Análisis comparativo de la dinámica temporal de las señales de fluorescencia y fotoacústica del conjugado de cetuximab-IRDye800 en tumores con sobreexpresión de EGFR.

La imagen de fluorescencia, ya sea mediante el monitoreo de las variaciones inherentes en la autofluorescencia de los tejidos enfermos y sanos, o mediante el uso de agentes de contraste fluorescentes administrados externamente, ha demostrado mejorar el diagnóstico y la delimitación de los márgenes tumorales durante la resección quirúrgica (^[1]–^[4]). Esto se ejemplifica con el uso de varios agentes de contraste fluorescentes [azul de metileno, ácido 5-aminolevulínico e indocianina verde (ICG)] para la imagen de los ganglios linfáticos centinelas, las patologías vasculares y linfáticas, y los tejidos tumorales durante los procedimientos quirúrgicos (^[5]–^[7]). Sin embargo, la imagen de fluorescencia de los agentes de contraste administrados externamente se ve limitada por su acumulación inespecífica, lo que conduce a un diagnóstico y una definición de márgenes inexactos (^[8]). En este contexto, se ha demostrado que la conjugación de fluoróforos con agentes dirigidos a moléculas específicas mejora la especificidad (^[9]–^[13]), y se están llevando a cabo varios estudios clínicos para estudiar la eficacia de los fluoróforos dirigidos a moléculas específicas en el cáncer de cabeza y cuello (NCT01987375), el cáncer de páncreas (NCT02736578), el cáncer de próstata (NCT02048150), el cáncer de mama (NCT01508572) y el cáncer de recto (NCT01972373).

Además, la menor profundidad de penetración asociada con la imagen de fluorescencia también ha sido una limitación en las aplicaciones que requieren una navegación en tiempo real (^[8]). La combinación de la fluorescencia con la imagen fotoacústica (PA) proporciona la profundidad de penetración necesaria para mejorar la resolución espacial (^[14]–^[16]). La imagen PA se basa en la excitación de cromóforos utilizando láseres pulsados de nanosegundos, lo que induce expansiones térmicas transitorias que pueden detectarse mediante transductores de ultrasonido (^[17]). En esencia, la imagen PA combina la imagen óptica y la imagen de ultrasonido, lo que a menudo resulta ventajoso debido a los beneficios combinados de ambas modalidades de imagen: la sensibilidad de la imagen óptica con la mayor profundidad de penetración de la imagen de ultrasonido. La imagen PA se encuentra en ensayos clínicos para evaluar su eficacia diagnóstica para varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de mama (NCT03897270), el cáncer de tiroides (NCT04248166), los tumores de colon y recto (NCT04339374) y los cánceres de cabeza y cuello (NCT04428515), entre otros. Sin embargo, la imagen PA sin contraste tiene una sensibilidad limitada a los cambios moleculares y una especificidad reducida para diferenciar los tumores de los tejidos sanos. Se han propuesto varios agentes de contraste para la imagen PA, pero carecen de especificidad tumoral debido a su acumulación inespecífica. Más recientemente, se han estudiado los agentes de contraste dirigidos a moléculas específicas, que se han informado principalmente para la imagen de fluorescencia, para la imagen PA en modelos tumorales preclínicos y en estudios clínicos para la identificación in vivo y ex vivo de metástasis de ganglios linfáticos (^[18]–^[21]). Sin embargo, el contraste para la imagen PA en estudios clínicos ha sido poco satisfactorio (^[21]).

En el presente estudio, comparamos las capacidades de imagen PA y de fluorescencia de un conjugado de cetuximab-IRDye800 en un modelo de xenoinjerto tumoral subcutáneo. El cetuximab es un anticuerpo aprobado clínicamente dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y el cetuximab-IRDye800 se encuentra en ensayos clínicos para la imagen de fluorescencia intraoperatoria de varios tipos de cáncer, incluidos los cánceres de cabeza y cuello (^[12], ^[22], ^[23]). El EGFR es un prometedor marcador molecular, que se ha utilizado como molécula diana para la imagen y con fines terapéuticos debido a su sobreexpresión en varios tipos de cáncer, incluidos los cánceres de cabeza y cuello, los cánceres de páncreas, los cánceres de ovario, etc. (^[9], ^[11], ^[16]). Además, se han utilizado varios colorantes de infrarrojo cercano (NIR), incluido el IRDye800, como conjugados con cetuximab para la imagen multimodal de fluorescencia y PA (^[24], ^[25]). Los fluoróforos más utilizados también se han utilizado como agentes de contraste para las mediciones de PA debido a un notable rendimiento cuántico de la desexcitación no radiativa. Las propiedades de fluorescencia de los colorantes dependen de la transferencia radiativa de energía desde el estado excitado de un solo electrón (S1) al estado fundamental (S0). En contraste, las propiedades de PA dependen de la transferencia no radiativa de energía, ya sea desde el estado excitado de un solo electrón (S1) o desde el estado excitado de tripletes (T1), lo que se logra mediante un cruce intersistémico. En principio, los colorantes NIR con altos rendimientos cuánticos de fluorescencia (ΦFL) a menudo se prefieren para la imagen basada en la fluorescencia, mientras que los colorantes caracterizados por un rendimiento cuántico no radiativo relativamente mayor (ΦNR; cuantificado como 1 – ΦFL) se pueden utilizar como agentes de contraste de PA. De los varios colorantes fluorescentes que se utilizan en la clínica, el ICG (ΦFL = 0,12) y el IRDye800CW (ΦFL = 0,15) (^[26]) son agentes de contraste de PA relativamente mejores y se han explorado ampliamente para la imagen PA. El contraste de imagen de estos agentes puede alterarse significativamente dependiendo de su estado de agregación, concentración, entorno y unión a proteínas (^[19], ^[27], ^[28]).

En el presente estudio, utilizando un conjugado de cetuximab-IRDye800, informamos que la conjugación de IRDye800 a un anticuerpo, incluso a la concentración clínicamente relevante (DOL) de 2, facilita su H-agregación, mejorando así la intensidad de la señal de PA. Esto tiene implicaciones importantes cuando se aplica a la imagen tumoral in vivo, ya que el contraste de PA disminuye cuando el conjugado de cetuximab-IRDye800 sufre internalización celular y degradación en los lisosomas. Dado que la sabiduría convencional sostiene que los tiempos de incubación prolongados (de 2 a 5 días en estudios clínicos) para los conjugados de colorantes y anticuerpos son necesarios para capturar la relación óptima entre la señal de fluorescencia y el ruido de fondo, demostramos que esto puede influir negativamente en el contraste de PA. A través del análisis comparativo microscópico del tejido tumoral, mostramos que, si bien la distribución de cetuximab-IRDye800 en las secciones tumorales es baja en los primeros puntos temporales, es específica de los tejidos tumorales. Por estas razones, la implementación de la imagen PA basada en cetuximab-IRDye800 en los primeros puntos temporales, después de la infusión, puede ser ideal para aplicaciones de diagnóstico, como la imagen de los ganglios linfáticos centinelas para identificar metástasis ocultas.

RESULTADOS

Síntesis de cetuximab-IRDye800

La síntesis de cetuximab-IRDye800 se realizó mediante un protocolo previamente establecido (^[29]–^[31]) con ligeras modificaciones, como se describe en la Fig. 1A. Se utilizó el anticuerpo anti-EGFR aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), cetuximab, para la especificidad y la orientación (^[32]), y el protocolo de síntesis se optimizó para incorporar IRDye800 con diferentes DOL. El DOL para IRDye800 fue de 2,25 ± 0,09, 4,20 ± 0,13, 4,93 ± 0,19 y 7,20 ± 0,29, lo que se logró utilizando relaciones de colorante a anticuerpo de 4, 8, 10 y 15, respectivamente (Fig. 1D). Como se muestra en la Fig. 1B, el cetuximab-IRDye800 mostró picos de absorción correspondientes tanto al cetuximab como al IRDye800. La pureza de los conjugados de cetuximab-IRDye800 se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE; Fig. 1C), y, como se muestra, las moléculas de IRDye800 se unieron tanto a las cadenas pesadas como a las cadenas ligeras del anticuerpo con una cantidad mínima ( 0,9999). El análisis cuantitativo de la señal de PA de IRDye800 corregida por la línea de base confirmó estas observaciones, revelando una rápida acumulación tumoral con una señal significativamente mayor ya a los 5 minutos (línea de base frente a 5 minutos; P = 0,0501) (fig. S2E). La señal se mantuvo elevada en los niveles máximos hasta las 1 a 3 horas (línea de base frente a 3 horas; P = 0,0338), aproximadamente un 75 % por encima de la línea de base. Después del pico, la señal de IRDye800 disminuyó gradualmente a las 6 horas (línea de base frente a 6 horas; P = 0,3194) antes de volver a la línea de base entre las 12 y las 24 horas (línea de base frente a 24 horas; P > 0,9999). La cuantificación basada en fotogramas capturó una importante heterogeneidad espacial en la distribución de Cetuximab-IRDye800, evidenciada por las variaciones visibles en la intensidad de la señal en las regiones tumorales.

Una comparación de las señales de intensidad de PA para múltiples cromóforos reveló importantes relaciones espaciales. Los puntos calientes brillantes de IRDye800 en los primeros puntos temporales (5 minutos a 3 horas) se correlacionaron espacialmente con una mayor señal de HbT, lo que sugiere que un alto volumen sanguíneo facilita una administración eficiente de anticuerpos. Esto apoya la administración vascular como un determinante crítico de la acumulación de anticuerpos en las primeras horas posteriores a la inyección. Por el contrario, las regiones con una señal de IRDye800 persistentemente baja correspondieron a regiones con poca vascularización o necróticas, que aparecieron como vacíos de señal en las imágenes de HbT. Las señales de 705 y 780 nm mantuvieron una intensidad más consistente que IRDye800, con perfiles temporales graduales y una señal de PA que alcanzó su punto máximo a las 6 horas.

Para un análisis más sólido, promediamos todos los fotogramas por animal y realizamos pruebas de Friedman de medidas repetidas sobre las medias a nivel del animal. A 705 nm, la trayectoria temporal general en todos los puntos temporales fue significativa (χ2 = 13,20, P = 0,040, n = 6 animales), y la fase de disminución de las 6 a las 24 horas fue altamente significativa (χ2 = 12,56, P = 0,0014, n = 6 animales), con la disminución de las 6 a las 24 horas confirmada por la prueba de Wilcoxon pareada (P = 0,031) y la prueba t pareada (P = 0,003) (tabla S1). A 780 nm, se observaron las mismas tendencias temporales, pero no alcanzaron la significación estadística a nivel del animal debido al tamaño de muestra limitado (n = 5 a 9) (tabla S2). Las comparaciones por pares individuales (por ejemplo, línea de base frente a 6 horas) también tuvieron poca potencia a nivel del animal, lo que es una limitación reconocida de los estudios de imagen longitudinal en animales pequeños. Para validar aún más las variaciones temporales en la intensidad de la señal de fluorescencia y PA, realizamos un análisis de varianza (ANOVA) de modelo mixto de dos vías con modalidad (fluorescencia frente a señales de PA de IRDye800 no mezcladas) y tiempo. Nuestros resultados revelaron una variación estadísticamente significativa (P = 0,0228; tabla S3), lo que confirma que las señales de fluorescencia y PA exhiben variaciones temporales después de la administración de Cetuximab-IRDye800. Se ha informado previamente una tendencia similar de un pico temprano en la intensidad de la señal de PA con una sonda de imagen dual molecular diferente (trastuzumab conjugado con BHQ3 y AF488) (^[14]).

Para determinar si el patrón de señal de PA temporal observado es específico de la captación dirigida a EGFR o se produce con cualquier acumulación de conjugados anticuerpo-colorante en los tumores, realizamos experimentos de control utilizando inmunoglobulina G (IgG)-IRDye800 (un anticuerpo que no se dirige a EGFR conjugado con IRDye800) en el mismo modelo tumoral A431 (fig. S3A). La imagen de fluorescencia de los tumores tratados con IgG-IRDye800 mostró una acumulación progresiva con el tiempo (fig. S3, B y C), lo que demuestra que el conjugado no dirigido se acumula en los tumores, probablemente a través del efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR). La cuantificación reveló aumentos significativos en la fluorescencia tumoral en los últimos puntos temporales (línea de base frente a 12 horas: P = 0,0388; línea de base frente a 18 horas: P = 0,0317), lo que confirma la acumulación tumoral pasiva.

Realizamos una imagen de PA longitudinal en ratones portadores de tumores A431 que recibieron un anticuerpo isótipo conjugado con IRDye800 (IgG-IRDye800). Las imágenes de PA representativas a 705 nm mostraron una señal brillante sostenida a través de los primeros puntos temporales, alcanzando visualmente su punto máximo a los 5 minutos y 1 hora antes de volver a la línea de base a las 3 horas. El análisis cuantitativo reveló aumentos significativos a los 5 minutos (línea de base frente a 5 minutos; P = 0,0032) y 1 hora (línea de base frente a 1 hora; P = 0,0014), pero, lo que es importante, un cambio no significativo en el punto temporal de 3 y 6 horas (P = 0,9977 y P = 0,5949, respectivamente). Sin embargo, se observó una disminución significativa por debajo de la línea de base a las 24 horas (fig. S4, A y B). De manera similar, las imágenes de PA de 780 nm demostraron una alta intensidad de señal en los primeros puntos temporales, con un brillo sostenido desde los 5 minutos hasta 1 hora antes de volver a la línea de base a las 3 horas. Se observaron elevaciones significativas a los 5 minutos (línea de base frente a 5 minutos; P = 0,0306) y 1 hora (línea de base frente a 1 hora; P = 0,0005), con un retorno a la línea de base en los últimos puntos temporales (fig. S4, C y D). Las imágenes de HbT mostraron regiones focales brillantes a la 1 hora, lo que indica un aumento localizado del volumen sanguíneo, visualmente similar al grupo de Cetuximab-IRDye800. Esto sugiere que la administración de anticuerpos en sí misma, independientemente de la conjugación con el colorante, induce respuestas vasculares. El análisis cuantitativo de HbT reveló una respuesta temprana pronunciada: aumentos significativos a los 5 minutos (línea de base frente a 5 minutos; P = 0,0269) y 1 hora (P < 0,0001) antes de volver a la línea de base (fig. S4, E y F). El patrón de respuesta de sO2 difería sustancialmente del de los animales tratados con Cetuximab-IRDye800. Se produjo una disminución inicial significativa a los 5 minutos (P = 0,0382) desde la línea de base (fig. S4G), seguida de una recuperación y posteriores aumentos significativos a las 12 y 24 horas (P < 0,0001 para la línea de base frente a 12 y 24 horas). Esta respuesta bifásica, desoxigenación inicial seguida de hiperoxigenación retardada, no se observó en el grupo de Cetuximab-IRDye800.

Además, los animales a los que se administró IgG-IRDye800 mostraron predominantemente una señal de IRDye800 más baja en todos los puntos temporales, fluctuando alrededor de los niveles de la línea de base. No se observaron puntos calientes brillantes ni una elevación sostenida, lo que contrasta marcadamente con la señal marcada en los animales tratados con Cetuximab-IRDye800. Se observó una elevación transitoria sutil a los 5 minutos, pero regresó rápidamente a la línea de base entre 1 y 3 horas. El análisis cuantitativo confirmó una señal de PA de IRDye800 mínima durante las 24 horas (fig. S4, H e I). Una elevación significativa transitoria a los 5 minutos (P = 0,0111) regresó rápidamente a los niveles de la línea de base a la 1 hora y se mantuvo en la línea de base hasta las 24 horas (todo ns frente a la línea de base). Esto confirma la especificidad de la detección de IRDye800 y valida que las señales robustas en el grupo de Cetuximab-IRDye800 se debieron al anticuerpo conjugado con IRDye800 en lugar de la autofluorescencia o el fondo inespecífico.

Estos experimentos de control demuestran que (i) la acumulación tumoral pasiva a través del efecto EPR es insuficiente para producir una mejora sostenida de la señal de PA, (ii) el patrón de señal de PA temporal observado con Cetuximab-IRDye800 (pico entre 1 y 6 horas seguido de un retorno a la línea de base) es específico de EGFR y posiblemente requiere una captación mediada por receptores, y (iii) la endocitosis mediada por receptores determina potencialmente tanto el pico de la señal de PA (mediante el mantenimiento de la agregación H de IRDye800 durante la unión a la superficie celular y la captación temprana) como el aumento gradual de la señal de fluorescencia a través de la desactivación mediante la disrupción de la agregación durante la degradación lisosomal.

Sobre la base de la discrepancia temporal entre los máximos de la señal de fluorescencia y PA, hipotetizamos que la disminución de la señal de PA del punto temporal de 6 horas al de 24 horas puede deberse a variaciones en la localización microscópica del tumor en lugar de a la acumulación macroscópica del tumor del conjugado Cetuximab-IRDye800. Para evaluar la localización intratumoral de Cetuximab-IRDye800, utilizamos un conjugado Cetuximab-IRDye800 con una molécula de Alexa Fluor 647 (Cet-IRDye-AF) incorporada para permitir la imagen ex vivo del conjugado Cetuximab-IRDye800. La síntesis y caracterización de Cetuximab-IRDye-AF se muestra en la fig. S5. El DOL fue de 1,87 ± 0,17 y 0,87 ± 0,07 para IRDye800 y AF647, respectivamente, logrado utilizando relaciones de colorante a anticuerpo de 4 y 2, respectivamente (fig. S5D). Como se muestra en la fig. S5B, Cetuximab-IRDye-AF mostró picos de absorción correspondientes tanto a AF647 como a IRDye800. Hubo una superposición espectral entre los dos colorantes, donde IRDye800 contribuyó a la absorción de AF647, y se aplicó un factor de corrección de 0,11 para calcular las concentraciones de AF647. La interferencia de la absorción de AF647 con la de IRDye800 a 780 nm fue mínima. La pureza del conjugado Cetuximab-IRDye-AF se confirmó mediante SDS-PAGE (fig. S5C), y, como se muestra, ambos colorantes se unieron a las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo con un mínimo ( 0,9999). La cuantificación basada en fotogramas capturó una heterogeneidad espacial sustancial en la distribución de cetuximab-IRDye800, evidenciada por las variaciones visibles en la intensidad de la señal en las regiones del tumor.

Una comparación de las señales de intensidad de PA para múltiples cromóforos reveló importantes relaciones espaciales. Los puntos calientes de IRDye800 brillantes en los primeros puntos temporales (de 5 minutos a 3 horas) se correlacionaron espacialmente con una mayor señal de HbT, lo que sugiere que un alto volumen sanguíneo facilita una administración eficiente de anticuerpos. Esto apoya la administración vascular como un determinante crítico de la acumulación de anticuerpos en las primeras horas posteriores a la inyección. Por el contrario, las regiones con una señal de IRDye800 persistentemente baja correspondieron a regiones poco vascularizadas o necróticas, que aparecieron como vacíos de señal en las imágenes de HbT. Las señales de 705 y 780 nm mantuvieron una intensidad más consistente que IRDye800, con perfiles temporales graduales y una señal de PA que alcanzó su punto máximo a las 6 horas.

Para un análisis más sólido, promediamos todos los fotogramas por animal y realizamos pruebas de medidas repetidas de Friedman sobre las medias a nivel del animal. A 705 nm, la trayectoria temporal general en todos los puntos temporales fue significativa (χ2 = 13,20, P = 0,040, n = 6 animales), y la fase de disminución de las 6 a las 24 horas fue muy significativa (χ2 = 12,56, P = 0,0014, n = 6 animales), con la disminución de las 6 a las 24 horas confirmada por la prueba de Wilcoxon pareada (P = 0,031) y la prueba t pareada (P = 0,003) (Tabla S1). A 780 nm, se observaron las mismas tendencias temporales, pero no alcanzaron la significación estadística a nivel del animal debido al tamaño de muestra limitado (n = 5 a 9) (Tabla S2). Las comparaciones por pares individuales (por ejemplo, antes frente a las 6 horas) también tuvieron un poder estadístico insuficiente a nivel del animal, lo que es una limitación conocida de los estudios de imagen longitudinal en animales pequeños. Para validar aún más las variaciones temporales en la intensidad de la señal de fluorescencia y PA, realizamos un análisis de varianza (ANOVA) de modelo mixto de dos vías con la modalidad (fluorescencia frente a señales de PA separadas espectralmente de IRDye800) y el tiempo. Nuestros resultados revelaron una variación estadísticamente significativa (P = 0,0228; Tabla S3), lo que confirma que las señales de fluorescencia y PA exhiben variaciones temporales después de la administración de cetuximab-IRDye800. Se ha informado previamente una tendencia similar de un pico temprano en la intensidad de la señal de PA con una sonda de imagen dual molecular diferente (trastuzumab conjugado con BHQ3 y AF488) (^[14]).

El direccionamiento a EGFR es necesario para una mejora sostenida de la señal de PA

Para determinar si el patrón de señal de PA temporal observado es específico de la captación dirigida a EGFR o se produce con cualquier acumulación de conjugados anticuerpo-colorante en los tumores, realizamos experimentos de control utilizando inmunoglobulina G (IgG)-IRDye800 (un anticuerpo que no se dirige a EGFR conjugado con IRDye800) en el mismo modelo tumoral de A431 (Fig. S3A). La imagen de fluorescencia de los tumores tratados con IgG-IRDye800 mostró una acumulación progresiva a lo largo del tiempo (Fig. S3, B y C), lo que demuestra que el conjugado no dirigido también se acumula en los tumores, probablemente a través del efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR). La cuantificación reveló aumentos significativos en la fluorescencia tumoral en los puntos temporales posteriores (antes frente a las 12 horas: P = 0,0388; antes frente a las 18 horas: P = 0,0317), lo que confirmó la acumulación tumoral pasiva.

Realizamos estudios de imagen por fotoacústica (PA) longitudinales en ratones A431 portadores de tumores, a los que se les administró un anticuerpo isotípico conjugado con IRDye800 (IgG-IRDye800). Las imágenes de PA representativas a 705 nm mostraron una señal brillante sostenida durante los primeros momentos, alcanzando su punto máximo visualmente a los 5 minutos y a la hora, para luego volver a la línea de base a las 3 horas. El análisis cuantitativo reveló aumentos significativos a los 5 minutos (preinyección frente a los 5 minutos; P = 0,0032) y a la hora (preinyección frente a la hora; P = 0,0014), pero, lo que es importante, un cambio no significativo a las 3 y 6 horas (P = 0,9977 y P = 0,5949, respectivamente). Sin embargo, se observó una disminución significativa por debajo de la línea de base a las 24 horas (fig. S4, A y B). De manera similar, las imágenes de PA a 780 nm demostraron una alta intensidad de señal en los primeros momentos, con una brillantez sostenida desde los 5 minutos hasta la hora, para luego volver a la línea de base a las 3 horas. Se observaron aumentos significativos a los 5 minutos (preinyección frente a los 5 minutos; P = 0,0306) y a la hora (preinyección frente a la hora; P = 0,0005), con un retorno hacia la línea de base en los momentos posteriores (fig. S4, C y D). Las imágenes de HbT mostraron regiones focales brillantes a la hora, lo que indica un aumento localizado del volumen sanguíneo, visualmente similar al grupo Cetuximab-IRDye800. Esto sugiere que la administración del anticuerpo en sí, independientemente de la conjugación del tinte, induce respuestas vasculares. El análisis cuantitativo de HbT reveló una respuesta temprana pronunciada: aumentos significativos a los 5 minutos (preinyección frente a los 5 minutos; P = 0,0269) y a la hora (P < 0,0001) antes de volver a la línea de base (fig. S4, E y F). El patrón de respuesta de sO2 difería sustancialmente de los animales tratados con Cetuximab-IRDye800. Se produjo una disminución significativa inicial a los 5 minutos (P = 0,0382) desde la línea de base (fig. S4G), seguida de una recuperación y posteriores aumentos significativos a las 12 y 24 horas (P < 0,0001 para la comparación entre la preinyección y las 12 y 24 horas). Esta respuesta bifásica (desoxigenación inicial seguida de hiperoxigenación retardada) no se observó en el grupo Cetuximab-IRDye800.

Además, los animales a los que se les administró IgG-IRDye800 mostraron predominantemente una señal de IRDye800 más baja en todos los momentos, fluctuando alrededor de los niveles de la línea de base. No se apreciaron puntos calientes brillantes ni una elevación sostenida, lo que contrasta marcadamente con la marcada señal en los animales tratados con Cetuximab-IRDye800. Se observó una elevación sutil y transitoria a los 5 minutos, pero rápidamente volvió a la línea de base entre 1 y 3 horas. El análisis cuantitativo confirmó una señal de PA de IRDye800 mínima durante las 24 horas (fig. S4, H e I). Una elevación significativa transitoria a los 5 minutos (P = 0,0111) volvió rápidamente a los niveles de la preinyección a la hora y se mantuvo en la línea de base hasta las 24 horas (todo ns frente a la preinyección). Esto confirma la especificidad de la detección de IRDye800 y valida que las señales robustas en el grupo Cetuximab-IRDye800 se debieron al anticuerpo conjugado con IRDye800 en lugar de la autofluorescencia o el fondo inespecífico.

Estos experimentos de control demuestran que (i) la acumulación tumoral pasiva a través del efecto EPR es insuficiente para producir una mejora sostenida de la señal de PA, (ii) el patrón temporal de la señal de PA observado con Cetuximab-IRDye800 (pico entre 1 y 6 horas seguido de un retorno a la línea de base) es específico de EGFR y posiblemente requiere una captación mediada por receptores, y (iii) la endocitosis mediada por receptores determina potencialmente tanto el pico de la señal de PA (mediante el mantenimiento de la agregación H de IRDye800 durante la unión a la superficie celular y la captación temprana) como el aumento gradual de la señal de fluorescencia a través de la desactivación mediante la disrupción de los agregados durante la degradación lisosomal.

Variaciones en la distribución intratumoral de Cetuximab-IRDye800 con el tiempo

Basándonos en la discrepancia temporal entre los máximos de la señal de fluorescencia y la señal de PA, hipotetizamos que la disminución de la señal de PA desde la 6.ª hora hasta la 24.ª hora puede deberse a variaciones en la localización microscópica del tumor en lugar de a la acumulación macroscópica del tumor del conjugado Cetuximab-IRDye800. Para evaluar la localización intratumoral de Cetuximab-IRDye800, utilizamos un conjugado Cetuximab-IRDye800 con una molécula de Alexa Fluor 647 (Cet-IRDye-AF) incorporada para permitir la imagen ex vivo del conjugado Cetuximab-IRDye800. La síntesis y caracterización de Cetuximab-IRDye-AF se muestra en la fig. S5. La DOL fue de 1,87 ± 0,17 y 0,87 ± 0,07 para IRDye800 y AF647, respectivamente, lo que se logró utilizando relaciones de tinte a anticuerpo de 4 y 2, respectivamente (fig. S5D). Como se muestra en la fig. S5B, Cetuximab-IRDye-AF mostró picos de absorción correspondientes tanto a AF647 como a IRDye800. Hubo una superposición espectral entre los dos tintes, donde IRDye800 contribuyó a la absorción de AF647, y se aplicó un factor de corrección de 0,11 para calcular las concentraciones de AF647. La interferencia de la absorción de AF647 con la de IRDye800 a 780 nm fue mínima. La pureza del conjugado Cetuximab-IRDye-AF se confirmó mediante SDS-PAGE (fig. S5C), y, como se muestra, ambos tintes se unieron a las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo con una cantidad mínima (