual está dentro de la incertidumbre experimental (fig. S13). El tamaño del espacio caliente EM de 110 nm medido mediante el experimento de la nanorrella representa un promedio que incluye tanto los campos EM extendidos directamente debajo de las microesferas de SiO2 como los puntos calientes convencionales más pequeños ubicados fuera de su contacto inmediato. Por lo tanto, el tamaño real de los espacios calientes debajo de las microesferas es probablemente mayor que 110 nm. No obstante, este método ofrece un enfoque práctico y cuantitativo para medir las dimensiones de los puntos calientes y los espacios calientes EM, lo que confirma la presencia de espacios calientes espacialmente extendidos dentro de la DLA. Al superar la compensación tradicional entre la intensidad y el tamaño del punto caliente, estos espacios calientes intensos y expansivos hacen que la DLA sea particularmente prometedora para la detección SERS de biomoléculas grandes y heterogéneas.

DLA fotónico-plasmónica para un perfilado multiómico integral de sEV

Como prueba de concepto, demostramos que la DLA fotónico-plasmónica, con sus grandes espacios calientes intensos, permite un perfilado SERS profundo y sin etiquetas de los contenidos biomoleculares, incluidos las proteínas y los ácidos nucleicos, dentro de sEV intactos (Fig. 5A). Estos biotargets grandes son típicamente inaccesibles para los puntos calientes plasmónicos convencionales debido a su alcance espacial limitado (^[29]–^[32]). Nos centramos en los sEV derivados de pacientes con CRC y donantes sanos, dado el significado clínico de la CRC como un importante problema de salud mundial y la urgente necesidad de métodos de detección no invasivos. Estos sEV son vesículas unidas por bicapas lipídicas (típicamente de 30 a 200 nm de diámetro) cuya membrana externa está compuesta principalmente por lípidos y proteínas, mientras que su núcleo contiene ADN, ARN y proteínas citosólicas (^[33]–^[37]). El acceso a este contenido interno es fundamental para un perfilado molecular integral, ya que refleja estrechamente el estado fisiológico de las células progenitoras y respalda el diagnóstico de enfermedades basado en biopsias líquidas (^[33]–^[35]). Sin embargo, los sustratos SERS convencionales dependen de puntos calientes altamente localizados que principalmente sondean especies unidas a la superficie, lo que proporciona un acceso limitado a los biomarcadores encapsulados más profundamente dentro de los sEV. Por lo tanto, prevemos que los espacios calientes intensos y espacialmente extendidos del sistema DLA puedan permitir una amplificación de la señal no destructiva tanto de los componentes unidos a la superficie como de los internos para avanzar en el análisis sin etiquetas de sEV completos.

Para establecer nuestro conjunto de datos, aislamos sEV de 20 muestras de plasma humano (10 donantes sanos y 10 pacientes con CRC) y realizamos mediciones SERS directas en fase líquida en la DLA. Este enfoque basado en líquidos evita los artefactos asociados con el secado de la muestra, como la cristalización de la sal, que pueden dañar la estructura de la DLA, bloquear los espacios intersticiales o desprender los sEV de los espacios calientes (fig. S14). Tanto los sEV sanos como los cancerosos exhiben la morfología esférica o en forma de copa característica (Fig. 5B-i) (^[34], ^[35]). El análisis de seguimiento de partículas (NTA) muestra que la mayoría de los sEV aislados se distribuyen dentro del rango esperado de 80 a 200 nm, con un diámetro máximo de 134 a 154 nm (fig. S15). El análisis de Western blotting verifica la presencia de biomarcadores de sEV, CD81 y TSG101, en la muestra de CRC y confirma la alta pureza de las muestras de sEV mediante la ausencia del marcador del retículo endoplásmico Calnexina (Fig. 5B-ii) (^[38], ^[39]).

Para evaluar la capacidad del DLA para proporcionar un perfilado molecular mejorado de los sEV, recolectamos 3000 espectros SERS (150 espectros por individuo) de 20 muestras en el DLA, comparando los resultados con los obtenidos de un arreglo de Au monocapa y una película de Au NP (fig. S16). Si bien todas las plataformas detectan picos de proteínas y lípidos, solo el DLA revela picos previamente no detectados a 678, 1342, 1480, 1582 y 1675 cm−1 y señales mejoradas a 780 y 1600 cm−1 (fig. 5C-i, fig. S17 y tabla S1) (^[40]–^[42]). Los picos a 678, 1480 y 1582 cm−1 están asociados con las purinas, y los de 780, 1342 y 1675 cm−1 corresponden a las pirimidinas, lo que indica una detección mejorada de los ácidos nucleicos (^[40]–^[42]). Estos hallazgos sugieren que el DLA permite una exploración más profunda del contenido interno de los exosomas y proporciona una información molecular más rica que las plataformas convencionales. En particular, los sEV derivados del CRC exhiben intensidades espectrales significativamente elevadas a 1342 y 1582 cm−1, que están asociadas con los ácidos nucleicos, y un pico de proteína a 1600 cm−1, que corresponde a la fenilalanina (fig. 5C-i). Esto es consistente con informes previos sobre niveles elevados de ácidos nucleicos y proteínas en los sEV cancerosos (^[43], ^[44]). Para evaluar la robustez y la incertidumbre de la clasificación de nuestro modelo, realizamos un procedimiento de validación cruzada de cinco pliegues. En cada pliegue, se utilizan 300 espectros de muestras sanas y 300 espectros de muestras cancerosas para entrenar y validar el modelo de forma independiente. El modelo alcanza una precisión de clasificación media del 99,3%, con una DE del 0,3%, lo que indica una alta reproducibilidad y una baja variabilidad entre los pliegues (fig. S18). El análisis estadístico mediante pruebas t independientes de dos muestras revela diferencias significativas entre los sEV cancerosos y los sEV sanos en la plataforma DLA en los picos 1342, 1582 y 1600 cm−1 (P 18 veces mayor que el del arreglo de monocapa de Au (1,9 × 105) (fig. 3C-ii y fig. S9A). Los resultados del mapeo Raman proporcionan evidencia directa del acoplamiento fotónico-plasmónico en cascada, por el cual los nanochorros fotónicos generados por las microesferas de SiO2 enfocan la luz de excitación en los sitios plasmónicos subyacentes para crear puntos calientes de alta intensidad. Este enfoque localizado amplifica significativamente la intensidad de excitación en la superficie plasmónica, lo que resulta en un campo cercano más fuerte y señales SERS notablemente mejoradas (^[25]). Además de proporcionar una alta intensidad de señal, el DLA exhibe una excelente reproducibilidad de la señal y homogeneidad espacial en condiciones de medición prácticas. Utilizando un objetivo de 50× [apertura numérica (NA) = 0,55], una configuración típica en aplicaciones reales, el DLA logra una baja desviación estándar relativa (RSD) del 5,2% en un área de 36 μm × 50 μm y una RSD intersustrato del 4,6% en 10 sustratos independientes (fig. S9, B y C). Si bien la modulación SERS periódica de las esferas de la capa superior está enmascarada en estas condiciones por el punto láser de ~1,74 μm, se vuelve observable con un objetivo de mayor NA y un tamaño de paso espectral más fino (~200 nm), lo que es consistente con la fig. 3C. Para descartar los posibles efectos de las diferencias de altura entre el DLA y el arreglo de monocapa, comparamos sus respuestas SERS a diferentes profundidades de enfoque que van desde -15 hasta +15 μm en relación con la superficie de las microesferas de SiO2 superiores (fig. S10**). El DLA supera constantemente al arreglo de monocapa de Au en todas las profundidades de enfoque, lo que indica que el efecto de mejora observado refleja la eficiencia intrínseca de su arquitectura de puntos calientes en lugar de los efectos relacionados con el enfoque. En general, estos resultados demuestran la sinergia entre los nanochorros fotónicos y la resonancia plasmónica en la plataforma DLA para aumentar las señales SERS, superando a cualquiera de los componentes por sí solo.

Sondear la extensión espacial de los puntos calientes

Tras la validación del campo EM, determinamos cuantitativamente la extensión espacial de los puntos calientes EM en el DLA. Para lograr esto, adoptamos una estrategia de nanoreglas utilizando nanopartículas de polisitireno@SiO2 (PS@SiO2), ya que la naturaleza subdifractiva de esta tarea excede los límites de resolución de la microscopía óptica convencional. Este enfoque está diseñado específicamente para estimar la profundidad de penetración del campo EM mejorado desde la superficie plasmónica, un parámetro esencial para aplicaciones que involucran recubrimientos dieléctricos gruesos o biomoléculas grandes. La capa de SiO2 ópticamente transparente actúa como un espaciador físico bien definido, que funciona como una regla a nanoescala al controlar con precisión la distancia entre el núcleo de PS Raman-activo y la superficie del DLA, al tiempo que minimiza la atenuación de la señal o la interferencia dentro de la capa espaciadora (fig. 4A) (^[26], ^[27]). Esta estrategia nos permite sondear la intensidad SERS y, por lo tanto, inferir la intensidad del campo EM local a diferentes distancias por encima de la superficie de Au.

Con este fin, sintetizamos nanoreglas de PS@SiO2 con un núcleo de PS fijo de ~40 nm, que exhibe un modo de flexión de anillo fuerte y distinto a ~1001 cm−1 como un marcador SERS confiable. Los espesores de la capa de SiO2 (0, 10, 22, 35 y 65 nm) se ajustan con precisión para variar sistemáticamente la distancia núcleo-superficie (fig. S11 y Materiales y Métodos). Estas nanoreglas se depositan sobre el DLA, cuyos grandes espacios intersticiales de ~350 nm son lo suficientemente amplios para permitir que estas nanoreglas accedan a las regiones de puntos calientes para las mediciones SERS posteriores (fig. S12). Dado que la intensidad SERS es directamente proporcional a la cuarta potencia de la amplitud del campo EM (|E/E0|4), medir la intensidad SERS del núcleo de PS en diferentes espesores de la capa de sílice permite la reconstrucción de los perfiles de decaimiento EM para los puntos calientes convencionales y los puntos calientes (Materiales Suplementarios) (^[20], ^[28]). Medimos las intensidades SERS del DLA y un nanoarreglo de monocapa de Au en varios espesores de la capa de sílice para mapear el perfil de decaimiento EM y estimar el tamaño del punto caliente (fig. 4B, i y ii). Para los puntos calientes, el perfil de decaimiento se deriva asumiendo una contribución fraccionaria del 50% de los puntos calientes grandes (f = 0,5) a la intensidad SERS total dentro del DLA (Materiales Suplementarios). Los datos SERS experimentales revelan que la intensidad SERS, y por lo tanto, la intensidad del campo EM, disminuye exponencialmente con el aumento del espesor de la capa de sílice en todas las plataformas. Utilizando el tamaño de punto caliente conocido (14 nm; de nuestras simulaciones numéricas) y el perfil EM establecido de los puntos calientes convencionales en el nanoarreglo de monocapa de Au, determinamos numéricamente el umbral del campo EM E/E0 que define el umbral del punto caliente o punto caliente para que sea 0,075. Aplicar este umbral al perfil EM del DLA produce una estimación del tamaño del punto caliente de ~110 nm, aproximadamente 7,9 veces mayor que el de las plataformas plasmónicas convencionales (fig. 4B-iii). El tamaño del punto caliente determinado utilizando el método de la nanorrela es robusto con f = 0,5: variar f en ±40% (0,3 o 0,7) cambia el tamaño extraído en solo 2,7 y 6,8%, respectivamente, dentro del margen de error experimental (fig. S13). El tamaño del punto caliente EM de 110 nm medido mediante el experimento de la nanorrela representa un promedio que incluye tanto los campos EM extendidos directamente debajo de las microesferas de SiO2 como los puntos calientes convencionales más pequeños ubicados fuera de su contacto inmediato. Por lo tanto, el tamaño real de los puntos calientes debajo de las microesferas es probablemente mayor que 110 nm. No obstante, este método ofrece un enfoque práctico y cuantitativo para medir las dimensiones de los puntos calientes EM y los puntos calientes, lo que confirma la presencia de puntos calientes espacialmente extendidos dentro del DLA. Al superar la compensación tradicional entre la intensidad y el tamaño de los puntos calientes, estos puntos calientes intensos y expansivos hacen que el DLA sea particularmente prometedor para la detección SERS de biomoléculas grandes y heterogéneas.

DLA fotónico-plasmónico para un perfilado multiómico integral de sEV

Como prueba de concepto, demostramos que el DLA fotónico-plasmónico, con sus puntos calientes grandes e intensos, permite un perfilado SERS profundo y sin etiquetas de los contenidos biomoleculares, incluidos las proteínas y los ácidos nucleicos, dentro de sEV intactos (fig. 5A). Estos biotargets grandes son típicamente inaccesibles para los puntos calientes plasmónicos convencionales debido a su alcance espacial limitado (^[29]–^[32]). Nos centramos en los sEV derivados de pacientes con CRC y donantes sanos, dado el significado clínico del CRC como un importante problema de salud mundial y la urgente necesidad de métodos de detección no invasivos. Estos sEV son vesículas unidas por bicapas lipídicas (típicamente de 30 a 200 nm de diámetro) cuya membrana externa está compuesta principalmente por lípidos y proteínas, mientras que su núcleo contiene ADN, ARN y proteínas citosólicas (^[33]–^[37]). El acceso a este contenido interno es fundamental para un perfilado molecular integral, ya que refleja estrechamente el estado fisiológico de las células progenitoras y respalda el diagnóstico de enfermedades basado en biopsias líquidas (^[33]–^[35]). Sin embargo, los sustratos SERS convencionales dependen de puntos calientes altamente localizados que principalmente sondean especies unidas a la superficie, lo que proporciona un acceso limitado a los biomarcadores encapsulados más profundamente dentro de los sEV. Por lo tanto, prevemos que los puntos calientes intensos y espacialmente extendidos del sistema DLA puedan permitir una amplificación de la señal no destructiva tanto de los componentes unidos a la superficie como de los internos para avanzar en el análisis sin etiquetas de sEV completos.

Para establecer nuestro conjunto de datos, aislamos sEV de 20 muestras de plasma humano (10 donantes sanos y 10 pacientes con CRC) y realizamos mediciones SERS directas en fase líquida en el DLA. Este enfoque basado en líquidos evita los artefactos asociados con el secado de la muestra, como la cristalización de la sal, que pueden dañar la estructura del DLA, bloquear los espacios intersticiales o desprender los sEV de los puntos calientes (fig. S14). Tanto los sEV sanos como los cancerosos exhiben la morfología esférica o en forma de copa característica (fig. 5B-i) (^[34], ^[35]). El análisis de seguimiento de partículas (NTA) muestra que la mayoría de los sEV aislados se distribuyen dentro del rango esperado de 80 a 200 nm, con un diámetro máximo de 134 a 154 nm (fig. S15). El análisis de Western blotting verifica la presencia de biomarcadores de sEV, CD81 y TSG101, en la muestra de CRC y confirma la alta pureza de las muestras de sEV por la ausencia del marcador del retículo endoplásmico Calnexina (fig. 5B-ii) (^[38], ^[39]).

Para evaluar la capacidad del DLA para proporcionar un perfilado molecular mejorado de los sEV, recolectamos 3000 espectros SERS (150 espectros por individuo) de 20 muestras en el DLA, comparando los resultados con los obtenidos de un arreglo de Au monocapa y una película de Au NP (fig. S16). Si bien todas las plataformas detectan picos de proteínas y lípidos, solo el DLA revela picos previamente no detectados a 678, 1342, 1480, 1582 y 1675 cm−1 y señales mejoradas a 780 y 1600 cm−1 (fig. 5C-i, fig. S17 y tabla S1) (^[40]–^[42]). Los picos a 678, 1480 y 1582 cm−1 están asociados con purinas, y los de 780, 1342 y 1675 cm−1 corresponden a pirimidinas, lo que indica una detección mejorada de ácidos nucleicos (^[40]–^[42]). Estos hallazgos sugieren que el DLA permite una exploración más profunda del contenido interno de los exosomas y proporciona una información molecular más rica que las plataformas convencionales. En particular, los sEV derivados de CRC exhiben intensidades espectrales significativamente elevadas a 1342 y 1582 cm−1, que están asociadas con ácidos nucleicos, y un pico de proteína a 1600 cm−1, que corresponde a la fenilalanina (fig. 5C-i). Esto es consistente con informes previos sobre niveles elevados de ácidos nucleicos y proteínas en sEV cancerosos (^[43], ^[44]). Para evaluar la robustez y la incertidumbre de la clasificación de nuestro modelo, realizamos un procedimiento de validación cruzada de cinco pliegues. En cada pliegue, se utilizan 300 espectros de muestras sanas y 300 espectros de muestras cancerosas para entrenar y validar el modelo de forma independiente. El modelo alcanza una precisión de clasificación media del 99,3%, con una DE del 0,3%, lo que indica una alta reproducibilidad y una baja variabilidad entre los pliegues (fig. S18). El análisis estadístico mediante pruebas t independientes de dos muestras revela diferencias significativas entre los sEV cancerosos y los sanos en la plataforma DLA en los picos 1342, 1582 y 1600 cm−1 (P