Los organoides derivados de tumores de pacientes con cáncer colorrectal metastásico reflejan la heterogeneidad tumoral y predicen la supervivencia del paciente y la sensibilidad a los fármacos.

La oncología funcional, basada en las pruebas ex vivo de sensibilidad a fármacos de células cancerosas derivadas del paciente, puede complementar los enfoques guiados por la genómica en la medicina de precisión contra el cáncer.^[1] La selección prospectiva de tratamientos guiada por ensayos funcionales ha demostrado beneficios clínicos en pacientes con cánceres hematológicos, pero ha resultado más difícil en pacientes con tumores sólidos.^[2],^[3] Las células tumorales pueden cultivarse como estructuras organoides tridimensionales autoorganizadas que se asemejan al tejido original, y el uso de modelos organoides en la investigación del cáncer ha aumentado exponencialmente en la última década. El cáncer colorrectal (CCR) fue uno de los primeros tipos de enfermedad en los que se demostró que era susceptible de modelado con organoides derivados del paciente (PDOs),^[4] y tanto la arquitectura tisular como los perfiles moleculares de los CCR pueden recapitularse con este sistema de modelos.^[5],^[6] Las pruebas de sensibilidad a fármacos de los PDOs de CCR también pueden reflejar las respuestas clínicas de los tumores originales al tratamiento quimioterapéutico estándar y a los agentes dirigidos.^[7],^[8],^[9] Sin embargo, los ejemplos exitosos de oncología funcional de precisión y la selección prospectiva de tratamientos en pacientes que utilizan este enfoque siguen siendo escasos o anecdóticos.^[10],^[11]

La heterogeneidad tumoral es una de las principales causas de resistencia al tratamiento y de un mal pronóstico del paciente.^[12] La heterogeneidad metastásica del CCR se ha estudiado ampliamente a nivel molecular, destacando la siembra temprana, la siembra policlonal, la siembra entre depósitos metastásicos y la plasticidad fenotípica en el desarrollo de la enfermedad metastásica, posiblemente aumentada por la exposición al tratamiento.^[13],^[14],^[15],^[16],^[17] Además, la heterogeneidad de la respuesta al tratamiento estándar es común entre las lesiones metastásicas y puede tener un impacto negativo en los resultados del paciente.^[18],^[19] Los PDOs derivados de múltiples células o regiones de tumores primarios han sugerido una marcada heterogeneidad intratumoral de la sensibilidad a los fármacos,^[20],^[21], mientras que los PDOs emparejados del tumor primario y la metástasis hepática han mostrado una sensibilidad ex vivo similar a las quimioterapias estándar.^[22],^[23] Sin embargo, los biobancos de CCR suelen incluir un único PDO por paciente.^[9],^[24],^[25],^[26] Estos recursos capturan una importante diversidad interpaciente, pero el modelado sistemático de la heterogeneidad intermetastásica y el muestreo de múltiples lesiones de pacientes individuales ha sido limitado. Aquí, basándonos en estudios previos de heterogeneidad farmacogenómica ex vivo en CCR metastásico^[27],^[28],^[29], establecemos 213 linajes de organoides a partir de metástasis hepáticas de CCR (CRLMs) de 102 pacientes, incorporando un muestreo sistemático de lesiones espacialmente distintas y metástasis recurrentes en re-resecciones. En consonancia con los esfuerzos internacionales para reducir la dependencia de los modelos animales y promover sistemas experimentales relevantes para los humanos, nuestro estudio tuvo como objetivo modelar la heterogeneidad intermetastásica funcional ex vivo con PDOs y evaluar las posibles implicaciones para el manejo de la enfermedad y la selección del tratamiento. Al integrar el perfil de sensibilidad a los fármacos con datos moleculares, morfológicos y clínicos, buscamos generar un recurso que conecte la farmacogenómica preclínica con la oncología de precisión traslacional en el CCR metastásico.

Resultados

Un biobanco vivo de CCR metastásico

Se incluyeron muestras de tejido fresco de 346 CRLMs de 132 pacientes tratados con hepatectomía para CCR metastásico para el cultivo ex vivo (Tabla S1; Figura S1). Se establecieron con éxito PDOs para 213 lesiones (62%) de 102 pacientes (77%), incluidas múltiples (hasta 6) lesiones separadas espacialmente de cada uno de 65 pacientes (64%), así como CRLMs recurrentes muestreadas en re-resecciones de seis pacientes (Figuras 1A–1D). El tiempo medio desde el muestreo hasta la finalización del cribado de fármacos y la criopreservación de los PDOs para el biobanco fue de 8,4 semanas (rango percentil 10-90: 4-21 semanas). No hubo diferencias en la tasa de éxito del cultivo según la ubicación del tumor (segmento hepático; Figura 1A), el número de lesiones intentadas para el cultivo por paciente (Figura 1C), el tipo de cirugía o cualquiera de las características clinicopatológicas o moleculares enumeradas en la Tabla S1. Las muestras con bajo contenido de células tumorales (n = 3) o necrosis (n = 5) no crecieron, pero la mayoría (90%) de los fracasos de crecimiento no pudieron atribuirse a marcadores histopatológicos o moleculares (Figuras 1B y S2; Tabla S1). Tampoco hubo selección de crecimiento basada en la exposición a la quimioterapia neoadyuvante (p > 0,9 mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson de las lesiones tratadas frente a las no tratadas), pero las lesiones que no se propagaron ex vivo mostraron una mayor respuesta al tratamiento neoadyuvante (Figura 1E). Las sensibilidades a los fármacos ex vivo en los PDOs establecidos con éxito no reflejaron las respuestas tumorales clínicas al tratamiento neoadyuvante correspondiente, y esto también podría reflejar la selección de células propagadas en función de la respuesta al tratamiento (Figura S3). Los pacientes con al menos un PDO establecido con éxito tuvieron un tiempo de supervivencia general medio significativamente más corto después de la resección hepática (38 meses) que los pacientes sin PDOs establecidos (la mediana no se alcanzó en un seguimiento de 4 años; Figura 1F), lo que apoya la hipótesis de que el crecimiento ex vivo exitoso refleja una enfermedad agresiva y/o una peor respuesta a la quimioterapia.

Una visión general del biobanco vivo y los datos farmaco-ómicos se muestra en la Figura 2 y la Tabla S2, incluidos los perfiles de sensibilidad a 41 o 47 fármacos (ilustrados por 24 fármacos superpuestos entre las dos bibliotecas personalizadas), los perfiles de expresión génica (ilustrados por la clasificación según los subtipos moleculares de consenso intrínseco [iCMS]^[30]), las mutaciones de 20 genes relevantes para el CCR (ilustradas por KRAS/NRAS [RAS], BRAF y TP53), la inmunohistoquímica fluorescente multiplex de 12 proteínas (ilustrada por CDX2, KRT20 y KI67) y los fenotipos morfológicos basados en tinciones de hematoxilina y eosina (H&E). Todos los PDOs se derivaron de tumores con microsatélites estables (MSS), lo que refleja su origen en CRLMs resecables.

Los PDOs conservan las características histológicas, transcriptómicas y de mutación de los CRLMs correspondientes

Los pares de tinciones H&E de los PDOs y las muestras de tejido tumoral correspondientes (n = 46 lesiones de 26 pacientes) indicaron que el 85% de los PDOs conservaron las morfologías tumorales para las características histopatológicas, como las estructuras acinares, quísticas y sólidas (Figuras 3A y S4; Tabla S3). Los PDOs con morfologías disímiles no se caracterizaron por tasas de crecimiento distintas ni por ningún marcador molecular específico (Tabla S4).

El perfil de expresión génica indicó altas puntuaciones de similitud de los PDOs (n = 211) para el tejido de CCR primario según el enfoque CancerCellNet (Figura S5A). En particular, los PDOs tenían puntuaciones de similitud más altas que sus muestras de tejido emparejadas (n = 50 pares de muestras evaluadas; p = 7 × 10−4 mediante la prueba t emparejada; Figura S5B), lo que probablemente refleja la influencia del microambiente tumoral específico del hígado en la comparación de los CRLMs con los tumores primarios. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de los pares de muestras de PDO-CRLM confirmó el enriquecimiento exclusivo con señales del microambiente tumoral en las muestras de tejido en relación con los PDOs (Figura 3B). Los PDOs mostraron un enriquecimiento con firmas de metabolismo y ciclo celular, lo que probablemente refleja una mayor actividad proliferativa y un amplio acceso a nutrientes y oxígeno en los cultivos celulares. El primer componente del análisis de componentes principales en los PDOs y los CRLMs se debió principalmente a la diferencia en las señales del microambiente tumoral (Figuras S5C–S5E) y no mostró correlación entre los pares de muestras emparejadas (Figura 3C). En contraste, el segundo componente se basó en características intrínsecas de las células cancerosas (ilustrado con una firma de expresión génica similar a la de BRAF mutante) y estuvo fuertemente correlacionado entre los PDOs y el tejido tumoral emparejado, lo que indica que los PDOs recapitularon el perfil transcriptómico de su tumor original.

Las frecuencias de mutación de los 10 genes más frecuentemente mutados (analizados en un único PDO de cada uno de los 102 pacientes) fueron similares a dos estudios previos de CCR metastásico^[31],^[32] (p = 0,98 mediante la prueba de chi-cuadrado; Figura 3D). Los pares de muestras de PDO-CRLM emparejados (n = 74 lesiones de 56 pacientes) también mostraron perfiles de mutación altamente concordantes, con un estado concordante para el 93,7% de las 491 mutaciones detectadas (Figura S6A). Las discordancias se debieron principalmente a mutaciones subclonal con bajas fracciones de alelos mutantes (p = 0,002 mediante la prueba de Wilcoxon de la fracción de alelos de las mutaciones discordantes y concordantes), que con frecuencia involucraron un segundo golpe en las mutaciones de APC o TP53 (Figuras S6B y S6C).

Asociaciones farmacológicas de los marcadores moleculares

Se confirmaron las asociaciones farmacogenómicas conocidas, incluida la resistencia a los inhibidores de EGFR en los PDOs mutados en RAS y BRAFV600E (Figuras 4A, S7A y S7B), la sensibilidad al inhibidor de MDM2-TP53 idasanutlin en los PDOs con TP53 de tipo salvaje y/o alta expresión de ARNm de TP53 (Figuras S7C–S7E), así como una sensibilidad atípica a sotorasib en los dos PDOs con mutación KRASG12C (de un único paciente; Figura S7F). En particular, la mayoría de los PDOs mutados en BRAFV600E fueron resistentes al tratamiento con un único agente con el inhibidor específico de la mutación encorafenib (PDOs de 4 de 5 pacientes; Figura S7G). Una combinación de encorafenib con afatinib (inhibidor de EGFR) y trametinib (inhibidor de MEK) mostró una mayor actividad (Figura S7H). Sin embargo, este efecto no fue específico de los PDOs mutados en BRAFV600E (Figura S7I), lo que sugiere que la distinción entre los efectos sinérgicos y aditivos de la combinación de fármacos requiere análisis adicionales de las matrices de dosis-respuesta completas de los pares de fármacos.

Un análisis ampliado de las sensibilidades a los fármacos (n = 51 fármacos únicos en ambas bibliotecas; Tabla S5) y las mutaciones (n = 8 genes con al menos 10 PDOs mutados o de tipo salvaje por grupo) mostró 12 asociaciones significativas, todas ellas que involucraban APC, KRAS, NRAS, BRAF o TP53 (pruebas de Wilcoxon con corrección de Benjamini-Hochberg; Figura 4A). Más allá de las asociaciones farmacogenómicas conocidas, las mutaciones de KRAS se asociaron con la sensibilidad al inhibidor de múltiples quinasas regorafenib (p = 0,045). No hubo diferencias según los puntos calientes de la mutación (Figura S8A), y la asociación fue más fuerte cuando se incluyó BRAFV600E (p = 7,7 × 10−3). Los PDOs mutados en BRAFV600E mostraron baja sensibilidad al inhibidor de IGF1R BMS-754807 (p = 0,01). Esta asociación fue específica de BRAFV600E y no se encontró para ninguno de los puntos calientes de RAS (Figura S8B). Además, los PDOs mutados en TP53 y APC fueron menos sensibles a los fármacos quimioterapéuticos estándar fluorouracilo (5-FU) (p = 0,03) y SN-38 (metabolito activo de irinotecán; p = 0,01) que los PDOs correspondientes de tipo salvaje, respectivamente (Figura 4A). Una evaluación sistemática de las mutaciones concurrentes en pares de genes (Figura S9A) mostró que los PDOs mutados en TP53 y APC tenían una menor sensibilidad a los fármacos en general (Tabla S6) y una menor puntuación media de sensibilidad a los fármacos (DSS) en las bibliotecas de fármacos (p = 0,02). Esto también fue cierto para el subgrupo de mal pronóstico definido por las mutaciones concurrentes de RAS/BRAFV600E y TP53 (Figura 4B). La asociación positiva más fuerte con la sensibilidad a los fármacos se observó con las mutaciones concurrentes de RAS y PIK3CA, y estos PDOs mostraron una fuerte sensibilidad a la quimioterapia combinada FLIRI (5-FU, leucovorina y SN-38; Figura 4C), aunque no a ninguno de los fármacos individuales correspondientes (Tabla S6).

Las comparaciones de los valores de DSS según la clasificación transcriptómica iCMS mostraron una mayor actividad de los inhibidores de EGFR en los PDOs iCMS2, atribuida al enriquecimiento con mutaciones RAS/BRAFV600E en el grupo iCMS3 (razón de probabilidades 32, p = 3,5 × 10−13 mediante la prueba exacta de Fisher). Sin embargo, la mayor actividad de la gemcitabina (quimioterapia) y el alisertib (inhibidor de la quinasa Aurora A) en los PDOs iCMS3 fue independiente del estado de mutación RAS/BRAFV600E (Figuras 4D y S8C).

La inmunohistoquímica multiplexa fluorescente de marcadores diagnósticos seleccionados, proteínas implicadas en la resistencia a los fármacos y otras proteínas de interés (n = 12) mostró que la actividad del 78% de los fármacos (n = 28 de 33 fármacos únicos) se correlacionaba significativamente con la expresión de al menos una proteína entre los PDOs (n = 77–134 PDOs de 37 a 67 pacientes; Figura 4E). La interacción fármaco-proteína más fuerte fue una correlación negativa entre la expresión del transportador ABC ABCB1 y la actividad del inhibidor de la vía PI3K/AKT, gedatolisib (coeficiente de Spearman = −0,5, p = 9,3 × 10−10). En general, las proteínas conocidas por estar implicadas en la resistencia a los fármacos y la respuesta al estrés, incluyendo ABCB1, ABCG2, UGT1A y HSF1, se correlacionaron negativamente con la actividad de varios fármacos. Las correlaciones positivas más fuertes se encontraron entre la expresión de CDX2 y las quimioterapias estándar 5-FU y TAS-102 (trifluridina/tipiracil). La sensibilidad a 5-FU también se correlacionó con la expresión de RCC2, una proteína que se ha sugerido que está asociada con el beneficio de la quimioterapia adyuvante en el CRC locorregional.^[33] La alta expresión de CDX2 o RCC2 (>70º percentil) representó la mayoría de los PDOs sensibles a 5-FU (DSS >14,3; razón de probabilidades 2,7, p = 0,01; Figura S8D). Además, la expresión de TP53 se correlacionó negativamente con la sensibilidad al inhibidor de PARP, olaparib. Se encontró una alta expresión de TP53 exclusivamente en los PDOs con mutaciones TP53 con cambio de sentido (Figura S7E), lo que coincide con nuestro estudio previo que sugiere que la actividad de TP53 de tipo salvaje es necesaria para la sensibilidad a los inhibidores de PARP en las células de CRC.^[34] Además, la expresión de RIPK1 se correlacionó positivamente con la actividad del mimético de SMAC, LCL161, que se dirige a las proteínas inhibidoras de la apoptosis.^[28]

Asociaciones clinicopatológicas y farmacológicas

Los pacientes con tumores primarios en el lado derecho tienen un beneficio limitado del tratamiento anti-EGFR,^[35] y el biobanco vivo confirmó la sensibilidad a los inhibidores de EGFR solo en los PDOs de tipo salvaje RAS/BRAF derivados de pacientes con tumores primarios en el lado izquierdo o rectal (p = 0,02 mediante la prueba de Wilcoxon; Figura S9B). En contraste, la localización del tumor primario en el lado derecho se asoció con una mayor sensibilidad a las quimioterapias estándar SN-38 y TAS-102, independientemente del estado de mutación RAS/BRAF (Figura S9B; Tabla S7). El sexo del paciente no se asoció con la sensibilidad a ningún fármaco, incluido 5-FU (p = 0,7 mediante la prueba de Wilcoxon), mientras que la edad avanzada del paciente se correlacionó débilmente con la sensibilidad a 5-FU (coeficiente de Spearman = 0,28, p = 0,02; Tabla S8). El diagnóstico de múltiples CRLMs en la imagen radiológica antes de la cirugía hepática se asoció con una baja sensibilidad a los fármacos en general, aunque se encontró una correlación estadísticamente significativa para SN-38 e idasanutlin (Tabla S9). El análisis de riesgos proporcionales de Cox indicó que las altas sensibilidades a los fármacos ex vivo se asociaron con una mejor supervivencia general entre los pacientes (DSS media en 24 fármacos como predictor; razón de riesgos, 0,91; intervalo de confianza del 95%, 0,82–1,0; p = 0,07), y la asociación pronóstica fue significativa para cuatro fármacos (atorvastatina, bemcentinib y dos inhibidores de EGFR; Tabla S10). La sensibilidad al agente hipocolesterolémico atorvastatina y al inhibidor de AXL, bemcentinib, mantuvo asociaciones pronósticas significativas en modelos multivariables con variables clinicopatológicas y estado de mutación RAS/BRAF (razón de riesgos multivariables, 0,81 y 0,79; intervalos de confianza del 95%, 0,71–0,93 y 0,64–0,96, respectivamente; Figura S10).

Los PDOs de CRLMs representan dos fenotipos morfológicos principales

Los PDOs se clasificaron en dos fenotipos morfológicos principales basándose en las tinciones de H&E de muestras incluidas en parafina (n = 213; Figuras 5A y S4; Tabla S11). Se identificó un fenotipo quístico en el 28% de los PDOs y se caracterizó por células cuboidales y columnares organizadas que forman estructuras quísticas/glandulares con un lumen central bien definido. Se encontró un fenotipo sólido en el 38% de los PDOs, y estos carecían de lumen central y presentaban patrones de crecimiento predominantemente sólidos, incluyendo vacuolas citoplasmáticas o células individualmente disgregadas. Los PDOs restantes (34%) presentaban características de ambos fenotipos, quístico y sólido, y se clasificaron como mixtos (menos del 50% de las estructuras individuales mostraban características claras de alguno de los fenotipos).

La inmunohistoquímica fluorescente multiplexa mostró una expresión diferencial de los marcadores diagnósticos de CRC, KRT20 y CDX2, según los fenotipos morfológicos (Figuras 5B, S11A y S11B). CDX2 tuvo la mayor expresión en los PDOs quísticos y KRT20 en los PDOs sólidos, y el fenotipo mixto mostró niveles de expresión intermedios de ambas proteínas. El fenotipo sólido también se enriqueció con mutaciones RAS y BRAFV600E (Figura 5C), y el 92% de los PDOs BRAFV600E presentaban un fenotipo sólido (Figura S11C). De manera consistente, el enriquecimiento con una firma de expresión similar a la de BRAF mutante en los PDOs sólidos también fue la distinción más fuerte entre los subtipos a nivel transcriptómico (Figuras 5E y S11E). Los PDOs sólidos también presentaron una mayor inestabilidad de microsatélites y un enriquecimiento con firmas de apoptosis e inflamación, incluyendo la señalización de TNF-α y la respuesta de IFN-α, así como la clase iCMS3 (Figura 5D). En contraste, los PDOs quísticos presentaban un perfil similar a MSS y un enriquecimiento con firmas de células madre cancerosas e iCMS2. Los PDOs quísticos también fueron generalmente más sensibles a los fármacos, estimado como una mayor sensibilidad media en los 24 fármacos evaluados en ambas bibliotecas (Figura 5F; Tabla S12). Esto incluyó una mayor sensibilidad a los tratamientos estándar para el CRC, como 5-FU e inhibidores de EGFR (Figura 5F), lo que refleja una mayor expresión de CDX2 y mutaciones menos frecuentes de RAS/BRAFV600E (Figura S11D).

Modelado de la heterogeneidad metastásica con PDOs de múltiples lesiones

Se analizó la heterogeneidad tumoral morfológica y farmacológica entre los PDOs de distintas lesiones metastásicas de cada uno de los 66 pacientes (n = 175 PDOs; Figura 6A). La mayoría de los pacientes presentaban PDOs del mismo fenotipo morfológico (n = 40, 61%). Sin embargo, el grupo mixto representa un fenotipo inherentemente heterogéneo, y además del 18% de los pacientes (n = 12) con PDOs exclusivamente mixtos, otro 23% (n = 15) presentaba heterogeneidad intermetastásica con una combinación de PDOs mixtos y ya sean quísticos o sólidos. Además, se observó heterogeneidad de los fenotipos quístico y sólido en el 12% de los pacientes (n = 8), y se observó un cambio de fenotipo morfológico después de la recurrencia en uno de los seis pacientes evaluables (Figura 6A).

La heterogeneidad de la sensibilidad a los fármacos fue menos prominente en las comparaciones intra-paciente que en las inter-paciente, evaluada como menores puntuaciones de heterogeneidad farmacológica entre pares de muestras del mismo paciente y estimada basándose en las distancias euclidianas de los valores de DSS (n = 24 fármacos superpuestos; Figura 6B; p < 0,0001 mediante ANOVA de una vía). Esto fue respaldado por el análisis de agrupamiento jerárquico, que mostró la agrupación de los PDOs del mismo paciente (Figura S12). No hubo diferencias en el nivel de heterogeneidad espacial entre las lesiones de la misma resección y la heterogeneidad longitudinal entre las lesiones recurrentes muestreadas en las re-resecciones (Figura 6B). La puntuación de heterogeneidad farmacológica intra-paciente no se asoció con ninguna variable clinicopatológica o supervivencia del paciente (Tabla S13).

Los PDOs sólidos presentaban valores de DSS medios más bajos que los quísticos en todos los pacientes con heterogeneidad morfológica, excepto en uno (p = 0,027, prueba de Wilcoxon pareada; Figura 6C), lo que indica que la heterogeneidad morfológica promovió la heterogeneidad farmacológica. Esto fue respaldado por puntuaciones de heterogeneidad farmacológica más altas entre los PDOs en pacientes con heterogeneidad morfológica (p = 0,017 mediante la prueba de Welch, Figura 6D). Sin embargo, la puntuación de heterogeneidad farmacológica más alta se encontró en un paciente con tres PDOs quísticos y un estado de mutación APCR213X heterogéneo (Figuras 6E y S13A). El PDO mutado fue menos sensible a varios fármacos de quimioterapia (5-FU, metotrexato y gemcitabina) y más sensible al mimético de SMAC, LCL161 (Figura S13B). Cabe destacar que los tres PDOs fueron altamente sensibles al inhibidor de EGFR, afatinib (dentro del percentil 3º–11º entre todos los PDOs) y moderadamente sensibles a la quimioterapia combinada con FLIRI (percentil 25º–55º), y esto se correspondió con respuestas clínicas similares a la quimioterapia neoadyuvante con FOLFIRI más un anticuerpo anti-EGFR en las tres lesiones (respuesta parcial con una reducción del 35–41% del tamaño del tumor; Figura S13A).

No hubo diferencias claras en el nivel de heterogeneidad farmacológica intra-paciente entre los fármacos o las clases de fármacos, estimado como la máxima diferencia de DSS para cada fármaco entre cualquier par de PDOs por paciente (Figura S13C; la baja heterogeneidad de encorafenib e idasanutlin probablemente se debió a la baja actividad del fármaco en general). Las estimaciones de heterogeneidad más altas (>95º percentil) se distribuyeron uniformemente entre los fármacos (mediana de 3 puntuaciones altas por fármaco, intervalo de confianza del 95%, 2–5), lo que apoya que la heterogeneidad farmacológica depende más de la biología del PDO que del fármaco específico.

Selección prospectiva del tratamiento basada en la farmacogenómica ex vivo

Se trató a dos pacientes con datos ex vivo prometedores para tratamientos estándar o bien establecidos para el CRC metastásico según su perfil de farmacogenómica. Las nominaciones de fármacos se realizaron en relación con un conjunto de datos de referencia de los PDOs analizados con la biblioteca de fármacos más grande (n = 114 PDOs de 55 pacientes analizados con lib2 de 47 fármacos). El primer paciente (Pt137) era un hombre con antecedentes de colitis ulcerosa que fue diagnosticado con cáncer de recto y CRLMs sincrónicos. Presentó enfermedad estable después del tratamiento de primera línea con FOLFIRI más el agente antiangiogénico bevacizumab y una respuesta mixta entre las lesiones metastásicas al tratamiento neoadyuvante posterior con FOLFOXIRI más bevacizumab (Figura 7A). Se intentó el cultivo de PDOs para cinco CRLMs resecados y el tumor primario, pero las dos lesiones hepáticas con respuesta al tratamiento neoadyuvante estaban necróticas y no se propagaron ex vivo (Figura S2A). El fármaco más activo fue el inhibidor dual de EGFR-ERBB2, lapatinib (mayor DSS medio), aunque con una heterogeneidad intertumoral considerable (clasificado en el percentil 2º–26º en relación con la referencia; Figura S14A). El perfil molecular confirmó la amplificación de ERBB2 y el estado de tipo salvaje RAS en todas las muestras de tejido y los PDOs analizados, pero la expresión in situ de ERBB2 fue heterogénea y se correspondió con la heterogeneidad ex vivo en la sensibilidad a lapatinib (la más baja en el tumor primario y la más alta en el CRLM T5). El paciente presentó recurrencia en el hígado después de la resección, y los CRLMs recurrentes progresaron con el tratamiento de tercera línea con FOLFIRI más el anticuerpo anti-EGFR, cetuximab. Basándose en los datos de farmacogenómica y los estudios clínicos previos,^[36],^[37] se trató al paciente con una combinación de los dos anticuerpos anti-ERBB2, trastuzumab y pertuzumab, en cuarta línea. Sin embargo, los CRLMs progresaron en la primera evaluación después de cuatro ciclos de tratamiento, probablemente debido a la heterogeneidad de la expresión de ERBB2 y/o una mutación ERBB2S310F detectada posteriormente en todos los PDOs y las muestras de tejido tumoral correspondientes, y posiblemente asociada con la resistencia a pertuzumab.^[38]

El segundo paciente (Pt160) era un hombre diagnosticado con cáncer de colon sigmoide y metástasis sincrónicas en el hígado (KRASG12A mutado). Se sometió a una cirugía simultánea del tumor primario y las metástasis después de cuatro ciclos de tratamiento neoadyuvante con FOLFOX (Figura 7B). El paciente continuó con FOLFOX después de la cirugía, hasta que se produjo una recurrencia con metástasis hepáticas y ganglionares no resecables. El tratamiento se cambió a FOLFIRI más bevacizumab (un total de 16 ciclos en 273 días), lo que resultó en una estabilización inicial de la enfermedad en el hígado, excepto una pequeña nueva metástasis ( 0,9 mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson de las lesiones tratadas frente a las no tratadas), pero las lesiones que no se propagaron ex vivo mostraron una mayor respuesta al tratamiento neoadyuvante (Figura 1E). Las sensibilidades a los fármacos ex vivo en los PDOs establecidos con éxito no reflejaron las respuestas tumorales clínicas al tratamiento neoadyuvante correspondiente, y esto también podría reflejar la selección de células propagadas en función de la respuesta al tratamiento (Figura S3). Los pacientes con al menos un PDO establecido con éxito tuvieron un tiempo medio de supervivencia general significativamente más corto después de la resección hepática (38 meses) que los pacientes sin PDOs establecidos (la mediana no se alcanzó en un seguimiento de 4 años; Figura 1F), lo que apoya la hipótesis de que el crecimiento ex vivo exitoso refleja una enfermedad agresiva y/o una peor respuesta a la quimioterapia.

Se muestra una visión general del biobanco vivo y los datos farmaco-ómicos en la Figura 2 y la Tabla S2, incluyendo perfiles de sensibilidad a los fármacos de 41 o 47 fármacos (ilustrados por 24 fármacos superpuestos entre las dos bibliotecas personalizadas), perfiles de expresión génica (ilustrados por la clasificación según los subtipos moleculares de consenso intrínsecos [iCMS]^[30]), mutaciones de 20 genes relevantes para el CRC (ilustrados por KRAS/NRAS [RAS], BRAF y TP53), inmunohistoquímica fluorescente multiplex de 12 proteínas (ilustrados por CDX2, KRT20 y KI67) y fenotipos morfológicos basados en tinciones de hematoxilina y eosina (H&E). Todos los PDOs se derivaron de tumores microsatélites estables (MSS), lo que refleja su origen en metástasis hepáticas resecables.

Los PDOs preservan las características histológicas, transcriptómicas y mutacionales de las metástasis hepáticas correspondientes

Los pares de tinciones H&E de los PDOs y las muestras de tejido tumoral correspondientes (n = 46 lesiones de 26 pacientes) indicaron que el 85% de los PDOs conservaron las morfologías tumorales para las características histopatológicas, como las estructuras acinares, quísticas y sólidas (Figuras 3A y S4; Tabla S3). Los PDOs con morfologías disímiles no se caracterizaron por tasas de crecimiento distintas ni por ningún marcador molecular específico (Tabla S4).

El perfil de expresión génica indicó altas puntuaciones de similitud de los PDOs (n = 211) para el tejido de CRC primario según el enfoque CancerCellNet (Figura S5A). En particular, los PDOs tuvieron puntuaciones de similitud más altas que sus muestras de tejido emparejadas (n = 50 pares de muestras evaluadas; p = 7 × 10−4 mediante la prueba t pareada; Figura S5B), lo que probablemente refleja la influencia del microambiente tumoral hepático específico en la comparación de las metástasis hepáticas con los tumores primarios. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de los pares de muestras de PDO-metástasis hepáticas confirmó el enriquecimiento exclusivo con señales del microambiente tumoral en las muestras de tejido en relación con los PDOs (Figura 3B). Los PDOs mostraron un enriquecimiento con firmas de metabolismo y el ciclo celular, lo que probablemente refleja una mayor actividad proliferativa y un amplio acceso a nutrientes y oxígeno en los cultivos celulares. El primer componente del análisis de componentes principales en los PDOs y las metástasis hepáticas se debió principalmente a la diferencia en las señales del microambiente tumoral (Figuras S5C-S5E) y no mostró correlación entre los pares de muestras emparejadas (Figura 3C). En contraste, el segundo componente se basó en características intrínsecas de las células cancerosas (ilustrado con una firma de expresión génica similar a la de BRAF mutado) y estuvo fuertemente correlacionado entre los PDOs y el tejido tumoral emparejado, lo que indica que los PDOs recapitularon el perfil transcriptómico de su tumor original.

Las frecuencias de mutación de los 10 genes más frecuentemente mutados (analizados en un solo PDO de cada uno de los 102 pacientes) fueron similares a dos estudios previos de CRC metastásico^[31],^[32] (p = 0,98 mediante la prueba de chi-cuadrado; Figura 3D). Los pares de muestras de PDO-metástasis hepáticas emparejadas (n = 74 lesiones de 56 pacientes) también mostraron perfiles de mutación altamente concordantes, con un estado concordante para el 93,7% de las 491 mutaciones detectadas (Figura S6A). Las discordancias se debieron principalmente a mutaciones sub-clonales con bajas fracciones de alelos mutantes (p = 0,002 mediante la prueba de Wilcoxon de la fracción alélica de las mutaciones discordantes y concordantes), que con frecuencia involucraron un segundo golpe en las mutaciones de APC o TP53 (Figuras S6B y S6C).

Asociaciones farmacológicas de los marcadores moleculares

Se confirmaron las asociaciones farmacogenómicas conocidas, incluyendo la resistencia a los inhibidores de EGFR en los PDOs mutados en RAS y BRAFV600E (Figuras 4A, S7A y S7B), la sensibilidad al inhibidor de MDM2-TP53, idasanutlin, en los PDOs con TP53 de tipo salvaje y/o alta expresión de ARNm de TP53 (Figuras S7C-S7E), así como una sensibilidad atípica a sotorasib en los dos PDOs con mutación KRASG12C (de un solo paciente; Figura S7F). En particular, la mayoría de los PDOs mutados en BRAFV600E fueron resistentes al tratamiento con un solo agente con el inhibidor específico de la mutación, encorafenib (PDOs de 4 de 5 pacientes; Figura S7G). Una combinación de encorafenib con afatinib (inhibidor de EGFR) y trametinib (inhibidor de MEK) mostró una mayor actividad (Figura S7H). Sin embargo, este efecto no fue específico de los PDOs mutados en BRAFV600E (Figura S7I), lo que sugiere que la distinción entre los efectos sinérgicos y aditivos de la combinación de fármacos requiere análisis adicionales de las matrices de dosis-respuesta completas de los pares de fármacos.

Un análisis ampliado de las sensibilidades a los fármacos (n = 51 fármacos únicos de ambas bibliotecas; Tabla S5) y las mutaciones (n = 8 genes con al menos 10 PDOs mutados o de tipo salvaje por grupo) mostró 12 asociaciones significativas, todas ellas que involucran a APC, KRAS, NRAS, BRAF o TP53 (pruebas de Wilcoxon con corrección de Benjamini-Hochberg; Figura 4A). Más allá de las asociaciones farmacogenómicas conocidas, las mutaciones de KRAS se asociaron con la sensibilidad al inhibidor multi-quinasa, regorafenib (p = 0,045). No hubo diferencias según los puntos calientes de la mutación (Figura S8A), y la asociación fue más fuerte cuando se incluyó BRAFV600E (p = 7,7 × 10−3). Los PDOs mutados en BRAFV600E mostraron baja sensibilidad al inhibidor de IGF1R, BMS-754807 (p = 0,01). Esta asociación fue específica de BRAFV600E y no se encontró para ninguno de los puntos calientes de RAS (Figura S8B). Además, los PDOs mutados en TP53 y APC fueron menos sensibles a los fármacos quimioterapéuticos estándar, fluorouracilo (5-FU) (p = 0,03) y SN-38 (metabolito activo de irinotecán; p = 0,01) que los PDOs correspondientes de tipo salvaje, respectivamente (Figura 4A). Una evaluación sistemática de las mutaciones concurrentes en pares de genes (Figura S9A) mostró que los PDOs mutados en TP53 y APC tenían una menor sensibilidad a los fármacos en general (Tabla S6) y una menor puntuación media de sensibilidad a los fármacos (DSS) en las bibliotecas de fármacos (p = 0,02). Esto también fue el caso para el subgrupo de mal pronóstico definido por las mutaciones concurrentes de RAS/BRAFV600E y TP53 (Figura 4B). La asociación positiva más fuerte con la sensibilidad a los fármacos se observó con las mutaciones concurrentes de RAS y PIK3CA, y estos PDOs mostraron una fuerte sensibilidad a la quimioterapia combinada, FLIRI (5-FU, leucovorina y SN-38; Figura 4C), aunque no a ninguno de los fármacos individuales correspondientes (Tabla S6).

Las comparaciones de los valores de DSS según la clasificación transcriptómica iCMS mostraron una mayor actividad de los inhibidores de EGFR en los PDOs iCMS2, atribuida al enriquecimiento con mutaciones RAS/BRAFV600E en el grupo iCMS3 (razón de probabilidades 32, p = 3,5 × 10−13 mediante la prueba exacta de Fisher). Sin embargo, la mayor actividad de gemcitabina (quimioterapia) y alisertib (inhibidor de la quinasa Aurora A) en los PDOs iCMS3 fue independiente del estado de mutación RAS/BRAFV600E (Figuras 4D y S8C).

Inmunohistoquímica multiplexa fluorescente de marcadores diagnósticos seleccionados, proteínas implicadas en la resistencia a los fármacos y otras proteínas de interés (n = 12) mostró que la actividad del 78% de los fármacos (n = 28 de 33 fármacos únicos) se correlacionaba significativamente con la expresión de al menos una proteína entre los PDO (n = 77–134 PDO de 37 a 67 pacientes; Figura 4E). La interacción fármaco-proteína más fuerte fue una correlación negativa entre la expresión del transportador ABC ABCB1 y la actividad del inhibidor de la vía PI3K/AKT, gedatolisib (rho de Spearman = −0,5, p = 9,3 × 10−10). En general, las proteínas conocidas por estar implicadas en la resistencia a los fármacos y la respuesta al estrés, incluyendo ABCB1, ABCG2, UGT1A y HSF1, se correlacionaron negativamente con la actividad de varios fármacos. Las correlaciones positivas más fuertes se encontraron entre la expresión de CDX2 y las quimioterapias estándar 5-FU y TAS-102 (trifluridina/tipiracil). La sensibilidad a 5-FU también se correlacionó con la expresión de RCC2, una proteína que se ha sugerido que está asociada con el beneficio de la quimioterapia adyuvante en el CRC locorregional.^[33] La alta expresión de CDX2 o RCC2 (>percentil 70) representó la mayoría de los PDO sensibles a 5-FU (DSS >14,3; razón de probabilidades 2,7, p = 0,01; Figura S8D). Además, la expresión de TP53 se correlacionó negativamente con la sensibilidad al inhibidor de PARP, olaparib. Se encontró una alta expresión de TP53 exclusivamente en los PDO con mutaciones TP53 con cambio de sentido (Figura S7E), lo que coincide con nuestro estudio previo que sugiere que la actividad de TP53 de tipo salvaje es necesaria para la sensibilidad a los inhibidores de PARP en las células de CRC.^[34] Además, la expresión de RIPK1 se correlacionó positivamente con la actividad del mimético de SMAC, LCL161, que se dirige a las proteínas inhibidoras de la apoptosis.^[28]

Asociaciones clinicopatológicas y farmacológicas

Los pacientes con tumores primarios en el lado derecho tienen un beneficio limitado del tratamiento anti-EGFR,^[35] y el biobanco vivo confirmó la sensibilidad a los inhibidores de EGFR solo en los PDO de tipo salvaje RAS/BRAF derivados de pacientes con tumores primarios en el lado izquierdo o rectal (p = 0,02 mediante la prueba de Wilcoxon; Figura S9B). En contraste, la localización del tumor primario en el lado derecho se asoció con una mayor sensibilidad a las quimioterapias estándar SN-38 y TAS-102, independientemente del estado de mutación RAS/BRAF (Figura S9B; Tabla S7). El sexo del paciente no se asoció con la sensibilidad a ningún fármaco, incluido 5-FU (p = 0,7 mediante la prueba de Wilcoxon), mientras que la edad avanzada del paciente se correlacionó débilmente con la sensibilidad a 5-FU (rho de Spearman = 0,28, p = 0,02; Tabla S8). El diagnóstico de múltiples CRLM en la imagen radiológica antes de la cirugía hepática se asoció con una baja sensibilidad a los fármacos en general, aunque se encontró una correlación estadísticamente significativa solo para SN-38 e idasanutlin (Tabla S9). El análisis de riesgos proporcionales de Cox indicó que las altas sensibilidades a los fármacos ex vivo se asociaron con una mejor supervivencia general entre los pacientes (DSS media en 24 fármacos como predictor; razón de riesgos, 0,91; intervalo de confianza del 95%, 0,82–1,0; p = 0,07), y la asociación pronóstica fue significativa para cuatro fármacos (atorvastatina, bemcentinib y dos inhibidores de EGFR; Tabla S10). La sensibilidad al agente hipocolesterolémico atorvastatina y al inhibidor de AXL, bemcentinib, mantuvo asociaciones pronósticas significativas en modelos multivariables con variables clinicopatológicas y estado de mutación RAS/BRAF (razón de riesgos multivariables, 0,81 y 0,79; intervalos de confianza del 95%, 0,71–0,93 y 0,64–0,96, respectivamente; Figura S10).

Los PDO de CRLM representan dos fenotipos morfológicos principales

Los PDO se clasificaron en dos fenotipos morfológicos principales basándose en las tinciones de H&E de muestras incluidas en parafina (n = 213; Figuras 5A y S4; Tabla S11). Se identificó un fenotipo quístico en el 28% de los PDO y se caracterizó por células cuboidales y columnares organizadas que forman estructuras quísticas/glandulares con un lumen central bien definido. Se encontró un fenotipo sólido en el 38% de los PDO, y estos carecían de lumen central y presentaban patrones de crecimiento predominantemente sólidos, incluyendo vacuolas citoplasmáticas o células individualmente disgregadas. Los PDO restantes (34%) presentaban características de ambos fenotipos, quístico y sólido, y se clasificaron como mixtos (menos del 50% de las estructuras individuales mostraban características claras de cualquiera de los fenotipos).

La inmunohistoquímica fluorescente multiplexa mostró una expresión diferencial de los marcadores diagnósticos de CRC, KRT20 y CDX2, según los fenotipos morfológicos (Figuras 5B, S11A y S11B). CDX2 tuvo la mayor expresión en los PDO quísticos y KRT20 en los PDO sólidos, y el fenotipo mixto mostró niveles de expresión intermedios de ambas proteínas. El fenotipo sólido también se enriqueció con mutaciones RAS y BRAFV600E (Figura 5C), y el 92% de los PDO BRAFV600E tenían un fenotipo sólido (Figura S11C). En consecuencia, el enriquecimiento con una firma de expresión similar a la de BRAF mutante en los PDO sólidos también fue la distinción más fuerte entre los subtipos a nivel transcriptómico (Figuras 5E y S11E). Los PDO sólidos también fueron más similares a la inestabilidad de microsatélites y se enriquecieron con firmas de apoptosis e inflamación, incluyendo la señalización de TNF-α y la respuesta de IFN-α, así como la clase iCMS3 (Figura 5D). En contraste, los PDO quísticos fueron similares a MSS y se enriquecieron con firmas de células madre cancerosas e iCMS2. Los PDO quísticos también fueron generalmente más sensibles a los fármacos, estimado como una mayor sensibilidad media en los 24 fármacos evaluados en ambas bibliotecas (Figura 5F; Tabla S12). Esto incluyó una mayor sensibilidad a los tratamientos estándar para el CRC, como 5-FU e inhibidores de EGFR (Figura 5F), lo que refleja una mayor expresión de CDX2 y mutaciones menos frecuentes de RAS/BRAFV600E (Figura S11D).

Modelado de la heterogeneidad metastásica con PDO de múltiples lesiones

Se analizó la heterogeneidad tumoral morfológica y farmacológica entre los PDO de distintas lesiones metastásicas de cada uno de los 66 pacientes (n = 175 PDO; Figura 6A). La mayoría de los pacientes tenían PDO del mismo fenotipo morfológico (n = 40, 61%). Sin embargo, el grupo mixto representa un fenotipo inherentemente heterogéneo, y además del 18% de los pacientes (n = 12) con PDO exclusivamente mixtos, otro 23% (n = 15) presentaba heterogeneidad intermetastásica con una combinación de mixtos y ya sea quísticos o sólidos. Además, se observó heterogeneidad de los fenotipos quísticos y sólidos en el 12% de los pacientes (n = 8), y se observó un cambio de fenotipo morfológico después de la recurrencia en uno de los seis pacientes evaluables (Figura 6A).

La heterogeneidad de la sensibilidad a los fármacos fue menos prominente en las comparaciones intra-paciente que en las inter-paciente, evaluada como menores puntuaciones de heterogeneidad farmacológica entre pares de muestras del mismo paciente y estimada basándose en las distancias euclidianas de los valores de DSS (n = 24 fármacos superpuestos; Figura 6B; p < 0,0001 mediante ANOVA de una vía). Esto fue respaldado por el análisis de agrupamiento jerárquico, que mostró la agrupación de los PDO del mismo paciente (Figura S12). No hubo diferencia en el nivel de heterogeneidad espacial entre las lesiones de la misma resección y la heterogeneidad longitudinal entre las lesiones recurrentes muestreadas en las re-resecciones (Figura 6B). La puntuación de heterogeneidad farmacológica intra-paciente no se asoció con ninguna variable clinicopatológica o supervivencia del paciente (Tabla S13).

Los PDO sólidos tenían valores de DSS medios más bajos que los quísticos en todos los pacientes con heterogeneidad morfológica, excepto en uno (p = 0,027, prueba de Wilcoxon pareada; Figura 6C), lo que indica que la heterogeneidad morfológica promovió la heterogeneidad farmacológica. Esto fue respaldado por puntuaciones de heterogeneidad farmacológica más altas entre los PDO en pacientes con heterogeneidad morfológica (p = 0,017 mediante la prueba de Welch, Figura 6D). Sin embargo, la puntuación de heterogeneidad farmacológica más alta se encontró en un paciente con tres PDO quísticos y un estado de mutación APCR213X heterogéneo (Figuras 6E y S13A). El PDO mutado fue menos sensible a varios fármacos de quimioterapia (5-FU, metotrexato y gemcitabina) y más sensible al mimético de SMAC, LCL161 (Figura S13B). Cabe destacar que los tres PDO fueron altamente sensibles al inhibidor de EGFR, afatinib (dentro del percentil 3º–11º entre todos los PDO) y moderadamente sensibles a la quimioterapia combinada con FLIRI (percentil 25º–55º), y esto correspondió con respuestas clínicas similares a la quimioterapia neoadyuvante con FOLFIRI más un anticuerpo anti-EGFR en las tres lesiones (respuesta parcial con una reducción del 35–41% del tamaño del tumor; Figura S13A).

No hubo diferencias claras en el nivel de heterogeneidad farmacológica intra-paciente entre los fármacos o las clases de fármacos, estimado como la máxima diferencia de DSS para cada fármaco entre cualquier par de PDO por paciente (Figura S13C; la baja heterogeneidad de encorafenib e idasanutlin probablemente se debió a la baja actividad del fármaco en general). Las estimaciones de heterogeneidad más altas (>percentil 95) se distribuyeron uniformemente entre los fármacos (mediana de 3 puntuaciones altas por fármaco, intervalo de confianza del 95%, 2–5), lo que apoya que la heterogeneidad farmacológica depende más de la biología del PDO que del fármaco específico.

Selección prospectiva del tratamiento basada en la farmacogenómica ex vivo

Dos pacientes con datos ex vivo prometedores para tratamientos estándar o bien establecidos para el CRC metastásico fueron tratados de acuerdo con su perfil de farmacogenómica. Se realizaron nominaciones de fármacos en relación con un conjunto de referencia de los PDO examinados con la biblioteca de fármacos más grande (n = 114 PDO de 55 pacientes examinados con lib2 de 47 fármacos). El primer paciente (Pt137) era un hombre con antecedentes conocidos de colitis ulcerosa que fue diagnosticado con cáncer de recto y CRLM sincrónicos. Presentó enfermedad estable después del tratamiento de primera línea con FOLFIRI más el agente antiangiogénico bevacizumab y una respuesta mixta entre las lesiones metastásicas al tratamiento neoadyuvante posterior con FOLFOXIRI más bevacizumab (Figura 7A). Se intentó el cultivo de PDO para cinco CRLM resecados y el tumor primario, pero las dos lesiones hepáticas con respuesta al tratamiento neoadyuvante estaban necróticas y no se propagaron ex vivo (Figura S2A). El inhibidor dual de EGFR-ERBB2, lapatinib, fue el fármaco más activo en los cuatro PDO establecidos (mayor DSS medio), aunque con una heterogeneidad intertumoral considerable (clasificado en el percentil 2º–26º en relación con la referencia; Figura S14A). El perfil molecular confirmó la amplificación de ERBB2 y el estado RAS de tipo salvaje en todas las muestras de tejido y los PDO analizados, pero la expresión in situ de ERBB2 fue heterogénea y correspondió con la heterogeneidad ex vivo en la sensibilidad a lapatinib (la más baja en el tumor primario y la más alta en el CRLM T5). El paciente tuvo recurrencia en el hígado después de la resección, y los CRLM recurrentes progresaron con el tratamiento de tercera línea con FOLFIRI más el anticuerpo anti-EGFR, cetuximab. Basándose en los datos de farmacogenómica y estudios clínicos previos,^[36],^[37] el paciente fue tratado con una combinación de los dos anticuerpos anti-ERBB2, trastuzumab y pertuzumab, en la cuarta línea. Sin embargo, los CRLM progresaron en la primera evaluación después de cuatro ciclos de tratamiento, probablemente debido a la heterogeneidad de la expresión de ERBB2 y/o una mutación ERBB2S310F detectada posteriormente en todos los PDO y las muestras de tejido tumoral correspondientes, y posiblemente asociada con la resistencia a pertuzumab.^[38]

El segundo paciente (Pt160) era un hombre diagnosticado con cáncer de colon sigmoide y metástasis hepáticas y ganglionares sincrónicas (KRASG12A mutado). Se sometió a una cirugía simultánea del tumor primario y las metástasis después de cuatro ciclos de tratamiento neoadyuvante con FOLFOX (Figura 7B). El paciente continuó con FOLFOX después de la cirugía, hasta que se produjo una recurrencia con metástasis hepáticas y ganglionares no resecables. El tratamiento se cambió a FOLFIRI más bevacizumab (un total de 16 ciclos en 273 días), lo que resultó en una estabilización inicial de la enfermedad en el hígado, excepto una pequeña nueva metástasis (