Un patógeno anaeróbico altera el metabolismo del huésped para impulsar el crecimiento oxidativo en el intestino inflamado.

Las infecciones entéricas son una de las principales causas de enfermedades diarreicas agudas y, recientemente, se ha demostrado que están implicadas en el desarrollo de afecciones crónicas, como la colitis y el cáncer colorrectal (CCR).^[1],^[2] Esta última asociación es particularmente importante, dado que el CCR se desarrolla en la interfaz hospedador-microbio más grande del cuerpo humano^[3] y es predominantemente esporádico, con la mayoría de los casos que carecen de mutaciones germinales bien definidas en el hospedador.^[4],^[5] En consecuencia, los factores ambientales, en particular la exposición a patógenos entéricos, se reconocen cada vez más como contribuyentes clave a la patogénesis del CCR.^[2],^[6]–^[9] A pesar de estas asociaciones, los mecanismos por los cuales los patógenos entéricos colonizan el intestino e influyen en la progresión de la enfermedad siguen siendo poco conocidos.

Bacteroides fragilis enterotoxigénico (ETBF), una subespecie productora de toxinas del común comensal intestinal B. fragilis, se ha implicado tanto en enfermedades diarreicas inflamatorias como en el CCR en estudios humanos independientes.^[10]–^[23] El ETBF también promueve la colitis inflamatoria crónica^[24] y la tumorigénesis colónica en modelos murinos gnotobióticos^[25] o convencionales^[15],^[26]–^[29]. Estos efectos patógenos están impulsados principalmente por el factor de virulencia toxina de Bacteroides fragilis (BFT), que provoca una serie de alteraciones fisiológicas en las células del hospedador.^[26],^[30]–^[35] Sin embargo, los mecanismos específicos por los cuales la BFT facilita el establecimiento del nicho del ETBF y promueve la colonización persistente en el intestino siguen estando en gran medida sin definir.

El metabolismo de los colonocitos es fundamental para las interacciones hospedador-microbio, ya que da forma a la composición y las funciones del microbioma intestinal.^[36] En el intestino sano, los colonocitos generan energía a través de la β-oxidación de ácidos grasos de cadena corta derivados del microbioma, como el butirato.^[37],^[38] Este proceso consume oxígeno de la superficie mucosa subyacente, manteniendo eficazmente un ambiente anaeróbico en el lumen colónico.^[39] Como resultado, las bacterias anaeróbicas obligadas, que dependen de la fermentación anaeróbica para generar energía, dominan el microbioma intestinal.^[40] Para colonizar con éxito el intestino densamente poblado, los patógenos deben emplear factores de virulencia para manipular las respuestas del hospedador, creando nuevos nichos nutricionales.^[41] Por ejemplo, los anaerobios facultativos como Salmonella enterica serovar Typhimurium y Citrobacter rodentium subvierten el metabolismo de los colonocitos para aumentar la disponibilidad de oxígeno luminal.^[42]–^[44] Esta estrategia les permite participar en el metabolismo respiratorio,^[42]–^[44] superando así a las bacterias anaeróbicas residentes que dependen de la fermentación anaeróbica, energéticamente menos eficiente, para crecer.^[36]

En contraste con estos patógenos anaerobios facultativos, los miembros del filo Bacteroidetes, incluido el ETBF (B. fragilis), se consideran clásicamente anaerobios que exhiben un crecimiento o viabilidad limitados tras la exposición al oxígeno.^[45],^[46] Como tal, se cree que residen en nichos anóxicos, como el colon de los mamíferos, y obtienen energía principalmente a través de la fermentación anaeróbica de glicanos dietéticos o derivados del hospedador.^[47],^[48] La creencia actual es que estos anaerobios, incluido el ETBF, carecen de α-cetoglutarato deshidrogenasa (SucAB), succinil-coenzima A (CoA) sintetasa (SucCD) y succinato deshidrogenasa (Sdh). Esto da como resultado una bifurcación del ciclo del ácido cítrico (CAC),^[49] una oxidación incompleta del acetil-CoA y, en consecuencia, una producción de energía menos eficiente que la de un CAC completamente oxidativo.

Cómo el ETBF, un patógeno clásicamente anaeróbico, persiste con éxito en el intestino inflamado y enriquecido con oxígeno que induce,^[50] ha seguido sin estar claro. Aquí, demostramos que el ETBF aprovecha su factor de virulencia, la BFT, para reprogramar el metabolismo de las células epiteliales, remodelando así el panorama nutricional del intestino. Esta reprogramación conduce a un aumento de los niveles de lactato y oxígeno, que impulsan el metabolismo oxidativo único del ETBF. Inesperadamente, la BFT también facilita la adaptación del ETBF a un nicho oxidativo independientemente de las células del hospedador. Estos hallazgos refinan la visión prevaleciente de la fisiología de B. fragilis y descubren un mecanismo por el cual un patógeno clásicamente anaeróbico remodela su entorno para establecer un nicho metabólico oxidativo que promueve su expansión en el intestino inflamado.

RESULTADOS

El ETBF opera un metabolismo oxidativo que respalda la respiración con oxígeno

Dado que la mayoría de los nichos nutricionales en el intestino ya están ocupados por el microbioma residente, los patógenos entéricos a menudo emplean estrategias de virulencia para provocar respuestas del hospedador, facilitando el establecimiento de nuevos nichos que permiten su colonización.^[42]–^[44],^[51]–^[55] Para explorar si la BFT, un factor de virulencia reconocido que se ha demostrado que induce una serie de cambios inflamatorios, remodela el panorama nutricional intestinal para facilitar la colonización del ETBF, colonizamos grupos de ratones C57BL/6 con la cepa de tipo salvaje de ETBF y una mutante isogénica deficiente en toxinas Δbft y evaluamos su aptitud y el estado inflamatorio del hospedador. De hecho, la pérdida de bft atenuó notablemente la inflamación y redujo la carga de patógenos en comparación con el homólogo de tipo salvaje (Figuras 1A–1C).

A continuación, buscamos determinar cómo el ETBF se adapta a los nichos inflamatorios esculpidos por la BFT. Dado que las bacterias adaptan sus programas transcripcionales a los nutrientes disponibles, el transcriptoma bacteriano puede servir como un indicador del estado funcional del metabolismo del ETBF in vivo.^[56],^[57] Sin embargo, el ARNm de los patógenos está superado en gran medida por los transcritos del hospedador^[58] y los de las diversas bacterias comensales.^[59],^[60] Para superar esto, empleamos la secuenciación de ARN con selección híbrida (hsRNA-seq),^[61] utilizando sondas de captura colocadas en todos los marcos de lectura abiertos predichos del ETBF. Este enfoque permite la captura selectiva de los transcritos del ETBF a partir del ARN total aislado de los tejidos del hospedador y la comunidad microbiana intestinal sin introducir un sesgo de enriquecimiento sustancial (Figuras 1D y S1A). El análisis transcriptómico mediante secuenciación de ARN sin captura dirigida reveló que los tejidos del hospedador montan respuestas robustas a la BFT, lo que probablemente remodela el panorama nutricional intestinal (Figuras S1B y S1C). A su vez, el ETBF adapta su transcriptoma al panorama nutricional alterado por la BFT, con 35 vías significativamente enriquecidas entre los genes expresados diferencialmente en el lumen (Figura S1D). En particular, estas vías incluyen "ribosoma", "expresión génica" y "traducción", todos los cuales son procesos que consumen mucha energía, lo que sugiere que las respuestas del hospedador inducidas por la BFT crean un nicho nutricional que mejora la aptitud del ETBF en el intestino inflamado.

Sorprendentemente, el análisis transcriptómico reveló que el ETBF codifica y transcribe activamente enzimas clave necesarias para un CAC completo, incluido Sdh, SucAB y SucCD, en el intestino inflamado (Figura 1E). El ETBF también expresa acetato:succinato CoA-transferasa (Asct),^[62] que cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato, similar a SucCD, pero con la producción adicional de acetil-CoA (Figura 1F), lo que respalda aún más la capacidad del ETBF para el metabolismo central oxidativo. Dado que estos genes son prescindibles para el crecimiento fermentativo y generalmente se suprimen en condiciones anaeróbicas,^[63],^[64] su expresión robusta in vivo puede reflejar una adaptación a una mayor disponibilidad de oxígeno durante la inflamación (Figuras 1E y 1F), refinando la visión prevaleciente de B. fragilis como un organismo clásicamente anaeróbico. En apoyo de esto, con las notables excepciones de sdh y asct, los niveles de transcripción de los genes del metabolismo oxidativo fueron generalmente más altos en las bacterias asociadas con el tejido intestinal, en comparación con los de las fracciones de moco o lumen (Figura 1E), lo que probablemente refleja el gradiente de oxígeno de tejido a lumen. La integración del transcriptoma in vivo en el modelado metabólico a escala genómica predijo un flujo sustancial a través de tres lactato deshidrogenasas (Ldh1, Ldh2 [RS13195] y LutABC), junto con los componentes de la respiración con oxígeno (CydAB) y el CAC oxidativo (SucAB, SucCD y Asct) (Figura 1F). En contraste, el flujo a través de estos genes es mínimo en condiciones anaeróbicas (Figura 1F). Es interesante destacar que sucAB (subunidad E1), sucCD y ldh2 muestran una distribución en mosaico dentro del género Bacteroides, con una mayor prevalencia en aquellos miembros con una tolerancia al oxígeno relativamente mayor, lo que sugiere que estos genes pueden participar en la adaptación a nichos oxidativos^[65] (Figura S1E). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el ETBF opera un programa metabólico que diverge de las vías de fermentación anaeróbica que normalmente se asocian con otros Bacteroides.^[66]

El oxígeno y el lactato impulsan un metabolismo oxidativo en el ETBF

La respiración celular implica la oxidación de un donante de electrones (por ejemplo, lactato) y la transferencia de los electrones resultantes a través de una cadena de transporte de electrones a un aceptor de electrones, como el oxígeno.^[67] Al permitir una oxidación más completa de las fuentes de carbono y una conservación de energía más eficiente, la respiración genera ATP de manera más eficiente, lo que confiere una ventaja metabólica sobre la fermentación anaeróbica.^[68] El oxígeno es el aceptor de electrones más favorable, dado el alto rendimiento de energía libre; sin embargo, la mayoría de los anaerobios exhiben un crecimiento o viabilidad limitados tras la exposición al oxígeno o a las especies reactivas del oxígeno (ROS), lo que impide su uso para la respiración.^[45],^[69] En particular, el trabajo reciente reveló que un subconjunto de anaerobios (nanaerobios), incluido B. fragilis, exhibe una mayor tolerancia al oxígeno^[70] y puede utilizar concentraciones nanomolares de oxígeno como aceptor de electrones para obtener beneficios adicionales para la aptitud.^[65],^[71],^[72] Sin embargo, los mecanismos que permiten la respiración con oxígeno en los nanaerobios y su relevancia fisiológica dentro del hospedador mamífero siguen siendo en gran medida desconocidos.

En los anaerobios facultativos, los niveles de expresión de las enzimas del CAC responden principalmente a la presencia de oxígeno y fuentes de carbono, como el lactato.^[63],^[73],^[74] Los abundantes transcritos de los genes involucrados en la utilización del lactato sugieren que el lactato puede ser una fuente de carbono candidata para el ETBF en el intestino inflamado (Figura 1E). Por lo tanto, preguntamos si el oxígeno y el lactato impulsan un CAC completo en el ETBF. La exposición in vitro al oxígeno y al lactato aumentó la expresión de los genes involucrados en la oxidación del lactato y el metabolismo central oxidativo (Figura 1G). Como un excelente aceptor de electrones, el oxígeno permite la utilización de fuentes de carbono que de otro modo serían poco fermentables, como el lactato,^[75] facilitando así la producción de ATP.^[76] De manera consistente con esto, el oxígeno y el lactato aumentaron sinérgicamente tanto la producción de ATP como la aptitud bacteriana del ETBF in vitro (Figuras 1H e 1I).

Para probar aún más esta hipótesis, inoculamos ETBF a baja densidad (2,5 × 104 unidades formadoras de colonias [UFC]) en una atmósfera microanaeróbica abierta con 1-10 μM de O2 (que corresponde a ~0,1-1%) para minimizar el impacto del barrido colectivo^[77] de oxígeno que puede ocurrir a altas cargas bacterianas y la consiguiente disminución de la tensión de oxígeno debido al consumo microbiano en recipientes sellados.^[65] Sorprendentemente, el lactato apoyó el crecimiento del ETBF en presencia de hasta 10 μM de oxígeno, una concentración un orden de magnitud mayor que las concentraciones nanomolares reportadas previamente para los nanaerobios,^[65],^[71],^[72] en un medio rico y semi-definido donde están disponibles otras fuentes de carbono (Figuras 1J y S1F). A 5 μM de O2, el ETBF entró en la fase exponencial antes que en condiciones anaeróbicas, lo que es consistente con una mayor eficiencia metabólica (Figura S1F). En contraste, una cepa no toxigénica de B. fragilis (NTBF) (ATCC 25285) no se benefició de estos nutrientes, incluso a 3 μM de O2 (Figura 1J). En particular, las enzimas clave que respaldan el metabolismo oxidativo en el ETBF están en gran medida conservadas en la cepa no toxigénica (Figura S1E), lo que sugiere que las diferencias en la regulación transcripcional o la función enzimática pueden subyacer a las distintas adaptaciones metabólicas a los entornos oxigenados entre las dos cepas.

La BFT licencia el metabolismo oxidativo y la adaptación del nicho

Dado que ETBF se distingue genéticamente de NTBF, principalmente por la presencia de la isla de patogenicidad de Bacteroides fragilis que codifica BFT,^[78],^[79], los defectos de aptitud del mutante ETBF Δbft en el intestino inflamado sugirieron que el propio BFT podría facilitar la adaptación a este nicho metabólico alterado. Para probar directamente esta hipótesis, comparamos el crecimiento microanaeróbico de la cepa ETBF Δbft con el de un derivado complementado en el que se reintrodujo una sola copia de bft bajo su promotor nativo en un sitio cromosómico neutro. Sorprendentemente, la expresión de bft por sí sola fue suficiente para restaurar el crecimiento microanaeróbico (Figura S2A). Además, la expresión heteróloga de bft permitió que múltiples cepas NTBF, incluidas ATCC 25285, TM4000 y un aislado clínico independiente BF-25-0092798, crecieran en presencia de 0,1% de O2 (Figuras S2B–S2D). La expresión inducible de bft a partir de un promotor sintético^[80] reprodujo la expresión nativa de bft, lo que indica que el propio BFT, en lugar de los elementos reguladores circundantes,^[81], es suficiente para conferir este fenotipo (Figura S2E). Cabe destacar que la expresión de las isoformas 2 y 3 de BFT, pero no de la isoforma 1,^[82]–^[85], permitió el crecimiento hipóxico de las cepas NTBF, lo que reveló diferencias específicas de las isoformas en la capacidad de mantener la aptitud hipóxica (Figura S2B). En consonancia con informes anteriores,^[86], la capacidad de crecimiento hipóxico varió entre los aislados de B. fragilis y no se segregó claramente según el estado toxigénico (Figuras S2F–S2I), lo que subraya la importancia de las comparaciones isogénicas para aislar la contribución de BFT.

A continuación, investigamos si BFT promueve la adaptación al entorno del intestino inflamado in vivo. En los ensayos de colonización única, una cepa NTBF isogénica que expresaba bft indujo la expresión de genes inflamatorios y exhibió una marcada ventaja de aptitud en relación con su cepa parental (Figuras S3A–S3C), lo que demuestra que la expresión de BFT por sí sola es suficiente para promover la colonización en el intestino inflamado. Para probar si esta ventaja refleja un beneficio intrínseco de la cepa en lugar de un acceso compartido a un entorno del huésped remodelado, realizamos experimentos de colonización competitiva utilizando cepas NTBF y NTBF::bft isogénicas. En estas condiciones, NTBF::bft indujo una inflamación moderada y superó significativamente a la cepa NTBF de tipo salvaje (Figuras S3D–S3F), lo que indica que la expresión de BFT confiere una ventaja competitiva incluso cuando ambas cepas experimentan entornos de huésped y nutrientes idénticos.

A continuación, investigamos si esta ventaja se amplifica en el contexto de la inflamación inducida por ETBF. En los experimentos de co-colonización, la cepa ETBF de tipo salvaje superó en gran medida a NTBF y provocó una inflamación robusta, mientras que el mutante ETBF Δbft isogénico exhibió una ventaja competitiva mínima (Figuras S3G–S3I), lo que demuestra que BFT es necesario para la ventaja preferencial de ETBF en este entorno. Finalmente, para probar si BFT puede funcionar in trans, aislamos vesículas de membrana externa (OMV)^[87] de la cepa ETBF de tipo salvaje o del mutante isogénico Δbft y las administramos a ratones colonizados con NTBF o ETBF Δbft. Las OMV BFT+, pero no las OMV BFT−, indujeron inflamación intestinal, perjudicaron la aptitud de NTBF y mejoraron la colonización por ETBF Δbft (Figuras S3J–S3L). En conjunto, estos datos demuestran que BFT autoriza un programa metabólico oxidativo que permite a B. fragilis adaptarse y explotar el entorno del intestino inflamado. A través del remodelado del huésped dependiente de BFT y la mayor tolerancia a las condiciones oxidativas, ETBF, a pesar de que clásicamente se considera un anaerobio, puede acoplar la oxidación del lactato a la respiración del oxígeno y obtener una ventaja selectiva en el intestino inflamado.### La respiración oxidativa del lactato es necesaria para la colonización de ETBF en el intestino inflamado

Después de establecer que ETBF participa en un metabolismo oxidativo en condiciones microanaeróbicas, a continuación, probamos si la oxidación del lactato y la respiración del oxígeno son necesarias para la aptitud de ETBF.^[75],^[88],^[89]. De hecho, la eliminación de los genes necesarios para la respiración del oxígeno (ΔcydAB),^[45], la utilización del lactato (Δldh1 o ΔlutABC Δldh2; tenga en cuenta que los repetidos intentos de generar el mutante triple no tuvieron éxito) o el metabolismo central oxidativo (ΔsucCD Δasct) en ETBF perjudicaron significativamente su capacidad para beneficiarse de la oxidación del lactato en condiciones microaeróbicas (Figuras 1I y 1K), pero tuvieron poco o ningún efecto sobre la aptitud bacteriana cuando ETBF se cultivó de forma anaeróbica (Figura S4A).

Dado que BFT promueve la colonización de ETBF (Figuras 1A–1C y S2), a continuación, preguntamos cómo ETBF explota los cambios mediados por BFT para la colonización del intestino. Dado que ETBF acopla la oxidación del lactato a la respiración del oxígeno in vitro y transcribe activamente los genes implicados en el metabolismo oxidativo en el intestino inflamado (Figura 1), hipotetizamos que ETBF se basa en el metabolismo oxidativo para explotar el entorno creado por BFT para una colonización eficiente del intestino. En consonancia con esta idea, la ablación de la oxidasa terminal^[45] (ΔcydAB) en la vía de la respiración del oxígeno atenuó significativamente la colonización de ETBF y redujo parcialmente la inflamación intestinal asociada a la infección (Figuras 2A–2D). El análisis de la red de coexpresión de genes ponderada (WGCNA) del transcriptoma del tejido intestinal reveló que el mutante ΔcydAB exhibió una reducción de los cambios asociados a la infección en los procesos del huésped, como la transición epitelio-mesenquimal, lo que refuerza la idea de que ETBF altera los procesos del huésped para remodelar el entorno nutricional del intestino (Figuras S4B y S4C).

Participar en un metabolismo central oxidativo podría permitir que ETBF acople la oxidación del lactato con la respiración del oxígeno a través de una cadena de transporte de electrones,^[75],^[90], lo que facilitaría su colonización del intestino. Para probar esta hipótesis, evaluamos la aptitud in vivo de los mutantes que carecen de deshidrogenasas del lactato (Ldh1; LutABC y Ldh2) y componentes clave del TCA oxidativo (SucCD y Asct; SucAB). En concordancia con nuestras observaciones in vitro (Figura 1K), estos genes fueron críticos para la aptitud y la patogenicidad de ETBF in vivo (Figuras 2E–2J). En particular, el mutante Δldh1 exhibió un defecto aún más pronunciado en la colonización de la capa de moco intestinal, lo que sugiere que la utilización del lactato en este nicho oxigenado es una estrategia adaptativa del patógeno (Figura S4D). Por el contrario, la eliminación de sucAB no produjo un costo de aptitud notable, lo que indica una posible redundancia funcional proporcionada por una enzima no caracterizada alternativa (Figura S4E).

Cabe destacar que la reducción de la colonización observada en los mutantes ΔsucCD Δasct y Δldh1 se acompañó de una atenuación de la inflamación intestinal (Figuras 2G, 2J y S4F), mientras que la eliminación de las otras dos deshidrogenasas del lactato (ΔlutABC Δldh2) o sucAB por sí sola no tuvo ningún impacto en la respuesta inflamatoria en comparación con la cepa de tipo salvaje (Figuras S4G y S4H). Todos los mutantes se generaron como deleciones no polares, y la reintroducción de una sola copia del gen eliminado bajo su promotor nativo en un locus cromosómico neutro restauró parcial o totalmente la aptitud tanto in vitro como in vivo (Figuras S5A–S5H y S6A–S6F). En los casos de rescate parcial, la restauración incompleta de la abundancia del transcrito probablemente refleja las diferencias en el contexto regulador entre los loci nativos y complementados^[91]–^[98] (Figuras S5I–S5K). Es importante destacar que es poco probable que los defectos de aptitud observados se deban a una disminución de la producción de toxinas, ya que los mutantes metabólicos expresaron bft a niveles más altos que la cepa de tipo salvaje al principio de la colonización de ETBF (Figuras S6G–S6I). Por el contrario, la eliminación de los genes correspondientes en un entorno NTBF no perjudicó la colonización in vivo (Figuras S6J y S6K), lo que indica que estas vías son selectivamente necesarias en el nicho inflamatorio impulsado por BFT. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la respiración del oxígeno, el metabolismo oxidativo y la oxidación selectiva del lactato son los principales impulsores metabólicos de la aptitud de ETBF en el intestino inflamado, lo que revela una capacidad previamente no apreciada de este anaerobio para explotar los nichos inflamatorios oxigenados.### BFT remodela el metabolismo de los colonocitos, aumentando los niveles de oxígeno y lactato en el intestino

Estudios anteriores han demostrado que BFT induce una serie de cambios epiteliales del huésped que pueden converger para remodelar el entorno nutricional intestinal. Estos incluyen la inducción de la escisión de la proteína de unión de la zona adherens E-caderina^[99] y la hiperplasia mediante la desregulación de la señalización Wnt/β-catenina/c-Myc.^[24],^[100]. La hiperplasia de las criptas, a su vez, expande la población de colonocitos inmaduros, que participan preferentemente en la glucólisis anaeróbica en lugar de la fosforilación oxidativa típica de los colonocitos diferenciados.^[101],^[102]. Más allá de los efectos directos sobre las células epiteliales, BFT también desencadena la activación patológica de las células T colaboradoras 17 (TH-17),^[26],^[30], lo que podría exacerbar aún más el cambio a la glucólisis a través de la citocina efectora interleucina 17 (IL-17).^[103],^[104]. En conjunto, estos efectos impulsan un cambio del metabolismo oxidativo a la glucólisis en los colonocitos,^[36],^[43],^[102],^[105]–^[109], aumentando así la exportación de lactato y permitiendo que el oxígeno se difunda desde la lámina propia hacia el lumen.^[89],^[110]. En consonancia con esta hipótesis, el análisis de RNA-seq del tejido colónico de ratones infectados con ETBF reveló la represión dependiente de BFT de los genes implicados en la β-oxidación y los complejos I–IV de la cadena de transporte de electrones (Figura 3A).

Para evaluar más a fondo el estado metabólico de los colonocitos durante la infección por ETBF, empleamos el ensayo de metabolismo energético de células únicas mediante la inhibición de la traducción (SCENITH) para perfilar las respuestas metabólicas en varios tipos de células ex vivo mediante citometría de flujo.^[111]. SCENITH aprovecha la incorporación de puromicina en las proteínas nacientes para medir los niveles de síntesis de proteínas, que sirven como un indicador fiable de la actividad metabólica global.^[112]. Al utilizar inhibidores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis, pudimos evaluar las contribuciones relativas de estas vías (Figura 3B). En concordancia con informes anteriores^[101],^[102],^[110] y nuestro análisis transcriptómico (Figura 3A), los colonocitos operan principalmente un metabolismo oxidativo en la homeostasis (Figura 3C). Sin embargo, tras la infección por ETBF, los colonocitos experimentaron un notable cambio metabólico hacia la glucólisis (Figura 3C).

Un cambio del metabolismo oxidativo al metabolismo glucolítico en los colonocitos reduce el consumo de oxígeno de los vasos sanguíneos subyacentes, lo que permite que el oxígeno se difunda hacia el lumen intestinal.^[110],^[113]. Al mismo tiempo, el lactato se secreta como producto metabólico final.^[114],^[115]. Los niveles elevados de oxígeno luminal también pueden perjudicar a las enzimas sensibles al oxígeno en los comensales anaerobios obligados, interrumpiendo las vías metabólicas clave, incluido el metabolismo central del carbono.^[116]. Este estrés oxidativo puede obligar a los comensales a redirigir el piruvato hacia la producción de lactato,^[117], lo que contribuye aún más a la acumulación de lactato en el intestino. De hecho, la medición de la oxigenación intestinal mediante pimonidazol, un compuesto que forma aductos irreversibles con proteínas o ADN en los tejidos hipóxicos,^[118], reveló que la infección por ETBF condujo a un aumento de la tensión de oxígeno (Figura 3D). Además, la cuantificación del lactato reveló un aumento paralelo del lactato luminal de forma dependiente de BFT, lo que sugiere que el cambio a la glucólisis anaeróbica en los colonocitos crea un nicho oxidativo rico en lactato (Figura 3E).

Si un aumento del oxígeno y el lactato favorece el crecimiento de ETBF, restaurar el metabolismo oxidativo epitelial debería contrarrestar la infección. Para probar esto, administramos terapéuticamente tributirina, un precursor de ácidos grasos de cadena corta que promueve el metabolismo oxidativo en los colonocitos,^[110], 2 días después de la inoculación de ETBF. El análisis de agrupamiento a nivel de características (Figura S7A), WGCNA (Figura S7B) y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (Figura S7C) revelaron que la tributirina suprimió la expresión de genes glicolíticos. En consonancia con estos cambios transcripcionales, la tributirina revirtió parcialmente la reprogramación metabólica inducida por ETBF de los colonocitos hacia la glucólisis (Figura 3F) y redujo significativamente la colonización por ETBF (Figura 3G). Además, el tratamiento con tributirina mejoró la pérdida de peso inducida por ETBF, atenuó la inflamación intestinal y mitigó los cambios histopatológicos asociados (Figuras 3H–3L). Cabe destacar que la tributirina no exhibió actividad antibacteriana directa contra ETBF (Figura S7D) ni alteró significativamente la composición de la microbiota (Figuras S7E–S7I), lo que indica que su efecto protector se deriva de la modulación del metabolismo del huésped en lugar de la interferencia microbiana. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que ETBF explota el aumento del oxígeno luminal para establecer y mantener la colonización durante la inflamación intestinal.

A continuación, examinamos si el funcionamiento de un metabolismo oxidativo facilita la tumorigénesis inducida por ETBF. Para este propósito, utilizamos el modelo de ratón con múltiples neoplasias intestinales (Min) (heterocigoto para el gen de la poliposis adenomatosa coli [Apc]). Aunque los ratones ApcMin se consideran un modelo de tumorigénesis del intestino delgado, estudios independientes han demostrado que la colonización por ETBF convierte a los ratones ApcMin en un modelo de tumor de colon.^[26],^[119]–^[121] En particular, los ratones ApcMin infectados con ETBF desarrollan tumores cólicos en cuestión de semanas, mucho antes de que los adenomas del intestino delgado sean clínicamente evidentes o detectables.^[122] Para interrumpir el metabolismo respiratorio de ETBF, genéticamente ablamos el complejo de la terminal oxidasa (ΔcydAB), interrumpiendo así la capacidad de ETBF para respirar, o farmacológicamente restauramos la hipoxia epitelial administrando una sola dosis de tributirina (Figura 3M). 12 semanas después de la infección, evaluamos la incidencia de tumores cólicos. En consonancia con nuestra hipótesis, ambas estrategias redujeron significativamente la carga tumoral (Figura 3N). Estos hallazgos respaldan un modelo en el que la tumorigénesis inducida por ETBF se ve potenciada por su capacidad para explotar el oxígeno y participar en el metabolismo oxidativo, lo que sugiere un vínculo entre la respiración microbiana y la promoción del cáncer en el intestino.

BFT reprograma el metabolismo de los colonocitos a través de la interferencia con los procesos epiteliales

Una característica distintiva de la actividad de BFT es la inducción de la escisión proteolítica de la proteína de unión estrecha E-caderina,^[33],^[99], lo que compromete la integridad de la barrera cólica. En consonancia con esto, la administración de fluoresceína isotiocianato (FITC)-dextrano reveló que la infección por ETBF aumentó notablemente la permeabilidad intestinal (Figura 4A). Estudios recientes han implicado a BFT, una metaloproteasa dependiente del zinc, en la escisión de E-caderina.^[123] Sin embargo, múltiples estudios indican que el procesamiento de E-caderina inducido por BFT también involucra vías proteolíticas dependientes del huésped, además de la actividad directa de la toxina.^[31],^[33],^[99],^[124] En consecuencia, el tratamiento con marimastat,^[125], un inhibidor de amplio espectro de las metaloproteasas de la matriz del huésped capaz de escindir E-caderina,^[126], redujo la colonización por ETBF y mejoró la pérdida de peso en los animales (Figuras 4B y 4C), lo que respalda un papel de la remodelación epitelial dependiente de proteasas del huésped aguas abajo de BFT.

La proteólisis de E-caderina también conduce a la liberación y la translocación nuclear de β-catenina, que activa la proliferación dependiente del factor de células T (TCF), lo que impulsa la hiperplasia de las criptas epiteliales.^[33],^[34],^[127] De hecho, la infección por ETBF promovió la hiperplasia epitelial de manera dependiente de BFT (Figuras 4D y 4E). Esta división excesiva de las células epiteliales provoca una expansión de las células indiferenciadas y de tránsito-amplificación (TA) desde su ubicación típica dentro de las criptas hasta la superficie del epitelio^[43] (Figuras S8A y S8B), lo que conduce al alargamiento de las criptas (Figuras 4D y 4E). A diferencia de los colonocitos maduros, las células TA se someten principalmente a glucólisis anaeróbica, lo que no contribuye a la hipoxia.^[102],^[128] En consecuencia, la hiperplasia de los colonocitos puede promover la oxigenación luminal y la acumulación de lactato.

Para evaluar si la hiperplasia de las criptas modula el entorno nutricional intestinal, inhibimos la señalización de Wnt/β-catenina con LGK-974^[129],^[130] durante la infección por ETBF. LGK-974 atenuó la hiperplasia de las criptas inducida por ETBF y su distorsión histológica asociada (Figuras 4F y 4G). En consonancia con una reversión de la glucólisis al metabolismo oxidativo, LGK-974 revirtió parcialmente el cambio hacia la glucólisis en los colonocitos impulsado por BFT y disminuyó la oxigenación epitelial (Figuras 4H y S8C). Es importante destacar que la normalización parcial del metabolismo de los colonocitos a través de LGK-974 redujo significativamente las cargas de ETBF y alivió la inflamación (Figuras 4I y 4J), como lo evidencian las reducciones en la expresión de citocinas inflamatorias, el acortamiento del colon y la pérdida de peso (Figuras 4K y 4L). También se observó una reducción similar en la colonización por ETBF en el pico de la infección (día 3, Figura S8D). LGK-974 no introdujo alteraciones importantes en la composición general de la microbiota (Figuras S8E–S8I), lo que indica que sus efectos protectores son principalmente mediados por el huésped. En conjunto, estos resultados indican que los cambios epiteliales impulsados por la toxina establecen un entorno oxidativo patológico que ETBF explota para una colonización robusta.

El agotamiento del ácido biliar dependiente de BFT promueve la colonización por ETBF

La infección por ETBF provoca una serie de respuestas extraepiteliales, incluida una cascada proinflamatoria que contribuye a la patogénesis de la enfermedad.^[30] Una característica distintiva de esta cascada es la inducción de un programa patológico de células T marcado por la producción de IL-17 (Figura 5A), una citocina fundamental para la patogénesis de ETBF.^[26] IL-17 no solo amplifica la inflamación local, sino que también puede exacerbar la reprogramación metabólica en las células epiteliales, promoviendo un cambio hacia la glucólisis.^[103],^[104],^[131] Para probar si la señalización de IL-17 es funcionalmente necesaria para la remodelación metabólica epitelial inducida por ETBF, bloqueamos agudamente la actividad de IL-17 in vivo utilizando anticuerpos neutralizantes anti-IL-17 con los controles de isotipo correspondientes.^[26],^[132] En consonancia con esta hipótesis,^[103],^[104], la neutralización aguda de IL-17 atenuó notablemente la remodelación metabólica epitelial inducida por ETBF (Figura 5B). Además, el bloqueo de IL-17 redujo significativamente la colonización por ETBF in vivo (Figura 5C). En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia experimental directa de que la señalización de IL-17 es un componente necesario de un bucle de retroalimentación que vincula la inflamación, la remodelación metabólica epitelial y la persistencia de ETBF. Sin embargo, los mecanismos por los cuales ETBF desencadena la producción de IL-17 y cómo la respuesta retroalimenta para apoyar la persistencia bacteriana siguen sin estar completamente definidos.

Para abordar esta brecha, realizamos un perfilado metabolómico no dirigido de los contenidos intestinales de ratones infectados con ETBF (Figura 5D). Sorprendentemente, varios ácidos biliares primarios, el ácido cólico (CA) y el ácido quenodeoxicólico (CDCA), compuestos esteroides sintetizados en el hígado y secretados en el intestino delgado para ayudar a la digestión,^[133], se agotaron significativamente de manera dependiente de BFT (Figura 5E). Esta pérdida es poco probable que se deba a una reducción de la biosíntesis, ya que tanto la expresión génica de la biosíntesis de ácidos biliares hepáticos como los niveles de ácidos biliares permanecieron sin cambios (Figuras 5F y S9A–S9D).

De manera similar, los ácidos biliares secundarios derivados de la transformación microbiana de estos ácidos biliares primarios,^[134], incluido el ácido desoxicólico (DCA), el ácido isolitocólico (isoLCA) y el ácido tauroursodeoxicólico (UDCA), también disminuyeron notablemente (Figura 5E). La cuantificación dirigida mediante cromatografía líquida-espectrometría de tándem (LC-MS/MS) confirmó el agotamiento extenso y dependiente de BFT tanto de los ácidos biliares primarios como secundarios (Figura 5G). En particular, un subconjunto de ácidos biliares secundarios, como el ácido 3-oxolitocólico (3-oxoLCA) y el isoLCA, suprime potently la diferenciación de células TH17 intestinales y la producción resultante de IL-17^[105] al inhibir el factor de transcripción receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico γt (RORγt).^[105],^[135],^[136] Este efecto probablemente se extiende más allá de las células TH17, ya que RORγt también regula las funciones de otras células inmunitarias que expresan IL-17, incluidas las células epiteliales intraepiteliales (IEL), los linfocitos innatos y las células T γδ.^[137],^[138] Como tal, el agotamiento de estos ácidos biliares secundarios podría promover ampliamente la señalización de IL-17 a través de la activación de las células inmunitarias que expresan RORγt.

Dado el agotamiento dependiente de BFT del 3-oxoLCA y el isoLCA observado durante la infección por ETBF (Figura 5G) y el papel clave de IL-17 en la patogénesis de ETBF,^[139], investigamos si el agotamiento de los ácidos biliares promueve la infección por ETBF al mejorar la inducción de IL-17. El perfilado de la expresión de IL-17 en el intestino infectado con ETBF reveló una robusta activación dependiente de BFT de las células inmunitarias que producen IL-17 y RORγt+ (Figuras 6A y 6B), que incluyen las IEL no T (TCRneg, RORγt+ e IL-17+), las células TH17 (TCRβ+, RORγt+ e IL-17+) y las células T γδ (TCRγδ+, RORγt+ e IL-17+) (Figuras 6C, 6D y S10A–S10C), en consonancia con informes anteriores.^[26],^[132],^[140] Es importante destacar que la suplementación con ácidos biliares primarios en el agua para beber redujo significativamente la producción de IL-17, particularmente en las IEL no T y las células T γδ, siendo estas últimas críticas para la patogénesis de ETBF (Figuras 6A, 6C, 6D y S10A–S10C). Además, la suplementación con ácidos biliares también suprimió la inducción de IL-17 en un modelo inflamatorio independiente de ETBF que utiliza el β-glucano fúngico curdlán y el sulfato de dextrano sódico^[113],^[141]–^[146] (Figuras S10D–S10F), lo que indica que los ácidos biliares restringen directamente las respuestas de IL-17 en lugar de afectarlas indirectamente a través de la alteración de la colonización por ETBF.

A continuación, investigamos si los ácidos biliares suprimen la infección por ETBF. En condiciones fisiológicas, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares secretados se reciclan de nuevo al hígado, mientras que aproximadamente el 5% llega al colon y se transforma microbianamente en ácidos biliares secundarios.^[147] Para imitar este contexto fisiológico, a los ratones infectados con ETBF se les administró una mezcla de ácidos biliares primarios a una dosis fisiológica (5 μmol/día/kg), lo que coincide con la exposición colónica en condiciones de homeostasis.^[147] En consonancia con nuestra hipótesis, la suplementación con ácidos biliares primarios redujo notablemente la pérdida de peso, la inflamación intestinal y la patogenia asociadas con ETBF (Figuras 6E–6G). Además, la suplementación directa con ácidos biliares secundarios, específicamente 3-oxoLCA e isoLCA, atenuó robustamente la patogénesis de ETBF, lo que subraya que el agotamiento de los ácidos biliares secundarios es una estrategia de virulencia crítica de ETBF (Figuras 6E–6G y S10G). El análisis de agrupamiento a nivel de características del transcriptoma cecal demostró distintas firmas moleculares asociadas con la suplementación con ácidos biliares primarios, 3-oxoLCA e isoLCA (Figura S10H). El análisis del transcriptoma reveló además que los ácidos biliares primarios promovieron el enriquecimiento de vías relacionadas con la respiración mitocondrial y la fosforilación oxidativa, lo que se alinea con nuestra observación de la restauración de la homeostasis metabólica epitelial (Figuras S10I y S10J). Es importante destacar que la suplementación con CA, un ácido biliar primario que no produce ácidos biliares secundarios inhibidores de TH17 como isoLCA y 3-oxoLCA,^[136], no tuvo ningún impacto en la colonización por ETBF ni en la gravedad de la enfermedad (Figuras 6F y 6G). Esta observación apoya la hipótesis de que los efectos protectores observados están mediados específicamente por la modulación inmunitaria dependiente de los ácidos biliares secundarios en lugar de las propiedades antimicrobianas generales de los ácidos biliares.^[148]

Dado que IL-17, la principal citocina efectora de la respuesta TH17, se ha relacionado con la adaptación epitelial a la glicólisis anaeróbica,^[103],^[104],^[131], a continuación examinamos si ETBF manipula el metabolismo epitelial a través de un eje de señalización ácido biliar-IL-17, analizando los estados metabólicos de los colonocitos mediante el ensayo SCENITH. Cabe destacar que la suplementación con ácidos biliares primarios suprimió significativamente la glicólisis en los colonocitos (Figura 6H). Además, la restauración de los niveles de ácidos biliares secundarios, ya sea mediante la suplementación con ácidos biliares primarios o secundarios, redujo la oxigenación epitelial y la acumulación de lactato en la luz (Figuras 6I y 6J). Estos tratamientos también atenuaron la diferenciación de las células T inducida por ETBF, lo que apoya la idea de que una respuesta de las células T patológica contribuye a la reprogramación metabólica epitelial (Figura S10K). En conjunto, estos hallazgos indican que ETBF explota la señalización de los ácidos biliares para reprogramar el metabolismo epitelial, facilitando así su colonización del intestino.

BFT explota la vía de reciclaje de los ácidos biliares para agotar los ácidos biliares en el intestino

A continuación, investigamos el mecanismo por el cual BFT promueve el agotamiento de los ácidos biliares en la luz intestinal. Dado que BFT no alteró los niveles de ácidos biliares hepáticos ni la vía de biosíntesis (Figuras 5F y S9), esto sugiere que otros procesos distintos de la biosíntesis de ácidos biliares pueden estar implicados en el agotamiento observado. Dado que la mayoría de los ácidos biliares secretados se devuelven al hígado a través de la vía de reciclaje de los ácidos biliares, hipotetizamos que ETBF puede explotar esta vía para remodelar el paisaje de los ácidos biliares intestinales.^[149] En esta vía de reciclaje, el transportador de ácidos biliares SLC10A2 (familia de transportadores de solutos 10, miembro 2) media la captación de ácidos biliares en los enterocitos, tras lo cual la proteína de unión a ácidos grasos 6 (FABP6) los transporta desde el lado luminal al lado basolateral del enterocito para su eflujo de regreso al hígado a través de transportadores como el transportador de solutos orgánicos OST-α/β.^[150] El análisis transcriptómico de los tejidos cólicos de ratones infectados con ETBF reveló que BFT reguló al alza varios componentes clave de la maquinaria de reciclaje de ácidos biliares, incluidos Slc10a2, Fabp6 y Ost-α/β (Figura 7A). Con la biosíntesis de ácidos biliares sin cambios, el reciclaje mejorado probablemente reduce la fracción de ácidos biliares que llega al colon para la conversión microbiana en ácidos biliares secundarios inmunomoduladores. Tanto las proteínas SLC10A2 como FABP6 se expresan en el intestino grueso (Figura S11A), lo que apoya la hipótesis de que BFT promueve la recaptación de ácidos biliares mediada por el huésped para agotar los ácidos biliares secundarios y amplificar la inflamación impulsada por IL-17.

Para probar esto aún más, impedimos el reciclaje de ácidos biliares utilizando maralixibat, un inhibidor selectivo del transportador de ácidos biliares primarios SLC10A2.^[151] En comparación con el control tratado con vehículo, el tratamiento con maralixibat restauró los niveles de ácidos biliares primarios en el intestino grueso de los ratones infectados con ETBF (Figuras S11B y S11C). Coherente con nuestra hipótesis, esta intervención redujo los niveles de transcritos de Il17 y Cxcl1, marcadores de la señalización de IL-17 y la inflamación (Figuras 7B y 7C), alivió el acortamiento del colon y redujo la carga de patógenos en los animales infectados con ETBF (Figuras 7D–7F). Además, el análisis del transcriptoma cecal reveló que maralixibat redujo la expresión de genes involucrados en la señalización de interferón y la activación de las células T γδ (Figura S11D), y se identificó una reducción más amplia de las vías de activación de las células T mediante WGCNA (Figura S11E). Es importante destacar que el secuenciamiento del ARNr 16S del contenido cecal mostró una amplificación de Firmicutes, miembros críticos conocidos de una microbiota homeostática, sin cambios significativos en la diversidad alfa o la diversidad beta entre los grupos de tratamiento (Figuras S11F–S11J), lo que indica que los efectos observados probablemente no se debieron a cambios en la microbiota. Además, ninguna de las intervenciones dirigidas al huésped alteró significativamente la abundancia de ETBF o la expresión de bft en las primeras etapas de la infección (Figura S12), lo que sugiere que la atenuación de la enfermedad refleja la modulación de las respuestas del huésped en lugar de la supresión directa del crecimiento bacteriano o la expresión de toxinas. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que BFT manipula el reciclaje de ácidos biliares del huésped para suprimir la acumulación de ácidos biliares secundarios inmunomoduladores en el colon, amplificando así la inflamación impulsada por IL-17 y promoviendo la colonización por ETBF (Figura S13).

ETBF opera un metabolismo oxidativo que respalda la respiración de oxígeno

Dado que la mayoría de los nichos nutricionales en el intestino ya están ocupados por la microbiota residente, los patógenos entéricos a menudo emplean estrategias de virulencia para provocar respuestas del huésped, facilitando el establecimiento de nuevos nichos que permiten su colonización.^[42]–^[44],^[51]–^[55] Para explorar si BFT, un factor de virulencia reconocido que previamente demostró inducir una serie de cambios inflamatorios, remodela el paisaje nutricional intestinal para facilitar la colonización por ETBF, colonizamos grupos de ratones C57BL/6 con la cepa de tipo salvaje de ETBF y una cepa mutante isogénica deficiente en toxinas Δbft y evaluamos su aptitud y el estado inflamatorio del huésped. De hecho, la pérdida de bft atenuó marcadamente la inflamación y redujo la carga de patógenos en comparación con el homólogo de tipo salvaje (Figuras 1A–1C).

A continuación, buscamos determinar cómo ETBF se adapta a los nichos inflamatorios esculpidos por BFT. Dado que las bacterias adaptan sus programas de transcripción a los nutrientes disponibles, el transcriptoma bacteriano puede servir como un indicador del estado funcional del metabolismo de ETBF in vivo.^[56],^[57] Sin embargo, el ARNm de los patógenos está superado en gran medida por los transcritos del huésped^[58] y los de las diversas bacterias comensales.^[59],^[60] Para superar esto, empleamos el secuenciamiento de ARN con selección híbrida (hsRNA-seq),^[61] utilizando sondas de captura colocadas en todos los marcos de lectura abiertos predichos de ETBF. Este enfoque permite la captura selectiva de los transcritos de ETBF a partir del ARN total aislado de los tejidos del huésped y la comunidad microbiana intestinal sin introducir un sesgo de enriquecimiento sustancial (Figuras 1D y S1A). El análisis transcriptómico mediante secuenciación de ARN sin captura dirigida reveló que los tejidos del huésped montan respuestas robustas a BFT, lo que probablemente remodela el paisaje nutricional intestinal (Figuras S1B y S1C). A su vez, ETBF adapta su transcriptoma al paisaje nutricional alterado por BFT, con 35 vías significativamente enriquecidas entre los genes expresados diferencialmente en el lumen (Figura S1D). Cabe destacar que estas vías incluyen "ribosoma", "expresión génica" y "traducción", todas ellas procesos que consumen mucha energía, lo que sugiere que las respuestas del huésped inducidas por BFT crean un nicho nutricional que mejora la aptitud de ETBF en el intestino inflamado.

Sorprendentemente, el análisis transcriptómico reveló que ETBF codifica y transcribe activamente enzimas clave necesarias para un ciclo de Krebs completo, incluido Sdh, SucAB y SucCD, en el intestino inflamado (Figura 1E). ETBF también expresa acetato:succinato CoA-transferasa (Asct),^[62] que cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato, similar a SucCD, pero con la producción adicional de acetil-CoA (Figura 1F), lo que apoya aún más la capacidad de ETBF para el metabolismo central oxidativo. Dado que estos genes son prescindibles para el crecimiento fermentativo y generalmente se suprimen en condiciones anaeróbicas,^[63],^[64], su expresión robusta in vivo puede reflejar una adaptación a una mayor disponibilidad de oxígeno durante la inflamación (Figuras 1E y 1F), refinando la visión prevaleciente de B. fragilis como un organismo clásicamente anaeróbico. En apoyo de esto, con las notables excepciones de sdh y asct, los niveles de transcritos de los genes del metabolismo oxidativo fueron generalmente más altos en las bacterias asociadas con el tejido intestinal, en comparación con los de las fracciones de moco o lumen (Figura 1E), lo que probablemente refleja el gradiente de oxígeno de tejido a lumen. La integración del transcriptoma in vivo en el modelado metabólico a escala genómica predijo un flujo sustancial a través de tres lactato deshidrogenasas (Ldh1, Ldh2 [RS13195] y LutABC), junto con los componentes de la respiración de oxígeno (CydAB) y el ciclo de Krebs oxidativo (SucAB, SucCD y Asct) (Figura 1F). En contraste, el flujo a través de estos genes es mínimo en condiciones anaeróbicas (Figura 1F). Es interesante destacar que sucAB (subunidad E1), sucCD y ldh2 muestran una distribución en mosaico dentro del género Bacteroides, con una mayor prevalencia en aquellos miembros con una tolerancia al oxígeno relativamente mayor, lo que sugiere que estos genes pueden participar en la adaptación a nichos oxidativos^[65] (Figura S1E). En conjunto, estos hallazgos sugieren que ETBF opera un programa metabólico que diverge de las vías de fermentación anaeróbica que normalmente se asocian con otros Bacteroides.^[66]

El oxígeno y el lactato impulsan un metabolismo oxidativo en ETBF

La respiración celular implica la oxidación de un donante de electrones (por ejemplo, lactato) y la transferencia de los electrones resultantes a través de una cadena de transporte de electrones a un aceptor de electrones, como el oxígeno.^[67] Al permitir una oxidación más completa de las fuentes de carbono y una conservación de energía más eficiente, la respiración genera ATP de manera más eficiente, lo que confiere una ventaja metabólica sobre la fermentación anaeróbica.^[68] El oxígeno es el aceptor de electrones más favorable, dado el alto rendimiento de energía libre; sin embargo, la mayoría de los anaerobios exhiben un crecimiento o viabilidad limitados al exponerse al oxígeno o a las especies reactivas del oxígeno (ROS), lo que impide su uso para la respiración.^[45],^[69] Cabe destacar que trabajos recientes revelaron que un subconjunto de anaerobios (nanaerobios), incluido B. fragilis, exhiben una mayor tolerancia al oxígeno^[70] y pueden utilizar concentraciones nanomolares de oxígeno como aceptor de electrones para obtener beneficios adicionales para la aptitud.^[65],^[71],^[72] Sin embargo, los mecanismos que permiten la respiración de oxígeno en los nanaerobios y su relevancia fisiológica dentro del huésped mamífero siguen siendo en gran medida desconocidos.

En los anaerobios facultativos, los niveles de expresión de las enzimas del ciclo de Krebs responden principalmente a la presencia de oxígeno y fuentes de carbono, como el lactato.^[63],^[73],^[74] Los abundantes transcritos de los genes involucrados en la utilización del lactato sugieren que el lactato puede ser una fuente de carbono candidata para ETBF en el intestino inflamado (Figura 1E). Por lo tanto, preguntamos si el oxígeno y el lactato impulsan un ciclo de Krebs completo en ETBF. La exposición in vitro al oxígeno y al lactato aumentó la expresión de los genes involucrados en la oxidación del lactato y el metabolismo central oxidativo (Figura 1G). Como un excelente aceptor de electrones, el oxígeno permite la utilización de fuentes de carbono que de otro modo serían poco fermentables, como el lactato,^[75], facilitando así la producción de ATP.^[76] Coherente con esto, el oxígeno y el lactato aumentaron sinérgicamente tanto la producción de ATP como la aptitud bacteriana de ETBF in vitro (Figuras 1H e 1I).

Para probar esto aún más, inoculamos ETBF a baja densidad (2,5 × 104 unidades formadoras de colonias [UFC]) en una atmósfera microanaeróbica abierta con 1-10 μM de O2 (correspondiente a ~0,1-1%) para minimizar el impacto del barrido colectivo^[77] de oxígeno que puede ocurrir a altas cargas bacterianas y la consiguiente disminución de la tensión de oxígeno debido al consumo microbiano en recipientes sellados.^[65] Sorprendentemente, el lactato apoyó el crecimiento de ETBF en presencia de hasta 10 μM de oxígeno, una concentración mayor que las concentraciones nanomolares reportadas previamente para los nanaerobios,^[65],^[71],^[72] en un medio rico y semidefinido donde están disponibles otras fuentes de carbono (Figuras 1J y S1F). A 5 μM de O2, ETBF entró en la fase exponencial antes que en condiciones anaeróbicas, lo que es consistente con una mayor eficiencia metabólica (Figura S1F). En contraste, una cepa no toxigénica de B. fragilis (NTBF) (ATCC 25285) no se benefició de estos nutrientes, incluso a 3 μM de O2 (Figura 1J). Cabe destacar que las enzimas clave que respaldan el metabolismo oxidativo en ETBF están en gran medida conservadas en la cepa no toxigénica (Figura S1E), lo que sugiere que las diferencias en la regulación transcripcional o la función enzimática pueden subyacer a las distintas adaptaciones metabólicas a los entornos oxigenados entre las dos cepas.

BFT licencia el metabolismo oxidativo y la adaptación al nicho

Dado que ETBF se distingue genéticamente de NTBF, principalmente por la presencia de la isla de patogenicidad de Bacteroides fragilis que codifica BFT,^[78],^[79], los defectos de aptitud del mutante ETBF Δbft en el intestino inflamado sugirieron que el propio BFT podría facilitar la adaptación a este nicho metabólico alterado. Para probar directamente esta hipótesis, comparamos el crecimiento microanaeróbico de la cepa ETBF Δbft con el de un derivado complementado en el que se reintrodujo una sola copia de bft bajo su promotor nativo en un sitio cromosómico neutro. Sorprendentemente, la expresión de bft por sí sola fue suficiente para restaurar el crecimiento microanaeróbico (Figura S2A). Además, la expresión heteróloga de bft permitió que múltiples cepas NTBF, incluidas ATCC 25285, TM4000 y un aislado clínico independiente BF-25-0092798, crecieran en 0,1% de O2 (Figuras S2B–S2D). La expresión inducible de bft a partir de un promotor sintético^[80] reprodujo la expresión nativa de bft, lo que indica que el propio BFT, en lugar de los elementos reguladores circundantes,^[81], es suficiente para conferir este fenotipo (Figura S2E). Cabe destacar que la expresión de las isoformas 2 y 3 de BFT, pero no de la isoforma 1,^[82]–^[85], permitió el crecimiento hipóxico de las cepas NTBF, lo que revela diferencias específicas de la isoforma en la capacidad de sustentar la aptitud hipóxica (Figura S2B). Coherente con informes anteriores,^[86], la capacidad de crecimiento hipóxico varió entre los aislados de B. fragilis y no se segregó claramente según el estado toxigénico (Figuras S2F–S2I), lo que subraya la importancia de las comparaciones isogénicas para aislar la contribución de BFT.

A continuación, preguntamos si BFT promueve la adaptación al entorno del intestino inflamado in vivo. En los ensayos de colonización única, una cepa NTBF isogénica que expresaba bft indujo la expresión de genes inflamatorios y exhibió una marcada ventaja de aptitud en relación con su cepa parental (Figuras S3A–S3C), lo que demuestra que la expresión de BFT por sí sola es suficiente para promover la colonización en el intestino inflamado. Para probar si esta ventaja refleja un beneficio intrínseco de la cepa en lugar de un acceso compartido a un entorno del huésped remodelado, realizamos experimentos de colonización competitiva utilizando cepas NTBF y NTBF::bft isogénicas. En estas condiciones, NTBF::bft indujo una inflamación modesta y superó significativamente a la cepa NTBF de tipo salvaje (Figuras S3D–S3F), lo que indica que la expresión de BFT confiere una ventaja competitiva incluso cuando ambas cepas experimentan entornos de huésped y nutrientes idénticos.

A continuación, preguntamos si esta ventaja se amplifica en el contexto de la inflamación impulsada por ETBF. En los experimentos de co-colonización, la cepa ETBF de tipo salvaje superó en gran medida a NTBF y provocó una inflamación robusta, mientras que el mutante ETBF Δbft isogénico exhibió una ventaja competitiva mínima (Figuras S3G–S3I), lo que demuestra que BFT es necesario para la ventaja preferencial de ETBF en este entorno. Finalmente, para probar si BFT puede funcionar in trans, aislamos vesículas de membrana externa (OMV)^[87] de la cepa ETBF de tipo salvaje o del mutante isogénico Δbft y las administramos a ratones colonizados con NTBF o ETBF Δbft. Las OMV BFT+, pero no las OMV BFT−, indujeron inflamación intestinal, perjudicaron la aptitud de NTBF y mejoraron la colonización por ETBF Δbft (Figuras S3J–S3L). En conjunto, estos datos demuestran que BFT autoriza un programa metabólico oxidativo que permite a B. fragilis adaptarse y explotar el entorno del intestino inflamado. A través del remodelamiento del huésped dependiente de BFT y la mayor tolerancia a las condiciones oxidativas, ETBF, a pesar de que clásicamente se considera un anaerobio, puede acoplar la oxidación del lactato a la respiración de oxígeno y obtener una ventaja selectiva en el intestino inflamado.

La respiración oxidativa del lactato es necesaria para la colonización de ETBF en el intestino inflamado

Después de establecer que ETBF participa en un metabolismo oxidativo en condiciones microanaeróbicas, a continuación, probamos si la oxidación del lactato y la respiración de oxígeno son necesarias para la aptitud de ETBF.^[75],^[88],^[89]. De hecho, la eliminación de los genes necesarios para la respiración de oxígeno (ΔcydAB),^[45], la utilización del lactato (Δldh1 o ΔlutABC Δldh2; tenga en cuenta que los repetidos intentos de generar el mutante triple no tuvieron éxito) o el metabolismo central oxidativo (ΔsucCD Δasct) en ETBF perjudicaron significativamente su capacidad para beneficiarse de la oxidación del lactato en condiciones microaeróbicas (Figuras 1I y 1K), pero tuvieron poco o ningún efecto sobre la aptitud bacteriana cuando ETBF se cultivó anaeróbicamente (Figura S4A).

Dado que BFT promueve la colonización de ETBF (Figuras 1A–1C y S2), a continuación, preguntamos cómo ETBF explota los cambios mediados por BFT para la colonización del intestino. Dado que ETBF acopla la oxidación del lactato a la respiración de oxígeno in vitro y transcribe activamente los genes involucrados en el metabolismo oxidativo en el intestino inflamado (Figura 1), hipotetizamos que ETBF depende del metabolismo oxidativo para explotar el entorno creado por BFT para una colonización eficiente del intestino. Coherente con esta noción, la ablación de la oxidasa terminal^[45] (ΔcydAB) en la vía de la respiración de oxígeno atenuó significativamente la colonización de ETBF y redujo parcialmente la inflamación intestinal asociada a la infección (Figuras 2A–2D). El análisis de la red de coexpresión de genes ponderada (WGCNA) del transcriptoma del tejido intestinal reveló que el mutante ΔcydAB exhibió una reducción de los cambios asociados a la infección en los procesos del huésped, como la transición epitelio-mesenquimal, lo que refuerza la noción de que ETBF altera los procesos del huésped para remodelar el entorno nutricional del intestino (Figuras S4B y S4C).

Participar en un metabolismo central oxidativo podría permitir que ETBF acople la oxidación del lactato con la respiración de oxígeno a través de una cadena de transporte de electrones,^[75],^[90], lo que facilitaría su colonización del intestino. Para probar esta hipótesis, evaluamos la aptitud in vivo de los mutantes que carecen de deshidrogenasas del lactato (Ldh1; LutABC y Ldh2) y componentes clave del TCA oxidativo (SucCD y Asct; SucAB). De acuerdo con nuestras observaciones in vitro (Figura 1K), estos genes fueron críticos para la aptitud y la patogenicidad de ETBF in vivo (Figuras 2E–2J). En particular, el mutante Δldh1 exhibió un defecto aún más pronunciado en la colonización de la capa de moco intestinal, lo que sugiere que la utilización del lactato en este nicho oxigenado es una estrategia adaptativa del patógeno (Figura S4D). Por el contrario, la eliminación de sucAB no produjo un costo de aptitud notable, lo que indica una posible redundancia funcional proporcionada por una enzima no caracterizada alternativa (Figura S4E).

Cabe destacar que la reducción de la colonización observada en los mutantes ΔsucCD Δasct y Δldh1 se acompañó de una atenuación de la inflamación intestinal (Figuras 2G, 2J y S4F), mientras que la eliminación de las otras dos deshidrogenasas del lactato (ΔlutABC Δldh2) o sucAB por sí sola no tuvo ningún impacto en la respuesta inflamatoria en comparación con la cepa de tipo salvaje (Figuras S4G y S4H). Todos los mutantes se generaron como deleciones no polares, y la reintroducción de una sola copia del gen eliminado bajo su promotor nativo en un locus cromosómico neutro restauró parcial o completamente la aptitud tanto in vitro como in vivo (Figuras S5A–S5H y S6A–S6F). En casos de rescate parcial, la restauración incompleta de la abundancia de transcritos probablemente refleje diferencias en el contexto regulatorio entre los loci nativos y complementados^[91]–^[98] (Figuras S5I–S5K). Es importante destacar que los defectos de aptitud observados probablemente no se debieron a una disminución de la producción de toxinas, ya que los mutantes metabólicos expresaron bft a niveles más altos que la cepa de tipo salvaje al principio de la colonización de ETBF (Figuras S6G–S6I). Por el contrario, la eliminación de los genes correspondientes en un entorno NTBF no perjudicó la colonización in vivo (Figuras S6J y S6K), lo que indica que estas vías son selectivamente necesarias en el nicho inflamatorio impulsado por BFT. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la respiración de oxígeno, el metabolismo oxidativo y la oxidación selectiva del lactato son impulsores metabólicos clave de la aptitud de ETBF en el intestino inflamado, lo que revela una capacidad previamente no apreciada de este anaerobio para explotar los nichos inflamatorios oxigenados.

BFT remodela el metabolismo de los colonocitos, aumentando los niveles de oxígeno y lactato en el intestino

Estudios anteriores han demostrado que BFT provoca una serie de cambios epiteliales del huésped que pueden converger para remodelar el entorno nutricional intestinal. Estos incluyen la inducción de la escisión de la proteína de unión de la zona adherens E-caderina^[99] y la hiperplasia mediante la desregulación de la señalización Wnt/β-catenina/c-Myc.^[24],^[100]. La hiperplasia de las criptas, a su vez, expande la población de colonocitos inmaduros, que participan preferentemente en la glucólisis anaeróbica en lugar de la fosforilación oxidativa típica de los colonocitos diferenciados.^[101],^[102]. Más allá de los efectos directos sobre las células epiteliales, BFT también desencadena la activación patológica de las células T colaboradoras 17 (TH-17),^[26],^[30], lo que podría exacerbar aún más el cambio a la glucólisis a través de la citocina efectora interleucina 17 (IL-17).^[103],^[104]. En conjunto, estos efectos impulsan un cambio del metabolismo oxidativo a la glucólisis en los colonocitos,^[36],^[43],^[102],^[105]–^[109], aumentando así la exportación de lactato y permitiendo que el oxígeno se difunda desde la lámina propia hacia el lumen.^[89],^[110]. Coherente con esta hipótesis, el análisis de ARN-seq del tejido colónico de ratones infectados con ETBF reveló la represión dependiente de BFT de los genes involucrados en la β-oxidación y los complejos I–IV de la cadena de transporte de electrones (Figura 3A).

Para evaluar aún más el estado metabólico de los colonocitos durante la infección por ETBF, empleamos el ensayo de metabolismo energético de células únicas mediante el perfilado de la inhibición de la traducción (SCENITH) para perfilar las respuestas metabólicas en varios tipos de células ex vivo mediante citometría de flujo.^[111]. SCENITH aprovecha la incorporación de puromicina en las proteínas nacientes para medir los niveles de síntesis de proteínas, que sirven como un indicador confiable de la actividad metabólica global.^[112]. Al utilizar inhibidores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis, pudimos evaluar las contribuciones relativas de estas vías (Figura 3B). De acuerdo con informes anteriores^[101],^[102],^[110] y nuestro análisis transcriptómico (Figura 3A), los colonocitos operan principalmente un metabolismo oxidativo en la homeostasis (Figura 3C). Sin embargo, tras la infección por ETBF, los colonocitos sufrieron un notable cambio metabólico hacia la glucólisis (Figura 3C).

Un cambio del metabolismo oxidativo al metabolismo glucolítico en los colonocitos reduce el consumo de oxígeno de los vasos sanguíneos subyacentes, lo que permite que el oxígeno se difunda hacia el lumen intestinal.^[110],^[113]. Simultáneamente, el lactato se secreta como un producto metabólico final.^[114],^[115]. Los niveles elevados de oxígeno luminal también pueden perjudicar las enzimas sensibles al oxígeno en los comensales anaerobios obligados, interrumpiendo las vías metabólicas clave, incluido el metabolismo central del carbono.^[116]. Este estrés oxidativo puede obligar a los comensales a redirigir el piruvato hacia la producción de lactato,^[117], lo que contribuye aún más a la acumulación de lactato en el intestino. De hecho, la medición de la oxigenación intestinal mediante pimonidazol, un compuesto que forma aductos irreversibles con proteínas o ADN en los tejidos hipóxicos,^[118], reveló que la infección por ETBF condujo a un aumento de la tensión de oxígeno (Figura 3D). Además, la cuantificación del lactato reveló un aumento paralelo del lactato luminal de manera dependiente de BFT, lo que sugiere que el cambio a la glucólisis anaeróbica en los colonocitos crea un nicho oxidativo rico en lactato (Figura 3E).

SPANISH TRANSLATION:
Dado que ETBF se distingue genéticamente de NTBF, principalmente por la presencia de la isla de patogenicidad de Bacteroides fragilis que codifica BFT,^[78],^[79], los defectos de aptitud del mutante ETBF Δbft en el intestino inflamado sugirieron que el propio BFT podría facilitar la adaptación a este nicho metabólico alterado. Para probar directamente esta hipótesis, comparamos el crecimiento microanaeróbico de la cepa ETBF Δbft con el de un derivado complementado en el que se reintrodujo una sola copia de bft bajo su promotor nativo en un sitio cromosómico neutro. Sorprendentemente, la expresión de bft por sí sola fue suficiente para restaurar el crecimiento microanaeróbico (Figura S2A). Además, la expresión heteróloga de bft permitió que múltiples cepas NTBF, incluidas ATCC 25285, TM4000 y un aislado clínico independiente BF-25-0092798, crecieran en 0,1% de O2 (Figuras S2B–S2D). La expresión inducible de bft a partir de un promotor sintético^[80] reprodujo la expresión nativa de bft, lo que indica que el propio BFT, en lugar de los elementos reguladores circundantes,^[81], es suficiente para conferir este fenotipo (Figura S2E). Cabe destacar que la expresión de las isoformas 2 y 3 de BFT, pero no de la isoforma 1,^[82]–^[85], permitió el crecimiento hipóxico de las cepas NTBF, lo que revela diferencias específicas de la isoforma en la capacidad de sustentar la aptitud hipóxica (Figura S2B). Coherente con informes anteriores,^[86], la capacidad de crecimiento hipóxico varió entre los aislados de B. fragilis y no se segregó claramente según el estado toxigénico (Figuras S2F–S2I), lo que subraya la importancia de las comparaciones isogénicas para aislar la contribución de BFT.

A continuación, preguntamos si BFT promueve la adaptación al entorno del intestino inflamado in vivo. En los ensayos de colonización única, una cepa NTBF isogénica que expresaba bft indujo la expresión de genes inflamatorios y exhibió una marcada ventaja de aptitud en relación con su cepa parental (Figuras S3A–S3C), lo que demuestra que la expresión de BFT por sí sola es suficiente para promover la colonización en el intestino inflamado. Para probar si esta ventaja refleja un beneficio intrínseco de la cepa en lugar de un acceso compartido a un entorno del huésped remodelado, realizamos experimentos de colonización competitiva utilizando cepas NTBF y NTBF::bft isogénicas. En estas condiciones, NTBF::bft indujo una inflamación modesta y superó significativamente a la cepa NTBF de tipo salvaje (Figuras S3D–S3F), lo que indica que la expresión de BFT confiere una ventaja competitiva incluso cuando ambas cepas experimentan entornos de huésped y nutrientes idénticos.

A continuación, preguntamos si esta ventaja se amplifica en el contexto de la inflamación impulsada por ETBF. En los experimentos de co-colonización, la cepa ETBF de tipo salvaje superó en gran medida a NTBF y provocó una inflamación robusta, mientras que el mutante ETBF Δbft isogénico exhibió una ventaja competitiva mínima (Figuras S3G–S3I), lo que demuestra que BFT es necesario para la ventaja preferencial de ETBF en este entorno. Finalmente, para probar si BFT puede funcionar in trans, aislamos vesículas de membrana externa (OMV)^[87] de la cepa ETBF de tipo salvaje o del mutante isogénico Δbft y las administramos a ratones colonizados con NTBF o ETBF Δbft. Las OMV BFT+, pero no las OMV BFT−, indujeron inflamación intestinal, perjudicaron la aptitud de NTBF y mejoraron la colonización por ETBF Δbft (Figuras S3J–S3L). En conjunto, estos datos demuestran que BFT autoriza un programa metabólico oxidativo que permite a B. fragilis adaptarse y explotar el entorno del intestino inflamado. A través del remodelamiento del huésped dependiente de BFT y la mayor tolerancia a las condiciones oxidativas, ETBF, a pesar de que clásicamente se considera un anaerobio, puede acoplar la oxidación del lactato a la respiración de oxígeno y obtener una ventaja selectiva en el intestino inflamado.

La respiración oxidativa del lactato es necesaria para la colonización de ETBF en el intestino inflamado

Después de establecer que ETBF participa en un metabolismo oxidativo en condiciones microanaeróbicas, a continuación, probamos si la oxidación del lactato y la respiración de oxígeno son necesarias para la aptitud de ETBF.^[75],^[88],^[89]. De hecho, la eliminación de los genes necesarios para la respiración de oxígeno (ΔcydAB),^[45], la utilización del lactato (Δldh1 o ΔlutABC Δldh2; tenga en cuenta que los repetidos intentos de generar el mutante triple no tuvieron éxito) o el metabolismo central oxidativo (ΔsucCD Δasct) en ETBF perjudicaron significativamente su capacidad para beneficiarse de la oxidación del lactato en condiciones microaeróbicas (Figuras 1I y 1K), pero tuvieron poco o ningún efecto sobre la aptitud bacteriana cuando ETBF se cultivó anaeróbicamente (Figura S4A).

Dado que BFT promueve la colonización de ETBF (Figuras 1A–1C y S2), a continuación, preguntamos cómo ETBF explota los cambios mediados por BFT para la colonización del intestino. Dado que ETBF acopla la oxidación del lactato a la respiración de oxígeno in vitro y transcribe activamente los genes involucrados en el metabolismo oxidativo en el intestino inflamado (Figura 1), hipotetizamos que ETBF depende del metabolismo oxidativo para explotar el entorno creado por BFT para una colonización eficiente del intestino. Co

Si un aumento del oxígeno y el lactato favorece el crecimiento de ETBF, restaurar el metabolismo oxidativo epitelial debería contrarrestar la infección. Para probar esto, administramos terapéuticamente tributirina, un precursor de ácidos grasos de cadena corta que promueve el metabolismo oxidativo en los colonocitos,^[110], 2 días después de la inoculación de ETBF. El análisis de agrupamiento a nivel de características (Figura S7A), WGCNA (Figura S7B) y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (Figura S7C) revelaron que la tributirina suprimió la expresión génica glucolítica. En consonancia con estos cambios transcripcionales, la tributirina revirtió parcialmente la reprogramación metabólica inducida por ETBF en los colonocitos hacia la glucólisis (Figura 3F) y redujo significativamente la colonización por ETBF (Figura 3G). Además, el tratamiento con tributirina mejoró la pérdida de peso inducida por ETBF, atenuó la inflamación intestinal y mitigó los cambios histopatológicos asociados (Figuras 3H–3L). Cabe destacar que la tributirina no exhibió actividad antibacteriana directa contra ETBF (Figura S7D) ni alteró significativamente la composición de la microbiota (Figuras S7E–S7I), lo que indica que su efecto protector se deriva de la modulación del metabolismo del huésped en lugar de la interferencia microbiana. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que ETBF explota el aumento del oxígeno luminal para establecer y mantener la colonización durante la inflamación intestinal.

A continuación, examinamos si el funcionamiento de un metabolismo oxidativo facilita la tumorigénesis inducida por ETBF. Para este propósito, utilizamos el modelo de ratón con múltiples neoplasias intestinales (Min) (heterocigoto para el gen de la poliposis adenomatosa coli [Apc]). Aunque los ratones ApcMin se consideran un modelo de tumorigénesis del intestino delgado, estudios independientes han demostrado que la colonización por ETBF convierte a los ratones ApcMin en un modelo de tumor de colon.^[26],^[119]–^[121] Cabe destacar que los ratones ApcMin infectados con ETBF desarrollan tumores cólicos en cuestión de semanas, mucho antes de que los adenomas del intestino delgado sean clínicamente evidentes o detectables.^[122] Para interrumpir el metabolismo respiratorio de ETBF, genéticamente ablamos el complejo terminal de la oxidasa (ΔcydAB), interrumpiendo así la capacidad de ETBF para respirar, o farmacológicamente restauramos la hipoxia epitelial administrando una sola dosis de tributirina (Figura 3M). 12 semanas después de la infección, evaluamos la incidencia de tumores cólicos. En consonancia con nuestra hipótesis, ambas estrategias redujeron significativamente la carga tumoral (Figura 3N). Estos hallazgos respaldan un modelo en el que la tumorigénesis inducida por ETBF se ve potenciada por su capacidad para explotar el oxígeno y participar en el metabolismo oxidativo, lo que sugiere un vínculo entre la respiración microbiana y la promoción del cáncer en el intestino.

BFT reprograma el metabolismo de los colonocitos a través de la interferencia con los procesos epiteliales

Una característica distintiva de la actividad de BFT es la inducción de la escisión proteolítica de la proteína de unión estrecha E-caderina,^[33],^[99], lo que compromete la integridad de la barrera cólica. En consonancia con esto, la administración de fluoresceína isotiocianato (FITC)-dextrano reveló que la infección por ETBF aumentó notablemente la permeabilidad intestinal (Figura 4A). Estudios recientes han implicado a BFT, una metaloproteasa dependiente del zinc, en la escisión de E-caderina.^[123] Sin embargo, múltiples estudios indican que el procesamiento de E-caderina inducido por BFT también involucra vías proteolíticas dependientes del huésped, además de la actividad directa de la toxina.^[31],^[33],^[99],^[124] En consecuencia, el tratamiento con marimastat,^[125], un inhibidor de amplio espectro de las metaloproteasas de la matriz del huésped capaz de escindir E-caderina,^[126], redujo la colonización por ETBF y mejoró la pérdida de peso en los animales (Figuras 4B y 4C), lo que respalda un papel de la remodelación epitelial dependiente de la proteasa del huésped aguas abajo de BFT.

La proteólisis de E-caderina también conduce a la liberación y la translocación nuclear de β-catenina, que activa la proliferación dependiente del factor de células T (TCF), lo que impulsa la hiperplasia de las criptas epiteliales.^[33],^[34],^[127] De hecho, la infección por ETBF promovió la hiperplasia epitelial de manera dependiente de BFT (Figuras 4D y 4E). Esta división excesiva de las células epiteliales provoca una expansión de las células indiferenciadas y de tránsito-amplificación (TA) desde su ubicación típica dentro de las criptas hasta la superficie del epitelio^[43] (Figuras S8A y S8B), lo que conduce al alargamiento de las criptas (Figuras 4D y 4E). A diferencia de los colonocitos maduros, las células TA se someten principalmente a glucólisis anaeróbica, lo que no contribuye a la hipoxia.^[102],^[128] En consecuencia, la hiperplasia de los colonocitos puede promover la oxigenación luminal y la acumulación de lactato.

Para evaluar si la hiperplasia de las criptas modula el entorno nutricional intestinal, inhibimos la señalización de Wnt/β-catenina con LGK-974^[129],^[130] durante la infección por ETBF. LGK-974 atenuó la hiperplasia de las criptas inducida por ETBF y su distorsión histológica asociada (Figuras 4F y 4G). En consonancia con una reversión de la glucólisis al metabolismo oxidativo, LGK-974 revirtió parcialmente el cambio hacia la glucólisis en los colonocitos impulsado por BFT y disminuyó la oxigenación epitelial (Figuras 4H y S8C). Es importante destacar que la normalización parcial del metabolismo de los colonocitos a través de LGK-974 redujo significativamente las cargas de ETBF y alivió la inflamación (Figuras 4I y 4J), como lo evidencian las reducciones en la expresión de citocinas inflamatorias, el acortamiento del colon y la pérdida de peso (Figuras 4K y 4L). También se observó una reducción similar en la colonización por ETBF en el pico de la infección (día 3, Figura S8D). LGK-974 no introdujo alteraciones importantes en la composición general de la microbiota (Figuras S8E–S8I), lo que indica que sus efectos protectores son principalmente mediados por el huésped. En conjunto, estos resultados indican que los cambios epiteliales impulsados por la toxina establecen un entorno oxidativo patológico que ETBF explota para una colonización robusta.

El agotamiento del ácido biliar dependiente de BFT promueve la colonización por ETBF

La infección por ETBF provoca una serie de respuestas extraepiteliales, incluida una cascada proinflamatoria que contribuye a la patogénesis de la enfermedad.^[30] Una característica distintiva de esta cascada es la inducción de un programa patológico de células T marcado por la producción de IL-17 (Figura 5A), una citocina fundamental para la patogénesis de ETBF.^[26] IL-17 no solo amplifica la inflamación local, sino que también puede exacerbar la reprogramación metabólica en las células epiteliales, promoviendo un cambio hacia la glucólisis.^[103],^[104],^[131] Para probar si la señalización de IL-17 es funcionalmente necesaria para la remodelación metabólica epitelial inducida por ETBF, bloqueamos agudamente la actividad de IL-17 in vivo utilizando anticuerpos neutralizantes anti-IL-17 con los controles de isotipo correspondientes.^[26],^[132] En consonancia con esta hipótesis,^[103],^[104], la neutralización aguda de IL-17 atenuó notablemente la remodelación metabólica epitelial inducida por ETBF (Figura 5B). Además, el bloqueo de IL-17 redujo significativamente la colonización por ETBF in vivo (Figura 5C). En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia experimental directa de que la señalización de IL-17 es un componente necesario de un bucle de retroalimentación que vincula la inflamación, la remodelación metabólica epitelial y la persistencia de ETBF. Sin embargo, los mecanismos por los cuales ETBF desencadena la producción de IL-17 y cómo la respuesta retroalimenta para apoyar la persistencia bacteriana siguen sin estar completamente definidos.

Para abordar esta brecha, realizamos un perfilado metabolómico no dirigido de los contenidos intestinales de ratones infectados con ETBF (Figura 5D). Sorprendentemente, varios ácidos biliares primarios, el ácido cólico (CA) y el ácido quenodeoxicólico (CDCA), compuestos esteroides sintetizados en el hígado y secretados en el intestino delgado para ayudar a la digestión,^[133], se agotaron significativamente de manera dependiente de BFT (Figura 5E). Esta pérdida es poco probable que se deba a una reducción de la biosíntesis, ya que tanto la expresión génica de la biosíntesis de ácidos biliares hepáticos como los niveles de ácidos biliares permanecieron sin cambios (Figuras 5F y S9A–S9D).

De manera similar, los ácidos biliares secundarios derivados de la transformación microbiana de estos ácidos biliares primarios,^[134], incluido el ácido desoxicólico (DCA), el ácido isolitocólico (isoLCA) y el ácido tauroursodesoxicólico (UDCA), también disminuyeron notablemente (Figura 5E). La cuantificación dirigida mediante cromatografía líquida-espectrometría de tándem (LC-MS/MS) confirmó el agotamiento extenso y dependiente de BFT tanto de los ácidos biliares primarios como secundarios (Figura 5G). Cabe destacar que un subconjunto de ácidos biliares secundarios, como el ácido 3-oxolitocólico (3-oxoLCA) y el isoLCA, suprime potently la diferenciación de células TH17 intestinales y la producción resultante de IL-17^[105] al inhibir el factor de transcripción receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico γt (RORγt).^[105],^[135],^[136] Este efecto probablemente se extiende más allá de las células TH17, ya que RORγt también regula las funciones de otras células inmunitarias que expresan IL-17, incluidas las células epiteliales intraepiteliales (IEL), los linfocitos innatos y las células T γδ.^[137],^[138] Como tal, el agotamiento de estos ácidos biliares secundarios podría promover ampliamente la señalización de IL-17 a través de la activación de las células inmunitarias que expresan RORγt.

Dado el agotamiento dependiente de BFT de 3-oxoLCA e isoLCA observado durante la infección por ETBF (Figura 5G) y el papel clave de IL-17 en la patogénesis de ETBF,^[139], investigamos si el agotamiento de los ácidos biliares promueve la infección por ETBF al mejorar la inducción de IL-17. El perfilado de la expresión de IL-17 en el intestino infectado con ETBF reveló una robusta activación dependiente de BFT de las células inmunitarias que producen IL-17 y RORγt+ (Figuras 6A y 6B), que incluyen las IEL no T (TCRneg, RORγt+ e IL-17+), las células TH17 (TCRβ+, RORγt+ e IL-17+) y las células T γδ (TCRγδ+, RORγt+ e IL-17+) (Figuras 6C, 6D y S10A–S10C), en consonancia con informes anteriores.^[26],^[132],^[140] Es importante destacar que la suplementación con ácidos biliares primarios en el agua para beber redujo significativamente la producción de IL-17, particularmente en las IEL no T y las células T γδ, siendo estas últimas críticas para la patogénesis de ETBF (Figuras 6A, 6C, 6D y S10A–S10C). Además, la suplementación con ácidos biliares también suprimió la inducción de IL-17 en un modelo inflamatorio independiente de ETBF que utiliza el β-glucano fúngico curdlán y el sulfato de dextrano sódico^[113],^[141]–^[146] (Figuras S10D–S10F), lo que indica que los ácidos biliares restringen directamente las respuestas de IL-17 en lugar de afectarlas indirectamente a través de la alteración de la colonización por ETBF.

A continuación, investigamos si los ácidos biliares suprimen la infección por ETBF. En condiciones fisiológicas, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares secretados se reciclan de nuevo al hígado, mientras que aproximadamente el 5% llega al colon y se transforma microbianamente en ácidos biliares secundarios.^[147] Para imitar este contexto fisiológico, se administró a los ratones infectados con ETBF una mezcla de ácidos biliares primarios a una dosis fisiológica (5 μmol/día/kg), lo que coincide con la exposición colónica en condiciones de homeostasis.^[147] En consonancia con nuestra hipótesis, la suplementación con ácidos biliares primarios redujo notablemente la pérdida de peso, la inflamación intestinal y la colonización por patógenos asociadas con ETBF (Figuras 6E–6G). Además, la suplementación directa con ácidos biliares secundarios, específicamente 3-oxoLCA e isoLCA, atenuó robustamente la patogénesis de ETBF, lo que subraya que el agotamiento de los ácidos biliares secundarios es una estrategia de virulencia crítica de ETBF (Figuras 6E–6G y S10G). El análisis de agrupamiento a nivel de características del transcriptoma cecal demostró distintas firmas moleculares asociadas con la suplementación con ácidos biliares primarios, 3-oxoLCA e isoLCA (Figura S10H). El análisis del transcriptoma reveló además que los ácidos biliares primarios promovieron el enriquecimiento de vías relacionadas con la respiración mitocondrial y la fosforilación oxidativa, lo que se alinea con nuestra observación de la restauración de la homeostasis metabólica epitelial (Figuras S10I y S10J). Es importante destacar que la suplementación con CA, un ácido biliar primario que no produce ácidos biliares secundarios inhibidores de TH17 como isoLCA y 3-oxoLCA,^[136], no tuvo un impacto en la colonización por ETBF ni en la gravedad de la enfermedad (Figuras 6F y 6G). Esta observación apoya la hipótesis de que los efectos protectores observados están mediados específicamente por la modulación inmunitaria dependiente de los ácidos biliares secundarios en lugar de las propiedades antimicrobianas generales de los ácidos biliares.^[148]

Dado que IL-17, la principal citocina efectora de la respuesta TH17, se ha relacionado con la adaptación epitelial a la glucólisis anaeróbica,^[103],^[104],^[131], a continuación examinamos si ETBF manipula el metabolismo epitelial a través de un eje de señalización ácido biliar-IL-17, analizando los estados metabólicos de los colonocitos mediante el ensayo SCENITH. Es notable que la suplementación con ácidos biliares primarios suprimió significativamente la glucólisis en los colonocitos (Figura 6H). Además, la restauración de los niveles de ácidos biliares secundarios, ya sea mediante la suplementación con ácidos biliares primarios o secundarios, redujo la oxigenación epitelial y la acumulación de lactato en la luz intestinal (Figuras 6I y 6J). Estos tratamientos también atenuaron la diferenciación de las células T inducida por ETBF, lo que apoya la idea de que una respuesta de las células T patológica contribuye a la reprogramación metabólica epitelial (Figura S10K). En conjunto, estos hallazgos indican que ETBF explota la señalización de los ácidos biliares para reprogramar el metabolismo epitelial, facilitando así su colonización del intestino.

ETBF explota la vía de reciclaje de los ácidos biliares para agotar los ácidos biliares en el intestino

A continuación, investigamos el mecanismo por el cual ETBF promueve el agotamiento de los ácidos biliares en la luz intestinal. Dado que ETBF no alteró los niveles de ácidos biliares hepáticos ni la vía de biosíntesis (Figuras 5F y S9), esto sugiere que procesos distintos de la biosíntesis de ácidos biliares pueden estar implicados en el agotamiento observado. Dado que la mayoría de los ácidos biliares secretados se devuelven al hígado a través de la vía de reciclaje de los ácidos biliares, hipotetizamos que ETBF puede explotar esta vía para remodelar el paisaje de los ácidos biliares intestinales.^[149] En esta vía de reciclaje, el transportador de ácidos biliares SLC10A2 (familia de transportadores de solutos 10, miembro 2) media la captación de ácidos biliares en los enterocitos, tras lo cual la proteína de unión a ácidos grasos 6 (FABP6) los transporta desde el lado luminal al lado basolateral del enterocito para su reflujo al hígado a través de transportadores como el transportador de solutos orgánicos OST-α/β.^[150] El análisis transcriptómico de los tejidos cólicos de ratones infectados con ETBF reveló que ETBF reguló al alza varios componentes clave de la maquinaria de reciclaje de ácidos biliares, incluidos Slc10a2, Fabp6 y Ost-α/β (Figura 7A). Con la biosíntesis de ácidos biliares sin cambios, el reciclaje mejorado probablemente reduce la fracción de ácidos biliares que llega al colon para la conversión microbiana en ácidos biliares secundarios inmunomoduladores. Tanto las proteínas SLC10A2 como FABP6 se expresan en el intestino grueso (Figura S11A), lo que apoya la hipótesis de que ETBF promueve la recaptación de ácidos biliares mediada por el huésped para agotar los ácidos biliares secundarios y amplificar la inflamación impulsada por IL-17.

Para probar esto aún más, impedimos el reciclaje de ácidos biliares utilizando maralixibat, un inhibidor selectivo del transportador de ácidos biliares primarios SLC10A2.^[151] En comparación con el control tratado con vehículo, el tratamiento con maralixibat restauró los niveles de ácidos biliares primarios en el intestino grueso de los ratones infectados con ETBF (Figuras S11B y S11C). Coherente con nuestra hipótesis, esta intervención redujo los niveles de transcritos de Il17 y Cxcl1, marcadores de la señalización de IL-17 y la inflamación (Figuras 7B y 7C), alivió el acortamiento del colon y redujo la carga de patógenos en los animales infectados con ETBF (Figuras 7D–7F). Además, el análisis del transcriptoma cecal reveló que maralixibat redujo la expresión de genes involucrados en la señalización de los interferones y la activación de las células T γδ (Figura S11D), y se identificó una reducción más amplia de las vías de activación de las células T mediante WGCNA (Figura S11E). Es importante destacar que el secuenciamiento del ARNr 16S del contenido cecal mostró una amplificación de Firmicutes, miembros críticos conocidos de una microbiota homeostática, sin cambios significativos en la diversidad alfa o la diversidad beta entre los grupos de tratamiento (Figuras S11F–S11J), lo que indica que los efectos observados probablemente no se debieron a cambios en la microbiota. Además, ninguna de las intervenciones dirigidas al huésped alteró significativamente la abundancia de ETBF o la expresión de bft en las primeras etapas de la infección (Figura S12), lo que sugiere que la atenuación de la enfermedad refleja la modulación de las respuestas del huésped en lugar de la supresión directa del crecimiento bacteriano o la expresión de toxinas. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que ETBF manipula el reciclaje de ácidos biliares del huésped para suprimir la acumulación de ácidos biliares secundarios inmunomoduladores en el colon, amplificando así la inflamación impulsada por IL-17 y promoviendo la colonización por ETBF (Figura S13).

DISCUSIÓN

Para prosperar en el entorno competitivo del intestino, muchos patógenos entéricos despliegan factores de virulencia para remodelar el nicho intestinal, obteniendo una ventaja competitiva sobre los microbios comensales. La investigación pionera del laboratorio de Sears y otros identificó a BFT como el principal factor de virulencia de ETBF, capaz de provocar cambios profundos en la fisiología del huésped. Estos cambios incluyen la escisión de la E-caderina, la inducción de la señalización de Wnt/β-catenina y la activación del factor de transcripción STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3) en las células epiteliales del intestino.^[99],^[100],^[152] En las células inmunitarias, BFT también induce una activación robusta de STAT3, promoviendo la inducción de IL-17 en subconjuntos como TH17 y células T δγ.^[132] Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales ETBF se beneficia al orquestar estos eventos siguen sin estar claros. Aquí, mostramos que ETBF remodela el paisaje nutricional del colon al involucrar tanto los compartimentos epiteliales como los inmunitarios. BFT impulsa la hiperplasia epitelial y la acumulación de colonocitos indiferenciados y glucolíticos. Simultáneamente, activa la vía de reciclaje de ácidos biliares, reduciendo los niveles de ácidos biliares en el colon y suprimiendo una respuesta de células T patológica. La producción resultante de IL-17, a su vez, refuerza la reprogramación metabólica en los colonocitos, creando un ciclo de retroalimentación que aumenta la disponibilidad de oxígeno y lactato, dos metabolitos que mejoran la colonización por ETBF (Figura S13). Inesperadamente, BFT también regula el metabolismo de ETBF a través de mecanismos desconocidos, lo que le permite adaptarse al crecimiento en condiciones microanaeróbicas en ausencia de células del huésped.

Nuestra observación de que BFT promueve la difusión de oxígeno en la luz intestinal para alimentar la colonización por ETBF tiene varias implicaciones para la patogénesis de ETBF. En primer lugar, estas observaciones indican que ETBF, que clásicamente se considera un patógeno anaeróbico, utiliza un metabolismo respiratorio oxidativo para explotar el paisaje nutricional alterado para la colonización intestinal. Esta capacidad está parcialmente facilitada por enzimas que unen las dos ramas del ciclo de Krebs (por ejemplo, SucCD, Asct y Sdh). Junto con las deshidrogenasas de lactato respiratorias y la terminal oxidasa del citocromo bd (CydAB), ETBF probablemente ejecuta su cadena de transporte de electrones de manera más eficiente, generando más ATP y precursores biosintéticos en comparación con los microbios intestinales competidores que dependen únicamente de la fermentación anaeróbica (Figura 1).

Esta capacidad respiratoria puede explicar los hallazgos previos de que B. fragilis puede utilizar oxígeno nanomolar (nanaerobe^[65],^[72]) y parece estar mejor adaptado que otros Bacteroidetes para prosperar dentro del entorno de la mucosa. Es importante destacar que nuestros resultados sugieren que ETBF puede crecer de manera robusta en presencia de oxígeno micromolar, lo que sugiere que esta cepa patógena puede haberse adaptado metabólicamente al intestino inflamado y oxidativo. No entendemos completamente por qué ETBF exhibe una mayor tolerancia al oxígeno que NTBF. Nuestros datos sugieren que la toxina bacteriana BFT, ubicada en la isla de patogenicidad de B. fragilis (BFPAI), probablemente adquirida a través de la transferencia horizontal de genes, mejora la resistencia al oxígeno a través de una vía no caracterizada.^[79],^[153] Es importante destacar que este fenotipo es isoforma específico, ya que BFT-2 y BFT-3, pero no BFT-1, confieren una ventaja de aptitud durante el crecimiento hipóxico. La base molecular de esta actividad aún está por definirse.

Además de apoyar el metabolismo oxidativo en ETBF, el aumento del oxígeno y los ROS, que surgen tanto de las respuestas inflamatorias del huésped como de la reactividad química intrínseca del oxígeno en entornos anaeróbicos, podrían dañar las enzimas sensibles al oxígeno en los comensales anaeróbicos.^[116] Esta interrupción metabólica puede obligar a estos microbios a desviar el piruvato hacia la producción de lactato.^[45],^[117] El lactato de origen microbiano, a menudo en la forma del enantiómero D, podría contribuir al aumento de la reserva total de lactato. De manera consistente, ETBF codifica deshidrogenasas capaces de utilizar tanto el L-lactato como el D-lactato (LutABC y Ldh2, y Ldh1, respectivamente), lo que le permite explotar la reserva ampliada de lactato. Además, el aumento de los niveles de oxígeno y ROS se asocia con el agotamiento de las especies menos aerotolerantes que, de otro modo, podrían competir con ETBF por nutrientes similares o desplegar un sistema de secreción de tipo VI bactericida.^[51],^[114],^[153]–^[155] Por lo tanto, al esculpir un nicho oxidativo, ETBF alimenta su propio crecimiento y suprime a sus competidores microbianos. Es importante destacar que este programa metabólico distinto podría utilizarse potencialmente para atacar y eliminar selectivamente a ETBF. Por ejemplo, previamente explotamos la dependencia del cofactor de molibdeno de Enterobacteriaceae y utilizamos tungstato para inhibir selectivamente su expansión inflamatoria.^[156] De manera similar, atacar la dependencia de ETBF en los colonocitos metabólicamente reprogramados podría limitar su persistencia en el intestino (Figura 3).

El eje de señalización ácido biliar-IL-17 también ofrece un punto de entrada terapéutico potencial. Sin embargo, dados los amplios papeles fisiológicos tanto de los ácidos biliares primarios como secundarios, incluido el control de la integridad de la barrera intestinal,^[157], las respuestas de curación de heridas,^[158], las funciones del sistema inmunitario,^[105] y la composición de la microbiota intestinal,^[134], las estrategias para restaurar la homeostasis de los ácidos biliares deben abordarse con cautela. Estos amplios impactos de los ácidos biliares en la fisiología intestinal probablemente contribuyen al modesto impacto fenotípico observado con maralixibat, un inhibidor selectivo de la vía de reciclaje de ácidos biliares (Figura 7). Por ejemplo, la inhibición excesiva de la reabsorción de ácidos biliares podría conducir a la acumulación de DCA, un ácido biliar secundario conocido por alterar la curación de heridas epiteliales del colon.^[158],^[159] Esto podría, paradójicamente, exacerbar la infección por ETBF al comprometer aún más la integridad epitelial y mejorar el acceso bacteriano a la lámina propia. Estos hallazgos subrayan la necesidad de explorar estrategias de combinación, como el emparejamiento de maralixibat con agentes que promueven la reparación epitelial, para optimizar la eficacia terapéutica contra la infección por ETBF y minimizar las alteraciones fisiológicas no deseadas.

En resumen, este trabajo revela un vínculo previamente poco apreciado entre el metabolismo de los ácidos biliares, la respuesta de IL-17 y el metabolismo de los colonocitos. Establecemos una interacción cruzada mecanicista entre el patógeno entérico ETBF y el metabolismo de los colonocitos en el contexto de la inflamación del colon, revelando cómo la reprogramación metabólica de los colonocitos impulsada por toxinas crea un nicho oxidativo que respalda la colonización selectiva por ETBF en el intestino inflamado (Figura S13).

Limitaciones del estudio

Aunque la capacidad de ETBF para el metabolismo oxidativo mejora su adaptación durante la inflamación, conserva la capacidad de fermentar glicanos complejos.^[160] Esta flexibilidad metabólica probablemente contribuye al fenotipo in vivo significativo, pero relativamente modesto, observado cuando se interrumpieron los componentes clave del metabolismo oxidativo de ETBF (Figura 2). Estos efectos pueden haberse visto aún más atenuados por una limitación clave de nuestro estudio: la necesidad de utilizar antibióticos para permitir una colonización consistente y robusta de ETBF.^[26],^[34] El tratamiento con antibióticos agota la microbiota residente, lo que podría abrir nichos nutricionales que normalmente están ocupados. Esta alteración ecológica también podría liberar fuentes de nutrientes alternativas, enmascarando así las contribuciones específicas del oxígeno y el lactato (metabolitos elevados a través de la reprogramación metabólica del huésped mediada por BFT) a la adaptación de ETBF. Aunque el modelo murino actual nos permitió analizar el papel del metabolismo oxidativo en la patogénesis de ETBF, el desarrollo futuro de modelos de colonización sin antibióticos podría ofrecer un marco más fisiológicamente relevante para descubrir todo el espectro de estrategias metabólicas que ETBF emplea para colonizar el intestino inflamado. Finalmente, aunque demostramos que BFT permite inesperadamente el crecimiento de ETBF en condiciones microanaeróbicas en ausencia de células del huésped, el mecanismo molecular subyacente a este efecto intrínseco a la bacteria aún debe ser dilucidado.

Limitaciones del estudio

Aunque la capacidad de ETBF para el metabolismo oxidativo mejora su adaptación durante la inflamación, conserva la capacidad de fermentar glicanos complejos.^[160] Esta flexibilidad metabólica probablemente contribuye al fenotipo in vivo significativo, pero relativamente modesto, observado cuando se interrumpieron los componentes clave del metabolismo oxidativo de ETBF (Figura 2). Estos efectos pueden haberse visto aún más atenuados por una limitación clave de nuestro estudio: la necesidad de utilizar antibióticos para permitir una colonización consistente y robusta de ETBF.^[26],^[34] El tratamiento con antibióticos agota la microbiota residente, lo que podría abrir nichos nutricionales que normalmente están ocupados. Esta alteración ecológica también podría liberar fuentes de nutrientes alternativas, enmascarando así las contribuciones específicas del oxígeno y el lactato (metabolitos elevados a través de la reprogramación metabólica del huésped mediada por BFT) a la adaptación de ETBF. Aunque el modelo murino actual nos permitió analizar el papel del metabolismo oxidativo en la patogénesis de ETBF, el desarrollo futuro de modelos de colonización sin antibióticos podría ofrecer un marco más fisiológicamente relevante para descubrir todo el espectro de estrategias metabólicas que ETBF emplea para colonizar el intestino inflamado. Finalmente, aunque demostramos que BFT permite inesperadamente el crecimiento de ETBF en condiciones microanaeróbicas en ausencia de células del huésped, el mecanismo molecular subyacente a este efecto intrínseco a la bacteria aún debe ser dilucidado.

DISPONIBILIDAD DE RECURSOS

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, diríjase al contacto principal, Wenhan Zhu (Wenhan.zhu@vumc.org), quien se encargará de atender las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Todos los materiales únicos generados en este estudio están disponibles a través del contacto principal.

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MÉTODOS ESTANDARIZADOS (STAR★METHODS)

DETALLES DEL MÉTODO

Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento, ensayo de competencia in vitro y ensayo de ATP

La cepa enterotoxigénica de Bacteroides fragilis (ETBF) 86-5443-2-2 y la cepa isogénica Δbft son un generoso regalo del Dr. Cynthia Sears.^[30]
Las cepas B. fragilis 1284, YCH46, J38-1, I1345, CL03T12C07, CL05T12C13 y CL07T12C05 son un generoso regalo del Dr. Laurie Comstock. Todos los aislados clínicos de B. fragilis se obtuvieron en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (VUMC).

La cepa ETBF 86-5443-2-2 y las cepas no toxigénicas de Bacteroides fragilis (NTBF) indicadas se cultivaron anaeróbicamente (90% N2, 5% CO2, 5% H2; cámara anaeróbica de vinilo, Coy Lab) en medio de infusión de cerebro y corazón suplementado (BHIS) (0,8% de infusión de cerebro y corazón sólida, 0,5% de digestión peptídica de tejido animal, 1,6% de digestión pancreática de caseína, 0,5% de cloruro de sodio, 0,2% de glucosa, 0,25% de fosfato de disodio, 0,005% de hemina, 0,0001% de vitamina K, pH 7,4) o en placas BHIS (caldo BHIS, 15 g/L de agar) que contienen 50 μg/mL de gentamicina (Gen) durante 2 días a 37 °C. Cuando fue apropiado, las placas y los medios de agar se suplementaron con 20 μg/mL de anidrotetraciclina (aTc), 20 μg/mL de cefoxitina (Cfx), 50 μg/mL de kanamicina (Kan), 25 μg/mL de eritromicina (Erm), 25 μg/mL de clindamicina (Clin) o 200 μg/mL de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR).

Para el crecimiento microaeróbico, colonias individuales de las cepas indicadas se cultivaron anaeróbicamente durante 24 horas en BHIS antes de subcultivarlas en un medio semidefinido modificado (SDM)^[181] (1,5 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NH4SO4, 0,9 g/L de NaCl, 150 mg/L de L-metionina, 5 μg/L de vitamina B12, 1 mg/L de resazurina, 1 g/L de triptona, 0,2% de NaHCO3, 0,005% de protoporfirina IX) suplementado con 1 mM de lactato. Las culturas se inocularon a una densidad de (2,5 x 104 UFC) en una atmósfera microaeróbica abierta que contenía 1-10 μM de O2 (0,1-1% de O2, 5% de CO2, 2,5% de H2; sistema de hipoxia in vitro, Coy Lab) y se incubaron a 37 °C durante un máximo de 72 horas.

Para los ensayos de competencia in vitro, las cepas de tipo salvaje y mutantes de ETBF o NTBF se cultivaron como se describió anteriormente. Las culturas se mezclaron en una proporción de 1:1 y se co-inocularon en SDM en condiciones microaeróbicas (0,1-1% de O2). Después de 24 horas de incubación, las culturas se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar BHIS selectivo que contenían los antibióticos apropiados. Las placas se incubaron anaeróbicamente a 37 °C durante 48 h, después de lo cual se enumeraron las unidades formadoras de colonias (UFC) de cada cepa.

Para el ensayo de ATP, colonias individuales se cultivaron en SDM anaeróbicamente antes de subcultivarlas en SDM suplementado con lactato en una atmósfera microaeróbica (0,1% de O2) durante 16 horas. Se utilizaron de 2,5 x 106 a 2,5 x 107 células para analizar la concentración de ATP utilizando un kit de determinación de ATP (kit de ensayo de viabilidad microbiana BacTiter-Glo, Promega). La luminiscencia de la muestra se leyó utilizando placas de pocillos blancos en un lector de placas BioTek H1 y se comparó con una curva estándar de concentraciones de ATP conocidas.

Las cepas de E. coli se cultivaron rutinariamente en caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio) o en placas LB (caldo LB, 15 g/L de agar) a 37 °C suplementado con 100 μg/mL de carbenicilina.

Plásmidos

Todos los cebadores y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave. Los plásmidos suicidas se propagaron rutinariamente en E. coli S17 λpir. Las regiones flanqueantes de los genes de interés de la cepa ETBF 086-5443-2-2 cydAB, lutABC, ldh1, ldh2, asct, sucAB, sucCD se amplificaron y se ensamblaron en pETBF-Exchange-tdk (pEET) utilizando el kit de clonación por ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston) para generar pRF237, pRF231, pML102, pML108, pML191, pRF317 y pRF247, respectivamente.

El marco de lectura BFT-2 junto con la región promotora nativa de 700 pb de B. fragilis cepa 86-5443-2-2 se amplificó y se ensambló en los vectores integrativos pNBU2-CmR o pNBU2-CfxR utilizando el ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston), generando los plásmidos pYW283 y pYW279, respectivamente.

De manera similar, BFT-1 junto con la región promotora nativa de 700 pb de B. fragilis cepa J38-1 se amplificó y se ensambló en pNBU2-CfxR para generar pYW827. El fragmento promotor-ORF correspondiente de BFT-3 de B. fragilis cepa Korea 570 se ensambló en pNBU2-CfxR, lo que dio como resultado pYW823.

Para los estudios de expresión inducible, el vector de integración pNBU2CmR-TetR-P1TDP-GH023 que contiene el promotor inducible de anidrotetraciclina (aTc) P1TDP se propagó rutinariamente en E. coli S17 λpir. El ORF de BFT-2 de B. fragilis cepa 86-5443-2-2 se amplificó y se ensambló mediante el ensamblaje de Gibson en pNBU2catP-TetR-P1TDP-GH023, un derivado de pNBU2erm-tetR-P1T_DP-GH023^[80], generando pYW508.

Construcción de mutantes mediante intercambio alélico

Todas las cepas mutantes bacterianas construidas utilizando el método que se describe a continuación se enumeran en la tabla de recursos clave. Para los mutantes de ETBF, el plásmido suicida pEET que contiene las regiones flanqueantes de los genes de interés se conjugó utilizando E. coli S17-1 λpir como la cepa donante conjugativa en el ETBF. Los exconjugantes con el plásmido suicida integrado en el cromosoma del receptor se seleccionaron en placas BHIS suplementadas con los antibióticos apropiados. Las placas de 5-fluoro-2-desoxiuridina (FudR, 200 μg/mL en BHIS) se utilizaron para seleccionar el segundo evento de cruce.

Análisis filogenético de los genes involucrados en el metabolismo oxidativo central

Las anotaciones del genoma RefSeq se descargaron utilizando la herramienta de línea de comandos NCBI Datasets^[177] (v16.40.1) el 8 de abril de 2025. Se descargaron los ensamblajes completos de Bacteroides fragilis, Phocaeicola vulgatus, Bacteroides uniformis, Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides caccae, Bacteroides salyersiae, Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides cellulosilyticus y Phocaeicola dorei, así como los ensamblajes de andamios de Hoylesella oralis, Bacteroides acidifaciens y Bacteroides nordii, que se utilizaron debido a la falta de ensamblajes completos. Se utilizó solo la última versión del ensamblaje y se excluyeron los genomas ensamblados a partir de metagenomas, los ensamblajes de proyectos grandes de múltiples aislados y los ensamblajes atípicos. Las secuencias de proteínas anotadas se utilizaron como entrada para Orthofinder^[178] (v3.0.1b1), que produjo la filogenia y las llamadas de presencia/ausencia para cada ortogrupo. Se utilizó ggtree^[175] (v3.16.0) para generar una filogenia de las especies.

Experimentos con animales

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt. Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje (cat# 000664) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor) y se alojaron en jaulas estériles en condiciones libres de patógenos específicos en un ciclo de luz de 12 horas, con acceso ad libitum a alimentos y agua estéril en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.

Tres semanas después, ratones machos y hembras se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento antes del experimento. Para permitir una colonización estable de B. fragilis, los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días (a partir del día 0), seguido de clindamicina sola durante 2 días adicionales. El día 4, se retiraron los antibióticos y los ratones se devolvieron al agua estéril.

Para los experimentos de colonización única con Bacteroides fragilis enterotoxigénico (ETBF), los ratones se inocularon por vía oral el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada o se dejaron sin inocular como controles. Para los experimentos de colonización competitiva, los ratones se inocularon con una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada y 0,5 × 109 UFC de la cepa mutante correspondiente.

Para los modelos de colonización con Bacteroides fragilis no toxigénico (NTBF), los ratones se sometieron al mismo régimen de pretratamiento con antibióticos y se inocularon el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa NTBF indicada o se dejaron sin inocular. En los experimentos de colonización competitiva, los ratones recibieron una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF y 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF o ETBF indicada, según se especificó. Los animales se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados.

Para la neutralización aguda de IL-17, los ratones se pretrataron con antibióticos como se describió anteriormente. El día 4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 500 μg por animal de anticuerpo anti-IL-17A de ratón (bioXcell) o un control de IgG1 de ratón con coincidencia de isotipo (bioXcell), como se describió anteriormente.^[26],^[171]

Veinticuatro horas después, los ratones se inocularon intragástricamente con 1 × 109 UFC de ETBF de tipo salvaje. El día 6, los ratones recibieron una segunda inyección intraperitoneal de anticuerpo anti-IL-17A o control de isotipo a la misma dosis. Los animales se sacrificaron el día 7.

Para el modelo de tumorigénesis, ratones ApcMin macho y hembra de tres semanas de edad, junto con sus controles de la misma camada, fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento antes del experimento. Los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días, seguida de clindamicina sola durante 2 días adicionales para permitir una colonización estable de Bacteroides fragilis. El día 4, los antibióticos se cambiaron por agua de beber estéril. El día 5, los ratones fueron inoculados con 1 x 109 UFC de las cepas ETBF indicadas o se dejaron sin inocular, seguido de una dosis única de tratamiento con tributirina. Doce semanas después de la infección, los animales fueron sacrificados, el tejido cólico se fijó con 4% de paraformaldehído y se cuantificó la incidencia de tumores.

Para el aislamiento de vesículas de membrana externa bacteriana (OMV) y la administración in vivo, se cultivaron colonias individuales de ETBF de tipo salvaje o de la mutante isogénica Δbft de forma anaeróbica durante 24 h en BHIS. La fracción de la capa densa en electrones se aisló mediante centrifugación de gradiente de densidad, como se describió anteriormente^[182], y posteriormente se subcultivó en SDM modificado. Las culturas se cultivaron de forma anaeróbica durante 16 h adicionales.

Las culturas bacterianas se centrifugaron a 5.000 × g durante 15 min a 4 °C, y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de polietetersulfona (PES) de 0,22 μm (Pall Corporation) para eliminar las células y los restos. Las OMV se precipitaron mediante ultracentrifugación a 150.000 × g durante 2 h a 4 °C utilizando un rotor Beckman 45 Ti. Las preparaciones de OMV se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante el contenido total de proteínas utilizando un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las OMV se normalizaron a 40 μg de proteína total por 100 μL de PBS para la administración in vivo, como se describió anteriormente.^[183]

Para administrar BFT in vivo a través de OMV, los ratones se pretrataron con estreptomicina (5 mg/mL) y clindamicina (0,1 mg/mL) en el agua de beber durante 2 días, seguida de clindamicina sola durante 2 días adicionales. El día 5, los ratones fueron inoculados intragástricamente con 1 × 109 UFC de ETBF de tipo salvaje o ETBF Δbft. A partir del día 6, los ratones recibieron OMV por gavage oral dos veces al día durante 4 días consecutivos.

Para inducir respuestas intestinales de IL-17 independientes de ETBF, ratones hembra de siete semanas de edad fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Los ratones recibieron gavage oral de curdlan (Sigma-Aldrich) a 10 mg/mL en vehículo (100 μL por ratón) o vehículo solo (glucosa al 5%; Fisher Chemical) una vez al día durante 14 días antes de la inducción de la colitis. A continuación, se administró sulfato de dextrano (DSS; Thermo Scientific) al 2,5% (p/v) en el agua de beber durante 5 días, preparando una solución fresca de DSS diariamente.^[113],^[141]–^[146] Después del tratamiento con DSS, los ratones recibieron 2 mM de sales biliares (Sigma-Aldrich) en el agua de beber o agua estéril durante 5 días adicionales.

Para todos los experimentos, los ratones fueron sacrificados humanamente en los puntos temporales indicados. Después del sacrificio, se recogieron tejidos de hígado, ciego y colon, se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C para el análisis posterior de ARNm o se fijaron en formalina al 10% para el análisis histopatológico. Para la metabolómica no dirigida, se recogieron los contenidos del ciego y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se almacenaron a −80 °C hasta que se extrajeron los metabolitos. Para la cuantificación dependiente del cultivo de la carga bacteriana, se recogieron los contenidos del colon y del ciego en PBS estéril, y se cuantificó la carga de ETBF mediante la siembra de contenidos intestinales diluidos en serie en agar selectivo.

Selección híbrida-RNAseq

Grupos de C57BL/6 fueron desafiados con la cepa ETBF de tipo salvaje o la mutante isogénica Δbft como se describió anteriormente. Después del sacrificio, las muestras del ciego se lisaron inmediatamente después de la recolección en 500 μl de tampón (0,2 M de NaCl y 20 mM de EDTA), 210 μl de SDS al 20% y 500 μl de mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico utilizando Lysing Matrix B. Se extrajo y purificó el ARN total de tres sitios por ratón (tejido intestinal, capa mucosa y contenidos luminales) de ocho ratones (24 muestras biológicas en total) utilizando el RNeasy Mini Kit.

El ARN se utilizó para generar bibliotecas de cDNA de Illumina utilizando una versión modificada del protocolo RNAtag-seq.^[184],^[185] Brevemente, el ARN se fragmentó, se eliminó el ADN genómico, se desfosforiló y se ligó a adaptadores de ADN que contienen códigos de barras 5′-AN8-3′ de secuencia conocida con un grupo fosfato 5′ y un grupo bloqueador 3′. Para garantizar un material de entrada suficiente para la captura híbrida, las bibliotecas se generaron utilizando 2,25 μg de ARN total por muestra, divididas en 9 réplicas técnicas procesadas en paralelo. Los ARN con códigos de barras de cuatro muestras biológicas se combinaron en cada grupo. El ARN agrupado se sometió a la eliminación de ARNr utilizando el Human RiboCop rRNA Depletion Kit (Lexogen, Cat. No. 144), seguido de la transcripción inversa utilizando un cebador que se dirige a la región constante del adaptador con código de barras, con la adición de un adaptador 3′ mediante el cambio de plantilla (SMARTScribe, Clontech).^[186] El cDNA se enriqueció mediante PCR durante 14 ciclos utilizando cebadores que se dirigen a las regiones constantes de los adaptadores con secuencias Illumina P5/P7 unidas que contienen índices únicos por grupo. Los cDNA de los grupos de réplicas generados en paralelo se combinaron y se concentraron y se utilizaron como entrada para el enriquecimiento. El rendimiento del grupo de bibliotecas después de 14 ciclos de PCR osciló entre 350 (mucosa, ETBF Δbft) y 1.600 ng (lumen, ETBF WT). Estas bibliotecas indexadas amplificadas que contienen muestras con códigos de barras se sometieron a un enriquecimiento de captura híbrida como se describe a continuación.

El enriquecimiento de secuencias de ETBF utilizando un panel de captura personalizado y reactivos de hibridación y lavado v1 (Twist Biosciences) se realizó en 6 reacciones de captura separadas, cada una de las cuales contenía aproximadamente 250 ng de grupo de biblioteca RNAtag pre-captura. Seguimos las instrucciones del fabricante, excepto que agregamos 5 μg de ADN Cot-1 de ratón (Thermo Fisher) en lugar de la solución bloqueadora humana a la hibridación y utilizamos HiFi HotStart ReadyMix (Roche) para la amplificación por PCR de la captura. Para determinar empíricamente el número mínimo de ciclos para generar cantidades aproximadamente iguales de producto de PCR a pesar de las diferentes cantidades de ETBF en los tres sitios intestinales (mayor en el lumen, menor en el tejido) y ETBF WT (mayor) frente a ETBF Δbft (menor), realizamos reacciones de PCR a pequeña escala de 10 μl a partir de 2 μl de lechada de cuentas de captura con 8, 12 o 16 ciclos. El número de ciclos de PCR necesarios para generar ~100 fmol de cada biblioteca de captura a partir de 25 μl de lechada de cuentas osciló entre 5 (ETBF WT en el lumen) y 11 (tejido).

Los grupos de RNAtag pre-captura se secuenciaron en dos carriles Illumina NovaSeq S4 a una profundidad promedio de 9,4 x 108 pares de lecturas por muestra. Las bibliotecas de captura se secuenciaron en un carril a una profundidad promedio de 4,8 x 108 pares de lecturas por muestra. Las lecturas de secuenciación generadas están disponibles en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de acceso PRJNA1269620.

Análisis de los datos de selección híbrida-RNAseq

Las lecturas de secuenciación de cada muestra en un grupo se desmultiplexaron en función de su secuencia de código de barras asociada utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/splitmergepl). Se permitió hasta 1 desajuste en el código de barras, siempre que no permitiera la asignación de la lectura a un código de barras diferente. Las secuencias de código de barras se eliminaron de la primera lectura y los G terminales de la segunda lectura que pudieron haberse agregado por SMARTScribe durante el cambio de plantilla.

Las lecturas derivadas de B. fragilis se alinearon a la secuencia de referencia GCF 023702735.1 ASM2370273v1 utilizando BWA^[187] y se asignaron los recuentos de lecturas a los genes anotados de RefSeq y a otras características genómicas utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/BactRNASeqCount). Las lecturas derivadas del ratón se alinearon a la secuencia Mus musculus Ensembl GRCm38r94p6 mm10 utilizando bbmap37.10 (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/) y se asignaron los recuentos de lecturas a los transcritos anotados utilizando Salmon0.8.2.^[188]

El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2^[174] y/o edgeR.^[189] La visualización de los datos de secuenciación sin procesar y los gráficos de cobertura en el contexto de las secuencias del genoma y las anotaciones de los genes se realizó utilizando GenomeView.^[190]

Cuantificación dirigida de los niveles de ARNm en el tejido y los contenidos intestinales

El tejido del colon o del ciego se homogeneizó en un homogeneizador de cuentas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies) y se extrajo el ARN utilizando el reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati). El ARN total del ciego o del contenido del colon se extrajo utilizando el RNeasy PowerFecal Pro Kit (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. La contaminación por ADN se eliminó utilizando el Turbo DNA-free Kit (Ambion, USA) según las recomendaciones del fabricante. El cDNA se generó mediante el SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, USA). La PCR en tiempo real se realizó utilizando PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem, USA), y los datos se adquirieron en un CFX Maestro 2.3 (Bio-Rad, USA). La transcripción del gen diana de cada muestra se normalizó a los niveles de ARNm de Gapdh (huésped) o mp2 (ETBF).

Análisis de Western blot de la expresión de FABP6 y SLC10A2 en el tejido intestinal

Las proteínas del colon se extrajeron utilizando un tampón de lisis RIPA. Para cada 5 mg de tejido, se agregaron 600 μL de tampón de lisis frío y las muestras se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de cuentas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies). Los lisados se agitaron durante 2 horas a 4 °C y luego se centrifugaron a 16.000 g durante 20 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek Instruments).

Las muestras se hirvieron a 95 °C durante 1 minuto y se resolvieron 50 μg de proteína total por muestra en geles prefundidos TGX del 4 al 20% (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilo (PVDF) mediante transferencia húmeda (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en TBS que contiene 3% de leche seca descremada y 0,1% de Tween-20, y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra FABP6 y SLC10A2. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con IRDye apropiados durante 1 hora a temperatura ambiente y se escanearon utilizando un escáner de Western blot Odyssey (LICORbio). Los niveles de expresión relativos se cuantificaron utilizando ImageJ, con un ajuste uniforme de los niveles de brillo entre las muestras.

Aislamiento de colonocitos

El colon y el ciego de los animales infectados con ETBF se retiraron y se mantuvieron en hielo en RPMI que contiene 10% de FBS. Los contenidos luminales se lavaron con HBSS + 5% de FBS + 2 mM de EDTA. A continuación, se cortó el colon y el ciego longitudinalmente y en trozos más pequeños, se colocaron en un medio HBSS que contiene 5% de FBS, 2 mM de EDTA y 1,5 mM de DTT, y se agitaron a 37 °C durante 50 minutos a 150 rpm. Después de la incubación, se separó el sobrenadante y el tejido, y el sobrenadante se filtró y se centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. El resultado de la centrifugación se resuspendió en HBSS que contiene 5% de FBS y 2 mM de EDTA y se mantuvo en hielo. El tejido se digirió en HBSS (contiene Ca2+ y Mg2+) suplementado con colagenasa (1,5 mg/mL) y DNasa I (1000X). Después de agitar durante 25 minutos a 100 rpm, se añadió HBSS que contiene 5% de FBS y 2 mM de EDTA para detener la digestión, el tejido restante se filtró utilizando un filtro celular y las células digeridas se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. Después de la centrifugación, las dos poblaciones de células (del sobrenadante y del tejido) se combinaron y se purificaron aún más utilizando la centrifugación del gradiente de Percoll. Se recogieron las células en la interfaz de la capa del 40% y del 70%, se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C, se lavaron utilizando RPMI que contiene 10% de FBS y, finalmente, se resuspendieron en 500 μL del mismo medio. Se cuantificó el recuento y la viabilidad de las células utilizando un contador de células Countess 3 (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo SCENITH

Se sembraron células a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml en medio RPMI que contenía un 10% de FBS en placas de 96 pocillos y se incubaron en un incubador de CO₂ a 37 °C durante 1 hora. Los pocillos se trataron con DMSO (control), 2-Desoxi-D-glucosa (DG, concentración final de 250 mM) u Oligomicina (Oligo, concentración final de 1 μM). Se añadió puromicina (concentración final de 10 μg/ml) y las células se devolvieron al incubador durante 20 minutos. Después del tratamiento con puromicina, las células se lavaron con PBS frío y se tiñeron con una mezcla de anticuerpos en una proporción de 1:100, que incluía anti-CD326-APC, CD45 RED Fluo 710 y TCR gamma/delta Fluo 450, durante 30 minutos a 4 °C en PBS, 5% de FCS y 2 mM de EDTA (tampón de lavado para FACS). Después del lavado con PBS frío, se añadió tinte de viabilidad (BV510) en una proporción de 1:100 en tampón para FACS, y las células se incubaron a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron en tampón para FACS y se fijaron y permeabilizaron utilizando el tampón de fijación y permeabilización FOXP3 (Thermofisher eBioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante. La tinción intracelular de puromicina se realizó incubando las células durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-puromicina (PE) 1:100 en tampón de permeabilización. Después del lavado, las células se resuspendieron en 250 ml de tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS) y se transfirieron a tubos para FACS, y los datos se adquirieron utilizando Fortessa (BD Biosciences). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (BD Biosciences).### Perfilado de células inmunitarias productoras de IL-17

Se sembraron entre 100.000 y 500.000 células por pocillo en 200 μl/pocillo de tampón de estimulación (RPMI que contiene 10% de FBS, 0,67 μl/ml de inhibidor del transportador de proteínas GolgiStop, 500 μg/ml de ionomicina, 25 μg/ml de 12-miristoato de forbol 13-acetato (PMA)) en placas de 96 pocillos, y se incubaron en un incubador de CO₂ a 37 °C durante 4 horas. Las células se tiñeron con anticuerpos biotinilados TCR γ/δ 1:100 en tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS), y se incubaron durante 25 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron e incubaron con una mezcla de anticuerpos en una proporción de 1:100, que incluía Streptavidina PE610, CD45 PECy7 y TCRβ APC Cy7, durante 25 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con PBS frío y se añadió tinte de viabilidad (BV510) en una proporción de 1:100 en tampón para FACS. Las células se incubaron a continuación a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron en tampón para FACS, se fijaron y se permeabilizaron utilizando el tampón de fijación y permeabilización FOXP3 (Thermo Fisher eBioscience). Las células se lavaron con 150 μl/pocillo de tampón Perm-Wash (Thermo Fisher eBioscience) y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 40 minutos con una mezcla de anticuerpos intracelulares en tampón Perm-Wash. Después de la incubación, las células se lavaron con tampón Perm-Wash, seguido de un segundo lavado en tampón para FACS. Finalmente, las células se resuspendieron en 200 μl de tampón para FACS y se transfirieron a tubos para FACS para su adquisición en un citómetro de flujo. Los datos se adquirieron utilizando Fortessa (BD Biosciences) y los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (BD Biosciences).### Histopatología

Se fijaron tejidos cecales y cólicos en formaldehído tamponado con fosfato durante 48 horas y se incluyeron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones teñidas se codificaron y se evaluaron utilizando los mismos criterios que se indican en la Tabla S1.### Tinción para hipoxia

A ratones infectados con ETBF con el tratamiento indicado se les inyectó por vía peritoneal con 60 mg/kg de pimonidazol (Hypoxyprobe) 30 minutos antes de la eutanasia. Después de la eutanasia, se recogieron las muestras como se describe anteriormente y se fijaron en formaldehído al 10%. Los tejidos se incluyeron, seccionaron y se montaron en portaobjetos. Las secciones de tejido cecal y cólico se desparafinarizaron e incubaron durante 10 minutos a 37 °C con 200 ml de solución de proteinasa K (New England Biolabs) en tampón TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH = 8,0). Las secciones se lavaron en PBS y se bloquearon durante 1 hora a 4 °C con 150 ml de reactivo de bloqueo de IgG de ratón M.O.M (Vector Laboratories). Las muestras se incubaron con 100 μl de antisueros de conejo α-pimonidazol (Hypoxyprobe) en una proporción de 1:100 durante la noche a 4 °C. Las muestras se lavaron en PBS y se incubaron con 100 μl de anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 (Cell Signaling, 1:150) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, las secciones se contratiñeron con Hoechst durante 5 minutos, seguido de lavados adicionales con PBS y montaje. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en mosaico (5 × 5 campos, 15% de superposición) con un microscopio de fluorescencia Nikon ECLIPSE Ti-2 con un objetivo de 20x y el sistema Perfect Focus habilitado. El empalme de imágenes se realizó en tiempo real utilizando NIS-Elements (versión 6.10.01). Las regiones de interés (ROI) se seleccionaron manualmente para excluir la lámina propia bien oxigenada. La intensidad de la tinción de pimonidazol dentro de cada ROI se normalizó a la señal de Hoechst en la misma región para obtener la intensidad de tinción de hipoxia normalizada.### Cuantificación de lactato

Se recogieron los contenidos del colon y del ciego de ratones infectados con ETBF en PBS estéril. Los contenidos se pesaron, se diluyeron con PBS 1x hasta una densidad final de 40 mg/ml y se homogeneizaron mediante una suave agitación en un baño de hielo a 5 °C. Se eliminaron los residuos insolubles mediante centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos a 5 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -20 °C hasta el día del análisis.

El lactato y un estándar interno de lactato-13C3 (Cambridge Isotopes) se derivatizaron con el reactivo dansilhidrazina y el agente activador de carboxilo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a sus correspondientes derivados de dansilhidrazona en un tampón acuoso de fosfato 250 mM a pH 4 que contiene 40% (v/v) de acetonitrilo. Brevemente, se tomaron alícuotas de 20 μl de los extractos descongelados y se añadieron 5 nmol de lactato-d3, se diluyeron 1:7 con el tampón de derivatización descrito anteriormente y se derivatizaron a temperatura ambiente con la adición de dansilhidrazina (25 μl x 50 mg/ml en acetonitrilo) y EDC (25 μl x 150 mg/ml en agua). Después de una hora a temperatura ambiente, se añadieron 25 μl de agua que contenía 5% (v/v) de TFA para apagar las reacciones. Después de la centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos a 5 °C, las mezclas de reacción apagadas se transfirieron a viales de muestra de 2 ml equipados con insertos de polipropileno de bajo volumen y septos de goma revestidos de teflón. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μl. Los estándares de calibración se prepararon en PBS 1x y se derivatizaron de la misma manera. El análisis LC-MS/MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas cuádruple de tres etapas Thermo TSQ Quantum acoplado a un sistema UPLC Waters Acquity. El espectrómetro de masas se operó en modo de iones positivos, con detección mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM) utilizando las siguientes transiciones: lactato, 338 → 170, CE 27; lactato-13C3, 341 → 170, CE 27. Se utilizaron los siguientes parámetros del analizador y de la fuente ESI para la detección del analito y del estándar interno: ancho de pico Q1 0,7 Da (FWHM), ancho de barrido Q3 2 Da, voltaje de pulverización 4 kV, temperatura del capilar 300 °C, lente del tubo 120, gas de nitrógeno de la vaina 50; gas auxiliar de nitrógeno 10; CID en la fuente 12. La adquisición de datos y el análisis espectral cuantitativo se realizaron utilizando Thermo Xcalibur versión 2.0.7 SP1 y Thermo LCQuan versión 2.7, respectivamente. Se construyeron curvas de calibración trazando las áreas de los picos frente a las concentraciones de los analitos para una serie de diez estándares de calibración, que abarcan de 0,10 a 1000 nmol totales de lactato. Se aplicó un factor de ponderación de 1/C2 en el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados para mantener la homogeneidad de la varianza en todo el rango de concentración. Se utilizó una columna analítica de fase inversa Waters Acquity BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) para todas las separaciones cromatográficas. Las fases móviles se compusieron de 0,2% de HCOOH + 10 mM de formiato de amonio en (A) agua y en (B) acetonitrilo/metanol (9:1). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-1,0 min, B = 5%; 1-8 min, B = 5-100%; 8-9,5 min, B = 100%; 9,5-10 min, B = 100-5%; 10-15 min, B = 5%. La velocidad de flujo se mantuvo en 300 μl/min y el tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 15 min. Se utilizó una válvula de derivación controlada por software para transferir el eluyente de LC del tiempo 0 al 3 min y del tiempo 5,5 al 15 min de cada ciclo cromatográfico a los residuos.### Metabolómica no dirigida

Las muestras se almacenaron a −80 °C hasta que se analizaron mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas tándem de alta resolución (LC-HRMS y LC-HRMS/MS) para realizar estudios metabolómicos en el Centro de Tecnología Innovadora (CIT) de Vanderbilt, utilizando métodos descritos previamente.^[192]–^[194] Brevemente, las muestras congeladas del contenido intestinal de ratón (n=8, 4 réplicas biológicas para cada grupo de muestras) se lisaron en 1 ml de tampón de lisis frío (1:1:2, v:v:v, acetonitrilo: metanol: bicarbonato amónico 0,1 M - pH 8,0) y se sometieron a sonicación individualmente utilizando un sonicador de punta de sonda al 50% de potencia (10 pulsos). Las muestras homogeneizadas se normalizaron por peso para obtener una cantidad igual por muestra. Las proteínas se precipitaron de las muestras individuales añadiendo 800 μL de metanol frío y, a continuación, se incubaron durante la noche a −80 °C. Las proteínas precipitadas se centrifugaron (15.000 rpm, 15 min) y los extractos de metabolitos se secaron al vacío.

Los extractos individuales se reconstituieron en 100 μl de acetonitrilo/agua (3:97, v:v) con 0,1% de ácido fórmico que contenía carnitina-D9, triptófano-D3, valina-D8 e inosina-4N15 marcados isotópicamente, y se centrifugaron durante 5 min a 10.000 rpm para eliminar el material insoluble. Se preparó una muestra de control de calidad agrupada (pooled QC) mezclando volúmenes iguales de muestras individuales. La muestra de control de calidad agrupada se utilizó para el acondicionamiento de la columna (8 inyecciones antes del análisis de la muestra), la alineación del tiempo de retención y para evaluar la reproducibilidad del instrumento de espectrometría de masas en todo el conjunto de muestras.

Se realizaron análisis de espectrometría de masas globales y no dirigidos en un espectrómetro de masas híbrido de cuadrupolo-Orbitrap de alta resolución Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) equipado con un sistema binario UHPLC Vanquish (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Los extractos (5 μL de volumen de inyección) se separaron en una columna Hypersil Gold C18, 1,9 μm, 2,1 mm × 100 mm (Thermo Fisher) mantenida a 40 °C. Se realizó cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) a 250 μL/min utilizando el disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y el disolvente B (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo/agua 80:20) con una longitud de gradiente de 30 min, como se describió previamente.^[195],^[196] Los análisis de MS intactos se adquirieron en el rango de relación masa/carga (m/z) de 70-1.050 en modo de iones positivos a una resolución de 120.000 con una velocidad de escaneo de 3,5 Hz, un control automático de ganancia (AGC) objetivo de 1x106 y un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms, y los espectros MS/MS (o tándem) se recogieron a una resolución de 15.000, un AGC objetivo de 2x105 iones, con un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms.### Procesamiento y análisis estadístico de los datos metabolómicos

Los datos brutos de espectrometría de masas (MS) se importaron, procesaron, normalizaron y evaluaron utilizando el software Progenesis QI (versión 3.0; Non-linear Dynamics, Newcastle, Reino Unido). Las abundancias relativas de los estándares de control de calidad (QA/QC) pesados añadidos mostraron una variabilidad inferior al 13% para la preparación de la muestra y inferior al 3% para la variabilidad del instrumento. Todos los análisis de MS y MS/MS se alinearon con una muestra de control de calidad agrupada (QC) de referencia. Los iones detectados (es decir, pares únicos de tiempo de retención y m/z) se desadujeron y desisotoparon para producir características analíticas distintas. Los datos se normalizaron a todos los compuestos y la significación estadística se evaluó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) sobre los valores de abundancia de los compuestos normalizados. Tanto las anotaciones de metabolitos tentativas como las putativas (nivel de confianza 1-3)^[197] se asignaron en función de las mediciones de masa precisas (error de masa < 5 ppm), la similitud del patrón isotópico, el espectro de fragmentación MS/MS y la coincidencia del tiempo de retención mediante la consulta de la Base de datos del metaboloma humano^[198] y la biblioteca de referencia interna del CIT.

Se utilizó Metaboanalyst 5.0 (www.metaboanalyst.ca/) para realizar visualizaciones de alto nivel, incluidos mapas de calor para los compuestos con significación estadística (valor p ≤ 0,05).^[199] Los datos metabolómicos no dirigidos están disponibles en el sitio web del National Metabolomics Data Repository (NMDR) del NIH Common Fund, Metabolomics Workbench, https://www.metabolomicsworkbench.org, en el estudio asignado, donde se le ha asignado el ID de estudio ST003919. Los datos se pueden acceder directamente a través de su DOI del proyecto: https://doi.org/10.21228/M8PR93.### Secuenciación y análisis de amplicones de ADNr 16S

Se prepararon bibliotecas a partir del ADN aislado de los contenidos cecales utilizando el kit Qiagen PowerSoil Pro y se amplificó la región hipervariable V3-V4 del código de secuencias de ADNr 16S. La biblioteca se construyó y se secuenció utilizando un sistema Illumina MiSeq, generando lecturas de 250 pb de extremo emparejado, con eliminación de quimeras.^[200] El análisis posterior se realizó y se visualizó con QIIME2^[179] versión 2024.5. Se realizó un perfilado taxonómico en comparación con la base de datos SILVA versión 132.^[180] Las lecturas de secuenciación generadas durante el presente estudio están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive con el número de acceso ENA: PRJEB89357 (número de acceso secundario ENA: ERP172384).### RNAseq y análisis a granel

Para el RNAseq bacteriano in vitro, ETBF se cultivó en BHIS antes de la subcultura en BHIS suplementado con lactato, de forma anaeróbica o en presencia de 0,1% de O2 durante 3 horas a 37 °C. Se añadió Bacteria RNAprotect (Qiagen) para preservar el transcrito. Las bacterias se lisaron utilizando Lysing Matrix B (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). Se construyó una biblioteca de extremo emparejado de 150 pb utilizando una estrategia RNAtag-seq^[184] y se secuenció en un Illumina NovaSeq (Illumina, CA). Las lecturas se recortaron utilizando el conjunto de software BBMap y se mapearon al genoma de ETBF (GCF023702735.1ASM2370273v1) utilizando Bow-tie2.^[184] Las lecturas mapeadas se cuantificaron utilizando el paquete de software featureCounts^[201] y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el software DESeq2.^[174] Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive con el número de acceso ENA: PRJEB89361 (número de acceso secundario ENA: ERP172389).

Para el RNAseq de tejidos de ratón, se extrajo el ARN de los tejidos cecales de ratones infectados con ETBF utilizando Tri-reagent (Molecular Biology Center) y el kit RNeasy mini (Qiagen). Los tejidos se homogeneizaron utilizando Lysing Matrix C (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). El transcriptoma se secuenció utilizando los métodos descritos anteriormente. Las lecturas se mapearon al genoma del ratón (mm10, UCSC Genome Browser) utilizando Bowtie2,^[184] y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el software DESeq2.^[174] Se realizó un agrupamiento a nivel de características, un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y un análisis de redes de coexpresión de genes ponderadas en BigOmics Analytics.^[172] Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive con el número de acceso ENA: PRJEB89362 (número de acceso secundario ENA: ERP172390).### Secuenciación del genoma completo

Los aislados de Bacteroides fragilis se cultivaron en BHIS. El ADN genómico se extrajo utilizando el kit Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Se prepararon bibliotecas de secuenciación de extremo emparejado (~150 pb de lecturas) utilizando un kit Illumina DNA Prep (Illumina, CA) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq (Illumina, CA). El ensamblaje del genoma y la identificación de especies bacterianas se realizaron utilizando la plataforma BV-BRC193 (versión 3.55.17). Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive con el número de acceso ENA: PRJEB107014 (número de acceso secundario ENA: ERP188052).### Modelado metabólico a escala genómica

Se reconstruyó un modelo metabólico a escala genómica para la cepa enterotoxigénica de B. fragilis siguiendo protocolos establecidos^[202] y el conjunto de herramientas COBRA versión 2.13.3 para Matlab.^[203] En particular, se utilizó como plantilla un GEM existente, curado y validado con datos para la cepa B. fragilis 638R,^[204] junto con varios otros GEMs de gramnegativas de la base de datos BiGG^[205]: múltiples GEMs de E. coli,^[206],^[207]
Shigella boydii,^[207]
Shigella dysenteriae,^[207]
Shigella flexneri,^[207] y Klebsiella pneumoniae.^[208] Los genes metabólicos utilizados en cada una de estas reconstrucciones anteriores se compararon con los genes de esta cepa de B. fragilis utilizando BLAST (valor E < 10−30, identidad > 50%); cualquier gen coincidente y sus reacciones asociadas se añadieron a un modelo de borrador y, a continuación, se curaron manualmente para garantizar su precisión. El modelo se curó para que creciera en un medio definido que se sabe que es adecuado para B. fragilis, una producción realista de ATP y un equilibrio de masas, como se hizo para la reconstrucción del modelo 638R existente.^[204]

A continuación, el modelo se transformó en modelos específicos del contexto para el análisis de los flujos en cada uno de los tres sitios de muestra (tejido cecal, lumen y moco) utilizando StanDep,^[209], un algoritmo para decidir qué reacciones deben estar activas en diferentes condiciones en función de los datos de transcriptómica. Para simular el medio complejo del intestino humano, se proporcionaron todos los nutrientes a los modelos en pequeñas cantidades (hasta un milimol por gramo de peso seco por hora). Los modelos reducidos para cada sitio se optimizaron a continuación para un crecimiento máximo utilizando el análisis de equilibrio de flujo parsimonioso.^[210] Esto se repitió para la cepa mutante isogénica ETBF que carece de bft. El modelo subyacente para el mutante no se alteró antes del procesamiento de StanDep, ya que bft no es un gen metabólico presente en la reconstrucción.### CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

A menos que se indique lo contrario, el análisis de datos se realizó en GraphPad Prism v10.4.2. Los valores de los tamaños de población bacteriana, los índices de competencia, los cambios en los niveles de ARNm y la longitud normalizada del colon se distribuyeron normalmente después de la transformación mediante el logaritmo natural. Se utilizó una prueba t de Student de dos colas para los datos transformados por logaritmo. A menos que se indique lo contrario, *, P < 0,05; , P < 0,01; *, P < 0,001; ns, no estadísticamente significativo. En todos los experimentos con ratones, N se refiere al número de animales de los que se obtuvieron muestras. Los detalles estadísticos de los experimentos, incluido el valor exacto de N, la definición del centro y la dispersión, se pueden encontrar en las figuras o en las leyendas de las figuras. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de los datos transformados por logaritmo. Los tamaños de muestra (es decir, el número de animales por grupo) no se estimaron a priori, ya que no se pueden predecir los tamaños del efecto en nuestro sistema. No se eliminaron los valores atípicos estadísticos previstos, ya que la presencia o ausencia de estos posibles valores atípicos estadísticos no afectó a la interpretación general. Los ratones que fueron sacrificados antes de lo previsto debido a problemas de salud se excluyeron del análisis.

DETALLES DEL MÉTODO

Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento, ensayo de competencia in vitro y ensayo de ATP

La cepa enterotoxigénica de Bacteroides fragilis (ETBF) 86-5443-2-2 y la cepa isogénica Δbft son un regalo de la Dra. Cynthia Sears.^[30]
Las cepas B. fragilis 1284, YCH46, J38-1, I1345, CL03T12C07, CL05T12C13 y CL07T12C05 son un regalo de la Dra. Laurie Comstock. Todos los aislados clínicos de B. fragilis se obtuvieron en el Vanderbilt University Medical Center (VUMC).

La cepa ETBF 86-5443-2-2 y las cepas Bacteroides fragilis no toxigénicas (NTBF) indicadas se cultivaron de forma anaeróbica (90% N2, 5% CO2, 5% H2; cámara anaeróbica de vinilo, Coy Lab) en medio suplementado con infusión de cerebro y corazón (BHIS) (0,8% de infusión de cerebro y corazón sólida, 0,5% de digestato peptídico de tejido animal, 1,6% de digestato pancreático de caseína, 0,5% de cloruro de sodio, 0,2% de glucosa, 0,25% de fosfato disódico, 0,005% de hemina, 0,0001% de vitamina K, pH 7,4) o placas BHIS (caldo BHIS, 15 g/L de agar) que contienen 50 μg/mL de gentamicina (Gen) durante 2 días a 37 °C. Cuando fue apropiado, las placas y los medios de agar se suplementaron con 20 μg/mL de anhidrotetraciclina (aTc), 20 μg/mL de cefoxitina (Cfx), 50 μg/mL de kanamicina (Kan), 25 μg/mL de eritromicina (Erm) o 200 μg/mL de 5-fluoro-2′-desoxiuridina (FUdR).

Para el crecimiento microaeróbico, se cultivaron colonias individuales de las cepas indicadas en condiciones anaeróbicas durante 24 horas en BHIS antes de realizar un subcultivo en medios semidefinidos modificados (SDM)^[181] (1,5 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NH4SO4, 0,9 g/L de NaCl, 150 mg/L de L-metionina, 5 μg/L de vitamina B12, 1 mg/L de resazurina, 1 g/L de triptona, 0,2% de NaHCO3, 0,005% de protoporfirina IX) suplementados con 1 mM de lactato. Las culturas se inocularon a una densidad de (2,5 x 104 UFC) en una atmósfera microanaeróbica abierta que contenía 1-10 μM de O2 (0,1-1% de O2, 5% de CO2, 2,5% de H2; sistema de hipoxia in vitro, Coy Lab) y se incubaron a 37 °C durante un máximo de 72 horas.

Para los ensayos de competencia in vitro, se cultivaron cepas de tipo salvaje y mutantes de ETBF o NTBF como se describió anteriormente. Las culturas se mezclaron en una proporción de 1:1 y se co-inocularon en SDM en condiciones microaeróbicas (0,1-1% de O2). Después de 24 horas de incubación, las culturas se diluyeron en serie y se sembraron en agar selectivo BHIS que contenía los antibióticos apropiados. Las placas se incubaron en condiciones anaeróbicas a 37 °C durante 48 h, después de lo cual se contabilizaron las unidades formadoras de colonias (UFC) para cada cepa.

Para el ensayo de ATP, se cultivaron colonias individuales en SDM en condiciones anaeróbicas antes de realizar un subcultivo en SDM suplementado con lactato en una atmósfera microaeróbica (0,1% de O2) durante 16 horas. Se utilizaron 2,5 x 106-2,5 x 107 células para analizar la concentración de ATP utilizando un kit de determinación de ATP (kit de ensayo de viabilidad de células microbianas BacTiter-Glo, Promega). La luminiscencia de la muestra se leyó utilizando placas de pocillos blancos en un lector de placas BioTek H1 y se comparó con una curva estándar de concentraciones conocidas de ATP.

Las cepas de E. coli se cultivaron rutinariamente en caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio) o en placas LB (caldo LB, 15 g/L de agar) a 37 °C suplementado con 100 μg/mL de carbenicilina.### Plásmidos

Todos los cebadores y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave. Los plásmidos suicidas se propagaron rutinariamente en E. coli S17 λpir. Las regiones flanqueantes de la cepa ETBF 086-54443-2-2 cydAB, lutABC, ldh1, ldh2, asct, sucAB, sucCD se amplificaron y se ensamblaron en pETBF-Exchange-tdk (pEET) utilizando el kit de clonación por ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston) para dar lugar a pRF237, pRF231, pML102, pML108, pML191, pRF317 y pRF247, respectivamente.

El marco de lectura abierto BFT-2 junto con la región promotora nativa de 700 pb de la cepa B. fragilis 86-5443-2-2 se amplificaron y se ensamblaron en los vectores integrativos pNBU2-CmR o pNBU2-CfxR utilizando el ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston), generando los plásmidos pYW283 y pYW279, respectivamente.

De manera similar, BFT-1 junto con la región promotora nativa de 700 pb de la cepa B. fragilis J38-1 se amplificaron y se ensamblaron en pNBU2-CfxR para generar pYW827. El fragmento correspondiente de promotor-ORF de BFT-3 de la cepa B. fragilis Korea 570 se ensambló en pNBU2-CfxR, lo que dio como resultado pYW823.

Para los estudios de expresión inducible, el vector de integración pNBU2CmR-TetR-P1TDP-GH023 que contiene el promotor inducible de anidro-tetraciclina (aTc) P1TDP se propagó rutinariamente en E. coli S17 λpir. El ORF de BFT-2 de la cepa B. fragilis 86-5443-2-2 se amplificó y se ensambló mediante el ensamblaje de Gibson en pNBU2catP-TetR-P1TDP-GH023, un derivado de pNBU2erm-tetR-P1T_DP-GH023^[80], generando pYW508.### Construcción de mutantes mediante intercambio alélico

Todas las cepas bacterianas mutantes construidas utilizando el método que se describe a continuación se enumeran en la tabla de recursos clave. Para los mutantes de ETBF, el plásmido suicida pEET que contiene las regiones flanqueantes de los genes de interés se conjugó utilizando E. coli S17-1 λpir como la cepa donante conjugativa en el ETBF. Los exconjugantes con el plásmido suicida integrado en el cromosoma del receptor se seleccionaron en placas BHIS suplementadas con los antibióticos apropiados. Se utilizaron placas de 5-fluoro-2-desoxiuridina (FudR, 200 μg/mL en BHIS) para seleccionar el segundo evento de cruce.### Análisis filogenético de los genes implicados en el metabolismo central oxidativo

Las anotaciones del genoma RefSeq se descargaron utilizando la herramienta de línea de comandos NCBI Datasets^[177] (v16.40.1) el 8 de abril de 2025. Se descargaron los ensamblajes completos de Bacteroides fragilis, Phocaeicola vulgatus, Bacteroides uniformis, Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides caccae, Bacteroides salyersiae, Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides cellulosilyticus y Phocaeicola dorei, así como los ensamblajes de andamios de Hoylesella oralis, Bacteroides acidifaciens y Bacteroides nordii, que se utilizaron debido a la falta de ensamblajes completos. Se utilizó solo la última versión del ensamblaje y se excluyeron los genomas ensamblados a partir de metagenomas, los ensamblajes de proyectos grandes y multi-aislados y los ensamblajes atípicos. Se utilizaron las secuencias de proteínas anotadas como entrada para Orthofinder^[178] (v3.0.1b1), que produjo la filogenia y las llamadas de presencia/ausencia para cada ortogrupo. Se utilizó ggtree^[175] (v3.16.0) para generar una filogenia de las especies.### Experimentos con animales

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Vanderbilt University Medical Center. Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje (n.º de catálogo 000664) de Jackson Laboratory (Bar Harbor) y se alojaron en jaulas estériles en condiciones libres de patógenos específicos en un ciclo de luz de 12 horas, con acceso ad libitum a alimentos y agua estéril en el Vanderbilt University Medical Center.

Los ratones machos y hembras de tres semanas de edad se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento antes del experimento. Para permitir una colonización estable de B. fragilis, los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días (a partir del día 0), seguido de clindamicina sola durante 2 días más. El día 4, se retiraron los antibióticos y los ratones se devolvieron al agua estéril.

Para los experimentos de colonización única con B. fragilis enterotoxigénico (ETBF), los ratones se inocularon por vía oral el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada o se dejaron sin inocular como controles. Para los experimentos de colonización competitiva, los ratones se inocularon con una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada y 0,5 × 109 UFC de la cepa mutante correspondiente.

Para los modelos de colonización con B. fragilis no toxigénico (NTBF), los ratones se sometieron al mismo régimen de pretratamiento con antibióticos y se inocularon el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa NTBF indicada o se dejaron sin inocular. En los experimentos de colonización competitiva, los ratones recibieron una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF y 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF o ETBF indicada, según se especifique. Los animales se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados.

Para la neutralización aguda de IL-17, los ratones se pretrataron con antibióticos como se describe anteriormente. El día 4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 500 μg por animal de anticuerpo anti-IL-17A de ratón (bioXcell) o un control de IgG1 de ratón con coincidencia de isotipo (bioXcell), como se describió anteriormente.^[26],^[171]

Veinticuatro horas después, los ratones se inocularon intragástricamente con 1 × 109 UFC de ETBF de tipo salvaje. El día 6, los ratones recibieron una segunda inyección intraperitoneal de anticuerpo anti-IL-17A de ratón o control de isotipo a la misma dosis. Los animales se sacrificaron el día 7.

Para el modelo de tumorigénesis, los ratones ApcMin machos y hembras de tres semanas de edad, junto con sus controles de camada, se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento antes del experimento. Los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días, seguido de clindamicina sola durante 2 días más para permitir una colonización estable de Bacteroides fragilis. El día 4, se cambiaron los antibióticos por agua estéril. El día 5, los ratones se inocularon con 1 x 109 UFC de las cepas ETBF indicadas o se dejaron sin inocular, seguido de una dosis única de tratamiento con tributirina. 12 semanas después de la infección, se sacrificaron los animales, se fijó el tejido cólico con 4% de paraformaldehído y se cuantificó la incidencia de tumores.

Para el aislamiento de vesículas de membrana externa (OMV) bacterianas y la administración in vivo, se cultivaron colonias individuales de ETBF de tipo salvaje o la mutante isogénica Δbft en condiciones anaeróbicas durante 24 h en BHIS. La fracción de capa densa de electrones se aisló mediante centrifugación de gradiente de densidad como se describió anteriormente^[182] y luego se realizó un subcultivo en SDM modificado. Las culturas se cultivaron en condiciones anaeróbicas durante 16 horas adicionales.

Las culturas bacterianas se centrifugaron a 5.000 × g durante 15 min a 4 °C y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de polietetersulfona (PES) de 0,22 μm (Pall Corporation) para eliminar las células y los residuos restantes. Las OMV se precipitaron mediante ultracentrifugación a 150.000 × g durante 2 h a 4 °C utilizando un rotor Beckman 45 Ti. Las preparaciones de OMV se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante el contenido total de proteínas utilizando un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las OMV se normalizaron a 40 μg de proteína total por 100 μL de PBS para la administración in vivo, como se describió anteriormente.^[183]

Para administrar BFT in vivo a través de OMV, los ratones se pretrataron con estreptomicina (5 mg/mL) y clindamicina (0,1 mg/mL) en el agua de beber durante 2 días, seguido de clindamicina sola durante 2 días más. El día 5, los ratones se inocularon intragástricamente con 1 × 109 UFC de NTBF de tipo salvaje o ETBF Δbft. A partir del día 6, los ratones recibieron OMV por gavage oral dos veces al día durante 4 días consecutivos.

Para inducir respuestas de IL-17 intestinales independientes de ETBF, los ratones hembra de siete semanas de edad se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Los ratones recibieron gavage oral de curdlan (Sigma-Aldrich) a 10 mg/mL en el vehículo (100 μL por ratón) o vehículo solo (glucosa al 5%; Fisher Chemical) una vez al día durante 14 días antes de la inducción de la colitis. Luego, se administró sulfato de dextrano (DSS; Thermo Scientific) al 2,5% (p/v) en el agua de beber durante 5 días, preparando una solución fresca de DSS diariamente.^[113],^[141]–^[146] Después del tratamiento con DSS, los ratones recibieron 2 mM de sales biliares (Sigma-Aldrich) en el agua de beber o agua estéril durante 5 días más.

Para todos los experimentos, los ratones se sacrificaron de forma humanitaria en los puntos de tiempo indicados. Después del sacrificio, se recogieron tejidos de hígado, ciego y colon, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C para análisis posteriores de ARNm o se fijaron en formaldehído al 10% para análisis histopatológico. Para la metabolómica no dirigida, se recogieron los contenidos del ciego y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se almacenaron a -80 °C hasta que se extrajeron los metabolitos. Para la cuantificación dependiente del cultivo de la carga bacteriana, se recogieron los contenidos del colon y del ciego en PBS estéril y se cuantificó la carga de ETBF sembrando los contenidos intestinales diluidos en serie en agar selectivo.### Selección híbrida-RNAseq

Se desafiaron grupos de C57BL/6 con la cepa ETBF de tipo salvaje o la cepa isogénica Δbft como se describe anteriormente. Después del sacrificio, se lisó inmediatamente la muestra del ciego después de la recolección en 500 μl de tampón (0,2 M de NaCl y 20 mM de EDTA), 210 μl de SDS al 20% y 500 μl de una mezcla de fenol, cloroformo e isoamil alcohol utilizando Lysing Matrix B. Se extrajo y purificó el ARN total de tres sitios por ratón (tejido intestinal, capa mucosa y contenidos luminales) de ocho ratones (24 muestras biológicas en total) utilizando el kit RNeasy Mini.

Se utilizó ARN para generar bibliotecas de cDNA de Illumina utilizando una versión modificada del protocolo RNAtag-seq.^[184],^[185] Brevemente, el ARN se fragmentó, se eliminó el ADN genómico, se desfosforiló y se ligó a adaptadores de ADN que contenían códigos de barras 5′-AN8-3′ de secuencia conocida con un grupo fosfato 5′ y un grupo bloqueador 3′. Para garantizar suficiente material de partida para la captura híbrida, se generaron bibliotecas utilizando 2,25 μg de ARN total por muestra, divididas en 9 réplicas técnicas procesadas en paralelo. Los ARN con códigos de barras de cuatro muestras biológicas se combinaron en cada grupo. El ARN agrupado se sometió a la eliminación de rRNA utilizando el kit de eliminación de rRNA RiboCop para humanos (Lexogen, n.º de catálogo 144), seguido de la transcripción inversa utilizando un cebador que se dirige a la región constante del adaptador con código de barras, con la adición de un adaptador 3′ mediante el cambio de plantilla (SMARTScribe, Clontech).^[186] El cDNA se enriqueció mediante PCR durante 14 ciclos utilizando cebadores que se dirigen a las regiones constantes de los adaptadores con las secuencias Illumina P5/P7 unidas que contienen índices únicos por grupo. Los cDNA de los grupos de réplicas generados en paralelo se combinaron y se concentraron y se utilizaron como material de partida para el enriquecimiento. El rendimiento del grupo de bibliotecas después de 14 ciclos de PCR osciló entre 350 (mucus, ETBF Δbft) y 1600 ng (lumen, ETBF WT). Estas bibliotecas indexadas amplificadas que contienen muestras con códigos de barras se sometieron a un enriquecimiento por captura híbrida según se describe a continuación.

El enriquecimiento de las secuencias de ETBF utilizando un panel de captura personalizado y reactivos de hibridación y lavado v1 (Twist Biosciences) se realizó en 6 reacciones de captura separadas, cada una de las cuales contenía aproximadamente 250 ng de grupo de bibliotecas RNAtag previo a la captura. Seguimos las instrucciones del fabricante, excepto que añadimos 5 μg de ADN Cot-1 de ratón (Thermo Fisher) en lugar de la solución bloqueadora humana a la hibridación y utilizamos HiFi HotStart ReadyMix (Roche) para la amplificación por PCR del producto de captura. Para determinar empíricamente el número mínimo de ciclos para generar cantidades aproximadamente iguales de producto de PCR a pesar de las diferentes cantidades de ETBF en los tres sitios intestinales (mayor en el lumen, menor en el tejido) y ETBF WT (mayor) frente a ETBF Δbft (menor), realizamos reacciones de PCR a escala reducida de 10 μl a partir de 2 μl de suspensión de cuentas de captura con 8, 12 o 16 ciclos. El número de ciclos de PCR necesarios para generar ~100 fmol de cada biblioteca de captura a partir de 25 μl de suspensión de cuentas osciló entre 5 (ETBF WT en el lumen) y 11 (tejido).

Los grupos de RNAtag previos a la captura se secuenciaron en dos carriles Illumina NovaSeq S4 hasta una profundidad promedio de 9,4 x 108 pares de lecturas por muestra. Las bibliotecas de captura se secuenciaron en un carril hasta una profundidad promedio de 4,8 x 108 pares de lecturas por muestra. Las lecturas de secuenciación generadas están disponibles en la base de datos NCBI BioProject con el número de acceso PRJNA1269620.### Análisis de los datos de selección híbrida-RNAseq

Las lecturas de secuenciación de cada muestra en un grupo se desmultiplexaron en función de su secuencia de código de barras asociada utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/splitmergepl). Se permitió hasta 1 desajuste en el código de barras, siempre y cuando no permitiera la asignación de la lectura a un código de barras diferente. Las secuencias de los códigos de barras se eliminaron de la primera lectura, al igual que las G terminales de la segunda lectura que pudieron haberse añadido por SMARTScribe durante el cambio de plantilla.

Las lecturas derivadas de B. fragilis se alinearon con la secuencia de referencia GCF 023702735.1 ASM2370273v1 utilizando BWA^[187] y se asignaron recuentos de lecturas a los genes anotados de RefSeq y a otras características genómicas utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/BactRNASeqCount). Las lecturas derivadas del ratón se alinearon con la secuencia Ensembl Mus musculus GRCm38r94p6 mm10 utilizando bbmap37.10 (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/) y se asignaron recuentos de lecturas a los transcritos anotados utilizando Salmon0.8.2.^[188]

El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2^[174] y/o edgeR.^[189] La visualización de los datos de secuenciación en bruto y los gráficos de cobertura en el contexto de las secuencias del genoma y las anotaciones de los genes se realizó utilizando GenomeView.^[190]### Cuantificación dirigida de los niveles de ARNm en el tejido y el contenido intestinal

El tejido cólico o cecal se homogeneizó en un homogeneizador de perlas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies) y se extrajo el ARN utilizando el reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati). El ARN total del ciego o el contenido del colon se extrajo utilizando el kit RNeasy PowerFecal Pro (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. La contaminación por ADN se eliminó utilizando el kit Turbo DNA-free (Ambion, EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante. El cDNA se generó mediante el kit de síntesis de cDNA SuperScript VILO (Thermo Fisher, EE. UU.). La PCR en tiempo real se realizó utilizando PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem, EE. UU.), y los datos se adquirieron en un CFX Maestro 2.3 (Bio-Rad, EE. UU.). La transcripción del gen diana de cada muestra se normalizó a los niveles de ARNm de Gapdh (huésped) o mp2 (ETBF).### Análisis de Western blot de la expresión de FABP6 y SLC10A2 en el tejido intestinal

Las proteínas del colon se extrajeron utilizando un tampón de lisis RIPA. Para cada 5 mg de tejido, se añadieron 600 μL de tampón de lisis frío y las muestras se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de perlas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies). Los lisados se agitaron durante 2 horas a 4 °C y luego se centrifugaron a 16 000 g durante 20 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek Instruments).

Las muestras se hirvieron a 95 °C durante 1 minuto y se resolvieron 50 μg de proteína total por muestra en geles prefundidos 4-20% TGX (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilo (PVDF) mediante transferencia húmeda (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en TBS que contenía 3% de leche seca descremada y 0,1% de Tween-20, y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra FABP6 y SLC10A2. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con IRDye durante 1 hora a temperatura ambiente y se escanearon utilizando un escáner de Western blot Odyssey (LICORbio). Los niveles de expresión relativos se cuantificaron utilizando ImageJ, con un ajuste uniforme de los niveles de brillo en todas las muestras.### Aislamiento de colonocitos

El colon y el ciego de los animales infectados con ETBF se retiraron y se mantuvieron en hielo en RPMI que contenía 10% de FBS. El contenido luminal se lavó con HBSS + 5% de FBS + 2 mM de EDTA. Luego, el colon y el ciego se cortaron longitudinalmente y en trozos más pequeños, se colocaron en un medio HBSS que contenía 5% de FBS, 2 mM de EDTA y 1,5 mM de DTT, y se agitaron a 37 °C durante 50 minutos a 150 rpm. Después de la incubación, el sobrenadante y el tejido se separaron, y el sobrenadante se filtró y se centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. El pellet resultante se resuspendió en HBSS que contenía 5% de FBS y 2 mM de EDTA y se mantuvo en hielo. El tejido se digirió en HBSS (que contiene Ca2+ y Mg2+) suplementado con colagenasa (1,5 mg/mL) y DNasa I (1000X). Después de agitar durante 25 minutos a 100 rpm, se añadió HBSS que contenía 5% de FBS y 2 mM de EDTA para detener la digestión, el tejido restante se filtró utilizando un filtro celular y las células digeridas se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. Después de la centrifugación, las dos poblaciones de células (del sobrenadante y del tejido) se combinaron y se purificaron aún más utilizando la centrifugación con gradiente de Percoll. Se recogieron las células en la interfaz de las capas del 40% y el 70%, se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C, se lavaron utilizando RPMI que contenía 10% de FBS y, finalmente, se resuspendieron en 500 μL del mismo medio. El recuento y la viabilidad de las células se cuantificaron utilizando un contador de células Countess 3 (Thermo Fisher Scientific).### Ensayo SCENITH

Las células se sembraron a 1 x 106 células/ml de RPMI que contenía 10% de FBS en placas de 96 pocillos y se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 1 hora. Los pocillos se trataron con DMSO Control, 2-desoxi-D-glucosa (DG, concentración final 250 mM) u oligomicina (Oligo, concentración final 1 μM). Se añadió puromicina (concentración final 10 μg/ml) y las células se devolvieron a la incubadora durante 20 minutos. Después del tratamiento con puromicina, las células se lavaron en PBS frío y se tiñeron con una mezcla 1:100 de anticuerpos anti-CD326-APC, CD45 RED Fluo 710, TCR gamma/delta Fluo 450 durante 30 minutos a 4 °C en PBS, 5% de FCS y 2 mM de EDTA (tampón de lavado para FACS). Después del lavado con PBS frío, se añadió tinte de viabilidad fantasma (BV510) 1:100 en tampón para FACS y las células se incubaron a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron en tampón para FACS, se fijaron y se permeabilizaron utilizando el tampón de fijación y permeabilización FOXP3 (Thermofisher eBioscience) según las instrucciones del fabricante. La tinción intracelular de puromicina se realizó incubando las células durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-puromicina (PE) 1:100 en el tampón de permeabilización. Después del lavado, las células se resuspendieron en 250 ml de tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS) y se transfirieron a tubos para FACS para adquirir los datos utilizando Fortessa (BD Biosciences). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (BD Biosciences).### Perfilado de células inmunitarias productoras de IL-17

Se sembraron de 100 000 a 500 000 células por pocillo en 200 μl/pocillo de tampón de estimulación (RPMI que contiene 10% de FBS, 0,67 μl/ml de inhibidor de la proteína de transporte de Golgi, 500 μg/ml de ionomicina, 25 μg/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)) en placas de 96 pocillos y se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 4 horas. Las células se tiñeron con 1:100 de anticuerpos biotinilados TCR γ/δ en tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS) y se incubaron durante 25 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron e incubaron con una mezcla 1:100 de Streptavidina PE610, CD45 PECy7, TCRβ APC Cy7 durante 25 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con PBS frío y se añadió tinte de viabilidad fantasma (BV510) en una proporción de 1:100 en tampón para FACS. Las células se incubaron a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron en tampón para FACS, se fijaron y se permeabilizaron utilizando el tampón de fijación y permeabilización FOXP3 (Thermo Fisher eBioscience). Las células se lavaron con 150 μl/pocillo de tampón de lavado Perm-Wash (Thermo Fisher eBioscience) y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 40 minutos con una mezcla de anticuerpos intracelulares en tampón de lavado Perm-Wash. Después de la incubación, las células se lavaron con tampón de lavado Perm-Wash, seguido de un segundo lavado en tampón para FACS. Finalmente, las células se resuspendieron en 200 μl de tampón para FACS y se transfirieron a tubos para FACS para adquirirse en una máquina para FACS. Los datos se adquirieron utilizando Fortessa (BD Biosciences) y los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (BD Biosciences).### Histopatología

El tejido cecal y cólico se fijó en tampón de fosfato durante 48 horas y se incluyó en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones teñidas se enmascararon y se evaluaron utilizando los mismos criterios que se indican en la tabla S1.### Tinción de hipoxia

Se inyectaron por vía peritoneal ratones infectados con ETBF, a los que se les administró la dosis indicada de 60 mg/kg de pimonidazol (Hypoxyprobe) 30 minutos antes de la eutanasia. Tras la eutanasia, se recogieron las muestras según lo descrito anteriormente y se fijaron en formaldehído al 10 %. Los tejidos se incluyeron en parafina, se seccionaron y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos de tejido cecal y cólico se desparafinaron e incubaron durante 10 minutos a 37 °C con 200 ml de solución de proteinasa K (New England Biolabs) en tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0). Los portaobjetos se lavaron en PBS y se bloquearon durante 1 hora a 4 °C con 150 ml de reactivo de bloqueo de IgG de ratón M.O.M (Vector Laboratories). Las muestras se incubaron con 100 μl de antisueros de conejo α-pimonidazol (Hypoxyprobe) en una proporción de 1:100 durante la noche a 4 °C. Las muestras se lavaron en PBS y se incubaron con 100 μl de anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 (Cell Signaling, 1:150) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBS, los portaobjetos se contrateñieron con Hoechst durante 5 minutos, seguido de lavados adicionales con PBS y montaje. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en mosaico (5 × 5 campos, 15 % de superposición) con un microscopio de fluorescencia Nikon ECLIPSE Ti-2 con un objetivo de 20x y el sistema Perfect Focus habilitado. El empalme de imágenes se realizó en tiempo real utilizando NIS-Elements (versión 6.10.01). Las regiones de interés (ROI) se seleccionaron manualmente para excluir la lámina propia bien oxigenada. La intensidad de la tinción de pimonidazol dentro de cada ROI se normalizó a la señal de Hoechst en la misma región para obtener una intensidad de tinción de hipoxia normalizada.

Cuantificación del lactato

Se recogieron los contenidos del colon y del ciego de ratones infectados con ETBF en PBS estéril. Los contenidos se pesaron, se diluyeron con PBS 1x hasta una densidad final de 40 mg/ml y se homogeneizaron mediante una suave agitación en un vórtice a 5 °C. Los residuos insolubles se eliminaron mediante centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos a 5 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a −20 °C hasta el día del análisis.

El lactato y un estándar interno de lactato marcado con un isótopo estable (lactato-13C3) (Cambridge Isotopes) se derivatizaron con el reactivo de hidrazina de dansilo y el agente activador de carboxilo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a sus correspondientes derivados de hidrazona de dansilo en un tampón acuoso de fosfato de sodio 250 mM a pH 4 que contiene 40 % (v/v) de acetonitrilo. Brevemente, se tomaron alícuotas de 20 μl de los extractos descongelados y se añadieron 5 nmol de lactato-d3, se diluyeron 1:7 con el tampón de derivatización descrito anteriormente y se derivatizaron a temperatura ambiente con la adición de hidrazina de dansilo (25 μl x 50 mg/ml en acetonitrilo) y EDC (25 μl x 150 mg/ml en agua). Después de una hora a temperatura ambiente, se añadieron 25 μl de agua que contenía 5 % (v/v) de TFA para detener las reacciones. Tras la centrifugación a 10.000 x g durante 30 min a 5 °C, las mezclas de reacción apagadas se transfirieron a viales de muestra de 2 ml equipados con insertos de polipropileno de bajo volumen y septos de goma revestidos de teflón. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μl. Los estándares de calibración se prepararon en PBS 1x y se derivatizaron de la misma manera. El análisis LC-MS/MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Thermo TSQ Quantum acoplado a un sistema UPLC Waters Acquity. El espectrómetro de masas se operó en modo de iones positivos, con detección mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM) utilizando las siguientes transiciones: lactato, 338 → 170, CE 27; lactato-13C3, 341 → 170, CE 27. Se utilizaron los siguientes parámetros del analizador y de la fuente ESI para la detección del analito y del estándar interno: ancho de pico Q1 0,7 Da (FWHM), ancho de barrido Q3 2 Da, voltaje de pulverización 4 kV, temperatura del capilar 300 °C, lente del tubo 120, gas de nitrógeno de la vaina 50; gas auxiliar de nitrógeno 10; CID en la fuente 12. La adquisición de datos y el análisis espectral cuantitativo se realizaron utilizando Thermo Xcalibur versión 2.0.7 SP1 y Thermo LCQuan versión 2.7, respectivamente. Se construyeron curvas de calibración trazando las áreas de los picos frente a las concentraciones de los analitos para una serie de diez estándares de calibración, que abarcan de 0,10 a 1000 nmol totales de lactato. Se aplicó un factor de ponderación de 1/C2 en el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados para mantener la homogeneidad de la varianza en todo el rango de concentración. Se utilizó una columna analítica de fase inversa Waters Acquity BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) para todas las separaciones cromatográficas. Las fases móviles se compusieron de 0,2 % de ácido fórmico + 10 mM de formiato de amonio en (A) agua y en (B) acetonitrilo/metanol (9:1). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-1,0 min, B = 5 %; 1-8 min, B = 5-100 %; 8-9,5 min, B = 100 %; 9,5-10 min, B = 100-5 %; 10-15 min, B = 5 %. El caudal se mantuvo en 300 μl/min, y el tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 15 min. Se utilizó una válvula de derivación controlada por software para transferir el eluyente de LC del tiempo 0 al 3 min y del tiempo 5,5 al 15 min de cada ciclo cromatográfico a los residuos.

Cuantificación de ácidos biliares

Los ácidos biliares (AB) se midieron como sus derivados de hidrazida de Girard P.^[191] Brevemente, a 25 μl de homogeneizado, se añadió una mezcla de estándares internos de ácidos biliares deuterados (5 μl x 25 μg/ml de cada uno: colato-d4, desoxicato-d4, glicocolato-d4, quenodesoxicato-d4, ursodesoxicato-d4 y litocolato-d4; todos de CDN Isotopes). Las muestras enriquecidas se extrajeron con 750 μl de una solución de metanol/metil tert-butil éter/cloroformo (1,3:1:1 v/v/v). Tras la centrifugación a 10.000 x g, se retiraron los sobrenadantes y se evaporaron bajo una corriente suave de gas nitrógeno. Los residuos se reconstituyeron en 100 μl de tampón de piridina clorhidrato (300 mM, pH 4,5) antes de añadir 25 μl x 50 mg/ml de reactivo de Girard P en acetonitrilo/agua (1:1) y 25 μl x 150 mg/ml del agente activador de carboxilo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) en agua para convertir los AB en sus correspondientes hidrazidas de Girard P. Después de agitar durante la noche a 4 °C, las reacciones se apagaron con 25 μl x 5 % (v/v) de TFA en agua. Las reacciones apagadas se centrifugaron a 18.000 x g y luego se transfirieron a viales de muestra de 2 ml equipados con insertos de polipropileno de bajo volumen y septos de goma revestidos de teflón. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μl. Los estándares de calibración de AB se prepararon en agua y se derivatizaron de la misma manera. El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS) se realizó utilizando un espectrómetro de masas híbrido de cuadrupolo/órbita Thermo Q Exactive HF acoplado a un sistema HPLC Vanquish Horizon (Thermo Fisher). Los espectros de masas de alta resolución se adquirieron en modo de iones positivos en el rango de masa a carga (m/z) de 300 a 800 a una potencia de resolución de 60.000 con una velocidad de barrido de 3,5 Hz, un control automático de ganancia (AGC) objetivo de 1x106 y un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms, y los espectros de MS/MS (o tándem) se recogieron a una resolución de 15.000, un AGC objetivo de 2x105 iones, con un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms. Se utilizaron los siguientes parámetros del analizador y de la fuente ESI para la detección del analito y del estándar interno: ancho de pico Q1 0,7 Da (FWHM), ancho de barrido Q3 2 Da, voltaje de pulverización 4 kV, temperatura del capilar 300 °C, temperatura HESI 100 °C, lente s 95, gas de nitrógeno de la vaina 40, gas auxiliar de nitrógeno 10. Se adquirieron cromatogramas de iones extraídos para cada AB basándose en las siguientes masas exactas de [M+H]+ y una tolerancia de masa de +/− 5 ppm: CA, 542,3588; CA-d4, 546,3840; DCA y CDCA, 526,3639; DCA-d4 y CDCA-d4, 530,3890; LCA e iso-LCA, 510,3690; LCA-d4, 514,3941; 3-oxo-LCA, 508,3534. La adquisición de datos y el análisis espectral cuantitativo se realizaron utilizando Thermo Xcalibur versión 4.1.31.9 y Thermo LCQuan versión 2.7, respectivamente. Se construyeron curvas de calibración trazando las áreas de los picos frente a las concentraciones de los analitos para una serie de once estándares de calibración, que abarcan de 0,15 a 1500 pmol totales de cada AB. Se aplicó un factor de ponderación de 1/C2 en el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados para mantener la homogeneidad de la varianza en todo el rango de concentración. Se utilizó una columna analítica de fase inversa Acquity HSS C18 (2,1 x 150 mm, 1,7 μm, Waters, Milford, MA) para todas las separaciones cromatográficas. Las fases móviles se compusieron de 0,2 % de ácido fórmico + 10 mM de formiato de amonio en (A) agua/metanol/acetonitrilo (8:1:1) y en (B) metanol/acetonitrilo (4:1). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-1,0 min, B = 10 %; 1-15 min, B = 10-100 %; 15-17,5 min, B = 100 %; 17,5-18 min, B = 100-10 %; 18-22 min, B = 10 %. El caudal se mantuvo en 300 μl/min, y el tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 22 min. Se utilizó una válvula de derivación controlada por software para transferir el eluyente de LC del tiempo 0 al 5 min de cada ciclo cromatográfico a los residuos.

Metabolómica no dirigida

Las muestras se almacenaron a −80 °C hasta que se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas tándem de alta resolución (LC-HRMS y LC-HRMS/MS) en el Centro de Tecnología Innovadora de Vanderbilt (CIT) utilizando métodos descritos previamente.^[192]–^[194] Brevemente, las muestras de contenido intestinal de ratón congeladas (n=8, 4 réplicas biológicas para cada grupo de muestras) se lisaron en 1 ml de tampón de lisis frío (1:1:2, v:v:v, acetonitrilo: metanol: bicarbonato de amonio 0,1 M - pH 8,0) y se homogeneizaron individualmente utilizando un sonicador de sonda a 50 % de potencia (10 pulsos). Las muestras homogeneizadas se normalizaron por peso a una cantidad igual por muestra. Las proteínas se precipitaron de las muestras individuales añadiendo 800 μl de metanol frío y se incubaron durante la noche a −80 °C. Las proteínas precipitadas se pelletizaron mediante centrifugación (15.000 rpm, 15 min), y los extractos de metabolitos se secaron al vacío.

Los extractos individuales se reconstituyeron en 100 μl de acetonitrilo/agua (3:97, v:v) con 0,1 % de ácido fórmico que contenía carnitina-D9, triptófano-D3, valina-D8 e inosina-4N15 marcados con isótopos, y se centrifugaron durante 5 min a 10.000 rpm para eliminar el material insoluble. Se preparó una muestra de control de calidad agrupada (QC) agrupando volúmenes iguales de muestras individuales. La muestra de QC agrupada se utilizó para el acondicionamiento de la columna (8 inyecciones antes del análisis de la muestra), la alineación del tiempo de retención y para evaluar la reproducibilidad del instrumento de espectrometría de masas en todo el conjunto de muestras.

Se realizaron análisis de espectrometría de masas globales y no dirigidos en un espectrómetro de masas híbrido de cuadrupolo-órbita Q-Exactive HF de alta resolución (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) equipado con un sistema UHPLC binario Vanquish (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Los extractos (5 μl de volumen de inyección) se separaron en una columna Hypersil Gold C18, 1,9 μm, 2,1 mm × 100 mm (Thermo Fisher) mantenida a 40 °C. La cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) se realizó a 250 μl/min utilizando el disolvente A (0,1 % de FA en agua) y el disolvente B (0,1 % de FA en acetonitrilo/agua 80:20) con una longitud de gradiente de 30 min como se describió anteriormente.^[195],^[196] Se adquirieron análisis de MS intactos en el rango de masa a carga (m/z) de 70-1.050 en modo de iones positivos a una resolución de 120.000 con una velocidad de barrido de 3,5 Hz, un control automático de ganancia (AGC) objetivo de 1x106 y un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms, y los espectros de MS/MS (o tándem) se recogieron a una resolución de 15.000, un AGC objetivo de 2x105 iones, con un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms.

Procesamiento de datos de metabolómica y análisis estadístico

Los datos brutos de espectrometría de masas (MS) se importaron, procesaron, normalizaron y evaluaron utilizando el software Progenesis QI (versión 3.0; Non-linear Dynamics, Newcastle, Reino Unido). Las abundancias relativas de los estándares de control de calidad (QA/QC) pesados añadidos mostraron < 13 % de variabilidad para la preparación de la muestra y < 3 % para la variabilidad del instrumento. Todos los análisis de MS y MS/MS se alinearon a una muestra de control de calidad agrupada (QC) de referencia. Los iones detectados (es decir, pares de m/z y tiempo de retención únicos) se desaditaron y desisotoparon para producir características analíticas distintas. Los datos se normalizaron a todos los compuestos, y la significación estadística se evaluó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) sobre los valores de abundancia de los compuestos normalizados. Se asignaron tanto las anotaciones de metabolitos tentativos como las putativas (nivel de confianza 1-3)^[197] basándose en mediciones de masa exactas (error de masa < 5 ppm), similitud del patrón isotópico, espectro de fragmentación de MS/MS y coincidencia del tiempo de retención mediante la consulta de la base de datos del metaboloma humano^[198] y la biblioteca de referencia interna del CIT.

Se utilizó Metaboanalyst 5.0 (www.metaboanalyst.ca/) para realizar visualizaciones de alto nivel, incluyendo mapas de calor para los compuestos con significación estadística (valor p ≤ 0,05).^[199] Los datos de metabolómica no dirigida están disponibles en el sitio web del National Metabolomics Data Repository (NMDR) del NIH Common Fund, Metabolomics Workbench, https://www.metabolomicsworkbench.org, bajo el estudio asignado, donde se le ha asignado el ID de estudio ST003919. Los datos se pueden acceder directamente a través de su DOI del proyecto: https://doi.org/10.21228/M8PR93.### Secuenciación y análisis de amplicones de ADNr 16S

Se prepararon bibliotecas a partir del ADN aislado de los contenidos cecales utilizando el kit Qiagen PowerSoil Pro, y se amplificó la región hipervariable V3-V4 del código de secuencias de ARNr 16S. La biblioteca se construyó y secuenció utilizando un sistema Illumina MiSeq, generando lecturas de 250 pb de extremo emparejado, con quimeras eliminadas.^[200] El análisis posterior se realizó y se visualizó con QIIME2^[179] versión 2024.5. Se realizó un perfilado taxonómico utilizando la base de datos SILVA versión 132.^[180] Las lecturas de secuenciación generadas durante el presente estudio están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB89357 (número de acceso secundario ENA: ERP172384).### RNAseq a granel y análisis

Para el RNAseq bacteriano in vitro, ETBF se cultivó en BHIS antes de un subcultivo en BHIS suplementado con lactato, de forma anaeróbica o en presencia de 0,1% de O2 durante 3 horas a 37 °C. Se añadió Bacteria RNAprotect (Qiagen) para preservar el transcrito. Las bacterias se lisaron utilizando Lysing Matrix B (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). Se construyó una biblioteca de extremo emparejado de 150 pb utilizando una estrategia RNAtag-seq^[184] y se secuenció en un Illumina NovaSeq (Illumina, CA). Las lecturas se recortaron utilizando el conjunto de software BBMap y se mapearon al genoma de ETBF (GCF023702735.1ASM2370273v1) utilizando Bow-tie2.^[184] Las lecturas mapeadas se cuantificaron utilizando el paquete de software featureCounts^[201] y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el software DESeq2.^[174] Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB89361 (número de acceso secundario ENA: ERP172389).

Para el RNAseq de tejido de ratón, se extrajo el ARN de los tejidos cecales de ratones infectados con ETBF utilizando Tri-reagent (Molecular Biology Center) y el kit RNeasy mini (Qiagen). Los tejidos se homogeneizaron utilizando Lysing Matrix C (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). El transcriptoma se secuenció utilizando los métodos descritos anteriormente. Las lecturas se mapearon al genoma del ratón (mm10, UCSC Genome Browser) utilizando Bowtie2,^[184] y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el software DESeq2.^[174] Se realizó un agrupamiento a nivel de características, un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y un análisis de redes de coexpresión de genes ponderadas en BigOmics Analytics.^[172] Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB89362 (número de acceso secundario ENA: ERP172390).### Secuenciación del genoma completo

Los aislados de Bacteroides fragilis se cultivaron en BHIS. El ADN genómico se extrajo utilizando el kit Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Se prepararon bibliotecas de secuenciación de extremo emparejado (~150 pb de lecturas) utilizando un kit Illumina DNA Prep (Illumina, CA) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq (Illumina, CA). El ensamblaje del genoma y la identificación de especies bacterianas se realizaron utilizando la plataforma BV-BRC193 (versión 3.55.17). Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB107014 (número de acceso secundario ENA: ERP188052).### Modelado metabólico a escala genómica

Se reconstruyó un modelo metabólico a escala genómica para la cepa enterotoxigénica de B. fragilis siguiendo protocolos establecidos^[202] y la caja de herramientas COBRA versión 2.13.3 para Matlab.^[203] En particular, se utilizó un GEM existente, curado y validado con datos para la cepa B. fragilis 638R como plantilla,^[204] junto con varios otros GEMs de bacterias Gram-negativas de la base de datos BiGG^[205]: múltiples GEMs de E. coli,^[206],^[207]
Shigella boydii,^[207]
Shigella dysenteriae,^[207]
Shigella flexneri,^[207] y Klebsiella pneumoniae.^[208] Se compararon los genes metabólicos utilizados en cada una de estas reconstrucciones anteriores con los genes de esta cepa de B. fragilis utilizando BLAST (valor E < 10−30, identidad > 50%); cualquier gen coincidente y sus reacciones asociadas se añadieron a un modelo de borrador y luego se curaron manualmente para garantizar su precisión. El modelo se curó para que creciera en medios definidos conocidos por ser adecuados para B. fragilis, con una producción de ATP realista y un equilibrio de masas, tal como se hizo para la reconstrucción del modelo 638R existente.^[204]

Luego, el modelo se transformó en modelos específicos del contexto para el análisis de los flujos en cada uno de los tres sitios de muestra (tejido cecal, lumen y moco) utilizando StanDep,^[209], un algoritmo para decidir qué reacciones deben estar activas en diferentes condiciones en función de los datos de transcriptómica. Para simular el medio complejo del intestino humano, se proporcionaron todos los nutrientes a los modelos en pequeñas cantidades (hasta un milimol por gramo de peso seco por hora). Los modelos reducidos para cada sitio se optimizaron luego para un crecimiento máximo utilizando el análisis de equilibrio de flujo parsimonioso.^[210] Esto se repitió para la cepa mutante isogénica ETBF que carece de bft. El modelo subyacente para el mutante no se alteró antes del procesamiento de StanDep, ya que bft no es un gen metabólico presente en la reconstrucción.

Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento, ensayo de competencia in vitro y ensayo de ATP

La cepa enterotoxigénica Bacteroides fragilis (ETBF) 86-5443-2-2 y la cepa isogénica Δbft son regalos de la Dra. Cynthia Sears.^[30]
Las cepas B. fragilis 1284, YCH46, J38-1, I1345, CL03T12C07, CL05T12C13 y CL07T12C05 son regalos de la Dra. Laurie Comstock. Todos los aislados clínicos de B. fragilis se obtuvieron en el Vanderbilt University Medical Center (VUMC).

La cepa ETBF 86-5443-2-2 y las cepas Bacteroides fragilis no toxigénicas (NTBF) indicadas se cultivaron de forma anaeróbica (90% N2, 5% CO2, 5% H2; cámara anaeróbica de vinilo, Coy Lab) en medio de infusión de cerebro y corazón suplementado (BHIS) (0,8% de infusión de cerebro y corazón sólida, 0,5% de digestato peptídico de tejido animal, 1,6% de digestato pancreático de caseína, 0,5% de cloruro de sodio, 0,2% de glucosa, 0,25% de fosfato de hidrógeno disódico, 0,005% de hemina, 0,0001% de vitamina K, pH 7,4) o en placas BHIS (caldo BHIS, 15 g/L de agar) que contienen 50 μg/mL de gentamicina (Gen) durante 2 días a 37 °C. Cuando fue apropiado, las placas y los medios de agar se suplementaron con 20 μg/mL de anidrotetraciclina (aTc), 20 μg/mL de cefoxitina (Cfx), 50 μg/mL de kanamicina (Kan), 25 μg/mL de eritromicina (Erm), 25 μg/mL de clindamicina (Clin) o 200 μg/mL de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR).

Para el crecimiento microaeróbico, se cultivaron colonias individuales de las cepas indicadas de forma anaeróbica durante 24 horas en BHIS antes de subcultivarlas en un medio modificado semidefinido (SDM)^[181] (1,5 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NH4SO4, 0,9 g/L de NaCl, 150 mg/L de L-metionina, 5 μg/L de vitamina B12, 1 mg/L de resazurina, 1 g/L de triptona, 0,2% de NaHCO3, 0,005% de protoporfirina IX) suplementado con 1 mM de lactato. Las culturas se inocularon a una densidad de (2,5 x 104 UFC) en una atmósfera microanaeróbica abierta que contenía 1-10 μM de O2 (0,1-1% de O2, 5% de CO2, 2,5% de H2; sistema de hipoxia in vitro, Coy Lab) y se incubaron a 37 °C durante un máximo de 72 horas.

Para los ensayos de competencia in vitro, las cepas de tipo salvaje y mutantes de ETBF o NTBF se cultivaron como se describió anteriormente. Las culturas se mezclaron en una proporción de 1:1 y se co-inocularon en SDM en condiciones microaeróbicas (0,1-1% de O2). Después de 24 horas de incubación, las culturas se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar BHIS selectivo que contenían los antibióticos apropiados. Las placas se incubaron de forma anaeróbica a 37 °C durante 48 h, después de lo cual se enumeraron las unidades formadoras de colonias (UFC) de cada cepa.

Para el ensayo de ATP, se cultivaron colonias individuales en SDM de forma anaeróbica antes de subcultivarlas en SDM suplementado con lactato en una atmósfera microaeróbica (0,1% de O2) durante 16 horas. Se utilizaron 2,5 x 106-2,5 x 107 células para analizar la concentración de ATP utilizando un kit de determinación de ATP (BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay kit, Promega). La luminiscencia de la muestra se leyó utilizando placas de pocillos blancos en un lector de placas BioTek H1 y se comparó con una curva estándar de concentraciones de ATP conocidas.

Las cepas de E. coli se cultivaron rutinariamente en caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio) o en placas LB (caldo LB, 15 g/L de agar) a 37 °C suplementado con 100 μg/mL de carbenicilina.

Plásmidos

Todos los cebadores y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave. Los plásmidos suicidas se propagaron rutinariamente en E. coli S17 λpir. Las regiones flanqueantes de los genes de interés de la cepa ETBF 086-54443-2-2 cydAB, lutABC, ldh1, ldh2, asct, sucAB, sucCD se amplificaron y se ensamblaron en pETBF-Exchange-tdk (pEET) utilizando el kit de ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston) para dar lugar a pRF237, pRF231, pML102, pML108, pML191, pRF317 y pRF247, respectivamente.

El marco de lectura abierto BFT-2 junto con la región promotora nativa de 700 pb de B. fragilis cepa 86-5443-2-2 se amplificaron y se ensamblaron en los vectores integrativos pNBU2-CmR o pNBU2-CfxR utilizando el ensamblaje de Gibson (New England Biolab, Boston), generando los plásmidos pYW283 y pYW279, respectivamente.

De manera similar, BFT-1 junto con la región promotora nativa de 700 pb de B. fragilis cepa J38-1 se amplificaron y se ensamblaron en pNBU2-CfxR para generar pYW827. El fragmento promotor-ORF correspondiente de BFT-3 de B. fragilis cepa Korea 570 se ensambló en pNBU2-CfxR, lo que dio como resultado pYW823.

Para los estudios de expresión inducible, el vector de integración pNBU2CmR-TetR-P1TDP-GH023 que contiene el promotor inducible de anidrotetraciclina (aTc) P1TDP se propagó rutinariamente en E. coli S17 λpir. El ORF de BFT-2 de B. fragilis cepa 86-5443-2-2 se amplificó y se ensambló mediante el ensamblaje de Gibson en pNBU2catP-TetR-P1TDP-GH023, un derivado de pNBU2erm-tetR-P1T_DP-GH023^[80], generando pYW508.

Construcción de mutantes mediante intercambio alélico

Todas las cepas mutantes bacterianas construidas utilizando el método que se describe a continuación se enumeran en la tabla de recursos clave. Para los mutantes de ETBF, el plásmido suicida pEET que contiene las regiones flanqueantes de los genes de interés se conjugó utilizando E. coli S17-1 λpir como la cepa donante conjugativa en el ETBF. Los exconjugantes con el plásmido suicida integrado en el cromosoma del receptor se seleccionaron en placas BHIS suplementadas con los antibióticos apropiados. Se utilizaron placas de 5-fluoro-2-desoxiuridina (FudR, 200 μg/mL en BHIS) para seleccionar el segundo evento de cruce.

Análisis filogenético de los genes involucrados en el metabolismo central oxidativo

Se descargaron las anotaciones del genoma RefSeq utilizando la herramienta de línea de comandos NCBI Datasets^[177] (v16.40.1) el 8 de abril de 2025. Se descargaron los ensamblajes completos para Bacteroides fragilis, Phocaeicola vulgatus, Bacteroides uniformis, Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides caccae, Bacteroides salyersiae, Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides cellulosilyticus y Phocaeicola dorei, así como los ensamblajes de andamios para Hoylesella oralis, Bacteroides acidifaciens y Bacteroides nordii, que se utilizaron debido a la falta de ensamblajes completos. Se utilizó solo la última versión del ensamblaje, y se excluyeron los genomas ensamblados a partir de metagenomas, los ensamblajes de proyectos grandes de múltiples aislados y los ensamblajes atípicos. Se utilizaron las secuencias de proteínas anotadas como entrada para Orthofinder^[178] (v3.0.1b1), que produjo la filogenia y las llamadas de presencia/ausencia para cada ortogrupo. Se utilizó ggtree^[175] (v3.16.0) para generar una filogenia para las especies.

Experimentos con animales

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt. Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje (número de catálogo 000664) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor) y se alojaron en jaulas estériles en condiciones libres de patógenos específicos, con un ciclo de luz de 12 horas, y con acceso ad libitum a alimento y agua estéril en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.

Tres semanas antes del experimento, se asignaron aleatoriamente ratones machos y hembras a los grupos de tratamiento. Para permitir una colonización estable de B. fragilis, los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días (a partir del día 0), seguido de clindamicina sola durante 2 días adicionales. El día 4, se suspendieron los antibióticos y los ratones se devolvieron al agua de beber estéril.

Para los experimentos de colonización única con B. fragilis enterotoxigénica (ETBF), los ratones fueron inoculados por vía oral el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada o se dejaron sin inocular como controles. Para los experimentos de colonización competitiva, los ratones fueron inoculados con una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa ETBF indicada y 0,5 × 109 UFC de la cepa mutante correspondiente.

Para los modelos de colonización con B. fragilis no toxigénica (NTBF), los ratones se sometieron al mismo régimen de pretratamiento con antibióticos y fueron inoculados el día 5 con 1 × 109 UFC de la cepa NTBF indicada o se dejaron sin inocular. En los experimentos de colonización competitiva, los ratones recibieron una mezcla equimolar de 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF y 0,5 × 109 UFC de la cepa NTBF o ETBF indicada, según se especifique. Los animales fueron sacrificados en los puntos temporales indicados.

Para la neutralización aguda de IL-17, los ratones fueron pretratados con antibióticos según lo indicado anteriormente. El día 4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 500 μg por animal de anticuerpo anti-IL-17A de ratón (bioXcell) o un control de IgG1 de ratón con isotipo coincidente (bioXcell), como se describió previamente.^[26],^[171]

Veinticuatro horas después, los ratones fueron inoculados intragástricamente con 1 × 109 UFC de la cepa ETBF de tipo salvaje. El día 6, los ratones recibieron una segunda inyección intraperitoneal de anticuerpo anti-IL-17A de ratón o control de isotipo a la misma dosis. Los animales fueron sacrificados el día 7.

Para el modelo de tumorigénesis, ratones ApcMin machos y hembras de tres semanas de edad, junto con sus controles de la misma camada, fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento antes del experimento. Los ratones recibieron estreptomicina (5 mg/ml) y clindamicina (0,1 mg/ml) en el agua de beber durante 2 días, seguido de clindamicina sola durante 2 días adicionales para permitir una colonización estable de Bacteroides fragilis. El día 4, los antibióticos se cambiaron por agua de beber estéril. El día 5, los ratones fueron inoculados con 1 x 109 UFC de las cepas ETBF indicadas o se dejaron sin inocular, seguido de una dosis única de tratamiento con tributirina. Doce semanas después de la infección, los animales fueron sacrificados, el tejido cólico se fijó con un 4% de paraformaldehído y se cuantificó la incidencia de tumores.

Para el aislamiento de vesículas de membrana externa bacteriana (OMV) y la administración in vivo, se cultivaron colonias únicas de ETBF de tipo salvaje o la mutante isogénica Δbft de forma anaeróbica durante 24 horas en BHIS. La fracción de la capa densa en electrones se aisló mediante centrifugación de gradiente de densidad, como se describió previamente^[182], y posteriormente se subcultivó en SDM modificado. Las culturas se cultivaron de forma anaeróbica durante 16 horas adicionales.

Las culturas bacterianas se centrifugaron a 5.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de polietetersulfona (PES) de 0,22 μm (Pall Corporation) para eliminar las células y los residuos restantes. Las OMV se precipitaron mediante ultracentrifugación a 150.000 × g durante 2 horas a 4 °C utilizando un rotor Beckman 45 Ti. Las preparaciones de OMV se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante el contenido total de proteínas utilizando un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las OMV se normalizaron a 40 μg de proteína total por 100 μL de PBS para la administración in vivo, como se describió previamente.^[183]

Para administrar BFT in vivo a través de OMV, los ratones fueron pretratados con estreptomicina (5 mg/mL) y clindamicina (0,1 mg/mL) en el agua de beber durante 2 días, seguido de clindamicina sola durante 2 días adicionales. El día 5, los ratones fueron inoculados intragástricamente con 1 × 109 UFC de la cepa NTBF de tipo salvaje o ETBF Δbft. A partir del día 6, los ratones recibieron OMV por gavage oral dos veces al día durante 4 días consecutivos.

Para inducir respuestas intestinales de IL-17 independientes de ETBF, ratones hembra de siete semanas de edad fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Los ratones recibieron gavage oral de curdlan (Sigma-Aldrich) a 10 mg/mL en vehículo (100 μL por ratón) o vehículo solo (glucosa al 5%; Fisher Chemical) una vez al día durante 14 días antes de la inducción de la colitis. Luego, se administró sulfato de dextrano (DSS; Thermo Scientific) al 2,5% (p/v) en el agua de beber durante 5 días, con una solución fresca de DSS preparada diariamente.^[113],^[141]–^[146] Después del tratamiento con DSS, los ratones recibieron 2 mM de sales biliares (Sigma-Aldrich) en el agua de beber o agua estéril durante 5 días adicionales.

Para todos los experimentos, los ratones fueron sacrificados de forma humanitaria en los puntos temporales indicados. Después del sacrificio, se recolectaron tejidos de hígado, ciego y colon, se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C para análisis posteriores de ARNm o se fijaron en formalina al 10% para análisis histopatológico. Para la metabolómica no dirigida, se recolectaron los contenidos del ciego y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se almacenaron a −80 °C hasta que se extrajeron los metabolitos. Para la cuantificación dependiente del cultivo de la carga bacteriana, se recolectaron los contenidos del colon y el ciego en PBS estéril, y se cuantificó la carga de ETBF mediante la siembra de contenidos intestinales diluidos en serie en agar selectivo.

Selección híbrida-RNAseq

Grupos de C57BL/6 fueron desafiados con la cepa ETBF de tipo salvaje o la mutante isogénica Δbft como se describió anteriormente. Después del sacrificio, las muestras del ciego se lisaron inmediatamente después de la recolección en 500 μl de tampón (0,2 M de NaCl y 20 mM de EDTA), 210 μl de SDS al 20% y 500 μl de mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico utilizando Lysing Matrix B. Se extrajo y purificó el ARN total de tres sitios por ratón (tejido intestinal, capa mucosa y contenidos luminales) de ocho ratones (24 muestras biológicas en total) utilizando el RNeasy Mini Kit.

El ARN se utilizó para generar bibliotecas de cDNA de Illumina utilizando una versión modificada del protocolo RNAtag-seq.^[184],^[185] Brevemente, el ARN se fragmentó, se eliminó el ADN genómico, se desfosforiló y se ligó a adaptadores de ADN que contenían códigos de barras 5′-AN8-3′ de secuencia conocida con un grupo fosfato 5′ y un grupo bloqueador 3′. Para garantizar un material de entrada suficiente para la captura híbrida, se generaron bibliotecas utilizando 2,25 μg de ARN total por muestra dividida en 9 réplicas técnicas procesadas en paralelo. Los ARN con códigos de barras de cuatro muestras biológicas se combinaron en cada grupo. El ARN agrupado se sometió a la eliminación de ARNr utilizando el Human RiboCop rRNA Depletion Kit (Lexogen, Cat. No. 144), seguido de la transcripción inversa utilizando un cebador que se dirige a la región constante del adaptador con código de barras, con la adición de un adaptador 3′ mediante el cambio de plantilla (SMARTScribe, Clontech).^[186] El cDNA se enriqueció mediante PCR durante 14 ciclos utilizando cebadores que se dirigen a las regiones constantes de los adaptadores con secuencias Illumina P5/P7 adjuntas que contienen índices únicos por grupo. Los cDNA de los grupos de réplicas generados en paralelo se combinaron y se concentraron y se utilizaron como entrada para el enriquecimiento. El rendimiento del grupo de bibliotecas después de 14 ciclos de PCR varió de 350 (mucosa, ETBF Δbft) a 1600 ng (lumen, ETBF WT). Estas bibliotecas indexadas amplificadas que contienen muestras con códigos de barras se sometieron a enriquecimiento de captura híbrida como se describe a continuación.

El enriquecimiento de secuencias de ETBF utilizando un panel de captura personalizado y reactivos de hibridación y lavado v1 (Twist Biosciences) se realizó en 6 reacciones de captura separadas, cada una de las cuales contenía aproximadamente 250 ng de grupo de bibliotecas de pre-captura. Seguimos las instrucciones del fabricante, excepto que agregamos 5 μg de ADN Cot-1 de ratón (Thermo Fisher) en lugar de la solución bloqueadora humana a la hibridación y utilizamos HiFi HotStart ReadyMix (Roche) para la amplificación por PCR de la captura. Para determinar empíricamente el número mínimo de ciclos para generar cantidades aproximadamente iguales de producto de PCR a pesar de las diferentes cantidades de ETBF en los tres sitios intestinales (mayor en el lumen, menor en el tejido) y ETBF WT (mayor) frente a ETBF Δbft (menor), realizamos reacciones de PCR a pequeña escala de 10 μl a partir de 2 μl de lechada de captura con 8, 12 o 16 ciclos. El número de ciclos de PCR necesarios para generar ~100 fmol de cada biblioteca de captura a partir de 25 μl de lechada varió de 5 (ETBF WT en el lumen) a 11 (tejido).

Los grupos de RNAtag de pre-captura se secuenciaron en dos carriles Illumina NovaSeq S4 a una profundidad promedio de 9,4 × 108 pares de lecturas por muestra. Las bibliotecas de captura se secuenciaron en un carril a una profundidad promedio de 4,8 × 108 pares de lecturas por muestra. Las lecturas de secuenciación generadas están disponibles en la base de datos NCBI BioProject bajo el número de acceso PRJNA1269620.

Análisis de los datos de selección híbrida-RNAseq

Las lecturas de secuenciación de cada muestra en un grupo se desmultiplexaron en función de su secuencia de código de barras asociada utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/splitmergepl). Se permitió hasta 1 desajuste en el código de barras, siempre que no permitiera la asignación de la lectura a un código de barras diferente. Las secuencias de código de barras se eliminaron de la primera lectura y los G terminales de la segunda lectura que pudieron haberse agregado por SMARTScribe durante el cambio de plantilla.

Las lecturas derivadas de B. fragilis se alinearon a la secuencia de referencia GCF 023702735.1 ASM2370273v1 utilizando BWA^[187] y se asignaron los recuentos de lecturas a los genes anotados de RefSeq y otras características genómicas utilizando scripts personalizados (https://github.com/broadinstitute/BactRNASeqCount). Las lecturas derivadas del ratón se alinearon a la secuencia Mus musculus Ensembl GRCm38r94p6 mm10 utilizando bbmap37.10 (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/) y se asignaron los recuentos de lecturas a los transcritos anotados utilizando Salmon0.8.2.^[188]

El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2^[174] y/o edgeR.^[189] La visualización de los datos de secuenciación sin procesar y los gráficos de cobertura en el contexto de las secuencias del genoma y las anotaciones de los genes se realizó utilizando GenomeView.^[190]

Cuantificación dirigida de los niveles de ARNm en el tejido y los contenidos intestinales

El tejido del colon o el ciego se homogeneizó en un homogeneizador de cuentas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies) y se extrajo el ARN utilizando el reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati). Se extrajo el ARN total del ciego o el contenido del colon utilizando el RNeasy PowerFecal Pro Kit (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. Se eliminó la contaminación por ADN utilizando el Turbo DNA-free Kit (Ambion, USA) según las recomendaciones del fabricante. El cDNA se generó mediante el SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, USA). Se realizó PCR en tiempo real utilizando PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem, USA), y los datos se adquirieron en un CFX Maestro 2.3 (Bio-Rad, USA). La transcripción del gen diana de cada muestra se normalizó a los niveles de ARNm de Gapdh (huésped) o mp2 (ETBF).

Análisis de Western blot de la expresión de FABP6 y SLC10A2 en el tejido intestinal

Las proteínas del colon se extrajeron utilizando un tampón de lisis RIPA. Para cada 5 mg de tejido, se agregaron 600 μL de tampón de lisis frío y las muestras se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de cuentas (Precellys 24 Touch, Bertin Technologies). Los lisados se agitaron durante 2 horas a 4 °C y luego se centrifugaron a 16.000 g durante 20 minutos a 4 °C. Se recolectaron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de proteína midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek Instruments).

Las muestras se hirvieron a 95 °C durante 1 minuto, y se resolvieron 50 μg de proteína total por muestra en geles prefabricados TGX al 4-20% (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante transferencia en medio húmedo (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en TBS que contenía 3% de leche seca descremada y 0,1% de Tween-20, y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra FABP6 y SLC10A2. Después del lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con IRDye apropiados durante 1 hora a temperatura ambiente y se analizaron utilizando un escáner de Western blot Odyssey (LICORbio). Los niveles de expresión relativos se cuantificaron utilizando ImageJ, con un ajuste uniforme de los niveles de brillo en todas las muestras.

Aislamiento de colonocitos

Se extrajeron el colon y el ciego de animales infectados con ETBF y se mantuvieron en hielo en RPMI que contenía 10% de FBS. Se eliminó el contenido luminal lavando con HBSS + 5% de FBS + 2 mM de EDTA. Luego, se cortó el colon y el ciego longitudinalmente y en trozos más pequeños, se colocaron en medio HBSS que contenía 5% de FBS, 2 mM de EDTA y 1,5 mM de DTT, y se agitaron a 37 °C durante 50 minutos a 150 rpm. Después de la incubación, se separó el sobrenadante y el tejido, y el sobrenadante se filtró y centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. El precipitado resultante se resuspendió en HBSS que contenía 5% de FBS y 2 mM de EDTA y se mantuvo en hielo. El tejido se digirió en HBSS (que contiene Ca2+ y Mg2+) suplementado con colagenasa (1,5 mg/mL) y DNasa 1 (1000X). Después de agitar durante 25 minutos a 100 rpm, se añadió HBSS que contenía 5% de FBS y 2 mM de EDTA para detener la digestión, el tejido restante se filtró utilizando un filtro celular y las células digeridas se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C. Después de la centrifugación, las dos poblaciones de células (del sobrenadante y del tejido) se combinaron y se purificaron aún más utilizando centrifugación con gradiente de Percoll. Se recogieron las células en la interfase de las capas del 40% y 70%, se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm a 4 °C, se lavaron con RPMI que contenía 10% de FBS y, finalmente, se resuspendieron en 500 μL del mismo medio. Se cuantificó el recuento y la viabilidad celular utilizando un contador de células Countess 3 (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo SCENITH

Las células se sembraron a una concentración de 1 x 106 células/mL en RPMI que contenía 10% de FBS en placas de 96 pocillos y se incubaron en un incubador de CO2 a 37 °C durante 1 hora. Los pocillos se trataron con DMSO Control, 2-Desoxi-D-glucosa (DG, concentración final 250 mM) u Oligomicina (Oligo, concentración final 1 μM). Se añadió puromicina (concentración final 10 μg/mL) y las células se devolvieron al incubador durante 20 minutos. Después del tratamiento con puromicina, las células se lavaron en PBS frío y se tiñeron con una mezcla 1:100 de anticuerpos anti-CD326-APC, CD45 RED Fluo 710, TCR gamma/delta Fluo 450 durante 30 minutos a 4 °C en PBS, 5% de FCS y 2 mM de EDTA (tampón de lavado para FACS). Después del lavado, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con IRDye durante 1 hora a temperatura ambiente y se analizaron utilizando un escáner de Western blot Odyssey (LICORbio). Los niveles de expresión relativos se cuantificaron utilizando ImageJ, con un ajuste uniforme de los niveles de brillo en todas las muestras.

Perfilado de células inmunitarias productoras de IL-17

Se sembraron de 100.000 a 500.000 células por pocillo en 200 μL/pocillo de tampón de estimulación (RPMI que contiene 10% de FBS, 0,67 μL/mL de inhibidor del transportador de proteínas GolgiStop, 500 μg/mL de ionomicina, 25 μg/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)) en placas de 96 pocillos, y se incubaron en un incubador de CO2 a 37 °C durante 4 horas. Las células se tiñeron con una mezcla 1:100 de anticuerpos biotinilados TCR γ/δ en tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS) y se incubaron durante 25 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron e incubaron con una mezcla 1:100 de Streptavidina PE610, CD45 PECy7, TCRβ APC Cy7 durante 25 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con PBS frío y se añadió tinte de viabilidad fantasma (BV510) en una proporción de 1:100 en tampón para FACS. Las células se incubaron luego a 4 °C durante 20 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron en tampón para FACS, se fijaron y se permeabilizaron utilizando el tampón de fijación y permeabilización FOXP3 (Thermo Fisher eBioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante. La tinción intracelular de puromicina se realizó incubando las células durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-puromicina (PE) 1:100 en tampón de permeabilización. Después del lavado, las células se resuspendieron en 250 mL de tampón para FACS (2% de FBS + 2 mM de EDTA en PBS) y se transfirieron a tubos para FACS, y los datos se adquirieron utilizando Fortessa (BD Biosciences). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo (BD Biosciences).

Histopatología

El tejido cecal y cólico se fijó en formaldehído tamponado con fosfato durante 48 horas y se incluyó en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones teñidas se codificaron y se evaluaron utilizando los mismos criterios que se indican en la Tabla S1.

Tinción para hipoxia

Se inyectaron por vía peritoneal 60 mg/kg de pimonidazol (Hypoxyprobe) a ratones infectados con ETBF con el tratamiento indicado, 30 minutos antes de la eutanasia. Después de la eutanasia, se recogieron las muestras como se describe anteriormente y se fijaron en formaldehído al 10%. Los tejidos se incluyeron, seccionaron y se montaron en portaobjetos. Las secciones de tejido cecal y cólico se desparafinaron e incubaron durante 10 minutos a 37 °C con 200 mL de solución de proteinasa K (New England Biolabs) en tampón TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH = 8,0). Los portaobjetos se lavaron en PBS y se bloquearon durante 1 hora a 4 °C con 150 mL de reactivo de bloqueo de IgG de ratón M.O.M (Vector Laboratories). Las muestras se incubaron con 100 μL de antisueros de conejo α-pimonidazol (Hypoxyprobe) en una proporción de 1:100 durante la noche a 4 °C. Las muestras se lavaron en PBS y se incubaron con 100 μL de anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 de cabra (Cell Signaling, 1:150) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, los portaobjetos se contratiñeron con Hoechst durante 5 minutos, seguido de lavados adicionales con PBS y montaje. Se adquirieron imágenes de fluorescencia en mosaico (5 × 5 campos, 15% de superposición) con un microscopio de fluorescencia Nikon ECLIPSE Ti-2 con un objetivo de 20x y el sistema Perfect Focus habilitado. El empalme de imágenes se realizó en tiempo real utilizando NIS-Elements (versión 6.10.01). Las regiones de interés (ROI) se seleccionaron manualmente para excluir la lámina propia bien oxigenada. La intensidad de la tinción de pimonidazol dentro de cada ROI se normalizó a la señal de Hoechst en la misma región para obtener la intensidad de tinción de hipoxia normalizada.

Cuantificación de lactato

Se recogieron el contenido del colon y el ciego de ratones infectados con ETBF en PBS estéril. El contenido se pesó, se diluyó con PBS 1x hasta una densidad final de 40 mg/mL y se homogeneizó mediante una suave agitación en un baño de hielo a 5 °C. Se eliminaron los residuos insolubles mediante centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos a 5 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -20 °C hasta el día del análisis.

El lactato y un estándar interno de lactato-13C3 de isótopo estable (Cambridge Isotopes) se derivatizaron con el reactivo dansilhidrazina y el agente activador de carboxilo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a sus derivados de dansilhidrazona correspondientes en un tampón acuoso de fosfato 250 mM a pH 4 que contiene 40% (v/v) de acetonitrilo. Brevemente, se tomaron alícuotas de 20 μL de los extractos descongelados y se añadieron 5 nmol de lactato-d3, se diluyeron 1:7 con el tampón de derivatización descrito anteriormente y se derivatizaron a temperatura ambiente con la adición de dansilhidrazina (25 μL x 50 mg/mL en acetonitrilo) y EDC (25 μL x 150 mg/mL en agua). Después de una hora a temperatura ambiente, se añadieron 25 μL de agua que contenía 5% (v/v) de TFA para apagar las reacciones. Después de la centrifugación a 10.000 x g durante 30 min a 5 °C, las mezclas de reacción apagadas se transfirieron a viales de muestra de 2 mL equipados con insertos de polipropileno de bajo volumen y septos de goma recubiertos de teflón. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μL. Los estándares de calibración se prepararon en PBS 1x y se derivatizaron de la misma manera. El análisis LC-MS/MS se realizó utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo TSQ Quantum acoplado a un sistema UPLC Waters Acquity. El espectrómetro de masas se operó en modo de iones positivos, con detección mediante monitoreo de reacciones múltiples (MRM) utilizando las siguientes transiciones: Lactato, 338 → 170, CE 27; Lactato-13C3, 341 → 170, CE 27. Los siguientes parámetros del analizador y de la fuente ESI se utilizaron para la detección del analito y del estándar interno: ancho de pico Q1 0,7 Da (FWHM), ancho de barrido Q3 2 Da, voltaje de pulverización 4 kV, temperatura del capilar 300 °C, lente del tubo 120, gas de nitrógeno de la vaina 50; gas auxiliar de nitrógeno 10; CID en la fuente 12. La adquisición de datos y el análisis espectral cuantitativo se realizaron utilizando Thermo Xcalibur versión 2.0.7 SP1 y Thermo LCQuan versión 2.7, respectivamente. Se construyeron curvas de calibración trazando las áreas de los picos frente a las concentraciones de los analitos para una serie de diez estándares de calibración, que oscilan entre 0,10 y 1000 nmol totales de lactato. Se aplicó un factor de ponderación de 1/C2 en el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados para mantener la homogeneidad de la varianza en todo el rango de concentración. Se utilizó una columna de fase inversa de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Waters Acquity BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) para todas las separaciones cromatográficas. Las fases móviles se prepararon con 0,2% de HCOOH + 10 mM de Formato de NH4+ en (A) agua y en (B) acetonitrilo/metanol (9:1). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-1,0 min, B = 5%; 1-8 min, B = 5-100%; 8-9,5 min, B = 100%; 9,5-10 min, B = 100-5%; 10-15 min, B = 5%. La velocidad de flujo se mantuvo en 300 μL/min y el tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 15 min. Se utilizó una válvula de derivación controlada por software para transferir el eluyente de CL desde 0 hasta 3 min y desde 5,5 hasta 15 min de cada ciclo cromatográfico a los residuos.

Cuantificación de ácidos biliares

Se midieron los ácidos biliares (AB) como sus derivados de hidrazida de Girard P.^[191] Brevemente, a 25 μL de homogenado, se añadió una mezcla de estándares internos de ácidos biliares deuterados (5 μL x 25 μg/mL de cada uno: colato-d4, desoxicato-d4, glicocolato-d4, quenodesoxicato-d4, ursodesoxicato-d4 y litocolato-d4; todos de CDN Isotopes). Las muestras enriquecidas se extrajeron posteriormente con 750 μL de una solución de metanol/metil terc-butil éter/cloroformo (1,3:1:1 v/v/v). Tras la centrifugación a 10.000 x g, se retiraron los sobrenadantes y se evaporaron bajo una suave corriente de gas nitrógeno. Los residuos se reconstituyeron en 100 μL de tampón de piridina clorhidrato (300 mM, pH 4,5) antes de añadir 25 μL x 50 mg/mL de reactivo de Girard P en acetonitrilo/agua (1:1) y 25 μL x 150 mg/mL del agente activador de carboxilo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) en agua para convertir los AB en sus correspondientes hidrazidas de Girard P. Después de agitar durante la noche a 4 °C, las reacciones se detuvieron con 25 μL x 5 % (v/v) de TFA en agua. Las reacciones detenidas se centrifugaron a 18.000 x g y luego se transfirieron a viales de autosamplificador de 2 mL equipados con insertos de polipropileno de bajo volumen y septos de goma revestidos de teflón. El volumen de inyección de la muestra fue de 10 μL. Los estándares de calibración de AB se prepararon en agua y se derivatizaron de la misma manera. El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS) se realizó utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución híbrido cuadrupolo/órbita-trampa Thermo Q Exactive HF, acoplado a un sistema HPLC Vanquish Horizon (Thermo Fisher). Los espectros de masas de alta resolución se adquirieron en modo de iones positivos en un rango de exploración de iones precursores de m/z de 300 a 800 a una potencia de resolución de 60.000 utilizando los siguientes parámetros de la fuente ESI: voltaje de pulverización 4 kV; temperatura del capilar 300 °C; temperatura HESI 100 °C; s-lente 95; gas de nitrógeno de la vaina 40; gas auxiliar de nitrógeno 10. Se construyeron cromatogramas de iones extraídos para cada AB basándose en las siguientes masas exactas [M+H]+ y una tolerancia de masa de +/− 5 ppm: CA, 542,3588; CA-d4, 546,3840; DCA y CDCA, 526,3639; DCA-d4 y CDCA-d4, 530,3890; LCA e iso-LCA, 510,3690; LCA-d4, 514,3941; 3-oxo-LCA, 508,3534. La adquisición de datos y el análisis espectral cuantitativo se realizaron utilizando Thermo Xcalibur versión 4.1.31.9 y Thermo LCQuan versión 2.7, respectivamente. Se construyeron curvas de calibración trazando las áreas de los picos frente a las concentraciones de los analitos para una serie de once estándares de calibración, que oscilan entre 0,15 y 1500 pmol totales de cada AB. Se aplicó un factor de ponderación de 1/C2 en el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados para mantener la homogeneidad de la varianza en todo el rango de concentración. Se utilizó una columna analítica de fase inversa Acquity HSS C18 (2,1 x 150 mm, 1,7 μm, Waters, Milford, MA) para todas las separaciones cromatográficas. Las fases móviles se prepararon con 0,2 % de ácido fórmico + 10 mM de formiato de amonio en (A) agua/metanol/acetonitrilo (8:1:1) y en (B) metanol/acetonitrilo (4:1). Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-1,0 min, B = 10 %; 1-15 min, B = 10-100 %; 15-17,5 min, B = 100 %; 17,5-18 min, B = 100-10 %; 18-22 min, B = 10 %. El caudal se mantuvo en 300 μL/min y el tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 22 min. Se utilizó una válvula de derivación controlada por software para transferir el eluyente de LC desde 0 hasta 5 min de cada ciclo cromatográfico a los residuos.

Metabolómica no dirigida

Las muestras se almacenaron a −80 °C hasta que se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas tándem de alta resolución (LC-HRMS y LC-HRMS/MS) en el Centro de Tecnología Innovadora de Vanderbilt (CIT) utilizando métodos descritos previamente.^[192]–^[194] Brevemente, las muestras de contenido intestinal de ratón congeladas (n=8, 4 réplicas biológicas para cada grupo de muestras) se lisaron en 1 ml de tampón de lisis frío (1:1:2, v:v:v, acetonitrilo: metanol: bicarbonato de amonio 0,1 M - pH 8,0) y se homogeneizaron individualmente utilizando un sonicador de punta de sonda al 50 % de potencia (10 pulsos). Las muestras homogeneizadas se normalizaron por peso a una cantidad igual por muestra. Las proteínas se precipitaron de las muestras individuales añadiendo 800 μL de metanol frío, seguido de incubación durante la noche a −80 °C. Las proteínas precipitadas se pelletizaron por centrifugación (15.000 rpm, 15 min) y los extractos de metabolitos se secaron al vacío.

Los extractos individuales se reconstituyeron en 100 μL de acetonitrilo/agua (3:97, v:v) con 0,1 % de ácido fórmico que contenía carnitina-D9, triptófano-D3, valina-D8 e inosina-4N15 isotópicamente etiquetados, y se centrifugaron durante 5 min a 10.000 rpm para eliminar el material insoluble. Se preparó una muestra de control de calidad agrupada (QC agrupada) agrupando volúmenes iguales de muestras individuales. El QC agrupado se utilizó para el acondicionamiento de la columna (8 inyecciones antes del análisis de la muestra), la alineación del tiempo de retención y para evaluar la reproducibilidad del instrumento de espectrometría de masas en todo el conjunto de muestras.

Se realizaron análisis de espectrometría de masas globales y no dirigidos en un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-órbita-trampa Q-Exactive HF de alta resolución (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) equipado con un sistema UHPLC binario Vanquish (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Los extractos (5 μL de volumen de inyección) se separaron en una columna Hypersil Gold C18, 1,9 μm, 2,1 mm × 100 mm (Thermo Fisher) mantenida a 40 °C. La cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) se realizó a 250 μL/min utilizando el disolvente A (0,1 % de ácido fórmico en agua) y el disolvente B (0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo/agua 80:20) con una longitud de gradiente de 30 min, como se describió previamente.^[195],^[196] Los análisis de MS intactos se adquirieron en el rango de relación masa/carga (m/z) de 70-1.050 en modo de iones positivos a una resolución de 120.000 con una velocidad de barrido de 3,5 Hz, un control automático de ganancia (AGC) objetivo de 1x106 y un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms, y los espectros de MS/MS (o tándem) se recogieron a una resolución de 15.000, un AGC objetivo de 2x105 iones, con un tiempo máximo de inyección de iones de 100 ms.

Procesamiento de datos de metabolómica y análisis estadístico

Los datos brutos de espectrometría de masas (MS) se importaron, procesaron, normalizaron y evaluaron utilizando el software Progenesis QI (versión 3.0; Non-linear Dynamics, Newcastle, Reino Unido). Las abundancias relativas de los estándares de control de calidad (QA/QC) pesados añadidos mostraron < 13 % de variabilidad para la preparación de la muestra y < 3 % para la variabilidad del instrumento. Todos los análisis de MS y MS/MS se alinearon a una muestra de control de calidad agrupada (QC). Los iones detectados (es decir, pares de m/z y tiempo de retención únicos) se desadujeron y desisotoparon para producir características analíticas distintas. Los datos se normalizaron a todos los compuestos y la significación estadística se evaluó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) sobre los valores de abundancia de los compuestos normalizados. Tanto las anotaciones de metabolitos tentativos como las putativas (nivel de confianza 1-3)^[197] se asignaron basándose en mediciones de masa exactas (error de masa < 5 ppm), similitud del patrón isotópico, espectro de fragmentación MS/MS y coincidencia del tiempo de retención mediante la consulta de la Base de datos del metaboloma humano^[198] y la biblioteca de referencia interna del CIT.

Se utilizó Metaboanalyst 5.0 (www.metaboanalyst.ca/) para realizar visualizaciones de alto nivel, incluidos mapas de calor para los compuestos con significación estadística (valor p ≤ 0,05).^[199] Los datos de metabolómica no dirigida están disponibles en el sitio web del National Metabolomics Data Repository (NMDR) del NIH Common Fund, el Metabolomics Workbench, https://www.metabolomicsworkbench.org, en el estudio asignado donde se le ha asignado el ID de estudio ST003919. Los datos se pueden acceder directamente a través de su DOI del proyecto: https://doi.org/10.21228/M8PR93.

Secuenciación y análisis de amplicones de ADNr 16S

Se prepararon bibliotecas a partir del ADN aislado de los contenidos cecales utilizando el kit Qiagen PowerSoil Pro y se amplificó la región hipervariable V3-V4 del código de secuencias de ADNr 16S. La biblioteca se construyó y se secuenció utilizando un sistema Illumina MiSeq, generando lecturas de 250 pb de pares finales, con quimeras eliminadas.^[200] El análisis posterior se realizó y se visualizó con QIIME2^[179] versión 2024.5. El perfilado taxonómico se realizó con la base de datos SILVA versión 132.^[180] Las lecturas de secuenciación generadas durante el presente estudio están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB89357 (número de acceso secundario ENA: ERP172384).

RNAseq a granel y análisis

Para el RNAseq in vitro de bacterias, ETBF se cultivó en BHIS antes de la subcultura en BHIS suplementado con lactato de forma anaeróbica o en presencia de 0,1 % de O2 durante 3 horas a 37 °C. Se añadió Bacteria RNAprotect (Qiagen) para preservar el transcrito. Las bacterias se lisaron utilizando Lysing Matrix B (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). Se construyó una biblioteca de pares finales de 150 pb utilizando una estrategia de RNAtag-seq^[184] y se secuenció en un Illumina NovaSeq (Illumina, CA). Las lecturas se recortaron utilizando el conjunto de software BBMap y se mapearon al genoma de ETBF (GCF023702735.1ASM2370273v1) utilizando Bow-tie2.^[184] Las lecturas mapeadas se cuantificaron utilizando el paquete de software featureCounts^[201] y el análisis de expresión diferencial se realizó utilizando el software DESeq2.^[174] El agrupamiento a nivel de características, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y el análisis de redes de coexpresión de genes ponderados se realizaron en BigOmics Analytics.^[172] Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB89361 (número de acceso secundario ENA: ERP172389).

Para el RNAseq de tejidos de ratón, se extrajo el ARN de los tejidos cecales de ratones infectados con ETBF utilizando Tri-reagent (Molecular Biology Center) y el kit RNeasy mini (Qiagen). Los tejidos se homogeneizaron utilizando Lysing Matrix C (MP Bio) y Tri-reagent (Molecular Biology Center), y el ARN se purificó utilizando el kit RNeasy mini (Qiagen). El transcriptoma se secuenció utilizando los métodos descritos anteriormente. Las lecturas se mapearon al genoma del ratón (mm10, UCSC Genome Browser) utilizando Bowtie2,^[184] y el análisis de expresión diferencial se realizó utilizando el software DESeq2.^[174]

Secuenciación del genoma completo

Los aislados de Bacteroides fragilis se cultivaron en BHIS. El ADN genómico se extrajo utilizando el kit Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Se prepararon bibliotecas de secuenciación de pares finales (~150 pb de lecturas) utilizando un kit de preparación de ADN Illumina (Illumina, CA) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq (Illumina, CA). El ensamblaje del genoma y la identificación de especies bacterianas se realizaron utilizando la plataforma BV-BRC193 (versión 3.55.17). Las lecturas de secuenciación generadas para este análisis están disponibles en el repositorio European Nucleotide Archive bajo el número de acceso ENA: PRJEB107014 (número de acceso secundario ENA: ERP188052).

Modelado metabólico a escala genómica

Se reconstruyó un modelo metabólico a escala genómica para la cepa enterotoxigénica de B. fragilis siguiendo protocolos establecidos^[202] y el conjunto de herramientas COBRA versión 2.13.3 para Matlab.^[203] En particular, se utilizó como plantilla un GEM existente, curado manualmente y validado con datos para la cepa B. fragilis 638R, junto con varios otros GEMs de gramnegativas de la base de datos BiGG^[205]: múltiples GEMs de E. coli,^[206],^[207]
Shigella boydii,^[207]
Shigella dysenteriae,^[207]
Shigella flexneri,^[207] y Klebsiella pneumoniae.^[208] Los genes metabólicos utilizados en cada una de estas reconstrucciones anteriores se compararon con los genes de esta cepa de B. fragilis utilizando BLAST (valor E < 10−30, identidad > 50 %); cualquier gen coincidente y sus reacciones asociadas se añadieron a un modelo de borrador y luego se curaron manualmente para garantizar la precisión. El modelo se curó para que creciera en medios definidos conocidos para ser adecuados para B. fragilis, una producción de ATP realista y un equilibrio de masas, como se hizo para la reconstrucción del modelo 638R existente.^[204]

El modelo se transformó posteriormente en modelos específicos para cada contexto, con el fin de analizar los flujos en cada uno de los tres sitios de muestra (tejido del ciego, lumen y moco), utilizando StanDep,^[209] un algoritmo para determinar qué reacciones deben estar activas en diferentes condiciones basándose en datos transcriptómicos. Para simular el complejo medio del intestino humano, todos los nutrientes se proporcionaron a los modelos en pequeñas cantidades (hasta un milimol por gramo de peso seco por hora). Los modelos reducidos para cada sitio se optimizaron posteriormente para un crecimiento máximo utilizando un análisis de equilibrio de flujo parsimonioso.^[210] Esto se repitió para la cepa mutante isogénica ETBF que carece de bft. El modelo subyacente para la cepa mutante no se modificó antes del procesamiento con StanDep, ya que bft no es un gen metabólico presente en la reconstrucción.

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

A menos que se indique lo contrario, el análisis de datos se realizó en GraphPad Prism v10.4.2. Los valores del tamaño de la población bacteriana, los índices de competencia, los cambios en los niveles de ARNm y la longitud normalizada del colon se distribuyeron normalmente después de la transformación mediante el logaritmo natural. Se utilizó una prueba t de Student de dos colas para los datos transformados con logaritmo natural. A menos que se indique lo contrario, *, P < 0,05; , P < 0,01; *, P < 0,001; ns, no estadísticamente significativo. En todos los experimentos con ratones, N se refiere al número de animales de los que se tomaron muestras. Los detalles estadísticos de los experimentos, incluido el valor exacto de N, la definición del centro y la dispersión, se pueden encontrar en las figuras o en las leyendas de las figuras. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de los datos transformados con logaritmo. El tamaño de la muestra (es decir, el número de animales por grupo) no se estimó a priori, ya que no se pueden predecir los tamaños del efecto en nuestro sistema. No se eliminaron valores atípicos estadísticos predichos, ya que la presencia o ausencia de estos posibles valores atípicos estadísticos no afectó a la interpretación general. Los ratones que fueron sacrificados antes de lo previsto debido a problemas de salud se excluyeron del análisis.

Material Suplementario

La información complementaria se puede encontrar en línea en https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.04.012.