Mecanismos de resistencia genéticos y no genéticos concurrentes a la inhibición de KRAS en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, y representa casi 1 millón de muertes anualmente.^[1],^[2] El gen KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) es el oncogén más comúnmente mutado en el CCR, y se observa en hasta el 50% de los casos.^[3] En la última década, han surgido múltiples inhibidores de moléculas pequeñas, tanto selectivos como no selectivos, dirigidos a las proteínas RAS.^[4],^[5] Los inhibidores de KRAS de primera generación, adagrasib y sotorasib, han demostrado beneficio clínico en pacientes con varios tipos de cáncer que presentan mutaciones KRASG12C.^[6]-^[9] Además de estas moléculas pequeñas selectivas para G12C, ahora existe una variedad de compuestos adicionales en desarrollo preclínico y clínico, incluidos los inhibidores selectivos para G12D y los inhibidores pan-RAS, con el potencial de dirigirse a la mayoría de las variantes de KRAS.^[10]-^[13] Por lo tanto, en la próxima década, es probable que millones de pacientes con cáncer sean tratados con inhibidores de KRAS.

Los ensayos clave KRYSTAL-1 y CodeBreak 300, que condujeron a la aprobación de adagrasib y sotorasib, respectivamente, mostraron que solo una fracción de los pacientes con CCR KRASG12C responden al tratamiento.^[6],^[7] Además, las respuestas objetivas a menudo son de corta duración, con una mediana de supervivencia libre de progresión de menos de 7 meses.^[6],^[7] El análisis del ADN libre de células tumorales (cfDNA) y las muestras de tumor después de la progresión muestra que las mutaciones secundarias de la vía RAS surgen con frecuencia durante el tratamiento.^[14]-^[17] Sin embargo, un subconjunto de tumores resistentes carece de un mecanismo genético de escape claro. Además, incluso cuando surgen mutaciones secundarias, a menudo están presentes en bajas frecuencias alélicas y, a veces, desaparecen bajo una presión terapéutica continua, lo que indica una baja aptitud clonal.^[14]-^[16] Por lo tanto, si bien los eventos subclonales pueden permitir que un subconjunto de células escape al tratamiento, es poco probable que impulsen el crecimiento de la mayoría de las células resistentes.

Comprender los mecanismos subyacentes tanto de la resistencia primaria como de la adquirida a los agentes dirigidos a KRAS es crucial para desarrollar terapias combinadas que logren respuestas más profundas y duraderas. Con este fin, analizamos muestras clínicas emparejadas de pacientes de ensayos de inhibidores de KRAS utilizando la secuenciación génica dirigida Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT) y la transcriptómica espacial unicelular. Además, desarrollamos modelos de organoides resistentes para investigar funcionalmente las adaptaciones tumorales a la inhibición de KRAS. Nuestros hallazgos revelan que tanto los mecanismos de resistencia genéticos como los no genéticos coexisten dentro de los mismos pacientes, exhibiendo una heterogeneidad intratumoral significativa, con diversos programas de transcripción adaptativos que predominan en diferentes zonas tumorales. Además, demostramos que la fase aguda inicial de la inhibición de KRAS se caracteriza por la señalización inflamatoria intrínseca a las células e identificamos una estrategia terapéutica que combina KRAS más la inhibición de la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1) para mitigar estas adaptaciones tempranas y mejorar las respuestas al tratamiento.

RESULTADOS

Adaptación genética y no genética a la inhibición de KRAS en el CCR

Para identificar las respuestas genéticas y no genéticas a la inhibición de KRAS, recopilamos de forma prospectiva muestras de pacientes emparejadas, pretratamiento (n = 11), durante el tratamiento (día 7 a día 21) (n = 11) y posprogresión (“resistente”) (n = 8) de 12 pacientes con CCR tratados con inhibición combinada de KRASG12C y EGFR (Figuras 1A y 1B). Once pacientes se sometieron a biopsias pretratamiento y durante el tratamiento, mientras que 7 pacientes se sometieron a biopsias en tres puntos temporales; en algunos casos, se capturó el perfil genómico a través de ADN tumoral libre o circulante (ctDNA) sin biopsia de tejido (Figura 1A). Los pacientes recibieron tratamiento en uno de dos ensayos clínicos que combinaban sotorasib más panitumumab, o que evaluaban adagrasib con o sin cetuximab^[6],^[18]; todos los pacientes habían recibido previamente quimioterapia basada en fluoropirimidinas, y todos los pacientes, excepto uno, recibieron inhibición combinada de KRASG12C y EGFR. Entre estos pacientes, cinco mostraron respuestas parciales, mientras que siete presentaban enfermedad estable según los criterios RECIST (Figura 1A). La duración media del tratamiento fue de 9,4 meses, lo que refleja estrechamente las poblaciones de ensayos más amplias.^[6],^[7] Las características tumorales, la respuesta al tratamiento y los datos de secuenciación del exoma (basal y resistente) se resumen en la Figura 1A.

La secuenciación del exoma dirigida utilizando MSK-IMPACT mostró eventos genéticos adquiridos en siete de los once pacientes para los que se dispuso de muestras pretratamiento y resistentes (incluidas muestras de tumor sólido o biopsias líquidas) (Figuras 1A y S1). Seis pacientes presentaban una o más mutaciones adquiridas en reguladores conocidos de la señalización RAS, incluidas las amplificaciones de KRASG12C y FLT3, y las mutaciones con cambio de sentido en EGFR, FLT3, DUSP4 y ROS1. La mayoría de los posibles impulsores de la resistencia eran subclonales; de las 17 mutaciones de novo detectadas en las biopsias resistentes, solo siete eran clonales (definidas como una frecuencia alélica de variantes >50% en relación con las mutaciones clonales preexistentes) (Figura S1). No se identificaron eventos genéticos adquiridos en los cuatro pacientes restantes. Por lo tanto, al igual que se informó previamente en el CCR y otros tipos de cáncer después de la progresión con inhibidores de KRAS, las mutaciones de escape no se identificaron de forma universal y, a menudo, eran subclonales.^[14]-^[16]

Para identificar las adaptaciones tumorales fenotípicas, realizamos transcriptómica espacial de biopsias emparejadas pretratamiento, durante el tratamiento y resistentes (Figura 1B). Utilizamos una plataforma de hibridación fluorescente cíclica in situ (CosMx) que cuantifica la abundancia relativa de 950 transcritos a nivel de resolución unicelular directamente en tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE).^[19] Un total de 679.588 células superaron el control de calidad en todas las muestras de pacientes, incluidas 375.985 células cancerosas. La agrupación no supervisada de perfiles unicelulares identificó 14 subconjuntos de células, que se anotaron mediante marcadores de expresión génica conocidos (Figuras 1C, 1D, S2A y S2B). Las células cancerosas se anotaron en función de su alta expresión de marcadores epiteliales/CCR (KRT8, KRT18, KRT19, EPCAM y CLDN4) que eran notablemente distintos de otras poblaciones epiteliales en los sitios metastásicos, como los hepatocitos (Figuras 1D, S2A y S2B). Las células malignas mostraron una heterogeneidad significativa y, en general, se agruparon por paciente y estado de tratamiento (Figura 1E). Las muestras pretratamiento y resistentes fueron más diversas en su transcripción que las muestras durante el tratamiento, que generalmente se agruparon y mostraron una menor heterogeneidad intratumoral (Figuras 1E y S2C). En contraste, la heterogeneidad transcripcional intratumoral fue similar en todas las condiciones de tratamiento (Figuras 1E y S2C). Como se esperaba, el análisis de la abundancia de tipos de células mostró una disminución significativa en el número de células malignas al inicio del tratamiento en relación con los puntos temporales pretratamiento (Figuras 1F, 1G y S2D-2G). También observamos una mayor proporción de fibroblastos asociados al cáncer (CAF), células B y células endoteliales en las biopsias durante el tratamiento (Figuras 1F, 1G y S2D), aunque la diferencia solo siguió siendo estadísticamente significativa para las células B cuando se excluyeron las células cancerosas del análisis (Figura S2E).

Dado que la sensibilidad limitada de la plataforma CosMx para resolver poblaciones inmunitarias específicas, complementamos el análisis de transcriptómica espacial con inmunofluorescencia multiplex (mIF) en un subconjunto de muestras con suficiente tejido restante (Figuras S2F y S2G). La abundancia relativa de las subpoblaciones epiteliales e inmunitarias se cuantificó utilizando anticuerpos contra panCK, CD4, FOXP3, CD8, CD68 y CD163. Este análisis reveló un enriquecimiento significativo de las células T CD4+ en las muestras durante el tratamiento, una población que no se capturó de forma robusta mediante el ensayo CosMx (Figuras S2F-S2G). Otras poblaciones inmunitarias y del estroma no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los puntos temporales.

Para identificar las respuestas adaptativas a la inhibición de RAS específicamente en las células tumorales, examinamos los genes y programas expresados de forma diferencial y en las muestras emparejadas de biopsias. El análisis de sobre-representación (ORA) y el análisis de variación de conjuntos de genes (GSVA) en las colecciones de conjuntos de genes Hallmark y de tipos de células intestinales seleccionados (Tabla S1) mostraron la activación de las firmas de células de Paneth y células madre intestinales, así como múltiples programas inflamatorios en las muestras durante el tratamiento y resistentes (Figuras 2A y 2B). La anotación de los genes individuales que se expresaron de forma significativa de forma diferencial (cambio de pliegue log2 >0,3, p ajustada 50% en relación con las mutaciones clonales preexistentes) (Figura S1). No se identificaron eventos genéticos adquiridos en los cuatro pacientes restantes. Por lo tanto, al igual que se informó previamente en el CRC y otros tipos de cáncer tras la progresión con inhibidores de KRAS, las mutaciones de escape no se identificaron de forma universal y, a menudo, eran subclonales.^[14]-^[16]

Para identificar las adaptaciones tumorales fenotípicas, realizamos transcriptómica espacial de biopsias emparejadas previas al tratamiento, durante el tratamiento y resistentes (Figura 1B). Utilizamos una plataforma de hibridación fluorescente cíclica in situ (CosMx) que cuantifica la abundancia relativa de 950 transcritos a nivel de resolución de una sola célula directamente en tejido fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE).^[19] Un total de 679.588 células superaron el control de calidad en todas las muestras de los pacientes, incluyendo 375.985 células cancerosas. La agrupación no supervisada de perfiles de células individuales identificó 14 subconjuntos de células, que se anotaron mediante marcadores de expresión génica conocidos (Figuras 1C, 1D, S2A y S2B). Las células cancerosas se anotaron en función de su alta expresión de marcadores epiteliales/de CRC (KRT8, KRT18, KRT19, EPCAM y CLDN4) que eran notablemente distintos de otras poblaciones epiteliales en los sitios metastásicos, como los hepatocitos (Figuras 1D, S2A y S2B). Las células malignas mostraron una heterogeneidad significativa y, en general, se agruparon por paciente y estado del tratamiento (Figura 1E). Las muestras previas al tratamiento y resistentes fueron más diversas a nivel de la transcripción que las muestras durante el tratamiento, que generalmente se agruparon y mostraron una disminución de la heterogeneidad intratumoral (Figuras 1E y S2C). En contraste, la heterogeneidad transcripcional intratumoral fue similar en todas las condiciones de tratamiento (Figuras 1E y S2C). Como se esperaba, el análisis de la abundancia de tipos de células mostró una disminución significativa en el número de células malignas al inicio del tratamiento en relación con los momentos previos al tratamiento (Figuras 1F, 1G y S2D-2G). También observamos una proporción aumentada de fibroblastos asociados al cáncer (CAF), células B y células endoteliales en las biopsias durante el tratamiento (Figuras 1F, 1G y S2D), aunque la diferencia solo siguió siendo estadísticamente significativa para las células B cuando se excluyeron las células cancerosas del análisis (Figura S2E).

Dada la sensibilidad limitada de la plataforma CosMx para resolver poblaciones inmunitarias específicas, complementamos el análisis de transcriptómica espacial con inmunofluorescencia multiplex (mIF) en un subconjunto de muestras con suficiente tejido restante (Figuras S2F y S2G). La abundancia relativa de las subpoblaciones epiteliales e inmunitarias se cuantificó utilizando anticuerpos contra panCK, CD4, FOXP3, CD8, CD68 y CD163. Este análisis reveló un enriquecimiento significativo de las células T CD4+ en las muestras durante el tratamiento, una población que no fue capturada de forma robusta por el ensayo CosMx (Figuras S2F-S2G). Otras poblaciones inmunitarias y del estroma no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes momentos.

Para identificar las respuestas adaptativas a la inhibición de RAS específicamente en las células tumorales, examinamos los genes y programas expresados de forma diferencial en el compartimento de las células malignas de las biopsias emparejadas. El análisis de sobre-representación (ORA) y el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) en las colecciones de conjuntos de genes Hallmark y de tipos de células intestinales seleccionados (Tabla S1) mostraron la activación de las firmas de células de Paneth y células madre intestinales, así como múltiples programas inflamatorios en las muestras durante el tratamiento y resistentes (Figuras 2A y 2B). La anotación de los genes individuales que se expresaron de forma significativamente diferencial (cambio de pliegue log2 >0,3, p ajustada < 0,05) en al menos dos tercios de las muestras mostró nuevamente un marcado enriquecimiento de la señalización del interferón (IFN) y las citocinas en las muestras durante el tratamiento (Figura 2C). En contraste, las muestras resistentes al tratamiento mostraron un enriquecimiento de la transición epitelial a mesenquimal (EMT), los programas de tipo fetal y la proteína asociada al Yes 1 (YAP) (Figuras 2B-2D, 3A, S3 y S4) que nosotros y otros hemos relacionado previamente con la metástasis del CRC y la resistencia a la terapia dirigida al WNT.^[20]-^[27] También hubo una disminución marcada de los marcadores de diferenciación epitelial e intestinal, y un aumento correspondiente de los marcadores de células madre intestinales bajo el tratamiento con el inhibidor de KRAS, pero en la mayoría de los casos, estas firmas volvieron a los niveles basales en las muestras resistentes (Figura 2B). Como se esperaba, la expresión de los genes diana de KRAS fue menor durante el tratamiento en comparación con el nivel basal y, posteriormente, aumentó en la progresión en un subconjunto de pacientes (Figuras 2B-2D, 3A y S3), probablemente debido a la interrupción de la terapia KRAS/EGFR.

Un resultado notable en nuestros datos fue el paciente 4, que, en contraste con otros casos, mostró una expresión robusta de los programas de IFN de tipo 1 y tipo 2 en la biopsia previa al tratamiento (Figura S3). Es importante destacar que, antes de la biopsia durante el tratamiento, el paciente comenzó el tratamiento para una exacerbación de la artritis reumatoide con el fármaco antiinflamatorio hidroxicloroquina y, después de la biopsia durante el tratamiento, recibió rituximab durante el tratamiento del estudio.

Coexistencia de resistencia genética y no genética a la inhibición de KRAS

La presencia de cambios genéticos y no genéticos en la transcripción en las muestras de progresión planteó la cuestión de si estos cambios eran coincidentes en los tumores individuales. De hecho, se identificó una reprogramación transcripcional en cada una de las ocho biopsias resistentes analizadas, incluidas aquellas con múltiples alteraciones genéticas de resistencia putativas (Figuras 3A, 3B y S3-S5). Por ejemplo, la secuenciación del exoma tumoral resistente del paciente 5 mostró una amplificación de KRASG12C (ganancia de 5,9 veces en el número de copias), FLT3 y MDM2, así como mutaciones con cambio de sentido adquiridas en DUSP4, ATM, AURKA, SERPINB3 y STAG3 (Figura 3A). Además de la sobreexpresión esperada de los transcritos de KRAS y la reactivación posterior de la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), probablemente impulsada por la amplificación de KRASG12C y otras mutaciones de la vía RAS, el análisis de la transcriptómica reveló un fuerte enriquecimiento de las firmas de YAP y del intestino fetal en la progresión (Figura 3B), lo que revela que incluso en los casos con perfiles de resistencia genética descritos,^[14]-^[17] pueden ocurrir adaptaciones transcripcionales y de linaje.

En algunos casos, la secuenciación de MSK-IMPACT y los datos de la transcriptómica revelaron mecanismos de resistencia genéticos y no genéticos coexistentes, pero el análisis espacial reveló una heterogeneidad intratumoral significativa, con un enriquecimiento de programas adaptativos distintos en diferentes zonas de los tumores individuales (Figuras 3C-3F y S3-S5). Por ejemplo, el paciente 4 progresó después de 23,5 meses de tratamiento con sotorasib más panitumumab, y la secuenciación de MSK-IMPACT no mostró eventos genéticos que predijeran la activación de la señalización de MAPK (Figura 3C). La transcriptómica espacial reveló dos áreas distintas con perfiles transcripcionales aparentemente mutuamente excluyentes. El área 1 mostró un fuerte enriquecimiento de los programas de IFN de tipo 1, YAP y del intestino fetal, pero una baja señalización de MAPK. En contraste, el área 2 mostró una reactivación robusta de MAPK, pero una supresión de los programas de IFN de tipo 1, YAP y los marcadores fetales (Figuras 3D y 3E). Observamos un fenómeno similar en las biopsias de progresión del paciente 1, que mostraron regiones tumorales aisladas con alta expresión de YAP y baja expresión de MAPK yuxtapuestas a áreas con baja expresión de YAP y alta expresión de MAPK (Figura S5). Estas observaciones resaltan la posibilidad de que perfiles de resistencia independientes puedan evolucionar en paralelo dentro del mismo tumor y pueden explicar la frecuente aparición de múltiples eventos genéticos subclonales en la progresión capturados mediante el perfilado de ctADN.^[14]-^[16]

Activación autónoma de los programas inflamatorios de las células cancerosas tras la inhibición de RAS

A continuación, preguntamos si la reprogramación transcripcional depende del microambiente tumoral. El análisis de las vías y la expresión génica diferencial del compartimento no maligno reveló amplias firmas inflamatorias en los CAF, las células mieloides y las células linfoides tanto en las muestras durante el tratamiento como en las resistentes (Figuras S6 y S7). El análisis de sobre-representación demostró un enriquecimiento significativo de las vías de las citocinas, el IFN, JAK-STAT y relacionadas con el sistema inmunitario en múltiples compartimentos. En particular, CXCL12, una quimiocina que se ha relacionado previamente con la EMT y la resistencia a la terapia,^[28], fue uno de los genes más expresados en los CAF y los monocitos en los momentos del tratamiento y la resistencia (Figuras S6 y S7).

Para investigar las posibles comunicaciones entre células, realizamos un análisis de interacción ligando-receptor utilizando CellChat,^[29], que infiere la señalización intercelular estimando la probabilidad de interacción en función de los niveles de expresión de los ligandos en las “células emisoras” y los receptores correspondientes en las “células receptoras”. Para obtener información sobre las interacciones ligando-receptor temporales y específicas del estado, realizamos análisis CellChat independientes de las muestras previas al tratamiento, durante el tratamiento y de progresión, así como de las regiones de biopsia con alta expresión de IFN, YAP y RAS (Figura S8). Estos análisis revelaron algunas interacciones ligando-receptor estadísticamente significativas, aunque débiles, incluyendo desde las células mieloides y linfocíticas hasta las células cancerosas, como la posible señalización TGFB2-TGFBR2 desde las células T hasta las células tumorales específicamente en el contexto del tratamiento (Figura S8). Es interesante destacar que previamente identificamos la señalización de TGF-β como un impulsor del cambio de linaje y la resistencia a los fármacos en las células cancerosas intestinales,^[20], lo que sugiere que estas interacciones pueden ser funcionalmente importantes en este contexto. Aún así, en general, estos datos sugieren que la señalización directa ligando-receptor desde las células inmunitarias hasta las células cancerosas puede ser limitada. Por supuesto, el análisis de CellChat se limita a solo los pares ligando-receptor incluidos en el panel de 950 genes de CosMx; no podemos descartar la participación de la señalización de genes/proteínas que no están representados en esta colección.

Para medir directamente las respuestas de las células tumorales a la inhibición de KRAS en presencia o ausencia de un microambiente tumoral completo, generamos organoides de colon C57Bl/6 que portan una truncación de Apc (APCQ1405X), una mutación endógena de Kras (KRASG12C) y una truncación de Trp53 (p53Q97X) (en adelante, AKP-G12C). Los organoides injertados tanto en ratones inmunocompetentes (C57Bl/6) como en ratones inmunocomprometidos (NSG) mostraron una respuesta marcada al tratamiento con adagrasib y, en un período de más de 4 semanas, mostraron un crecimiento acelerado en presencia del fármaco. No observamos diferencias significativas en el crecimiento de los tumores en ratones C57Bl/6 o NSG (Figuras S9A y S9B), lo que sugiere que, al menos en el modelo murino, la respuesta y la resistencia a adagrasib no dependen de la señalización de los tipos de células inmunitarias, aunque no podemos descartar la contribución de poblaciones no inmunitarias. Para explorar la resistencia en ausencia de todos los demás tipos de células, tratamos los organoides AKP-G12C con adagrasib solo o con la combinación de adagrasib y afatinib, imitando el tratamiento combinado de KRAS/EGFRi utilizado clínicamente. Las culturas de organoides AKP-G12C mostraron una disminución dependiente de la dosis en la fosforilación de ERK (Figura 4A) y detención del crecimiento tras la inhibición de KRAS (adagrasib) o la inhibición combinada de KRAS/EGFR (adagrasib/afatinib) (Figuras 4B-4D). El tratamiento continuo dio lugar a organoides altamente resistentes después de 10 a 12 semanas de tratamiento (Figuras 4B-4F), mostrando un cambio en la CE50 de 25 a 100 veces en comparación con los organoides que no habían recibido tratamiento (Figuras 4C y 4D). Los organoides resistentes a adagrasib mostraron resistencia cruzada al inhibidor de KRASG12C, sotorasib, y al inhibidor multi-selectivo de RAS(ON) RMC-7977, descrito recientemente (Figuras S9C y S9D).

Para caracterizar la respuesta a la inhibición de KRAS, realizamos una secuenciación de ARN de los organoides AKP-G12C antes, durante el tratamiento (adagrasib solo (100 nM) o adagrasib/afatinib (50/5 nM) durante 72 h) y en las células resistentes, reflejando los contextos de las biopsias de los pacientes. En total, generamos cinco líneas independientes de AKP-G12C resistentes a adagrasib y cinco líneas de AKP-G12C resistentes a adagrasib/afatinib. Un subconjunto de líneas de organoides resistentes a los fármacos exhibió una alta amplificación del número de copias de Kras (definida como ≥4 copias) (Figura 4G). Curiosamente, los organoides amplificados en Kras dependían de la inhibición de KRAS, ya que la interrupción del fármaco condujo a una disminución del crecimiento de los organoides (Figura S9E). Estos hallazgos recuerdan al fenotipo senescente observado tras la interrupción del fármaco en el CRC humano amplificado en KRASG12C^[16]. El análisis del transcriptoma de los organoides tratados con adagrasib y adagrasib/afatinib que no habían recibido tratamiento reveló un enriquecimiento de las firmas de células madre intestinales, como se informó recientemente^[30], así como programas inflamatorios, incluidos el tipo 1 y el tipo 2 de IFN, que se redujeron en los organoides resistentes (Figuras 4H e 4I; Tabla S2). Estos hallazgos reflejaron los datos de las biopsias de los pacientes e indican que los programas inflamatorios se activan al inicio de la inhibición de KRAS^[20]-^[25] y no dependen estrictamente de las células no malignas dentro del microambiente tumoral. Las firmas de YAP y de tipo fetal dominaron el perfil transcripcional de los organoides resistentes, independientemente de las alteraciones en el número de copias de KRAS, lo que demuestra la coexistencia de cambios genéticos y no genéticos, como se observa en los casos clínicos (Figuras 4H-4K, S9F y S9G). De hecho, hubo una correlación positiva significativa entre el enriquecimiento del conjunto de genes observado tanto en los organoides AKP en tratamiento como en los resistentes en comparación con las muestras de los pacientes (Figura S9H). Coherente con el aumento de la producción transcripcional de YAP, los organoides resistentes mostraron una elevación de YAP activo (no fosforilado) en comparación con los organoides parentales (Figura 4J); no hubo evidencia de elevación de YAP no fosforilado tras el tratamiento agudo con adagrasib/afatinib (Figura 4J).

La inhibición de TBK1 bloquea la reprogramación inflamatoria temprana y se sinergiza con la inhibición de KRAS

Nuestro grupo y otros han demostrado que los programas inflamatorios se activan durante la respuesta inicial de las células cancerosas a las terapias dirigidas y citotóxicas.^[20]-^[24],^[31] Para probar si el bloqueo de la señalización inflamatoria anularía las respuestas adaptativas iniciales y se sinergizaría con la inhibición de KRAS para controlar el crecimiento de las células tumorales, realizamos un cribado de fármacos pequeño y enfocado en organoides de CRC con mutación KRASG12C derivados de pacientes (organoides derivados de pacientes o PDO), combinando adagrasib con inhibidores de quinasas que se dirigen a las vías inflamatorias. Evaluamos dos concentraciones (0,5 y 1 μM) de moléculas pequeñas que se dirigen a ocho quinasas: PI3K, FAK, KIT, JNK, IKK, TGFβRI, JAK y TBK1 (Figuras 5A y S10A). De estas, solo el inhibidor de la quinasa de unión a la proteína TANK 1 (TBK1), TBK1/IKKε-in-5, retrasó el crecimiento en presencia de adagrasib (Figuras 5A y S10A), mientras que la inhibición de TBK1 sola no tuvo un efecto significativo en el crecimiento de los organoides. Se obtuvieron resultados similares con el inhibidor dual de TBK1/JAK aprobado por la FDA, momelotinib (Figura 5B). Coherente con un papel de TBK1 en la respuesta celular a la inhibición de KRAS, observamos un aumento dependiente de la dosis en la fosforilación de TBK1 tras el tratamiento de los organoides AKP-G12C con adagrasib durante 24 a 72 h (Figura 5C). El mismo aumento dependiente de la dosis de pTBK1 también se observó en las células de CRC HCT116 con mutación KRASG13D tratadas con el inhibidor multi-selectivo de RAS, RMC-7977 (Figura S10B).

TBK1 y la quinasa relacionada IKKε señalan a través del factor regulador de interferón 3 (IRF3), un mediador clave de la respuesta inmune antiviral innata.^[21],^[32]. De hecho, la fosforilación de IRF3 se elevó en las células HCT116 tratadas con RMC-7977, coincidiendo con los aumentos en pTBK1 (Figura S10B). El análisis de las muestras emparejadas de los pacientes reveló que los genes diana de IRF3 incluidos en el panel CosMx se regularon al alza tras la combinación de la inhibición de KRAS y EGFR (Figuras 5D y S10C). De manera similar, la expresión diferencial de los genes de los organoides AKP-G12C tratados con adagrasib mostró un enriquecimiento robusto de los genes diana de IRF3 (Figuras 5E y S10D), mientras que el co-tratamiento con momelotinib mostró una disminución drástica de las firmas inflamatorias, con los genes diana de IRF3 entre los más suprimidos (Figuras 5F y 5G). En conjunto, estos datos respaldan la noción de que la señalización TBK1-IRF3 se activa en respuesta a la inhibición de KRAS. Para garantizar que el efecto combinado de adagrasib y la inhibición de TBK1 no fuera específico de una sola línea de PDO, tratamos los organoides murinos AKP que portan mutaciones KRASG12C (Figura S10E) o KRASG12D (Figura S10F), así como un segundo PDO de CRC con mutación KRASG12C (Figura S10G) y las células de CRC HCT116 (Figura S10H). En cada caso, el bloqueo de TBK1 tuvo un impacto mínimo como monoterapia, pero detuvo la proliferación celular en combinación con la inhibición de KRAS. Tanto TBK1/IKKε-in-5 como momelotinib inhiben quinasas relacionadas además de TBK1; sin embargo, el silenciamiento de solo TBK1 utilizando dos ARN de horquilla corta (shRNA) independientes inducibles por doxiciclina imitó el efecto del tratamiento con fármacos (Figuras 5H e 5I), lo que implica que la inhibición de TBK1 es suficiente para mejorar la actividad del tratamiento con adagrasib en los organoides que no habían recibido tratamiento. Es importante destacar que momelotinib también mejoró la respuesta al tratamiento combinado estándar actual para el CRC, la inhibición de KRAS/EGFR (Figuras 5J y 5K). En conjunto, estos datos destacan que la inducción aguda de programas inflamatorios tras la inhibición de KRAS, al menos en parte a través de TBK1, puede desempeñar un papel en la aparición de un crecimiento tumoral resistente a los fármacos.

DISCUSIÓN

Adagrasib y sotorasib han demostrado un beneficio clínico significativo en el tratamiento de cánceres epiteliales avanzados, y varios inhibidores de RAS de nueva generación se encuentran ahora en las últimas etapas de desarrollo clínico, lo que ofrece el potencial de mejorar significativamente los resultados de millones de pacientes con cáncer en los próximos años. Sin embargo, como ocurre con otras terapias dirigidas, la resistencia primaria o adquirida es probable que ocurra en prácticamente todos los pacientes. Comprender los mecanismos subyacentes a la evasión de los fármacos es esencial para desarrollar estrategias para retrasar o incluso prevenir el fracaso del tratamiento. Los estudios recientes muestran que los tumores resistentes a los inhibidores de KRAS adquieren con frecuencia mutaciones de novo que se predicen para reactivar la señalización de RAS.^[14]-^[17]. En concordancia con estos estudios, nuestro análisis identificó mutaciones adquiridas en la vía RAS en la mayoría de las muestras de progresión; sin embargo, como en ejemplos anteriores,^[14]-^[17], la mayoría de las mutaciones fueron subclonales, lo que plantea la cuestión de si son verdaderos impulsores del crecimiento resistente.

Al integrar datos genómicos y transcriptómicos de biopsias emparejadas recogidas en serie y modelos de cáncer, nuestro estudio revela que las alteraciones genéticas adquiridas a menudo coexisten con mecanismos de resistencia no genéticos. Mostramos que los tumores resistentes activan programas transcripcionales asociados a YAP que recuerdan al intestino regenerativo o fetal, lo que nosotros y otros hemos informado que se asocia con metástasis y resistencia a múltiples fármacos.^[20]-^[27],^[33]-^[38]. En algunos tumores, estas respuestas adaptativas se activan en paralelo con la reactivación de la vía MAPK, probablemente impulsada por eventos genéticos, como las amplificaciones de KRASG12C^[16]. En particular, los programas transcripcionales en las biopsias resistentes fueron más diversos en comparación con las muestras previas al tratamiento y en tratamiento, y a menudo involucraron firmas inflamatorias que se demostró que desempeñan un papel en la resistencia a la terapia,^[20]-^[25],^[33],^[34], lo que indica que pueden servir como mediadores tempranos de la adaptación tumoral a la inhibición de KRAS. El perfil de fármacos dirigidos a quinasas involucradas en los programas inflamatorios mostró que la combinación de KRAS más la inhibición de TBK1 o KRAS/EGFR/TBK1 restringió el crecimiento de los organoides derivados de pacientes y murinos. Esta no es la primera indicación de un papel de la inhibición de TBK1 en los cánceres con mutación KRAS^[39]-^[41]; sin embargo, en contraste con el trabajo anterior de Barbie et al., que sugirió una dependencia específica de TBK1 en las células con mutación KRAS, nuestro trabajo implica que TBK1 se activa tras la inhibición de KRAS y que la focalización de ambas proteínas mejora la eficacia antitumoral. Estos resultados se alinean con estudios recientes en el cáncer de pulmón no microcítico con mutación EGFR, donde la inhibición de EGFR activa una respuesta inmune antiviral innata a través del eje TBK1-IRF3, y la inhibición combinada de TBK1 y EGFR produce efectos sinérgicos en modelos preclínicos.^[21]

En general, nuestro estudio revela la complejidad de la respuesta adaptativa a la inhibición de KRAS en el CRC. La heterogeneidad inter e intratumoral en las muestras de progresión, y la coexistencia de mecanismos de resistencia genéticos y no genéticos, subraya el desafío de revertir la resistencia terapéutica. La focalización de las adaptaciones inflamatorias tempranas, que demostramos que son más conservadoras y generalizables dentro y entre los tumores, puede ofrecer un camino para obtener respuestas más profundas y duraderas a las terapias dirigidas a RAS en el CRC.

Limitaciones del estudio

Si bien nuestro estudio arroja luz sobre procesos adaptativos críticos y la importante heterogeneidad de los mecanismos de resistencia a los fármacos dentro de los tumores individuales, existen limitaciones. Aunque las muestras emparejadas de los pacientes proporcionan un excelente recurso para analizar la progresión de la enfermedad durante el tratamiento, el tamaño relativamente pequeño de la cohorte limita nuestra capacidad para correlacionar características clínicas específicas, como el sitio de metástasis o la respuesta según los criterios RECIST, con las adaptaciones transcripcionales. De manera similar, no podemos determinar el impacto de perfiles genómicos específicos en las respuestas fenotípicas. Además, debido al volumen limitado de muestra de las biopsias individuales, el alcance del perfilamiento transcripcional y epigenético es restringido, lo que limita nuestra capacidad para analizar poblaciones malignas o inmunitarias raras, y el análisis de las interacciones tumor-estroma. Mediante la inmunomarcación multiplexada, detectamos un aumento significativo de la infiltración de células T en las muestras durante el tratamiento, lo que se ha observado en varios contextos preclínicos.^[4],^[42],^[43] En estos entornos, la inhibición de KRAS puede aliviar un entorno inmunosupresor y sinergizar con el bloqueo de los puntos de control inmunitario. En nuestro modelo murino, el tratamiento de tumores AKP-G12C injertados no reveló diferencias significativas en la respuesta en presencia o ausencia de un sistema inmunitario funcional. Sin embargo, es importante señalar que estos modelos de organoides tienen una carga mutacional relativamente baja y, por lo tanto, es poco probable que desencadenen respuestas mediadas por CD8, como se informa en modelos de cáncer de páncreas con alta infiltración basal de células T.^[42] No obstante, la reproducibilidad de las principales firmas inflamatorias en las muestras y los modelos de organoides subraya la relevancia de estos mecanismos adaptativos, que son, al menos en parte, intrínsecos a las células.

Limitaciones del estudio

Si bien nuestro estudio arroja luz sobre procesos adaptativos críticos y la importante heterogeneidad de los mecanismos de resistencia a los fármacos dentro de los tumores individuales, existen limitaciones. Aunque las muestras emparejadas de los pacientes proporcionan un excelente recurso para analizar la progresión de la enfermedad durante el tratamiento, el tamaño relativamente pequeño de la cohorte limita nuestra capacidad para correlacionar características clínicas específicas, como el sitio de metástasis o la respuesta según los criterios RECIST, con las adaptaciones transcripcionales. De manera similar, no podemos determinar el impacto de perfiles genómicos específicos en las respuestas fenotípicas. Además, debido al volumen limitado de muestra de las biopsias individuales, el alcance del perfilamiento transcripcional y epigenético es restringido, lo que limita nuestra capacidad para analizar poblaciones malignas o inmunitarias raras, y el análisis de las interacciones tumor-estroma. Mediante la inmunomarcación multiplexada, detectamos un aumento significativo de la infiltración de células T en las muestras durante el tratamiento, lo que se ha observado en varios contextos preclínicos.^[4],^[42],^[43] En estos entornos, la inhibición de KRAS puede aliviar un entorno inmunosupresor y sinergizar con el bloqueo de los puntos de control inmunitario. En nuestro modelo murino, el tratamiento de tumores AKP-G12C injertados no reveló diferencias significativas en la respuesta en presencia o ausencia de un sistema inmunitario funcional. Sin embargo, es importante señalar que estos modelos de organoides tienen una carga mutacional relativamente baja y, por lo tanto, es poco probable que desencadenen respuestas mediadas por CD8, como se informa en modelos de cáncer de páncreas con alta infiltración basal de células T.^[42] No obstante, la reproducibilidad de las principales firmas inflamatorias en las muestras y los modelos de organoides subraya la relevancia de estos mecanismos adaptativos, que son, al menos en parte, intrínsecos a las células.

Métodos detallados

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DE LOS PARTICIPANTES DEL ESTUDIO

Pacientes

Todos los pacientes recibieron tratamiento como parte de ensayos clínicos de inhibidores de KRAS aprobados por la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad del MSKCC bajo los protocolos 19-408 (NCT03785249) y 20-183 (NCT04185883). Se revisaron los informes de patología, radiología, oncología médica y cirugía en el registro médico electrónico para anotar las características clínicas de los pacientes. La recolección de muestras de los pacientes siguió los protocolos y exenciones apropiados de la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad (protocolos 06-107, 12-245, 14-019). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito tanto para los ensayos clínicos como para la recolección de biomuestras. Este estudio se adhirió a los principios éticos descritos en la Declaración de Helsinki.

Líneas celulares

Las células HEK293T se compraron a ATCC (CRL-3216) y se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado (DMEM, Corning, 10-013-CV) que contiene 1% de penicilina/estreptomicina (Fisher Scientific 15140163) y 10% de FBS (Gibco A5670801) a 37 °C con 5% de CO2. Las células HCT116 se compraron a ATCC (CCL-247) y se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con L-glutamina (Corning, 10-040-CV) suplementado con 10% de FBS (Gibco A5670801), 1% de penicilina/estreptomicina (Fisher Scientific 15140163) y 1% de GlutaMAX (Gibco 35050061) a 37 °C con 5% de CO2. Las líneas celulares se analizaron rutinariamente para detectar micoplasma cada seis meses.

Modelos animales y tratamientos de tumores en ratones

Todos los experimentos con ratones descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine y Memorial Sloan Kettering Cancer Center, bajo el número de protocolo 2014-0038. Los ratones C57Bl/6n se compraron a Charles River y los ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) se compraron al centro de Recursos y Cumplimiento de Animales de Investigación de Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Se permitió que los ratones se adaptaran a las instalaciones durante 1 semana antes del trasplante subcutáneo de organoides AKP-G12C (~200 000 células) en solución salina estéril con 50% de Matrigel. El crecimiento tumoral se controló mediante mediciones con calibrador y, una vez que el tamaño promedio de los tumores alcanzó los 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con vehículo y adagrasib. Adagrasib (50 mg/kg) se administró por gavage oral diariamente (5 días, 2 días de descanso) durante 30 días.

Organoides de cáncer de colon murino

Las ratonas (4-8 semanas de edad) fueron sacrificadas por inhalación de dióxido de carbono y rociadas con 70% de etanol. Se abrió la cavidad abdominal, se extirpó el colon y se abrió longitudinalmente con tijeras estériles. Se raspó la materia fecal y el exceso de moco con un portaobjetos. El colon se transfirió a un tubo de 50 mL y se lavó con 20 mL de PBS frío. Luego, el colon se cortó en trozos de 5-10 mm, se colocó en 10 mL de EDTA/PBS frío y se incubó en un agitador a 4 °C durante 60 minutos. Después de la incubación, el tubo se agitó vigorosamente 10 veces y se eliminó el sobrenadante. El tejido se resuspendió en 20 mL de PBS estéril frío que contenía 200 U de DNasa I y se agitó aproximadamente 30 veces para liberar los criptas del colon. La suspensión se filtró dos veces utilizando tamices de células de 100 μm. El filtrado se centrifugó durante 5 minutos a 1100 RPM y el precipitado se resuspendió en 400-500 μL de Matrigel y se colocó en 6 pocillos independientes de una placa de 12 pocillos. Los organoides de tipo salvaje se cultivaron en medio avanzado DMEM/F12 (Gibco, 12634028), 10 mM de HEPES (Corning, 25-060-Cl), 1× GlutaMAX (Gibco, 35050061), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (Immunoreactive Antibodies, N-001), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15-500UG), 40 ng/mL de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071) y medio acondicionado con RSPO3 (2% del volumen final). Se añadió fungina (InvivoGen, ant-fn-1) y primocina (InvivoGen, ant-pm-05) al cultivo durante los primeros siete días.

Para generar organoides de cáncer de colon, las criptas del colon derivadas de ratones LSL-KrasG12C o LSL-KrasG12D se transfectaron con un constructo que contenía un ARN guía sgRNA de Trp53 y recombinasa Cre, y se seleccionaron retirando el EGF del medio y tratando con Nutlin-3 durante 10 días.^[44] Para generar mutaciones de cambio de sentido en Apc, los organoides se nucleofectaron con un constructo que contenía la enzima de edición de bases FNLS y un ARN guía sintético dirigido al codón Q1405, y se seleccionaron retirando RSPO3 del medio.^[48],^[49] Los organoides AKP se cultivaron en medio de organoides murinos (MO) que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 1× y GlutaMAX (Gibco, 35050061). El pasaje y la criopreservación de los organoides se realizaron como se describió anteriormente.^[50],^[51] Los organoides se pasaron en 300 μL de Matrigel en un pocillo cada uno de una placa de 6 pocillos (Corning 353224). El aislamiento de ADN, proteínas y ARN se realizó como se describió anteriormente.^[50],^[51] Los modelos resistentes se generaron tratando los organoides con adagrasib solo (100 nM) o adagrasib más afatinib (50 y 5 nM, respectivamente) hasta que surgieran organoides resistentes (4-12 semanas). Los organoides se pasaron aproximadamente cada 3-7 días según sea necesario, y los fármacos se renovaron con cada pasaje.

Organoides derivados de pacientes

Los organoides derivados de pacientes se establecieron como se describió anteriormente.^[52] Las muestras de tumores de los pacientes se lavaron, se cortaron en fragmentos de 5 mm y se incubaron en un tampón de disociación que contenía DMEM/F12 avanzado (Gibco, 12634028), 4 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 250 U/mL de colagenasa tipo III (Worthington, 9001-12-1) y 1 U/mL de dispasa (Sigma-Aldrich, D4818). Las muestras se agitaron a 37 °C durante 30 minutos, se filtraron a través de un tamiz de células de 70 μm, se centrifugaron a 1100 RPM durante 5 minutos y se lavaron con DMEM/F12 avanzado. Las células se contaron y se resuspendieron en Matrigel a una concentración de aproximadamente 10 000 a 50 000 células por 200 μL de Matrigel en placas de 6 pocillos. Los PDO se mantuvieron en medio de organoides humanos (HO), que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich A9165), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich N0636), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15), 20 ng/mL de FGF-10 (Peprotech, 100-26), 10 μM de Y-27632 (MedChemExpress, HY-10071), 500 nM de A-83-01 (MedChemExpress, HY-10432), 10 μM de SB202190 (MedChemExpress, HY-10295), 200 nM de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071), 10 nM de gastrina-I (MedChemExpress, HY-P2671), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (ImmunoPrecise Antibodies, N-001), medio acondicionado con RSPO3 (2% del volumen final) y suplemento B27 (Gibco 17504044).

DETALLES DEL MÉTODO

Clonación

Los oligonucleótidos de 97 pares de bases amplificados por PCR se insertaron en pCF806 digerido con EcoRI y XhoI^[53] (Addgene 186711) mediante la clonación de restricción estándar. Los vectores y los insertos se ligaron utilizando la ligasa de ADN T4 (NEB M0202M) a 16 °C durante la noche y se transformaron en células competentes químicamente Stbl3. Los oligonucleótidos para la clonación de shRNA se enumeran en la Tabla S3. Para la producción lentiviral, las células HEK293T se transfectaron con el vector de transferencia lentiviral apropiado junto con los plásmidos de empaquetamiento psPax2 (Addgene, número de catálogo 12260) y pMD2.G (Addgene, número de catálogo 12259) utilizando polietilenimina. Los sobrenadantes virales se cosecharon a las 48, 72 y 96 horas posteriores a la transfección, se centrifugaron a 25 000 RPM y 37 °C durante 2 horas y se almacenaron a -80 °C.

Experimentos de crecimiento de organoides

Se cultivaron organoides de ratón y humanos de cáncer colorrectal en Matrigel y se mantuvieron en medios de cultivo de organoides sin EGF. Los organoides se sembraron en placas de 48 pocillos. El crecimiento de los organoides se monitorizó en tiempo real utilizando el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 (Sartorius). Se adquirieron imágenes representativas en campo claro cada 24 a 72 horas durante un período de 7 días para los organoides de ratón y 14 días para los organoides humanos. El área de los organoides se cuantificó utilizando el módulo de organoides, con segmentación y parámetros de análisis automatizados optimizados para la morfología de los organoides de cáncer colorrectal. Para cada punto temporal, el área de los organoides se normalizó al área inicial medida el día 0. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib, (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261), RMC-7977 (MedChemExpress HY-148439), TBK1/IKK-IN-5 (MedChemExpress HY-128679), momelotinib (MedChemExpress HY-10961), GSK8612 (MedChemExpress HY-111941), alpelisib (MedChemExpress, HY-15244), defactinib (MedChemExpress HY-12289), TPCA-1 (MedChemExpress HY-10074), pexidartinib (MedChemExpress HY-16749), SP600125 (MedChemExpress HY-12041), LY2157299 (MedChemExpress HY-13226). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y en las figuras. Para los experimentos de validación de shRNA, los organoides AKP-G12C se transfectaron con vectores lentivirales que codifican shRNAs inducibles por dox dirigidos a Tbk1 o Renilla. Se probaron dos shRNAs independientes dirigidos a Tbk1. Los organoides se cultivaron en presencia de doxiciclina (1 μg/mL) durante 7 días, con o sin adagrasib (50 nM). El crecimiento de los organoides se monitorizó en el Incucyte.

Western Blot

Los organoides en Matrigel se lavaron con PBS frío y se incubaron en 1 mL de solución fría de recuperación celular (Corning 354253) durante aproximadamente 60 minutos para ablandar el Matrigel. Después de la disolución completa del Matrigel, la suspensión de organoides se transfirió a un tubo cónico de 15 mL y se añadió 5 mL de PBS frío. Los organoides se centrifugaron a 800g durante 5 minutos a 4°C. Los pellets de organoides se lavaron con 1 mL de PBS y se centrifugaron a 800g durante 5 minutos a 4°C. Los pellets se resuspendieron en 30 μL de tampón RIPA, se agitaron a 4°C durante 25 minutos y se centrifugaron a 20.000g a 4°C durante 20 minutos. Se recogió el sobrenadante de proteínas y se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas DC (BioRad 5000116). Se cargaron 30 μg de proteína por Western Blot. Los anticuerpos utilizados para el análisis de Western blot fueron: anti-fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Cell Signaling Technology 9107), anti-fosfo TBK1/NAK1 (Ser172) (Cell Signaling Technology 5483), anti-TBK1 (Cell Signaling Technology 3504), anti-no fosfo (activo) Yap (Ser127) (Cell Signaling Technology 29495), anti-Yap (Cell Signaling Technology 12395), anti-fosfo-IRF-3 (Ser396) (Cell Signaling Technology 4947), (anti-beta-actina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 12262), anti-vinculina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 18799).

Ensayo de viabilidad Cell TiterGlo

Los organoides de ratón se cultivaron en Matrigel y se mantuvieron en medios de cultivo de organoides sin EGF en placas de 48 pocillos bajo el tratamiento adecuado. Después de 3 o 5 días, la viabilidad celular se midió utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 3D (Promega G9681) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib, (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261) y momelotinib (MedChemExpress HY-10961). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y en las figuras.

Ensayo de número de copias de KRAS

Los organoides se disociaron y se pelletizaron después de tres días en cultivo. Tras el aislamiento del ADN genómico, se realizaron ensayos de número de copias utilizando el ensayo de número de copias TaqMan (Thermo Fisher Scientific, 4400291) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron 1.500 células HCT116 por pocillo en una placa de 12 pocillos. 24 horas después de la siembra, se retiró el medio y se reemplazó por medio fresco que contenía el tratamiento adecuado. Los tratamientos se renovaron cada 2-3 días hasta que los controles alcanzaron la confluencia. Luego, las células se fijaron utilizando 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente, con agitación. Las células se tiñeron utilizando tinte de Giemsa al 10% en PBS, con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Las células fijadas y teñidas se lavaron tres veces en agua y se dejaron secar durante la noche. Después de la imagen, las células se destiñeron utilizando ácido acético al 10% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia utilizando un lector de placas Omega.

Aislamiento de ARN y secuenciación de ARN (RNA-seq)

Los organoides se recogieron en 5 mL de PBS frío y se centrifugaron a 2500 RPM durante 5 minutos a 4°C. El pellet se resuspendió en 800 μL de TRIzol (Invitrogen, 15596-026). La extracción de ARN se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Para eliminar la contaminación por ADN, el ARN se trató con DNaseI recombinante (Roche Diagnostics, 04716728001) durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la purificación en columna utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini (74106). La síntesis de cDNA se realizó utilizando 1 μg de ARN y se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El Laboratorio Central de Genómica en Weill Cornell Medicine evaluó la calidad del ARN con un Agilent 2100 Bioanalyzer, preparó la biblioteca de ARN utilizando el kit de preparación de bibliotecas de muestras de ARNm TruSeq (Illumina) y realizó la secuenciación de ARN (de un solo extremo, 75 ciclos) en un Illumina NextSeq 500. Los archivos FASTQ sin procesar se han enviado al SRA con el número de acceso SRA: PRJNA1244364.

Análisis de RNA-seq

Los archivos FASTQ sin procesar se pseudoalinearon al genoma de ratón (GRCm39) utilizando Kallisto (versión 0.51.1).^[46] La expresión génica diferencial se estimó utilizando el paquete R DEseq2.^[54] El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando los paquetes R fgsea^[55] y GSVA.^[45],^[47] El análisis de sobre-representación (ORA) se realizó en una lista de genes regulados al alza o a la baja para condiciones de tratamiento específicas con un cambio de pliegue de log2 >1,0 (RNAseq a granel) o >0,3 (CosMx) y un valor p ajustado 500× de cobertura mediana). Todos los tipos de alteraciones genómicas, incluidos sustituciones, indels, variaciones en el número de copias y reordenamientos, se identificaron comparando las muestras tumorales con sus contrapartes normales correspondientes. Todas las secuenciaciones y los análisis se realizaron en un laboratorio clínico certificado por CLIA. Las alteraciones somáticas, incluidas las sustituciones no sinónimas, las pequeñas inserciones/deleciones, las amplificaciones a nivel de gen focal, las deleciones homocigóticas y las fusiones génicas seleccionadas, se identificaron mediante una plataforma bioinformática validada clínicamente.^[58] Posteriormente, cada alteración se anotó para determinar su oncogenicidad y relevancia clínica utilizando OncoKB (v3.9, 30 de diciembre de 2021).^[59] Las alteraciones de todas las categorías (mutaciones, alteraciones en el número de copias y fusiones) clasificadas como "oncogénicas" o "probablemente oncogénicas" por OncoKB, así como aquellas correspondientes a nuevos puntos calientes mutacionales identificados, se designaron como alteraciones impulsoras.

Transcriptómica espacial

La transcriptómica espacial se realizó en el Laboratorio de Genómica Integrada del Memorial Sloan Kettering utilizando la plataforma NanoString CosMx. Las secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) (grosor de 5 μm) de 30 muestras de pacientes se montaron en portaobjetos de vidrio, se desparafinaron y se rehidrataron según los protocolos de Nanostring. La detección de ARN dirigida se llevó a cabo utilizando el panel de ARN humano NanoString CosMx (950 genes). Después de la hibridación, los portaobjetos se procesaron y se analizaron en el instrumento CosMx, generando imágenes de inmunofluorescencia (IF) y coordenadas de transcritos de ARN de molécula única resueltas espacialmente. La tinción de inmunofluorescencia incluyó DAPI para la identificación nuclear, pancitoqueratina (panCK) para las células epiteliales, CD45 para las células inmunitarias y CD298/B2M como marcadores de membrana (NanoString). La segmentación celular se realizó mediante la plataforma patentada de NanoString, utilizando señales nucleares y de membrana combinadas, produciendo recuentos de transcritos por célula y coordenadas espaciales.

Importación de datos, control de calidad y preprocesamiento

Los resultados brutos de CosMx se importaron a Rstudio y se convirtieron en objetos Seurat (Seurat v5) utilizando scripts personalizados basados en el flujo de trabajo recomendado por NanoString. Inicialmente, se procesaron los portaobjetos individuales de forma independiente y, posteriormente, se fusionaron en un único objeto Seurat después de confirmar la ausencia de identificadores de células duplicados en los portaobjetos. Se excluyeron las células con menos de 100 transcritos detectados para eliminar las células de baja calidad o mal segmentadas. Solo se conservaron las células que cumplían este umbral para el análisis posterior. Se eliminaron los posibles dobletes excluyendo las células que coexpresaban marcadores canónicos de dos linajes celulares distintos.

Los valores de expresión se normalizaron utilizando la función NormalizeData de Seurat (normalización logarítmica con el factor de escala predeterminado).^[60] Se identificaron los genes altamente variables utilizando FindVariableFeatures, seguido de la escala de los valores de expresión con ScaleData. Se realizó la agrupación de células utilizando el algoritmo de Louvain (FindClusters) con un parámetro de resolución de 3, seleccionado para permitir la separación de los principales tipos de células epiteliales, estromales y endoteliales. Se generaron incrustaciones bidimensionales utilizando la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) con min.dist = 0,1 y spread = 4. Con fines de visualización, se generaron gráficos de UMAP en submuestras aleatorias de células. El subconjunto de células cancerosas se reprocesó de forma independiente con normalización, selección de características variables, escala, análisis de componentes principales (PCA), construcción de gráficos de vecinos (dims 1:30), agrupación (resolución 0,5) e incrustación de UMAP (min.dist = 0,2, spread = 1). Para la visualización, se submuestrearon aleatoriamente hasta 200.000 células cancerosas antes de la creación del gráfico de UMAP.

Anotación del tipo celular

Las identidades de los grupos se anotaron manualmente en función de la expresión de los genes marcadores canónicos utilizando gráficos de características y mapas de calor. Los genes marcadores utilizados para la anotación del tipo celular incluyeron COL1A1, COL1A2, COL3A1 y THBS2 (fibroblastos asociados al cáncer, CAFs); CD74, CD68, SPP1 y MSR1 (células mieloides); IGHG1, IGHM, IGKC y JCHAIN (células B); CD3D, CD3G, CTLA4 y TCF7 (células T); KRT8, KRT18, KRT19 y KRT20 (células cancerosas epiteliales); APOA1, TTR, SERPINA1 y FGG (hepatocitos); y PECAM1, VWF, ENG y SPARCL1 (células endoteliales). Las identidades celulares finales se consolidaron en los siguientes tipos de células: células epiteliales de CRC, fibroblastos asociados al cáncer (CAFs), células endoteliales, monocitos/macrófagos, células B, células T y hepatocitos. Solo se conservaron las células que pertenecían a estas categorías para los análisis posteriores. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 1 y S2. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Análisis de expresión diferencial

Para evaluar los cambios transcripcionales a nivel del paciente individual (Figura 2C), se realizaron comparaciones emparejadas dentro del paciente para todos los pacientes con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento emparejadas (n = 11 pares) y biopsias pretratamiento y resistentes (n = 8 pares) utilizando FindMarkers con la prueba de Wilcoxon. La significación se calculó utilizando valores p ajustados de Benjamini-Hochberg. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, 3, 5, S3, S5 y S6.

La actividad a nivel de vía se cuantificó utilizando la puntuación UCell y el suavizado espacial. Las puntuaciones UCell se calcularon en el subconjunto de células cancerosas (cancercells) y se suavizaron espacialmente utilizando SmoothKNN (k = 100, reducción = PCA). Luego, las puntuaciones se transformaron en rangos para generar puntuaciones de cuantiles por célula (escala de 0 a 1), lo que permite comparaciones entre muestras. Estas puntuaciones de cuantiles se transfirieron posteriormente del objeto de células cancerosas (que incluía todas las células cancerosas de todos los portaobjetos) a objetos de portaobjetos espaciales individuales mediante la coincidencia de códigos de barras de las células. Los conjuntos de genes seleccionados de la colección Hallmark, CRC y la literatura relevante para el intestino se filtraron para retener los genes detectados en el conjunto de datos CosMx. Se calcularon las puntuaciones UCell para cada conjunto de genes a nivel de célula. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, S5, S6 y S8. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Visualización espacial

Se definieron regiones de interés (ROIs) representativas mediante el recorte manual de portaobjetos de tejido individuales utilizando la función Crop en Seurat, con coordenadas de recorte seleccionadas en función de la morfología del tejido, la composición del tipo celular y la calidad de la señal, según lo evaluado mediante ImageDimPlot de portaobjetos completos. Las imágenes del tipo celular se generaron utilizando ImageDimPlot con límites de segmentación celular. La actividad de la vía se visualizó espacialmente en las células de CRC solas utilizando ImageFeaturePlot con valores de expresión recortados al rango del percentil 5-95 (min.cutoff = 0,05, max.cutoff = 0,95) para reducir la influencia de los valores atípicos. Se generaron superposiciones de transcritos de molécula única utilizando ImageDimPlot con el argumento de moléculas. Para las comparaciones específicas de la región, las células de CRC se estratificaron en regiones RAS-altas y RAS-bajas en función de las asignaciones de campo de visión (FOV) seleccionadas manualmente, y la expresión diferencial entre las regiones se realizó utilizando la prueba de Wilcoxon mediante FindMarkers. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Análisis de la comunicación célula-célula

Las comunicaciones célula-célula se analizaron utilizando CellChat (v1.6)^[29] en el conjunto de datos combinado, agrupando las células por los tipos celulares anotados finales. Solo se consideraron las interacciones de señalización secretadas de la base de datos de CellChat humana. Los genes y los pares ligando-receptor se filtraron en función de los criterios de sobreexpresión, y las probabilidades de comunicación se calcularon con un mínimo de 10 células por grupo que interactúa. Las redes de comunicación agregadas se mostraron utilizando gráficos circulares, mapas de calor y diagramas de acordes. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en la Figura S7. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism (versión 10.0.3) y R (versión 4.5.1, R Studio versión 2025.05.1 + 513). Los detalles estadísticos de cada experimento, incluido el test específico utilizado, el valor exacto de n y lo que n representa y mide, se proporcionan en las leyendas de las figuras correspondientes (Figuras 1, 2, 3, 4, 5 y S1-S10). A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM), con puntos conectados que representan muestras de pacientes emparejadas cuando corresponda. A menos que se indique lo contrario, cada punto de datos representa el promedio de ≥3 experimentos independientes. No se realizaron pruebas formales de normalidad o igualdad de varianza en los datos analizados mediante la prueba t de Student; para todos los análisis de expresión diferencial de transcriptómica espacial y ARN a granel, se utilizó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon y, por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad. Para los experimentos con ratones, los investigadores no estaban cegados a las condiciones del tratamiento.

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DE LOS PARTICIPANTES DEL ESTUDIO

Pacientes

Todos los pacientes recibieron tratamiento como parte de ensayos clínicos de inhibidores de KRAS aprobados por la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad de MSKCC bajo los protocolos 19-408 (NCT03785249) y 20-183 (NCT04185883). Se revisaron los informes de patología, radiología, oncología médica y cirugía en el registro médico electrónico para anotar las características clínicas de los pacientes. La recolección de muestras de los pacientes siguió los protocolos y exenciones apropiados de la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad (protocolos 06-107, 12-245, 14-019). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito tanto para los ensayos clínicos como para la recolección de biomuestras. Este estudio se adhirió a los principios éticos descritos en la Declaración de Helsinki.

Líneas celulares

Las células HEK293T se compraron a ATCC (CRL-3216) y se mantuvieron en medio de cultivo Dulbecco modificado (DMEM, Corning, 10-013-CV) que contiene 1% de penicilina/estreptomicina (Fisher Scientific 15140163) y 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco A5670801) a 37 °C con 5% de CO2. Las células HCT116 se compraron a ATCC (CCL-247) y se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con L-glutamina (Corning, 10-040-CV) suplementado con 10% de FBS (Gibco A5670801), 1% de penicilina/estreptomicina (Fisher Scientific 15140163) y 1% de GlutaMAX (Gibco 35050061) a 37 °C con 5% de CO2. Las líneas celulares se analizaron para detectar micoplasma de forma rutinaria cada seis meses.

Modelos de ratón y tratamientos de tumores en ratones

Todos los experimentos con ratones descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine y Memorial Sloan Kettering Cancer Center, bajo el número de protocolo 2014-0038. Los ratones C57Bl/6n se compraron a Charles River y los ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) se compraron al centro de Recursos y Cumplimiento de Animales de Investigación del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Se permitió que los ratones se aclimaten a las instalaciones durante 1 semana antes del trasplante subcutáneo de organoides AKP-G12C (~200.000 células) en solución salina estéril con 50% de Matrigel. El crecimiento tumoral se controló mediante mediciones con calibrador y, una vez que el tamaño promedio de los tumores alcanzó los 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con vehículo y adagrasib. Adagrasib (50 mg/kg) se administró por gavage oral diariamente (5 días, 2 días de descanso) durante 30 días.

Organoides de cáncer de colon murino

Se sacrificaron ratones hembra (de 4 a 8 semanas de edad) mediante la inhalación de dióxido de carbono y se rociaron con etanol al 70%. Se abrió la cavidad abdominal, se extirpó el colon y se abrió longitudinalmente con tijeras estériles. Se eliminaron las heces y el exceso de moco con una lamula. El colon se transfirió a un tubo de 50 mL y se lavó con 20 mL de PBS frío. A continuación, se cortó el colon en trozos de 5 a 10 mm, se colocó en 10 mL de EDTA/PBS frío y se incubó en un agitador a 4 °C durante 60 minutos. Después de la incubación, se agitó vigorosamente el tubo 10 veces y se eliminó el sobrenadante. El tejido se resuspendió en 20 mL de PBS estéril frío que contenía 200 U de DNasa I y se agitó aproximadamente 30 veces para liberar las criptas del colon. La suspensión se filtró dos veces utilizando tamices celulares de 100 μm. El filtrado se centrifugó durante 5 minutos a 1100 RPM y el precipitado se resuspendió en 400-500 μL de Matrigel y se colocó en 6 pocillos independientes de una placa de 12 pocillos. Los organoides de tipo salvaje se cultivaron en DMEM/F12 avanzado (Gibco, 12634028), 10 mM de HEPES (Corning, 25-060-Cl), 1× GlutaMAX (Gibco, 35050061), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (Immunoreactive Antibodies, N-001), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15-500UG), 40 ng/mL de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071) y medio acondicionado RSPO3 (2% del volumen final). Se añadió Fungin (InvivoGen, ant-fn-1) y Primocin (InvivoGen, ant-pm-05) al cultivo durante los primeros siete días.

Para generar organoides de cáncer de colon, las criptas del colon derivadas de ratones LSL-KrasG12C o LSL-KrasG12D se transfectaron con un constructo que contenía un sgRNA Trp53 y Cre recombinasa, y se seleccionaron retirando el EGF del medio y tratándolos con Nutlin-3 durante 10 días.^[44] Para generar mutaciones de Apc con cambio de sentido, los organoides se nucleofectaron con un constructo que contenía la enzima de edición de bases FNLS y un gRNA sintético dirigido al codón Q1405, y se seleccionaron retirando el RSPO3 del medio.^[48],^[49] Los organoides AKP se cultivaron en un medio de organoides murinos (MO) que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 1× y GlutaMAX (Gibco, 35050061). El pasaje y la criopreservación de los organoides se realizaron como se describió anteriormente.^[50],^[51] Los organoides se pasaron en 300 μL de Matrigel colocados en un pocillo cada uno de una placa de 6 pocillos (Corning 353224). El aislamiento de ADN, proteínas y ARN se realizó como se describió anteriormente.^[50],^[51] Se generaron modelos resistentes tratando los organoides con adagrasib solo (100 nM) o adagrasib más afatinib (50 y 5 nM, respectivamente), hasta que surgieran organoides resistentes (4-12 semanas). Los organoides se pasaron aproximadamente cada 3-7 días según fuera necesario, y los fármacos se renovaron con cada pasaje.

Organoides derivados de pacientes

Los organoides derivados de pacientes se establecieron como se describió anteriormente.^[52] Las muestras de tumores de los pacientes se lavaron, se cortaron en fragmentos de 5 mm y se incubaron en un tampón de disociación que contenía DMEM/F12 avanzado (Gibco, 12634028), 4 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 250 U/mL de colagenasa tipo III (Worthington, 9001-12-1) y 1 U/mL de dispasa (Sigma-Aldrich, D4818). Las muestras se agitaron a 37 °C durante 30 minutos, se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm, se centrifugaron a 1100 RPM durante 5 minutos y se lavaron con DMEM/F12 avanzado. Se contaron las células y se resuspendieron en Matrigel a una concentración de aproximadamente 10.000 a 50.000 células por 200 μL de Matrigel en placas de 6 pocillos. Los PDO se mantuvieron en un medio de organoides humanos (HO) que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich A9165), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich N0636), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15), 20 ng/mL de FGF-10 (Peprotech, 100-26), 10 μM de Y-27632 (MedChemExpress, HY-10071), 500 nM de A-83-01 (MedChemExpress, HY-10432), 10 μM de SB202190 (MedChemExpress, HY-10295), 200 nM de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071), 10 nM de Gastrina-I (MedChemExpress, HY-P2671), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (ImmunoPrecise Antibodies, N-001), medio acondicionado RSPO3 (2% del volumen final) y suplemento B27 (Gibco 17504044).

Pacientes

Todos los pacientes recibieron tratamiento como parte de ensayos clínicos de inhibidores de KRAS aprobados por la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad del MSKCC, según los protocolos 19-408 (NCT03785249) y 20-183 (NCT04185883). Se revisaron los informes de patología, radiología, oncología médica y cirugía en el registro médico electrónico para anotar las características clínicas de los pacientes. La recolección de muestras de los pacientes siguió los protocolos y exenciones apropiados de la Junta de Revisión Institucional/Junta de Privacidad (protocolos 06-107, 12-245, 14-019). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito tanto para los ensayos clínicos como para la recolección de biomuestras. Este estudio se adhirió a los principios éticos descritos en la Declaración de Helsinki.

Líneas celulares

Las células HEK293T se compraron a ATCC (CRL-3216) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Corning, 10-013-CV) que contenía 1% de Pen/Strep (Fisher Scientific 15140163) y 10% de FBS (Gibco A5670801) a 37 °C con 5% de CO2. Las células HCT116 se compraron a ATCC (CCL-247) y se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con L-glutamina (Corning, 10-040-CV) suplementado con 10% de FBS (Gibco A5670801), 1% de Pen/Strep (Fisher Scientific 15140163) y 1% de GlutaMAX (Gibco 35050061) a 37 °C con 5% de CO2. Las líneas celulares se analizaron para detectar micoplasma de forma rutinaria cada seis meses.

Modelos animales y tratamientos con tumores de ratón

Todos los experimentos con ratones descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine y Memorial Sloan Kettering Cancer Center, según el protocolo número 2014-0038. Los ratones C57Bl/6n se compraron a Charles River y los ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) se compraron al centro de Recursos y Cumplimiento de Animales de Investigación de Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Se permitió que los ratones se adaptaran a las instalaciones durante 1 semana antes del trasplante subcutáneo de organoides AKP-G12C (~200.000 células) en solución salina estéril con 50% de Matrigel. El crecimiento tumoral se controló mediante mediciones con calibrador y, una vez que el tamaño medio de los tumores alcanzó los 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con vehículo y adagrasib. Se administró adagrasib (50 mg/kg) por gavage oral diariamente (5 días, 2 días de descanso) durante 30 días.

Organoides de cáncer de colon murino

Se sacrificaron ratones hembra (de 4 a 8 semanas de edad) mediante la inhalación de dióxido de carbono y se rociaron con etanol al 70%. Se abrió la cavidad abdominal, se extirpó el colon y se abrió longitudinalmente con tijeras estériles. Se eliminaron las heces y el exceso de moco con una lamula. El colon se transfirió a un tubo de 50 mL y se lavó con 20 mL de PBS frío. A continuación, se cortó el colon en trozos de 5 a 10 mm, se colocó en 10 mL de EDTA/PBS frío y se incubó en un agitador a 4 °C durante 60 minutos. Después de la incubación, se agitó vigorosamente el tubo 10 veces y se eliminó el sobrenadante. El tejido se resuspendió en 20 mL de PBS estéril frío que contenía 200 U de DNasa I y se agitó aproximadamente 30 veces para liberar las criptas del colon. La suspensión se filtró dos veces utilizando tamices celulares de 100 μm. El filtrado se centrifugó durante 5 minutos a 1100 RPM y el precipitado se resuspendió en 400-500 μL de Matrigel y se colocó en 6 pocillos independientes de una placa de 12 pocillos. Los organoides de tipo salvaje se cultivaron en DMEM/F12 avanzado (Gibco, 12634028), 10 mM de HEPES (Corning, 25-060-Cl), 1× GlutaMAX (Gibco, 35050061), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (Immunoreactive Antibodies, N-001), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15-500UG), 40 ng/mL de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071) y medio acondicionado RSPO3 (2% del volumen final). Se añadió Fungin (InvivoGen, ant-fn-1) y Primocin (InvivoGen, ant-pm-05) al cultivo durante los primeros siete días.

Para generar organoides de cáncer de colon, las criptas del colon derivadas de ratones LSL-KrasG12C o LSL-KrasG12D se transfectaron con un constructo que contenía un sgRNA Trp53 y Cre recombinasa, y se seleccionaron retirando el EGF del medio y tratándolos con Nutlin-3 durante 10 días.^[44] Para generar mutaciones de Apc con cambio de sentido, los organoides se nucleofectaron con un constructo que contenía la enzima de edición de bases FNLS y un gRNA sintético dirigido al codón Q1405, y se seleccionaron retirando el RSPO3 del medio.^[48],^[49] Los organoides AKP se cultivaron en un medio de organoides murinos (MO) que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 1× y GlutaMAX (Gibco, 35050061). El pasaje y la criopreservación de los organoides se realizaron como se describió anteriormente.^[50],^[51] Los organoides se pasaron en 300 μL de Matrigel colocados en un pocillo cada uno de una placa de 6 pocillos (Corning 353224). El aislamiento de ADN, proteínas y ARN se realizó como se describió anteriormente.^[50],^[51] Se generaron modelos resistentes tratando los organoides con adagrasib solo (100 nM) o adagrasib más afatinib (50 y 5 nM, respectivamente), hasta que surgieran organoides resistentes (4-12 semanas). Los organoides se pasaron aproximadamente cada 3-7 días según fuera necesario, y los fármacos se renovaron con cada pasaje.

Organoides derivados de pacientes

Los organoides derivados de pacientes se establecieron como se describió anteriormente.^[52] Las muestras de tumores de los pacientes se lavaron, se cortaron en fragmentos de 5 mm y se incubaron en un tampón de disociación que contenía DMEM/F12 avanzado (Gibco, 12634028), 4 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 250 U/mL de colagenasa tipo III (Worthington, 9001-12-1) y 1 U/mL de dispasa (Sigma-Aldrich, D4818). Las muestras se agitaron a 37 °C durante 30 minutos, se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm, se centrifugaron a 1100 RPM durante 5 minutos y se lavaron con DMEM/F12 avanzado. Se contaron las células y se resuspendieron en Matrigel a una concentración de aproximadamente 10.000 a 50.000 células por 200 μL de Matrigel en placas de 6 pocillos. Los PDO se mantuvieron en un medio de organoides humanos (HO) que contenía DMEM/F12 avanzado, 10 mM de HEPES, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich A9165), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich N0636), 50 ng/mL de EGF (Peprotech AF-100-15), 20 ng/mL de FGF-10 (Peprotech, 100-26), 10 μM de Y-27632 (MedChemExpress, HY-10071), 500 nM de A-83-01 (MedChemExpress, HY-10432), 10 μM de SB202190 (MedChemExpress, HY-10295), 200 nM de LDN193189 (MedChemExpress, HY-12071), 10 nM de Gastrina-I (MedChemExpress, HY-P2671), 0,5 nM de proteína de fusión WNT Surrogate-Fc (ImmunoPrecise Antibodies, N-001), medio acondicionado RSPO3 (2% del volumen final) y suplemento B27 (Gibco 17504044).

DETALLES DEL MÉTODO

Clonación

Los oligonucleótidos de 97 pares de bases amplificados por PCR se insertaron en pCF806^[53] (Addgene 186711) digerido con EcoRI y XhoI mediante la clonación de restricción estándar. Los vectores y los insertos se ligaron utilizando la ligasa de ADN T4 (NEB M0202M) durante la noche a 16 °C y se transformaron en células competentes químicamente Stbl3. Los oligonucleótidos para la clonación de shRNA se enumeran en la Tabla S3. Para la producción lentiviral, las células HEK293T se transfectaron con el vector de transferencia lentiviral apropiado junto con los plásmidos de empaquetamiento psPax2 (Addgene, catálogo n.º 12260) y pMD2.G (Addgene, catálogo n.º 12259) utilizando polietilenimina. Los sobrenadantes virales se cosecharon a las 48, 72 y 96 horas después de la transfección, se centrifugaron a 25.000 RPM y 37 °C durante 2 horas y se almacenaron a -80 °C.

Experimentos de crecimiento de organoides

Se cultivaron organoides de ratón y humanos de cáncer colorrectal en Matrigel y se mantuvieron en medios de cultivo de organoides sin EGF. Los organoides se sembraron en placas de 48 pocillos. El crecimiento de los organoides se monitorizó en tiempo real utilizando el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 (Sartorius). Se adquirieron imágenes representativas en campo claro cada 24 a 72 horas durante un período de 7 días para los organoides de ratón y 14 días para los organoides humanos. El área de los organoides se cuantificó utilizando el módulo de organoides, con segmentación y parámetros de análisis automatizados optimizados para la morfología de los organoides de cáncer colorrectal. Para cada punto temporal, el área de los organoides se normalizó al área inicial medida el día 0. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib, (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261), RMC-7977 (MedChemExpress HY-148439), TBK1/IKK-IN-5 (MedChemExpress HY-128679), momelotinib (MedChemExpress HY-10961), GSK8612 (MedChemExpress HY-111941), alpelisib (MedChemExpress, HY-15244), defactinib (MedChemExpress HY-12289), TPCA-1 (MedChemExpress HY-10074), pexidartinib (MedChemExpress HY-16749), SP600125 (MedChemExpress HY-12041), LY2157299 (MedChemExpress HY-13226). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y en las figuras. Para los experimentos de validación de shRNA, los organoides AKP-G12C se transfectaron con vectores lentivirales que codifican shRNAs inducibles por dox dirigidas a Tbk1 o Renilla. Se probaron dos shRNAs independientes dirigidas a Tbk1. Los organoides se cultivaron en presencia de doxiciclina (1 μg/mL) durante 7 días, con o sin adagrasib (50 nM). El crecimiento de los organoides se monitorizó en el Incucyte.

Western Blot

Los organoides en Matrigel se lavaron con PBS frío y se incubaron en 1 mL de solución de recuperación de células fría (Corning 354253) durante aproximadamente 60 minutos para ablandar el Matrigel. Después de la disolución completa del Matrigel, la suspensión de organoides se transfirió a un tubo cónico de 15 mL y se añadió 5 mL de PBS frío. Los organoides se centrifugaron a 800g durante 5 minutos a 4°C. Los pellets de organoides se lavaron con 1 mL de PBS y se centrifugaron a 800g durante 5 minutos a 4°C. Los pellets se resuspendieron en 30 μL de tampón RIPA, se agitaron a 4°C durante 25 minutos y se centrifugaron a 20.000g a 4°C durante 20 minutos. Se recogió el sobrenadante de proteínas y se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas DC (BioRad 5000116). Se cargaron 30 μg de proteína por Western Blot. Los anticuerpos utilizados para el análisis de Western blot fueron: anti-fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Cell Signaling Technology 9107), anti-fosfo TBK1/NAK1 (Ser172) (Cell Signaling Technology 5483), anti-TBK1 (Cell Signaling Technology 3504), anti-no fosfo (activo) Yap (Ser127) (Cell Signaling Technology 29495), anti-Yap (Cell Signaling Technology 12395), anti-fosfo-IRF-3 (Ser396) (Cell Signaling Technology 4947), (anti-beta-actina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 12262), anti-vinculina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 18799).

Ensayo de viabilidad Cell TiterGlo

Los organoides de ratón se cultivaron en Matrigel y se mantuvieron en medios de cultivo de organoides sin EGF en placas de 48 pocillos bajo el tratamiento adecuado. Después de 3 o 5 días, la viabilidad celular se midió utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 3D (Promega G9681) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib, (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261) y momelotinib (MedChemExpress HY-10961). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y en las figuras.

Ensayo de número de copias de KRAS

Los organoides se disociaron y se pelletizaron después de tres días en cultivo. Tras el aislamiento del ADN genómico, se realizaron ensayos de número de copias utilizando el ensayo de número de copias TaqMan (Thermo Fisher Scientific, 4400291) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron 1.500 células HCT116 por pocillo en una placa de 12 pocillos. 24 horas después de la siembra, se retiró el medio y se reemplazó por medio fresco que contenía el tratamiento adecuado. Los tratamientos se renovaron cada 2-3 días hasta que los controles alcanzaron la confluencia. Luego, las células se fijaron utilizando 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente, con agitación. Las células se tiñeron utilizando tinte de Giemsa al 10% en PBS, con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Las células fijadas y teñidas se lavaron tres veces con agua y se dejaron secar durante la noche. Después de la imagen, las células se destiñeron utilizando ácido acético al 10% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia utilizando un lector de placas Omega.

Aislamiento de ARN y secuenciación de ARN (RNA-seq)

Los organoides se recogieron en 5 mL de PBS frío y se centrifugaron a 2500 RPM durante 5 minutos a 4°C. El pellet se resuspendió en 800 μL de TRIzol (Invitrogen, 15596-026). La extracción de ARN se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Para eliminar la contaminación por ADN, el ARN se trató con DNaseI recombinante (Roche Diagnostics, 04716728001) durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la purificación en columna utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini Kit (74106). La síntesis de cDNA se realizó utilizando 1 μg de ARN y se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El Laboratorio Central de Genómica en Weill Cornell Medicine evaluó la calidad del ARN con un Agilent 2100 Bioanalyzer, preparó la biblioteca de ARN utilizando el kit de preparación de bibliotecas de muestras de ARNm TruSeq (Illumina) y realizó la secuenciación de ARN (de un solo extremo, 75 ciclos) en un Illumina NextSeq 500. Los archivos FASTQ brutos se han enviado a SRA con el número de acceso SRA: PRJNA1244364.

Análisis de RNA-seq

Los archivos FASTQ brutos se pseudoalinearon al genoma de ratón (GRCm39) utilizando Kallisto (versión 0.51.1).^[46] La expresión génica diferencial se estimó utilizando el paquete R DEseq2.^[54] El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando los paquetes R fgsea^[55] y GSVA.^[45],^[47] El análisis de sobre-representación (ORA) se realizó en una lista de genes regulados al alza o a la baja para condiciones de tratamiento específicas con un cambio de pliegue de log2 de >1,0 (RNAseq a granel) o >0,3 (CosMx) y un valor p ajustado 500× de cobertura mediana). Todos los tipos de alteraciones genómicas, incluidos sustituciones, indels, variaciones en el número de copias y reordenamientos, se identificaron comparando las muestras tumorales con sus contrapartes normales correspondientes. Todas las secuenciaciones y análisis se realizaron en un laboratorio clínico certificado por CLIA. Las alteraciones somáticas, incluidas las sustituciones no sinónimas, las pequeñas inserciones/deleciones, las amplificaciones a nivel de gen focal, las deleciones homocigóticas y las fusiones génicas seleccionadas, se identificaron mediante una plataforma bioinformática validada clínicamente.^[58] Posteriormente, cada alteración se anotó para determinar su oncogenicidad y relevancia clínica utilizando OncoKB (v3.9, 30 de diciembre de 2021).^[59] Las alteraciones de todas las categorías (mutaciones, alteraciones en el número de copias y fusiones) clasificadas como "oncogénicas" o "probablemente oncogénicas" por OncoKB, así como aquellas correspondientes a nuevos puntos calientes mutacionales identificados, se designaron como alteraciones impulsoras.

Transcriptómica espacial

La transcriptómica espacial se realizó en el Laboratorio de Genómica Integrada de Memorial Sloan Kettering utilizando la plataforma NanoString CosMx. Las secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) (grosor de 5 μm) de 30 muestras de pacientes se montaron en portaobjetos de vidrio, se desparafinaron y se rehidrataron según los protocolos de Nanostring. La detección de ARN dirigida se llevó a cabo utilizando el panel de ARN humano NanoString CosMx (950 genes). Después de la hibridación, las láminas se procesaron e imágenes en el instrumento CosMx, generando imágenes de inmunofluorescencia (IF) y coordenadas de transcritos de ARN de una sola molécula resueltas espacialmente. El tinte de inmunofluorescencia incluyó DAPI para la identificación nuclear, pancitoqueratina (panCK) para las células epiteliales, CD45 para las células inmunitarias y CD298/B2M como marcadores de membrana (NanoString). La segmentación celular se realizó mediante la plataforma patentada de NanoString utilizando señales nucleares y de membrana combinadas, produciendo recuentos de transcritos por célula y coordenadas espaciales.

Importación de datos, control de calidad y preprocesamiento

Los resultados brutos de CosMx se importaron a Rstudio y se convirtieron en objetos Seurat (Seurat v5) utilizando scripts personalizados basados en el flujo de trabajo recomendado por NanoString. Inicialmente, las láminas individuales se procesaron de forma independiente y posteriormente se fusionaron en un único objeto Seurat después de confirmar la ausencia de identificadores de células duplicados en todas las láminas. Se excluyeron las células con menos de 100 transcritos detectados para eliminar las células de baja calidad o mal segmentadas. Solo se conservaron las células que cumplían este umbral para el análisis posterior. Los posibles dobletes se eliminaron excluyendo las células que coexpresaban marcadores canónicos de dos linajes celulares distintos.

Los valores de expresión se normalizaron utilizando la función NormalizeData de Seurat (normalización logarítmica con el factor de escala predeterminado).^[60] Se identificaron los genes altamente variables utilizando FindVariableFeatures, seguido de la escala de los valores de expresión con ScaleData. La agrupación de células se realizó utilizando el algoritmo de Louvain (FindClusters) con un parámetro de resolución de 3, seleccionado para permitir la separación de los principales tipos de células epiteliales, estromales y endoteliales. Se generaron incrustaciones bidimensionales utilizando la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) con min.dist = 0,1 y spread = 4. Con fines de visualización, se generaron gráficos UMAP en submuestras aleatorias de células. El subconjunto de células cancerosas se reprocesó de forma independiente con normalización, selección de características variables, escala, PCA, construcción de gráficos de vecinos (dims 1:30), agrupación (resolución 0,5) e incrustación UMAP (min.dist = 0,2, spread = 1). Para la visualización, se submuestrearon aleatoriamente hasta 200.000 células cancerosas antes de la creación del gráfico UMAP.

Anotación del tipo de célula

Las identidades de los grupos se anotaron manualmente en función de la expresión de los genes marcadores canónicos utilizando gráficos de características y mapas de calor. Los genes marcadores utilizados para la anotación del tipo de célula incluyeron COL1A1, COL1A2, COL3A1 y THBS2 (fibroblastos asociados al cáncer, CAFs); CD74, CD68, SPP1 y MSR1 (células mieloides); IGHG1, IGHM, IGKC y JCHAIN (células B); CD3D, CD3G, CTLA4 y TCF7 (células T); KRT8, KRT18, KRT19 y KRT20 (células cancerosas epiteliales); APOA1, TTR, SERPINA1 y FGG (hepatocitos); y PECAM1, VWF, ENG y SPARCL1 (células endoteliales). Las identidades finales de las células se consolidaron en los siguientes tipos de células: células epiteliales de CRC, fibroblastos asociados al cáncer (CAFs), células endoteliales, monocitos/macrófagos, células B, células T y hepatocitos. Solo se conservaron las células que pertenecían a estas categorías para los análisis posteriores. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 1 y S2. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de rango de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ninguna suposición de normalidad.

Análisis de expresión diferencial

Para evaluar los cambios transcripcionales a nivel del paciente individual (Figura 2C), se realizaron comparaciones emparejadas dentro del paciente para todos los pacientes con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento emparejadas (n = 11 pares) y biopsias pretratamiento y resistentes (n = 8 pares) utilizando FindMarkers con la prueba de Wilcoxon. La significación se calculó utilizando valores p ajustados de Benjamini-Hochberg. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, 3, 5, S3, S5 y S6.

La actividad a nivel de vía se cuantificó utilizando la puntuación UCell y el suavizado espacial. Las puntuaciones UCell se calcularon en el subconjunto de células cancerosas (cancercells) y se suavizaron espacialmente utilizando SmoothKNN (k = 100, reducción = PCA). Luego, las puntuaciones se transformaron en rangos para generar puntuaciones de cuantiles por célula (escala de 0 a 1), lo que permite comparaciones entre muestras. Estas puntuaciones de cuantiles se transfirieron posteriormente del objeto de células cancerosas (que incluía todas las células cancerosas de todas las láminas) a objetos de láminas espaciales individuales mediante la coincidencia de códigos de barras de las células. Los conjuntos de genes seleccionados de la colección Hallmark, CRC y la literatura relevante para el intestino se filtraron para retener los genes detectados en el conjunto de datos CosMx. Se calcularon las puntuaciones UCell para cada conjunto de genes a nivel de célula. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, S5, S6 y S8. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de rango de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ninguna suposición de normalidad.

Visualización espacial

Se definieron regiones de interés (ROIs) representativas mediante el recorte manual de láminas de tejido individuales utilizando la función Crop en Seurat, con coordenadas de recorte seleccionadas en función de la morfología del tejido, la composición del tipo de célula y la calidad de la señal, según lo evaluado mediante ImageDimPlot de toda la lámina. Las imágenes del tipo de célula se generaron utilizando ImageDimPlot con límites de segmentación celular. La actividad de la vía se visualizó espacialmente en las células de CRC solas utilizando ImageFeaturePlot con valores de expresión recortados al rango del percentil 5-95 (min.cutoff = 0,05, max.cutoff = 0,95) para reducir la influencia de los valores atípicos. Las superposiciones de transcritos de una sola molécula se generaron utilizando ImageDimPlot con el argumento de moléculas. Para las comparaciones específicas de la región, las células de CRC se estratificaron en regiones RAS-altas y RAS-bajas en función de las asignaciones de campo de visión (FOV) seleccionadas manualmente, y la expresión diferencial entre las regiones se realizó utilizando la prueba de Wilcoxon mediante FindMarkers. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de rango de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ninguna suposición de normalidad.

Análisis de la comunicación célula-célula

Las comunicaciones célula-célula se analizaron utilizando CellChat (v1.6)^[29] en el conjunto de datos combinado, agrupando las células por los tipos de células anotados finales. Solo se consideraron las interacciones de señalización secretadas de la base de datos de CellChat humana. Los genes y los pares ligando-receptor se filtraron en función de los criterios de sobreexpresión, y las probabilidades de comunicación se calcularon con un mínimo de 10 células por grupo que interactúa. Las redes de comunicación agregadas se mostraron utilizando gráficos circulares, mapas de calor y diagramas de acordes. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en la Figura S7. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de rango de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ninguna suposición de normalidad.

Clonación

Los oligómeros de 97 mer amplificados por PCR se insertaron en pCF806^[53] digerido con EcoRI y XhoI (Addgene 186711) mediante la clonación de restricción estándar. Los vectores y los insertos se ligaron utilizando la ligasa de ADN T4 (NEB M0202M) a 16 °C durante la noche y se transformaron en células competentes químicamente Stbl3. Los oligómeros para la clonación de shRNA se enumeran en la Tabla S3. Para la producción lentiviral, las células HEK293T se transfectaron con el vector de transferencia lentiviral apropiado junto con los plásmidos de empaquetamiento psPax2 (Addgene, número de catálogo 12260) y pMD2.G (Addgene, número de catálogo 12259) utilizando polietilenimina. Los sobrenadantes virales se cosecharon a las 48, 72 y 96 horas posteriores a la transfección, se centrifugaron a 25.000 RPM y 37 °C durante 2 horas y se almacenaron a -80 °C.

Experimentos de crecimiento de organoides

Los organoides de colon rectosigmoide de ratón y humano se cultivaron en Matrigel y se mantuvieron en medios de crecimiento de organoides sin EGF. Los organoides se sembraron en placas de 48 pocillos. El crecimiento de los organoides se controló en tiempo real utilizando el sistema de análisis de células vivas Incucyte S3 (Sartorius). Se adquirieron imágenes representativas de campo claro cada 24 a 72 horas durante un período de 7 días para los organoides de ratón y 14 días para los organoides humanos. El área de los organoides se cuantificó utilizando el módulo de organoides, con parámetros de segmentación y análisis automatizados optimizados para la morfología de los organoides de colon rectosigmoide. Para cada punto temporal, el área de los organoides se normalizó al área inicial medida el día 0. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib, (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261), RMC-7977 (MedChemExpress HY-148439), TBK1/IKK-IN-5 (MedChemExpress HY-128679), momelotinib (MedChemExpress HY-10961), GSK8612 (MedChemExpress HY-111941), alpelisib (MedChemExpress, HY-15244), defactinib (MedChemExpress HY-12289), TPCA-1 (MedChemExpress HY-10074), pexidartinib (MedChemExpress HY-16749), SP600125 (MedChemExpress HY-12041), LY2157299 (MedChemExpress HY-13226). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y las figuras. Para los experimentos de validación de shRNA, los organoides AKP-G12C se transfectaron con vectores lentivirales que codifican shRNA inducibles por dox dirigidos a Tbk1 o Renilla. Se probaron dos shRNA independientes dirigidos a Tbk1. Los organoides se cultivaron en presencia de doxiciclina (1 μg/mL) durante 7 días, con o sin adagrasib (50 nM). El crecimiento de los organoides se controló en el Incucyte.

Western Blot

Los organoides en Matrigel se lavaron con PBS frío y se incubaron en 1 mL de solución de recuperación celular fría (Corning 354253) durante aproximadamente 60 minutos para ablandar el Matrigel. Después de la disolución completa del Matrigel, la suspensión de organoides se transfirió a un tubo cónico de 15 mL y se añadieron 5 mL de PBS frío. Los organoides se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos a 4 °C. Los pellets de organoides se lavaron con 1 mL de PBS y se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos a 4 °C. Los pellets se resuspendieron en 30 μL de tampón RIPA, se agitaron a 4 °C durante 25 minutos y se centrifugaron a 20.000 g a 4 °C durante 20 minutos. Se recogió el sobrenadante de proteínas y se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas DC (BioRad 5000116). Se cargaron 30 μg de proteína por Western Blot. Los anticuerpos utilizados para el análisis de Western blot fueron: anti-fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Cell Signaling Technology 9107), anti-fosfo TBK1/NAK1 (Ser172) (Cell Signaling Technology 5483), anti-TBK1 (Cell Signaling Technology 3504), anti-no fosfo (Activo) Yap (Ser127) (Cell Signaling Technology 29495), anti-Yap (Cell Signaling Technology 12395), anti-fosfo-IRF-3 (Ser396) (Cell Signaling Technology 4947), (anti-beta-actina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 12262), anti-vinculina HRP conjugado (Cell Signaling Technology 18799).

Ensayo de viabilidad Cell TiterGlo

Los organoides de ratón se cultivaron en Matrigel y se mantuvieron en medios de cultivo de organoides sin EGF en placas de 48 pocillos, bajo el tratamiento adecuado. Después de 3 o 5 días, se midió la viabilidad celular utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 3D (Promega G9681) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes fármacos: adagrasib (MedChemExpress HY-130149), afatinib (MedChemExpress HY-10261) y momelotinib (MedChemExpress HY-10961). Las concentraciones utilizadas para cada fármaco y las duraciones del tratamiento se describen en detalle en la sección de resultados y en las figuras.

Ensayo de número de copias de KRAS

Los organoides se disociaron y se pelletizaron después de tres días en cultivo. Tras el aislamiento del ADN genómico (gDNA), se realizaron ensayos de número de copias utilizando el ensayo de número de copias TaqMan (Thermo Fisher Scientific, 4400291) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron 1.500 células HCT116 por pocillo en una placa de 12 pocillos. 24 horas después de la siembra, se retiró el medio y se reemplazó por medio fresco que contenía el tratamiento adecuado. Los tratamientos se renovaron cada 2-3 días hasta que los controles alcanzaron la confluencia. A continuación, las células se fijaron utilizando un 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente, con agitación. Las células se tiñeron utilizando un 10% de tinte Giemsa en PBS, con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Las células fijadas y teñidas se lavaron tres veces con agua y se dejaron secar durante la noche. Después de la obtención de imágenes, las células se destiñeron utilizando un 10% de ácido acético durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se midió la absorbancia utilizando un lector de placas Omega.

Aislamiento de ARN y secuenciación de ARN (RNA-seq)

Los organoides se recogieron en 5 mL de PBS frío y se centrifugaron a 2500 RPM durante 5 minutos a 4 °C. El pellet se resuspendió en 800 μL de TRIzol (Invitrogen, 15596-026). La extracción de ARN se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Para eliminar la contaminación por ADN, el ARN se trató con DNasa I recombinante (Roche Diagnostics, 04716728001) durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la purificación en columna utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini (74106). La síntesis de ADNc se realizó utilizando 1 μg de ARN y se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El Laboratorio Central de Genómica de Weill Cornell Medicine evaluó la calidad del ARN con un Agilent 2100 Bioanalyzer, preparó la biblioteca de ARN utilizando el kit de preparación de bibliotecas de muestras de ARNm TruSeq (Illumina) y realizó la secuenciación de ARN (de un solo extremo, 75 ciclos) en un Illumina NextSeq 500. Los archivos FASTQ sin procesar se han enviado al SRA con el número de acceso SRA: PRJNA1244364.

Análisis de la secuenciación de ARN (RNA-seq)

Los archivos FASTQ sin procesar se pseudoalinearon al genoma del ratón (GRCm39) utilizando Kallisto (versión 0.51.1).^[46] La expresión génica diferencial se estimó utilizando el paquete R DEseq2.^[54] El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando los paquetes R fgsea^[55] y GSVA.^[45],^[47] El análisis de sobre-representación (ORA) se realizó sobre una lista de genes con expresión aumentada o disminuida para condiciones de tratamiento específicas con un cambio de pliegue log2 de >1,0 (RNAseq a granel) o >0,3 (CosMx) y un valor p ajustado 500× de cobertura mediana). Todos los tipos de alteraciones genómicas, incluidas las sustituciones, las inserciones/deleciones, las amplificaciones a nivel de gen focal, las deleciones homozigóticas y las fusiones de genes seleccionadas, se identificaron comparando las muestras tumorales con sus contrapartes normales correspondientes. Todas las secuenciaciones y los análisis se realizaron en un laboratorio clínico certificado por CLIA. Las alteraciones somáticas, incluidas las sustituciones no sinónimas, las pequeñas inserciones/deleciones, las amplificaciones a nivel de gen focal, las deleciones homozigóticas y las fusiones de genes seleccionadas, se identificaron mediante una canalización bioinformática validada clínicamente.^[58] Cada alteración se anotó posteriormente para la oncogenicidad y la relevancia clínica utilizando OncoKB (v3.9, 30 de diciembre de 2021).^[59] Las alteraciones de todas las categorías (mutaciones, alteraciones del número de copias y fusiones) clasificadas como “oncogénicas” o “probablemente oncogénicas” por OncoKB, así como las que corresponden a nuevos puntos calientes de mutación, se designaron como alteraciones impulsoras.

Transcriptómica espacial

La transcriptómica espacial se realizó por el Grupo de Operaciones de Genómica Integrada del Memorial Sloan Kettering utilizando la plataforma NanoString CosMx. Las secciones de tejido FFPE (grosor de 5 μm) de 30 muestras de pacientes se montaron en portaobjetos, se desparafinarizaron y se rehidrataron según los protocolos de Nanostring. La detección de ARN dirigida se llevó a cabo utilizando el panel de ARN humano NanoString CosMx (950 genes). Tras la hibridación, las láminas se procesaron y se obtuvieron imágenes en el instrumento CosMx, lo que generó imágenes de inmunofluorescencia y coordenadas de transcritos de ARN resueltas espacialmente. La tinción por inmunofluorescencia incluyó DAPI para la identificación nuclear, pan-citoqueratina (panCK) para las células epiteliales, CD45 para las células inmunitarias y CD298/B2M como marcadores de membrana (NanoString). La segmentación celular se realizó mediante la canalización patentada de Nanostring utilizando señales nucleares y de membrana combinadas, lo que produjo recuentos de transcritos por célula y coordenadas espaciales.

Importación de datos, control de calidad y preprocesamiento

Los datos brutos de CosMx se importaron a Rstudio y se convirtieron en objetos Seurat (Seurat v5) utilizando scripts personalizados basados en el flujo de trabajo recomendado por NanoString. Inicialmente, las láminas individuales se procesaron de forma independiente y, posteriormente, se fusionaron en un único objeto Seurat después de confirmar la ausencia de identificadores de células duplicados entre las láminas. Se excluyeron las células con menos de 100 transcritos detectados para eliminar las células de baja calidad o con segmentación deficiente. Solo se conservaron las células que cumplían este umbral para el análisis posterior. Los posibles dobletes se eliminaron excluyendo las células que coexpresaban marcadores canónicos de dos linajes celulares distintos.

Los valores de expresión se normalizaron utilizando la función NormalizeData de Seurat (normalización logarítmica con el factor de escala predeterminado).^[60] Los genes altamente variables se identificaron utilizando FindVariableFeatures, seguido de la escala de los valores de expresión con ScaleData. La agrupación de células se realizó utilizando el algoritmo de Louvain (FindClusters) con un parámetro de resolución de 3, seleccionado para permitir la separación de los principales tipos de células epiteliales, estromales y endoteliales. Se generaron incrustaciones bidimensionales utilizando la aproximación y proyección de la variedad uniforme (UMAP) con min.dist = 0,1 y spread = 4. Con fines de visualización, se generaron gráficos UMAP a partir de submuestras aleatorias de células. El subconjunto de células cancerosas se reprocesó de forma independiente con normalización, selección de características variables, escala, análisis de componentes principales (PCA), construcción del gráfico de vecinos (dims 1:30), agrupación (resolución 0,5) e incrustación UMAP (min.dist = 0,2, spread = 1). Para la visualización, se submuestrearon aleatoriamente hasta 200.000 células cancerosas antes de generar el gráfico UMAP.

Anotación del tipo celular

Las identidades de los grupos se anotaron manualmente basándose en la expresión de genes marcadores canónicos utilizando gráficos de características y mapas de calor. Los genes marcadores utilizados para la anotación del tipo celular incluyeron COL1A1, COL1A2, COL3A1 y THBS2 (fibroblastos asociados al cáncer, CAFs); CD74, CD68, SPP1 y MSR1 (células mieloides); IGHG1, IGHM, IGKC y JCHAIN (células B); CD3D, CD3G, CTLA4 y TCF7 (células T); KRT8, KRT18, KRT19 y KRT20 (células cancerosas epiteliales); APOA1, TTR, SERPINA1 y FGG (hepatocitos); y PECAM1, VWF, ENG y SPARCL1 (células endoteliales). Las identidades finales de las células se consolidaron en los siguientes tipos de células: células epiteliales de CRC, fibroblastos asociados al cáncer (CAFs), células endoteliales, monocitos/macrófagos, células B, células T y hepatocitos. Solo se conservaron las células que pertenecían a estas categorías para los análisis posteriores. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 1 y S2. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Análisis de expresión diferencial

Para evaluar los cambios transcripcionales a nivel del paciente individual (Figura 2C), se realizaron comparaciones emparejadas dentro del paciente para todos los pacientes con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento emparejadas (n = 11 pares) y biopsias pretratamiento y resistentes (n = 8 pares) utilizando FindMarkers con la prueba de Wilcoxon. La significación se calculó utilizando valores p ajustados por Benjamini-Hochberg. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, 3, 5, S3, S5 y S6.

La actividad a nivel de vía se cuantificó utilizando la puntuación UCell y el suavizado espacial. Las puntuaciones UCell se calcularon en el subconjunto de células cancerosas (cancercells) y se suavizaron espacialmente utilizando SmoothKNN (k = 100, reducción = PCA). A continuación, las puntuaciones se transformaron en rangos para generar puntuaciones de cuantiles por célula (escala de 0 a 1), lo que permite comparaciones entre muestras. Estas puntuaciones de cuantiles se transfirieron posteriormente del objeto de células cancerosas (que incluía todas las células cancerosas de todas las láminas) a objetos de láminas espaciales individuales mediante la coincidencia de códigos de barras de las células. Los conjuntos de genes seleccionados de la colección Hallmark, CRC y la literatura relevante sobre el intestino se filtraron para conservar los genes detectados en el conjunto de datos de CosMx. Las puntuaciones UCell se calcularon para cada conjunto de genes a nivel de célula. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en las Figuras 2, S5, S6 y S8. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Visualización espacial

Se definieron regiones de interés (ROIs) representativas mediante el recorte manual de láminas de tejido individuales utilizando la función Crop en Seurat, con coordenadas de recorte seleccionadas en función de la morfología del tejido, la composición del tipo celular y la calidad de la señal, según lo evaluado mediante ImageDimPlot de toda la lámina. Se generaron imágenes de tipo celular utilizando ImageDimPlot con límites de segmentación de células. La actividad de la vía se visualizó espacialmente solo en las células de CRC utilizando ImageFeaturePlot con valores de expresión recortados al rango del percentil 5 al 95 (min.cutoff = 0,05, max.cutoff = 0,95) para reducir la influencia de los valores atípicos. Se generaron superposiciones de transcritos de una sola molécula utilizando ImageDimPlot con el argumento de moléculas. Para las comparaciones específicas de la región, las células de CRC se estratificaron en regiones de alta y baja expresión de RAS basándose en las asignaciones de campo de visión (FOV) seleccionadas manualmente, y se realizó una expresión diferencial entre las regiones utilizando la prueba de Wilcoxon mediante FindMarkers. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

Análisis de la comunicación célula-célula

Se analizaron las comunicaciones célula-célula utilizando CellChat (v1.6)^[29] en el conjunto de datos combinado, agrupando las células por los tipos de células anotados finales. Solo se consideraron las interacciones de señalización secretadas de la base de datos de CellChat humana. Los genes y los pares ligando-receptor se filtraron en función de los criterios de sobreexpresión, y las probabilidades de comunicación se calcularon con un mínimo de 10 células por grupo que interactúa. Las redes de comunicación agregadas se mostraron utilizando gráficos circulares, mapas de calor y diagramas de acordes. Los detalles estadísticos se pueden encontrar en la Figura S7. Se utilizaron pruebas estadísticas no paramétricas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon) para comparar los grupos; por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad.

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism (versión 10.0.3) y R (versión 4.5.1, R Studio versión 2025.05.1 + 513). Los detalles estadísticos de cada experimento, incluido el test específico utilizado, el valor exacto de n y lo que n representa y mide, se proporcionan en las leyendas de las figuras correspondientes (Figuras 1, 2, 3, 4, 5 y S1-S10). A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM), con puntos conectados que representan muestras de pacientes emparejadas cuando corresponda. A menos que se indique lo contrario, cada punto de datos representa el promedio de ≥3 experimentos independientes. No se realizaron pruebas formales de normalidad o igualdad de varianza en los datos analizados mediante la prueba t de Student; para todos los análisis de expresión diferencial de transcriptómica espacial y ARN-seq a granel, se utilizó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon y, por lo tanto, no se requirió ningún supuesto de normalidad. Para los experimentos con ratones, los investigadores no estaban cegados a las condiciones del tratamiento.

Material suplementario

La información complementaria se puede encontrar en línea en https://doi.org/10.1016/j.ccell.2026.04.009.