Las células T con receptores quiméricos de antígenos dirigidos contra KRASG12V/HLA-A*02:01 muestran una potente actividad preclínica contra tumores sólidos.

Los tratamientos eficaces siguen siendo limitados para los tumores avanzados, especialmente para las neoplasias sólidas (^[1]). Las células T modificadas con receptores de antígenos quiméricos (CAR), ejemplificadas por la orientación a CD19 y al antígeno de maduración de células B (BCMA), han logrado importantes avances en el tratamiento de los tumores hematológicos (^[2], ^[3]). A pesar de décadas de investigación, los avances terapéuticos para los tumores sólidos siguen siendo limitados, con barreras persistentes para lograr respuestas clínicas duraderas. Uno de los principales obstáculos es la selección de los objetivos óptimos (^[4]). Actualmente, los objetivos de las células T CAR para los tumores sólidos consisten principalmente en antígenos asociados al tumor, como la mesotelina, el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) y B7-H3 (^[5]–^[7]). Estos objetivos también se expresan en los tejidos normales, lo que conlleva una eficacia terapéutica incierta y riesgos o problemas de seguridad fuera del objetivo (^[8]). Por lo tanto, es de suma importancia abordar el urgente problema de identificar objetivos de alta especificidad para el tratamiento de los tumores sólidos. Los neoantígenos son antígenos específicos derivados de mutaciones no sinónimas en los tumores (^[9]). El gen homólogo del oncogén del sarcoma de rata de Kirsten (KRAS) está frecuentemente mutado en tumores de tres tipos principales de cáncer: adenocarcinoma de pulmón (30%), cáncer colorrectal (CRC; 40%) y adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC; más del 90%) (^[10]–^[13]). Las mutaciones primarias en KRAS, en particular G12D y G12V, que están presentes en el 60% al 70% del cáncer de páncreas y en el 20% al 30% del CRC, se producen en el codón 12 (^[10]). Dada la importante relevancia clínica de KRASG12V y los desafíos que presenta para el desarrollo de fármacos debido a problemas estructurales (^[14]–^[16]), actualmente no existe ninguna terapia dirigida disponible para esta mutación en particular. Por lo tanto, este objetivo no solo exhibe características que lo hacen susceptible a fármacos, sino que también aborda necesidades clínicas insatisfechas.

Actualmente, las estrategias terapéuticas celulares dirigidas a KRASG12V se centran principalmente en la terapia con células T con receptor de células T restringido a HLA-A*11:01 (células T CAR) (^[17], ^[18]). Cabe destacar que, si bien un estudio reciente ha desarrollado con éxito células T CAR dirigidas a KRAS G12V presentado por HLA-A*11:01 (^[19]), hasta donde sabemos, no se ha notificado hasta la fecha ninguna célula T CAR específica para el complejo KRASG12V/HLA-A*02:01. Desde una perspectiva de la distribución de la población, HLA-A*11:01 es relativamente frecuente en las poblaciones asiáticas (~15% a 30%) (^[20]), mientras que HLA-A*02:01 no solo mantiene una proporción considerable en las poblaciones asiáticas (~10% a 20%), sino que también es predominante en las poblaciones europeas y americanas (~30% a 50%) (^[21]–^[23]). Esto hace que las estrategias terapéuticas dirigidas a epítopos restringidos a HLA-A*02:01 sean aplicables a una población de pacientes más amplia, con un mayor potencial de mercado. Sobre esta base, nuestro estudio tuvo como objetivo desarrollar una terapia con células T CAR dirigida al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 para superar las limitaciones terapéuticas actuales y proporcionar una opción de tratamiento eficaz para una población de pacientes más amplia. Utilizamos la tecnología de visualización de anticuerpos fágicos para seleccionar anticuerpos capaces de interacciones específicas y de alta afinidad con los péptidos KRASG12V presentados por HLA-A*02:01 a partir de bibliotecas de fragmentos de cadena variable de cadena única (scFv). Estos anticuerpos se combinaron con los dominios intracelulares CAR 4-1BB y CD3ζ para construir receptores de antígenos quiméricos que puedan dirigirse selectivamente a las células que expresan KRASG12V/HLA-A*02:01. Además, se añadió una etiqueta RQR8 para mejorar la seguridad en el entorno clínico (^[24]).

Este estudio describe el desarrollo y la validación de una célula T CAR dirigida a KRASG12V/HLA-A*02:01 que demostró actividad antitumoral tanto in vitro como in vivo, lo que ofrece un tratamiento potencialmente eficaz y seguro para los tumores sólidos. Además, al combinar las ventajas de la terapia con células T CAR con la alta frecuencia de las mutaciones de KRAS en los tumores sólidos, desarrollamos con éxito una prometedora estrategia de tratamiento del tumor, sentando las bases para futuros ensayos clínicos.

RESULTADOS

Selección de scFv específicos para el complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 e ingeniería de la estructura de la célula T CAR

Analizamos la frecuencia de la mutación KRASG12V utilizando las bases de datos bioinformáticas en línea (cBioPortal) y en cohortes de pacientes locales, confirmando su alta prevalencia en múltiples tumores sólidos, incluidos los tumores de páncreas, colon y pulmón (fig. S1). Dada la dificultad de desarrollar fármacos de molécula pequeña dirigidos a KRAS (^[16]), en particular debido a la falta de fármacos aprobados para KRASG12V, utilizamos la terapia con células T CAR para eliminar directamente los tumores que expresan la mutación KRASG12V. Utilizamos la base de datos Allele Frequency Net Database (AFND) para analizar la distribución y expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) y seleccionamos HLA-A*02:01, una molécula MHC de clase I que es muy frecuente en la población (10% a 28%) (fig. S2). Primero, eluímos fragmentos scFv que se unían específicamente al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 a partir de una biblioteca scFv natural derivada de la sangre de individuos sanos. Después de varias rondas de enriquecimiento, se verificaron casi 1000 monoclonales con afinidad confirmada por la proteína tetramérica KRASG12V/HLA-A*02:01, y la figura 1A ilustra 11 clones con capacidad de unión al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01. De estos 11 clones positivos, solo dos (A4 y B9) podían unirse específicamente al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 y no unirse de forma no específica al complejo KRAS WT/HLA-A*02:01 (fig. 1A). A continuación, se secuenciaron ambos clones y se sintetizaron proteínas de anticuerpos de cadena única; la concentración efectiva media (EC50) del tetrámero objetivo fue de 9,159 nM (A4) y 2,589 nM (B9), respectivamente (fig. 1B). Para estimar aún más la afinidad de unión, utilizamos un ensayo de visualización de superficie de levadura (^[25]), midiendo las constantes de disociación aparentes (Kd) de 34,92 nM para A4 y 5,17 nM para B9 (fig. S3). La afinidad superior de B9 se alinea con su mayor potencia funcional observada en los ensayos posteriores. Se utilizaron dos scFv específicos para KRASG12V/HLA-A*02:01 para generar dos construcciones CAR únicas denominadas A4.CAR y B9.CAR (fig. 1C). Las células T CAR CD19 [con scFv derivados del anticuerpo FMC63, según se informó anteriormente (^[26])] y las células T no transducidas (UTD) se utilizaron como controles. El análisis citométrico de flujo de la positividad de CD34 confirmó que superaba el 50% de la tasa de transducción en las poblaciones de linfocitos T activadas (fig. 1D). Para comparar la eficacia de los dos grupos de células T CAR frente a las células T de control, se utilizaron microesferas de CD34 para la clasificación positiva de las células T CAR transducidas, logrando una pureza de casi el 100% (fig. 1E). El análisis fenotípico reveló que las células T CAR preparadas exhibían una proporción aumentada de células T de memoria efectoras (CD45RA−CCR7−) y una disminución de la población de células T ingenuas (CD45RA+CCR7+), mientras que las frecuencias de los subconjuntos de efectores terminales (CD45RA+CCR7−) y de memoria central T (CD45RA−CCR7+) permanecieron comparables (fig. 1F). Por lo tanto, generamos con éxito células T CAR que se dirigían a KRASG12V/HLA-A*02:01.

Las células T CAR B9 inducen la muerte de tumores positivos para KRASG12V/HLA-A*02:01

Para validar funcionalmente las células T CAR in vitro, se diseñaron tres líneas celulares utilizando la línea celular de leucemia K562. Estas incluían células K562 transducidas con solo KRASG12V, HLA-A*02:01 o tanto KRASG12V como HLA-A*02:01 (fig. 2A). Primero, se pulsaron diferentes concentraciones de péptido KRAS de tipo salvaje (KLVVVGAGGV), péptido G12D (KLVVVGADGV) y péptido G12V (KLVVVGAVGV) en las células K562 objetivo transducidas con HLA-A*02:01. La liberación de la citocina interferón-γ (IFN-γ) se utilizó para validar preliminarmente las funciones de las células T CAR A4 y B9. Los resultados mostraron que las dos células T CAR construidas eran capaces de reconocer específicamente las células objetivo con KRAS G12V, pero no las células tumorales con KRAS WT o G12D, en respuesta a la administración de HLA-A*02:01 (fig. 1B). En contraste con A4, las células T CAR B9 exhibieron una potente actividad, incluso a concentraciones mucho más bajas de péptido G12V (fig. 1B). Después de la cocultivación con células objetivo a diferentes proporciones durante 24 horas, tanto las células T CAR A4 como B9 exhibieron citotoxicidad específica contra las células tumorales KRASG12V presentadas por HLA-A*02:01, con B9 exhibiendo una mayor eficacia de muerte en comparación con A4 (fig. 2C). A una relación efector:objetivo (E:T) de 2:1, tanto las células T CAR A4 como B9 produjeron significativamente más factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e IFN-γ que las células T CAR CD19 o las células UTD de control (fig. 2D y fig. S4A). Esta especificidad se limitó al mutante G12V. Cuando se probaron contra las células K562 diseñadas para coexpresar HLA-A*02:01 y otro mutante común, KRASG12C, ni las células T CAR A4 ni B9 mostraron una notable respuesta citotóxica o liberación de citocinas (fig. S4, B a D), lo que confirmó la ausencia de reactividad fuera del objetivo contra este mutante relacionado.

Además, seleccionamos líneas celulares endógenas que expresan el objetivo de los cánceres de páncreas, colon, pulmón no microcítico y ovario para validar la citotoxicidad de las células T CAR. Utilizando la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer (CCLE) y las bases de datos Cellosaurus, identificamos cuatro líneas celulares tumorales humanas (CFPAC-1, SW620, NCI-H441 y OVCAR-5) que expresan KRASG12V y HLA-A*02:01, y cuatro líneas celulares tumorales humanas (PANC-1, Caco-2, A549 y SK-OV-3) que no expresan KRASG12V. Se verificó la expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 en estas líneas celulares utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR) y la citometría de flujo (fig. S5 y tabla S1). Las células T CAR A4 y B9 lisaron eficazmente las células objetivo (fig. 2E). En los ensayos de cocultivo con las células CFPAC-1, NCI-H441 y OVCAR-5, las células T CAR B9 exhibieron una mayor eficacia de muerte en relación con A4. Ni las células T CAR A4 ni B9 controlaron el crecimiento tumoral en las cuatro líneas celulares KRASG12V negativas. De manera similar a la línea celular K562 diseñada, tanto las células T CAR A4 como B9 mostraron una mayor secreción de TNF-α e IFN-γ en los sobrenadantes del cultivo (fig. 2F y fig. S4D). Cuando se eliminó la proteína KRAS o la proteína beta-2-microglobulina (B2M) en las células CFPAC-1, la capacidad de muerte específica de las células T CAR A4 y B9 se perdió posteriormente (fig. 2, G a L). En conjunto, estas dos células T CAR demostraron una actividad de muerte específica eficaz contra las células tumorales que expresan KRASG12V/HLA-A*02:01. Teniendo en cuenta la mayor activación de las células T y la liberación de citocinas observadas en las células T CAR B9 in vitro, las seleccionamos para los estudios posteriores de citotoxicidad de organoides, secuenciación de células individuales y estudios in vivo.

Las células T CAR B9 muestran un potente efecto citotóxico sobre los organoides de CRC derivados de pacientes

Para establecer un modelo clínicamente relevante para evaluar la eficacia de la terapia con células T CAR, recogimos tejidos tumorales de CRC de pacientes con o sin expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 y establecimos con éxito organoides derivados de pacientes (PDO). Se identificó KRASG12V utilizando PCR cuantitativa en tiempo real de ADN genómico humano extraído de tejidos patológicos incluidos en parafina, y se identificaron los alelos del antígeno leucocitario humano (HLA) utilizando la secuenciación de Sanger del sangre total. Los organoides de CRC derivados de pacientes recapitularon fielmente las características histológicas de sus tumores parentales (fig. 3A). Después de 72 horas de cocultivo, las células T CAR B9 demostraron una actividad lítica significativamente mejorada contra los organoides objetivo, medida por la liberación de caspasa-3 escindida (fig. 3B). En particular, las células T CAR B9 secretaron cantidades sustancialmente mayores de IFN-γ y TNF-α cuando se dirigieron a organoides que expresaban tanto KRASG12V como HLA-A*02:01 (fig. 3C). Esta actividad dependía estrictamente de la presencia del neoantígeno KRASG12V, ya que las células T CAR B9 no provocaron una respuesta significativa contra los PDO de control positivos para HLA-A*02:01 y negativos para KRASG12V (fig. S6). Estos hallazgos validan los PDO como una plataforma fisiológicamente relevante para evaluar la eficacia de la terapia con células T CAR y resaltan su potencial para avanzar en la investigación de la inmunología tumoral y el desarrollo de la inmunoterapia de precisión.

El perfilado transcriptómico de células individuales revela heterogeneidad metabólica y funcional en las células T CAR B9 durante la activación específica del antígeno

Para caracterizar las células B9 CAR T, realizamos un análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células UTD T, células B9 CAR T y células B9 CAR T estimuladas por los grupos CFPAC-1. En total, se retuvieron 27.068 células para el análisis posterior tras el control de calidad. El análisis de agrupamiento no supervisado y la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) utilizando Seurat revelaron 11 poblaciones celulares distintas en el conjunto de datos de secuenciación de una sola célula (Fig. 4A). Entre ellas, los grupos 0, 3, 6 y 10 disminuyeron gradualmente en las células UTD T, las células B9 CAR T y las células B9 CAR T con los grupos CFPAC-1, mientras que los grupos 1, 2, 5, 8 y 9 fueron más abundantes en las células B9 CAR T que en los grupos UTD; los grupos 1, 8 y 9 mostraron una proliferación marcada en las células B9 CAR T con el grupo CFPAC-1 (Fig. 4B), lo que sugiere que las células B9 CAR T pueden funcionar principalmente a través de estos tres grupos después de la estimulación antigénica. Los 11 grupos se anotaron utilizando marcadores T conocidos (^[27]) y se identificaron cinco subtipos de células T: el grupo 9 se anotó como células T de memoria (expresión elevada del receptor de la interleucina-7 (IL-7R), linfotoxina beta (LTB), acuaporina 3 (AQP3) y CD27), los grupos 0 y 2 como células T naïvas (expresión elevada de TCF7, SELL y CCR7), el grupo 10 como células T citotóxicas (expresión elevada de GZMA, GZMB, GZMH, PRF1, GNLY y NKG7), el grupo 3 como células T activadas (expresión elevada de CD69, HLA-DRA, HLA-DRB1) y los seis grupos restantes como células T proliferantes (Fig. 4C). Las células T citotóxicas disminuyeron gradualmente en las células UTD T, las células B9 CAR T y las células B9 CAR T con los grupos CFPAC-1 (Fig. 4D), posiblemente debido a la alta expresión del gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), que regula su fenotipo de agotamiento. Tras la estimulación antigénica, la proliferación de las células T y las células T de memoria aumentó sustancialmente en el grupo de células B9 CAR T (Fig. 4E), probablemente debido a la fuerte activación de la vía de señalización CAR, lo que conduce a una rápida proliferación y diferenciación de las células B9 CAR T, con algunas diferenciándose en células T efectoras para una rápida proliferación y función citotóxica, mientras que otras se convierten en células T de memoria con supervivencia a largo plazo y capacidades de reactivación rápida.

Entre las células T proliferantes (grupos 1, 4, 5, 6, 7 y 8), los grupos 1 y 8 en las células B9 CAR T con el grupo CFPAC-1 mostraron una proliferación pronunciada, mientras que los grupos 4, 5, 6 y 7 se eliminaron casi por completo. Para explorar las diferencias entre la expansión y la disminución de la proliferación de las células T, se realizó un análisis diferencial en los grupos 1 y 8 frente a los grupos 4, 5, 6 y 7, identificando 28 genes expresados diferencialmente (DEG). Los grupos 1 y 8 exhibieron una regulación al alza marcada en la producción de citocinas, incluido IFNG, CSF2 y CCL3/4 (Fig. 4F). El análisis de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) reveló un enriquecimiento pronunciado en vías clave críticas para la activación y proliferación de las células T, incluidas la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-Akt, la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la vía de señalización Janus quinasa-transductor y activador de la señalización (^[28]), mientras que las vías de la apoptosis y la senescencia celular se suprimieron (Fig. 4G). Además, encontramos que IL-2RA se expresó altamente en los grupos 1 y 8, particularmente en el grupo 1, así como en las células T de memoria (grupo 9). IL-2RA, una subunidad del receptor de IL-2, desempeña un papel importante en la terapia de células CAR T (^[29]). En el grupo UTD, los grupos 1, 8 y 9 estuvieron casi ausentes, mientras que su abundancia aumentó progresivamente en las células B9 CAR T y las células B9 CAR T con los grupos CFPAC1, lo que sugiere que las células T CAR+ pueden mejorar la proliferación y los efectos de memoria en las células CAR T al aumentar la expresión de IL-2RA.

La proliferación de las células T consistió principalmente en dos subconjuntos espacialmente separados: los grupos 6 y 8 frente a los grupos 1, 4, 5 y 7 (Fig. 4D). Los análisis diferenciales y funcionales posteriores entre los grupos 6 y 8 y los grupos 1, 4, 5 y 7 revelaron que la mayoría de los DEG se expresaron altamente en los grupos 1, 4, 5 y 7, que participaron principalmente en la biosíntesis de trifosfato de adenosina 5', la fosforilación oxidativa, la respiración aeróbica, la respiración celular y otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo energético (Fig. 4I). Una evaluación adicional de la actividad metabólica de una sola célula en los seis grupos de células T proliferantes demostró que los grupos 1, 4, 5 y 7 exhibieron procesos de metabolismo energético mejorados críticos para la proliferación celular, incluido el metabolismo de las purinas, el metabolismo de las pirimidinas, la fosforilación oxidativa y la glucólisis/gluconeogénesis. Tras la estimulación, las células B9 CAR T aceleraron el metabolismo energético para satisfacer las demandas bioenergéticas y biosintéticas de la activación, la función efectora y la expansión rápida, lo que sugiere que la proliferación sustancial del grupo 1 en las células B9 CAR T con el grupo CFPAC-1 puede estar estrechamente relacionada con su mayor actividad metabólica. Además, para dilucidar la dinámica de diferenciación de las células T y determinar si los dos subconjuntos de células T proliferantes divergen durante este proceso, se utilizó Monocle2 para el análisis de la trayectoria pseudotemporal en todas las células (Fig. 4K). Las células T naïvas ocuparon el punto de partida de la diferenciación, con células T proliferantes que se bifurcaron posteriormente en dos ramas distintas (Fig. 4L): los grupos 6 y 8 y los grupos 1, 4, 5 y 7 (Fig. 4M). Dada la divergencia de los estados metabólicos de estos subconjuntos, los caminos de diferenciación divergentes de las células T proliferantes parecen estar impulsados principalmente por las diferencias en la actividad metabólica energética, lo que indica que los distintos perfiles metabólicos pueden determinar el compromiso del destino de las células T proliferantes. En conjunto, utilizamos las ventajas de alta resolución de scRNA-seq para descubrir la heterogeneidad composicional y la funcionalidad de las células B9 CAR T, así como sus respuestas a las células de CPAC. Estos hallazgos ofrecen una explicación mecanicista de las características esenciales de las células B9 CAR T y las interacciones con las células tumorales.

Las células B9 CAR T suprimen el crecimiento del xenoinjerto de CPAC subcutáneo

Para evaluar la eficacia de las células B9 CAR T in vivo, construimos un modelo de xenoinjerto subcutáneo inyectando 1 × 106 células tumorales CFPAC-1 que expresan luciferasa por vía subcutánea, seguido de la administración intravenosa de 5 × 106 células B9 CAR T a través de la vena de la cola 1 semana después (Fig. 5A). Los resultados de la imagen de bioluminiscencia mostraron que las células B9 CAR T controlaron eficazmente el crecimiento tumoral, en contraste con el tampón fosfato salino (PBS), las células UTD T y las células CAR T CD19 (Fig. 5, C y D). Los cinco ratones del grupo B9.CAR sobrevivieron durante más de 80 días y mantuvieron un estado de supresión tumoral, mientras que todos los demás ratones de control murieron en 60 días (Fig. 5, B y C). Por lo tanto, las células B9 CAR T demuestran una actividad antitumoral eficaz en un modelo de ratón de CPAC subcutáneo.

Las células B9 CAR T muestran eficacia terapéutica en modelos de CPAC metastásico humano

Para evaluar el efecto terapéutico de las células B9 CAR T sobre la metástasis tumoral, establecimos un modelo de CPAC metastásico humano mediante la inyección intravenosa de 1 × 106 células CFPAC-1 en ratones NCG. Siete días después de la inoculación del tumor, los ratones del modelo metastásico fueron tratados con dosis variables (0,5 × 106 a 5 × 106 células) de células CAR T administradas por vía intravenosa (Fig. 5E). El día 35 después de la inyección del tumor, las células tumorales se habían metastatizado con éxito a varias partes del cuerpo en los grupos que recibieron la infusión de células UTD y células CAR T CD19 (Fig. 5, G y H). En comparación, las células B9 CAR T a dosis de 1, 2 y 5 millones suprimieron eficazmente el crecimiento y la metástasis del tumor. Los ratones que recibieron una dosis baja (0,5) de la infusión de células B9 CAR T no mostraron supresión del crecimiento tumoral, pero mostraron una curva de supervivencia algo prolongada en comparación con los controles tratados con células CAR T CD19 (Fig. 5, F a H). Este resultado demostró que las células B9 CAR T mostraron una gran eficacia terapéutica en este modelo de metástasis de CPAC.

A continuación, establecimos un modelo de CPAC metastásico utilizando la línea celular de CRC Caco-2, que expresa HLA-A*02:01 pero carece de KRASG12V. Siguiendo un protocolo similar, se inyectaron 1 × 106 células Caco-2 por vía intravenosa, seguido de tratamiento con 0,5 × 106 a 5 × 106 células B9 CAR T por inyección en la vena de la cola 1 semana después (fig. S7A). Coherente con los hallazgos in vitro, las células B9 CAR T no lograron inhibir el crecimiento tumoral in vivo en todas las dosis probadas (fig. S7, C y D). En comparación con las células CAR T CD19, incluso las dosis altas de células B9 CAR T no mostraron ningún beneficio para la supervivencia (fig. S7B). Estos resultados demuestran que el asesinato tumoral mediado por las células B9 CAR T es altamente específico tanto in vitro como in vivo, lo que confirma el direccionamiento dependiente de HLA y excluye la toxicidad fuera del objetivo en contextos de desajuste de HLA.

Las células B9 CAR T erradican las metástasis peritoneales en los modelos de CPAC

Además, las metástasis peritoneales se desarrollan en aproximadamente el 9% de los pacientes con CPAC, lo que resulta en carcinomatosis, que empeora sustancialmente el pronóstico, pero sigue siendo poco comprendida y terapéuticamente no abordada (^[30]). Por lo tanto, establecimos un modelo de CPAC peritoneal diseminado mediante la inyección intraperitoneal de 2 × 106 células tumorales CFPAC-1, seguido de la administración intraperitoneal de 5 × 106 células B9 CAR T 1 semana después para el tratamiento (Fig. 5I). Los resultados mostraron que las células B9 CAR T eliminaron por completo los tumores intraperitoneales y prolongaron la supervivencia en comparación con los grupos de tratamiento con células UTD y células CAR T CD19 (Fig. 5, J a L). Por lo tanto, nuestros datos demostraron que las células B9 CAR T restringieron eficazmente el crecimiento tumoral y mejoraron la supervivencia en los modelos de CPAC metastásico.

El perfil completo de los efectos fuera del objetivo de las células B9 CAR T revela un motivo de reconocimiento crítico y una reactividad cruzada mínima con el proteoma humano

A continuación, para evaluar la posible toxicidad fuera del objetivo de las células CAR T B9, reemplazamos cada aminoácido del péptido KRAS G12V de 10 aminoácidos con glicina y alanina para generar 17 péptidos distintos. Estos péptidos se añadieron a las células K562/HLA-A*02:01 y se detectaron los niveles de la citocina IFN-γ liberada de los sobrenadantes después del cocultivo con las células CAR T B9. Se encontró que el nivel de activación de las células CAR T B9 disminuyó sustancialmente cuando se reemplazaron la valina en las posiciones 3, 4 y 8 y la glicina en las posiciones 6 y 9 (fig. S8A). Por lo tanto, se considera que los residuos en esta posición son esenciales, lo que implica que las posiciones 3, 4, 6, 8 y 9 son fundamentales para la capacidad de las células CAR T B9 de reconocer las células diana. Se realizó una búsqueda de secuencias de proteínas que contuvieran el motivo “XXVVXGXVGX” utilizando la herramienta ScanProsite (^[31]) y luego se analizaron para predecir la afinidad del péptido a HLA-A*02:01 utilizando la herramienta NetMHCpan-4.1, y se identificaron un total de seis péptidos relevantes para los humanos (tabla S2). Posteriormente, se sintetizaron con éxito seis péptidos y se utilizaron para añadir a las células diana K562/HLA-A*02:01. La capacidad de las células CAR T B9 para reconocer estos objetivos se determinó mediante la liberación de IFN-γ. Los resultados mostraron que solo dos péptidos de las proteínas RNF112 y SUOX mostraron una ligera respuesta en el reconocimiento de las células CAR T B9 (fig. S8B). Sin embargo, la diferencia seguía siendo más evidente que la del péptido KRAS G12V. Para validar y definir con precisión estos residuos críticos, realizamos un análisis exhaustivo sustituyendo cada posición en el péptido KRAS G12V con los 19 aminoácidos naturales (excluyendo la cisteína) y evaluamos la activación de las células CAR T B9 como antes (fig. 6A). Utilizando el motivo de reconocimiento refinado (umbral, 30%), realizamos una búsqueda de secuencias de proteínas con la herramienta ScanProsite y predijimos la afinidad de HLA-A*02:01 utilizando NetMHCpan-4.1. Este análisis identificó 27 péptidos candidatos derivados de proteínas humanas (tabla S2). La validación experimental de estos candidatos no reveló ningún péptido cruzado adicional más allá de los dos (RNF112 y SUOX) identificados inicialmente (fig. 6B). Al buscar en la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica, encontramos que estos dos péptidos humanos eran homólogos a los de los ratones. Además, el análisis inmunohistoquímico mostró que RNF112 se localizaba principalmente en el núcleo en el riñón del ratón, mientras que la expresión de SUOX era principalmente citoplásmica en el hígado del ratón (fig. S9). Por lo tanto, a continuación, intentamos verificar la seguridad de las células CAR T B9 en ratones.

Las células CAR T B9 muestran la ausencia de potencial toxicidad in vivo

Para evaluar el potencial de toxicidad in vivo de las células CAR T B9, las infundimos en ratones transgénicos inmunodeficientes NCG que expresaban HLA-A*02:01 humano (NCG-HLA-A2.1) (fig. 6C). Los ratones se observaron durante 1 mes con un control regular del peso corporal y la salud después de la infusión de las células CAR T y luego se sacrificaron a la semana 1 y al mes 1, respectivamente, para recoger muestras de tejido. Encontramos que el tratamiento con células CAR T B9 no causó cambios notables en el peso corporal ni diferencias aparentes en el crecimiento en comparación con los ratones sanos (fig. 6D). En el momento del sacrificio, todos los ratones estaban sanos y no mostraban signos de anomalías. Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en los tejidos para evaluar las lesiones histológicas. Los resultados mostraron que los ratones infundidos con células CAR T B9 no mostraron cambios patológicos aparentes ni infiltración anormal de linfocitos T en los tejidos en comparación con los ratones sanos infundidos con PBS (fig. 6E y fig. S10A). Además, realizamos un análisis de recuento sanguíneo completo (CBC) de los ratones y encontramos que el recuento total de glóbulos blancos (WBC) y la proporción de linfocitos eran ligeramente más altos y la proporción de granulocitos era ligeramente más baja en los receptores de células CAR T B9 que en los controles, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas (fig. 6F). No se observaron cambios estadísticamente significativos en las otras pruebas de sangre de rutina (fig. 6F y fig. S10B). Estos datos indicaron que, además de controlar eficazmente el crecimiento tumoral, las células CAR T B9 no produjeron toxicidad evidente ni representan un potencial de toxicidad para los órganos vitales, lo que demuestra plenamente la seguridad de las células CAR T B9 y proporciona un sólido respaldo para sus futuras aplicaciones clínicas.

Evaluación de la seguridad y eficacia de las células CAR T B9 en un modelo murino completamente inmunocompetente

Para evaluar el potencial de toxicidad in vivo de las células CAR T B9 dentro de un sistema inmunitario funcional, establecimos un modelo inmunocompetente. Las células de cáncer de páncreas de ratón Panc02 se diseñaron para coexpresar KRASG12V y HLA-A*02:01 humano. Las células T aisladas del bazo de ratones C57BL/6 se transfectaron con un constructo CAR B9 optimizado para ratones, que incorpora el scFv humano B9 original fusionado con dominios de señalización de ratón (coestimulación murina CD28 y CD3ζ). In vitro, estas células CAR T B9 murinas demostraron citotoxicidad específica contra las células diana (fig. S11A). In vivo, se establecieron tumores subcutáneos en ratones C57BL/6 inmunocompetentes, seguido de tratamiento con las células CAR T B9 murinas (fig. S11B). La terapia resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (fig. S11C) y una prolongación marcada de la supervivencia de los ratones en comparación con los grupos de control (fig. S11D). Además, el tratamiento exhibió un perfil de seguridad favorable sin efectos adversos en el peso corporal (fig. S11E), y no hubo evidencia de síndrome de liberación de citocinas grave, como lo indican los niveles de citocinas séricas (fig. S11F). El examen histopatológico de los órganos principales (por ejemplo, corazón, hígado, bazo, pulmones y riñones) no reveló daños ni lesiones aparentes (fig. S10G), lo que confirmó la ausencia de toxicidad dirigida al tumor o toxicidad fuera del objetivo u otras lesiones orgánicas relacionadas con el tratamiento en este entorno inmunocompetente.

Cribado de scFv específicos para el complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 y diseño de la estructura de la célula CAR T

Analizamos la frecuencia de la mutación KRASG12V utilizando las bases de datos bioinformáticas en línea (cBioPortal) y en cohortes de pacientes locales, lo que confirmó su alta prevalencia en múltiples tumores sólidos, incluidos los cánceres de páncreas, colon y pulmón (fig. S1). Dada la dificultad para desarrollar fármacos de molécula pequeña que se dirijan a KRAS (^[16]), particularmente debido a la falta de fármacos aprobados para KRASG12V, utilizamos la terapia con células CAR T para eliminar directamente los tumores que expresan la mutación KRASG12V. Utilizamos la base de datos Allele Frequency Net (AFND) para analizar la distribución y expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano y seleccionamos HLA-A*02:01, una molécula del MHC de clase I que es muy frecuente en la población (10 a 28%) (fig. S2). Primero, eluimos fragmentos de scFv que se unían específicamente al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 de una biblioteca de scFv naturales derivadas de la sangre de individuos sanos. Después de varias rondas de enriquecimiento, se verificaron casi 1000 monoclonales con avidez confirmada para la proteína tetramérica KRASG12V/HLA-A*02:01, y la fig. 1A ilustra 11 clones con capacidad de unión al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01. Entre estos 11 clones positivos, solo dos (A4 y B9) pudieron unirse específicamente al complejo KRASG12V/HLA-A*02:01 y no unirse de forma no específica al complejo KRAS WT/HLA-A*02:01 (fig. 1A). A continuación, se secuenciaron ambos clones y se sintetizaron proteínas de cadena única de anticuerpos; la concentración efectiva media (EC50) del tetrámero diana fue de 9,159 nM (A4) y 2,589 nM (B9), respectivamente (fig. 1B). Para estimar aún más la afinidad de unión, utilizamos un ensayo de visualización de superficie de levadura (^[25]), midiendo las constantes de disociación aparentes (Kd) de 34,92 nM para A4 y 5,17 nM para B9 (fig. S3). La afinidad superior de B9 se alinea con su mayor potencia funcional observada en los ensayos posteriores. Se utilizaron dos scFv específicos para KRASG12V/HLA-A*02:01 para generar dos constructos CAR únicos denominados A4.CAR y B9.CAR (fig. 1C). Las células CAR T CD19 [con scFv derivadas del anticuerpo FMC63, como se informó anteriormente (^[26])] y las células T no transfectadas (UTD) se utilizaron como controles. El análisis citométrico de flujo de la positividad de CD34 confirmó que superó el 50% de la tasa de transfección en las poblaciones de linfocitos T activadas (fig. 1D). Para comparar la eficacia de los dos grupos de células CAR T frente a las células T de control, se utilizaron microesferas de CD34 para el cribado positivo de las células CAR T transfectadas, lo que logró una pureza de casi el 100% (fig. 1E). El análisis fenotípico reveló que las células CAR T preparadas exhibieron una proporción aumentada de células T de memoria efectoras (CD45RA−CCR7−) y una disminución de la población de células T ingenuas (CD45RA+CCR7+), mientras que las frecuencias de los subconjuntos de efectores terminales (CD45RA+CCR7−) y de memoria central T (CD45RA−CCR7+) permanecieron comparables (fig. 1F). Por lo tanto, generamos con éxito células CAR T que se dirigían a KRASG12V/HLA-A*02:01.

Las células CAR T B9 inducen la muerte de tumores positivos para KRASG12V/HLA-A*02:01

Para validar funcionalmente las células CAR T in vitro, se diseñaron tres líneas celulares utilizando la línea celular de leucemia K562. Estas incluían células K562 transfectadas solo con KRASG12V, HLA-A*02:01 o KRASG12V y HLA-A*02:01 (fig. 2A). Primero, se añadieron diferentes concentraciones de péptido KRAS de tipo salvaje (KLVVVGAGGV), péptido G12D (KLVVVGADGV) y péptido G12V (KLVVVGAVGV) a las células diana K562 transfectadas con HLA-A*02:01. La liberación de la citocina interferón-γ (IFN-γ) se utilizó para validar preliminarmente las funciones de las células CAR T A4 y B9. Los resultados mostraron que las dos células CAR T construidas eran capaces de reconocer específicamente las células diana con KRAS G12V, pero no las células tumorales con KRAS WT o G12D, en respuesta a la administración de HLA-A*02:01 (fig. 1B). En contraste con A4, las células CAR T B9 exhibieron una potente actividad, incluso a concentraciones mucho más bajas de péptido G12V (fig. 1B). Después del cocultivo con células diana a diferentes proporciones durante 24 horas, tanto las células CAR T A4 como B9 exhibieron citotoxicidad específica contra las células tumorales KRASG12V presentadas por HLA-A*02:01, con B9 exhibiendo una eficacia de muerte superior en comparación con A4 (fig. 2C). A una relación efector-diána (E:T) de 2:1, tanto las células CAR T A4 como B9 produjeron significativamente más factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y IFN-γ que las células CAR T CD19 o las células de control UTD (fig. 2D y fig. S4A). Esta especificidad se limitó a la mutación G12V. Cuando se probaron contra las células K562 diseñadas para coexpresar HLA-A*02:01 y otra mutación común, KRASG12C, ni las células CAR T A4 ni B9 montaron una respuesta citotóxica notable o liberación de citocinas (fig. S4, B a D), lo que confirmó la ausencia de reactividad fuera del objetivo contra esta mutación relacionada.

Además, seleccionamos líneas celulares endógenas que expresan el antígeno diana, provenientes de cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de ovario, para validar la citotoxicidad de las células CAR T. Utilizando las bases de datos Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) y Cellosaurus, identificamos cuatro líneas celulares tumorales humanas (CFPAC-1, SW620, NCI-H441 y OVCAR-5) que expresan KRASG12V y HLA-A*02:01, y cuatro líneas celulares tumorales humanas (PANC-1, Caco-2, A549 y SK-OV-3) que no expresan KRASG12V. La expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 en estas líneas celulares se verificó mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR) y citometría de flujo (fig. S5 y tabla S1). Las células CAR T A4 y B9 lisaron eficientemente las células diana (fig. 2E). En ensayos de cocultivo con células CFPAC-1, NCI-H441 y OVCAR-5, las células CAR T B9 exhibieron una mayor eficacia de eliminación en comparación con A4. Ni las células CAR T A4 ni las B9 controlaron el crecimiento tumoral en las cuatro líneas celulares KRASG12V-negativas. De manera similar a la línea celular K562 modificada, tanto las células CAR T A4 como las B9 mostraron una mayor secreción de TNF-α e IFN-γ en los sobrenadantes del cultivo (fig. 2F y fig. S4D). Cuando la proteína KRAS o la proteína Beta-2-microglobulina (B2M) en las células CFPAC-1 fueron eliminadas, la capacidad de eliminación específica de las células CAR T A4 y B9 se perdió posteriormente (fig. 2, G a L). En conjunto, estas dos células CAR T demostraron una actividad citotóxica específica efectiva contra las células tumorales que expresan KRASG12V/HLA-A*02:01. Considerando la mayor activación de las células T y la liberación de citocinas observadas en las células CAR T B9 in vitro, las seleccionamos para estudios posteriores de citotoxicidad en organoides, secuenciación de células individuales y estudios in vivo.

Las células CAR T B9 muestran un potente efecto citotóxico en organoides de CRC derivados de pacientes

Para establecer un modelo clínicamente relevante para evaluar la eficacia de la terapia con células CAR T, recolectamos tejidos tumorales de CRC de pacientes con o sin expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 y establecimos con éxito organoides derivados de pacientes (PDO). KRASG12V se identificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real del ADN genómico humano extraído de tejidos patológicos incluidos en parafina, y los alelos del antígeno leucocitario humano (HLA) se identificaron mediante secuenciación de Sanger de sangre total. Los organoides de CRC derivados de pacientes recapitularon fielmente las características histológicas de sus tumores originales (fig. 3A). Después de 72 horas de cocultivo, las células CAR T B9 demostraron una actividad lítica significativamente mejorada contra los organoides diana, medida por la liberación de caspasa-3 escindida (fig. 3B). En particular, las células CAR T B9 secretaron sustancialmente más IFN-γ y TNF-α al dirigirse a organoides que expresan tanto KRASG12V como HLA-A*02:01 (fig. 3C). Esta actividad dependía estrictamente de la presencia del neoantígeno KRASG12V, ya que las células CAR T B9 no provocaron una respuesta significativa contra los PDO de control positivos para HLA-A*02:01 y negativos para KRASG12V (fig. S6). Estos hallazgos validan los PDO como una plataforma fisiológicamente relevante para evaluar la eficacia de las células CAR T y resaltan su potencial para avanzar en la investigación de la inmunología tumoral y el desarrollo de inmunoterapia de precisión.

El perfilado transcriptómico de células individuales revela heterogeneidad metabólica y funcional en las células CAR T B9 durante la activación específica del antígeno

Para caracterizar las células CAR T B9, realizamos un análisis de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) en células UTD, células CAR T B9 y células CAR T B9 estimuladas por el grupo CFPAC-1. En total, se retuvieron 27.068 células para el análisis posterior después del control de calidad. El agrupamiento no supervisado y el análisis de la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) utilizando Seurat revelaron 11 poblaciones celulares distintas en el conjunto de datos de secuenciación de células individuales (fig. 4A). Entre ellas, los grupos 0, 3, 6 y 10 disminuyeron gradualmente en las células UTD, las células CAR T B9 y las células CAR T B9 con los grupos CFPAC-1, mientras que los grupos 1, 2, 5, 8 y 9 fueron más abundantes en las células CAR T B9 que en los grupos UTD; los grupos 1, 8 y 9 mostraron una marcada proliferación en las células CAR T B9 con el grupo CFPAC-1 (fig. 4B), lo que sugiere que las células CAR T B9 pueden funcionar principalmente a través de estos tres grupos después de la estimulación del antígeno. Los 11 grupos se anotaron utilizando marcadores de células T conocidos (^[27]) y se identificaron cinco subtipos de células T: el grupo 9 se anotó como células T de memoria (expresión elevada del receptor de interleucina-7 (IL-7R), linfotoxina beta (LTB), acuaporina 3 (AQP3) y CD27), los grupos 0 y 2 como células T ingenuas (expresión elevada de TCF7, SELL y CCR7), el grupo 10 como células T citotóxicas (expresión elevada de GZMA, GZMB, GZMH, PRF1, GNLY y NKG7), el grupo 3 como células T activadas (expresión elevada de CD69, HLA-DRA, HLA-DRB1) y los seis grupos restantes como células T proliferantes (fig. 4C). Las células T citotóxicas disminuyeron gradualmente en los grupos de células UTD, células CAR T B9 y células CAR T B9 con CFPAC-1 (fig. 4D), posiblemente debido a la alta expresión del gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), que regula su fenotipo de agotamiento. Después de la estimulación del antígeno, la proliferación de las células T y las células T de memoria aumentó sustancialmente en el grupo de células CAR T B9 (fig. 4E), probablemente debido a la fuerte activación de la vía de señalización CAR, lo que condujo a una rápida proliferación y diferenciación de las células CAR T B9, con algunas diferenciándose en células T efectoras para una rápida proliferación y función citotóxica, mientras que otras se convirtieron en células T de memoria con supervivencia a largo plazo y capacidades de reactivación rápida.

Entre las células T proliferantes (grupos 1, 4, 5, 6, 7 y 8), los grupos 1 y 8 en el grupo de células CAR T B9 con CFPAC-1 mostraron una proliferación pronunciada, mientras que los grupos 4, 5, 6 y 7 se eliminaron casi por completo. Para explorar las diferencias entre la proliferación expandida y disminuida de las células T, se realizó un análisis diferencial en los grupos 1 y 8 frente a los grupos 4, 5, 6 y 7, identificando 28 genes expresados diferencialmente (DEG). Los grupos 1 y 8 exhibieron una regulación al alza marcada en la producción de citocinas, incluido IFNG, CSF2 y CCL3/4 (fig. 4F). El análisis de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) reveló un enriquecimiento pronunciado en vías clave críticas para la activación y proliferación de las células T, incluido el fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-Akt, la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la señalización Janus quinasa-transductor y activador de la señal (^[28]), mientras que las vías de la apoptosis y la senescencia celular se suprimieron (fig. 4G). Además, encontramos que IL-2RA se expresó altamente en los grupos 1 y 8, particularmente en el grupo 1, así como en las células T de memoria (grupo 9). IL-2RA, un subunidad del receptor de IL-2, desempeña un papel importante en la terapia con células CAR T (^[29]). En el grupo UTD, los grupos 1, 8 y 9 estaban casi ausentes, mientras que su abundancia aumentó progresivamente en las células CAR T B9 y los grupos de células CAR T B9 con CFPAC1, lo que sugiere que las células CAR+ T pueden mejorar la proliferación y los efectos de la memoria en las células CAR T al aumentar la expresión de IL-2RA.

La proliferación de las células T consistió principalmente en dos subconjuntos espacialmente separados: los grupos 6 y 8 frente a los grupos 1, 4, 5 y 7 (fig. 4D). El análisis diferencial y funcional posterior entre los grupos 6 y 8 y los grupos 1, 4, 5 y 7 reveló que la mayoría de los DEG se expresaron altamente en los grupos 1, 4, 5 y 7, que se relacionaron principalmente con la biosíntesis de adenosina 5'-trifosfato, la fosforilación oxidativa, la respiración aeróbica, la respiración celular y otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo energético (fig. 4I). Una evaluación adicional de la actividad metabólica de células individuales en los seis grupos de células T proliferantes demostró que los grupos 1, 4, 5 y 7 exhibieron procesos de metabolismo energético mejorados críticos para la proliferación celular, incluido el metabolismo de las purinas, el metabolismo de las pirimidinas, la fosforilación oxidativa y la glucólisis/gluconeogénesis. Tras la estimulación, las células CAR T B9 aceleraron el metabolismo energético para satisfacer las demandas bioenergéticas y biosintéticas de la activación, la función efectora y la rápida expansión, lo que sugiere que la proliferación sustancial del grupo 1 en el grupo de células CAR T B9 con CFPAC-1 puede estar estrechamente relacionada con su mayor actividad metabólica. Además, para dilucidar la dinámica de diferenciación de las células T y determinar si los dos subconjuntos de células T proliferantes divergen durante este proceso, se utilizó Monocle2 para el análisis de la trayectoria pseudotemporal en todas las células (fig. 4K). Las células T ingenuas ocuparon el punto de partida de la diferenciación, con células T proliferantes que se bifurcaron posteriormente en dos ramas distintas (fig. 4L): los grupos 6 y 8 y los grupos 1, 4, 5 y 7 (fig. 4M). Dada la divergencia de los estados metabólicos de estos subconjuntos, las vías de diferenciación divergentes de las células T proliferantes parecen estar impulsadas principalmente por las diferencias en la actividad metabólica energética, lo que indica que los distintos perfiles metabólicos pueden determinar el compromiso del destino de las células T proliferantes. En conjunto, utilizamos las ventajas de alta resolución de scRNA-seq para descubrir la heterogeneidad composicional y la funcionalidad de las células CAR T B9, así como sus respuestas a las células de CPDA. Estos hallazgos ofrecen una explicación mecanicista de las características esenciales de las células CAR T B9 y las interacciones con las células tumorales.

Las células CAR T B9 suprimen el crecimiento del xenoinjerto subcutáneo de CPDA

Para evaluar la eficacia de las células CAR T B9 in vivo, construimos un modelo de xenoinjerto subcutáneo inyectando 1 × 106 células tumorales CFPAC-1 que expresan luciferasa subcutáneamente, seguido de la administración intravenosa de 5 × 106 células CAR T B9 a través de la vena de la cola 1 semana después (fig. 5A). Los resultados de la imagen de bioluminiscencia mostraron que las células CAR T B9 controlaron eficazmente el crecimiento tumoral, en contraste con el tampón fosfato salino (PBS), las células UTD y las células CAR T CD19 (fig. 5, C y D). Los cinco ratones del grupo B9.CAR sobrevivieron durante más de 80 días y mantuvieron un estado de supresión tumoral, mientras que todos los demás ratones de control murieron en 60 días (fig. 5, B y C). Por lo tanto, las células CAR T B9 demuestran una actividad antitumoral eficaz en un modelo de ratón de CPDA subcutáneo.

Las células CAR T B9 muestran eficacia terapéutica en modelos de CPDA metastásico humano

Para evaluar el efecto terapéutico de las células CAR T B9 sobre la metástasis tumoral, establecimos un modelo de CPDA metastásico humano mediante la inyección intravenosa de 1 × 106 células CFPAC-1 en ratones NCG. Siete días después de la inoculación del tumor, los ratones del modelo metastásico fueron tratados con dosis variables (0,5 × 106 a 5 × 106 células) de células CAR T administradas por vía intravenosa (fig. 5E). El día 35 después de la inyección del tumor, las células tumorales se habían metastatizado con éxito a varias partes del cuerpo en los grupos que recibieron la infusión de células UTD y células CAR T CD19 (fig. 5, G y H). En comparación, las células CAR T B9 a dosis de 1, 2 y 5 millones de células suprimieron eficazmente el crecimiento y la metástasis del tumor. Los ratones que recibieron una dosis baja (0,5) de la infusión de células CAR T B9 no mostraron supresión del crecimiento tumoral, pero mostraron una curva de supervivencia ligeramente prolongada en comparación con los controles tratados con células CAR T CD19 (fig. 5, F a H). Este resultado demostró que las células CAR T B9 mostraron una gran eficacia terapéutica en este modelo de metástasis de CPDA.

A continuación, establecimos un modelo de CPDA metastásico utilizando la línea celular de CRC Caco-2, que expresa HLA-A*02:01 pero carece de KRASG12V. Siguiendo un protocolo similar, se inyectaron 1 × 106 células Caco-2 por vía intravenosa, seguido de tratamiento con 0,5 × 106 a 5 × 106 células CAR T B9 por inyección en la vena de la cola 1 semana después (fig. S7A). Coherente con los hallazgos in vitro, las células CAR T B9 no lograron inhibir el crecimiento tumoral in vivo en todas las dosis probadas (fig. S7, C y D). En comparación con las células CAR T CD19, incluso las dosis altas de células CAR T B9 no mostraron ningún beneficio para la supervivencia (fig. S7B). Estos resultados demuestran que el ataque tumoral mediado por las células CAR T B9 es altamente específico tanto in vitro como in vivo, lo que confirma el ataque dependiente de HLA y excluye la toxicidad fuera del tumor en contextos de desajuste de HLA.

Las células CAR T B9 erradican las metástasis peritoneales en modelos de CPDA

Además, se desarrollan metástasis peritoneales en aproximadamente el 9% de los pacientes con Cáncer de Páncreas Ductal Adenoescamoso (PDAC), lo que resulta en carcinomatosis, que empeora sustancialmente el pronóstico, pero sigue siendo poco comprendida y sin una solución terapéutica (^[30]). Por lo tanto, establecimos un modelo de PDAC peritoneal diseminado mediante la inyección intraperitoneal de 2 × 106 células tumorales CFPAC-1, seguida de la administración intraperitoneal de 5 × 106 células CAR T B9 una semana después para el tratamiento (Fig. 5I). Los resultados mostraron que las células CAR T B9 eliminaron por completo los tumores intraperitoneales y prolongaron la supervivencia en comparación con los grupos de tratamiento con células UTD y células CAR T CD19 (Fig. 5, J a L). Por lo tanto, nuestros datos demostraron que las células CAR T B9 restringieron eficazmente el crecimiento tumoral y mejoraron la supervivencia en modelos de PDAC metastásico.

Perfil completo de la reactividad cruzada fuera del objetivo de las células CAR T B9, que revela un motivo de reconocimiento crítico y una reactividad cruzada mínima con el proteoma humano

A continuación, para evaluar la posible toxicidad fuera del objetivo de las células CAR T B9, reemplazamos cada aminoácido en el péptido KRAS G12V de 10 aminoácidos con glicina y alanina para generar 17 péptidos distintos. Estos péptidos se añadieron a las células K562/HLA-A*02:01 y se detectaron los niveles de la citocina IFN-γ liberada de los sobrenadantes después del cocultivo con las células CAR T B9. Se encontró que el nivel de activación de las células CAR T B9 disminuyó sustancialmente cuando la valina en las posiciones 3, 4 y 8 y la glicina en las posiciones 6 y 9 fueron reemplazadas (fig. S8A). Por lo tanto, se considera que los residuos en esta posición son esenciales, lo que implica que las posiciones 3, 4, 6, 8 y 9 son críticas para la capacidad de las células CAR T B9 de reconocer las células diana. Se buscaron secuencias de proteínas que contuvieran el motivo “XXVVXGXVGX” utilizando la herramienta ScanProsite (^[31]) y luego se analizaron para predecir la afinidad del péptido a HLA-A*02:01 utilizando la herramienta NetMHCpan-4.1, y se identificaron un total de seis péptidos relevantes para los humanos (tabla S2). Posteriormente, seis péptidos se sintetizaron con éxito y se utilizaron para añadir a las células diana K562/HLA-A*02:01. La capacidad de las células CAR T B9 para reconocer estos objetivos se determinó mediante la liberación de IFN-γ. Los resultados mostraron que solo dos péptidos de las proteínas RNF112 y SUOX mostraron una ligera respuesta en el reconocimiento de las células CAR T B9 (fig. S8B). Sin embargo, la diferencia seguía siendo más evidente que la del péptido KRAS G12V. Para validar y definir con precisión estos residuos críticos, realizamos un análisis exhaustivo sustituyendo cada posición en el péptido KRAS G12V con los 19 aminoácidos naturales (excluyendo la cisteína) y evaluamos la activación de las células CAR T B9 como antes (Fig. 6A). Utilizando el motivo de reconocimiento refinado (punto de corte, 30%), realizamos una búsqueda de secuencias de proteínas con la herramienta ScanProsite y predijimos la afinidad de HLA-A*02:01 utilizando NetMHCpan-4.1. Este análisis identificó 27 péptidos candidatos derivados de proteínas humanas (tabla S2). La validación experimental de estos candidatos no reveló ningún péptido cruzado adicional más allá de los dos (RNF112 y SUOX) identificados inicialmente (Fig. 6B). Al buscar en la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica, encontramos que estos dos péptidos humanos eran homólogos a los de los ratones. Además, el análisis inmunohistoquímico mostró que RNF112 se localizaba principalmente en el núcleo en el riñón del ratón, mientras que la expresión de SUOX era principalmente citoplásmica en el hígado del ratón (fig. S9). Por lo tanto, a continuación, intentamos verificar la seguridad de las células CAR T B9 en ratones.

Las células CAR T B9 no muestran la ausencia de potencial toxicidad in vivo

Para evaluar el potencial de toxicidad in vivo de las células CAR T B9, las infundimos en ratones transgénicos inmunodeficientes NCG que expresaban HLA-A*02:01 humano (NCG-HLA-A2.1) (Fig. 6C). Los ratones se observaron durante 1 mes con un control regular del peso corporal y la salud después de la infusión de las células CAR T y luego se sacrificaron a la semana 1 y al mes 1, respectivamente, para recolectar muestras de tejido. Encontramos que el tratamiento con células CAR T B9 no causó cambios notables en el peso corporal ni diferencias aparentes en el crecimiento en comparación con los ratones sanos (Fig. 6D). En el momento del sacrificio, todos los ratones estaban sanos y no mostraron signos de anomalías. Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en los tejidos para evaluar las lesiones histológicas. Los resultados mostraron que los ratones infundidos con células CAR T B9 no mostraron cambios patológicos aparentes ni infiltración anormal de linfocitos T en los tejidos en comparación con los ratones sanos infundidos con PBS (Fig. 6E y fig. S10A). Además, realizamos un análisis de recuento sanguíneo completo (CBC) de los ratones y encontramos que el recuento total de glóbulos blancos (WBC) y la proporción de linfocitos eran ligeramente más altos y la proporción de granulocitos era ligeramente más baja en los receptores de células CAR T B9 que en los controles, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 6F). No se observaron cambios estadísticamente significativos en las otras pruebas de sangre de rutina (Fig. 6F y fig. S10B). Estos datos indicaron que, además de controlar eficazmente el crecimiento tumoral, las células CAR T B9 no produjeron toxicidad evidente ni representaron un potencial de toxicidad para los órganos vitales, lo que demuestra plenamente la seguridad de las células CAR T B9 y proporciona un fuerte apoyo para sus futuras aplicaciones clínicas.

Evaluación de la seguridad y eficacia de las células CAR T B9 en un modelo murino completamente inmunocompetente

Para evaluar el potencial de toxicidad in vivo de las células CAR T B9 dentro de un sistema inmunitario funcional, establecimos un modelo inmunocompetente. Las células de cáncer de páncreas murino Panc02 se modificaron genéticamente para coexpresar KRASG12V y HLA-A*02:01 humano. Las células T aisladas del bazo de ratones C57BL/6 se transfectaron con un constructo CAR B9 optimizado para ratones, que incorpora el scFv humano B9 original fusionado con dominios de señalización murinos (coestimulación murina CD28 y CD3ζ). In vitro, estas células CAR T B9 murinas demostraron citotoxicidad específica contra las células diana (fig. S11A). In vivo, se establecieron tumores subcutáneos en ratones C57BL/6 inmunocompetentes, seguido de tratamiento con las células CAR T B9 murinas (fig. S11B). La terapia resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (fig. S11C) y una prolongación marcada de la supervivencia de los ratones en comparación con los grupos de control (fig. S11D). Además, el tratamiento exhibió un perfil de seguridad favorable sin efectos adversos en el peso corporal (fig. S11E), y no hubo evidencia de síndrome de liberación de citocinas grave, como lo indican los niveles de citocinas séricas (fig. S11F). El examen histopatológico de los órganos principales (por ejemplo, corazón, hígado, bazo, pulmones y riñones) no reveló daños ni lesiones aparentes (fig. S10G), lo que confirmó la ausencia de toxicidad dirigida al tumor o cualquier otra lesión orgánica relacionada con el tratamiento en este entorno inmunocompetente.

DISCUSIÓN

Si bien es transformadora para las neoplasias hematológicas, la terapia con células CAR T encuentra obstáculos sustanciales en el tratamiento de tumores sólidos, y la selección del objetivo representa un desafío fundamental (^[4], ^[32]). Desde las perspectivas de la eficacia y los efectos secundarios fuera del objetivo, los antígenos específicos del tumor (TSA) son una opción ideal como objetivo para la inmunoterapia tumoral (^[33]). Entre las mutaciones de alta frecuencia en tumores sólidos, los mutantes de RAS han atraído un interés creciente tanto de las instituciones de investigación como de las empresas farmacéuticas (^[16], ^[34]). Las estrategias terapéuticas actuales contra los mutantes de RAS, particularmente los variantes de KRAS, siguen principalmente dos enfoques: inhibidores de moléculas pequeñas tradicionales que se dirigen selectivamente a las proteínas mutantes de guanosina difosfato (GDP) unidas a KRAS para bloquearlas en un estado inactivo (por ejemplo, inhibidores de KRAS mutantes específicos como sotorasib y adagrasib) (^[35]–^[37]) o se unen a la chaperona intracelular ciclofilina A (CypA) para formar complejos ternarios con RAS activado (por ejemplo, inhibidores pan, como RMC-6236) (^[38]), bloqueando así la señalización oncogénica, y la identificación de TCR o anticuerpos que imitan TCR (TCRm) que reconocen los complejos péptido-MHC de KRAS mutante para terapias dirigidas que utilizan células T/CAR o anticuerpos bispecíficos anti-CD3 (^[17], ^[18], ^[39]–^[41]). Actualmente, los inhibidores de moléculas pequeñas en el mercado se clasifican principalmente en dos categorías: inhibidores de KRAS mutantes específicos e inhibidores pan que se dirigen a múltiples mutaciones de KRAS (^[35]–^[38], ^[42], ^[43]). Si bien se han aprobado los inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a las mutaciones de KRASG12C (como sotorasib y adagrasib) (^[35]–^[37], ^[42]) y los que se dirigen a KRASG12D están ahora en investigación clínica (^[44]), todavía no existen opciones de tratamiento dirigidas para los pacientes con las mutaciones de KRASG12V altamente prevalentes. En contraste, los inhibidores pan-KRAS enfrentan desafíos debido a la supresión concomitante de la actividad de KRAS de tipo salvaje (^[45]). El trabajo previo en modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) demostró que la pérdida de KRAS de tipo salvaje exacerba la señalización de MAPK impulsada por KRAS oncogénico, acelerando paradójicamente la progresión tumoral (^[46]). Por ejemplo, en un modelo de CRC impulsado por KRASG12D, la pérdida de KRAS de tipo salvaje aceleró la formación de tumores y acortó sustancialmente la supervivencia de los ratones (^[46]). Estos hallazgos sugirieron que la inhibición pan-KRAS puede causar toxicidad dirigida al objetivo en los tejidos normales, lo que genera preocupaciones de seguridad. En comparación, las terapias con células TCR/CAR evitan los efectos secundarios fuera del objetivo contra KRAS de tipo salvaje, aunque conservan los riesgos potenciales de la reactividad cruzada con péptidos homólogos (^[31]). Para abordar esto, nuestras células CAR T B9 diseñadas demostraron citotoxicidad tumoral precisa al tiempo que eliminaban la toxicidad fuera del objetivo, asegurando tanto la eficacia como la seguridad. Además, los inhibidores de KRAS actuales funcionan principalmente inhibiendo el crecimiento y la proliferación tumoral a través de la inhibición de dos vías críticas aguas abajo, las cascadas de señalización MAPK y PI3K (^[46]). En contraste, nuestro enfoque terapéutico utiliza una estrategia basada en células que permite la erradicación tumoral directa y rápida a través del direccionamiento específico de KRASG12V, lo que puede reducir potencialmente la probabilidad de desarrollo de resistencia a los fármacos.

En comparación con los inhibidores de moléculas pequeñas, la terapia con células T TCR y la terapia con células CAR basadas en anticuerpos que imitan TCR han demostrado un potencial considerable en el direccionamiento de los TSA intracelulares (^[47], ^[48]). Sin embargo, su aplicación clínica está estrictamente limitada por el polimorfismo de HLA, ya que su eficacia depende en gran medida del genotipo HLA específico del paciente, lo que restringe fundamentalmente la población de pacientes aplicable (^[49]). Las moléculas HLA, que sirven como los mecanismos moleculares centrales de la presentación de antígenos, exhiben una alta diversidad genética y heterogeneidad de distribución entre las poblaciones (^[20]–^[23]). En investigaciones y esfuerzos de desarrollo anteriores, se desarrollaron terapias con células T TCR restringidas a HLA-A*11:01 y HLA-A*03:01, así como terapias con células CAR restringidas a HLA-A*11:01 para dirigirse al antígeno mutante KRASG12V (^[17], ^[18], ^[39], ^[40], ^[50]). Este estudio se centró en el alelo HLA-A*02:01, que está ampliamente distribuido tanto en las poblaciones orientales como occidentales y exhibe la frecuencia más alta en las poblaciones europeas y americanas (^[21]–^[23]) para desarrollar terapias con células CAR. Para superar el cuello de botella de la restricción de HLA, seleccionamos estratégicamente alelos HLA de alta frecuencia (como HLA-A*24:02, HLA-A*01:01 y HLA-C*07:01) (^[21]) para desarrollar anticuerpos que imitan TCR adicionales. Este enfoque puede mejorar significativamente la cobertura de la población, lo que permite que más pacientes se beneficien de las inmunoterapias de precisión dirigidas a antígenos intracelulares.

La terapia personalizada ofrece grandes promesas en el campo de la oncología de precisión, aunque su principal desafío radica en el desarrollo de terapias dirigidas altamente eficaces contra neoantígenos específicos del paciente (^[49], ^[51]). Si bien se han logrado avances en las estrategias de selección de anticuerpos personalizados dirigidos a neoantígenos tumorales de amplio espectro (por ejemplo, mutaciones de KRAS), particularmente con tecnologías de anticuerpos multiespecíficos, este enfoque aún requiere la adaptación de fármacos específicos para cada paciente (^[17], ^[18], ^[39], ^[49]). La terapia con células CAR T presenta ventajas considerables sobre los fármacos de molécula pequeña y la terapia con células T receptor (TCR). Los modelos tradicionales de desarrollo de fármacos tienen dificultades para satisfacer las demandas del tratamiento personalizado, ya que las empresas farmacéuticas generalmente carecen de la capacidad de desarrollar rápidamente fármacos para mutaciones raras y los procesos de selección convencionales a menudo no cumplen con los plazos clínicos (^[49]). Mientras tanto, la terapia con células T receptor (TCR) enfrenta múltiples obstáculos técnicos en la selección rápida y de alto rendimiento de múltiples dianas de neoantígenos tumorales. En primer lugar, la eficiencia de la selección de TCR se ve limitada por la diversidad limitada de la biblioteca de TCR, que se basa principalmente en células T autólogas del paciente (^[49]), un número limitado de donantes sanos (^[52]) o ratones transgénicos HLA (^[10]), lo que resulta en un rendimiento de selección gravemente insuficiente. Por ejemplo, estudios previos han informado que solo se pueden identificar tres TCR funcionales a partir de 16 muestras clínicas, y algunos pacientes requieren más de 6 meses para una selección exitosa, lo que no satisface las demandas clínicas (^[49]). En segundo lugar, el desafío técnico de larga data del emparejamiento de las cadenas TCRαβ complica aún más la selección y prolonga significativamente los ciclos de fabricación de células T receptor (TCR) (^[53]). En contraste, las plataformas de selección de anticuerpos basadas en la visualización de fagos ofrecen ventajas distintas, con capacidades de biblioteca clave que alcanzan los 1012 o más, lo que permite la construcción de bibliotecas entre especies (humana, de ratón, de alpaca, etc.) y, teóricamente, permite una selección rápida y de alto rendimiento, lo que no solo mejora las tasas de reconocimiento de neoantígenos, sino que también permite la selección paralela de múltiples dianas, lo que mejora considerablemente el potencial de comercialización de las estrategias terapéuticas (^[54], ^[55]). Esta plataforma también ofrece una alta flexibilidad, lo que permite la selección de diferentes scFv mediante el reemplazo de péptidos, sin alterar los alelos HLA. Además, en términos de afinidad molecular, los fragmentos de anticuerpos de las células CAR T típicamente exhiben una afinidad a nivel nanomolar, varias órdenes de magnitud mayor que los TCR naturales (generalmente a nivel micromolar), lo que permite que las terapias con células CAR T logren una eficacia comparable a dosis dos o tres órdenes de magnitud menores que las terapias con células TIL y TCR (^[56]). Además, la afinidad de los anticuerpos se puede optimizar sistemáticamente mediante estrategias como la evolución dirigida, con una viabilidad mucho mayor que la modificación de TCR (^[57]). Cabe destacar que es importante señalar que, si bien los anticuerpos TCRm tienen una mayor afinidad en comparación con los TCR naturales, lo que mejora su estabilidad de unión en un estado soluble, esta característica puede introducir riesgos potenciales en el entorno intracelular. La interacción de baja afinidad (rango micromolar) entre los TCR naturales y el complejo péptido-mayor histocompatibilidad (pMHC) ayuda a mantener la especificidad del reconocimiento y la señalización controlable. En contraste, la alta afinidad de los anticuerpos TCRm podría aumentar potencialmente el riesgo de reactividad cruzada con pMHC similares, lo que provocaría toxicidad fuera del objetivo (^[58]–^[61]). Además, los TCR naturales logran una regulación de señal en capas a través del complejo CD3, que contiene múltiples motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor (ITAM; por ejemplo, hasta 10), mientras que los CAR convencionales típicamente incorporan solo tres ITAM, lo que resulta en una arquitectura de señalización simplificada. Los estudios han demostrado que, a pesar de niveles de expresión superficial más bajos, los TCR exhiben una sensibilidad de señal significativamente mayor que las estructuras CAR que se dirigen al mismo epítopo (^[62]). Esto sugiere que la sensibilidad superior de los TCR no depende únicamente de la afinidad, sino que proviene del control preciso del umbral de activación mediado por su red de señalización multi-ITAM. En consecuencia, la unión de TCRm dentro de un contexto CAR, que carece de estas capas de regulación nativas, puede predisponer a las células a la sobreactivación o disfunción. Prometedoramente, el receptor y receptor de antígenos sintéticos, que integra los componentes de señalización TCR nativos, ha demostrado una notable sensibilidad al antígeno y eficacia antitumoral al dirigirse a neoantígenos de baja densidad, lo que ofrece una dirección alternativa para preservar las ventajas de alta afinidad al tiempo que mejora la regulación de la señal (^[63]). Todavía no hemos realizado experimentos relacionados, pero el trabajo futuro explorará la aplicación de esta estrategia para optimizar los diseños basados en TCRm. En resumen, la plataforma de tecnología de células CAR T basada en anticuerpos que imitan TCR, aprovechando sus ventajas en la selección de alta eficiencia, la compatibilidad con múltiples dianas y la superioridad de la dosis, demostró un valor de traslación considerable y un potencial clínico en el campo de la terapia combinada personalizada y de múltiples dianas basada en neoantígenos para el cáncer.

Para la evaluación de seguridad de nuestras células CAR T B9, adoptamos una estrategia preclínica de múltiples niveles, al tiempo que reconocemos las limitaciones inherentes de cada modelo utilizado. Por ejemplo, los métodos de selección bioinformática, como X-scan, evalúan principalmente las sustituciones de un solo aminoácido y, a menudo, no pueden cubrir sistemáticamente los posibles péptidos fuera del objetivo que difieren del péptido diana en múltiples posiciones. Si bien los modelos de ratón transgénico que expresan moléculas HLA humanas representan una plataforma ampliamente utilizada para evaluar la toxicidad in vivo del objetivo y los fenotipos de seguridad preliminares (^[48]), su capacidad para recapitular completamente el repertorio humano fuera del objetivo se ve limitada por las diferencias interespecíficas en la genómica, las secuencias de proteínas y los patrones de expresión de HLA (por ejemplo, expresión específica de tejidos y variabilidad en el nivel de expresión). No obstante, al combinar la selección de X-scan con experimentos in vivo en ratones transgénicos, establecimos un marco de evaluación de riesgos en capas para la reactividad fuera del objetivo. Los datos generados dentro de este marco son consistentes y, en conjunto, respaldan un perfil de seguridad aceptable para las células CAR T B9 en la etapa preclínica. Sin embargo, debe enfatizarse que ningún modelo preclínico puede sustituir la validación final en humanos. Los próximos pasos hacia la traslación clínica requerirán una selección de reactividad cruzada más completa basada en el proteoma humano, como la predicción in silico del proteoma completo y las pruebas funcionales en células o tejidos humanos primarios, para fortalecer aún más la base para la seguridad clínica.

En resumen, desarrollamos con éxito células CAR T que se dirigen al TSA KRASG12V/HLA-A*02:01. Dirigirse a este antígeno no solo ofrece un tratamiento potencialmente eficaz para los tumores sólidos, sino que también establece una base técnica y teórica para el avance sistemático de terapias de un solo objetivo contra este y otros neoantígenos. Además, allana el camino para el desarrollo de una terapia con células CAR T personalizada y de múltiples dianas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas en este estudio incluyeron K562 (RRID: CVCL0004), PANC-1 (RRID: CVCL0480), SW620 (RRID: CVCL0547), A549 (RRID: CVCL0023), NCI-H441 (RRID: CVCL1561) y SK-OV-3 (RRID: CVCL0532) (obtenidas del Banco de Células del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghái); riñón embrionario humano (HEK) 293T (RRID: CVCL0063), CFPAC-1 (RRID: CVCL1119) y Caco-2 (RRID: CVCL0025) (compradas a Wuhan Pricella Life Technology Co. Ltd.); OVCAR-5 (RRID: CVCL1628) (adquiridas de Shanghai YaJi Biological Co. Ltd.); y células KOP293 en suspensión (RRID no disponible) (compradas a Zhuhai Kairui Biotech). Las células KOP293 se cultivaron en un medio KOP293 sin suero (Kairui Biotech, 03252) en una incubadora de agitación de CO2 a 37 °C con 5 % de CO2 y agitación a 120 rpm. Todas las demás líneas celulares (excepto Caco-2) se mantuvieron a 37 °C en un medio apropiado suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina (100 U/ml cada una). Las células Caco-2 requerían un 20 % de FBS. Específicamente, las células K562, NCI-H441 y Panc02 se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, C22400500BT); HEK293T y PANC-1 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco, C11995500BT); CFPAC-1 en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) (Pricella, PM150510); SW620 en L-15 de Leibovitz (Pricella, PM151010) sin CO2; A549 en F-12 K de Ham (Gibco, 21127022); SK-OV-3 en McCoy's 5A (Pricella, PM150710); y Caco-2 en MEM (Pricella, PM150410). Se confirmó que todas las líneas celulares estaban libres de micoplasma utilizando un kit de detección por PCR (Beyotime, C0301S) antes de su uso. La expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 se verificó utilizando PCR cuantitativa y citometría de flujo.### Análisis de bases de datos

Los datos de mutación de KRAS se recopilaron y analizaron de cBioPortal (https://www.cbioportal.org/). Los datos de distribución de HLA-A*02:01 se recopilaron y analizaron de AFND (http://allelefrequencies.net/). Los subtipos de mutación de KRAS y el estado de HLA-A*02:01 en las líneas celulares de tumores humanos se recopilaron de CCLE (https://sites.broadinstitute.org/ccle/) y Cellosaurus (www.cellosaurus.org/).### Construcción de la biblioteca de visualización de fagos de anticuerpos scFv humanos

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos, seguida de la extracción de ARNm (Tiangen, DP419) y la transcripción inversa a ADNc (Takara, RR047A). Los genes codificantes de VH y VL de anticuerpos se amplificaron por separado mediante PCR (Vazyme, P520-02), se purificaron y se ensamblaron aleatoriamente en genes scFv utilizando cebadores que incorporan enlazadores que permitieron que los fragmentos VH y VL sirvieran como cebadores y plantillas mutuas a través de secuencias de enlazador complementarias. El fragmento se clonó luego en el vector pCANTAB 5E y se electroporó en células competentes de Escherichia coli (TG1) utilizando un electroporador BTX Gemini SC (2,5 kV, pulso de 5,0 ms, resistencia de 750 Ω, capacitancia de 25 μF y espacio de 2 mm) con 1000 pulsos. La capacidad de la biblioteca se determinó en 1,7 × 1012 unidades formadoras de colonias en función del análisis de secuenciación de 100 a 200 clones seleccionados aleatoriamente.### Péptidos

Todas las síntesis de péptidos fueron realizadas por GL Biochem (Shanghai) Ltd. utilizando la metodología estándar de síntesis de péptidos en fase sólida 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Tomando como ejemplo el péptido sintético KLVVVGAVGV, comience con la resina Fmoc-Val-Wang (Val en el extremo C preunido), desproteja el grupo Fmoc utilizando 20 % de piperidina/DMF (20 min) y confirme la desprotección mediante una prueba de ninhidrina (color azul, NH2 libre). Acople Fmoc-Gly-OH utilizando HBTU/DIEA en DMF (1 hora), confirme el éxito del acoplamiento mediante una prueba de ninhidrina (incoloro) y luego desproteja Fmoc con 20 % de piperidina (azul). Repita el acoplamiento/desprotección secuencialmente y asegúrese de la validación de ninhidrina en cada paso (incoloro después del acoplamiento, azul después de la desprotección). Después de la eliminación final de Fmoc, seque la resina. Clave el péptido de la resina utilizando TFA/TIS/H2O (2 horas), precipite el péptido crudo con éter frío, purifique mediante cromatografía líquida de alto rendimiento y liofilice para obtener el producto puro.### Síntesis de complejos tetraméricos de péptido-HLA-A*02:01

La síntesis de tetrámeros de péptido KRAS-HLA-A*02:01 implica tres pasos secuenciales: plegamiento, donde la cadena pesada de MHC de clase I, β2m y el péptido se ensamblan en un complejo monomérico; biotinilación, donde la enzima BirA etiqueta la lisina en el extremo C de la cadena pesada, seguida de la purificación mediante cromatografía para eliminar las impurezas; y tetramerización, donde la unión biotina-estreptavidina se utiliza para formar el tetrámero.### Selección de scFv específicos que se dirigen a KRASG12V/HLA-A*02:01

El tetrámero de péptido KRAS G12V/HLA-A*02:01 (2 μg en 200 μl de PBS por pocillo) se recubrió durante la noche a 4 °C y, a continuación, se bloqueó con un tampón de bloqueo de leche al 4 % (350 μl por pocillo) a 37 °C durante 1 hora. La biblioteca de fagos (1,7 × 1012 unidades formadoras de placa en 50 μl) se preincubó con 2 μg de tetrámero soluble KRAS WT/HLA-A*02:01 durante 1 hora. Los fagos no unidos continuaron incubándose con 2 μg de KRAS G12V/HLA-A*02:01 durante 2 horas. Después de seis lavados rigurosos (420 μl de PBS por pocillo, agitación de 1 minuto), los fagos unidos se eluyeron en medio ácido, se neutralizaron y se utilizaron para infectar TG1 en fase logarítmica media durante 1 hora con agitación. El cultivo se suplementó con glucosa (2 %), ampicilina y fago auxiliar M13KO7 (1 hora, 37 °C), y luego se centrifugó y se resuspendió en 1 ml de medio 2× de extracto de levadura-triptona (YT) que contenía ampicilina y kanamicina para la incubación durante la noche. El sobrenadante que contenía fagos enriquecidos sirvió como material de partida para rondas posteriores, manteniendo una concentración constante de tetrámero KRAS WT (2 μg) al tiempo que se disminuía progresivamente la concentración del tetrámero recubierto de KRAS G12V (de 2 a 0,06 μg en las rondas) y se aumentaba el número de ciclos de lavado (de 6 a 21). En la ronda final de competición se utilizó una relación molar de 32:1 de tetrámeros solubles KRAS WT: G12V para maximizar la especificidad.

Validación ELISA de clones positivos

Un total de 960 clones monoclonales (seleccionados aleatoriamente de 10 placas de 96 pocillos) se sometieron a un cribado mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). El ELISA primario evaluó la afinidad de unión de los clones al tetrámero KRAS G12V-HLA-A*02:01 utilizando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (SinoBiological, 11973-MM05T-H; RRID: AB_2857928). En el cribado secundario, se evaluó aún más la especificidad de los clones reactivos a la proteína diana frente al tetrámero KRAS WT-HLA-A*02:01. Los clones que demostraron una unión selectiva se secuenciaron para obtener sus secuencias de scFv.

Producción y purificación de anticuerpos

El sistema de células en suspensión KOP293 (Kairui Biotech) se cultivó en medio KPM (Kairui Biotech) a 37 °C con 5 % de CO2, con agitación a 120 rpm. El constructo scFv contenía una etiqueta His terminal C y una etiqueta Flag terminal N para la purificación. El scFv se expresó en células KOP293 utilizando el reactivo de transfección TA-293 (Kairui Biotech), seguido de la purificación mediante cromatografía de afinidad con nitrilotriacético de níquel en un sistema ÄKTA (Cytiva).

Medición de la afinidad de unión basada en ELISA y determinación de la CE50 de los anticuerpos purificados frente a los tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01

La afinidad de unión de los anticuerpos purificados a los tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01 se evaluó cuantitativamente mediante ELISA. Se incubaron diluciones seriadas de anticuerpos purificados con tetrámeros inmovilizados, seguido de la detección con un anticuerpo secundario anti-etiqueta Flag conjugado con HRP (SinoBiological, 100233-MM01-H; RRID: AB_3676780). Se generaron curvas de unión y se determinó la CE50 mediante análisis de regresión no lineal (GraphPad Prism, función de ajuste de curva).

Construcción del sistema de visualización de levaduras

Los vectores de visualización de superficie de levaduras para los scFv A4 y B9 se construyeron sobre la base del andamio pNACP, un derivado de pCTCon2 (Addgene, 41843), como se describió anteriormente (^[64]). En resumen, las secuencias de genes que codifican los scFv A4 o B9 se clonaron en el sitio multiclon de la vector pNACP. Los plásmidos resultantes, pNACP-A4 y pNACP-B9, permiten la visualización del scFv respectivo como una proteína de fusión Aga2p en la superficie de la levadura. Los plásmidos se transformaron en células de levadura Saccharomyces cerevisiae EBY100 químicamente competentes y se colocaron en placas de selección SD-CAA. Después de la incubación a 30 °C durante 3 días, se verificaron los transformantes positivos mediante PCR en colonias. Se inoculó una sola colonia verificada en medio SD-CAA suplementado con antibióticos [ampicilina (100 μg/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y kanamicina (100 μg/ml)] y se cultivó a 30 °C con agitación a 225 rpm durante 24 horas. Las células de levadura se recogieron por centrifugación (2500g durante 3 min), se resuspendieron en medio de inducción SG-CAA (con los mismos suplementos de antibióticos) hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,5 a 1,0 y se indujeron durante 60 horas a 20 °C con agitación a 225 rpm.

Medición de la afinidad scFv mediante citometría de flujo

Para medir la afinidad de unión, las células de levadura inducidas se etiquetaron con un anticuerpo anti-etiqueta Myc [anticuerpo monoclonal 9B11 de ratón, conjugado con ficoeritrina (PE); Cell Signaling Technology, 3739] para tener en cuenta los niveles de expresión en la superficie. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora con una serie de diluciones de tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01 marcados con aloficocianina (APC). Después del lavado, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se registró la intensidad media de fluorescencia (IMF) del canal APC (unión del tetrámero) para cada concentración de tetrámero. La IMF se representó gráficamente frente a la concentración de tetrámero, y los datos se ajustaron mediante regresión no lineal de mínimos cuadrados (en GraphPad Prism) utilizando la ecuación de unión específica de un sitio, donde IMFmin es la IMF de fondo, IMFmax es la IMF a la saturación, [X] es la concentración de tetrámero y Kd es la constante de disociación aparente. Se consideraron aceptables los ajustes con un valor de coeficiente de determinación de 0,998 o superior, lo que proporciona estimaciones de Kd precisas en un 30 %.

Ingeniería de células CAR T humanas

Las secuencias de scFv anti-KRASG12V (A4 y B9), scFv anti-CD19 (FMC63), región de bisagra/TM de CD8α, módulo costimulador 4-1BB, dominio de señalización CD3ζ, secuencia de autoescisión P2A y genes de suicidio/marcador RQR8 se clonaron en un vector lentiviral. Se aislaron PBMCs de donantes sanos mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll. A continuación, se activaron las células T con anticuerpos CD3/CD28 (Novoprotein, GMP-A018 y GMP-A063) antes de la transducción lentiviral para expresar los CAR. Las células se expandieron aún más y se cultivaron con IL-7 (Novoprotein, CX47) e IL-15 (Novoprotein, C016) para una amplificación continua. La eficiencia de la transducción se determinó mediante citometría de flujo de la expresión de CD34 en el día 14. Las células CAR T se seleccionaron positivamente con el kit de microesferas CD34 (Miltenyi Biotec, 130-100-453).

Preparación de células CAR T murinas

El scFv anti-KRASG12V (A4 y B9) y el scFv anti-CD19 (FMC63), junto con mCD28, mCD3ζ y los genes de suicidio/marcador RQR8, se clonaron en un vector retroviral de células madre murinas. Se aislaron células T de los bazo de ratón utilizando un kit de aislamiento de células T pancreáticas de ratón (Miltenyi, 130-095-130). Tras el aislamiento, las células T se activaron durante 24 horas con anticuerpos anti-CD3/CD28 de ratón (BioLegend, 100340 y 102116) y, a continuación, se transducieron con los vectores retrovirales. Las células T murinas se cultivaron y se expandieron en medio RPMI 1640 completo suplementado con 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, Hepes, l-glutamina, β-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y proteína recombinante de IL-2 de ratón (50 U/ml; PeproTech, 212-12-5UG).

Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar la actividad citotóxica, las células CAR T pareadas de donantes se cocultivaron con células diana que expresaban luciferasa a las proporciones E:T especificadas durante 24 horas. La señal de luciferasa (APExBIO, C3654) y la absorbancia (560 nm) se cuantificaron para determinar la lisis celular.

Detección de citocinas

Las células diana se cocultivaron durante 24 horas con células CAR T pareadas de donantes a las proporciones E:T especificadas. Después de la incubación de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se cuantificaron las concentraciones de TNF-α e IFN-γ utilizando un panel de respuesta inmune esencial LEGENDplex HU (BioLegend, 740930) en un citómetro de flujo. Para el ensayo de péptidos, se añadieron diferentes concentraciones de péptidos de KRAS WT, G12D o G12V de 10 aminoácidos a células K562 transducidas con HLA-A*02:01 durante 1 hora a 37 °C y, a continuación, se cocultivaron con células CAR A4 y B9 a una proporción E:T de 2:1. Después de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes para detectar la expresión de IFN-γ. Para el ensayo de glicina/alanina y X-scan, cada residuo de la secuencia del péptido de KRAS G12V de 10 aminoácidos se sustituyó secuencialmente por 19 aminoácidos naturales. A continuación, los péptidos se añadieron a células K562 transducidas con HLA-A*02:01 a una concentración de 10 μM durante 1 hora. Se realizó la cocultivación con células CAR B9 a una proporción E:T de 1:1 o 2:1 durante 24 horas para evaluar la liberación de IFN-γ. El péptido de 10 aminoácidos de tipo salvaje y el péptido de 10 aminoácidos de KRAS G12V se utilizaron como controles.

Eliminación génica mediada por CRISPR-Cas9 en células CFPAC-1

Para la eliminación génica mediada por CRISPR-Cas9 en células CFPAC-1, se utilizaron dos ARN guía únicos (sgRNA): sgRNA dirigido a KRAS (TCTCGACACAGCAGGTCAAG) diseñado utilizando la herramienta de diseño de CRISPR (crispr.mit.edu) y sgRNA dirigido a B2M (CGCGAGCACAGCTAAGGCCA) de la literatura publicada (^[65]). Ambos sgRNA se clonaron en el vector lentiCRISPR v2 utilizando la digestión con Bsm BI y la ligación de ADN con T4, seguida de la transformación en células competentes Stbl3 y la verificación de la secuencia. Las partículas lentivirales se generaron en células HEK293T mediante la cotransfección de los constructos de sgRNA junto con los plásmidos de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, L3000015). Los sobrenadantes virales se recogieron después de 72 horas y, a continuación, se concentraron mediante ultracentrifugación. Las células CFPAC-1 se transducieron con lentivirus. La eficiencia de la eliminación de KRAS se validó mediante Western blot, y la de B2M mediante citometría de flujo.

Western blot

Las células se trataron con tripsina, se lisaron (tampón Western/IP y fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y se centrifugaron (12 000g, 10 min). Se desnaturalizaron muestras de proteína (20 a 30 μg), se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (gel de apilamiento de 80 V/gel de separación de 120 V) y se transfirieron a membranas de PVDF (300 mA, 90 min). Después del bloqueo (5 % de leche), las membranas se incubaron con anticuerpos KRAS (Proteintech, 12063-1-AP; RRID: AB878040; 1:1000) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Affinity, AF7021; RRID: AB2839421; 1:5000) durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (Boster, BA1054; RRID: AB_2734136; 1:5000), las señales se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) utilizando ChemiDoc MP (Bio-Rad).

Cultivo de organoides

Se establecieron organoides de CRC humanos a partir de muestras quirúrgicas. En resumen, los tejidos tumorales se enjuagaron en PBS, se picaron en fragmentos de 1 a 3 mm3 y se digirieron con 3 a 5 volúmenes de tripsina a 4 °C durante 10 a 15 min. Se detuvo la digestión con FBS (3× volumen) cuando se observaron de 5 a 10 cúmulos de células. La suspensión se filtró (100 μm), se centrifugó (300g, 5 min) y se resuspendió en medio de cultivo de organoides (Luohua, LH2302-CR-A100/LH2301-LR-A100). Las células se mezclaron con 25× volumen de Matrigel helado (Corning, 356231), se colocaron (25 μl por pocillo en placas de 24 pocillos) y se polimerizaron a 37 °C durante 40 a 60 min antes de añadir 500 a 750 μl de medio. Para el pasaje, los organoides se disociaron utilizando 2× volumen de tripsina (37 °C, 30 a 60 min), se replantaron en Matrigel (25× volumen) y se cultivaron como se indicó anteriormente. La criopreservación se realizó en 10 % de FBS/dimetilsulfóxido.

Cocultivo de organoides y células CAR T

Para los ensayos funcionales, los organoides se disociaron enzimáticamente de Matrigel y se disociaron mecánicamente en suspensiones de células individuales. Tras el recuento de las células, las células CAR T se cocultivaron con las células diana a una proporción E:T de 1:1. Los sobrenadantes recogidos después de 24 horas se analizaron para detectar citocinas, mientras que la apoptosis se determinó mediante ELISA de caspasa-3 escindida (BOSTER, EK1425) según las instrucciones del kit. Se detectaron TNF-α e IFN-γ como se describió anteriormente.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se recogieron líneas celulares y tejidos patológicos en parafina de pacientes, y se extrajo el ADN genómico. Se detectaron los subtipos de KRAS utilizando un kit de detección de siete mutaciones del gen KRAS humano (TZYMED, YZYMT-001-A).

Citometría de flujo

Los anticuerpos utilizados en este estudio incluyeron el anticuerpo humano CD34 conjugado con PE (R&D Systems, FAB7227P; RRID: AB10973177), inmunoglobulina G1 (IgG1) de ratón conjugada con PE, utilizada como control isotípico (R&D Systems, IC002P; RRID: AB357242), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-humano CD45RA (BioLegend, 983002; RRID: AB2650650), APC anti-humano CD197 (CCR7) (BioLegend, 353213; RRID: AB10915474), FITC, control isotípico de ratón IgG2b κ (BioLegend, 402207; RRID: AB3097051), APC, control isotípico de ratón IgG2a κ (BioLegend, 981906; RRID: AB3097032) y FITC anti-humano HLA-A2 (BioLegend, 343303; RRID: AB_1659246).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Las células B9 CAR T se recolectaron después de 24 horas de cultivo en dos condiciones: (i) monocultivo o (ii) cocultivo con células CFPAC-1 como objetivo, en una proporción de 1:1. Las células UTD T se incluyeron como controles. Se prepararon suspensiones celulares simples con >80% de viabilidad antes de la secuenciación (realizada por Shanghai Neo-Bio Company). Brevemente, las células viables se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 700 a 1200 células/μl. El particionado de células individuales se realizó utilizando el sistema Chromium X (10x Genomics) para generar GEM (perlas de gel en emulsión). La transcripción inversa se llevó a cabo en un termociclador para la síntesis de ADNc, seguida de la purificación de GEM, la amplificación de ADNc y la purificación utilizando cuentas magnéticas. A partir del ADNc que superó el control de calidad (QC), se construyó una biblioteca de expresión 3′ mediante fragmentación, adición de adaptadores y PCR de índice. Después de la cuantificación, se realizó la secuenciación Illumina (lecturas de pares emparejados de 150 pares de bases).

Análisis de datos de scRNA-seq

Los datos de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38, seguido del etiquetado y el recuento de identificadores moleculares únicos, y las matrices de expresión génica se generaron utilizando Cell Ranger v.6.1.2 (10x Genomics). El paquete R Seurat se utilizó para el procesamiento sistemático de los datos de scRNA-seq (^[66]). Primero, los datos se sometieron a un control de calidad para identificar y excluir células dúplex, y solo se retuvieron las células con recuentos de genes expresados entre 200 y 6000 y menos del 20% de genes mitocondriales para el análisis posterior. Posteriormente, utilizando el análisis de componentes principales (PCA), se detectaron efectos de lote en los conjuntos de datos de tres fuentes, y se utilizaron los parámetros predeterminados de la función RunHarmony para mitigar los posibles efectos de lote y permitir la integración de datos. A continuación, la función FindVariableFeatures se utilizó para identificar genes altamente variables basándose en el método mean.var.plot, la función RunPCA se utilizó para realizar PCA en genes altamente variables y se seleccionaron 10 componentes principales integrando los métodos JackStraw y Elbow. El agrupamiento no supervisado de células se realizó utilizando la función FindClusters con la resolución establecida en 0,5, y los resultados del agrupamiento se visualizaron utilizando el método UMAP. Los genes marcadores para los subtipos de células T se obtuvieron de la literatura publicada (^[27]), y la función AddModuleScore se utilizó para calcular las puntuaciones de los genes marcadores de los subtipos de células T. La función FindAllMarkers se utilizó para identificar los genes diferencialmente expresados (DEG) en cada grupo de células, y los umbrales de significación se establecieron en umbrales de |avglog2FC| > 1 y Pvaladj < 0,01. Los análisis de enriquecimiento funcional de los DEG se realizaron utilizando el paquete R clusterProfile, y los umbrales de significación para los análisis de enriquecimiento se establecieron en adj. P < 0,01. El análisis de series temporales de una sola célula se realizó utilizando el método DDR-Tree y los parámetros predeterminados en el paquete R Monocle2 (^[27]); las funciones learngraph y ordercells se utilizaron para la inferencia de la trayectoria celular, ambas utilizando la configuración de parámetros predeterminada; se utilizaron datos normalizados en logaritmo como entradas; y los DEG agrupados por subtipos de células T se utilizaron como el conjunto de genes de ordenación. La actividad metabólica de las células individuales se evaluó utilizando el paquete R scMetabolism (^[67]), el método "VISION" y la vía KEGG integrada en scMetabolism como entrada.

Modelos xenogénicos

Los ratones NCG de seis semanas de edad (NOD/SCID/IL-2Rgcnull; Sperford Biotechnology) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en el Wannan Medical College. Para los modelos de PDAC subcutáneo, los ratones con tumores CFPAC-1-luc subcutáneos (1 × 106 células) durante 7 días se aleatorizaron en cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron PBS intravenoso, células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 (5 × 106 células cada una). Para los modelos metastásicos, los ratones inyectados intravenosamente con células CFPAC-1-luc o Caco-2-luc (1 × 106) se aleatorizaron en seis grupos (n = 5), que recibieron células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 en cuatro dosis (0,5 × 106 a 5 × 106 células). Para los modelos de metástasis peritoneal, los ratones inyectados intraperitonealmente con células CFPAC-1-luc (2 × 106) se aleatorizaron en tres grupos (n = 5) que recibieron células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 intraperitoneales (5 × 106 células cada una). La progresión tumoral se controló mediante imagen de bioluminiscencia (AniView100, Biolight Biotechnology) y se registró la supervivencia.

Evaluación de la toxicidad de las células B9 CAR T en ratones NCG-HLA-A2.1

Se utilizaron ratones NCG-HLA-A2.1 de seis semanas de edad [NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22H2-K1emCin (HLA-A2.1)/Gpt; GemPharmatech] para la evaluación de la toxicidad. Los ratones fueron inoculados subcutáneamente con 1 × 106 células CFPAC1-Luc, seguido de la administración intravenosa de 5 × 106 células B9 CAR T 7 días después. Se controlaron los pesos corporales semanalmente durante el período de estudio. Las cohortes fueron sacrificadas a la semana 1 y al mes después del tratamiento para el análisis histopatológico. Se recolectaron órganos para el examen histológico con H&E, y se recolectó sangre periférica para un hemograma completo (CBC). Los ratones sanos de la misma edad que recibieron PBS por inyección en la vena de la cola sirvieron como controles.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) de ratones NCG-HLA-A2.1 utilizando un kit de detección universal (Proteintech, PK10006). Después de la recuperación del antígeno en un tampón de citrato y el bloqueo de la peroxidasa endógena, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios específicos: anti-RNF112 (Proteintech, 25165-1-AP; diluido 1:200) para tejidos renales y anti-SUOX (Proteintech, 15075-1-AP; diluido 1:200) para tejidos hepáticos. La inmunorreactividad se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con HRP y un cromógeno de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Todas las secciones se contracolorearon con hematoxilina.

Modelo de ratón inmunocompetente y evaluación de la eficacia terapéutica

Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis semanas de edad (Qinglongshan Biotechnology). Para establecer tumores, se inyectaron subcutáneamente 1 × 106 células Panc02 diseñadas para sobreexpresar tanto KRASG12V como HLA-A*02:01 en la espalda. Siete días después de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y recibieron por vía intravenosa 5 × 106 células CAR T de ratón (por ejemplo, células CAR T mB9) o células T de control (por ejemplo, células CAR T anti-CD19) o PBS. Las dimensiones del tumor [longitud (L) y ancho (W)] se midieron semanalmente utilizando un calibrador, y el volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula.

El peso corporal del ratón se controló simultáneamente como un indicador de la salud sistémica. Se registró la supervivencia, y los ratones fueron sacrificados cuando el volumen tumoral excedió los 1500 mm3 o si se observaron signos de angustia grave. Para evaluar las respuestas de citocinas relacionadas con el tratamiento, se trataron cohortes separadas de ratones con tumor como se describió anteriormente. Se recolectaron muestras de sangre mediante sangrado retro-orbital en los días 7 y 21 después de la infusión de células CAR T. Se separó el suero y se cuantificaron los niveles de citocinas inflamatorias (incluidas IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-12p70, IL-10 e IL-6) utilizando el panel de inflamación de ratón LEGENDplex (BioLegend, 740150) según las instrucciones del fabricante. Para la evaluación histopatológica, se sacrificaron grupos adicionales de ratones en los días 7 y 30 después del tratamiento. Se recolectaron los órganos principales y se tiñeron con H&E para el examen microscópico de posibles lesiones o infiltrados inflamatorios.

Aprobación ética

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bienestar y Ética Animal del Wannan Medical College (WNMC-AWE-2023058) y el Comité de Ética Médica del Wannan Medical College (2023 n.º 66). Los tejidos tumorales para el cultivo de organoides se obtuvieron de pacientes con CRC que proporcionaron consentimiento informado por escrito.

Análisis estadístico

Las evaluaciones estadísticas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 8.0), con datos experimentales representados como medias ± DE a menos que se especifique lo contrario. Las comparaciones estadísticas entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con pruebas post hoc relevantes. El método de Kaplan-Meier se utilizó para analizar los datos de supervivencia, y se aplicó la prueba de rango logarítmico para determinar la significación.

Líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas en este estudio incluyeron K562 (RRID: CVCL0004), PANC-1 (RRID: CVCL0480), SW620 (RRID: CVCL0547), A549 (RRID: CVCL0023), NCI-H441 (RRID: CVCL1561) y SK-OV-3 (RRID: CVCL0532) (obtenidas del Banco de Células del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghái); riñón embrionario humano (HEK) 293T (RRID: CVCL0063), CFPAC-1 (RRID: CVCL1119) y Caco-2 (RRID: CVCL0025) (compradas a Wuhan Pricella Life Technology Co. Ltd.); OVCAR-5 (RRID: CVCL1628) (adquiridas de Shanghai YaJi Biological Co. Ltd.); y células KOP293 en suspensión (RRID no disponible) (compradas a Zhuhai Kairui Biotech). Las células KOP293 se cultivaron en un medio KOP293 libre de suero (Kairui Biotech, 03252) en un incubador de agitación de CO2 a 37 °C con 5% de CO2 y agitación a 120 rpm. Todas las demás líneas celulares (excepto Caco-2) se mantuvieron a 37 °C en un medio apropiado suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y penicilina/estreptomicina (100 U/ml cada una). Las células Caco-2 requerían un 20% de SFB. Específicamente, las células K562, NCI-H441 y Panc02 se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, C22400500BT); HEK293T y PANC-1 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco, C11995500BT); CFPAC-1 en medio de Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) (Pricella, PM150510); SW620 en L-15 de Leibovitz (Pricella, PM151010) sin CO2; A549 en F-12 K de Ham (Gibco, 21127022); SK-OV-3 en McCoy's 5A (Pricella, PM150710); y Caco-2 en MEM (Pricella, PM150410). Todas las líneas celulares se confirmaron libres de micoplasma utilizando un kit de detección por PCR (Beyotime, C0301S) antes de su uso. La expresión de KRASG12V y HLA-A*02:01 se verificó utilizando PCR cuantitativa y citometría de flujo.

Análisis de bases de datos

Los datos de mutación de KRAS se recopilaron y analizaron de cBioPortal (https://www.cbioportal.org/). Los datos de distribución de HLA-A*02:01 se recopilaron y analizaron de AFND (http://allelefrequencies.net/). Los subtipos de mutación de KRAS y el estado de HLA-A*02:01 en las líneas celulares tumorales humanas se recopilaron de CCLE (https://sites.broadinstitute.org/ccle/) y Cellosaurus (www.cellosaurus.org/).

Construcción de la biblioteca de visualización de anticuerpos scFv humanos

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos, seguida de la extracción de ARNm (Tiangen, DP419) y la transcripción inversa a ADNc (Takara, RR047A). Los genes codificantes de VH y VL de anticuerpos se amplificaron por separado mediante PCR (Vazyme, P520-02), se purificaron y se ensamblaron aleatoriamente en genes scFv utilizando cebadores que incorporan enlazadores que permitieron que los fragmentos VH y VL sirvieran como cebadores y plantillas mutuas a través de secuencias de enlazador complementarias. El fragmento se clonó en el vector pCANTAB 5E y se electroporó en células competentes de Escherichia coli (TG1) utilizando un electroporador BTX Gemini SC (2,5 kV, pulso de 5,0 ms, resistencia de 750 Ω, capacitancia de 25 μF y espacio de 2 mm) con 1000 pulsos. La capacidad de la biblioteca se determinó en 1,7 × 1012 unidades formadoras de colonias basándose en el análisis de secuenciación de 100 a 200 clones seleccionados aleatoriamente.

Péptidos

Todas las síntesis de péptidos se realizaron por GL Biochem (Shanghai) Ltd. utilizando la metodología estándar de síntesis de péptidos en fase sólida 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Tomando como ejemplo el péptido sintético KLVVVGAVGV, comience con la resina Fmoc-Val-Wang (Val en el extremo C preacoplado), desproteja el grupo Fmoc utilizando 20% de piperidina/N,N'-dimetilformamida (DMF; 20 min) y confirme la desprotección mediante una prueba con ninhidrina (color azul, NH2 libre). Acople Fmoc-Gly-OH utilizando HBTU/DIEA en DMF (1 hora), confirme el éxito del acoplamiento mediante una prueba con ninhidrina (incoloro) y, a continuación, desproteja Fmoc con 20% de piperidina (azul). Repita el acoplamiento/desprotección secuencialmente, asegurando la validación con ninhidrina en cada paso (incoloro después del acoplamiento, azul después de la desprotección). Después de la eliminación final de Fmoc, seque la resina. Clive el péptido de la resina utilizando TFA/TIS/H2O (2 horas), precipite el péptido crudo con éter frío, purifique mediante cromatografía líquida de alto rendimiento y liofilice para obtener el producto puro.

Síntesis de complejos tetraméricos de péptido-HLA-A*02:01

La síntesis de tetrámeros de péptido KRAS-HLA-A*02:01 implica tres pasos secuenciales: plegamiento, donde la cadena pesada del MHC de clase I, β2m y el péptido se ensamblan en un complejo monomérico; biotinilación, donde la enzima BirA etiqueta la lisina en el extremo C de la cadena pesada, seguida de la purificación mediante cromatografía para eliminar las impurezas; y tetramerización, donde la unión biotina-estreptavidina se utiliza para formar el tetrámero.

Cribado de scFv específicos que se dirigen a KRASG12V/HLA-A*02:01

El tetrámero de péptido KRAS G12V/HLA-A*02:01 (2 μg en 200 μl de PBS por pocillo) se recubrió durante la noche a 4 °C y, a continuación, se bloqueó con un tampón de bloqueo de leche al 4% (350 μl por pocillo) a 37 °C durante 1 hora. La biblioteca de fagos (1,7 × 1012 unidades formadoras de placa en 50 μl) se preincubó con 2 μg de tetrámero soluble KRAS WT/HLA-A*02:01 durante 1 hora. Los fagos no unidos continuaron incubándose con 2 μg de KRAS G12V/HLA-A*02:01 durante 2 horas. Después de seis lavados rigurosos (420 μl de PBS por pocillo, agitación de 1 minuto), los fagos unidos se eluyeron en medio ácido, se neutralizaron y se utilizaron para infectar TG1 en fase logarítmica media durante 1 hora con agitación. La cultura se suplementó con glucosa (2%), ampicilina y fago auxiliar M13KO7 (1 hora, 37 °C), luego se centrifugó y se resuspendió en 1 ml de medio 2× extracto de levadura-triptona (YT) que contiene ampicilina y kanamicina para la incubación durante la noche. El sobrenadante que contiene fagos enriquecidos sirvió como entrada para rondas posteriores, manteniendo una concentración constante de tetrámero KRAS WT (2 μg) al tiempo que se disminuía progresivamente la concentración del tetrámero recubierto de KRAS G12V (de 2 a 0,06 μg en las rondas) y se aumentaba el número de ciclos de lavado (de 6 a 21). La ronda final de competición utilizó una relación molar de 32:1 de tetrámeros solubles KRAS WT: G12V para maximizar la especificidad.

Validación ELISA de clones positivos

Un total de 960 clones monoclonales (seleccionados aleatoriamente de 10 placas de 96 pocillos) se sometieron a un cribado mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). El ELISA primario evaluó la afinidad de unión de los clones al tetrámero KRAS G12V-HLA-A*02:01 utilizando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (SinoBiological, 11973-MM05T-H; RRID: AB_2857928). En el cribado secundario, se evaluó aún más la especificidad de los clones reactivos a la proteína diana frente al tetrámero KRAS WT-HLA-A*02:01. Los clones que demostraron una unión selectiva se secuenciaron para obtener sus secuencias de scFv.

Producción y purificación de anticuerpos

El sistema de células KOP293 en suspensión (Kairui Biotech) se cultivó en medio KPM (Kairui Biotech) a 37 °C con 5% de CO2 bajo agitación a 120 rpm. El constructo scFv contenía una etiqueta His en el extremo C y una etiqueta Flag en el extremo N para la purificación. El scFv se expresó en células KOP293 utilizando el reactivo de transfección TA-293 (Kairui Biotech), seguido de la purificación mediante cromatografía de afinidad de nitrilotriacético de níquel en un sistema ÄKTA (Cytiva).

Medición de la afinidad de unión basada en ELISA y determinación de la CE50 de los anticuerpos purificados frente a los tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01

La afinidad de unión de los anticuerpos purificados a los tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01 se evaluó cuantitativamente mediante ELISA. Se incubaron diluciones seriadas de anticuerpos purificados con tetrámeros inmovilizados, seguido de la detección con un anticuerpo secundario anti-etiqueta Flag conjugado con HRP (SinoBiological, 100233-MM01-H; RRID: AB_3676780). Se generaron curvas de unión y se determinó la CE50 utilizando análisis de regresión no lineal (GraphPad Prism, función de ajuste de curva).

Construcción del sistema de visualización de levaduras

Los vectores de visualización de superficie de levaduras para los scFv A4 y B9 se construyeron sobre la base del andamio pNACP, un derivado de pCTCon2 (Addgene, 41843), como se describió anteriormente (^[64]). Brevemente, las secuencias de genes que codifican los scFv A4 o B9 se clonaron en el sitio multiclon de la vector pNACP. Los plásmidos resultantes, pNACP-A4 y pNACP-B9, permiten la visualización del scFv respectivo como una proteína de fusión Aga2p en la superficie de la levadura. Los plásmidos se transformaron en células de levadura Saccharomyces cerevisiae EBY100 químicamente competentes y se colocaron en placas de selección SD-CAA. Después de la incubación a 30 °C durante 3 días, se verificaron los transformantes positivos mediante PCR en colonias. Una sola colonia verificada se inoculó en medio SD-CAA suplementado con antibióticos [ampicilina (100 μg/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y kanamicina (100 μg/ml)] y se cultivó a 30 °C con agitación a 225 rpm durante 24 horas. Las células de levadura se recolectaron por centrifugación (2500 g durante 3 min), se resuspendieron en medio de inducción SG-CAA (con los mismos suplementos de antibióticos) a una densidad óptica a 600 nm de 0,5 a 1,0 y se indujeron durante 60 horas a 20 °C con agitación a 225 rpm.

Medición de la afinidad de scFv mediante citometría de flujo

Para medir la afinidad de unión, las células de levadura inducidas se etiquetaron con un anticuerpo anti-etiqueta Myc [anticuerpo monoclonal 9B11 de ratón, conjugado con ficoeritrina (PE); Cell Signaling Technology, 3739] para tener en cuenta los niveles de expresión en la superficie. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora con una serie de diluciones de tetrámeros KRAS G12V-HLA-A*02:01 marcados con aloficocianina (APC). Después del lavado, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se registró la intensidad media de fluorescencia (IMF) del canal APC (unión del tetrámero) para cada concentración de tetrámero. La IMF se representó gráficamente frente a la concentración de tetrámero, y los datos se ajustaron mediante regresión no lineal de mínimos cuadrados (en GraphPad Prism) utilizando la ecuación de unión específica de un sitio, donde IMFmin es la IMF de fondo, IMFmax es la IMF a la saturación, [X] es la concentración de tetrámero y Kd es la constante de disociación aparente. Los ajustes con un valor de coeficiente de determinación de 0,998 o superior se consideraron aceptables, proporcionando estimaciones de Kd precisas dentro del 30%.

Ingeniería de células CAR T humanas

Las secuencias de scFv anti-KRASG12V (A4 y B9), scFv anti-CD19 (FMC63), región de bisagra/TM de CD8α, módulo costimulador 4-1BB, dominio de señalización CD3ζ, secuencia de autoescisión P2A y genes de suicidio/marcador RQR8 se clonaron en un vector lentiviral. Las PBMCs se aislaron de donantes sanos mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll. A continuación, las células T se activaron con anticuerpos CD3/CD28 (Novoprotein, GMP-A018 y GMP-A063) antes de la transducción lentiviral para expresar los CAR. Las células se expandieron aún más y se cultivaron con IL-7 (Novoprotein, CX47) e IL-15 (Novoprotein, C016) para una amplificación continua. La eficiencia de transducción se determinó mediante citometría de flujo de la expresión de CD34 en el día 14. Las células CAR T se seleccionaron positivamente con el kit de microesferas CD34 (Miltenyi Biotec, 130-100-453).

Preparación de células CAR T murinas

El scFv anti-KRASG12V (A4 y B9) y el scFv anti-CD19 (FMC63), junto con mCD28, mCD3ζ y los genes de suicidio/marcador RQR8, se clonaron en un vector retroviral de células madre murinas. Las células T se aislaron de los bazo de ratón utilizando un kit de aislamiento de células T pancreáticas de ratón (Miltenyi, 130-095-130). Tras el aislamiento, las células T se activaron durante 24 horas con anticuerpos anti-CD3/CD28 de ratón (BioLegend, 100340 y 102116) y, a continuación, se transducieron con los vectores retrovirales. Las células T murinas se cultivaron y se expandieron en medio completo RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, Hepes, glutamina, β-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y proteína recombinante de IL-2 de ratón (50 U/ml; PeproTech, 212-12-5UG).

Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar la actividad citotóxica, las células CAR T pareadas del donante se cocultivaron con células diana que expresan luciferasa a las relaciones E:T especificadas durante 24 horas. La señal de luciferasa (APExBIO, C3654) y la absorbancia (560 nm) se cuantificaron para determinar la lisis celular.

Detección de citocinas

Las células diana se cocubaron durante 24 horas con células CAR T pareadas del donante a las relaciones E:T especificadas. Después de la incubación de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y se cuantificaron las concentraciones de TNF-α e IFN-γ utilizando un panel de respuesta inmune esencial LEGENDplex HU (BioLegend, 740930) en un citómetro de flujo. Para el ensayo de péptidos, se pulsaron diferentes concentraciones de péptidos KRAS WT, G12D o G12V de 10 aminoácidos en células K562 transfectadas con HLA-A*02:01 durante 1 hora a 37 °C y, a continuación, se cocultivaron con células CAR T A4 y B9 a una relación E:T de 2:1. Después de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes para detectar la expresión de IFN-γ. Para el ensayo de glicina/alanina y X-scan, cada residuo en la secuencia del péptido KRAS G12V de 10 aminoácidos se sustituyó secuencialmente por 19 aminoácidos naturales. A continuación, los péptidos se pulsaron en células K562 HLA-A*02:01 a una concentración de 10 μM durante 1 hora. La cocultivación con células CAR B9 a una relación E:T de 1:1 o 2:1 durante 24 horas se realizó para evaluar la liberación de IFN-γ. El péptido de 10 aminoácidos de tipo salvaje y el péptido de 10 aminoácidos de KRAS G12V se utilizaron como controles.

Eliminación génica mediada por CRISPR-Cas9 en células CFPAC-1

Para la eliminación génica mediada por CRISPR-Cas9 en células CFPAC-1, se utilizaron dos ARN guía únicos (sgRNA): sgRNA dirigido a KRAS (TCTCGACACAGCAGGTCAAG) diseñado utilizando la herramienta de diseño de CRISPR (crispr.mit.edu) y sgRNA dirigido a B2M (CGCGAGCACAGCTAAGGCCA) de la literatura publicada (^[65]). Ambos sgRNA se clonaron en el vector lentiCRISPR v2 utilizando la digestión con Bsm BI y la ligación de ADN con T4, seguida de la transformación en células competentes Stbl3 y la verificación de la secuencia. Las partículas lentivirales se generaron en células HEK293T mediante la cotransfección de los constructos sgRNA junto con los plásmidos de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, L3000015). Los sobrenadantes virales se recolectaron después de 72 horas y, a continuación, se concentraron mediante ultracentrifugación. Las células CFPAC-1 se transducieron con lentivirus. La eficiencia de eliminación de KRAS se validó mediante Western blot, y para B2M mediante citometría de flujo.

Western blot

Las células se trataron con tripsina, se lisaron (tampón occidental/IP y fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y se centrifugaron (12 000 g, 10 min). Se desnaturalizaron muestras de proteína (20 a 30 μg), se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (gel de apilamiento de 80 V/gel de separación de 120 V) y se transfirieron a membranas de PVDF (300 mA, 90 min). Después del bloqueo (5% de leche), las membranas se incubaron con anticuerpos KRAS (Proteintech, 12063-1-AP; RRID: AB878040; 1:1000) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Affinity, AF7021; RRID: AB2839421; 1:5000) durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (Boster, BA1054; RRID: AB_2734136; 1:5000), las señales se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) utilizando ChemiDoc MP (Bio-Rad).

Cultivo de organoides

Se establecieron organoides de CRC humanos a partir de muestras quirúrgicas. Brevemente, los tejidos tumorales se lavaron en PBS, se picaron en fragmentos de 1 a 3 mm³ y se digirieron con 3 a 5 volúmenes de tripsina a 4 °C durante 10 a 15 minutos. La digestión se detuvo con FBS (3× volumen) cuando se observaron de 5 a 10 grupos de células. La suspensión se filtró (100 μm), se centrifugó (300g, 5 min) y se resuspendió en un medio de cultivo de organoides (Luohua, LH2302-CR-A100/LH2301-LR-A100). Las células se mezclaron con 25× volumen de Matrigel (Corning, 356231) a temperatura ambiente, se sembraron (25 μl por pocillo en placas de 24 pocillos) y se polimerizaron a 37 °C durante 40 a 60 minutos antes de añadir de 500 a 750 μl de medio. Para el pasaje, los organoides se disociaron utilizando 2× volumen de tripsina (37 °C, 30 a 60 min), se resuspendieron en Matrigel (25× volumen) y se cultivaron como se describió anteriormente. La criopreservación se realizó en 10% de FBS/dimetilsulfóxido.

Cocultivo de organoides y células CAR T

Para los ensayos funcionales, los organoides se disociaron enzimáticamente de Matrigel y se disociaron mecánicamente en suspensiones de células individuales. Después del recuento celular, las células CAR T se cocultivaron con las células diana en una proporción E:T de 1:1. Los sobrenadantes recogidos después de 24 horas se analizaron para detectar citocinas, mientras que la apoptosis se determinó mediante ELISA de caspasa-3 clivada (BOSTER, EK1425) según las instrucciones del kit. Se detectaron TNF-α e IFN-γ como se describe anteriormente.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se recogieron líneas celulares y tejidos patológicos fijados en parafina de pacientes, y se extrajo el ADN genómico. Los subtipos de KRAS se detectaron utilizando un kit de detección de siete mutaciones del gen KRAS humano (TZYMED, YZYMT-001-A).

Citometría de flujo

Los anticuerpos utilizados en este estudio incluyeron anticuerpo anti-CD34 humano conjugado con PE (R&D Systems, FAB7227P; RRID: AB10973177), inmunoglobulina G1 (IgG1) de ratón conjugada con PE, control de isotipo (R&D Systems, IC002P; RRID: AB357242), fluoresceína isotiocianato (FITC) anti-CD45RA humano (BioLegend, 983002; RRID: AB2650650), APC anti-CD197 (CCR7) humano (BioLegend, 353213; RRID: AB10915474), control de isotipo IgG2b κ de ratón FITC (BioLegend, 402207; RRID: AB3097051), control de isotipo IgG2a κ de ratón APC (BioLegend, 981906; RRID: AB3097032) y FITC anti-HLA-A2 humano (BioLegend, 343303; RRID: AB_1659246).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Las células B9 CAR T se recogieron después de 24 horas de cultivo en dos condiciones: (i) monocultivo o (ii) cocultivo con células CFPAC-1 como células diana en una proporción de 1:1. Las células UTD T se incluyeron como controles. Se prepararon suspensiones de células individuales con >80% de viabilidad antes de la secuenciación (realizada por Shanghai Neo-Bio Company). Brevemente, las células viables se lavaron y se resuspendieron a 700 a 1200 células/μl. El particionado de células individuales se realizó utilizando el sistema Chromium X (10x Genomics) para generar GEM (perlas de gel en emulsión). La transcripción inversa se llevó a cabo en un termociclador para la síntesis de ADNc, seguida de la limpieza de GEM, la amplificación de ADNc y la purificación utilizando cuentas magnéticas. A partir del ADNc que superó el control de calidad (QC), se construyó una biblioteca de expresión 3′ mediante fragmentación, adición de adaptadores y PCR de índice. Después de la cuantificación, se realizó la secuenciación Illumina (lecturas PE de 150 pares de bases).

Análisis de datos de scRNA-seq

Los datos de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38, seguido del etiquetado y el recuento de identificadores moleculares únicos, y se generaron las matrices de expresión génica utilizando Cell Ranger v.6.1.2 (10x Genomics). El paquete R Seurat se utilizó para el procesamiento sistemático de los datos de scRNA-seq (^[66]). Primero, los datos se sometieron a un control de calidad para identificar y excluir las células dúplex, y solo se retuvieron las células con recuentos de genes expresados entre 200 y 6000 y menos del 20% de genes mitocondriales para el análisis posterior. Posteriormente, utilizando el análisis de componentes principales (PCA), se detectaron efectos de lote en los conjuntos de datos de tres fuentes, y se utilizaron los parámetros predeterminados de la función RunHarmony para mitigar los posibles efectos de lote y permitir la integración de datos. A continuación, la función FindVariableFeatures se utilizó para identificar los genes altamente variables basándose en el método mean.var.plot, la función RunPCA se utilizó para realizar PCA en los genes altamente variables y se seleccionaron 10 componentes principales integrando los métodos JackStraw y Elbow. El agrupamiento no supervisado de células se realizó utilizando la función FindClusters con la resolución establecida en 0,5, y los resultados del agrupamiento se visualizaron utilizando el método UMAP. Los genes marcadores para los subtipos de células T se obtuvieron de la literatura publicada (^[27]), y la función AddModuleScore se utilizó para calcular las puntuaciones de los genes marcadores de los subtipos de células T. La función FindAllMarkers se utilizó para identificar los DEG en cada grupo de células, y los umbrales de significación se establecieron en umbrales de |avglog2FC| > 1 y Pvaladj < 0,01. Los análisis de enriquecimiento funcional de los DEG se realizaron utilizando el paquete R clusterProfile, y los umbrales de significación para los análisis de enriquecimiento se establecieron en adj. P < 0,01. El análisis de series temporales de una sola célula se realizó utilizando el método DDR-Tree y los parámetros predeterminados en el paquete R Monocle2 (^[27]); las funciones learngraph y ordercells se utilizaron para la inferencia de la trayectoria celular, ambas utilizando la configuración de parámetros predeterminada; se utilizaron datos normalizados por logaritmo como entradas; y los DEG agrupados por subtipos de células T se utilizaron como el conjunto de genes de ordenación. La actividad metabólica de las células individuales se evaluó utilizando el paquete R scMetabolism (^[67]), el método "VISION" y la vía KEGG integrada en scMetabolism como entrada.

Modelos xenogénicos

Se mantuvieron ratones NCG de seis semanas de edad (NOD/SCID/IL-2Rgcnull; Sperford Biotechnology) en condiciones libres de patógenos específicos en el Wannan Medical College. Para los modelos de PDAC subcutáneo, los ratones con tumores CFPAC-1-luc subcutáneos (1 × 106 células) durante 7 días se aleatorizaron en cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron PBS intravenoso, células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 (5 × 106 células cada una). Para los modelos metastásicos, los ratones inyectados intravenosamente con células CFPAC-1-luc o Caco-2-luc (1 × 106) se aleatorizaron en seis grupos (n = 5), que recibieron células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 en cuatro dosis (de 0,5 × 106 a 5 × 106 células). Para los modelos de metástasis peritoneal, los ratones inyectados intraperitonealmente con células CFPAC-1-luc (2 × 106) se aleatorizaron en tres grupos (n = 5) que recibieron células UTD T, células CAR T CD19 o células CAR T B9 intraperitoneales (5 × 106 células cada una). La progresión tumoral se controló mediante imagen de bioluminiscencia (AniView100, Biolight Biotechnology), y se registró la supervivencia.

Evaluación de la toxicidad de las células CAR T B9 en ratones NCG-HLA-A2.1

Se utilizaron ratones NCG-HLA-A2.1 de seis semanas de edad [NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22H2-K1emCin (HLA-A2.1)/Gpt; GemPharmatech] para la evaluación de la toxicidad. Los ratones se inocularon subcutáneamente con 1 × 106 células CFPAC1-Luc, seguido de la administración intravenosa de 5 × 106 células CAR T B9 7 días después. Se controlaron los pesos corporales semanalmente durante el período de estudio. Las cohortes se sacrificaron a la semana 1 y al mes después del tratamiento para el análisis histopatológico. Se recogieron órganos para el examen histológico con H&E, y se recogió sangre periférica para un hemograma completo. Los ratones sanos de la misma edad que recibieron PBS por inyección en la vena de la cola sirvieron como controles.

Inmunohistoquímica

Se realizó inmunohistoquímica en secciones de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) de ratones NCG-HLA-A2.1 utilizando un kit de detección universal (Proteintech, PK10006). Tras la recuperación del antígeno en un tampón de citrato y el bloqueo de la peroxidasa endógena, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios específicos: anti-RNF112 (Proteintech, 25165-1-AP; diluido 1:200) para tejidos renales y anti-SUOX (Proteintech, 15075-1-AP; diluido 1:200) para tejidos hepáticos. La inmunorreactividad se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con HRP y un cromógeno de 3,3′-diaminobencidina (DAB). Todas las secciones se contracolorearon con hematoxilina.

Modelo de ratón inmunocompetente y evaluación de la eficacia terapéutica

Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis semanas de edad (Qinglongshan Biotechnology). Para establecer tumores, se inyectaron subcutáneamente 1 × 106 células Panc02 diseñadas para sobreexpresar tanto KRASG12V como HLA-A*02:01 en la espalda. Siete días después de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y recibieron por vía intravenosa 5 × 106 células CAR T de ratón (por ejemplo, células CAR T mB9) o células T de control (por ejemplo, células CAR T anti-CD19) o PBS. Las dimensiones del tumor [longitud (L) y anchura (W)] se midieron semanalmente utilizando un calibrador, y el volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula

Se controló simultáneamente el peso corporal del ratón como indicador de la salud sistémica. Se registró la supervivencia, y se sacrificaron los ratones cuando el volumen tumoral superó los 1500 mm3 o si se observaron signos de angustia grave. Para evaluar las respuestas de las citocinas relacionadas con el tratamiento, se trataron cohortes separadas de ratones con tumor como se describió anteriormente. Se recogieron muestras de sangre por punción de la órbita en los días 7 y 21 después de la infusión de células CAR T. Se separó el suero y se cuantificaron los niveles de citocinas inflamatorias (incluidas IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-12p70, IL-10 e IL-6) utilizando el panel de inflamación de ratón LEGENDplex (BioLegend, 740150) según las instrucciones del fabricante. Para la evaluación histopatológica, se sacrificaron grupos adicionales de ratones en los días 7 y 30 después del tratamiento. Se recogieron los órganos principales y se tiñeron con H&E para el examen microscópico de posibles lesiones o infiltrados inflamatorios.

Aprobación ética

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Bienestar y Ética Animal del Wannan Medical College (WNMC-AWE-2023058) y el Comité de Ética Médica del Wannan Medical College (2023 n.º 66). Los tejidos tumorales para el cultivo de organoides se obtuvieron de pacientes con CRC que proporcionaron el consentimiento informado por escrito.

Análisis estadístico

Las evaluaciones estadísticas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 8.0), y los datos experimentales se representaron como medias ± DE, a menos que se especifique lo contrario. Las comparaciones estadísticas entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con las pruebas post hoc pertinentes. El método de Kaplan-Meier se utilizó para analizar los datos de supervivencia, y se aplicó la prueba de rango logarítmico para determinar la significación.