La deficiencia de caspasa-3/7 se asocia con un aumento de la inflamación intestinal y una reducción de la tumorigénesis.

El epitelio intestinal está compuesto por una monocapa de células epiteliales intestinales (CEI), que forman la barrera celular entre el ambiente luminal y la lámina propia subyacente (^[1]–^[3]). Junto con la capa de moco, funciona como una barrera física contra los contenidos luminales, que, en algunos casos, pueden representar amenazas externas, como microorganismos, antígenos dietéticos y toxinas (^[4]). Al mismo tiempo, la mucosa intestinal facilita la comunicación entre la microbiota intestinal y el sistema inmunitario del huésped para mantener la homeostasis intestinal (^[5]). En consecuencia, las células epiteliales están compuestas por diversas poblaciones celulares especializadas, que incluyen enterocitos que absorben nutrientes y también presentan antígenos, células caliciformes secretoras de moco y células epiteliales de Paneth que producen péptidos antimicrobianos (^[2]). A pesar de estas funciones divergentes, la mayoría de las CEI se renuevan rápidamente cada 4 a 5 días a través de procesos reguladores finamente ajustados que involucran la proliferación de células madre, la diferenciación y la muerte celular regulada, lo cual, a su vez, es esencial para preservar la integridad epitelial durante la homeostasis (^[1]).

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que comprende la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), es un trastorno inflamatorio crónico y recurrente del tracto gastrointestinal (^[5]–^[7]). Junto con la disregulación inmune y el desequilibrio microbiano, la muerte celular epitelial excesiva y desregulada es una característica distintiva de la EII (^[8]–^[10]). La apoptosis y la anoikis se entienden tradicionalmente como las principales formas de muerte de las CEI en condiciones de estado estacionario. En contraste, varias líneas de evidencia provenientes de modelos experimentales y biopsias de pacientes han implicado otras modalidades de muerte celular regulada, que incluyen la necroptosis, la piroptosis y la ferroptosis, en la patología de la enfermedad (^[9], ^[11]–^[13]). Por lo tanto, la expresión aberrante de los principales efectores y reguladores, como la caspasa-3 (^[14]), la caspasa-7 (^[15]), la quinasa de lignaje mixto (MLKL) (^[16]), las gasderminas (^[12], ^[17]–^[19]) y la glutatión peroxidasa 4 (GPX4) (^[20]), sugiere que múltiples programas de muerte celular pueden actuar en conjunto para promover la inflamación intestinal. Aún así, su contribución relativa a la inflamación de la mucosa sigue siendo incierta.

Las caspasas 3 y 7, que representan las caspasas efectoras críticas en la apoptosis, se activan aguas abajo de las caspasas iniciadoras y escinden una amplia gama de sustratos (^[21]–^[23]). Más allá de su función canónica en la muerte celular, también influyen en la proliferación celular, la adhesión y las respuestas inmunitarias (^[24]–^[26]). Por el contrario, la desregulación de la actividad de la caspasa-3/7 se ha relacionado con una amplia gama de enfermedades, que incluyen el cáncer, los trastornos autoinmunes y las infecciones (^[27]–^[29]). Por lo tanto, para investigar su función específica en el epitelio intestinal, generamos ratones con deleción específica de CEI de Casp3 y Casp7 (Casp3/7ΔIEC). En condiciones de estado estacionario, estos ratones no presentan anomalías evidentes en la arquitectura o la homeostasis intestinal, lo que demuestra que, en ratones no desafiados, la apoptosis de las CEI per se no es esencial para la renovación de las CEI en la parte superior de las vellosidades, la dinámica del tejido intestinal, el microbioma y la composición de las células inmunitarias del intestino (^[30]). Sin embargo, los ratones Casp3/7ΔIEC son resistentes a la toxicidad gastrointestinal inducida por la quimioterapia (^[31]) y son altamente susceptibles a la infección por Clostridium difficile (^[32]). Aunque trabajos previos han sugerido que la deleción sistémica de la caspasa-3 o la caspasa-7 aumenta la susceptibilidad a la colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (SDS) (^[15], ^[33]), las contribuciones específicas de tipo celular de la caspasa-3/7, particularmente en las CEI durante la EII y el cáncer colorrectal (CCR), siguen sin estar claras.

Para analizar las modalidades de muerte celular regulada más importantes, las comparamos sistemáticamente y evaluamos la participación de la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la ferroptosis en un modelo murino de colitis e identificamos una sensibilidad notablemente mayor en los ratones Casp3/7ΔIEC. El análisis de la deficiencia de la caspasa-3/7 en el intestino en estas circunstancias reveló un compartimento de células madre intestinales alterado, la integridad de la barrera y una mayor inflamación. En un modelo de CCR, estos ratones exhibieron una carga tumoral reducida, probablemente debido a una regeneración disfuncional impulsada por las células madre.

RESULTADOS

La muerte celular excesiva en pacientes con EII se asocia con la desregulación de los efectores de la muerte celular y los reguladores clave

Para explorar la asociación a nivel del genoma entre las vías de muerte celular y la EII, analizamos la superposición entre 319 loci genéticos asociados con la EII y el término de la Ontología Genética (GO) "genes de muerte celular". Este análisis identificó 40 genes superpuestos, incluidos reguladores de la muerte celular bien conocidos, como BOK, BCL2L11 (también conocido como BIM) y DAP1 (Fig. 1A). Además, se identificaron varios genes involucrados en la señalización del factor de necrosis tumoral (TNF) y la eferocitosis, lo que subraya un posible papel de la muerte celular y la regulación de la inflamación en la patogénesis de la EII. También evaluamos la superposición entre los genes de muerte celular y los genes expresados diferencialmente (DE) en tres conjuntos de datos transcriptómicos independientes de pacientes con CU y EC. En todas las cohortes, se encontraron más de 500 genes relacionados con la muerte celular entre los genes DE (Fig. 1B), lo que sugiere una modulación transcripcional generalizada de las vías de muerte celular en la EII. En particular, varios genes efectores clave de la muerte celular (CASP3, CASP7, MLKL y GSDME) y el guardián de la ferroptosis, GPX4, exhibieron patrones de expresión modulados, aunque con cierta variabilidad entre los conjuntos de datos. Para comprender mejor la dinámica de estos cambios durante la inflamación intestinal, analizamos la expresión de seis genes seleccionados involucrados en la ejecución de la muerte celular (Casp3, Casp7, Mlkl, Gsdmd, Gsdme y Gpx4) en las CEI de modelos de colitis inducida por SDS en ratones, utilizando dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (RNA-seq) disponibles públicamente (^[34], ^[35]). Los patrones de expresión de estos seis genes parecen variar con la progresión de la enfermedad, lo que sugiere una posible asociación entre estas vías de muerte celular en la patofisiología de la colitis (Fig. 1C).

Para validar aún más estos hallazgos experimentalmente, inducimos colitis por SDS en ratones de tipo salvaje (WT) y analizamos la expresión de proteínas de marcadores de muerte celular seleccionados en las CEI colónicas aisladas (Fig. 1, D a H, y fig. S1A). El tratamiento con SDS condujo a la activación de las caspasas 8, 3 y 7, lo que indica la inducción de la apoptosis, mientras que la MLKL fosforilada (pMLKL), un marcador de la necroptosis, no fue detectable. Aunque no se observó la proteólisis de GSDME, se detectaron altos niveles de p30 GSDMD, lo que sugiere un posible papel de la piroptosis al generar el fragmento de GSDMD que forma poros en el extremo N-terminal. En cuanto a la ferroptosis, aunque los niveles de proteína GPX4 permanecieron sin cambios con el tiempo, lo que sugiere que no hay una regulación central a nivel de la expresión de proteínas, su actividad enzimática aún podría ser funcionalmente relevante (^[20]).

Casp3/7, pero no Mlkl, Gsdmd, Gsdme o Gpx4, determina la susceptibilidad a la colitis inducida por SDS

Para analizar los posibles roles de los distintos modos de muerte celular de las CEI en la inflamación intestinal, generamos y analizamos el fenotipo después de la colitis inducida por SDS en un panel de líneas de ratones transgénicas: Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC y Casp3/7ΔIEC (deficientes en los efectores de la apoptosis), MlklΔIEC y Mlkl−/− (deficientes en la ejecución de la necroptosis), Gsdmd−/− (deficientes en la ejecución de la piroptosis), GsdmeΔIEC y Gsdme−/− (deficientes en la necrosis secundaria/ejecución de la piroptosis) y Gpx4iΔIEC y Gpx4+/−ΔIEC (propensos a la ferroptosis). Los ratones Casp3/7ΔIEC, MlklΔIEC, Gsdmd−/−, GsdmeΔIEC y Gpx4iΔIEC se sometieron a un protocolo experimental estandarizado que consistió en un tratamiento con SDS al 3% durante 4 días, seguido de una fase de recuperación con agua potable normal. En el contexto de la deficiencia de las caspasas efectoras, los ratones Casp3/7ΔIEC exhibieron una colitis marcadamente empeorada en comparación con sus congéneres Casp3/7fl/fl. Esto se evidenció por una rápida pérdida de peso corporal, un índice de actividad de la enfermedad (IAE) elevado y una longitud del colon acortada (Fig. 2A y fig. S2, A y B). El análisis histológico reveló una erosión epitelial más extensa, infiltración de células inmunitarias y pérdida de criptas en los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que se corroboró aún más con los hallazgos de la colonoscopia que indicaron ulceración, heces más blandas y sangrado (Fig. 2B). Además, la destrucción de las criptas y el daño de la barrera fueron más pronunciados en los ratones Casp3/7ΔIEC (fig. S1, B y C). A continuación, también variamos las concentraciones de SDS y las duraciones del tratamiento para probar si el régimen de SDS podría afectar el fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC. En estas condiciones, los ratones Casp3/7ΔIEC exhibieron constantemente un fenotipo inflamatorio robusto (fig. S1, D y E). Por último, considerando el fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC, investigamos las contribuciones relativas de la caspasa-3 y la caspasa-7 en el modelo de colitis. Con este fin, los ratones Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC y sus congéneres se sometieron a tratamiento con SDS. A diferencia de los ratones Casp3/7ΔIEC, ni la deficiencia de Casp3 ni la de Casp7 por sí solas en las CEI alteraron la susceptibilidad del huésped a la colitis inducida por SDS (fig. S1, F y G), lo que sugiere una redundancia funcional entre estas caspasas efectoras de la apoptosis en las CEI al regresar al estado estacionario después de la colitis inducida por SDS.

Para explorar aún más las consecuencias posteriores de la deficiencia de la apoptosis, realizamos una secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq) de los tejidos del colon distal de los ratones Casp3/7ΔIEC y los controles, que fueron tratados con SDS. La secuenciación de ARN identificó cambios sustanciales en la expresión génica, incluido el aumento de los genes de respuesta inflamatoria y al estrés y la disminución de los genes involucrados en la función epitelial. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) destacó una supresión significativa de las vías de la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los ácidos grasos. En contraste, las vías de transición epitelial-mesenquimal y la respuesta inflamatoria se regularon al alza de manera notable (Fig. 2C). Estos hallazgos se validaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), que reveló una expresión reducida del marcador epitelial Villin y el marcador de las células madre intestinales residentes Lgr5, junto con una expresión elevada de las citocinas inflamatorias Il1b y Il6, y una expresión alterada de los componentes de las uniones estrechas Zo1 y Occludin (Fig. 2D). Para examinar el posible papel de la ejecución de la necroptosis, evaluamos los ratones MlklΔIEC. Los ratones que carecían de Mlkl en las CEI no mostraron diferencias significativas en la pérdida de peso, el IAE o la longitud del colon en comparación con sus congéneres WT. La evaluación histopatológica confirmó un daño de la mucosa similar en todos los grupos tratados con SDS, sin diferencias específicas del genotipo (Fig. 2E y fig. S2C). De manera similar, la deleción específica del epitelio de Gsdme tuvo una influencia limitada en los principales parámetros de la enfermedad, lo que indica un papel insignificante de GSDME en este modelo (Fig. 2F y fig. S2, D y E). Aunque se generó p30 GSDMD después del tratamiento con SDS, lo que indica la activación proteolítica (Fig. 1H), los ratones Gsdmd−/− no mostraron diferencias significativas en la gravedad de la colitis en comparación con los controles Gsdmd+/+, en las mismas condiciones experimentales. En particular, ambos genotipos mostraron una enfermedad relativamente leve, lo que sugiere que la piroptosis mediada por GSDMD puede no contribuir significativamente a la gravedad de la enfermedad en este contexto de colitis inducida por SDS (Fig. 2G y fig. S2, F a H).

Se examinó el posible papel de la ferroptosis sensibilizada en las células epiteliales del intestino (IEC) mediante el uso de ratones Gpx4iΔIEC, en los que se indujo la deleción del gen Gpx4 en las IEC mediante la inyección de tamoxifeno (fig. S3A). Los ratones Gpx4iΔIEC no expuestos a ningún estímulo no mostraron signos de inflamación intestinal ni de activación inmune sistémica (fig. S3, de la B a la G). En contraste con estudios anteriores (^[20]), la deficiencia inducible de Gpx4 no alteró la gravedad de la enfermedad, ya que el peso corporal, el índice de enfermedad (DAI), la longitud del colon y las puntuaciones histológicas fueron comparables con los controles Gpx4fl/fl en la colitis inducida por DSS (fig. 2H y fig. S3, de la I a la J). Cabe destacar que esta línea de ratones mostró una mayor susceptibilidad a las lesiones inducidas por DSS en general, independientemente del estado de Gpx4 en las IEC, lo que sugiere un efecto dependiente del fondo genético en este modelo. Coherente con las líneas de eliminación específica de IEC, los ratones con eliminación total de Mlkl−/−, Gsdme−/− y los ratones con eliminación heterocigota de IEC Gpx4+/−ΔIEC no mostraron diferencias significativas en comparación con los controles en el modelo de colitis inducida por DSS (fig. S1, de la H a la J), lo que también excluye una contribución crucial de la necroptosis y la piroptosis por parte de células distintas de las IEC en este modelo.

En conjunto, estos resultados indican paradójicamente que la actividad de la caspasa-3/7 en las IEC está críticamente implicada en la atenuación de la gravedad de la colitis inducida por DSS y en la facilitación de una recuperación más rápida. Al mismo tiempo, ni la deficiencia de necroptosis (MLKL), ni la piroptosis (GSDME y GSDMD), ni las vías de ferroptosis (GPX4) parecen afectar directamente el resultado fenotípico de la colitis inducida por DSS, lo que sugiere un papel único de las caspasas ejecutoras de la apoptosis.

La ablación de Casp3/7 conduce a defectos de proliferación de las células madre intestinales (ISC) y las células amplificadoras transitorias (TAC)

Para investigar sistemáticamente la base molecular de la disfunción epitelial en los ratones Casp3/7ΔIEC, realizamos un secuenciamiento de ARN masivo (bulk RNA-seq) de las IEC aisladas del colon distal en el estado basal (día 0) y durante la fase temprana de la colitis (día 3) (fig. 3A). Coherente con los hallazgos previos (^[30]), la deleción de la caspasa-3/7 en las IEC tuvo un impacto mínimo en el transcriptoma epitelial en condiciones de estado estacionario, como lo indica un número limitado de genes diferencialmente expresados (DE) (fig. 3B). En contraste, el tratamiento con DSS reveló notables diferencias transcripcionales entre los ratones Casp3/7ΔIEC y los controles. El análisis del diagrama de dispersión (volcano plot) destacó la supresión de genes clave relacionados con la proliferación, como Mki67, Stmn1, Pole, Cdk1 y Cdc20 (fig. 3C). GSEA mostró una regulación a la baja significativa de las vías relacionadas con el ciclo celular, incluido el punto de control G2M, los objetivos de E2F y el huso mitótico, en las IEC Casp3/7ΔIEC el día 3 (fig. 3D). Para evaluar si otras líneas celulares epiteliales también se vieron afectadas, analizamos los cambios en la expresión génica específica de cada tipo celular utilizando los datos de secuenciación de ARN (fig. 3E). La firma transcripcional de las células madre intestinales (ISC) y las células amplificadoras transitorias (TAC) se redujo notablemente en los ratones Casp3/7ΔIEC. En contraste, la expresión génica asociada con los tipos celulares terminalmente diferenciados, incluidos los células caliciformes, las células enteroendocrinas (EEC), las células en forma de copa y los enterocitos, permaneció sin cambios. Validamos estas observaciones mediante qPCR. Coherente con los resultados de la secuenciación de ARN, Lgr5 (marcador de ISC) se redujo significativamente el día 3 después del DSS. En contraste, la expresión de Muc2 y Tff3 (células caliciformes), Chga, Neurod1 y Sct (EEC) y Sis (enterocitos) permaneció comparable entre los genotipos estudiados (fig. 3F).

Aunque no se observó ninguna histopatología evidente en esta etapa mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (fig. 3G), la tinción de Ki67 reveló una reducción significativa de las ISC y las TAC proliferantes en los ratones Casp3/7ΔIEC (fig. 3, H e I). Para explorar más a fondo si la reducción de las ISC y las TAC da como resultado una enfermedad más grave, los ratones Casp3/7ΔIEC y los controles fueron tratados con un 3% de DSS durante 3 días, seguido de un cambio a agua potable normal. En estas condiciones, los ratones Casp3/7ΔIEC perdieron más peso corporal y tuvieron una puntuación de enfermedad más alta (fig. S4, A y B). Cabe destacar que se observó un aumento de la permeabilidad intestinal en los ratones Casp3/7ΔIEC en comparación con los controles después del tratamiento con DSS (fig. S4C), lo que indica defectos en la función de barrera. Para investigar el posible mecanismo detrás de este defecto de proliferación, generamos organoides cólicos ex vivo. Coherente con nuestros hallazgos anteriores, la ausencia de caspasa-3/7 no tiene impacto en la capacidad de formación de organoides cólicos y la velocidad de crecimiento en estado estacionario (fig. S4, D y E) (^[30]). A continuación, intentamos evaluar cómo la adición de DSS puede afectar el crecimiento de los organoides in vitro, como se informó anteriormente (^[36], ^[37]). Sin embargo, el Matrigel comenzó a desintegrarse poco después del tratamiento con DSS de baja concentración (0,001%), lo que dificultó la recapitulación de un modelo de DSS in vitro (fig. S4F). Por lo tanto, los resultados in vivo indican que la deficiencia de caspasa-3/7 en las IEC altera selectivamente la proliferación de las ISC y las TAC durante la fase temprana de la colitis inducida por DSS, sin afectar la diferenciación o el mantenimiento de las líneas celulares epiteliales maduras (fig. 3, E y F).

La deleción de Casp3/7 no tiene impacto en los eventos generales de muerte celular

Dado que la apoptosis representa un modo crucial de muerte de las IEC durante la colitis inducida por DSS (^[38]), a continuación, buscamos cuantificar la muerte celular de las IEC en los ratones Casp3/7fl/fl y Casp3/7ΔIEC. La tinción de la terminal deoxynucleotidil transferasa mediada por la incorporación de trifosfato de desoxiuridina (TUNEL) reveló niveles comparables de muerte celular de las IEC en todos los genotipos, tanto con como sin la administración de DSS (fig. S5, A y B). Este resultado inesperado sugiere que, en ausencia de Casp3/7, otras modalidades de muerte celular pueden compensar la pérdida de la apoptosis. Para evaluar más a fondo la muerte celular ex vivo, derivamos organoides cólicos de los ratones Casp3/7ΔIEC y de control y los tratamos con TNF y interferón-γ de ratón para inducir las vías de muerte celular. La viabilidad de los organoides no se vio afectada por la deficiencia de Casp3/7 en estas condiciones, lo que indica que no hay una diferencia significativa en las tasas generales de muerte celular (fig. S5, C y D), lo que es coherente con nuestro informe anterior en el estado estacionario in vivo (^[30]). Dado que la apoptosis es típicamente inmunológicamente silenciosa, hipotetizamos que las formas proinflamatorias de muerte celular, específicamente la piroptosis y la necroptosis, pueden explicar el aumento de la inflamación observada en los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que es coherente con las firmas de secuenciación de ARN masivo (fig. 3, C y D). Para probar esto, examinamos los marcadores canónicos de la apoptosis, la necroptosis y la piroptosis en las IEC mediante inmunoblotting.

En línea con nuestras observaciones anteriores (fig. 1H), el tratamiento con DSS indujo la apoptosis mediada por la caspasa-8 en las IEC, como lo demuestra la activación de la caspasa-8, la caspasa-3 y la caspasa-7 (fig. S5E). Cabe destacar que no detectamos RIPK1 fosforilada ni MLKL, y la activación de la caspasa-8 permaneció intacta en los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que sugiere que la necroptosis no se activa en ausencia de caspasa-3/7. Para confirmar esto, generamos ratones Casp3/7/MlklΔIEC que carecen tanto de las vías de apoptosis como de necroptosis. Estos ratones mostraron una sensibilidad idéntica a la colitis inducida por DSS en comparación con los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que refuerza que la necroptosis no compensa la pérdida de la apoptosis en este entorno (fig. S5, F y G).

También exploramos si GSDMD podría contribuir al fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC como un posible mecanismo compensatorio para la falta de ejecución de la apoptosis. La piroptosis se ejecuta mediante un fragmento de p30 de GSDMD, que es producido por las caspasas inflamatorias en Asp276 (^[39], ^[40]). Se ha demostrado previamente que la caspasa-3/7 inhibe la actividad de GSDMD murino mediante su escisión en Asp88, generando un fragmento inactivo de p20 de GSDMD que no puede formar poros (^[41]–^[43]). Tras el tratamiento con DSS en los ratones Casp3/7fl/fl y Casp3/7ΔIEC, detectamos la activación de la caspasa-1/11/8 y la generación del efector pirotótico GSDMD p30, mientras que GSDME no se escindió (fig. S5E). En los ratones Casp3/7ΔIEC, observamos una abundancia comparable del fragmento activo de GSDMD p30 en las IEC después de la administración de DSS. Sin embargo, el fragmento inactivo de GSDMD p20 estaba aparentemente ausente, lo que indica que posiblemente un aumento en la relación p30/p20 de GSDMD pueda contribuir a la muerte celular inflamatoria durante la colitis inducida por DSS en los ratones Casp3/7ΔIEC.

Para validar una posible contribución funcional de GSDMD in vivo, administramos disulfiram a los ratones Casp3/7ΔIEC durante la colitis inducida por DSS (fig. S6A). El disulfiram es un fármaco tiol-reactivo aprobado clínicamente que modifica covalentemente a Cys192 (correspondiente a Cys191 en GSDMD humano) para inhibir la actividad del poro de GSDMD (^[44]), además de muchos otros objetivos de proteínas que contienen grupos tiol (^[45], ^[46]). El tratamiento con disulfiram abolió significativamente la diferencia en la gravedad de la colitis en los ratones Casp3/7ΔIEC en comparación con los controles de vehículo (fig. S6B). El disulfiram también restauró la longitud del colon (fig. S6, C y D) y mejoró la arquitectura histológica, con una mejor integridad epitelial y una reducción de la infiltración inmune (fig. S6E). Además, el análisis de qPCR reveló una reducción de los niveles de ARNm de la citocina proinflamatoria Il6 y la quimiocina Cxcl1 en los tejidos del colon de los grupos tratados con disulfiram (fig. S6F). En conjunto, estos hallazgos muestran que la caspasa-3/7 no restringe la inflamación colónica previniendo el nivel de muerte celular de las IEC per se, sino más bien al impedir una mayor muerte celular inflamatoria por parte de células no IEC que podrían prevenirse con el tratamiento con disulfiram.

La caspasa-3/7 epitelial promueve la carcinogénesis intestinal asociada a la inflamación

La inflamación intestinal crónica es un factor de riesgo bien establecido para la carcinogénesis, y los pacientes que sufren de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) presentan una mayor incidencia de cáncer colorrectal (CCR) (^[47], ^[48]). El desarrollo tumoral requiere típicamente dos procesos clave: la acumulación de mutaciones genéticas y un entorno inflamatorio o lesionado pro-tumorigénico que promueve la expansión de las células mutadas. El modelo de azoximetano (AOM)/DSS recapitula esta secuencia, donde las mutaciones inducidas por AOM son seguidas por ciclos de inflamación inducida por DSS para estimular el crecimiento tumoral, lo que refleja la patogénesis del CCR asociado a la colitis en humanos. Dado nuestra observación previa de que los ratones Casp3/7ΔIEC presentan una mayor inflamación intestinal pero una proliferación alterada de las células madre y las TAC durante la colitis aguda inducida por DSS (fig. 3, de la C a la F), buscamos determinar cuál de estos efectos opuestos predomina en el contexto de la tumorigénesis crónica. Por lo tanto, sometimos a los ratones Casp3/7ΔIEC y a los controles Casp3/7fl/fl al protocolo AOM/DSS (fig. 4A). Inesperadamente, los ratones Casp3/7ΔIEC desarrollaron significativamente menos tumores que los controles, con una marcada reducción en la categoría de tumores más grandes (fig. 4, B y C). La carga tumoral total, según el volumen tumoral acumulado, también fue significativamente menor en estos ratones (fig. 4D). El análisis histopatológico reveló que los carcinomas agresivos se observaron con frecuencia en los animales de control, mientras que los ratones Casp3/7ΔIEC exhibieron lesiones más leves (fig. 4E). El tinción inmunohistoquímica demostró además una actividad proliferativa reducida dentro de las regiones tumorales de los ratones Casp3/7ΔIEC (fig. 4F), lo que apoya la conclusión de que la regeneración epitelial defectuosa debido a la alteración de la función de las células madre y las TAC, en lugar de la inflamación mejorada por sí sola, determina el crecimiento tumoral en este modelo. Además, los tumores reducidos en los ratones Casp3/7ΔIEC carecen de caspasa-3/7, lo que indica que se originan en las IEC (fig. 4G).

Nuestros resultados sugieren que la deficiencia de caspasa-3/7 altera la proliferación y la capacidad de las células madre epiteliales. A pesar de la inflamación exacerbada y la disfunción de la barrera, esta alteración parece reducir la carcinogénesis colorrectal impulsada por la inflamación al limitar la capacidad de las células madre residentes y la expansión de los clones premalignos (fig. 4H).

Un papel prescindible de la GPX4 epitelial en la lesión inducida por rayos X y el desarrollo del CCR AOM/DSS

La desregulación de la abundancia y la actividad de GPX4 se ha asociado con varias enfermedades intestinales, lo que indica que la ferroptosis podría ser un posible objetivo terapéutico, pero faltan pruebas genéticas que respalden esta implicación (^[20], ^[49]–^[51]). En el presente estudio, nuestros datos sugieren que la deficiencia de GPX4 en las células epiteliales intestinales (IEC) no afecta el estado estable intestinal (fig. S3). No se observó ninguna diferencia en la susceptibilidad en el modelo de colitis con DSS, lo que descarta un papel para GPX4 (fig. 2H). Además de la colitis aguda, utilizamos un modelo de irradiación de todo el abdomen, ya que se ha implicado la inducción de la ferroptosis en la muerte celular inducida por la radiación (^[52]–^[56]). La deficiencia de GPX4 en el epitelio no tiene un impacto patofisiológico significativo en la sensibilidad a la radiación gastrointestinal, como se muestra en las mediciones del peso corporal (fig. 5, A y B). Dado el posible papel supresor de tumores de la inducción de la ferroptosis en el CCRC (^[57], ^[58]), examinamos si la deficiencia de Gpx4 en las IEC afectaría negativamente el desarrollo del CCRC inducido por AOM/DSS. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia entre el grupo control y el grupo con deficiencia de GPX4 inducida por tamoxifeno en los ratones Gpx4iΔIEC, lo que sugiere que GPX4 no tiene un papel crucial en la tumorigénesis AOM/DSS (fig. 5, C a G). En conjunto, nuestro estudio argumenta que GPX4 no tiene un papel crucial en el epitelio intestinal durante la lesión inducida por la radiación y el desarrollo del CCRC asociado a la inflamación.

La muerte celular excesiva en pacientes con EII se asocia con la desregulación de los ejecutores de la muerte celular y los reguladores clave

Para explorar la asociación a nivel del genoma entre las vías de muerte celular y la EII, analizamos la superposición entre 319 loci genéticos asociados con la EII y el término de la Ontología Genética (GO) "genes de muerte celular". Este análisis identificó 40 genes superpuestos, incluidos reguladores de la muerte celular bien conocidos, como BOK, BCL2L11 (también conocido como BIM) y DAP1 (fig. 1A). Además, se identificaron varios genes involucrados en la señalización del factor de necrosis tumoral (TNF) y la eferocitosis, lo que subraya un posible papel de la muerte celular y la regulación de la inflamación en la patogénesis de la EII. También evaluamos la superposición entre los genes de muerte celular y los genes expresados diferencialmente (DE) en tres conjuntos de datos transcriptómicos independientes de pacientes con CU y CD. En todas las cohortes, se encontraron más de 500 genes relacionados con la muerte celular entre los genes DE (fig. 1B), lo que sugiere una modulación transcripcional generalizada de las vías de muerte celular en la EII. En particular, varios genes clave de los ejecutores de la muerte celular (CASP3, CASP7, MLKL y GSDME) y el guardián de la ferroptosis, GPX4, mostraron patrones de expresión modulados, aunque con cierta variabilidad entre los conjuntos de datos. Para comprender mejor la dinámica de estos cambios durante la inflamación intestinal, analizamos la expresión de seis genes seleccionados involucrados en la ejecución de la muerte celular (Casp3, Casp7, Mlkl, Gsdmd, Gsdme y Gpx4) en las IEC de modelos de ratón con colitis inducida por DSS utilizando dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (RNA-seq) disponibles públicamente (^[34], ^[35]). Los patrones de expresión de estos seis genes parecen variar con la progresión de la enfermedad, lo que sugiere una posible asociación entre estas vías de muerte celular en la patofisiología de la colitis (fig. 1C).

Para validar aún más estos hallazgos experimentalmente, inducimos colitis con DSS en ratones de tipo salvaje (WT) y analizamos la expresión de proteínas de marcadores de muerte celular seleccionados en las IEC colónicas aisladas (fig. 1, D a H, y fig. S1A). El tratamiento con DSS condujo a la activación de las caspasas 8, 3 y 7, lo que indica la inducción de la apoptosis, mientras que la MLKL fosforilada (pMLKL), un marcador de la necroptosis, no fue detectable. Aunque no se observó la proteólisis de GSDME, se detectaron altos niveles de p30 GSDMD, lo que sugiere un posible papel de la piroptosis mediante la generación del fragmento de GSDMD que forma poros en el extremo N-terminal. En cuanto a la ferroptosis, aunque los niveles de proteína GPX4 permanecieron sin cambios con el tiempo, lo que sugiere que no hay una regulación central a nivel de la expresión de proteínas, su actividad enzimática aún podría ser funcionalmente relevante (^[20]).

Casp3/7, pero no Mlkl, Gsdmd, Gsdme o Gpx4, determina la susceptibilidad a la colitis inducida por DSS

Para dilucidar los posibles papeles de los distintos modos de muerte celular de las IEC en la inflamación intestinal, generamos y analizamos el fenotipo tras la colitis inducida por DSS en un panel de líneas de ratones transgénicos: Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC y Casp3/7ΔIEC (deficientes en los ejecutores de la apoptosis), MlklΔIEC y Mlkl−/− (deficientes en la ejecución de la necroptosis), Gsdmd−/− (deficientes en la ejecución de la piroptosis), GsdmeΔIEC y Gsdme−/− (deficientes en la necrosis secundaria/ejecución de la piroptosis) y Gpx4iΔIEC y Gpx4+/−ΔIEC (propensos a la ferroptosis). Los ratones Casp3/7ΔIEC, MlklΔIEC, Gsdmd−/−, GsdmeΔIEC y Gpx4iΔIEC se sometieron a un protocolo experimental estandarizado que consistió en un tratamiento con DSS al 3% durante 4 días, seguido de una fase de recuperación con agua potable normal. En el contexto de la deficiencia de las caspasas ejecutoras, los ratones Casp3/7ΔIEC mostraron una colitis notablemente empeorada en comparación con sus compañeros de camada Casp3/7fl/fl. Esto se evidenció por una rápida pérdida de peso corporal, un índice de actividad de la enfermedad (DAI) elevado y una longitud del colon acortada (fig. 2A y fig. S2, A y B). El análisis histológico reveló una erosión epitelial más extensa, infiltración de células inmunitarias y pérdida de criptas en los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que se corroboró aún más con los hallazgos de la colonoscopia que indicaron ulceración, heces más blandas y sangrado (fig. 2B). Además, la destrucción de las criptas y el daño de la barrera fueron más pronunciados en los ratones Casp3/7ΔIEC (fig. S1, B y C). A continuación, también variamos las concentraciones de DSS y las duraciones del tratamiento para probar si el régimen de DSS podría afectar el fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC. En estas condiciones, los ratones Casp3/7ΔIEC mostraron constantemente un fenotipo inflamatorio robusto (fig. S1, D y E). Por último, considerando el fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC, investigamos las contribuciones relativas de la caspasa-3 y la caspasa-7 en el modelo de colitis. Con este fin, los ratones Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC y sus compañeros de camada se sometieron a tratamiento con DSS. A diferencia de los ratones Casp3/7ΔIEC, ni la deficiencia de Casp3 ni la de Casp7 por sí solas en las IEC alteraron la sensibilidad del huésped a la colitis inducida por DSS (fig. S1, F y G), lo que sugiere una redundancia funcional entre estas caspasas ejecutoras de la apoptosis en las IEC en el retorno al estado estable tras la colitis inducida por DSS.

Para explorar aún más las consecuencias posteriores de la deficiencia de la apoptosis, realizamos una secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq) de los tejidos del colon distal de los ratones Casp3/7ΔIEC y los controles tratados con DSS. La secuenciación de ARN identificó cambios sustanciales en la expresión génica, incluido el aumento de la expresión de los genes de respuesta inflamatoria y al estrés y la disminución de la expresión de los genes involucrados en la función epitelial. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) destacó la supresión significativa de las vías relacionadas con el ciclo celular, incluido el punto de control G2M, los objetivos de E2F y el huso mitótico, en las IEC Casp3/7ΔIEC el día 3 (fig. 3D). Para evaluar si también se vieron afectadas otras líneas celulares epiteliales, analizamos los cambios en la expresión génica específicos del tipo celular utilizando los datos de secuenciación de ARN (fig. 3E). La firma transcripcional de las células madre intestinales (ISCs) y las células amplificadoras transitorias (TACs) disminuyó notablemente en los ratones Casp3/7ΔIEC. En contraste, la expresión génica asociada con los tipos celulares diferenciados terminalmente, incluidas las células caliciformes, las células enteroendocrinas (EECs), las células en copa y los enterocitos, permaneció sin cambios. Validamos estas observaciones mediante qPCR. Coherente con los resultados de la secuenciación de ARN, Lgr5 (marcador de ISC) se redujo significativamente el día 3 después del DSS. En contraste, la expresión de Muc2 y Tff3 (células caliciformes), Chga, Neurod1 y Sct (EECs) y Sis (enterocitos) permaneció comparable entre los genotipos estudiados (fig. 3F).

En conjunto, estos resultados indican paradójicamente que la actividad de la caspasa-3/7 en las IEC está críticamente involucrada en la atenuación de la gravedad de la colitis inducida por DSS y en la facilitación de una recuperación más rápida. Al mismo tiempo, ni la deficiencia de la necroptosis (MLKL), ni la piroptosis (GSDME y GSDMD), ni las vías de la ferroptosis (GPX4) parecen afectar directamente el resultado fenotípico de la colitis inducida por DSS, lo que sugiere un papel único de las caspasas ejecutoras de la apoptosis.

La ablación de Casp3/7 conduce a defectos de proliferación de las ISCs y las TACs

Para investigar sistemáticamente la base molecular de la disfunción epitelial en los ratones Casp3/7ΔIEC, realizamos una secuenciación de ARN masiva de las IEC aisladas del colon distal en la línea de base (día 0) y durante la colitis temprana (día 3) (fig. 3A). Coherente con los hallazgos anteriores (^[30]), la deleción de la caspasa-3/7 en las IEC tuvo un impacto mínimo en el transcriptoma epitelial en condiciones de estado estable, como lo indica un número limitado de genes DE (fig. 3B). En contraste, el tratamiento con DSS reveló notables diferencias transcripcionales entre los ratones Casp3/7ΔIEC y los controles. El análisis del diagrama de dispersión destacó la supresión de los genes clave relacionados con la proliferación, como Mki67, Stmn1, Pole, Cdk1 y Cdc20 (fig. 3C). El GSEA mostró una disminución significativa de las vías relacionadas con el ciclo celular, incluido el punto de control G2M, los objetivos de E2F y el huso mitótico, en las IEC Casp3/7ΔIEC el día 3 (fig. 3D). Para evaluar si también se vieron afectadas otras líneas celulares epiteliales, analizamos los cambios en la expresión génica específicos del tipo celular utilizando los datos de secuenciación de ARN (fig. 3E). La firma transcripcional de las células madre intestinales (ISCs) y las células amplificadoras transitorias (TACs) disminuyó notablemente en los ratones Casp3/7ΔIEC. En contraste, la expresión génica asociada con los tipos celulares diferenciados terminalmente, incluidas las células caliciformes, las células enteroendocrinas (EECs), las células en copa y los enterocitos, permaneció sin cambios. Validamos estas observaciones mediante qPCR. Coherente con los resultados de la secuenciación de ARN, Lgr5 (marcador de ISC) se redujo significativamente el día 3 después del DSS. En contraste, la expresión de Muc2 y Tff3 (células caliciformes), Chga, Neurod1 y Sct (EECs) y Sis (enterocitos) permaneció comparable entre los genotipos estudiados (fig. 3F).

Aunque no se observó ninguna histopatología evidente en esta etapa mediante la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (Fig. 3G), la tinción de Ki67 reveló una reducción significativa de las células madre intestinales (CMI) y las células de tránsito amplificadoras (CTA) proliferantes en los ratones Casp3/7ΔIEC (Fig. 3, H e I). Para explorar más a fondo si la reducción de las CMI y las CTA da como resultado una enfermedad más grave, se trató a los ratones Casp3/7ΔIEC y a los controles con un 3% de DSS durante 3 días, seguido de un cambio a agua potable normal. En estas condiciones, los ratones Casp3/7ΔIEC perdieron más peso corporal y presentaron una puntuación de enfermedad más alta (fig. S4, A y B). Cabe destacar que se observó un aumento de la permeabilidad intestinal en los ratones Casp3/7ΔIEC_ en comparación con los controles después del tratamiento con DSS (fig. S4C), lo que indica defectos en la función de barrera. Para investigar el posible mecanismo subyacente a este defecto de proliferación, generamos organoides cólicos ex vivo. Coherente con nuestros hallazgos previos, la ausencia de caspasas 3/7 no tiene impacto en la capacidad de formación de organoides cólicos y la velocidad de crecimiento en condiciones basales (fig. S4, D y E) (^[30]). A continuación, intentamos evaluar cómo la adición de DSS podría afectar el crecimiento de los organoides in vitro, como se informó anteriormente (^[36], ^[37]). Sin embargo, el Matrigel comenzó a desintegrarse poco después del tratamiento con DSS de baja concentración (0,001%), lo que dificultó la recapitulación de un modelo de DSS in vitro (fig. S4F). Por lo tanto, los resultados in vivo indican que la deficiencia de caspasas 3/7 en las células epiteliales del intestino delgado (CEI) altera selectivamente la proliferación de las CMI y las CTA durante la colitis inducida por DSS en las primeras etapas, sin afectar la diferenciación o el mantenimiento de las líneas celulares epiteliales maduras (Fig. 3, E y F).

La deleción de Casp3/7 en las CEI no tiene impacto en los eventos generales de muerte celular

Dado que la apoptosis representa un modo crucial de muerte de las CEI durante la colitis inducida por DSS (^[38]), a continuación, buscamos cuantificar la muerte celular de las CEI en los ratones Casp3/7fl/fl y Casp3/7ΔIEC. La tinción mediante la marca terminal de desoxinucleotidil transferasa (TdT) con trifosfato de desoxiuridina (dUTP) reveló niveles comparables de muerte celular de las CEI en los diferentes genotipos, tanto con como sin la administración de DSS (fig. S5, A y B). Este resultado inesperado sugiere que, en ausencia de Casp3/7, otras modalidades de muerte celular pueden compensar la pérdida de apoptosis. Para evaluar más a fondo la muerte celular de las CEI ex vivo, derivamos organoides cólicos de los ratones Casp3/7ΔIEC y de los controles y los tratamos con TNF y interferón-γ de ratón para inducir vías de muerte celular. La viabilidad de los organoides no se vio afectada por la deficiencia de Casp3/7 en estas condiciones, lo que indica que no hay una diferencia significativa en las tasas generales de muerte celular (fig. S5, C y D), lo que es coherente con nuestro informe anterior en condiciones basales in vivo (^[30]). Dado que la apoptosis suele ser inmunológicamente silenciosa, hipotetizamos que las formas proinflamatorias de muerte celular, específicamente la piroptosis y la necroptosis, pueden explicar la mayor inflamación observada en los ratones Casp3/7ΔIEC_, lo que es coherente con las firmas de ARN masivo (fig. 3, C y D). Para probar esto, examinamos los marcadores canónicos de apoptosis, necroptosis y piroptosis en las CEI mediante inmunoblotting.

En línea con nuestras observaciones anteriores (fig. 1H), el tratamiento con DSS indujo la apoptosis mediada por la caspasa-8 en las CEI, como lo demuestra la activación de la caspasa-8, la caspasa-3 y la caspasa-7 (fig. S5E). Cabe destacar que no detectamos RIPK1 o MLKL fosforilados, y la activación de la caspasa-8 se mantuvo intacta en los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que sugiere que la necroptosis no se activa en ausencia de caspasas 3/7. Para confirmar esto, generamos ratones Casp3/7/MlklΔIEC que carecen tanto de las vías apoptóticas como de las necroptóticas. Estos ratones mostraron una sensibilidad idéntica a la colitis inducida por DSS que los ratones Casp3/7ΔIEC, lo que refuerza que la necroptosis no compensa la pérdida de apoptosis en este entorno (fig. S5, F y G).

También exploramos si GSDMD podría contribuir al fenotipo de los ratones Casp3/7ΔIEC como un posible mecanismo compensatorio para la falta de ejecución de la apoptosis. La piroptosis se ejecuta mediante un fragmento de p30 de GSDMD, que es producido por las caspasas inflamatorias en Asp276 (^[39], ^[40]). Se ha demostrado previamente que la caspasa-3/7 inhibe la actividad de GSDMD de ratón mediante su escisión en Asp88, generando un fragmento inactivo de p20 de GSDMD que no puede formar poros (^[41]–^[43]). Tras el tratamiento con DSS en los ratones Casp3/7fl/fl y Casp3/7ΔIEC, detectamos la activación de las caspasas 1/11/8 y la generación del efector pirotótico GSDMD p30, mientras que GSDME no se escindió (fig. S5E). En los ratones Casp3/7ΔIEC, observamos una abundancia comparable del fragmento activo de GSDMD p30 en las CEI tras la administración de DSS. Sin embargo, el fragmento inactivo de GSDMD p20 estaba aparentemente ausente, lo que indica que posiblemente un aumento en la relación p30/p20 de GSDMD pueda contribuir a la muerte celular inflamatoria durante la colitis inducida por DSS en los ratones Casp3/7ΔIEC.

Para validar una posible contribución funcional de GSDMD in vivo, administramos disulfiram a los ratones Casp3/7ΔIEC durante la colitis inducida por DSS (fig. S6A). El disulfiram es un fármaco tiol-reactivo aprobado clínicamente que modifica covalentemente a Cys192 (correspondiente a Cys191 en GSDMD humano) para inhibir la actividad del poro de GSDMD (^[44]), además de muchos otros objetivos de proteínas que contienen grupos tiol (^[45], ^[46]). El tratamiento con disulfiram abolió significativamente la diferencia en la gravedad de la colitis en los ratones Casp3/7ΔIEC en comparación con los controles de vehículo (fig. S6B). El disulfiram también restauró la longitud del colon (fig. S6, C y D) y mejoró la arquitectura histológica, con una mejor integridad epitelial y una reducción de la infiltración inmunitaria (fig. S6E). Además, el análisis de qPCR reveló una reducción de los niveles de ARNm de la citocina proinflamatoria Il6 y la quimiocina Cxcl1 en los tejidos cólicos del grupo tratado con disulfiram (fig. S6F). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la caspasa-3/7 no restringe la inflamación cólica previniendo el nivel de muerte celular de las CEI per se, sino más bien al impedir una mayor muerte celular inflamatoria por células no epiteliales que podría prevenirse con el tratamiento con disulfiram.

La caspasa-3/7 epitelial promueve la carcinogénesis intestinal asociada a la inflamación

La inflamación intestinal crónica es un factor de riesgo bien establecido para la carcinogénesis, y los pacientes que sufren de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) presentan una mayor incidencia de cáncer colorrectal (CCR) (^[47], ^[48]). El desarrollo tumoral suele requerir dos procesos clave: la acumulación de mutaciones genéticas y un entorno inflamatorio o lesionado protumorogénico que promueve la expansión de las células mutadas. El modelo de azoximetano (AOM)/DSS recapitula esta secuencia, en la que las mutaciones inducidas por AOM van seguidas de ciclos de inflamación inducida por DSS para estimular el crecimiento tumoral, lo que refleja la patogénesis del CCR asociado a la colitis en humanos. Dado nuestro hallazgo previo de que los ratones Casp3/7ΔIEC presentan una mayor inflamación intestinal pero una proliferación alterada de las CMI y las CTA durante la colitis aguda inducida por DSS (fig. 3, C a F), buscamos determinar cuál de estos efectos opuestos predomina en el contexto de la tumorigénesis crónica. Por lo tanto, sometimos a los ratones Casp3/7ΔIEC y a los ratones de control Casp3/7fl/fl al protocolo AOM/DSS (fig. 4A). Inesperadamente, los ratones Casp3/7ΔIEC desarrollaron significativamente menos tumores que los controles, con una marcada reducción en la categoría de tumores más grandes (fig. 4, B y C). La carga tumoral total, según lo evaluado por el volumen tumoral acumulado, también fue significativamente menor en estos ratones (fig. 4D). El análisis histopatológico reveló que los carcinomas agresivos se observaron con frecuencia en los animales de control, mientras que los ratones Casp3/7ΔIEC exhibieron lesiones más leves (fig. 4E). El tinte inmunohistoquímico demostró además una actividad proliferativa reducida dentro de las regiones tumorales de los ratones Casp3/7ΔIEC (fig. 4F), lo que apoya la conclusión de que la regeneración epitelial defectuosa debido a la alteración de la función de las CMI y las CTA, en lugar de la inflamación mejorada por sí sola, determina el crecimiento tumoral en este modelo. Además, los tumores reducidos en los ratones Casp3/7ΔIEC carecen de caspasa-3/7, lo que indica que se originan en las CEI (fig. 4G).

Nuestros resultados sugieren que la deficiencia de caspasa-3/7 altera la proliferación y la capacidad de las células madre epiteliales. A pesar de la exacerbación de la inflamación y la disfunción de la barrera, esta alteración parece reducir la carcinogénesis colorrectal impulsada por la inflamación al limitar la capacidad de las células madre residentes y la expansión de los clones premalignos (fig. 4H).

Un papel prescindible de la caspasa-3/7 epitelial en la lesión inducida por rayos X y el desarrollo del CCR inducido por AOM/DSS

Se ha asociado la abundancia y la actividad desreguladas de GPX4 con varias enfermedades intestinales, lo que indica que la ferroptosis es un posible objetivo terapéutico, pero faltan pruebas genéticas que respalden su implicación (^[20], ^[49]–^[51]). Aquí, nuestros datos indican que la deficiencia de GPX4 en las CEI no afecta el estado intestinal basal (fig. S3). No se observó ninguna diferencia en la susceptibilidad en el modelo de colitis por DSS, lo que descarta un papel para GPX4 (fig. 2H). Aparte de la colitis aguda, utilizamos además un modelo de irradiación de todo el abdomen, ya que se ha implicado la inducción de la ferroptosis en la muerte celular inducida por la radiación (^[52]–^[56]). La deficiencia de GPX4 epitelial no tiene un impacto patofisiológico significativo en la sensibilidad de la radiación del tracto gastrointestinal intacto, como lo demuestran las mediciones del peso corporal (fig. 5, A y B). Dado el posible papel supresor de tumores de la inducción de la ferroptosis en el CCR (^[57], ^[58]), examinamos si la deficiencia de Gpx4 en las CEI afectaría negativamente el desarrollo del CCR inducido por AOM/DSS. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia entre los controles y la deficiencia de GPX4 inducida por tamoxifeno en los ratones Gpx4iΔIEC, lo que sugiere que GPX4 no desempeña un papel crucial en la tumorigénesis AOM/DSS (fig. 5, C a G). En conjunto, nuestro estudio argumenta que GPX4 no es crucial en el epitelio intestinal durante la lesión inducida por la radiación y el desarrollo del CCR asociado a la inflamación.

DISCUSIÓN

La renovación de las CEI es un proceso estrechamente regulado que garantiza la integridad y la función del intestino. Si bien se ha reconocido durante mucho tiempo que la apoptosis es la principal forma de muerte de las CEI en condiciones fisiológicas y patológicas, los estudios recientes han sugerido que otras vías de muerte celular regulada, incluidas la necroptosis, la piroptosis y la ferroptosis, pueden desempeñar un papel dependiente del contexto durante la inflamación o la lesión intestinal (^[11]–^[13]). Sin embargo, la contribución relativa de cada modo de muerte celular, particularmente en las CEI durante la EII, aún no se comprende completamente. Utilizando un panel de modelos de ratón modificados genéticamente, identificamos la combinación de las caspasas 3 y 7 como un determinante crítico de la homeostasis de las CEI, la regeneración epitelial y la tolerancia inmunitaria durante la inflamación intestinal y la tumorigénesis.

Nuestra comparación de líneas de ratones deficientes en la muerte celular en un modelo de colitis por DSS estandarizado reveló un fenotipo inflamatorio exacerbado en los ratones Casp3/7ΔIEC, mientras que los ratones deficientes en la necroptosis (MlklΔIEC), la piroptosis (Gsdmd−/−), la necrosis secundaria/piroptosis (GsdmeΔIEC) o los reguladores de la ferroptosis (Gpx4iΔIEC) no mostraron diferencias significativas en comparación con los controles de la camada. Esto sugiere que, en estas condiciones, la apoptosis desempeña un papel no redundante y protector, mientras que otras vías de muerte son prescindibles o se ven compensadas eficazmente por mecanismos compensatorios. Los análisis transcriptómicos e histológicos proporcionaron información mecanicista sobre este fenotipo. Demostramos que los genes Casp3/7 son esenciales para mantener la proliferación de las CMI y las CTA durante la regeneración inducida por la lesión. A pesar de no observarse ningún fenotipo en condiciones basales (^[30]), los ratones Casp3/7ΔIEC exhiben una represión transcripcional de las vías del ciclo celular y una reducción de la expresión de los marcadores de proliferación después del DSS, particularmente dentro de los compartimentos de las CMI y las CTA, sin afectar a las líneas celulares epiteliales diferenciadas terminalmente. Esto sugiere un requisito selectivo para las caspasas 3/7 en la proliferación epitelial regenerativa, posiblemente a través de funciones no apoptóticas de las caspasas en la regulación del ciclo celular. Esto podría incluir el fenómeno de la proliferación compensatoria inducida por la apoptosis (AiP) (^[59], ^[60]).

Aunque se reconoció que la apoptosis mediada por caspasa-3/7 es una modalidad principal de muerte celular en este modelo, se observó un número comparable de células epiteliales intestinales (IEC) en proceso de muerte en los ratones Casp3/7ΔIEC y en los ratones de control, como lo demuestra la tinción con TUNEL y la viabilidad de los organoides. Para evaluar más a fondo si la naturaleza cualitativa de la muerte celular se alteró en los ratones Casp3/7ΔIEC, analizamos otros marcadores de muerte celular. La generación de p20 GSDMD debido al escisión de la caspasa-3/7 en Asp88 estuvo completamente ausente en las IEC Casp3/7ΔIEC. En contraste, la generación de p30 GSDMD se mantuvo en un nivel similar, lo que sugiere un nivel comparable de potencial de piroptosis tanto en los ratones Casp3/7ΔIEC como en sus hermanos de camada Casp3/7fl/fl. Sin embargo, la diferencia fenotípica en la colitis inducida por DSS entre las dos cepas sugiere que mecanismos adicionales mediados por la caspasa-3/7 podrían estar implicados en la inflamación intestinal crónica en el contexto de las IEC. Un menor potencial regenerativo puede afectar aún más la inflamación al perjudicar la renovación de la barrera. Paradójicamente, aunque los ratones Casp3/7ΔIEC sufrieron una colitis más grave, exhibieron una menor tumorigenesis asociada a la colitis en el modelo AOM/DSS. Este resultado subraya nuevamente el papel dual de la caspasa-3/7 en las IEC: por un lado, limitando la inflamación; por otro, apoyando paradójicamente la tumorigenesis al mantener la regeneración impulsada por las células madre. A pesar de la inflamación exacerbada, la reducción de la carga tumoral y la proliferación en los ratones Casp3/7ΔIEC sugieren que la reparación epitelial y la expansión clonal alteradas, en lugar de la inflamación mejorada, impulsan la progresión neoplásica en este entorno. La ausencia de expresión de la caspasa-3 y la caspasa-7 en los tumores confirmó su origen en los progenitores Casp3/7ΔIEC.

Aunque los mecanismos por los cuales la caspasa-3/7 regula la muerte celular y la proliferación se han investigado ampliamente in vitro, los estudios que utilizan huéspedes deficientes en caspasa-3/7 siguen siendo limitados en la investigación del cáncer (^[61]). Los ratones Casp3−/− y Casp7−/− son resistentes a la carcinogénesis cutánea inducida por DMBA/TPA, debido a la reducción de la inestabilidad genética mediada por la endonucleasa G (^[62]). Dado que la inestabilidad genómica es una característica del modelo de ratón AOM/DSS, en el que la carga de mutaciones somáticas es comparable a la del CRC humano con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) (^[63]), este mecanismo también puede contribuir al fenotipo de nuestros ratones Casp3/7ΔIEC, junto con un nivel más bajo de AiP (^[59], ^[60]).

GPX4 es el guardián de la ferroptosis y es fundamental para el desarrollo embrionario (^[64]–^[68]). Aunque los cachorros GPX4ΔIEC supervivientes nacieron más pequeños, alcanzaron un peso corporal similar a las 7 semanas y exhibieron una morfología normal del tracto gastrointestinal en comparación con sus hermanos de camada de control WT, lo que sugiere un papel redundante de la GPX4 epitelial en los ratones adultos en condiciones de estado estacionario. En línea con este hallazgo, nuestro estudio muestra que la inactivación inducible de GPX4 en el epitelio intestinal no tiene un impacto importante. La radiación ionizante induce una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno y peroxidación de lípidos, mientras que GPX4 convierte los hidroperóxidos de lípidos en alcoholes de lípidos, previniendo así la ferroptosis y mitigando el daño tisular (^[52], ^[67], ^[69], ^[70]). Se ha demostrado que la modulación farmacológica de la actividad o abundancia de GPX4 afecta la lesión intestinal inducida por la radiación ionizante, aunque la evidencia genética sigue siendo insuficiente (^[71], ^[72]). Los ratones que carecen de GPX4 en el epitelio no mostraron una actividad de la enfermedad más grave ni una recuperación retrasada. Como una modalidad de muerte celular descrita recientemente con mecanismos distintos, la terapia contra el cáncer inducida por la ferroptosis ha sido un tema muy investigado durante años, posiblemente mediante la focalización de GPX4 (^[73]–^[75]). La expresión de GPX4 está aumentada en el tejido de CRC, y su alta expresión se correlaciona con un mal pronóstico (^[76], ^[77]), lo que implica que GPX4 puede estar involucrada en el desarrollo del CRC. Sin embargo, nuestros resultados de AOM/DSS sugieren que la ausencia de GPX4 no tiene un impacto notable en el desarrollo del CRC, como lo demuestra el número y la carga tumoral comparables entre Gpx4iΔIEC y los controles. Estas observaciones sugieren que la focalización de GPX4 para enfermedades relacionadas con el tracto gastrointestinal debería reconsiderarse críticamente.

Desde una perspectiva traslacional, nuestros hallazgos proponen un marco que invita a la contemplación de la modulación de la actividad de la caspasa-3 y la caspasa-7 para proporcionar un beneficio terapéutico en la EII o el CRC asociado a la inflamación, dependiendo del contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se podría deducir de nuestros datos que el aumento de la actividad de la caspasa-3 y la caspasa-7 podría suprimir la piroptosis inflamatoria en la colitis activa, mientras que una inhibición más transitoria podría aprovechar las señales protectoras contra la toxicidad inducida por la quimioterapia (^[32]) o incluso limitar la hiperproliferación epitelial en el cáncer. Sin embargo, los roles no redundantes y altamente dependientes del contexto de la caspasa-3 y la caspasa-7 también advierten firmemente contra la focalización indiscriminada y, en cambio, abogan por estrategias específicas para el tipo de célula y la etapa de la enfermedad. En conclusión, nuestro estudio identifica que la caspasa-3 y la caspasa-7 son reguladores centrales del destino del epitelio intestinal, equilibrando la señalización inflamatoria y la capacidad regenerativa a través de un control dual de la proliferación de las células madre y la restricción inflamatoria (piroptótica). Estas ideas ofrecen una comprensión más matizada de la dinámica de la muerte celular en el epitelio intestinal y abren vías previamente inexploradas para intervenciones dirigidas en la EII y el CRC.

Limitaciones de este estudio

Este trabajo tiene varias limitaciones. Primero, nuestros resultados se generan principalmente en modelos de colitis inducida por DSS y tumorigenesis colorrectal impulsada por AOM/DSS, que, aunque se utilizan y validan ampliamente, no reflejan completamente la complejidad de la EII o el CRC humanos. En particular, en la EII, se han informado variantes genéticas que conducen a una propensión a sufrir necroptosis, lo que matiza el alcance de los experimentos basados en DSS en el contexto de este espectro de enfermedades. En segundo lugar, nuestro estudio utiliza un enfoque de eliminación condicional que limita la eliminación de Casp3/7 a las IEC que expresan Villin, descartando así un posible papel de los factores derivados de las células del estroma o del sistema inmunitario. Además, debe tenerse en cuenta que las diferentes eficiencias de recombinación, en función del tiempo o del método de eliminación temporalmente controlada, como se observa en nuestros modelos inducibles, como Gpx4iΔIEC, pueden impartir un grado de "variabilidad" a la especificidad de nuestros experimentos de ablación génica. En tercer lugar, si bien parece haber un deterioro definitivo en la proliferación, así como una "firma" inflamatoria distinta, según una variedad de análisis de expresión de ARN, aún no se ha resuelto qué vía o mecanismo, como la señalización no apoptótica, la expresión alterada de la proteína asociada a yes o AiP (^[24]–^[26]), parece modular la caspasa-3/7 la regulación de la homeostasis de las ISC.

Limitaciones de este estudio

Este trabajo tiene varias limitaciones. Primero, nuestros resultados se generan principalmente en modelos de colitis inducida por DSS y tumorigenesis colorrectal impulsada por AOM/DSS, que, aunque se utilizan y validan ampliamente, no reflejan completamente la complejidad de la EII o el CRC humanos. En particular, en la EII, se han informado variantes genéticas que conducen a una propensión a sufrir necroptosis, lo que matiza el alcance de los experimentos basados en DSS en el contexto de este espectro de enfermedades. En segundo lugar, nuestro estudio utiliza un enfoque de eliminación condicional que limita la eliminación de Casp3/7 a las IEC que expresan Villin, descartando así un posible papel de los factores derivados de las células del estroma o del sistema inmunitario. Además, debe tenerse en cuenta que las diferentes eficiencias de recombinación, en función del tiempo o del método de eliminación temporalmente controlada, como se observa en nuestros modelos inducibles, como Gpx4iΔIEC, pueden impartir un grado de "variabilidad" a la especificidad de nuestros experimentos de ablación génica. En tercer lugar, si bien parece haber un deterioro definitivo en la proliferación, así como una "firma" inflamatoria distinta, según una variedad de análisis de expresión de ARN, aún no se ha resuelto qué vía o mecanismo, como la señalización no apoptótica, la expresión alterada de la proteína asociada a yes o AiP (^[24]–^[26]), parece modular la caspasa-3/7 la regulación de la homeostasis de las ISC.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis de conjuntos de datos públicos

La superposición de los loci genéticos asociados a la EII y los loci de muerte celular se analizó tomando los loci anotados como asociados a la EII por Liu et al. (^[78]) y buscando la superposición con el conjunto de genes anotados como genes de muerte celular programada por GO, según se tomó de AmiGO 2 utilizando los filtros organismo: Homo sapiens y tipo: proteína. La superposición se determinó comparando conjuntos de símbolos de genes. La asociación adicional entre los genes de muerte celular y la EII se investigó utilizando datos de ARN-seq de pacientes con CU o CD y sus respectivos controles (^[79]–^[81]). El análisis de expresión diferencial se realizó descargando los recuentos brutos de Gene Expression Omnibus (GEO) y utilizando DESeq2 (v1.46.0) (^[82]). Los valores P en los gráficos de dispersión son valores P ajustados, según lo calculado por DESeq2. Las barras de error indican la desviación estándar. Por último, los datos de secuenciación de una sola célula de muestras de CU inducida por DSS en ratones (^[34], ^[35]) se procesaron utilizando Seurat (v5.2.0) (^[83]). El control de calidad se realizó calculando la expresión de genes mitocondriales utilizando la función PercentageFeatureSet y filtrando las células utilizando los siguientes umbrales: nFeatureRNA > 200, nFeatureRNA < 2500, percent.mt < 5. Posteriormente, los datos se normalizaron y escalaron utilizando lo siguiente: NormalizeData (SeuratOjb), FindVariableFeatures (SeuratObj, selection.method = "vst", nFeatures = 2000), ScaleData [SeuratObj, features = rownames(SeuratObj)]. Los mapas de calor representan los valores de expresión escalados promedio.

Ratones

Los ratones Casp3/7fl/fl (^[30]), Casp3/7/Mlklfl/fl (^[30]), Gpx4fl/fl (^[66]) y Gsdmd−/− (^[39], ^[40]) se describieron previamente. Los ratones Mlkl/−/− y Mlklfl/fl se obtuvieron de J. M. Murphy (Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research) (^[84]). Las células Dfna5tm1a(KOMP)Wtsi ES se obtuvieron del Programa Europeo de Mutagénesis Condicional de Ratones y se establecieron en un fondo C57Bl6. Los ratones Gsdmetm1a(KOMP)Wtsi se cruzaron con ratones C57BL/6-Tg(CAG-Flpo)1Afst/Ieg tg/+ para obtener el alelo Gsdmetm1c(KOMP)Wtsi con el gen "floxed". El alelo Gsdmetm1d(KOMP)Wtsi de eliminación se obtuvo cruzando ratones Gsdmetm1c(KOMP)Wtsi con ratones C57BL/6J-Edil3Tg(Sox2-cre)1Amc/J. Los ratones Casp3fl/fl y Casp7fl/fl se generaron cruzando ratones Casp3/7fl/fl con ratones WT. Los ratones Casp3/7ΔIEC, Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC, Casp3/7/MlklΔIEC, MlklΔIEC, GsdmeΔIEC y Gpx4+/−ΔIEC se obtuvieron cruzándolos con ratones Vil1-Cre. Los ratones Gpx4iΔIEC se obtuvieron cruzándolos con ratones Vil1-CreERT2. Para agotar Gpx4, los ratones Gpx4iΔIEC y de control se inyectaron por vía intraperitoneal con 2 mg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz el día 0 y el día 2, se eliminó Gpx4 y los ratones se sometieron a tratamiento a partir del día 9. Los ratones se criaron en el laboratorio utilizando pares de apareamiento heterocigotos para obtener transgénicos y controles de hermanos de camada WT en el Instituto Flamenco de Biotecnología (VIB) Centro de Investigación de la Inflamación en condiciones libres de patógenos específicos. Los ratones C57BL6/N WT se compraron a JANVIER LABS y se aclimataron durante al menos 1 semana antes del inicio de cualquier experimento. Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones animales institucionales, nacionales y europeas. El Comité de Ética local de la Universidad de Gante aprobó los protocolos de animales (números de aprobación del estudio: LP0024, 2025-003, 2025-037 y 2025-097). Se utilizaron hermanos de camada cohabitados y de la misma edad a lo largo de todo el estudio, excepto cuando se indica lo contrario.

Modelo de colitis inducida por DSS

Tanto los machos como las hembras, alojados juntos en la misma camada, recibieron sal de DSS al 2% o 3% (160110, MP Biomedicals) durante 3, 4 o 5 días, según lo indicado en el esquema experimental, seguido de agua potable normal hasta el final del experimento. Para evaluar la gravedad de la colitis, se controló diariamente la pérdida de peso corporal (20%, puntuación 4), la consistencia de las heces (normal, puntuación 0; blanda pero aún formada, puntuación 1; muy blanda, puntuación 2; diarrea, puntuación 3; diarrea disentérica, puntuación 4) y el sangrado (hemoculto negativo, puntuación 0; hemoculto positivo, puntuación 1; rastros de sangre en las heces visibles, puntuación 2; sangrado rectal leve, puntuación 3; sangrado rectal, puntuación 4). El DAI es la suma de los tres parámetros mencionados anteriormente (^[85]). Se recogieron heces en los días indicados. Se obtuvo suero mediante punción cardíaca tras la anestesia con ketamina/xilazina. Tras la dislocación cervical, se midió la longitud del intestino delgado y del colon, y se recogió el contenido intestinal. Para el tratamiento con disulfiram, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de disulfiram [50 mg/kg; HY-B0240, MedChemExpress (MCE)] o vehículo (10% de dimetilsulfóxido + 90% de aceite de maíz) durante el período indicado.

Modelo de irradiación de todo el abdomen

Tanto los machos como las hembras, alojados juntos en la misma camada, fueron anestesiados con ketamina y xilazina, y para evitar el fallo de la médula ósea e irradiar específicamente la cavidad abdominal, el resto del cuerpo de los ratones fue protegido con plomo. Se utilizó la irradiación con rayos X de todo el abdomen de 9 o 12 Gy para inducir diferentes niveles de lesión intestinal (Precision X-Ray), y se controlaron los ratones hasta el final del experimento.

Modelo de colitis asociada a CRC inducida por AOM/DSS

A los machos, alojados juntos en la misma camada, se les inyectó AOM (10 mg/kg; A5486, Sigma-Aldrich) por vía intraperitoneal el día 0. Una semana después, se administró a los ratones un 3% de DSS durante 3 días, seguido de 2 semanas de agua potable normal, lo que se repitió durante 2 o 3 ciclos, según lo indicado. Todos los ratones fueron sacrificados y disecados en el día indicado, se recogió el colon y se midieron los tumores. Se analizaron la histopatología y la inmunofluorescencia (IF).

Generación, tratamiento e imagenología in vivo de organoides intestinales

Los criptas cólicas se aislaron siguiendo un protocolo bien descrito con modificaciones (^[86]). Brevemente, se recogió el colon y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría para eliminar cualquier resto de contenido fecal, se abrió longitudinalmente y se cortó en trozos de aproximadamente 5 mm. Los trozos de tejido se incubaron en 10 ml de tampón de disociación intestinal [10 mM de EDTA, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1× de penicilina-estreptomicina y 10 mM de Hepes en PBS] a 4 °C durante 90 minutos con agitación suave. A continuación, los tejidos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos y se pipetearon 10 veces, pasándolos por un tamiz de 70 μm, y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se centrifugó a 100g durante 10 minutos y se recogió el pellet que contenía las criptas. El pellet se resuspendió con PBS y se contaron las criptas. Se tomaron un determinado número de criptas, se centrifugaron a 100g durante 5 minutos y se suspendieron con medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo (06005, STEMCELL) hasta obtener 1000 criptas por 50 μl. A continuación, las criptas se mezclaron con un volumen igual de Matrigel (356231, Corning) pipeteando 10 veces. Se pipetearon cuidadosamente 50 μl de la mezcla en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Tras la incubación a 37 °C y 5% de CO2 durante 10 minutos, se añadió 500 μl de medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo que contuviera 1× de penicilina-estreptomicina, 3 μM de CHIR99021 (HY-13076, MCE) y 10 μM de Y-27632 (HY-10071, MCE). El medio se renovó con medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo cada 2 días hasta el final del experimento. Para el ensayo de crecimiento de organoides, se capturaron imágenes de los organoides diariamente con Incucyte S3 (Sartorius). Para el ensayo de tratamiento con citocinas y DSS, se trataron los organoides cólicos con TNF murino (315-01A, Thermo Fisher Scientific) e interferón gamma murino (315-05, Thermo Fisher Scientific) o 0,001% de DSS el día 4.

Cuantificación de la viabilidad de los organoides

La tasa de muerte de los organoides se cuantificó utilizando Ilastik (versión 1.4.0). Se utilizó un flujo de trabajo de varios pasos que incluía lo siguiente: (i) clasificación de píxeles de autocontexto para generar mapas de probabilidad de contorno de los organoides; (ii) multicut para la segmentación basada en el contorno; y (iii) clasificación de objetos para categorizar los organoides segmentados como vivos o muertos. Se utilizaron modelos entrenados para el procesamiento por lotes (^[87]).

Endoscopia de colon de alta resolución

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se anestesiaron con un 2% de isoflurano. Se realizó una endoscopia de ratón de alta resolución según lo descrito anteriormente (^[88]) con el sistema endoscópico COLOVIEW (Karl Storz).

Ensayo de permeabilidad intestinal

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se les administró por sonda fluoresceína isotiocianato-dextrano 4 (600 mg/kg; 46944-100MG-F, Sigma-Aldrich), y 4 horas después, se midió la intensidad de fluorescencia del suero (excitación 490 nm/emisión 520 nm) con FLUOstar Omega (BMG LABTECH).

Histología, inmunohistoquímica e IF de tejidos

Los tejidos intestinales se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante la noche, se procesaron con el procesador de tejidos Shandon Citadel (Thermo Fisher Scientific) utilizando métodos estándar y se incluyeron en parafina. Los bloques de tejido se cortaron en secciones de 5 μm de grosor. Se realizaron la tinción con H&E y la tinción con azul de Alcian/ácido periódico-Schiff según lo descrito anteriormente (^[30]). Las secciones del intestino se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a la recuperación de epítopos inducida por calor para la recuperación del antígeno. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó utilizando un 3% de H2O2 en metanol, y la unión inespecífica se bloqueó con el tampón de bloqueo (5% de suero de cabra y 1% de albúmina sérica bovina en PBS). Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo específico que se dirige a Ki67 [1:1000; 12202S, Cell Signaling Technology (CST)] en el tampón de bloqueo. Posteriormente, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP) y las señales positivas se detectaron utilizando un kit DAB (DAB, Vector, Burlingame, CA). Por último, las secciones se contrateñeron con hematoxilina para su visualización. Para la IF, se realizó la tinción TUNEL según las instrucciones del fabricante (kit de detección de muerte celular in situ, TMR rojo, 12156792910, Roche). Se utilizaron procaspasa-3 (1:200; 9662S, CST), procaspasa-7 (preparada en el laboratorio, 1:200) y anticuerpo secundario anti-inmunoglobulina G de cabra AF546 (1:500; A-11035, Thermo Fisher Scientific). Las secciones se contrateñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (1 μg/ml; 62248, Thermo Fisher Scientific) durante 5 minutos para visualizar los núcleos. Tras pasos de lavado adicionales, las secciones se montaron con un medio de montaje y cubreobjetos. La imagen de IF se adquirió utilizando un Zeiss AxioScan Z1.

Microscopía electrónica de transmisión

El tejido del colon distal del ratón se cortó en pequeños trozos, se sumergió en una solución fijadora de 2,5% de glutaraldehído y 3% de formaldehído en un tampón de Na-cacodilato 0,1 M, se colocó en un horno de vacío durante 30 minutos y se dejó girando durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, esta solución se reemplazó por una solución fijadora fresca y las muestras se dejaron girando durante la noche a 4 °C. Tras el lavado, las muestras se postfijaron en 1% de OsO4 con K3Fe(CN)6 en un tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,2). Tras el lavado en agua destilada doble, las muestras se deshidrataron sucesivamente en una serie de etanol (EtOH) con concentraciones crecientes, incluido un tratamiento con un 2% de acetato de uranilo en el paso de EtOH al 50%, y luego se incluyeron en resina de Spurr. Para seleccionar el área de interés en el bloque y obtener una visión general del fenotipo, primero se cortaron secciones delgadas a 0,5 μm y se tiñeron con azul de toluidina. Las secciones ultrafinas de color de interferencia dorada se cortaron utilizando un ultramicrotomo (Leica EM UC6), y a continuación se sometieron a un post-tratamiento en un Leica EM AC20 durante 40 minutos en acetato de uranilo a 20 °C y durante 10 minutos en tinte de plomo a 20 °C. Las secciones se recogieron en rejillas de cobre recubiertas con formvar. Las rejillas se observaron con un microscopio electrónico de transmisión JEM 1400plus (JEOL, Tokio, Japón) que funcionaba a 80 kV.

Microscopía electrónica de barrido

El método se describió en detalle anteriormente (^[30]). Las muestras de colon recién aisladas se incubaron en un fijador recién preparado [2% de paraformaldehído [Electron Microscopy Sciences (EMS)] y 2,5% de glutaraldehído (EMS) en un tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (EMS) (pH 7,4)] durante la noche a 4 °C. Tras el lavado 5 × 3 minutos en un tampón de cacodilato 0,1 M, las muestras se incubaron en un 2% de OsO4 (EMS) en un tampón de cacodilato 0,1 M durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se lavaron en H2O durante 3 × 5 minutos y se deshidrataron utilizando soluciones de concentración creciente de EtOH (50, 70, 85, 95 y 2 × 100%) durante 15 minutos cada una. A continuación, las muestras se deshidrataron en EtOH:acetona (1:1) durante 15 minutos, seguido de acetona al 100% durante 15 minutos. Las muestras se secaron a continuación en un secador de puntos críticos (Leica EM CPD300) y se montaron en un soporte de aluminio (EMS) utilizando cinta adhesiva de carbono (EMS); a continuación, las muestras se recubrieron con 5 nm de platino (Quorum Q150T ES). La imagen SEM 5 se realizó utilizando un Zeiss Crossbeam 540.

Aislamiento de células epiteliales intestinales (IEC)

Brevemente, se recogió el colon distal y se lavó con PBS frío para eliminar cualquier resto de contenido fecal, se abrió longitudinalmente y se cortó en trozos pequeños de aproximadamente 3 mm. Los trozos de tejido se incubaron en 10 ml de tampón de aislamiento de IEC (5 mM de EDTA, 1 μM de emricasan, 10 μM de Y-27632, 1 mM de DTT, 10 mM de Hepes y penicilina-estreptomicina en PBS) a 4 °C durante 90 minutos con agitación suave. A continuación, los tejidos se agitaron vigorosamente durante 5 segundos y se pasaron por un tamiz de 1000 μm (43-51000-50, pluriSelect), y se recogió el sobrenadante. Los tejidos se transfirieron a un tubo nuevo que contenía 10 ml de PBS frío, se agitaron durante 30 segundos y se pipetearon 10 veces con pipetas serológicas prehumedecidas, y tras pasar por un tamiz de 1000 μm y recoger el sobrenadante, se descartaron los tejidos restantes. El sobrenadante se centrifugó a 600g durante 10 minutos a 4 °C y se recogió el pellet. El pellet se resuspendió en 10 ml de PBS frío y se pasó por un tamiz de 70 μm. Esta suspensión se centrifugó a 600g durante 10 minutos a 4 °C y se recogieron las IEC del pellet para su posterior análisis.

Extracción de ARN de ratón y RT-qPCR

Para la extracción de ARN del tejido del colon, se colocó un colon distal de 5 mm en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenía una cuenta de acero inoxidable (5 mm de diámetro medio), se añadió 150 μl de tampón RLT por tubo y se hizo funcionar el TissueLyser II durante 5 minutos a 20 Hz para generar un homogeneizado de tejido. El homogeneizado se mantuvo en hielo durante 10 minutos, se centrifugó a 12 000g durante 10 minutos a 4 °C y se recogió el sobrenadante. Para la extracción de ARN de las IEC, el pellet que contenía las IEC se lisó directamente con 150 μl de tampón RLT. A continuación, se aisló el ARN total utilizando el kit RNeasy Micro (74004, QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ADNc, se transcribió inversamente de 200 a 1000 ng de ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc Sensifast (BIO-65054, GC Biotech BV). Se realizó una reacción de cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para analizar los niveles de expresión de genes específicos. Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo utilizando el Roche LightCycler 480 con el kit SensiFAST SYBR No-ROX (BIO-98020, GC Biotech BV).

Los niveles de expresión relativos de los genes diana se determinaron utilizando el método comparativo CT (umbral del ciclo). Los datos de expresión se normalizaron con el control interno Actb o Hprt. Los primers de qPCR utilizados en este estudio se proporcionan en los Materiales Suplementarios (tabla S1).

RNA-seq a granel

Se procesaron cien nanogramos de ARN total en Novogene para la secuenciación masiva de ARNm. Las muestras (ARN aislado del tejido del colon o de las células epiteliales del colon (Casp3/7ΔIEC) de ratones y sus controles de la camada) se secuenciaron utilizando la secuenciación Illumina de doble extremo (150 nt). El conjunto de muestras de células epiteliales del colon (cinco controles WT, cinco controles transgénicos, cinco WT-DSS y cinco transgénicos-DSS) se procesó recortando las lecturas utilizando Trimmomatic (v0.39) (^[89]) con la siguiente configuración de parámetros: ILLUMINACLIP:“adapters.fa”:3:30:10:2:True, SLIDINGWINDOW:5:20, MINLEN:36. Las secuencias de los adaptadores en el archivo fasta son AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT (sentido) y GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGATGACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG (antisentido). El mapeo de las lecturas se realizó utilizando STAR (v2.7.8a) (^[90]) en el genoma del ratón GRCm39. Solo se conservaron las lecturas mapeadas de forma única estableciendo --outFilterMultimapNmax 1.

Los archivos BAM se leyeron en un entorno R (v4.4) y se creó una tabla de recuentos utilizando la función SummarizeOverlaps (modo = “Union”) del paquete GenomicAlignments (^[91]) y la anotación de genes GRCm39 de la versión 106 de Ensembl. Se excluyeron las muestras de un WT DSS y un DSS transgénico (DSSSeq112 y DSSSeq115) basándose en el análisis de componentes principales. Se utilizó DESeq2 (^[82]) para el análisis de expresión diferencial. Por último, se realizó un análisis GSEA en los genes expresados diferencialmente (|cambio log2| > 0,5, valor P ajustado < 0,05) utilizando el paquete fgsea (^[92]) con los conjuntos de genes característicos de la base de datos de firmas moleculares (MSIGDB) (^[93]). El conjunto de muestras de tejido del colon (cinco día 0–WT, seis día 0–transgénicos, cinco día 8–WT y seis día 8–transgénicos) se procesó de forma similar con los siguientes cambios: se omitió el paso de recorte y el análisis de DESeq2 se realizó por punto temporal en lugar de en todas las muestras a la vez.

Western blotting

Las células se lisaron en un tampón de lisis para el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contenía cóctel de inhibidores de proteasas (5056489001, Sigma-Aldrich) y PhosSTOP (4906837001, Sigma-Aldrich) durante 30 minutos sobre hielo y se centrifugaron a 12.000g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de ácido bicinquinónico y luego se diluyeron con el tampón RIPA para obtener una concentración igual. A continuación, las muestras se mezclaron con el tampón de Laemmli, se hirvieron a 95 °C durante 10 minutos, se cargaron en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Después del bloqueo, las proteínas se sondearon con los siguientes anticuerpos primarios: caspasa-1 (1:2000; VIB Core), caspasa-3 (1:1000; 9662, CST), caspasa-7 (1:1000; 9492S, CST), caspasa-8 (1:1000; MAB3429, Abnova), clcaspasa-8 (1:1000; 9429, CST), caspasa-9 (1:1000; 9508, CST), caspasa-11 (1:200; NB120-10454, NOVUS), pRIPK1 (Ser166) (1:1000; 53286S, CST), RIPK1 (1:1000; 3493, CST), pRIPK3 (Thr231/Ser232) (1:1000; 57220, CST), pMLKL (Ser345) (1:1000; 37333, CST), MLKL (1:1000; MABC604, Millipore), GSDMD (1:1000; ab209845, Abcam), GSDME (1:500; 13075-1-AP, Proteintech), GPX4 (1:5000; ab125066, Abcam), vinculina (1:200; V9131, Sigma-Aldrich), β-tubulina HRP (1:10.000; ab21058, Abcam) y β-actina HRP (1:5000; 5125, CST); seguido de la incubación con anticuerpo secundario conjugado con HRP (GE Healthcare). La detección se realizó con el kit de quimioluminiscencia Western Lightning plus (NEL105001EA, PerkinElmer). Los fibroblastos embrionarios murinos inmortalizados, utilizados como controles positivos, se crearon internamente. Los macrófagos derivados de la médula ósea se obtuvieron de la médula ósea del ratón con factor estimulante de colonias de macrófagos.

Análisis estadístico

Las células Ki67 positivas y las células TUNEL positivas se cuantificaron basándose en la región de interés seleccionada en el software QuPath, en relación con el área elegida. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8.0. El número de réplicas (n) en las leyendas de las figuras se refiere a las réplicas biológicas, a menos que se indique lo contrario. El número de experimentos independientes se menciona en las leyendas de las figuras correspondientes. Todos los datos se expresan como medias ± SEM o DE, según se indique. Las comparaciones de grupos se analizaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no pareadas si se evaluaron dos condiciones y análisis de varianza (ANOVA) de una vía si se evaluaron tres condiciones. Los cambios a lo largo del tiempo, como el peso corporal, se probaron utilizando ANOVA de dos vías o análisis de modelo de efectos mixtos (máxima verosimilitud restringida) si faltaban puntos de datos. Los valores P se indicaron en cada comparación. En lo que respecta a las pruebas estadísticas de los datos de los ratones, se realizó una aleatorización para la asignación de los ratones. No se realizó un cegamiento durante las mediciones. El tamaño de la muestra se calculó mediante análisis de potencia o basándose en la disponibilidad.

Análisis de conjuntos de datos públicos

La superposición de los loci genéticos asociados con la EII y los loci de muerte celular se analizó tomando los loci anotados como asociados con la EII por Liu et al. (^[78]) y buscando la superposición con el conjunto de genes anotados como genes de muerte celular programada por GO, tal como se obtuvo de AmiGO 2 utilizando los filtros organismo: Homo sapiens y tipo: proteína. La superposición se determinó comparando conjuntos de símbolos de genes. Se investigó más a fondo la asociación entre los genes de muerte celular y la EII utilizando datos de secuenciación de ARN de pacientes con CU o CD y sus respectivos controles (^[79]–^[81]). El análisis de expresión diferencial se realizó descargando los recuentos brutos de Gene Expression Omnibus (GEO) y utilizando DESeq2 (v1.46.0) (^[82]). Los valores P en los diagramas de dispersión son valores P ajustados, tal como se calculan mediante DESeq2. Las barras de error indican la DE. Por último, los datos de secuenciación de una sola célula de muestras de CU inducida por DSS en ratones (^[34], ^[35]) se procesaron utilizando Seurat (v5.2.0) (^[83]). El control de calidad se realizó calculando la expresión de genes mitocondriales utilizando la función PercentageFeatureSet y filtrando las células utilizando los siguientes umbrales: nFeatureRNA > 200, nFeatureRNA < 2500, percent.mt < 5. Posteriormente, los datos se normalizaron y escalaron utilizando lo siguiente: NormalizeData (SeuratOjb), FindVariableFeatures (SeuratObj, selection.method = “vst”, nFeatures = 2000), ScaleData [SeuratObj, features = rownames(SeuratObj)]. Los mapas de calor representan los valores de expresión escalados promedio.

Ratones

Casp3/7fl/fl (^[30]), Casp3/7/Mlklfl/fl (^[30]), Gpx4fl/fl (^[66]) y Gsdmd−/− (^[39], ^[40]) se describieron previamente. Los ratones Mlkl/−/− y Mlklfl/fl se obtuvieron de J. M. Murphy (Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research) (^[84]). Las células ES Dfna5tm1a(KOMP)Wtsi se obtuvieron del Programa Europeo de Mutagénesis Condicional de Ratones y se establecieron en un fondo C57Bl6. Los ratones Gsdmetm1a(KOMP)Wtsi se cruzaron con ratones C57BL/6-Tg(CAG-Flpo)1Afst/Ieg tg/+ para obtener el alelo Gsdmetm1c(KOMP)Wtsi con el gen Gsdme con promotor floxed. El alelo Gsdmetm1d(KOMP)Wtsi con el gen Gsdme knockout se obtuvo cruzando ratones Gsdmetm1c(KOMP)Wtsi con ratones C57BL/6J-Edil3Tg(Sox2-cre)1Amc/J. Los ratones Casp3fl/fl y Casp7fl/fl se generaron cruzando ratones Casp3/7fl/fl con ratones WT. Los ratones Casp3/7ΔIEC, Casp3ΔIEC, Casp7ΔIEC, Casp3/7/MlklΔIEC, MlklΔIEC, GsdmeΔIEC y Gpx4+/−ΔIEC se obtuvieron cruzándolos con ratones Vil1-Cre. Los ratones Gpx4iΔIEC se obtuvieron cruzándolos con ratones Vil1-CreERT2. Para agotar Gpx4, los ratones Gpx4iΔIEC y los controles se inyectaron por vía intraperitoneal con 2 mg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz el día 0 y el día 2, se desactivó Gpx4 y los ratones se sometieron a tratamiento a partir del día 9. Los ratones se criaron internamente utilizando pares de reproducción heterocigotos para obtener ratones transgénicos y controles de la camada en el Centro de Investigación de la Inflamación del Instituto Flamenco de Biotecnología (VIB) en condiciones libres de patógenos específicos. Los ratones C57BL6/N WT se compraron a JANVIER LABS y se aclimataron durante al menos 1 semana antes del inicio de cualquier experimento. Todos los experimentos en ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones animales institucionales, nacionales y europeas. El Comité de Ética local de la Universidad de Gante aprobó los protocolos animales (números de aprobación del estudio: LP0024, 2025-003, 2025-037 y 2025-097). Se utilizaron compañeros de camada de la misma edad y sexo durante todo el estudio, excepto cuando se indica lo contrario.

Modelo de colitis inducida por DSS

Tanto los compañeros de camada machos como las hembras recibieron sal de DSS al 2 o 3% (160110, MP Biomedicals) durante 3, 4 o 5 días, según lo indicado en el esquema experimental, seguido de agua potable normal hasta el final del experimento. Para evaluar la gravedad de la colitis, se controlaron diariamente la pérdida de peso (20%, puntuación 4), la consistencia de las heces (normal, puntuación 0; blanda pero aún formada, puntuación 1; muy blanda, puntuación 2; diarrea, puntuación 3; diarrea disentérica, puntuación 4) y el sangrado (hemocultivo negativo, puntuación 0; hemocultivo positivo, puntuación 1; rastros de sangre en las heces visibles, puntuación 2; sangrado rectal leve, puntuación 3; sangrado rectal, puntuación 4). El DAI es la suma de los tres parámetros mencionados anteriormente (^[85]). Se recogieron heces en los días indicados. Se recogió suero mediante punción cardíaca después de la anestesia con ketamina/xilazina. Después de la dislocación cervical, se midió la longitud del intestino delgado y del colon, y se recogió el contenido intestinal. Para el tratamiento con disulfiram, se inyectó por vía intraperitoneal a los ratones disulfiram [50 mg/kg; HY-B0240, MedChemExpress (MCE)] o vehículo (10% de dimetilsulfóxido + 90% de aceite de maíz) durante el período indicado.

Modelo de irradiación abdominal total

Tanto los compañeros de camada machos como las hembras se anestesiaron con ketamina y xilazina, y para evitar el fallo de la médula ósea e irradiar específicamente la cavidad abdominal, el resto del cuerpo del ratón se protegió con plomo. Se utilizó la irradiación de rayos X de todo el abdomen de 9 o 12 Gy para inducir diferentes niveles de lesión intestinal (Precision X-Ray) y se controlaron los ratones hasta el final del experimento.

Modelo de CRC asociado a colitis inducido por AOM/DSS

Se inyectó por vía intraperitoneal a los compañeros de camada machos AOM (10 mg/kg; A5486, Sigma-Aldrich) el día 0. Una semana después, se administró a los ratones un 3% de DSS durante 3 días, seguido de 2 semanas de agua potable normal, lo que se repitió durante 2 o 3 ciclos, según se indica. Todos los ratones se sacrificaron y se disecaron en el día indicado, se recogió el colon y se midieron los tumores. Se analizaron la histopatología y la inmunofluorescencia (IF).

Generación, tratamiento e imagen in vivo de organoides intestinales

Se aislaron criptas cólicas basándose en un protocolo bien descrito con modificaciones (^[86]). Brevemente, se recogió el colon, se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría para eliminar cualquier resto de contenido fecal, se abrió longitudinalmente y se cortó en trozos de aproximadamente 5 mm. Los trozos de tejido se incubaron en 10 ml de tampón de disociación intestinal [10 mM de EDTA, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1× de penicilina-estreptomicina y 10 mM de Hepes en PBS] a 4 °C durante 90 minutos con agitación suave. A continuación, los tejidos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos y se pipetearon repetidamente durante 10 veces, pasándolos por el tamiz de 70 μm, y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se centrifugó a 100g durante 10 minutos y se recogió el precipitado que contenía las criptas. El precipitado se resuspendió en PBS y se contaron las criptas. Se tomaron un determinado número de criptas, se centrifugaron a 100g durante 5 minutos y se suspendieron en medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo (06005, STEMCELL) hasta obtener 1000 criptas por 50 μl. A continuación, las criptas se mezclaron con un volumen igual de Matrigel (356231, Corning) pipeteando repetidamente durante 10 veces. Cincuenta microlitros de la mezcla se pipetearon cuidadosamente en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de incubar a 37 °C y 5 % de CO2 durante 10 minutos, se añadieron 500 μl de medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo que contenía 1× de penicilina-estreptomicina, 3 μM de CHIR99021 (HY-13076, MCE) y 10 μM de Y-27632 (HY-10071, MCE). El medio se renovó con medio de crecimiento de organoides IntestiCult completo cada 2 días hasta el final del experimento. Para el ensayo de crecimiento de organoides, se capturaron imágenes de los organoides diariamente con Incucyte S3 (Sartorius). Para el ensayo de tratamiento con citocinas y DSS, se trataron los organoides cólicos con TNF murino (315-01A, Thermo Fisher Scientific) e interferón gamma murino (315-05, Thermo Fisher Scientific) o 0,001 % de DSS en el día 4.

Cuantificación de la viabilidad de los organoides

La tasa de muerte de los organoides se cuantificó utilizando Ilastik (versión 1.4.0). Se utilizó un flujo de trabajo de varios pasos que incluyó lo siguiente: (i) clasificación de píxeles de autocontexto para generar mapas de probabilidad de los límites de los organoides; (ii) multicut para la segmentación basada en límites; y (iii) clasificación de objetos para categorizar los organoides segmentados como vivos o muertos. Se utilizaron modelos entrenados para el procesamiento por lotes (^[87]).

Endoscopia de colon de alta resolución

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se anestesiaron con un 2 % de isoflurano. Se realizó una endoscopia de ratón de alta resolución según lo descrito anteriormente (^[88]) con el sistema endoscópico COLOVIEW (Karl Storz).

Ensayo de permeabilidad intestinal

Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se les administró por sonda fluoresceína isotiocianato-dextrano 4 (600 mg/kg; 46944-100MG-F, Sigma-Aldrich), y 4 horas después, se midió la intensidad de fluorescencia del suero (excitación 490 nm/emisión 520 nm) con FLUOstar Omega (BMG LABTECH).

Histología tisular, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Los tejidos intestinales se fijaron en un 4 % de paraformaldehído durante la noche, se procesaron con el procesador de tejidos Shandon Citadel (Thermo Fisher Scientific) utilizando métodos estándar y se incluyeron en parafina. Los bloques de tejido se cortaron en secciones de 5 μm de espesor. Se realizaron la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción con azul de Alcian/ácido periódico-Schiff según lo descrito anteriormente (^[30]). Las secciones del intestino se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a la recuperación de epítopos inducida por calor para la recuperación del antígeno. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó utilizando un 3 % de H2O2 en metanol, y la unión inespecífica se bloqueó con el tampón de bloqueo (5 % de suero de cabra y 1 % de albúmina sérica bovina en PBS). Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo específico que se dirige a Ki67 [1:1000; 12202S, Cell Signaling Technology (CST)] en el tampón de bloqueo. Posteriormente, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) y las señales positivas se detectaron utilizando un kit DAB (DAB, Vector, Burlingame, CA). Por último, las secciones se contrateñeron con hematoxilina para su visualización. Para la inmunofluorescencia, se realizó la tinción TUNEL según las instrucciones del fabricante (In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red, 12156792910, Roche). Se utilizaron procaspasa-3 (1:200; 9662S, CST), procaspasa-7 (preparada en el laboratorio, 1:200) y anticuerpo secundario de inmunoglobulina G de cabra AF546 (1:500; A-11035, Thermo Fisher Scientific). Las secciones se contrateñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (1 μg/ml; 62248, Thermo Fisher Scientific) para visualizar los núcleos durante 5 minutos. Después de pasos de lavado adicionales, las secciones se montaron con un medio de montaje y cubreobjetos. La imagen de inmunofluorescencia se adquirió utilizando Zeiss AxioScan Z1.

Microscopía electrónica de transmisión

El tejido del colon distal del ratón se cortó en trozos pequeños, se sumergió en una solución fijadora de 2,5 % de glutaraldehído y 3 % de formaldehído en un tampón de 0,1 M de Na-cacodilato, se colocó en un horno de vacío durante 30 minutos y se dejó rotando durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, esta solución se reemplazó por una solución fijadora fresca y las muestras se dejaron rotando durante la noche a 4 °C. Después del lavado, las muestras se postfijaron en 1 % de OsO4 con K3Fe(CN)6 en un tampón de 0,1 M de Na-cacodilato (pH 7,2). Después del lavado en agua destilada doble, las muestras se deshidrataron posteriormente a través de una serie de etanol (EtOH) graduado, incluido un tinte masivo con 2 % de acetato de uranilo en el paso de 50 % de EtOH, seguido de la inclusión en resina de Spurr. Para seleccionar el área de interés en el bloque y obtener una visión general del fenotipo, primero se cortaron secciones delgadas a 0,5 μm y se tiñeron con azul de toluidina. Las secciones ultrafinas de color de interferencia dorado se cortaron utilizando un ultramicrotomo (Leica EM UC6), seguidas de una posttinción en un Leica EM AC20 durante 40 minutos en acetato de uranilo a 20 °C y durante 10 minutos en tinte de plomo a 20 °C. Las secciones se recogieron en rejillas de cobre recubiertas con formvar. Las rejillas se observaron con un microscopio electrónico de transmisión JEM 1400plus (JEOL, Tokio, Japón) que funcionaba a 80 kV.

Microscopía electrónica de barrido

El método se describió en detalle anteriormente (^[30]). Las muestras de colon recién aisladas se incubaron en un fijador recién preparado [2 % de paraformaldehído [Electron Microscopy Sciences (EMS)] y 2,5 % de glutaraldehído (EMS) en un tampón de 0,1 M de cacodilato de sodio (EMS) (pH 7,4)] durante la noche a 4 °C. Después de lavar 5 × 3 minutos en un tampón de 0,1 M de cacodilato, las muestras se incubaron en 2 % de osmio (OsO4, EMS) en un tampón de 0,1 M de cacodilato durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se lavaron en H2O durante 3 × 5 minutos y se deshidrataron utilizando soluciones de concentración creciente de EtOH (50, 70, 85, 95 y 2 × 100 %) durante 15 minutos cada una. A continuación, las muestras se deshidrataron en EtOH:acetona (1:1) durante 15 minutos, seguido de 100 % de acetona durante 15 minutos. Las muestras se secaron en un secador de puntos críticos (Leica EM CPD300) y se montaron en un portaobjetos de aluminio (EMS) utilizando cinta adhesiva de carbono (EMS); posteriormente, las muestras se recubrieron con 5 nm de platino (Quorum Q150T ES). La imagen SEM se realizó utilizando un Zeiss Crossbeam 540.

Aislamiento de células epiteliales intestinales

Brevemente, se recogió el colon distal, se lavó con PBS frío para eliminar cualquier resto de contenido fecal, se abrió longitudinalmente y se cortó en trozos pequeños de aproximadamente 3 mm. Los trozos de tejido se incubaron en 10 ml de tampón de aislamiento de células epiteliales intestinales (5 mM de EDTA, 1 μM de emricasan, 10 μM de Y-27632, 1 mM de DTT, 10 mM de Hepes y penicilina-estreptomicina en PBS) a 4 °C durante 90 minutos con agitación suave. A continuación, los tejidos se agitaron vigorosamente durante 5 segundos y se pasaron por un tamiz de 1000 μm (43-51000-50, pluriSelect), y se recogió el sobrenadante. Los tejidos se transfirieron a un tubo nuevo que contenía 10 ml de PBS frío, se agitaron durante 30 segundos y se pipetearon repetidamente 10 veces con pipetas serológicas prehumedecidas, y después de pasar por un tamiz de 1000 μm y recoger el sobrenadante, se descartaron los tejidos restantes. El sobrenadante se centrifugó a 600g durante 10 minutos a 4 °C y se recogió el precipitado. El precipitado se resuspendió en 10 ml de PBS frío y se pasó por un tamiz de 70 μm. Esta suspensión se centrifugó a 600g durante 10 minutos a 4 °C y se recogieron las células epiteliales intestinales del precipitado para su posterior análisis.

Extracción de ARN de ratón y RT-qPCR

Para la extracción de ARN del tejido del colon, se colocó un colon distal de 5 mm en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenía una cuenta de acero inoxidable (5 mm de diámetro medio), se añadieron 150 μl de tampón RLT por tubo y se hizo funcionar el TissueLyser II durante 5 minutos a 20 Hz para generar un homogeneizado de tejido. El homogeneizado se mantuvo en hielo durante 10 minutos, se centrifugó a 12 000g durante 10 minutos a 4 °C y se recogió el sobrenadante. Para la extracción de ARN de las células epiteliales intestinales, el precipitado que contenía las células epiteliales se lisó directamente con 150 μl de tampón RLT. A continuación, se aisló el ARN total utilizando el kit RNeasy Micro (74004, QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ADNc, se transcribió inversamente de 200 a 1000 ng de ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc Sensifast (BIO-65054, GC Biotech BV). Se realizó una reacción de cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para analizar los niveles de expresión de genes específicos. Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo utilizando el Roche LightCycler 480 con el kit SensiFAST SYBR No-ROX (BIO-98020, GC Biotech BV).

Los niveles de expresión relativos de los genes diana se determinaron utilizando el método comparativo CT (umbral del ciclo). Los datos de expresión se normalizaron con el control interno Actb o Hprt. Los materiales suplementarios (tabla S1) proporcionan los cebadores de qPCR utilizados en este estudio.

RNA-seq masivo

Se procesaron 100 nanogramos de ARN total por Novogene para la secuenciación masiva de ARNm. Las muestras (ARN aislado del tejido del colon o de las células epiteliales del colon de ratones Casp3/7ΔIEC y controles de la camada) se secuenciaron utilizando la secuenciación Illumina de doble extremo (150 nt). El conjunto de muestras de células epiteliales (cinco WT-control, cinco transgénicos-control, cinco WT-DSS y cinco transgénicos-DSS) se procesó recortando las lecturas utilizando Trimmomatic (v0.39) (^[89]) con la siguiente configuración de parámetros: ILLUMINACLIP:“adapters.fa”:3:30:10:2:True, SLIDINGWINDOW:5:20, MINLEN:36. Las secuencias de los adaptadores en el archivo fasta son AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT (directo) y GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGATGACTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG (reverso). El mapeo de las lecturas se realizó utilizando STAR (v2.7.8a) (^[90]) en el genoma de ratón GRCm39. Solo se conservaron las lecturas mapeadas de forma única estableciendo --outFilterMultimapNmax 1.

Los archivos BAM se leyeron en un entorno R (v4.4) y se creó una tabla de recuentos utilizando la función SummarizeOverlaps (modo = “Union”) del paquete GenomicAlignments (^[91]) y la anotación de genes GRCm39 de Ensembl versión 106. Se excluyeron una muestra WT DSS y una muestra transgénica DSS (DSSSeq112 y DSSSeq115) basándose en el análisis de componentes principales. Se utilizó DESeq2 (^[82]) para el análisis de expresión diferencial. Por último, se realizó un análisis GSEA en los genes expresados diferencialmente (|log2fold change| > 0,5, valor p ajustado < 0,05) utilizando el paquete fgsea (^[92]) con el conjunto de genes de la base de datos de firmas moleculares (MSIGDB) (^[93]). El conjunto de muestras de tejido del colon (cinco WT-día 0, seis transgénicos-día 0, cinco WT-día 8 y seis transgénicos-día 8) se procesó de forma similar con los siguientes cambios: se omitió el paso de recorte y el análisis de DESeq2 se realizó por punto de tiempo en lugar de en todas las muestras a la vez.

Western blot

Las células se lisaron en tampón de lisis para el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA), que contenía cóctel de inhibidores de proteasas (5056489001, Sigma-Aldrich) y PhosSTOP (4906837001, Sigma-Aldrich) durante 30 minutos sobre hielo y se centrifugaron a 12.000g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo de ácido bicinquinónico y, a continuación, se diluyeron con tampón RIPA para obtener una concentración igual. A continuación, las muestras se mezclaron con tampón de Laemmli, se hirvieron a 95 °C durante 10 minutos y se cargaron en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Después del bloqueo, las proteínas se analizaron con los siguientes anticuerpos primarios: caspasa-1 (1:2000; VIB Core), caspasa-3 (1:1000; 9662, CST), caspasa-7 (1:1000; 9492S, CST), caspasa-8 (1:1000; MAB3429, Abnova), caspasa-8 truncada (1:1000; 9429, CST), caspasa-9 (1:1000; 9508, CST), caspasa-11 (1:200; NB120-10454, NOVUS), pRIPK1 (Ser166) (1:1000; 53286S, CST), RIPK1 (1:1000; 3493, CST), pRIPK3 (Thr231/Ser232) (1:1000; 57220, CST), pMLKL (Ser345) (1:1000; 37333, CST), MLKL (1:1000; MABC604, Millipore), GSDMD (1:1000; ab209845, Abcam), GSDME (1:500; 13075-1-AP, Proteintech), GPX4 (1:5000; ab125066, Abcam), vinculina (1:200; V9131, Sigma-Aldrich), β-tubulina HRP (1:10.000; ab21058, Abcam) y β-actina HRP (1:5000; 5125, CST); seguido de la incubación con anticuerpo secundario conjugado con HRP (GE Healthcare). La detección se realizó con el kit de reactivo quimioluminiscente Western Lightning (NEL105001EA, PerkinElmer). Los fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados, utilizados como controles positivos, se crearon internamente. Los macrófagos derivados de la médula ósea se obtuvieron a partir de la médula ósea de ratón con factor estimulante de colonias de macrófagos.

Análisis estadístico

Las células Ki67 positivas y las células TUNEL positivas se cuantificaron en función de la región de interés seleccionada en el software QuPath, en relación con el área elegida. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8.0. El número de réplicas (n) en las leyendas de las figuras se refiere a las réplicas biológicas, a menos que se especifique lo contrario. El número de experimentos independientes se indica en las leyendas de las figuras correspondientes. Todos los datos se expresan como medias ± SEM o DE, según corresponda. Las comparaciones de grupos se analizaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no pareadas si se evaluaron dos condiciones y análisis de varianza (ANOVA) de una vía si se evaluaron tres condiciones. Los cambios a lo largo del tiempo, como el peso corporal, se analizaron utilizando ANOVA de dos vías o análisis de modelo de efectos mixtos (máxima verosimilitud restringida) si faltaban puntos de datos. Los valores P se indicaron en cada comparación. En lo que respecta a las pruebas estadísticas de los datos de ratones, se realizó una aleatorización para la asignación de ratones. No se realizó un enmascaramiento durante las mediciones. El tamaño de la muestra se calculó mediante análisis de potencia o en función de la disponibilidad.