La expansión de antígenos media la erradicación heterogénea de tumores sólidos mediante células CAR-T programadas con un agente desmetilante del ADN.

Las células T modificadas con receptores quiméricos de antígenos (CAR T) han experimentado avances rápidos en los últimos años, demostrando una notable eficacia clínica en el tratamiento de neoplasias hematológicas de células B. Este éxito ha generado un interés considerable en extender la terapia con células CAR T a tumores sólidos (^[1], ^[2]). A pesar de numerosos estudios que confirman la seguridad y la viabilidad del uso de células CAR T para tumores sólidos, los resultados clínicos siguen siendo subóptimos (^[3]–^[5]). La heterogeneidad antigénica, caracterizada por la expresión incompleta del antígeno diana en las células tumorales, representa un desafío importante para la eficacia terapéutica de las células CAR T, particularmente en el tratamiento de tumores sólidos (^[6], ^[7]). Esta limitación se ha demostrado en un ensayo clínico que evalúa las células CAR T dirigidas al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) para el cáncer de páncreas, donde se observó la aparición de variantes tumorales EGFR-negativas (^[8]). De manera similar, se ha documentado la heterogeneidad antigénica en pacientes con glioblastoma recurrente tratados con células CAR T anti-EGFRvIII (^[9]). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una estrategia eficaz para abordar la heterogeneidad antigénica, mejorando así la eficacia antitumoral de las células CAR T.

Las evidencias emergentes indican que la propagación de antígenos (PA) desempeña un papel crucial en el aumento de la eficacia antitumoral, y los datos actuales subrayan su importancia terapéutica (^[10], ^[11]). La PA se refiere a un fenómeno caracterizado por la activación de la inmunidad celular T endógena dirigida hacia antígenos tumorales asociados (ATA) no diana. Se ha establecido que la activación de las células presentadoras de antígenos (CPA) es un requisito previo esencial para la PA en las células T, un proceso fundamental necesario para inducir la inmunidad celular T endógena (^[12]). Tras la lisis de las células tumorales durante la terapia inicial, las CPA, en particular las células dendríticas (CD), captan los ATA no diana y, posteriormente, presentan estos antígenos para activar respuestas de células T policlonales contra las neoplasias residuales. Hasta la fecha, existen pocas evidencias que sugieran que la terapia con células CAR T en sí misma induce la generación de PA con potencial terapéutico. Solo algunos estudios preclínicos han informado sobre respuestas específicas de células T antitumorales débiles asociadas con este fenómeno (^[13]). La modificación de las células CAR T para coexpresar moléculas inmunostimulantes adicionales, como la interleucina-7 (IL-7)/CCL19 (^[14]), CD40L (^[15]), IL-12 (^[16]) e incluso factores de virulencia bacterianos (^[17]), ha permitido observar efectos antitumorales mejorados contra las células tumorales positivas para el antígeno, así como la generación documentada de células T endógenas antitumorales específicas observadas en modelos murinos inmunocompetentes. Sin embargo, se requiere una mayor investigación para evaluar la eficacia de estas células CAR T modificadas contra tumores heterogéneos recurrentes o abscópicos. Algunos estudios han informado que las células CAR T combinadas con agonistas del estimulador de los genes de interferón (STING) o vacunas sincrónicas en el tratamiento de tumores sólidos activaron con éxito la PA e indujeron respuestas antitumorales endógenas en ratones inmunocompetentes, y se observaron algunos efectos abscópicos (^[7], ^[18]). Aunque el uso de múltiples agentes en combinación aumenta la complejidad y la incertidumbre de la traslación clínica, estos resultados basados en animales sugieren el valor potencial de inducir la PA para mejorar la eficacia de las células CAR T en el tratamiento de tumores sólidos heterogéneos.

Recientemente demostramos que la aplicación de decitabina a baja dosis [5-aza-2'-desoxicitidina (DAC)], un potente inhibidor de la ADN metiltransferasa, mejoró sustancialmente la eficacia antitumoral de las células CAR T contra las neoplasias hematológicas, tanto in vitro como en modelos de xenoinjerto tumoral inmunodeficientes (^[19]). En particular, este efecto de programación del ADN se activa específicamente mediante la interacción entre el receptor quimérico de antígenos y su antígeno diana. Además, otros estudios han demostrado que la inhibición farmacológica de la ADN metiltransferasa o la ablación genética de la ADN metiltransferasa 3 alfa (DNMT3A) de novo pueden potenciar eficazmente la eficacia antitumoral de las células T al tiempo que mejoran su agotamiento (^[20], ^[21]). Con base en esta información, extendimos aún más el uso de células CAR T programadas con DAC a baja dosis (dCAR T) para tratar tumores sólidos.

En varios modelos de tumores sinérgicos que utilizan ratones inmunocompetentes, se observó la PA después de la administración de la terapia con células dCAR T. Este fenómeno se caracterizó por un aumento marcado y la activación de células T CD8+ específicas del tumor endógenas en los ratones, incluido el sitio tumoral, el bazo y la sangre periférica. Estas células T demostraron la capacidad de responder a antígenos negativos, facilitando así el control de masas tumorales mixtas compuestas tanto por células tumorales positivas como negativas para el antígeno diana, y limitando eficazmente el crecimiento de lesiones tumorales abscópicas negativas para el antígeno, incluso sin el condicionamiento previo con linfodepleción. Descubrimos que las células dCAR T se dirigieron específicamente y erradicaron las células tumorales positivas para el antígeno, al tiempo que liberaban niveles elevados de interferón-γ (IFN-γ; que superan la producción de las células CAR T convencionales), lo que indujo una muerte celular inmunogénica (MCI) robusta en las contrapartes negativas para el antígeno. Esta cascada activó las CD para activar las células T CD8+ endógenas específicas del tumor, lo que finalmente condujo a la erradicación de poblaciones malignas heterogéneas en cuanto al antígeno. A diferencia de los enfoques de ingeniería o las terapias combinadas con múltiples agentes, este estudio proporciona una plataforma de células CAR T integral capaz de inducir una potente inmunidad antitumoral en las células T CD8+ endógenas, erradicando eficazmente los tumores sólidos heterogéneos en cuanto al antígeno.

RESULTADOS

Las células dCAR T exhiben una mayor eficacia antitumoral e inducen un cambio en la composición de las células inmunitarias endógenas dentro de los tumores sólidos positivos para el antígeno

En este estudio, primero evaluamos la eficacia antitumoral de las células dCAR T contra tumores sólidos en ratones inmunocompetentes. Generamos células CAR T anti-CD19 murinas mediante la transducción de células T murinas con un retrovirus y producimos células dCAR T murinas mediante la incorporación de 10 nM de DAC durante el cultivo de células CAR T, como se describe en nuestro estudio anterior (fig. S1, A y B) (^[19]). Coherente con nuestras observaciones previas en células dCAR T humanas, las células dCAR T murinas no mostraron diferencias significativas en términos de proliferación y viabilidad celular, expresión de CAR o composición celular en comparación con las células CAR T convencionales en el "estado de reposo" (fig. S1, C a F). Sin embargo, hubo un enriquecimiento significativo de las células T de memoria central (Tcm, CD44+CD62L+) en las células dCAR T en comparación con las células CAR T convencionales (fig. S1F). En los experimentos de citotoxicidad, al ser cocultivadas con la línea celular de melanoma B16F10, que expresa constitutivamente el antígeno humano CD19 (B16 CD19+), las células dCAR T mostraron una capacidad marcadamente superior para lisar las células tumorales (fig. S2, A a C). Esta mayor capacidad en las células dCAR T exhibió niveles aumentados de expresión de CD107a, producción de citocinas, población de células Tcm e índice de proliferación Ki67, en comparación con las células CAR T convencionales (fig. S2, D a J).

Posteriormente, realizamos una evaluación in vivo de la eficacia antitumoral de las células dCAR T. Tras el establecimiento del tumor mediante la implantación subcutánea de 3 × 105 células B16 CD19+ en ratones inmunocompetentes (fig. 1A), administramos linfodepleción mediante el precondicionamiento intraperitoneal de 200 μg de ciclofosfamida y 100 μg de fludarabina (^[16], ^[22], ^[23]). Posteriormente, los ratones recibieron terapia celular adoptiva (TCA) mediante la inyección intravenosa de 1 × 107 células. El tratamiento con células dCAR T suprimió sustancialmente el crecimiento tumoral, lo que resultó en una regresión tumoral completa en un subconjunto de ratones. En contraste, las células CAR T convencionales mostraron una eficacia limitada, y los tumores en el grupo de células T no transducidas (NT) progresaron rápidamente (fig. 1B). Posteriormente, implantamos células tumorales B16 CD19+ en el flanco contralateral de los dos ratones que habían logrado una respuesta completa en el experimento anterior. No observamos crecimiento tumoral en los ratones re-desafiados e identificamos células CAR+ en sus esplenos (fig. 1, C y D). Estos hallazgos sugieren colectivamente que las células dCAR T tienen una memoria persistente relativamente superior para lograr la vigilancia tumoral in vivo.

La inmunosupresión del microambiente tumoral (MET) se ha considerado un factor crítico que contribuye a la eficacia limitada de la terapia con células CAR T en tumores sólidos (^[24]). Evaluamos el estado de las células inmunitarias endógenas en el MET después del tratamiento con células CAR T utilizando un modelo animal de células dCAR T congénicas (CD45.1+) infundidas en ratones C57BL/6 (CD45.2+) (fig. 1A). Después de 7 días de la infusión de células, observamos una reducción significativa en el crecimiento tumoral en el grupo de células dCAR T (fig. S3A). Utilizando citometría de flujo y citometría de masas en mezclas de células inmunitarias infiltrantes tumorales postratamiento, el grupo de tratamiento con células dCAR T mostró un aumento significativo en los leucocitos CD45+ infiltrantes tumorales (fig. S3B), acompañado de un aumento en el número de células CAR+, células T endógenas, células asesinas naturales (NK) y CD (fig. 1, E a G, y fig. S3, C y D), especialmente las células T endógenas, que aumentaron 13 veces en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (fig. 1G). El número de células T endógenas infiltrantes tumorales en el grupo de células dCAR T superó con creces el número de células CAR+ en el tejido tumoral (7,6 veces) (fig. 1G). Las células T endógenas mostraron simultáneamente niveles notablemente elevados de activación (Icos+Gran B+), función efectora (Gran B+perforina+) y fenotipos de memoria (CD44+CD62L+) en el grupo de células dCAR T (fig. 1H), lo que sugiere que el efecto de control prominente de las células dCAR T sobre los tumores sólidos puede lograrse conjuntamente mediante la terapia CAR T dirigida a las células tumorales positivas para el antígeno, combinada con la activación de la eficacia antitumoral endógena.

Eliminación de tumores heterogéneos por las células T endógenas activadas por las células dCAR T

Dado que la activación de las células T endógenas es una característica crítica de la PA (^[7]) y a la luz de los hallazgos anteriores, utilizamos además un modelo de tumor mixto que consiste en células B16 CD19+ y B16F10 (B16F10 CD19-) en una proporción de 1:1 para investigar si el tratamiento con células dCAR T puede activar las células T endógenas e inducir una respuesta antitumoral contra los tumores negativos para el antígeno diana. Primero, determinamos que las células B16 CD19+ y B16F10 CD19- tenían tasas de crecimiento comparables en ratones C57BL/6 (fig. S4A). Para evaluar de manera más integral la respuesta inmunitaria endógena después del tratamiento con células dCAR T, eliminamos el régimen de precondicionamiento con linfodepleción. Inesperadamente, incluso en ausencia de precondicionamiento, las células CAR T anti-CD19 fueron capaces de inducir una regresión significativa de los tumores mixtos positivos y negativos para el antígeno CD19. El treinta por ciento de los ratones que presentaban mezclas de tumores heterogéneas lograron una remisión completa después del tratamiento (fig. 2A y fig. S4B). En contraste, el grupo de células CAR T convencionales exhibió un control mínimo sobre el crecimiento del tumor mixto, comparable al grupo NT (fig. 2A y fig. S4B). A continuación, realizamos un experimento de re-desafío con células B16F10 CD19- en ratones que habían logrado una remisión completa después del tratamiento con células dCAR T. No observamos un nuevo crecimiento tumoral durante 20 días después de la inoculación de células tumorales, y hubo un aumento marcado en las células T endógenas en los esplenos de los ratones re-desafiados (fig. 2, B y C). Para determinar si las células dCAR T exógenas o las células T endógenas ejercían un efecto de eliminación sobre las células tumorales CD19-negativas, tratamos a los ratones con anticuerpos que agotan las células T CD3+ después de la implantación de células tumorales, pero antes de la infusión de células CAR T (fig. 2D). Cuando se bloquearon las células T endógenas, las células dCAR T, de manera análoga a las células CAR T convencionales, mostraron solo un grado modesto de inhibición del crecimiento del tumor mixto. Las células dCAR T solo fueron capaces de lograr el control de los tumores heterogéneos en cuanto al antígeno si se conservaron las células T endógenas (fig. 2, E y F).

Tras identificar que las células T endógenas pueden representar la población celular predominante responsable de eliminar las células tumorales que carecen del antígeno diana tras el tratamiento con dCAR T, evaluamos más a fondo su funcionalidad y caracterización mediante el secuenciamiento del transcriptoma de células individuales. Establecimos un modelo tumoral mixto con una proporción de 1:1 de células B16 CD19+ y B16F10 CD19− y, a continuación, utilizamos las masas tumorales resultantes para realizar un secuenciamiento de ARN de células individuales (scRNA-seq) 7 días después de la terapia celular (fig. S5A). Utilizando firmas génicas específicas de tipo celular establecidas (^[25]), anotamos inicialmente los grupos que exhibían patrones de expresión similares (fig. S5, B y C). El posterior agrupamiento no supervisado de los datos del transcriptoma reveló cinco grupos de CD8 endógenos y cuatro grupos de CD4 endógenos (fig. S5D), y categorizamos aún más estos grupos en CD8+ (efector o de agotamiento), CD4+ [efector, de agotamiento o célula T reguladora (célula Treg)] y algunos grupos no definidos (fig. S5E). Los grupos CD8-C2-Gzmd y CD4-C1-Gzma, ambos indicativos de células T efectoras, comprendían predominantemente células de tumores tratados con células dCAR T, mientras que los grupos CD8-C4-Tox (células T CD8+ agotadas), CD4-C4-Pdcd1 (células T CD4+ agotadas) y CD4-C3-Foxp3 (células T CD4+ Treg) estaban poblados principalmente por células de tumores tratados con células CAR T (fig. S5F). Los análisis posteriores de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaron que los genes expresados diferencialmente dentro de los grupos efectores CD8-C2 y CD4-C1 en ratones tratados con células dCAR T estaban sustancialmente enriquecidos en vías relacionadas con la respuesta inmune e inflamatoria, la activación y proliferación de células T, la regulación de la migración de células T, la vía de señalización de quimiocinas y las vías metabólicas relativas (fig. S5, G a J). Estos resultados sugieren que las células T endógenas infiltrantes tumorales tratadas con dCAR T exhiben una notable activación y proliferación de características del transcriptoma efector en comparación con las células T endógenas infiltrantes tumorales después del tratamiento convencional con células CAR T.### Las células dCAR T inducen una respuesta sistémica (AS) de las células T CD8+ endógenas

La evidencia emergente sugiere que la AS podría ser un factor importante en los beneficios terapéuticos observados en tumores heterogéneos durante la inmunoterapia contra el cáncer (^[6], ^[17]). En el presente estudio, para evaluar el alcance de la AS de las células T endógenas después de la terapia con células dCAR T, utilizamos células de melanoma murino B16F10 que expresan el antígeno sustituto ovalbúmina (OVA+B16). Inoculamos ratones C57BL/6 con una mezcla de B16 CD19+ y OVA+B16 en el flanco izquierdo y OVA+B16 solo en el flanco derecho, definiendo la lesión tumoral abscopal (fig. 3A). Las células dCAR T no solo mostraron un notable control de los tumores mixtos, sino que también exhibieron una destacada inhibición superior de los tumores abscopales CD19-negativos y OVA-positivos (fig. 3B). En los ratones tratados con células dCAR T, hubo un marcado aumento en el porcentaje de células T CD8+ específicas de OVA (dirigidas a SIINFEKL) del huésped dentro de los tumores injertados bilateralmente (fig. 3, C y D). A continuación, aislamos esplenocitos en el día 7 y los cultivamos con células B16F10 OVA−CD19− irradiadas en un ensayo de inmunospot enzimático ligado a IFN-γ para evaluar la respuesta de las células T del huésped contra antígenos que no son el objetivo de las células CAR T. Detectamos más de 52 inmunospots de células T en el grupo dCAR T después del cocultivo con células tumorales dobles negativas para CD19 y OVA, superando con creces los 10 (de 3 a 14,5) inmunospots observados en el grupo de células CAR T convencionales (fig. 3E). Por último, evaluamos el cambio en el repertorio clonal del receptor de células T (TCR) de las células T CD8+ del huésped de los tumores mixtos utilizando scRNA-seq y secuenciación de TCR, y observamos que la proporción de más de cinco clones celulares era significativamente mayor en el grupo dCAR T en comparación con el grupo CAR T (fig. 3F y fig. S6, A a C), lo que indica una mejora en la amplificación oligoclonal del TCR de las células T CD8+ reactivas al tumor del huésped en el grupo dCAR T en relación con el grupo CAR T. Además, evaluamos la AS de las células T CD8+ del huésped directamente contra los antígenos asociados al tumor (TAA) y encontramos un aumento significativo de las células T CD8+ específicas de MuLV p15E (dirigidas a KSPWFTTL) del huésped en ratones con tumores B16 CD19+ después del tratamiento con células dCAR T (fig. S7). Esto sugiere que las células dCAR T también pueden promover la AS en las células T endógenas, permitiéndoles reconocer una gama más amplia de TAA.

Para confirmar que la AS se produce en las células T endógenas después del tratamiento con dCAR T, volvimos a utilizar la línea celular de cáncer colorrectal MC38 para la validación. De manera similar, inoculamos ratones C57BL/6 con una mezcla de MC38 CD19+ y MC38 OVA+ en el flanco izquierdo y MC38 OVA+ solo en el flanco derecho (fig. S8A). Tras la ACT, observamos un notable control tanto de los tumores mixtos como de los tumores abscopales (fig. S8, B y C). Además, realizamos un ensayo de inmunospot de IFN-γ con células MC38 irradiadas dobles negativas para CD19 y OVA, revelando significativamente más inmunospots de células T en el grupo dCAR T en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (fig. S8D). También observamos un aumento notable en el porcentaje de células T CD8+ específicas de OVA (dirigidas a SIINFEKL) del huésped dentro de los tumores injertados bilateralmente en el grupo dCAR T (fig. S8, E y F). Para explorar más a fondo los posibles efectos universales de la desmetilación del ADN en la ACT, inoculamos ratones con una mezcla de OVA+B16 y OVA−B16F10 en el flanco izquierdo y OVA−B16F10 en el flanco derecho, seguido de tratamiento con células T CD8+ OT-1 tratadas con dosis bajas de DAC (fig. S9A). Después de la ACT, se logró un mayor control tumoral tanto en las lesiones tumorales mixtas como en las lesiones tumorales abscopales en el grupo de células T CD8+ OT-1 tratadas con DAC (fig. S9, B y C). Además, observamos una activación de las células T endógenas contra antígenos que no son OVA en el grupo tratado con DAC (fig. S9D).

En conjunto, estos hallazgos indican que la posible AS en las células T CD8+ reactivas al tumor del huésped podría ser inducida por el tratamiento con células dCAR T, erradicando así las lesiones tumorales abscopales negativas para el antígeno.### El requisito de las células dendríticas (DC) activadas para la AS de las células T endógenas

Está bien establecido que la AS requiere la activación de las DC para captar los TAA y, por lo tanto, inducir las respuestas de las células T endógenas (^[12]). Por lo tanto, para establecer posteriormente que las células dCAR T tienen la capacidad de inducir la AS, las investigaciones iniciales priorizaron la evaluación de la posible contribución de las DC al mecanismo de la AS. Los análisis previos de citometría de flujo y citometría de masas de tumores postratamiento habían observado un aumento significativo en el número de DC infiltrantes tumorales en el grupo dCAR T (fig. 1, F y G, y fig. S3D). Los datos de scRNA-seq revelaron una firma génica regulada al alza asociada con la activación en las DC infiltrantes tumorales, incluidos los moléculas costimuladoras como MHC I, MHC II y Cd86, en el grupo dCAR T (fig. 4A). Además, encontramos que las quimiocinas como Ccr7, Ccl3, Ccl4, Cxcl9 y Cxcl10, que reclutan y activan las células T, estaban reguladas al alza (fig. 4A). Además, observamos un aumento en la frecuencia de las DC responsables de completar la presentación de antígenos, incluidas las DC1 convencionales (cDC1) y las DC migratorias (migDC), en los ratones tratados con células dCAR T (fig. S10). Utilizando una línea celular de tumor B16 CD19+ que expresa mCherry como antígeno rastreable, encontramos que la terapia con células dCAR T podía aumentar la captación de antígenos tumorales por las DC en comparación con el grupo CAR T (fig. 4B), lo que sugiere una mayor capacidad de presentación de antígenos de las DC. En conjunto, estos datos indican un aumento en la activación y el número de DC intratumorales tras la terapia con células dCAR T.

A continuación, utilizamos ratones Batf3−/− deficientes en las DC que presentan antígenos cruzados para determinar la adquisición de las DC para impulsar la activación de las células T endógenas (fig. 4C). En estos ratones, el grupo dCAR T exhibió un control tumoral superior en las lesiones tumorales B16 CD19+ (fig. 4D), pero no mostró una diferencia significativa en el control tumoral en comparación con el grupo CAR T para las lesiones tumorales mixtas B16 CD19+ y OVA+B16 (fig. 4E). Además, las células T CD8+ específicas de OVA fueron indetectables en el bazo y en los tumores mixtos OVA+B16 y CD19+B16 (fig. 4, F y G). Estos resultados sugieren que la activación de las DC inducida por la terapia con células dCAR T es un requisito importante para el establecimiento de la AS.

A continuación, exploramos los factores clave que subyacen a la activación de las DC. El análisis de scRNA-seq reveló inicialmente que los niveles de expresión de los patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) como el trifosfato de adenosina (ATP; Atp5a1 y Atp5b) y la calreticulina (Calr) estaban aumentados tanto en las células tumorales positivas como negativas para el antígeno en el grupo de terapia dCAR T (fig. 4H). El reclutamiento, la activación y la captación de antígenos de las DC pueden verse mejorados por los DAMP liberados por las células tumorales que mueren y que son procesadas por la ICD (^[26], ^[27]). Esto se acompañó de niveles significativamente aumentados de ATP y calreticulina en el suero y los homogenados tumorales en el grupo de terapia dCAR T (fig. 4I). Además, observamos una regulación al alza en la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés del retículo endoplásmico, como Atf4 y Hspa5, tanto en las células tumorales positivas como negativas para el antígeno en el grupo dCAR T en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (fig. 4H). En conjunto, estos datos sugieren que la ICD se produce en las células tumorales después de la terapia con células dCAR T.

Para analizar más a fondo la ICD inducida por las células dCAR T en las células tumorales, cultivamos células tumorales positivas para el antígeno con células dCAR T y evaluamos el alcance de la permeabilización de la membrana, lo que facilita la liberación de los DAMP intracelulares. El análisis citométrico de flujo utilizando la tinción con anexina V y 7-aminoactinomicina D confirmó que las células dCAR T inducían una mayor permeabilización de la membrana en las células tumorales positivas para el antígeno (fig. S11A). Además, detectamos cantidades significativas de ATP y calreticulina en los sobrenadantes de cocultivo del grupo de células dCAR T (fig. S11B). Las células tumorales tratadas con células dCAR T mostraron un aumento de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) (fig. S11, C y D), lo que sugiere que estas células presentan autoepítopos tumorales a las células T tumorales endógenas. También observamos un aumento de la permeabilización de la membrana en las células tumorales negativas para el antígeno, lo que indica una muerte de células vecinas, que separamos físicamente del cocultivo de células dCAR T y células tumorales positivas para el antígeno utilizando una Transwell (fig. S11, E y F). En conjunto, estos datos sugieren que las células dCAR T inducen una ICD más extensa en las células tumorales, fortaleciendo así el requisito previo para la activación de las DC.### El destacado efecto de AS es causado por la ICD de las células tumorales negativas para el antígeno diana debido al nivel elevado y sostenido de producción de IFN-γ después de la activación de las células dCAR T

Hemos demostrado que, tras el tratamiento con células dCAR T, las células tumorales negativas para el antígeno diana sufren ICD, lo que promueve la activación de las DC. Este proceso indujo la AS y activó las células T endógenas específicas del tumor, lo que condujo a la eliminación de las células tumorales negativas para el antígeno diana. Sin embargo, también observamos que, aunque las células dCAR T tienen una eficacia notablemente mejorada en la eliminación de las células tumorales positivas para el antígeno diana (fig. 1), no inducen directamente la ICD en las células tumorales heterogéneas (fig. 2, D a F; bloqueo con anticuerpo anti-CD3); por lo tanto, investigamos más a fondo el mecanismo subyacente a la iniciación de la ICD en el antígeno negativo después de la infusión de células dCAR T. Las células tumorales CD19-negativas en el grupo dCAR T exhibieron una regulación al alza sustancial de los genes sensibles a IFN-γ, incluidos Ccl5, Isg15, Stat1 y Jak (fig. 5A). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló un enriquecimiento significativo de la presentación de antígenos y procesamiento, la interacción citocina-receptor de citocinas, la vía de señalización JAK-STAT y las vías de la apoptosis en las células tumorales negativas para el antígeno del grupo dCAR T en comparación con el grupo CAR T (fig. 5B). Estos resultados sugieren que la expresión de genes sensibles a IFN-γ en las células tumorales CD19-negativas se mejora tras el tratamiento con células dCAR T, acompañado de la activación de los genes sensibles y las vías de señalización asociadas.

Analizamos los niveles de expresión de IFN-γ en ratones, 7 días después de la terapia con células ACT, y observamos que tanto los niveles séricos como los intratumorales de IFN-γ aumentaron significativamente en los ratones tratados con dCAR T en comparación con el grupo de CAR T convencionales (Fig. 5, C y D). Además, experimentos in vitro previos demostraron que las células dCAR T producían niveles más altos de IFN-γ tras la estimulación con CD19+B16 (fig. S2, E y F). El secuenciamiento de células individuales del tejido tumoral, realizado 7 días después del tratamiento con ACT, reveló que las células CAR+ infiltrantes en el tumor del grupo dCAR T presentaban niveles significativamente más altos de expresión de Ifng en comparación con el grupo de CAR T convencionales (Fig. 5E y fig. S12), junto con una regulación al alza de los principales reguladores de la expresión de IFN-γ, incluyendo Tbx21, Atf2, Nfat, Stat3 y Gapdh (Fig. 5, F a H) (^[28], ^[29]). Posteriormente, para determinar aún más el programa mediado por la desmetilación del ADN que afecta a Ifng y a la expresión de sus genes diana, realizamos un ensayo de cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) para examinar los cambios regulatorios epigenéticos en las células dCAR T antes de la infusión. Nuestros hallazgos indicaron que el tratamiento ex vivo con DAC de las células CAR T resultó en un aumento de la accesibilidad de la cromatina en los loci de Ifng y en su regulador asociado (Tbx21), en los genes efectores (Gzmb y Prf1) y en los genes de respuesta (Stat1, Jak1, Jak2, Irf1, Casp1, Icam1 y Gbp2) antes de la infusión de las células (Fig. 5I y fig. S13).

Se ha informado que la señalización de IFN-γ desempeña un papel esencial en el proceso de muerte celular (^[30]–^[32]). Mecánicamente, IFN-γ puede inducir directamente la apoptosis de las células tumorales o promover la muerte celular no apoptótica a través de la autofagia, o indirectamente sensibilizar las células tumorales a las respuestas inmunitarias o a la apoptosis inducida por la quimioterapia. Basándonos en los hallazgos mencionados anteriormente, proponemos que los altos niveles intratumorales de IFN-γ inducen la muerte celular inmunogénica (ICD) en las células tumorales. El perfilaje transcriptómico y la citometría de flujo confirmaron una abundante expresión del receptor de IFN-γ en los modelos tumorales evaluados (B16 y MC38) (fig. S14, A a D). Posteriormente, la estimulación directa in vitro de las células tumorales con IFN-γ recombinante a una concentración de 20 ng/ml, detectada previamente en el tumor, resultó en una muerte celular tumoral significativa después de 48 horas (fig. S14, E y F). Luego, separamos físicamente las células tumorales antígeno-negativas cocultivadas con células dCAR T y las células tumorales antígeno-positivas utilizando un inserto Transwell en presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ. En este entorno, observamos una disminución de la muerte celular en las células tumorales antígeno-negativas cuando se exponen al anticuerpo neutralizante de IFN-γ (Fig. 5, J y K, y fig. S14G). Estos datos sugieren que el IFN-γ de alto nivel liberado por las células dCAR T activadas por el antígeno diana puede eludir la dependencia del antígeno para inducir la ICD en las células tumorales antígeno-negativas.

Además, para determinar si IFN-γ actúa como un iniciador clave de la respuesta sistémica antitumoral (AS), tratamos ratones con tumores mixtos con células dCAR T en presencia de un anticuerpo neutralizante contra IFN-γ (Fig. 6A). Descubrimos que la administración de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ disminuyó significativamente el nivel de IFN-γ sérico (fig. S15A). Aunque no afectó la infiltración de células CAR+ en los tumores (fig. S15B), este bloqueo abolió el control tumoral en las lesiones tumorales mixtas CD19+B16 y OVA+B16 (Fig. 6B). Además, observamos que la presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ perjudicó el control tumoral en las lesiones tumorales OVA+B16 abscópicas (Fig. 6C). Encontramos una notable reducción de las células dendríticas CD103+ y las células T CD8+ específicas de OVA que se infiltran en los tumores tratados en presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ en las lesiones tumorales mixtas (Fig. 6D). Además, el bloqueo de IFN-γ resultó en una disminución pronunciada de las células T CD8+ específicas de OVA en las lesiones tumorales abscópicas (Fig. 6E). Estos resultados sugieren que la activación de la vía de señalización de IFN-γ es un requisito previo esencial para la aparición de la ICD y la inducción de la AS.

Finalmente, determinamos las células de origen de los niveles elevados de IFN-γ dentro de las regiones tumorales después de la terapia con células dCAR T. Aquí, utilizamos células T derivadas de ratones Ifng−/− para generar células dCAR T, que habían perdido la capacidad de secreción de IFN-γ. Después de que los ratones con tumores mixtos CD19+B16 y CD19−B16 y tumores abscópicos CD19−B16 recibieron la infusión de células, descubrimos que el grupo dCAR T Ifng−/− no logró controlar ni las lesiones tumorales mixtas ni las abscópicas, en contraste con el control eficaz logrado con el tratamiento con dCAR T (Fig. 6, F y G, y fig. S15, C y D). En conclusión, hemos identificado definitivamente que las células dCAR T son la fuente de IFN-γ intratumoral, que posteriormente induce la ICD en las células tumorales antígeno-negativas. Este efecto secundario mediado por citocinas desencadena la AS, iniciando una potente respuesta inmunitaria antitumoral endógena y culminando en la erradicación de tumores heterogéneos.

Las células dCAR T exhiben una mayor eficacia antitumoral e inducen un cambio en la composición de las células inmunitarias endógenas dentro de los tumores sólidos antígeno-positivos

En este estudio, primero evaluamos la eficacia antitumoral de las células dCAR T contra tumores sólidos en ratones inmunocompetentes. Generamos células CAR T murinas anti-CD19 mediante la transducción de células T murinas con un retrovirus y producimos células dCAR T murinas mediante la incorporación de 10 nM de DAC durante el cultivo de células CAR T, como se describe en nuestro estudio anterior (fig. S1, A y B) (^[19]). Coherente con nuestras observaciones previas en células dCAR T humanas, las células dCAR T murinas no mostraron diferencias significativas en términos de proliferación y viabilidad celular, expresión de CAR o composición celular en comparación con las células CAR T convencionales en el "estado de reposo" (fig. S1, C a F). Sin embargo, hubo un enriquecimiento significativo de las células T de memoria central (Tcm, CD44+CD62L+) en las células dCAR T en comparación con las células CAR T convencionales (fig. S1F). En los experimentos de citotoxicidad, cocultivadas con la línea celular de melanoma B16F10, que expresa constitutivamente el antígeno humano CD19 (CD19+B16), las células dCAR T mostraron una capacidad marcadamente superior para lisar las células tumorales (fig. S2, A a C). Esta mayor capacidad en las células dCAR T exhibió niveles más altos de expresión de CD107a, producción de citocinas, población de células Tcm e índice de proliferación Ki67, en comparación con las células CAR T convencionales (fig. S2, D a J).

Posteriormente, realizamos una evaluación in vivo de la eficacia antitumoral de las células dCAR T. Después del establecimiento del tumor mediante la implantación subcutánea de 3 × 105 células CD19+B16 en ratones inmunocompetentes (Fig. 1A), administramos linfodepleción mediante un acondicionamiento pro-pretratamiento intraperitoneal de 200 μg de ciclofosfamida y 100 μg de fludarabina (^[16], ^[22], ^[23]). Posteriormente, los ratones recibieron terapia celular adoptiva (ACT) mediante inyección intravenosa de 1 × 107 células. El tratamiento con células dCAR T suprimió sustancialmente el crecimiento tumoral, lo que resultó en una regresión tumoral completa en un subconjunto de ratones. En contraste, las células CAR T convencionales mostraron una eficacia limitada, y los tumores en el grupo de células T no transducidas (NT) progresaron rápidamente (Fig. 1B). Posteriormente, implantamos células tumorales CD19+B16 en el flanco contralateral de los dos ratones supervivientes que habían logrado una respuesta completa en el experimento anterior. No observamos crecimiento tumoral en los ratones re-estimulados e identificamos células CAR+ en sus bazo (Fig. 1, C y D). Estos hallazgos sugieren colectivamente que las células dCAR T tienen una memoria persistente relativamente superior para lograr la vigilancia tumoral in vivo.

La inmunosupresión del microambiente tumoral (TME) se ha considerado un factor crítico que contribuye a la eficacia limitada de la terapia con células CAR T en tumores sólidos (^[24]). Evaluamos el estado de las células inmunitarias endógenas en el TME después del tratamiento con células CAR T utilizando un modelo animal de células dCAR T congénicas (CD45.1+) infundidas en ratones C57BL/6 (CD45.2+) (Fig. 1A). Después de 7 días de la infusión de células, observamos una reducción significativa del crecimiento tumoral en el grupo dCAR T (fig. S3A). Utilizando citometría de flujo y citometría de masas en mezclas de células inmunitarias infiltrantes tumorales postratamiento, el grupo de tratamiento con células dCAR T mostró un aumento significativo de los leucocitos CD45+ infiltrantes tumorales (fig. S3B), acompañado de un aumento en el número de células CAR+, células T endógenas, células asesinas naturales (NK) y células dendríticas en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (Fig. 1, E a G, y fig. S3, C y D), especialmente las células T endógenas, que aumentaron 13 veces en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (Fig. 1G). El número de células T endógenas infiltrantes tumorales en el grupo dCAR T superó con creces el número de células CAR+ en el tejido tumoral (7,6 veces) (Fig. 1G). Las células T endógenas exhibieron concurrentemente niveles notablemente elevados de activación (Icos+Gran B+), función efectora (Gran B+perforina+) y fenotipos de memoria (CD44+CD62L+) en el grupo dCAR T (Fig. 1H), lo que sugiere que el efecto de control prominente de las células dCAR T sobre los tumores sólidos puede lograrse conjuntamente mediante la focalización de las células CAR T en las células tumorales antígeno-positivas, combinada con la activación de la eficacia antitumoral endógena.

Eliminación de tumores heterogéneos por las células T endógenas desencadenadas por las células dCAR T

Dado que la activación de las células T endógenas es una característica crítica de la AS (^[7]) y a la luz de los hallazgos mencionados anteriormente, utilizamos además un modelo de tumor mixto que consiste en células CD19+B16 y B16F10 (CD19−B16F10) en una proporción de 1:1 para investigar si el tratamiento con células dCAR T puede activar las células T endógenas e inducir una respuesta antitumoral contra los tumores antígeno-negativos. Primero, determinamos que las células CD19+B16 y CD19−B16F10 tenían tasas de crecimiento comparables en ratones C57BL/6 (fig. S4A). Para evaluar de manera más integral la respuesta inmunitaria endógena después del tratamiento con células dCAR T, eliminamos el régimen de preacondicionamiento de linfodepleción. Inesperadamente, incluso en ausencia de preacondicionamiento, las células dCAR T anti-CD19 fueron capaces de inducir una regresión significativa de los tumores mixtos positivos y negativos para CD19. El treinta por ciento de los ratones con mezclas de tumores heterogéneos lograron una remisión completa después del tratamiento (Fig. 2A y fig. S4B). En contraste, el grupo de células CAR T convencionales exhibió un control mínimo sobre el crecimiento del tumor mixto, comparable al grupo NT (Fig. 2A y fig. S4B). A continuación, realizamos un experimento de re-estimulación de CD19−B16F10 en ratones que habían logrado una remisión completa después del tratamiento con células dCAR T. No observamos un nuevo crecimiento tumoral durante 20 días después de la inoculación de células tumorales, y hubo un aumento marcado de las células T endógenas en el bazo de los ratones re-estimulados (Fig. 2, B y C). Para determinar si las células dCAR T exógenas o las células T endógenas ejercían un efecto de eliminación sobre las células tumorales CD19-negativas, tratamos a los ratones con anticuerpos depletores de células T CD3+ después de la implantación de células tumorales, pero antes de la infusión de células CAR T (Fig. 2D). Cuando se bloquearon las células T endógenas, las células dCAR T, de manera análoga a las células CAR T convencionales, mostraron solo un grado modesto de inhibición del crecimiento del tumor mixto. Las células dCAR T solo pudieron lograr el control de los tumores antígeno-heterogéneos si se conservaron las células T endógenas (Fig. 2, E y F).

Tras identificar que las células T endógenas pueden representar la población celular predominante responsable de eliminar las células tumorales que carecen del antígeno diana tras el tratamiento con dCAR T, evaluamos más a fondo su funcionalidad y caracterización mediante el secuenciamiento del transcriptoma de células individuales. Establecimos un modelo tumoral mixto con una proporción de 1:1 de células B16 CD19+ y B16F10 CD19− y, a continuación, utilizamos las masas tumorales resultantes para realizar un secuenciamiento de ARN de células individuales (scRNA-seq) 7 días después de la terapia celular (fig. S5A). Utilizando firmas génicas específicas de tipo celular establecidas (^[25]), anotamos inicialmente los grupos que mostraban patrones de expresión similares (fig. S5, B y C). El posterior agrupamiento no supervisado de los datos del transcriptoma reveló cinco grupos de CD8 endógenos y cuatro grupos de CD4 endógenos (fig. S5D), y categorizamos aún más estos grupos en CD8+ (efector o de agotamiento), CD4+ [efector, de agotamiento o célula T reguladora (célula Treg)] y algunos grupos no definidos (fig. S5E). Los grupos CD8-C2-Gzmd y CD4-C1-Gzma, ambos indicativos de células T efectoras, comprendían predominantemente células de tumores tratados con células dCAR T, mientras que los grupos CD8-C4-Tox (células T CD8+ agotadas), CD4-C4-Pdcd1 (células T CD4+ agotadas) y CD4-C3-Foxp3 (células T CD4+ Treg) estaban poblados principalmente por células de tumores tratados con células CAR T (fig. S5F). Los análisis posteriores de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaron que los genes expresados diferencialmente dentro de los grupos efectores CD8-C2 y CD4-C1 en ratones tratados con células dCAR T estaban sustancialmente enriquecidos en vías relacionadas con la respuesta inmune e inflamatoria, la activación y proliferación de células T, la regulación de la migración de células T, la vía de señalización de quimiocinas y las vías metabólicas relativas (fig. S5, G a J). Estos resultados sugieren que las células T endógenas infiltrantes tumorales tratadas con dCAR T exhiben una notable activación y proliferación de características del transcriptoma efector en comparación con las células T endógenas infiltrantes tumorales después del tratamiento convencional con células CAR T.

Las células dCAR T inducen una respuesta sistémica (AS) de las células T CD8+ endógenas

Las pruebas emergentes sugieren que la AS podría ser un factor importante en los beneficios terapéuticos observados en tumores heterogéneos durante la inmunoterapia contra el cáncer (^[6], ^[17]). En el presente estudio, para evaluar el alcance de la AS de las células T endógenas después de la terapia con células dCAR T, utilizamos células de melanoma murino B16F10 que expresan el antígeno sustituto ovalbúmina (OVA+B16). Inoculamos ratones C57BL/6 con una mezcla de B16 CD19+ y OVA+B16 en el flanco izquierdo y OVA+B16 solo en el flanco derecho, definiendo la lesión tumoral abscopal (fig. 3A). Las células dCAR T no solo mostraron un notable control de los tumores mixtos, sino que también exhibieron una excelente inhibición superior de los tumores abscopales CD19-negativos y OVA-positivos (fig. 3B). En los ratones tratados con células dCAR T, hubo un marcado aumento en el porcentaje de células T CD8+ específicas de OVA del huésped dentro de los tumores injertados bilateralmente (fig. 3, C y D). A continuación, aislamos esplenocitos en el día 7 y los cultivamos con células B16F10 OVA−CD19− irradiadas en un ensayo de inmunospot enzimático ligado a IFN-γ para evaluar la respuesta de las células T del huésped contra antígenos que no son el objetivo de las células CAR T. Detectamos más de 52 inmunospots de células T (rango de 34,5 a 65) en el grupo dCAR T después del cocultivo con células tumorales dobles negativas para CD19 y OVA, superando con creces los 10 (3 a 14,5) inmunospots observados en el grupo de células CAR T convencionales (fig. 3E). Por último, evaluamos el cambio en el repertorio clonal del receptor de células T (TCR) de las células T CD8+ del huésped de los tumores mixtos utilizando scRNA-seq y secuenciación de TCR, y observamos que la proporción de más de cinco clones celulares era significativamente mayor en el grupo dCAR T en comparación con el grupo CAR T (fig. 3F y fig. S6, A a C), lo que indica una mejora en la amplificación oligoclonal del TCR de las células T CD8+ reactivas al tumor del huésped en el grupo dCAR T en relación con el grupo CAR T. Además, evaluamos la AS de las células T CD8+ del huésped directamente contra los antígenos asociados al tumor (TAA) y encontramos un aumento significativo de las células T CD8+ específicas de MuLV p15E (dirigidas a KSPWFTTL) en ratones con tumores B16 CD19+ después del tratamiento con células dCAR T (fig. S7). Esto sugiere que las células dCAR T también pueden promover la AS en las células T endógenas, permitiéndoles reconocer una gama más amplia de TAA.

Para confirmar que la AS se produjo en las células T endógenas después del tratamiento con dCAR T, volvimos a utilizar la línea celular de cáncer colorrectal MC38 para la validación. De manera similar, inoculamos ratones C57BL/6 con una mezcla de MC38 CD19+ y MC38 OVA+ en el flanco izquierdo y MC38 OVA+ solo en el flanco derecho (fig. S8A). Tras la terapia celular adoptiva (ACT), observamos un notable control tanto de los tumores mixtos como de los tumores abscopales (fig. S8, B y C). Además, realizamos un ensayo de inmunospot de IFN-γ con células MC38 irradiadas dobles negativas para CD19 y OVA, lo que reveló significativamente más inmunospots de células T en el grupo dCAR T en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (fig. S8D). También observamos un aumento notable en el porcentaje de células T CD8+ específicas de OVA (dirigidas a SIINFEKL) dentro de los tumores injertados bilateralmente en el grupo dCAR T (fig. S8, E y F). Para explorar más a fondo los posibles efectos universales de la desmetilación del ADN en la ACT, inoculamos ratones con una mezcla de OVA+B16 y OVA−B16F10 en el flanco izquierdo y OVA−B16F10 en el flanco derecho, seguido de tratamiento con células T CD8+ OT-1 tratadas con dosis bajas de DAC (fig. S9A). Después de la ACT, se logró un mayor control tumoral tanto en las lesiones tumorales mixtas como en las lesiones tumorales abscopales en el grupo de células T CD8+ OT-1 tratadas con DAC (fig. S9, B y C). Además, observamos una activación de las células T endógenas contra antígenos que no son OVA en el grupo tratado con DAC (fig. S9D).

En conjunto, estos hallazgos indican que la posible AS en las células T CD8+ reactivas al tumor del huésped podría ser inducida por el tratamiento con células dCAR T, erradicando así las lesiones tumorales abscopales negativas para el antígeno.

El requisito de las células dendríticas (DC) activadas para la AS de las células T endógenas

Está bien establecido que la AS requiere la activación de las DC para captar los TAA y, por lo tanto, inducir las respuestas de las células T endógenas (^[12]). Por lo tanto, para establecer posteriormente que las células dCAR T tienen la capacidad de inducir la AS, las investigaciones iniciales priorizaron la evaluación de la posible contribución de las DC al mecanismo de la AS. Los análisis previos de citometría de flujo y citometría de masas de los tumores postratamiento habían observado un aumento significativo en el número de DC infiltrantes tumorales en el grupo dCAR T (fig. 1, F y G, y fig. S3D). Los datos de scRNA-seq revelaron una firma génica regulada al alza asociada con la activación en las DC infiltrantes tumorales, incluidos los moléculas costimuladoras como MHC I, MHC II y Cd86, en el grupo dCAR T (fig. 4A). Además, encontramos que las quimiocinas como Ccr7, Ccl3, Ccl4, Cxcl9 y Cxcl10, que reclutan y activan las células T, estaban reguladas al alza (fig. 4A). Además, observamos un aumento en la frecuencia de las DC responsables de completar la presentación de antígenos, incluidas las DC1 convencionales (cDC1) y las DC migratorias (migDC), en los ratones tratados con células dCAR T (fig. S10). Utilizando una línea celular de tumor B16 CD19+ que expresa mCherry como antígeno rastreable, encontramos que la terapia con células dCAR T podía aumentar la captación de antígenos tumorales por las DC en comparación con el grupo de células CAR T (fig. 4B), lo que sugiere una mayor capacidad de presentación de antígenos de las DC. En conjunto, estos datos indican un aumento en la activación y el número de DC intratumorales tras la terapia con células dCAR T.

A continuación, utilizamos ratones Batf3−/− deficientes en las DC que realizan la presentación cruzada para determinar la adquisición de las DC para impulsar la activación de las células T endógenas (fig. 4C). En estos ratones, el grupo dCAR T exhibió un control tumoral superior en las lesiones tumorales B16 CD19+ (fig. 4D), pero no mostró una diferencia significativa en el control tumoral en comparación con el grupo de células CAR T para las lesiones tumorales mixtas B16 CD19+ y OVA+B16 (fig. 4E). Además, las células T CD8+ específicas de OVA fueron indetectables en el bazo y en los tumores mixtos OVA+B16 y CD19+B16 (fig. 4, F y G). Estos resultados sugieren que la activación de las DC inducida por la terapia con células dCAR T es un requisito importante para el establecimiento de la AS.

A continuación, exploramos los factores clave que subyacen a la activación de las DC. El análisis de scRNA-seq reveló inicialmente que los niveles de expresión de los patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) como el trifosfato de adenosina (ATP; Atp5a1 y Atp5b) y la calreticulina (Calr) estaban aumentados tanto en las células tumorales positivas como negativas para el antígeno en el grupo de terapia dCAR T (fig. 4H). El reclutamiento, la activación y la captación de antígenos de las DC pueden mejorarse mediante los DAMP liberados por las células tumorales moribundas que son procesadas por la ICD (^[26], ^[27]). Esto se acompañó de niveles significativamente elevados de ATP y calreticulina en el suero y los homogenados tumorales en el grupo de terapia dCAR T (fig. 4I). Además, observamos una regulación al alza en la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés del retículo endoplásmico, como Atf4 y Hspa5, tanto en las células tumorales positivas como negativas para el antígeno en el grupo dCAR T en comparación con el grupo de células CAR T convencionales (fig. 4H). En conjunto, estos datos sugieren que la ICD se produce en las células tumorales después de la terapia con células dCAR T.

Para analizar más a fondo la ICD inducida por las células dCAR T en las células tumorales, cultivamos células tumorales positivas para el antígeno con células dCAR T y evaluamos el alcance de la permeabilización de la membrana, lo que facilita la liberación de los DAMP intracelulares. El análisis citométrico de flujo utilizando la tinción con anexina V y 7-aminoactinomicina D confirmó que las células dCAR T inducían una mayor permeabilización de la membrana en las células tumorales positivas para el antígeno (fig. S11A). Además, detectamos cantidades significativas de ATP y calreticulina en los sobrenadantes de cocultivo del grupo de células dCAR T (fig. S11B). Las células tumorales tratadas con células dCAR T mostraron un aumento de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) (fig. S11, C y D), lo que sugiere que estas células presentan autoepítopos tumorales a las células T tumorales endógenas. También observamos un aumento de la permeabilización de la membrana en las células tumorales negativas para el antígeno, lo que indica una muerte de células vecinas, que separamos físicamente del cocultivo de células dCAR T y células tumorales positivas para el antígeno utilizando una Transwell (fig. S11, E y F). En conjunto, estos datos sugieren que las células dCAR T inducen una ICD más extensa en las células tumorales, fortaleciendo así el requisito previo para la activación de las DC.

El efecto prominente de la AS se debe a la ICD de las células tumorales negativas para el antígeno diana debido al nivel elevado y sostenido de producción de IFN-γ después de la activación de las células dCAR T

Hemos demostrado que, tras el tratamiento con células dCAR T, las células tumorales negativas para el antígeno diana sufren ICD, lo que promueve la activación de las DC. Este proceso indujo la AS y activó las células T endógenas específicas del tumor, lo que condujo a la eliminación de las células tumorales negativas para el antígeno diana. Sin embargo, también observamos que, aunque las células dCAR T tienen una eficacia notablemente mejorada en la eliminación de las células tumorales positivas para el antígeno diana (fig. 1), no inducen directamente la ICD en las células tumorales heterogéneas (fig. 2, D a F; bloqueo de anticuerpos anti-CD3); por lo tanto, investigamos más a fondo el mecanismo subyacente al inicio de la ICD en el antígeno negativo después de la infusión de células dCAR T. Las células tumorales CD19-negativas en el grupo dCAR T exhibieron una regulación al alza sustancial de los genes sensibles a IFN-γ, incluidos Ccl5, Isg15, Stat1 y Jak (fig. 5A). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló un enriquecimiento significativo de la presentación y el procesamiento de antígenos, la interacción citocina-receptor de citocinas, la vía de señalización JAK-STAT y las vías de la apoptosis en las células tumorales negativas para el antígeno del grupo dCAR T en comparación con el grupo CAR T (fig. 5B). Estos resultados sugieren que la expresión de genes sensibles a IFN-γ en las células tumorales CD19-negativas se mejora tras el tratamiento con células dCAR T, acompañado de la activación de los genes sensibles y las vías de señalización asociadas.

Analizamos los niveles de expresión de IFN-γ en ratones, 7 días después de la terapia con células ACT, y observamos que tanto los niveles séricos como los intratumorales de IFN-γ estaban significativamente aumentados en los ratones tratados con dCAR T en comparación con el grupo de CAR T convencionales (Fig. 5, C y D). Además, experimentos in vitro previos demostraron que las células dCAR T producían niveles más altos de IFN-γ tras la estimulación con CD19+B16 (fig. S2, E y F). El secuenciamiento de células individuales del tejido tumoral, obtenido 7 días después del tratamiento con células ACT, reveló que las células CAR+ infiltrantes en el tumor del grupo dCAR T presentaban niveles significativamente elevados de expresión de Ifng en relación con el grupo de CAR T convencionales (Fig. 5E y fig. S12), junto con una regulación al alza de los principales reguladores de la expresión de IFN-γ, incluyendo Tbx21, Atf2, Nfat, Stat3 y Gapdh (Fig. 5, F a H) (^[28], ^[29]). Posteriormente, para determinar aún más el programa mediado por la desmetilación del ADN y su efecto en la expresión de Ifng y sus genes de respuesta, realizamos un ensayo de cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) para examinar los cambios regulatorios epigenéticos en las células dCAR T antes de la infusión. Nuestros hallazgos indicaron que el tratamiento ex vivo con DAC de las células CAR T resultó en un aumento de la accesibilidad de la cromatina en los loci de Ifng y su regulador asociado (Tbx21), el efector (Gzmb y Prf1) y los genes de respuesta (Stat1, Jak1, Jak2, Irf1, Casp1, Icam1 y Gbp2) antes de la infusión de las células (Fig. 5I y fig. S13).

Se ha informado que la señalización de IFN-γ desempeña un papel esencial en el proceso de muerte celular (^[30]–^[32]). Mecánicamente, IFN-γ puede inducir directamente la apoptosis de las células tumorales o promover la muerte celular no apoptótica a través de la autofagia, o indirectamente sensibilizar las células tumorales a las respuestas inmunitarias o a la apoptosis inducida por la quimioterapia. Basándonos en los hallazgos mencionados anteriormente, proponemos que los altos niveles intratumorales de IFN-γ inducen la muerte celular inmunogénica (ICD) en las células tumorales. El perfilaje transcriptómico y la citometría de flujo confirmaron una abundante expresión del receptor de IFN-γ en los modelos tumorales probados (B16 y MC38) (fig. S14, A a D). Posteriormente, la estimulación directa in vitro de las células tumorales con IFN-γ recombinante a una concentración de 20 ng/ml, detectada previamente en el tumor, resultó en una muerte celular tumoral significativa después de 48 horas (fig. S14, E y F). Luego, separamos físicamente las células tumorales antígeno-negativas, cocultivadas con células dCAR T, y las células tumorales antígeno-positivas, utilizando un inserto Transwell en presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ. En este entorno, observamos una disminución de la muerte celular en las células tumorales antígeno-negativas cuando se exponen al anticuerpo neutralizante de IFN-γ (Fig. 5, J y K, y fig. S14G). Estos datos sugieren que los altos niveles de IFN-γ liberados por las células dCAR T activadas por el antígeno pueden eludir la dependencia del antígeno para inducir la ICD en las células tumorales antígeno-negativas.

Además, para determinar si IFN-γ actúa como un iniciador clave de la respuesta sistémica (AS), tratamos ratones con tumores mixtos con células dCAR T en presencia de un anticuerpo neutralizante contra IFN-γ (Fig. 6A). Descubrimos que la administración de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ disminuyó significativamente el nivel de IFN-γ en el suero (fig. S15A). Aunque no afectó la infiltración de células CAR+ en los tumores (fig. S15B), este bloqueo abolió el control tumoral en las lesiones tumorales mixtas CD19+B16 y OVA+B16 (Fig. 6B). Además, observamos que la presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ perjudicó el control tumoral en las lesiones tumorales OVA+B16 abscópicas (Fig. 6C). Encontramos una notable reducción de las células dendríticas CD103+ y las células T CD8+ específicas de OVA que se infiltran en los tumores tratados en presencia de anticuerpos bloqueadores de IFN-γ en las lesiones tumorales mixtas (Fig. 6D). Además, el bloqueo de IFN-γ resultó en una disminución pronunciada de las células T CD8+ específicas de OVA en las lesiones tumorales abscópicas (Fig. 6E). Estos resultados sugieren que la activación de la vía de señalización de IFN-γ es un requisito previo esencial para la aparición de la ICD, con el fin de inducir la AS.

Finalmente, determinamos las células de origen de los niveles elevados de IFN-γ dentro de las regiones tumorales después de la terapia con células dCAR T. Aquí, utilizamos células T derivadas de ratones Ifng−/− para generar células dCAR T, que habían perdido la capacidad de secretar IFN-γ. Después de que los ratones con tumores mixtos CD19+B16 y CD19−B16 y tumores abscópicos CD19−B16 recibieran la infusión de células, encontramos que el grupo dCAR T Ifng−/− no logró controlar ni las lesiones tumorales mixtas ni las abscópicas, en contraste con el control eficaz logrado con el tratamiento con dCAR T (Fig. 6, F y G, y fig. S15, C y D). En conclusión, hemos identificado definitivamente que las células dCAR T son la fuente de IFN-γ intratumoral, que posteriormente induce la ICD en las células tumorales antígeno-negativas. Este efecto secundario mediado por citocinas desencadena la AS, iniciando una potente respuesta inmunitaria antitumoral endógena y culminando en la erradicación de tumores heterogéneos.

DISCUSIÓN

Abordar la heterogeneidad del antígeno tumoral en la terapia con células CAR T para tumores sólidos es fundamental para avanzar en el desarrollo de una inmunoterapia contra el cáncer eficaz. Basándonos en nuestro trabajo anterior, que demostró la actividad antitumoral duradera de las células dCAR T en neoplasias hematológicas (^[19]), buscamos abordar los desafíos adicionales que plantean la mayor complejidad antigénica y la capacidad de evasión inmunitaria característica de los tumores sólidos (^[33], ^[34]). En este estudio, ampliamos sustancialmente la aplicación de la tecnología dCAR T a tumores sólidos y descubrimos un mecanismo previamente no reportado por el cual las células dCAR T desencadenan una AS robusta, lo que en última instancia permite la erradicación sistémica de subclones antígeno-negativos e incluso lesiones abscópicas.

En este estudio, demostramos que las células tumorales tratadas con células dCAR T, a diferencia de las expuestas a células CAR T convencionales, sufren una ICD pronunciada, como lo evidencian la permeabilización de la membrana, la liberación de DAMP (ATP y calreticulina) y el aumento de la expresión de MHC-I. Estos cambios se observaron en las células tumorales antígeno-negativas que nunca fueron reconocidas directamente por las células CAR T, lo que indica un efecto no autónomo, un efecto secundario probablemente propagado por la señalización de citocinas. Hasta la fecha, existen pocas pruebas que demuestren que la terapia con células CAR T en sí misma induce la producción de AS con un potencial terapéutico. Se ha establecido que la activación de las células dendríticas (DC) es un requisito previo fundamental para la AS en las células T, que es un proceso fundamental necesario para inducir la inmunidad de las células T endógenas (^[12]). Estudios recientes han demostrado que la ingeniería de células CAR T para secretar citocinas que no se producen de forma nativa por las células T, como IL-12, IL-18 o IL-7, o para expresar constitutivamente moléculas inmunomoduladoras como CD40L o CCL19, puede potenciar la inmunidad antitumoral endógena (^[14], ^[16], ^[35], ^[36]). Aunque estos enfoques mejoraron la activación de las DC y promovieron la infiltración de células T endógenas en el microambiente tumoral (TME), no indujeron la ICD en el tumor heterogéneo. Inducir una respuesta antitumoral duradera y específica a través de la activación de las DC por sí sola, sin un aumento concomitante de la disponibilidad del antígeno diana, sigue siendo un desafío. Demostramos que IFN-γ, secretado específicamente por las células dCAR T, es el desencadenante que inicia la ICD en las células tumorales antígeno-negativas, a su vez activa las DC y prepara las células T endógenas.

Si bien tanto las células T endógenas como las células CAR T en el TME son capaces de producir IFN-γ, nuestros estudios in vivo utilizando células dCAR T Ifng−/− demostraron que el IFN-γ derivado específicamente de las células dCAR T es esencial para iniciar la AS. La terapia con células CAR T convencionales a menudo no logra alcanzar concentraciones intratumorales de IFN-γ suficientes para ejercer efectos antitumorales. En particular, Ma et al. (^[7]) ilustraron que la combinación de células CAR T con vacunas y agonistas de STING puede mejorar la producción de IFN-γ para desencadenar la AS. Para determinar la capacidad intrínseca de las células dCAR T para producir altos niveles de IFN-γ sin intervención farmacológica, realizamos ATAC-seq en las células dCAR T en reposo antes de la infusión. Las modificaciones epigenéticas mediante agentes de desmetilación del ADN o la deleción de DNMT3A pueden afectar la expresión de los factores de transcripción (^[20], ^[21]). Coherente con estos fenómenos, los resultados de ATAC-seq revelaron una mayor accesibilidad de la cromatina en los genes relacionados con IFN-γ, sus elementos reguladores y los genes de respuesta en comparación con las células CAR T convencionales. De manera consistente, el análisis transcriptómico de células individuales de las células dCAR T demostró una regulación al alza sustancial de la expresión de los principales reguladores de IFN-γ, como Tbx21, Atf2, Nfat y Stat3 (^[28], ^[29]), así como la regulación al alza de Gapdh, como un modulador postranscripcional que se une a la región 3′ no traducida de IFN-γ para regular su expresión postranscripcional (^[37]). En conjunto, estas líneas de evidencia establecen que las células dCAR T están epigenéticamente preparadas para una producción robusta de IFN-γ.

Si bien IFN-γ es una citocina bien caracterizada que participa en las respuestas mediadas por las células T (^[7], ^[38], ^[39]), nuestro estudio radica en definir una plataforma autónoma y autorreforzante por la cual las células CAR T programadas epigenéticamente, sin una ingeniería genética o regímenes de combinación adicionales, pueden producir intrínsecamente niveles suprabiológicos de IFN-γ, induciendo así la ICD en los tumores antígeno-negativos, activando las DC y, posteriormente, iniciando una respuesta de células T endógenas policlonales de novo.

Aunque se ha establecido previamente la capacidad de IFN-γ para mediar la muerte celular tumoral (^[30]–^[32]), nuestro estudio revela cómo las células CAR T programadas epigenéticamente pueden orquestar de forma autónoma toda la cascada de AS, lo que permite un control eficaz de los tumores antígeno-negativos y las lesiones abscópicas. Al utilizar múltiples modelos tumorales, distintas configuraciones de antígenos (tanto sustitutos como antígenos asociados a tumores) y una serie de ensayos funcionales, incluida la citometría ELISPOT, scTCR-seq, la citometría de masas (CyTOF) y estudios de aloinjerto en ratones, hemos construido un marco causal integral que demuestra que la terapia con células dCAR T es tanto necesaria como suficiente para iniciar la eliminación tumoral impulsada por la AS.

En resumen, este estudio demostró un mecanismo potencial para la generación de AS después del tratamiento con células dCAR T, en el que las células dCAR T activadas por el antígeno liberan cantidades sustanciales de IFN-γ para impulsar una ICD generalizada en las células tumorales, activando así las DC y estimulando las células T CD8+ endógenas (Fig. 6H). Estos conocimientos respaldan firmemente la función antitumoral de las células dCAR T tanto en los tumores antígeno-positivos como en los antígeno-negativos mixtos y los tumores abscópicos antígeno-negativos. Nuestros hallazgos subrayan el papel fundamental de las células dCAR T en el tratamiento eficaz de los tumores heterogéneos e incluso de los tumores heterogéneos abscópicos, lo que afirma su potencial en los ensayos clínicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio

Este estudio fue diseñado para investigar el papel de las células dCAR T en la inducción de la AS dentro de las células T endógenas para la erradicación de tumores sólidos antigénicamente heterogéneos en ratones inmunocompetentes. Generamos células dCAR T murinas mediante la transducción de células T esplénicas murinas con un retrovirus, incorporando 10 nM de DAC según lo descrito en nuestro estudio anterior (^[19]). La eficacia antitumoral y la capacidad de remodelación del microambiente tumoral (TME) de las células dCAR T se evaluaron mediante citometría de flujo, citometría de masas (CyTOF) y estudios de aloinjerto en ratones. Analizamos aún más la eliminación de tumores heterogéneos mediada por la AS desencadenada por las células dCAR T en las células T endógenas mediante secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq), ELISPOT, citometría de flujo, bloqueo del anticuerpo CD3, tumores de mezcla de antígeno positivo y antígeno negativo y estudios de injerto de tumores abscópicos antígeno negativos, y estudios de reinoculación de tumores antígeno negativos. Por último, dilucidamos el mecanismo de la AS dentro de las células T endógenas inducida por las células dCAR T mediante cocultivo in vitro utilizando un inserto Transwell, citometría de flujo, análisis multiómicos y diversos estudios de injerto tumoral. Para los experimentos in vivo, los ratones C57BL/6, OT-I y Batf3−/− de 6 a 8 semanas de edad se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento. Durante la recopilación y el análisis de los datos, los investigadores no estaban cegados a la asignación de los grupos.

Líneas celulares

Se mantuvieron en cultivo las líneas celulares, incluidas OVA+MC38, MC38, OVA+B16F10, B16F10 y B16F10 que expresaban luciferasa, mCherry y CD19 humano (generadas en este estudio), y MC38 que expresaba CD19 humano (generada en este estudio), en medio RPMI 1640 completo (Gibco), que contenía 10% (v/v) de suero bovino fetal (SFB; Gibco), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Las células 293T (American Type Culture Collection) se cultivaron en medio Dulbecco modificado Eagle (Gibco) suplementado con 10% (v/v) de SFB (Gibco), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml).

Animales

Se adquirieron ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad de SPF Biotechnology Co., Ltd. Se adquirieron ratones C57BL/6 con alelos CD45.1+ de seis a ocho semanas de edad del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín. Los ratones OT-I y Batf3−/− se obtuvieron del Jackson Laboratory. Los ratones Ifng−/− fueron donados por M. Jing (Instituto Chino de Investigación Cerebral, Pekín, China). Estos ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales del Hospital General del Ejército Popular Chino en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Ejército Popular Chino (SQ2021216).

Construcción de CAR y generación de células T CAR

La secuencia del fragmento variable de cadena única (ScFv) de unión a CD19 humano se derivó del anticuerpo monoclonal FMC63. Los constructos murinos de CAR contenían un ScFv anti-CD19 humano, un dominio de bisagra y transmembrana CD8a murino, y los dominios intracelulares murinos de 4-1BB y CD3ζ; la proteína fluorescente verde (GFP), que estaba separada por una secuencia peptídica de autolimpieza (T2A), se generó y clonó en un vector retroviral de virus de células madre murinas, como se describió previamente (fig. S1A) (^[40]). El CAR y el plásmido pCL-ECO se transfectaron en células 293T utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 3000. Los sobrenadantes retrovirales se recogieron y se almacenaron a −80 °C.

Se aislaron linfocitos murinos del bazo utilizando el kit de separación de linfocitos murinos (Solarbio, China). Los linfocitos se sembraron a 3 × 106 por pocillo en placas de 24 pocillos en medio RPMI 1640 y se estimularon con anticuerpos anti-CD3 (500 μg/ml) y anti-CD28 (500 μg/ml) (BioLegend) y IL-2 humana recombinante (rhIL-2; 300 UI/ml; PeproTech). De 24 a 48 horas después de la activación celular, se añadieron los sobrenadantes retrovirales en placas de 24 pocillos pretratadas con retronectina (Takara) y se centrifugaron a 2000 g durante 1,5 horas a 32 °C. A continuación, se eliminaron los sobrenadantes. Se añadieron un total de 1,5 × 106 células activadas durante 24 horas a cada pocillo, y también se añadió polibreno (8 μg/ml; Sigma-Aldrich) a cada pocillo. Además, se añadió 10 nM de DAC (Sigma-Aldrich) al sistema infectado para la preparación de células T CAR con pretratamiento con DAC. Después de la centrifugación a 800 g durante 10 min a 32 °C, las placas se incubaron a 37 °C en 5% de CO2. Las células transducidas por retrovirus se transfirieron a nuevas placas al día siguiente y se expandieron aún más con rhIL-2 (300 UI/ml).

Análisis citométrico de flujo

Se evaluó el inmunofenotipo de los productos de células T dCAR mediante citometría de flujo con anticuerpos fluorescentes antimurinos específicos para CD3, CD4, CD8, CD44, CD62L, TIM3, LAG3 y PD1 (BioLegend). Las células T dCAR se recogieron después de un total de 10 días en cultivo y se tiñeron con estos anticuerpos durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. El tinción de control se realizó con anticuerpos monoclonales de isotipo coincidente. Se detectó la expresión de GFP en las células T para determinar la eficiencia de transducción.

Para un ensayo de desgranulación, las células T dCAR-19 se cocultivaron con células B16+CD19 a una relación efector:objetivo (E:O) de 1:1 que contenía un anticuerpo anti-CD107a murino (BioLegend) durante 1 hora, seguido de la incubación con un inhibidor del transporte de proteínas del Golgi Plug (BD Biosciences) durante 3 horas. Para un ensayo de citocinas intracelulares, las células T dCAR-19 se cocultivaron con células B16+CD19 a una relación E:O de 1:1 que contenía un inhibidor del transporte de proteínas del Golgi Plug durante 4 horas. Después de eso, las células se fijaron/permeabilizaron utilizando el juego de tinción de Foxp3/factor de transcripción (Invitrogen) durante 1 hora a 4 °C y se lavaron con tampón de permeabilización. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos anti-IL-2, IFN-γ, TNF-α, perforina y granzima B murinos (BioLegend) a temperatura ambiente durante 30 min y se lavaron de nuevo con tampón de permeabilización.

Todas las muestras se evaluaron utilizando un citómetro de flujo DxFLEX (BECKMAN COULTER). Los datos se analizaron con Kaluza analysis 2.0 (BECKMAN COULTER) y el software FlowJo v.10 (FlowJo LLC).

Análisis de citotoxicidad basado en luciferasa

Se evaluó la citotoxicidad basada en células CD19+B16-luciferasa, como se describió previamente (^[41]). Las células T CAR-19 o dCAR T-19 se sembraron en una placa blanca opaca; a continuación, se añadieron células CD19+B16-luciferasa a cada pocillo a relaciones E:O de 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 y 1:30, y las placas se incubaron a 37 °C en 5% de CO2 durante los tiempos indicados. Después de eso, se añadieron 100 μl de solución de D-luciferina 2× (300 μg/ml) a cada pocillo, y la luminiscencia se evaluó después de 5 min mediante Varioskan LUX (Thermo Fisher). El porcentaje de lisis tumoral se analizó mediante la siguiente fórmula: 1 − [(valor de la muestra) − (valor del control negativo)]/[(valor del control positivo) − (valor del control negativo)].

Muerte celular tumoral

Para la muerte celular tumoral bajo estimulación con IFN-γ, se sembraron células tumorales (5 × 104 células por pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos y se estimularon con IFN-γ murino recombinante (20 ng/ml; PeproTech) durante 48 horas. Después de eso, se determinó la muerte celular mediante un kit de detección de apoptosis siguiendo el protocolo del fabricante.

Para la permeabilización de la membrana de células tumorales positivas para el antígeno, las células tumorales se cocultivaron con células T dCAR-19 o CAR T-19 premarcadas con éster de carboxyfluoresceína durante 24 horas a una relación E:O de 1:1. A continuación, se utilizó un kit de detección de apoptosis (BD Biosciences) para analizar la permeabilización de la membrana de las células tumorales.

Para la permeabilización de la membrana de células tumorales negativas para el antígeno, se utilizó un Transwell en este experimento in vitro. En los insertos superiores, las células tumorales positivas para el antígeno se cocultivaron con células T dCAR-19 o CAR T-19 a una relación E:O de 1:1, y las células tumorales negativas para el antígeno se sembraron en los pocillos inferiores. Después de la incubación durante 24 horas, se analizaron las células tumorales negativas para el antígeno en el pocillo inferior mediante un kit de detección de apoptosis.

Experimentos con animales

Se inyectaron por vía subcutánea 3 × 105 células tumorales CD19+B16 a ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad. A continuación, se realizó una linfodepleción en los ratones mediante inyecciones intraperitoneales de 200 μg de ciclofosfamida y 100 μg de fludarabina, respectivamente, después de 4 y 5 días. Siete días después, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos y recibieron una inyección intravenosa en la cola con 1 × 107 células T no transducidas, células CAR T-19 y células dCAR T-19 por ratón. Para los experimentos de reexposición tumoral, se inyectaron por vía subcutánea células tumorales CD19+B16 en el flanco opuesto de los ratones supervivientes que lograron una respuesta completa, y se utilizaron ratones C57BL/6 de la misma edad y sin tumores como control.

Para la activación de AS desencadenada por experimentos con dCAR T, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con 3 × 105 células premixadas en una relación de 1:1 de CD19+B16:OVA+B16 o CD19+MC38:OVA+MC38 en el flanco izquierdo y 1,5 × 105 células OVA+B16 o OVA+MC38 en el flanco derecho. A continuación, se transfirieron por vía intravenosa 1 × 107 células CAR T-19 y dCAR T-19 congénicas a los receptores a través de la vena de la cola.

Para los experimentos de activación de AS desencadenados por células T TCR, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con 3 × 105 células premixadas en una relación de 1:1 de OVA+B16:OVA−B16 en el flanco izquierdo y 1,5 × 105 células OVA−B16 en el flanco derecho. A continuación, se transfirieron por vía intravenosa 5 × 105 células CD8+ OT-1 y células CD8+ OT-1 con pretratamiento con DAC congénicas a los receptores a través de la vena de la cola.

Para los experimentos de bloqueo de anticuerpos anti-CD3, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con 3 × 105 células premixadas en una relación de 1:1 de CD19+B16:OVA+B16 en el flanco izquierdo y 1,5 × 105 células OVA+B16 en el flanco derecho. A continuación, se inyectaron por vía intraperitoneal 200 μg/ratón de anticuerpos anti-CD3 murinos (BioXcell) después de 5 y 6 días, respectivamente. Siete días después, se inyectaron por vía intravenosa en la cola 1 × 107 células CAR T-19 y dCAR T-19 por ratón.

Para los experimentos de bloqueo de anticuerpos anti-IFN-γ, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con 3 × 105 células premixadas en una relación de 1:1 de CD19+B16:OVA+B16 en el flanco izquierdo y 1,5 × 105 células OVA+B16 en el flanco derecho. Siete días después, se inyectaron por vía intravenosa en la cola 1 × 107 células CAR T-19 y dCAR T-19 por ratón. A continuación, se inyectaron por vía intraperitoneal 500 μg de anticuerpos anti-IFN-γ murinos (Bioxcell) por ratón 2, 3 y 5 días después de la terapia celular adoptiva (ACT).

Se monitorizó el tamaño del tumor en los momentos indicados, y se analizó el tamaño del tumor mediante la siguiente fórmula: (longitud × ancho2)/2. Se recogieron muestras de sangre, bazo y tumor en los momentos indicados. Los ratones con tumores se sacrificaron cuando mostraron parálisis, movilidad reducida, mala condición física o tumores con un diámetro mayor de 2000 mm3.

CyTOF

Tras la linfodepleción, se inyectaron ratones C57BL/6 (CD45.2+) con tumores de CD19+B16 con 1 × 107 células CAR T-19 y dCAR T-19 congénicas. Se recogieron tejidos tumorales de cinco ratones por grupo en el día 7 después de la ACT. Los tejidos de cada grupo se juntaron y se disociaron en células individuales utilizando un kit de disociación de tejidos. A continuación, se aislaron las células CD45+ utilizando cuentas magnéticas para el ensayo CyTOF.

Se añadió cisplatino-194Pt a las suspensiones de células CD45+ y se incubó a 4 °C durante 5 min. A continuación, se lavaron las células con PBS dos veces y se incubaron con la mezcla de bloqueo a 4 °C durante 20 min. Después de eso, las células se tiñeron con los cócteles de anticuerpos de superficie conjugados con metal deseados para las células inmunitarias, incluidos CD4+ CAR T (CD45.1+CD3+CD4+), CD8+ CAR T (CD45.1+CD3+CD8+), CD4+ T endógenos (CD45.2+CD3+CD4+), CD8+ T endógenos (CD45.2+CD3+CD8+), NK (CD45.2+CD3−CD49b+CD161+), DC (CD45.2+CD11b+MHC-II+CD11c+CD86+) y macrófagos (CD45.2+CD11b+F4/80+CD86−CD11c−), y se incubaron a 4 °C durante 30 min. Las células se tiñeron con iridio-191/193 después de ser fijadas y permeabilizadas con el tampón de fijación/transcripción de Foxp3 a 4 °C durante la noche. A continuación, las células se tiñeron secuencialmente con una mezcla de anticuerpos intracelulares conjugados con metal a 4 °C durante 30 min. Se utilizó un citómetro de masas CyTOF Helios (Fluidigm) para analizar y adquirir datos, que se normalizaron a la señal de las cuentas EQ, se desbarajaron utilizando un esquema de filtrado de dobletes y se analizaron con el software FlowJo v.10.

ELISPOT

Se aislaron las células T endógenas del bazo para evaluar la activación de AS mediante la medición de la expresión de IFN-γ, como se describió previamente (^[7]). Primero, para obtener células CD45.1+ o CD45.2+ endógenas, se tiñeron los leucocitos con anticuerpos anti-CD45.1 o anti-CD45.2 conjugados con ficoeritrina (PE) (BioLegend), y luego se añadieron cuentas anti-PE (MACS) y se incubaron. A continuación, se recogieron las células CD45.1+ o CD45.2+ del efluente mediante separación celular magnética. Después de eso, se aislaron las células T CD3+ de las células CD45.1+ o CD45.2+ utilizando un kit de aislamiento de células T CD3+ (BioLegend).

Se mezclaron un total de 2 × 105 células T CD3+ con 2 × 104 células pretratadas con 100 UI de IFN-γ murino y células cancerosas irradiadas en 200 μl de medio completo y se sembraron en una placa ELISPOT de 96 pocillos pretratada con anticuerpo de captura de IFN-γ (BD Biosciences). Después de la incubación durante 24 horas a 37 °C en la oscuridad, se evaluó la producción de IFN-γ con un kit de ensayo ELISPOT de IFN-γ (BD Biosciences) según el protocolo del fabricante. A continuación, se utilizó un analizador ImmunoSpot S6 (Cellular Technology Limited) para enumerar los puntos de citocinas.

Medición de citocinas en el sobrenadante del cultivo: las células dCAR T-19 se cocultivaron con células B16 CD19+ en una proporción E:T de 1:1 en 1 ml de medio RPMI 1640 completo durante 24 horas. Después, se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó la producción de IL-2, IFN-γ y TNF-α en los sobrenadantes mediante un kit de ensayo inmunoenzimático (ELISA) (Novus) según el protocolo del fabricante.

Medición de citocinas en suero: se obtuvo sangre en tubos recubiertos con heparina mediante punción de la vena caudal y, a continuación, se recogió el suero después de centrifugar la sangre a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y se almacenó a −80 °C. Los niveles de IFN-γ, calreticulina, proteína de unión al ADN de alta movilidad 1 (HMGB1) (Novus) y ATP (Absin) se determinaron mediante un kit ELISA según el protocolo del fabricante.

Medición de citocinas en el tumor: los tumores se recogieron el día 7 después de la implantación del tumor. A continuación, se aplicaron 100 mg de tumores al homogeneizado en 100 μl de PBS. Las muestras de tumor se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y se recogieron los sobrenadantes. Los niveles de IFN-γ, ATP, calreticulina y HMGB1 se determinaron mediante un kit ELISA según el protocolo del fabricante.

Fenotipado de células inmunitarias en bazo y tumores

Se recogieron los bazos y se disociaron en 1 ml de PBS. Las células del bazo se recogieron después de centrifugarlas a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Los tumores de los ratones que recibieron terapia con células CAR T o dCAR T se recogieron quirúrgicamente y se pesaron. A continuación, los tumores se disociaron en suspensión de células individuales mediante el kit de disociación de tejidos (MACS) según el protocolo del fabricante, y las células individuales se recogieron haciendo pasar los tumores a través de un tamiz celular de 70 mM y se resuspendieron con 100 μl de PBS por cada 200 mg de tumor.

Análisis de inmunofenotipado en células del bazo: las células del bazo se tiñeron con un cóctel de anticuerpos CD3 y CD45, y luego se detectó la expresión de GFP en las células T CD3+ para determinar las células T CAR+ en el bazo.

Análisis de inmunofenotipado en células inmunitarias en tumores: se lavaron 50 μl de la suspensión de células tumorales prepreparada y se tiñeron con los cócteles de anticuerpos deseados para las células inmunitarias del huésped, incluyendo T (CD45.2+CD3+), NK (CD45.2+CD3−NK1.1+), CD11b (CD45.2+CD11b+), DCs (CD45.2+Ly6G−CD11b−CD11c+), y M2 (CD45.2+Ly6G−CD11b+F4/80+CD206+) (^[42]), así como DCs CD103+ (CD45.2+Ly6c−MHC II+F4/80−CD11b−CD103+) (^[15], ^[43]), durante 30 minutos a 4 °C, seguido de dos lavados con 1 ml de PBS. Después, las células se resuspendieron en PBS para el análisis de citometría de flujo.

Tinción con tetrámero en células inmunitarias en tumores: se lavaron 50 μl de la suspensión de células tumorales prepreparada y se tiñeron con 10 μl de tetrámero PE conjugado-SIINFEKL o tetrámero PE conjugado-KSPWFTTL (MBL) más bloqueador de Fc durante 60 minutos a 4 °C en la oscuridad, seguido de la tinción con un cóctel de anticuerpos premezclado para las células T CD8+ específicas de OVA endógenas (CD45.2+CD3+CD8+SIINFEKL-Tetrámero+) o las células T CD8+ específicas de MuLV p15E (CD45.2+CD3+CD8+KSPWFTTL-Tetrámero+) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. A continuación, las células se lavaron dos veces y se analizaron con citometría de flujo.

Secuenciación ATAC

Las células CAR+ T se clasificaron mediante citometría de flujo después de 10 días de cultivo in vitro de células CAR T y dCAR T. Se aislaron los núcleos de aproximadamente 1 × 105 células CAR+ T clasificadas utilizando ATAC-LB. Las muestras se enviaron a LC-Bio para la construcción y secuenciación de la biblioteca. A continuación, se realizó una reacción de transposición con la transposasa Tn5 (Illumina) durante 30 minutos a 37 °C con agitación a 1000 rpm. El ADN se purificó utilizando el kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen) después de la tagmentación. Después, el ADN tagmentado se amplificó con la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion (NEB) durante 14 ciclos de PCR. Las bibliotecas amplificadas se purificaron aún más con el kit de purificación de PCR MinElute. Antes de la secuenciación, se realizó una selección de doble tamaño de las bibliotecas finales utilizando cuentas AMPure. Se realizó la secuenciación de extremo a extremo (2 × 75 pares de bases) en una plataforma Illumina NextSeq 5000.

Análisis de secuenciación ATAC

La calidad de las secuencias sin procesar se analizó utilizando el software FASTQ, mientras que Cutadapt filtra y extrae lecturas limpias de alta calidad. Los datos de secuenciación se alinean con los genomas de referencia utilizando bwa-mem2. Se seleccionan las lecturas con una puntuación MAPQ de 30 o superior para la comparación, y se excluyen las lecturas duplicadas. Después de la alineación, los resultados por posiciones de alineación del genoma se ordenan utilizando Samtools, y los alineamientos duplicados se eliminan utilizando rmdup. A continuación, Bedtools convierte el archivo bam en un archivo bed para un análisis posterior.

Se utilizó el software MACS2 para identificar y evaluar las regiones del genoma con alta abundancia de longitud de lectura. Se estableció el valor umbral P en