Las metástasis hepáticas disminuyen la actividad de las células γδ T y la respuesta a la inmunoterapia mediada por IL18 en el cáncer colorrectal.

El hígado es una barrera inmunológica de primera línea con un microambiente inmunitario altamente especializado para prevenir la inflamación excesiva contra antígenos derivados de alimentos y del microbioma intestinal que no son patógenos.^[1],^[2],^[3] Se ha demostrado que los mecanismos de tolerancia hepática, como la disminución de la activación de las células T, influyen en las enfermedades autoinmunes, las infecciones virales y el trasplante de órganos.^[4],^[5],^[6] Sin embargo, los mecanismos inmunorreguladores hepáticos que controlan el equilibrio entre la tolerancia homeostática y el control inmunológico se comprenden poco.^[7],^[8] Es importante destacar que el hígado también es uno de los sitios más frecuentes de metástasis cancerosas, siendo el cáncer colorrectal (CCR) uno de los cánceres primarios más comunes que se disemina al hígado.^[9],^[10]

El bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICB) dirigido contra la proteína de muerte programada-1 (PD-1) y el ligando de la proteína de muerte programada-1 (PD-L1) ha surgido como una terapia eficaz para pacientes con una variedad de tipos de tumores. Sin embargo, la evidencia acumulada sugiere que la presencia de metástasis hepáticas (MH) puede afectar negativamente las respuestas inmunoterapéuticas en el melanoma, el cáncer de pulmón y el cáncer de riñón.^[11] Los estudios mecanísticos que utilizaron modelos de ratón mostraron que las MH modulan la inmunidad antitumoral adaptativa sistémica a través de la eliminación de las células T αβ^[11] o la generación de células T reguladoras,^[12], creando un "desierto inmunitario" sistémico que afecta a todas las lesiones tumorales en todo el cuerpo. Sin embargo, dado que el ICB es muy eficaz en el CCR deficiente en la reparación de errores de emparejamiento (MMR-d) al involucrar tanto la inmunidad innata como la adaptativa, aún no está claro si las MH tienen una influencia similar en los resultados del tratamiento en este contexto.^[13],^[14],^[15],^[16],^[17],^[18],^[19]

Recientemente, las células T gamma delta residentes en los tejidos (células T γδ) han surgido como efectores inesperados de la inmunoterapia, actuando como un sistema de respaldo celular en entornos donde hay una disminución de la vigilancia inmunitaria de las células T αβ, como los tumores MMR-d con defectos del antígeno leucocitario humano (HLA) y los melanomas con baja carga de neoantígenos.^[13],^[20] Los diferentes subconjuntos de células T γδ se definen por su cadena δ del receptor de células T (TCR), de las cuales las que expresan Vδ1 y Vδ3 son principalmente "residentes en los tejidos" y las que expresan Vδ2 se encuentran principalmente en la sangre.^[21] En el contexto del cáncer, específicamente, los subconjuntos de células T Vδ1+ y Vδ3+ pueden infiltrarse en los tumores, tener efectos citotóxicos y pueden ser reactivadas directamente por la inmunoterapia anti-PD1.^[13],^[15],^[20],^[22],^[23],^[24] Sin embargo, las señales inflamatorias que regulan su activación y funcionalidad en los tejidos, como la estimulación del TCR γδ o los receptores innatos o de citoquinas, se comprenden de forma incompleta. Dado que el hígado alberga una gran cantidad de linfocitos innatos residentes en los tejidos, y la disminución informada de la inmunidad de las células T αβ en el hígado, nos propusimos dilucidar la contribución de las células T γδ a la inmunidad antitumoral en el microambiente tumoral hepático (MTT) y las señales inflamatorias que rigen su actividad.

Utilizamos una cohorte de pacientes con cánceres metastásicos MMR-d tratados con ICB (n = 167 pacientes). Este es un tipo de tumor con una respuesta inmunitaria muy activa impulsada por subconjuntos de linfocitos innatos, como las células T γδ y las células asesinas naturales (NK).^[14],^[15],^[25] En resumen, mostramos que los pacientes con MH MMR-d presentan peores resultados con la inmunoterapia y descubrimos un papel fundamental de la inmunidad inducida por IL18/IL18BP de las células T γδ residentes. En comparación, encontramos que los CCR con reparación de errores de emparejamiento competente (MMR-p) (n = 388), que no responden al ICB y tienen un alto grado de tropismo hepático, presentan una menor actividad intratumoral de IL18.

Resultados

Las metástasis hepáticas se asocian con peores resultados con la inmunoterapia en pacientes con cánceres MMR-d avanzados

Para confirmar el impacto de las MH MMR-d en las respuestas al ICB, evaluamos las respuestas al bloqueo de PD-(L)1 (nivolumab/durvalumab) en una cohorte de 167 pacientes con cánceres metastásicos MMR-d, independientemente del tipo de tumor. Todos los pacientes fueron tratados prospectivamente como parte del Protocolo de Redescubrimiento de Fármacos (DRUP),^[26], un ensayo clínico multicéntrico en el que los pacientes con cáncer metastásico reciben tratamiento en función de los perfiles moleculares de sus tumores. Posteriormente, los pacientes se dividieron en dos grupos: con o sin MH al inicio del ICB (Figura 1A). La presencia de MH se asoció con una peor supervivencia libre de progresión (SLP) (razón de riesgo [RR], 1,638; intervalo de confianza (IC), 1,099–2,440; p = 0,015) en comparación con los pacientes metastásicos sin MH (Figuras 1B y 1C). Este resultado se ajusta a los patrones de respuesta al ICB observados en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y el melanoma, donde la presencia de MH también se asoció con la falta de respuesta a la inmunoterapia.^[11] En un análisis multivariado, encontramos que el efecto de la MH se asoció con la SLP independientemente de la carga tumoral, las líneas de tratamiento previas, el tipo de tumor primario y el fármaco utilizado (Figura S1A; RR ajustada, 1,62; IC, 1,06–2,47; p = 0,026; consulte la Tabla 1 para obtener más características clínicas). El número medio de líneas de terapia sistémica previas no diferenció entre los subgrupos. Es importante destacar que, una vez confirmada la progresión según los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST), la gran mayoría de los pacientes con MH mostraron progresión de todas las lesiones, en lugar de una progresión aislada de las lesiones tumorales hepáticas (Figura 1D).

Para confirmar estas observaciones en una cohorte independiente de cánceres MMR-d, y para destacar que el efecto es generalizable independientemente del tipo de tumor primario o las líneas de tratamiento previas, evaluamos retrospectivamente una cohorte "del mundo real" de 154 pacientes con CCR metastásicos MMR-d del Registro del Cáncer de los Países Bajos, que fueron tratados con inmunoterapia como tratamiento estándar de primera línea, fuera del contexto del estudio. En este conjunto de datos del mundo real, también encontramos que los pacientes con MH al inicio mostraron menos beneficio clínico del ICB (tasa de beneficio clínico [TBC] [MH/sin MH], 70,4%/90,7%; razón de probabilidades [OR], 0,26; p = 0,0026), con un 29,6% (MH) y un 9,3% (sin MH) que presentaban enfermedad progresiva como mejor respuesta al tratamiento (Figura 1C, derecha). Para la cohorte exploratoria principal, se observó una tendencia similar con tasas de beneficio clínico reducidas, aunque esto no alcanzó una significación estadística (TBC [MH/sin MH], 60%/69,6%; OR, 0,66; p = 0,22). Además, el análisis de una pequeña cohorte de pacientes con CCR metastásico MMR-p (n = 28) tratados con inmunoterapia en el ensayo DRUP^[26] reveló tasas de respuesta significativamente más bajas, con una TBC del 13,6% y ninguna respuesta objetiva confirmada entre los pacientes evaluables. Es importante destacar que los cánceres MMR-p tenían una tasa mucho mayor de MH (78%) en comparación con la población MMR-d (cohorte DRUP, 32,5%; cohorte de CCR de primera línea, 38,7%). Debido al pequeño tamaño de la muestra, con solo 4 pacientes evaluables sin MH, no fue posible realizar análisis de subgrupos para diferencias en la eficacia del ICB. En conjunto, esto sugiere que los cánceres MMR-p pueden provocar una disminución de la inmunidad anti-metastásica hepática en comparación con los cánceres MMR-d, lo que destaca la importancia de comprender las diferencias inmunológicas entre los dos subtipos.

Dado que las aberraciones genómicas pueden influir en la capacidad metastásica y el tropismo, así como en las respuestas a la inmunoterapia, hipotetizamos que las características intrínsecas de las células tumorales pueden diferir entre los grupos de pacientes con MH y sin MH de MMR-d. Por lo tanto, primero evaluamos los marcadores intrínsecos de las células tumorales de la inmunogenicidad mediante el secuenciamiento del genoma completo (WGS) entre los pacientes con y sin MH al inicio de la terapia. Es importante destacar que no hubo diferencias en los biomarcadores genómicos convencionales de respuesta, como la carga mutacional tumoral, la carga de mutaciones tumorales y el número de indels de microsatélites (Figuras 1E–1G). De manera similar, no identificamos diferencias en la expresión de PD-L1 (basada en el secuenciamiento de ARN) o la presencia de mutaciones inactivadoras en la β2-microglobulina (B2M) entre los dos subgrupos (Figuras 1H e 1I). Por lo tanto, la diferencia observada en la respuesta a la inmunoterapia es probablemente independiente de la antigenicidad intrínseca de las células tumorales.

La expresión de TCR Vδ1 disminuye en el microambiente tumoral hepático

Dado que no pudimos identificar diferencias genómicas entre los pacientes con MH y sin MH de MMR-d como una posible explicación de la diferencia en la respuesta al tratamiento, a continuación, investigamos la composición celular del MTT de estos subgrupos de pacientes. Con este fin, utilizamos datos de expresión de ARN a granel de biopsias tumorales generadas a partir de biopsias tumorales de pacientes en nuestra cohorte de inmunoterapia MMR-d, para estimar las diferencias en la infiltración de células inmunitarias entre los cánceres MMR-d con MH y sin MH. Para el grupo de MH, se tomaron biopsias de pacientes que presentaban MH al inicio del estudio. La mayoría de las biopsias se tomaron de la lesión hepática, lo que nos permitió estimar la infiltración inmunitaria local en el MTT hepático (Figura S2A). Como grupo de comparación, se utilizaron biopsias tumorales de sitios metastásicos alternativos de pacientes sin MH al inicio ("sin MH"). Recientemente, se demostró que los macrófagos hepáticos eliminan las células T convencionales en pacientes tratados con ICB.^[11] Por lo tanto, primero evaluamos la infiltración de células T de los cánceres con MH y sin MH en nuestra cohorte de pacientes. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la presencia de células T CD4 y CD8 (Figura 2A) entre los pacientes con y sin MH. De manera similar, no se identificaron diferencias en el número absoluto de linfocitos en la sangre periférica entre los dos subgrupos (Figura S2B). Dado que hemos demostrado recientemente que la inmunidad mediada por las células T γδ es fundamental para las respuestas al ICB en los tumores MMR-d,^[13],^[14], evaluamos la expresión de los marcadores de las células T γδ en los cánceres con MH y sin MH. Es importante destacar que identificamos una disminución de las células T γδ Vδ1+ (reflejada por una menor expresión del gen TRDV1) en los pacientes con MH en comparación con los pacientes sin MH (Figura 2A). Este gen es un sustituto ampliamente aceptado para las células Vδ1+.^[13],^[22],^[23],^[27] Es importante destacar que los genes TRDV2 y TRDV3, que codifican los subunidades del TCR Vδ2 y Vδ3, no mostraron diferencias entre los dos subgrupos. Para comparar el MTT de los cánceres metastásicos MMR-d y MMR-p, analizamos pacientes con CCR metastásico MMR-p (n = 388) y MMR-d (n = 46) en la base de datos de la Fundación Médica Hartwig^[28] y observamos una menor expresión de TRDV1 en la población MMR-p no responsiva (Figura 2B). Con la hipótesis de que las células T γδ pueden desempeñar un papel en la inmunidad anti-MH, buscamos caracterizar y comprender aún más su función en el MTT hepático.

Dado que las células T γδ Vδ1+ son residentes en los tejidos, pueden estar adaptadas a su órgano de origen, lo que podría afectar a su funcionalidad en diferentes sitios tumorales. Por lo tanto, analizamos los fenotipos transcripcionales de las células T γδ Vδ1+ en diferentes órganos utilizando una base de datos pública, el atlas de células inmunitarias de los tejidos.^[29] Es importante destacar que observamos dos grupos distintos en función del origen del órgano; las células derivadas del colon y el intestino delgado se agruparon estrechamente, mientras que las células del pulmón, el hígado y la sangre se agruparon por separado (Figura 2C). Esto sugiere una fuerte divergencia de los transcriptomas de las células T γδ Vδ1+, con una expresión diferencial de los moduladores citotóxicos y los puntos de control inmunitarios (Figura S2C). Es importante destacar que las células T γδ Vδ1+ del hígado expresaron altos niveles de IFNγ en la línea de base en comparación con sus contrapartes intestinales (Figura 2C, centro y derecha). Por lo tanto, estos resultados muestran que las células T γδ son transcripcionalmente heterogéneas en diferentes órganos, lo que sugiere que los mecanismos de activación también pueden diferir según su origen en el órgano. En resumen, observamos una disminución de las células T γδ Vδ1+ en los pacientes con MH, independientemente del estado de B2M (Figura 1I). Dada la alta expresión de IFNγ de estas células en la línea de base, esto sugiere una posible importancia funcional de las células T γδ hepáticas como mediadoras de la inmunidad antimetastásica.

IL18 se asocia con la respuesta a la inmunoterapia solo en pacientes con MH

Dado la reducción observada de las células T Vδ1+ en los metástasis hepáticos (MH), nos propusimos investigar más a fondo las señales inflamatorias que regulan su actividad. Por lo tanto, medimos la expresión de un panel de citocinas inflamatorias en el plasma de pacientes con tumores gastrointestinales MMR-d. Al comparar los niveles de citocinas plasmáticas entre pacientes con y sin MH, la única citocina significativamente diferente y aumentada fue IL18, que es un regulador importante de las actividades de las células Th1 y NK (Figura 3A, izquierda, y S3A). Para confirmar estas observaciones, a continuación, medimos los niveles de IL18 en una cohorte de pacientes con cáncer en general con tumores MMR-d y observamos, de manera similar, niveles elevados de IL18 en el grupo de MH (Figura 3A, derecha). Además, al evaluar la expresión intratumoral de un panel de citocinas inflamatorias (ver Tabla S1 para la lista de genes), IL18 fue la citocina más asociada con la respuesta en la población de MH (Figura 3B). Curiosamente, la expresión de IL18 solo se asoció con la respuesta a la inmunoterapia en pacientes con MH, pero no en el subgrupo sin MH (Figura 3C), lo que sugiere un efecto hepático específico de IL18. A continuación, estratificamos los subgrupos de MH y sin MH en función de la expresión de IL18 y evaluamos su supervivencia libre de progresión (SLP). Sorprendentemente, los MH con baja expresión de IL18 tuvieron una SLP significativamente menor en comparación con los MH con alta expresión de IL18 (Figura 3D; HR, 4,1; IC, 1,28–13,1; p = 0,0174), mientras que los pacientes con MH con alta expresión de IL18 tuvieron una SLP comparable a la de los pacientes sin MH. Además, los MH con alta expresión de IL18 mostraron un enriquecimiento de las firmas de respuesta del interferón en comparación con los MH con baja expresión de IL18 (Figura 3E). En comparación, la expresión intratumoral de IL18 fue significativamente menor en la población de CRC MMR-p no responsiva a la inmunoterapia de bloqueo de puntos de control inmunitarios (ICB) en comparación con los cánceres MMR-d (Figura 3F). Por lo tanto, la presencia de MH se asocia con cambios en la inmunidad sistémica y los perfiles de citocinas inflamatorias. Además, la asociación de la expresión de IL18 con la respuesta a la inmunoterapia, exclusivamente en pacientes con MH, sugiere que la inmunidad efectiva contra los MH es particularmente sensible a las reducciones en los niveles intratumorales de IL18.

Si bien las células tumorales son capaces de expresar IL18 de forma endógena (Figura S3B), no encontramos correlación entre la carga tumoral (como indicador de la cantidad de células tumorales) y los niveles séricos de IL18 (R = -0,007971, p = 0,9750) o la expresión de IL18 (R = -0,158; p = 0,185) (Figuras S3C y S3D), lo que sugiere una fuente extrínseca a las células cancerosas. Por lo tanto, evaluamos la expresión de IL18 y NLRP3 en el atlas de células hepáticas,^[30] una gran base de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de poblaciones de células hepáticas humanas sanas (Figuras 3G–3I). NLRP3 forma parte del complejo proteico del inflamasoma que regula los niveles de IL18 y convierte la pro-IL18 en su forma madura.^[31] En particular, observamos coexpresión de IL18 y NLRP3 en las células mieloides hepáticas, siendo la población más grande los macrófagos hepáticos y las células derivadas de monocitos (Figura 3I). En nuestro conjunto de datos transcriptómicos de pacientes con MH MMR-d, evaluamos qué firmas de células inmunitarias se asociaron con la expresión intratumoral de IL18. Aquí, observamos un patrón similar, en el que las poblaciones de células mieloides, como los neutrófilos, las células dendríticas y los macrófagos, se encontraban entre los conjuntos de genes que mostraban la asociación más fuerte con IL18 (Figura 3J). En conjunto, esto sugiere que en un hígado con tumor, las células mieloides hepáticas podrían servir como una fuente importante de IL18.

IL18 potencia la inmunidad antitumoral de las células γδ T Vδ1+ derivadas del hígado y depende de IL12

Dado la heterogeneidad observada de las células γδ T en los diferentes órganos, así como la asociación específica de los MH con la respuesta a la inmunoterapia, queríamos determinar si existía una sensibilidad específica del órgano de las células γδ T a IL18. Con este fin, aislamos las células inmunitarias residentes en los tejidos (CIR) del colon y el hígado humanos normales y estimulamos el conjunto de CIR con citocinas ex vivo durante 24 horas (Figura 4A). Para garantizar que las células γδ T conservaran sus fenotipos tisulares nativos, las células no se expandieron después del aislamiento, sino que se estimularon directamente. Tras la estimulación con IL12 e IL18, tanto las células Vδ1+ del hígado como las del intestino produjeron IFNγ. Sin embargo, la reactividad de las células Vδ1+ del hígado fue mucho más pronunciada en comparación con las células Vδ1+ del intestino, con un 51,66 % frente a un 12,39 % de células Vδ1 T que produjeron IFNγ, respectivamente (Figuras 4B y 4C). Además, tras la incubación únicamente con IL18, solo las células Vδ1+ del hígado mostraron una reactividad aumentada, pero las células Vδ1+ del intestino no. Al observar dentro de las CIR del hígado, las células T αβ residentes en el hígado no mostraron producción de IFNγ inducida por IL18 (Figura 4D). Para evaluar aún más la especificidad del hígado, estimulamos células Vδ1+ frescas del torrente sanguíneo periférico con citocinas y, de manera similar al intestino, observamos una producción limitada de IFNγ (Figura S4A). La diferencia de sensibilidad entre el origen del órgano no pudo explicarse por una expresión alterada de IL18R1, ya que esta se expresó de manera similar en las células Vδ1+ de los diferentes órganos (Figuras S4B–S4D). Considerando que el efecto de IL18 depende de la señalización cooperativa con citocinas como IL15 e IL12, evaluamos la expresión de estas citocinas, que se expresaron de manera similar entre los subgrupos de pacientes (Figura S4E). Por lo tanto, el conjunto de células Vδ1+ residentes en el hígado muestra una mayor sensibilidad a IL18 en comparación con otras células del intestino y circulantes. Estos resultados indican que los programas inflamatorios que impulsan la actividad de las células Vδ1+ periféricas pueden diferir entre los órganos y los sitios metastásicos, debido a la adaptación de estas células dentro de su órgano de origen.

Para estudiar más a fondo los efectos de IL18 en las células γδ T y cómo esto puede afectar posteriormente a la inmunidad antitumoral, utilizamos un sistema in vitro utilizando células γδ Vδ1+ expandidas derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Figura 4E). Si bien no se encontró que las células Vδ1+ frescas derivadas de la sangre fueran sensibles a las estimulaciones con citocinas, después de una expansión a largo plazo, sí observamos sensibilidad, medida por la producción de IFNγ (Figuras 4F y S4E). A diferencia de su contraparte residente en los tejidos, esto dependió de la adición de IL12, lo que condujo a la regulación al alza del receptor de IL18 (Figura 4G). A continuación, comparamos la reactividad de las células Vδ1+ tras la estimulación con citocinas en cocultivo con células tumorales y observamos una reducción significativa en la reactividad en presencia de estimulación con citocinas (Figuras 4F y S5A). Además, cocultivamos células γδ Vδ1+ con dos organoides tumorales derivados de pacientes (OTDP) de cánceres MMR-d y evaluamos la viabilidad después de 24 horas. Al agregar IL18 recombinante, observamos solo un aumento modesto y no significativo en la muerte de las células tumorales en este momento (Figura S5B). Además, dado que las células tumorales pueden producir IL18 de forma endógena, realizamos un cocultivo de OTDP y células γδ Vδ1+ en presencia de IL12 y agregamos un anticuerpo bloqueador de IL18. La adición de un anticuerpo bloqueador de IL18 no alteró la reactividad de las células T (Figura S5C). Estos resultados sugieren que, aunque las células tumorales son capaces de producir IL18, es posible que no sea funcionalmente activo. En conjunto, estos datos sugieren que las células cancerosas pueden restringir la actividad de las células γδ T, lo que nos lleva a examinar más a fondo la base mecanicista de este proceso inmunosupresor.

Las células cancerosas limitan la inmunidad antitumoral mediada por las células γδ T secretando IL18BP

Para determinar las posibles proteínas derivadas de las células tumorales que modulan las respuestas de IL18, analizamos la fracción de proteínas secretadas de cuatro OTDP MMR-d tras la estimulación con IFNγ utilizando espectrometría de masas. En particular, como una de las proteínas más reguladas al alza, encontramos que los OTDP aumentan significativamente la secreción de IL18BP en respuesta a IFNγ (Figura 4H). Curiosamente, IL18BP es una proteína señuelo que intercepta IL18 y evita la señalización en las células que expresan el receptor de IL18.^[32],^[33],^[34] La expresión de IL18BP se confirmó mediante citometría de flujo para un panel de tres OTDP MMR-d, donde se detectó en las tres líneas (Figura 4I). El aumento de la secreción de IL18BP tras la estimulación con IFNγ en los organoides tumorales se confirmó mediante ELISA y no se observó en una línea de organoides de colon sanos (Figura S5D).

A continuación, para confirmar que la IL18BP derivada de las células cancerosas puede modular la reactividad de las células inmunitarias, utilizamos un ensayo de cocultivo in vitro con células γδ Vδ1+ derivadas de PBMC y con tres OTDP y evaluamos la reactividad de las células γδ Vδ1+ mediante citometría de flujo basada en la producción de IFNγ. Cuando IL18BP se bloqueó con un anticuerpo, las células γδ Vδ1+ fueron significativamente más reactivas en comparación con el control isotípico en las tres líneas de OTDP (Figura 4J). A continuación, evaluamos si el bloqueo de IL18BP podría potenciar la muerte de las células cancerosas. Con este fin, cocultivamos células γδ Vδ1+ con tres OTDP MMR-d/MSI-hi en presencia de un reportero fluorescente de caspasa-3/7 escindida para medir la apoptosis de las células cancerosas a lo largo del tiempo. En MSI-1 y MSI-3, la apoptosis de las células cancerosas fue significativamente mayor cuando se agregó el anti-IL18BP en comparación con el control isotípico (Figuras 4K–4M). Para evaluar si las estrategias de bloqueo de IL18BP también podrían ser relevantes para los tumores MMR-p/MSS, realizamos un ensayo de muerte con una línea de CRC MMR-p y observamos una mayor muerte tras el bloqueo de IL18BP (Figura 4N). A continuación, para evaluar la asociación de IL18BP con la respuesta a la inmunoterapia, calculamos una relación entre la expresión de IL18 y IL18BP para cada paciente. En particular, en los pacientes con MH, los pacientes que respondieron a la inmunoterapia tenían una relación IL18/IL18BP significativamente mayor en comparación con los pacientes que no respondieron (Figura 4O). Para los pacientes sin MH, las relaciones IL18/IL18BP no se asociaron con la respuesta (Figura 4O) y ni la relación transcriptómica ni los niveles de proteínas plasmáticas fueron significativamente diferentes del grupo de MH (Figuras 4P y S5E). En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de IL18 contribuye a la activación específica de las células γδ Vδ1+ en el hígado, lo que puede suprimirse localmente por las células cancerosas a través de la producción de IL18BP. Además, nuestros hallazgos destacan que las terapias centradas en IL18 pueden ser beneficiosas para potenciar la funcionalidad de las células γδ T en el tumor.

Los metástasis hepáticos se asocian con un peor resultado en la inmunoterapia en pacientes con cánceres MMR-d avanzados

Para confirmar el impacto de los MH MMR-d en las respuestas a la ICB, evaluamos las respuestas al bloqueo de PD-(L)1 (nivolumab/durvalumab) en una cohorte de 167 pacientes con cánceres MMR-d metastásicos, independientemente del tipo de tumor. Todos los pacientes fueron tratados prospectivamente como parte del Protocolo de Redescubrimiento de Fármacos (DRUP),^[26], un ensayo clínico multicéntrico en el que los pacientes con cáncer metastásico reciben tratamiento en función de los perfiles moleculares de sus tumores. Posteriormente, los pacientes se dividieron en dos grupos: con o sin MH al inicio de la ICB (Figura 1A). La presencia de MH se asoció con una peor supervivencia libre de progresión (SLP) (razón de riesgo [HR], 1,638; intervalo de confianza (IC), 1,099–2,440; p = 0,015) en comparación con los pacientes metastásicos sin MH (Figuras 1B y 1C). Este resultado se ajusta a los patrones de respuesta a la ICB observados en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y el melanoma, donde la presencia de MH también se asoció con la falta de respuesta a la inmunoterapia.^[11] En un análisis multivariado, encontramos que el efecto de los MH se asoció con la SLP independientemente de la carga tumoral, las líneas de tratamiento previas, el tipo de tumor primario y el fármaco utilizado (Figura S1A; HR ajustada, 1,62; IC, 1,06–2,47; p = 0,026; consulte la Tabla 1 para obtener más características clínicas). El número medio de líneas de terapia sistémica previas no diferenció entre los subgrupos. Es importante destacar que, una vez confirmada la progresión según los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST), la gran mayoría de los pacientes con MH mostraron progresión de todas las lesiones, en lugar de una progresión aislada de las lesiones hepáticas (Figura 1D).

Para confirmar estas observaciones en una cohorte independiente de cánceres MMR-d, y para destacar que el efecto es generalizable independientemente del tipo de tumor primario o de las líneas de tratamiento previas, evaluamos retrospectivamente una cohorte “del mundo real” de 154 pacientes con CRC metastásico MMR-d del Registro del Cáncer de los Países Bajos, que fueron tratados con inmunoterapia como tratamiento estándar de primera línea, fuera del contexto de un estudio. En este conjunto de datos del mundo real, también encontramos que los pacientes con LM en la línea de base mostraron menos beneficio clínico de la ICB (tasa de beneficio clínico [CBR] [LM/no LM], 70,4%/90,7%; razón de probabilidades [OR], 0,26; p = 0,0026), con un 29,6% (LM) y un 9,3% (no LM) que presentaban enfermedad progresiva como la mejor respuesta a la terapia (Figura 1C, derecha). Para la cohorte exploratoria principal, se observó una tendencia similar con tasas de beneficio clínico reducidas, aunque esto no alcanzó significación estadística (CBR [LM/no LM], 60%/69,6%; OR, 0,66; p = 0,22). Además, el análisis de una pequeña cohorte de pacientes con CRC metastásico MMR-p (mCRC, n = 28) tratados con inmunoterapia en el ensayo DRUP^[26] reveló tasas de respuesta significativamente más bajas, con una CBR del 13,6% y ninguna respuesta objetiva confirmada entre los pacientes evaluables. Cabe destacar que los cánceres MMR-p presentaban una tasa mucho mayor de LM (78%) en comparación con la población MMR-d (cohorte DRUP, 32,5%; cohorte de CRC de primera línea, 38,7%). Debido al pequeño tamaño de la muestra, con solo 4 pacientes evaluables sin LM, no fue posible realizar análisis de subgrupos para evaluar las diferencias en la eficacia de la ICB. En conjunto, esto sugiere que los cánceres MMR-p pueden provocar una inmunidad anti-metastásica hepática disminuida en comparación con los cánceres MMR-d, lo que destaca la importancia de comprender las diferencias inmunológicas entre los dos subtipos.

Dado que las aberraciones genómicas pueden influir en la capacidad metastásica y el tropismo, así como en las respuestas a la inmunoterapia, hipotetizamos que las características intrínsecas de las células tumorales pueden diferir entre los grupos LM y no LM de pacientes MMR-d. Por lo tanto, primero evaluamos los marcadores intrínsecos de las células tumorales de inmunogenicidad mediante secuenciación del genoma completo (WGS) entre pacientes con y sin LM al inicio de la terapia. Cabe destacar que no hubo diferencias en los biomarcadores genómicos convencionales de respuesta, como la carga mutacional tumoral, la carga de mutaciones tumorales y el número de indels de microsatélites (Figuras 1E–1G). De manera similar, no identificamos diferencias en la expresión de PD-L1 (basada en la secuenciación de ARN) o en la presencia de mutaciones inactivadoras en la β2-microglobulina (B2M) entre los dos subgrupos (Figuras 1H e 1I). Por lo tanto, la diferencia observada en la respuesta a la inmunoterapia es probablemente independiente de la antigenicidad intrínseca de las células tumorales.

La expresión de Vδ1 TCR disminuye en el microambiente tumoral hepático

Dado que no pudimos identificar diferencias genómicas entre los pacientes MMR-d con LM y sin LM como una posible explicación de la diferencia en la respuesta al tratamiento, a continuación, investigamos la composición celular del microambiente tumoral (TME) de estos subgrupos de pacientes. Con este fin, utilizamos datos de expresión de ARN masiva de biopsias tumorales generadas a partir de pacientes de nuestra cohorte de inmunoterapia MMR-d, para estimar las diferencias en la infiltración de células inmunitarias entre los cánceres MMR-d con LM y sin LM. Para el grupo LM, se tomaron biopsias de pacientes que presentaban LM al inicio del estudio. La mayoría de las biopsias se tomaron de la lesión hepática, lo que nos permitió estimar la infiltración inmune local en el TME hepático (Figura S2A). Como grupo de comparación, se utilizaron biopsias tumorales de sitios metastásicos alternativos de pacientes sin LM en la línea de base (“no LM”). Recientemente, se demostró que los macrófagos hepáticos eliminan las células T convencionales en pacientes tratados con ICB.^[11] Por lo tanto, primero evaluamos la infiltración de células T de los cánceres con LM y sin LM en nuestra cohorte de pacientes. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la presencia de células T CD4 y CD8 (Figura 2A) entre los pacientes con y sin LM. De manera similar, no se identificaron diferencias en el recuento absoluto de linfocitos en la sangre periférica entre los dos subgrupos (Figura S2B). Dado que recientemente hemos demostrado que la inmunidad innata mediada por las células T γδ es fundamental para las respuestas a la ICB en los tumores MMR-d,^[13],^[14], evaluamos la expresión de los marcadores de las células T γδ en los cánceres con LM y sin LM. Cabe destacar que identificamos una disminución de las células T γδ Vδ1+ (reflejada por una menor expresión del gen TRDV1) en los pacientes con LM en comparación con los pacientes sin LM (Figura 2A). Este gen es un sustituto ampliamente aceptado para las células Vδ1+.^[13],^[22],^[23],^[27]. Cabe destacar que los genes TRDV2 y TRDV3, que codifican las subunidades TCR Vδ2 y Vδ3, no mostraron diferencias entre los dos subgrupos. Para comparar el TME de los cánceres metastásicos MMR-d y MMR-p, analizamos a los pacientes con MMR-p (n = 388) y MMR-d (n = 46) mCRC en la base de datos de la Fundación Hartwig Medical^[28] y observamos una menor expresión de TRDV1 en la población MMR-p no responsiva (Figura 2B). Hipotetizando que las células T γδ pueden desempeñar un papel en la inmunidad anti-LM, buscamos caracterizar y comprender aún más su función en el TME hepático.

Dado que las células T γδ Vδ1+ son residentes tisulares, pueden estar adaptadas a su órgano de origen, lo que podría afectar su funcionalidad en diferentes sitios tumorales. Por lo tanto, analizamos los fenotipos transcripcionales de las células T Vδ1+ en diferentes órganos utilizando una base de datos de acceso público, el atlas de células inmunitarias tisulares.^[29]. Cabe destacar que observamos dos grupos distintos basados en el origen del órgano; las células derivadas del colon y el intestino delgado se agruparon estrechamente, mientras que las células del pulmón, el hígado y la sangre se agruparon por separado (Figura 2C). Esto sugiere una fuerte divergencia de los transcriptomas de las células T Vδ1+, con una expresión diferencial de moduladores citotóxicos y puntos de control inmunitarios (Figura S2C). Cabe destacar que las células T Vδ1+ del hígado expresaron altos niveles de IFNγ en la línea de base en comparación con sus contrapartes intestinales (Figura 2C, centro y derecha). Por lo tanto, estos resultados muestran que las células T γδ son transcripcionalmente heterogéneas en diferentes órganos, lo que sugiere que los mecanismos de activación también pueden diferir según su origen. En resumen, observamos una disminución de las células T γδ Vδ1+ en pacientes con LM que es independiente del estado de B2M (Figura 1I). Dado el alto nivel de expresión de IFNγ de estas células en la línea de base, esto sugiere una posible importancia funcional de las células γδ hepáticas como mediadoras de la inmunidad anti-metastásica.

IL18 se asocia con la respuesta a la inmunoterapia solo en pacientes con LM

Dada la reducción observada de las células T γδ Vδ1+ en los LM, nos propusimos investigar más a fondo las señales inflamatorias que rigen su actividad. Por lo tanto, medimos la expresión de un panel de citocinas inflamatorias en el plasma de pacientes con tumores gastrointestinales MMR-d. Al comparar los niveles de citocinas plasmáticas entre pacientes con y sin LM, la única citocina significativamente diferente y aumentada fue IL18, que es un regulador importante de las actividades de las células Th1 y NK (Figura 3A, izquierda, y S3A). Para confirmar estas observaciones, a continuación, medimos los niveles de IL18 en una cohorte de cánceres MMR-d y observamos niveles elevados de IL18 en el grupo LM (Figura 3A, derecha). Además, al evaluar la expresión intratumoral de un panel de citocinas inflamatorias (consulte la Tabla S1 para obtener la lista de genes), IL18 fue la citocina más asociada con la respuesta en la población LM (Figura 3B). Es interesante destacar que la expresión de IL18 solo se asoció con la respuesta a la inmunoterapia en pacientes con LM, pero no en el subgrupo sin LM (Figura 3C), lo que sugiere un efecto hepático específico de IL18. A continuación, estratificamos los subgrupos LM y no LM en función de la expresión de IL18 y evaluamos su SLP. Sorprendentemente, los LM con niveles bajos de IL18 tuvieron una SLP significativamente menor en comparación con los LM con niveles altos de IL18 (Figura 3D; HR, 4,1; IC, 1,28–13,1; p = 0,0174), mientras que los pacientes con LM con niveles altos de IL18 tuvieron una SLP comparable a los pacientes sin LM. Además, los LM con niveles altos de IL18 mostraron un enriquecimiento de las firmas de respuesta a los interferones en comparación con los LM con niveles bajos de IL18 (Figura 3E). En comparación, la expresión intratumoral de IL18 fue significativamente menor en la población de CRC MMR-p no responsiva a la ICB en comparación con los cánceres MMR-d (Figura 3F). Por lo tanto, la presencia de LM se asocia con cambios en la inmunidad sistémica y los perfiles de citocinas inflamatorias. Además, la asociación de la expresión de IL18 con la respuesta a la inmunoterapia, exclusivamente en pacientes con LM, sugiere que la inmunidad efectiva contra los LM es particularmente sensible a las reducciones en los niveles intratumorales de IL18.

Si bien las células tumorales son capaces de expresar IL18 de forma endógena (Figura S3B), no encontramos correlación entre la carga tumoral (como un indicador de la cantidad de células tumorales) y los niveles séricos de IL18 (R = -0,007971, p = 0,9750) o la expresión de IL18 (R = -0,158; p = 0,185) (Figuras S3C y S3D), lo que sugiere una fuente extracelular del cáncer. Por lo tanto, evaluamos la expresión de IL18 y NLRP3 en el atlas de células hepáticas,^[30] una gran base de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de poblaciones de células hepáticas humanas sanas (Figuras 3G–3I). NLRP3 es parte del complejo de proteínas del inflamasoma que regula los niveles de IL18 y convierte la pro-IL18 en su forma madura.^[31]. Cabe destacar que observamos la coexpresión de IL18 y NLRP3 en las células mieloides hepáticas, siendo la población más grande los macrófagos hepáticos y las células derivadas de los monocitos (Figura 3I). En nuestro conjunto de datos transcriptómicos de pacientes MMR-d con LM, evaluamos qué firmas de células inmunitarias se asociaron con la expresión intratumoral de IL18. Aquí, observamos un patrón similar, en el que las poblaciones de células mieloides, como los neutrófilos, las células dendríticas y los macrófagos, se encontraban entre los conjuntos de genes que mostraban la asociación más fuerte con IL18 (Figura 3J). En conjunto, esto sugiere que en un hígado con tumor, las células mieloides hepáticas podrían servir como una fuente importante de IL18.

IL18 potencia la inmunidad antitumoral de las células T γδ Vδ1+ derivadas del hígado y depende de IL12

Dada la heterogeneidad observada de las células T γδ en diferentes órganos, así como la asociación específica de LM de IL18 con la respuesta a la inmunoterapia, queríamos determinar si existía una sensibilidad específica del órgano de las células T γδ a IL18. Con este fin, aislamos las células inmunitarias residentes tisulares (TRIC) del colon y el hígado humanos normales y estimulamos el grupo de TRIC con citocinas ex vivo durante 24 horas (Figura 4A). Para garantizar que las células T γδ conservaran sus fenotipos tisulares nativos, las células no se expandieron después del aislamiento, sino que se estimularon directamente. Tras la estimulación con IL12 e IL18, tanto las células T Vδ1+ del hígado como las del intestino produjeron IFNγ. Sin embargo, la reactividad de las células T Vδ1+ del hígado fue mucho más pronunciada en comparación con las células T Vδ1+ del intestino, con un 51,66% frente a un 12,39% de células T Vδ1+ que produjeron IFNγ, respectivamente (Figuras 4B y 4C). Además, tras la incubación solo con IL18, solo las células T Vδ1+ del hígado mostraron una reactividad aumentada, pero las células T Vδ1+ del intestino no. Al observar el TRIC hepático, las células T αβ residentes del hígado no mostraron producción de IFNγ inducida por IL18 (Figura 4D). Para evaluar aún más la especificidad del hígado, estimulamos células T Vδ1+ frescas de la sangre periférica con citocinas y, de manera similar al intestino, observamos una producción limitada de IFNγ (Figura S4A). La diferencia de sensibilidad entre el origen del órgano no pudo explicarse por una expresión alterada de IL18R1, ya que esta se expresó de manera similar en las células T Vδ1+ en diferentes órganos (Figuras S4B–S4D). Dado que el efecto de IL18 depende de la señalización cooperativa con citocinas como IL15 e IL12, evaluamos la expresión de estas citocinas, que se expresaron de manera similar entre los subgrupos de pacientes (Figura S4E). Por lo tanto, el grupo de células T Vδ1+ residentes del hígado muestra una mayor sensibilidad a IL18 en comparación con otras células del intestino y circulantes. Estos resultados indican que los programas inflamatorios que impulsan la actividad de las células T Vδ1+ periféricas pueden diferir entre los órganos y los sitios metastásicos, debido a la adaptación de estas células dentro de su órgano de origen.

Para estudiar más a fondo los efectos de IL18 en las células γδ T y cómo esto puede afectar posteriormente a la inmunidad antitumoral, empleamos un sistema in vitro utilizando células γδ T Vδ1+ expandidas derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Figura 4E). Si bien no se encontró que las células Vδ1+ derivadas de sangre fresca fueran sensibles a las estimulaciones con citocinas, después de una expansión a largo plazo, sí observamos sensibilidad, medida por la producción de IFNγ (Figuras 4F y S4E). A diferencia de su contraparte residente en los tejidos, esto dependió de la adición de IL12, lo que condujo a la regulación al alza del receptor de IL18 (Figura 4G). A continuación, comparamos la reactividad de las células Vδ1+ T tras la estimulación con citocinas en un cocultivo con células tumorales y observamos una reducción significativa en la reactividad en presencia de la estimulación con citocinas (Figuras 4F y S5A). Además, realizamos un cocultivo de células γδ T Vδ1+ con dos organoides tumorales derivados de pacientes (PDTO) de cánceres MMR-d y evaluamos la viabilidad después de 24 horas. Al añadir IL18 recombinante, observamos solo un modesto aumento, no significativo, en la muerte de las células tumorales en este punto temporal (Figura S5B). Además, dado que las células tumorales pueden producir IL18 de forma endógena, realizamos un cocultivo de PDTO y células γδ T Vδ1+ en presencia de IL12 y añadimos un anticuerpo bloqueador de IL18. La adición de un anticuerpo bloqueador de IL18 no alteró la reactividad de las células T (Figura S5C). Estos resultados sugieren que, aunque las células tumorales son capaces de producir IL18, es posible que no sea funcionalmente activo. En conjunto, estos datos sugieren que las células cancerosas pueden restringir la actividad de las células γδ T, lo que nos llevó a examinar más a fondo la base mecanicista subyacente de este proceso inmunosupresor.

Las células cancerosas limitan la inmunidad antitumoral mediada por las células γδ T mediante la secreción de IL18BP

Para determinar las posibles proteínas derivadas de las células tumorales que modulan las respuestas de IL18, analizamos la fracción de proteínas secretadas de cuatro PDTO MMR-d tras la estimulación con IFNγ utilizando espectrometría de masas. Destacadamente, como una de las proteínas más reguladas al alza, encontramos que los PDTO aumentan significativamente la secreción de IL18BP en respuesta a IFNγ (Figura 4H). Curiosamente, IL18BP es una proteína señuelo que intercepta IL18 y previene la señalización en las células que expresan el receptor de IL18.^[32],^[33],^[34] La expresión de IL18BP se confirmó mediante citometría de flujo para un panel de tres PDTO MMR-d, donde se detectó en las tres líneas (Figura 4I). El aumento de la secreción de IL18BP tras la estimulación con IFNγ en los organoides tumorales se confirmó mediante ELISA y no se observó en una línea de organoides de colon sanos (Figura S5D).

A continuación, para confirmar que el IL18BP derivado de las células cancerosas puede modular la reactividad de las células inmunitarias, empleamos un ensayo de cocultivo in vitro con células γδ T Vδ1+ derivadas de PBMC y con tres PDTO y evaluamos la reactividad de las células γδ T Vδ1+ mediante citometría de flujo basada en la producción de IFNγ. Cuando IL18BP se bloqueó con un anticuerpo, las células γδ T Vδ1+ fueron significativamente más reactivas en comparación con el control isotípico en las tres líneas de PDTO (Figura 4J). A continuación, evaluamos si el bloqueo de IL18BP podría potenciar la muerte de las células cancerosas. Con este fin, realizamos un cocultivo de células γδ T Vδ1+ con tres PDTO MMR-d/MSI-hi en presencia de un reportero fluorescente de caspasa-3/7 escindida para medir la apoptosis de las células cancerosas a lo largo del tiempo. En MSI-1 y MSI-3, la apoptosis de las células cancerosas fue significativamente mayor cuando se añadió anti-IL18BP en comparación con el control isotípico (Figuras 4K–4M). Para evaluar si las estrategias de bloqueo de IL18BP también podrían ser relevantes para los tumores MMR-p/MSS, realizamos un ensayo de muerte con una línea de CRC MMR-p y observamos un aumento de la muerte tras el bloqueo de IL18BP (Figura 4N). A continuación, para evaluar la asociación de IL18BP con la respuesta a la inmunoterapia, calculamos una relación entre la expresión de IL18 y IL18BP para cada paciente. Destacadamente, en los pacientes con LM, los pacientes que respondieron a la inmunoterapia tenían una relación IL18/IL18BP significativamente mayor en comparación con los pacientes que no respondieron (Figura 4O). Para los pacientes sin LM, las relaciones IL18/IL18BP no se asociaron con la respuesta (Figura 4O) y ni la relación transcriptómica ni los niveles de proteína plasmática fueron significativamente diferentes del grupo LM (Figuras 4P y S5E). En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de IL18 contribuye a la activación específica de las células γδ T Vδ1+ en el hígado, lo que puede ser suprimido localmente por las células cancerosas a través de la producción de IL18BP. Además, nuestros hallazgos destacan que las terapias centradas en IL18 pueden ser beneficiosas para aumentar la funcionalidad de las células γδ T en el tumor.

Discusión

El hígado ha evolucionado como un centro inmunogénico central del cuerpo.^[1],^[2] Aquí, mostramos que la presencia de LM en pacientes metastásicos MMR-d atenúa la respuesta a la inmunoterapia en todo el cuerpo, afectando también a los sitios tumorales extrahepáticos. Es importante destacar que nuestro estudio identifica un eje inmunológico que involucra a IL18/IL18BP/células T Vδ1+, capaz de cambiar el entorno inmunitario hepático local de supresión a control, lo que está significativamente asociado con las respuestas terapéuticas a la ICB.

Estudios previos informaron que los LM del melanoma y el NSCLC pueden aprovechar los mecanismos de tolerancia hepática, específicamente la eliminación mediada por macrófagos de las células T αβ^[11], para atenuar las respuestas sistémicas de la ICB. En contraste, dentro de la población MMR-d, no observamos una depleción de las células T αβ intratumorales ni en la sangre periférica. Previamente demostramos que estos tumores exhiben dinámicas inmunitarias distintas en respuesta a la ICB, caracterizadas por un papel prominente de la inmunidad innata.^[13],^[14] Esta divergencia inmunológica puede explicarse por la pérdida de la expresión de HLA de clase I que se produce en hasta el 70% de los cánceres MMR-d,^[35],^[36],^[37],^[38], lo que conduce a la evasión de la inmunidad adaptativa.^[39],^[40],^[41] Las diferentes presiones inmunológicas a las que se someten estos tumores pueden, a su vez, impulsar la aparición de diferentes mecanismos de retroalimentación negativa. Aquí, identificamos un mecanismo que regula la actividad de las células γδ T residentes en el hígado.

Las células γδ T son un tipo de célula diverso, que consiste en subconjuntos que exhiben funciones variables que, en el contexto del cáncer, van desde efectos promotores del tumor hasta efectos antitumorales.^[20],^[22],^[24],^[42] Encontramos evidencia de heterogeneidad funcional entre las células γδ T en diferentes órganos y demostramos que, en el hígado, pueden exhibir un papel específicamente antitumoral, productor de IFNγ. Mostramos (1) transcriptomas divergentes de las células Vδ1+ T en diferentes órganos, con las células Vδ1+ hepáticas particularmente altas en la expresión de IFNγ, y (2) desiguales respuestas de IL18 ex vivo, lo que se refleja en los datos de respuesta a la ICB de los pacientes. Anteriormente, se investigó el compartimento de células γδ T hepáticas adultas humanas y se encontró que estaba enriquecido con un subconjunto efector residente en los tejidos, que mostraba una mayor producción de citocinas y sensibilidad a los estímulos innatos en comparación con las células derivadas de la sangre.^[43] Nuestros resultados se alinean con estas observaciones previas, ya que observamos que las células γδ T del hígado producen niveles más altos de IFNγ en respuesta a la estimulación con citocinas en comparación con las derivadas de la sangre fresca y el intestino. Curiosamente, cuando las células γδ T derivadas de la sangre se sometieron a una expansión, la sensibilidad a los estímulos innatos como IL12 e IL18 aumentó, lo que cambió el perfil funcional de estas células, de manera similar a lo que se observa en el hígado. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que los contextos específicos de los órganos pueden dictar el estado funcional de las células γδ T e impactar en la función efectora antitumoral. Estos programas específicos de los órganos pueden ser el resultado de señales locales al llegar a los tejidos, o pueden estar ya grabados epigenéticamente durante el desarrollo de los tejidos, como es el caso de los macrófagos residentes en los tejidos de larga duración, por ejemplo.^[44],^[45],^[46] Actualmente, no está claro si la heterogeneidad de los órganos en el conjunto de células γδ T Vδ1+ se debe a la impronta de los órganos, la ontogenia o una combinación de ambos.^[47] Por lo tanto, es necesario comprender mejor las diferencias específicas de los órganos y los perfiles moleculares de las poblaciones efectoras residentes de la ICB, para adaptar racionalmente las posibles estrategias terapéuticas para inducir respuestas inmunitarias antimetastásicas específicas del sitio.

Más específicamente, identificamos IL18 y su proteína señuelo IL18BP como reguladores clave de la actividad inmunológica en el microambiente tumoral metastásico del hígado. Utilizando ensayos ex vivo con TRIC, mostramos que IL18 tiene diferentes efectos inmunológicos según el sitio de acción anatómico y encontramos que las células γδ T hepáticas son particularmente sensibles a esta citocina. Si bien múltiples tipos de células en el microambiente tumoral del hígado expresan su receptor y, por lo tanto, pueden verse afectadas por IL18, nuestros resultados señalan a las células γδ T Vδ1+ como una población objetivo clave. Los ensayos ex vivo mostraron la sensibilidad de las células γδ T Vδ1+, pero no de las células T αβ, a la estimulación con IL18. De manera similar, en los tumores de los pacientes, observamos una reducción en la expresión de las firmas Vδ1+, pero no de las células T αβ. La expresión intratumoral de IL18 se asoció fuertemente con la respuesta a la inmunoterapia en pacientes con LM, lo que sugiere que, específicamente en el hígado, la actividad inmunitaria impulsada por IL18 es necesaria para la reinvigoration inmunitaria mediada por la ICB. Sin embargo, para demostrar formalmente la participación de IL18 en las respuestas de la ICB, se requerirían modelos de pérdida de función, lo cual lamentablemente no es posible, ya que no se ha identificado un subconjunto equivalente a las células T Vδ1+ o Vδ3+ en los ratones. Además, la fuente exacta de IL18, su regulación y su distribución espacial son preguntas importantes que aún deben abordarse. La secreción de IL18BP tras la liberación de IFNγ puede atenuar la posterior actividad inmunológica. Si bien los niveles de IL18BP probablemente son más bajos en el microambiente pretratamiento, el bloqueo de IL18BP ofrece la oportunidad de aumentar la biodisponibilidad de IL18 local. Utilizando cocultivos de células inmunitarias y PDTO,^[48],^[49],^[50] mostramos que el bloqueo de IL18BP mejoró la reactividad de las células γδ T y la muerte de PDTO. Si bien este informe se centró en el papel de IL18/IL18BP en el microambiente tumoral pretratamiento, sería interesante comprender cómo cambia la expresión de IL18BP tras el tratamiento con ICB y cómo da forma a la posterior dinámica de reinvigoration inmunitaria. Además, si la secreción de esta proteína señuelo en el sitio del tumor primario está involucrada en la modulación de la inmunidad local y si desempeña un papel en la formación de un nicho premetastásico inmunosuprimido en el hígado, actualmente no está claro.

Nuestros resultados sugieren que los pacientes con LM MMR-d pueden beneficiarse de terapias que potencien las células γδ T. Las terapias de células γδ T ofrecen la ventaja de actuar independientemente del reconocimiento de antígenos tumorales específicos y, por lo tanto, aún pueden eliminar los tumores que escaparon a la vigilancia de las células T. La estimulación con citocinas de las células γδ T con IL12 e IL18 indujo una potente respuesta inmunitaria antitumoral independiente del TCR. Por lo tanto, la modulación del eje IL18 puede ser una estrategia terapéutica atractiva en combinación con la ICB o las terapias adoptivas de células γδ T. Anteriormente, se descubrió que el desarrollo clínico de IL18 recombinante como monoterapia era seguro y bien tolerado, pero se abandonó debido a la falta de eficacia.^[51] Actualmente, se están desarrollando varias formas de inmunoterapias centradas en IL18, como anticuerpos bloqueadores para IL18BP, citocinas "diseñadoras" altamente potentes o terapias de células secretoras de citocinas.^[32],^[52],^[53] Nuestros resultados muestran que tales estrategias podrían ayudar adicionalmente a aumentar la funcionalidad de las células γδ T, aunque el sitio de acción puede afectar la actividad biológica.

Para la población de CRC MMR-p que no responde a la inmunoterapia, encontramos una menor expresión intratumoral basal de IL18. Si IL18 es un actor central en la inmunidad hepática, sería interesante ver si las estrategias de agonismo de IL18 en combinación con la inmunoterapia podrían inducir la inmunidad tumoral para estos tumores notoriamente "fríos". De manera similar, la observación de que los tumores MMR-p exhiben una mayor tropismo hepático en comparación con los tumores MMR-d, aunque provienen de ubicaciones anatómicas similares, sugiere que los tumores MMR-p evitan desencadenar respuestas inmunitarias antimetastásicas al entrar en el hígado. Es tentador especular que el equilibrio entre IL18/IL18BP podría determinar el reconocimiento inmunitario innato y actuar como una barrera específica del tejido para el crecimiento de las células tumorales diseminadas. Por lo tanto, es de interés evaluar el potencial de los agonistas de IL18 resistentes a las proteínas señuelo para prevenir el desarrollo de LM metacrónicos.

En conclusión, nuestros resultados sugieren que el eje IL18/IL18BP representa una barrera importante para las respuestas a la inmunoterapia con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICB) en pacientes con cánceres MMR-d que han metastatizado al hígado. A nivel mecanístico, las células γδ T residentes en el hígado actúan como importantes centinelas tisulares, respondiendo a la IL18 mediante la secreción de IFNγ. Las células cancerosas pueden protegerse mediante la secreción posterior de IL18BP, que actúa como un mecanismo de retroalimentación negativa para atenuar la inmunidad antitumoral inducida por IL18. Desde un punto de vista conceptual, nuestros resultados demuestran que las poblaciones efectoras inmunitarias residentes pueden diferir intrínsecamente según el órgano de origen, lo que a su vez modula la inmunidad antitumoral dentro del sitio metastásico. Por lo tanto, el cáncer metastásico es una enfermedad sistémica que requiere estrategias terapéuticas que vayan más allá del sitio de la enfermedad primaria para combatir eficazmente las metástasis.

Limitaciones del estudio

Para reforzar aún más la asociación entre las metástasis hepáticas (LM) y la respuesta a la ICB en cánceres MMR-d, son de interés otros grupos de validación con métricas de eficacia consistentes y validación del estado MMR-d mediante secuenciación del genoma completo (WGS). Una limitación de nuestro estudio es la dependencia de los datos de expresión de ARN para la infiltración de células inmunitarias, específicamente porque el TCR Vδ1+ se expresa en bajas cantidades. Si bien esta es la práctica estándar para la infiltración de células T Vδ1+, ya que no existen anticuerpos específicos para subconjuntos en tejido fijado con formalina y embebido en parafina (FFPE), son de interés otras formas de estimar la infiltración de Vδ1+. Además, para la comparación entre pacientes con LM y sin LM, se utilizaron biopsias de localizaciones metastásicas alternativas, lo que puede introducir sesgos debido a las diferencias específicas del órgano en el paisaje inmunitario. Además, los ensayos ex vivo que utilizan células γδ T derivadas del hígado no se validaron con células T Vδ1+ intratumorales, sino que se obtuvieron de muestras de hígado normal, ya que el material de resección de LM MMR-d no está disponible fácilmente en la clínica. Para IL18BP, el impacto funcional solo se probó en células T Vδ1+ derivadas de PBMC en cocultivo con PDTO, pero no en células derivadas del hígado. La mayoría de los PDTO se derivaron de material de resección primaria. Además, es de interés una mayor comprensión de la regulación de la expresión de IL18 en el microambiente tumoral (TME), incluido el origen celular y la distribución espacial.

Limitaciones del estudio

Para reforzar aún más la asociación entre las metástasis hepáticas (LM) y la respuesta a la ICB en cánceres MMR-d, son de interés otros grupos de validación con métricas de eficacia consistentes y validación del estado MMR-d mediante secuenciación del genoma completo (WGS). Una limitación de nuestro estudio es la dependencia de los datos de expresión de ARN para la infiltración de células inmunitarias, específicamente porque el TCR Vδ1+ se expresa en bajas cantidades. Si bien esta es la práctica estándar para la infiltración de células T Vδ1+, ya que no existen anticuerpos específicos para subconjuntos en tejido fijado con formalina y embebido en parafina (FFPE), son de interés otras formas de estimar la infiltración de Vδ1+. Además, para la comparación entre pacientes con LM y sin LM, se utilizaron biopsias de localizaciones metastásicas alternativas, lo que puede introducir sesgos debido a las diferencias específicas del órgano en el paisaje inmunitario. Además, los ensayos ex vivo que utilizan células γδ T derivadas del hígado no se validaron con células T Vδ1+ intratumorales, sino que se obtuvieron de muestras de hígado normal, ya que el material de resección de LM MMR-d no está disponible fácilmente en la clínica. Para IL18BP, el impacto funcional solo se probó en células T Vδ1+ derivadas de PBMC en cocultivo con PDTO, pero no en células derivadas del hígado. La mayoría de los PDTO se derivaron de material de resección primaria. Además, es de interés una mayor comprensión de la regulación de la expresión de IL18 en el microambiente tumoral (TME), incluido el origen celular y la distribución espacial.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos, diríjase a Emile Voest (e.voest@nki.nl).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de WGS, metadatos clínicos y datos de transcriptómica de pacientes desidentificados de la Hartwig Medical Foundation están disponibles de forma gratuita para uso académico a través de procedimientos estandarizados. Los formularios de solicitud se pueden encontrar en https://www.hartwigmedicalfoundation.nl/en/data/data-acces-request/. Los datos están disponibles públicamente a partir de la fecha de publicación.

•Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio asociado PRIDE^[54] con el identificador del conjunto de datos PRIDE: PXD071538.

•Este artículo no presenta código original. La bioinformática para los datos de WGS y transcriptómica se realizó con herramientas de código abierto. Los DOI se enumeran en la tabla de recursos clave.

•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este trabajo está disponible a través del contacto principal a pedido.

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•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este trabajo está disponible a través del contacto principal a pedido.

Agradecimientos

Agradecemos a los pacientes que participaron en el ensayo DRUP, así como a sus familias y cuidadores. Nos gustaría agradecer a todos los miembros del grupo de Voest por sus interesantes debates, a la Unidad de Citometría de Flujo del NKI-AVL por su apoyo en citometría de flujo, a la Unidad Central del NKI-AVL de Patología Molecular y Biobanco por proporcionar material del Biobanco del NKI-AVL y apoyo de laboratorio, y a Judith Westra y Jeannette Schoep por su apoyo clínico y la obtención de muestras de pacientes. Agradecemos a Paula van Royen y Vivien Veninga por su ayuda con los experimentos de células γδ T. Agradecemos a Bob Ignacio y Kim Bonger por su apoyo en la configuración de THRONCAT y el suministro de beta-etynylserina, a Jelmer Dijkstra y Michiel Vermeulen por su apoyo en el diseño y el análisis de los experimentos de espectrometría de masas, y a Liesbeth Hoekman y Onno Blijerveld del centro de proteómica del Instituto Oncológico de los Países Bajos por su apoyo técnico. Agradecemos al Registro Nacional de Cáncer de los Países Bajos (NCR), Organización Integral de Cáncer de los Países Bajos (IKNL), por la aprobación de la solicitud de datos para el grupo de validación. K.K.D. recibió el apoyo de una beca Veni de NOW/ZonMW bajo el número de proyecto 09150162210100. El trabajo actual está financiado por el Instituto Oncode, Países Bajos (beneficiario E.E.V.).

Contribuciones de los autores

A.W.J.v.R., conceptualización, análisis formal, investigación, visualización, metodología, redacción del borrador original y revisión y edición de la redacción; M.P.-M., curación de datos, análisis formal, investigación, visualización, metodología y edición; M.W., curación de datos, análisis formal e investigación; K.V., curación de datos y análisis formal; M.S., investigación; L.J.Z., curación de datos; K.K.D., conceptualización y supervisión. L.A., conceptualización, supervisión y edición del borrador original. E.E.V., conceptualización, supervisión, obtención de financiación y redacción del borrador original.

Declaración de intereses

E.E.V. es fundador y miembro actual de la junta de supervisión de la Hartwig Medical Foundation, director no ejecutivo independiente de Sanofi, cofundador de Mosaic Therapeutics y miembro de la junta y fundador del Centro de Tratamiento Personalizado del Cáncer. Ha recibido subvenciones para estudios clínicos de Amgen, AstraZeneca, BI, BMS, Clovis, Eli Lilly, GSK, Ipsen, MSD, Novartis, Pfizer y Roche. K.K.D. prestó servicios de consultoría a Achilles Therapeutics UK Ltd.

Declaración sobre el uso de IA generativa y tecnologías de IA asistida en el proceso de redacción

Durante la preparación de este trabajo, los autores utilizaron ChatGPT5.0 para editar y revisar el texto, así como para editar sus propias ilustraciones para el resumen gráfico. Después de utilizar esta herramienta, los autores revisaron y editaron el contenido según fuera necesario y asumen toda la responsabilidad del contenido de la publicación.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Dentro de la cohorte de la Hartwig Medical Foundation, se incluyeron pacientes con cáncer avanzado sin otras opciones de tratamiento como parte de los estudios clínicos CPCT-02 (NCT01855477) y DRUP (NCT02925234), que fueron aprobados por los comités de ética médica (METC) de la Universidad Médica de Utrecht y el Instituto Oncológico de los Países Bajos, respectivamente. Se obtuvo el consentimiento informado para la secuenciación del genoma completo (WGS) y el intercambio de datos con fines de investigación. Los análisis clínicos se realizaron utilizando datos del estudio DRUP, que fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Oncológico de los Países Bajos en Ámsterdam y se lleva a cabo de acuerdo con las directrices de Buenas Prácticas Clínicas y los principios éticos de la Declaración de Helsinki para la investigación médica. Todos los pacientes tenían más de 18 años y un estado funcional de 0-2; otras características basales, incluido el género y la edad, se proporcionan en las tablas 1 y S3. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos. DRUP está registrado en ClinicalTrials.gov, número NCT02925234.

Para los ensayos ex vivo de tejido, se recogieron muestras de tumor y tejido no maligno de individuos con cáncer colorrectal sometidos a tratamiento quirúrgico en el Instituto Oncológico de los Países Bajos-Antoni van Leeuwenhoekziekenhuis (NKI-AVL). El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del NKI-AVL (IRBdm24-078) y se llevó a cabo en cumplimiento de todas las normas éticas pertinentes. Todos los pacientes consintieron en el uso de material para investigación que no sea necesario para fines de diagnóstico, ya sea mediante un procedimiento de exclusión voluntaria o mediante un consentimiento informado previo (después del 23 de mayo de 2018). Los organoides derivados de pacientes se generaron previamente; se proporciona una descripción general de los organoides en la tabla S2. El muestreo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del NKI-AvL (NL48824.031.14) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes. El uso de organoides para investigaciones posteriores se incluyó en el consentimiento informado. Los organoides se controlaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasma y se autenticaron mediante un análisis de SNP, como se describió anteriormente.^[49]

Detalles del método

Análisis de datos clínicos

El Protocolo de Redescubrimiento de Fármacos (DRUP) es un ensayo clínico prospectivo, multicéntrico y no aleatorizado en curso, en el que los pacientes con tumores sólidos avanzados o metastásicos que han agotado todas las opciones terapéuticas estándar reciben tratamiento en función del perfil molecular de su tumor, con terapias dirigidas o inmunoterapias aprobadas fuera de su indicación registrada.^[26] Para los análisis clínicos, incluimos a pacientes con cánceres MMR-d tratados con bloqueo de PD-(L)1, provenientes de tres cohortes completadas con MMR-d/MSI-hi como un objetivo terapéutico.^[14],^[61] Para los pacientes en los que se dispuso de secuenciación del genoma completo (WGS) (lo que incluye a todos los pacientes incluidos en el análisis de biomarcadores basado en la transcriptómica), se confirmó el estado de microsatélites y se excluyeron de los análisis clínicos y de biomarcadores los pacientes con resultados discordantes de los diagnósticos de rutina. Se consideró que los pacientes eran evaluables según el protocolo del estudio si la respuesta era radiológicamente o clínicamente evaluable, y si recibieron al menos una (durvalumab) o dos (nivolumab) administraciones de tratamiento. La presencia de metástasis hepáticas se determinó en función de las lesiones (no) objetivo, según las directrices RECIST v1.1, en las imágenes de referencia. Para los análisis actuales, la medida de resultado primaria fue la SCP, todas evaluadas según las directrices RECIST v1.1^[62] o la Evaluación de la Respuesta en Neuro-Oncología (RANO).^[63] Para todos los pacientes con LM sin beneficio clínico, se analizó el patrón de progresión de la enfermedad. Tras la confirmación inicial de la enfermedad progresiva según RECIST 1.1, los pacientes se clasificaron como ‘progresión hepática aislada’ si 1) desarrollaron nuevas lesiones hepáticas sin nuevas lesiones en otros sitios, o 2) progresión de las metástasis hepáticas existentes, pero no en otros sitios. Si los pacientes presentaban un aumento del volumen tumoral de las lesiones extrahepáticas, o desarrollaban nuevas lesiones fuera del hígado, se clasificaron como ‘progresión sistémica’. La carga tumoral se evaluó en la línea de base siguiendo el procedimiento RECIST v1.1, que toma la suma del diámetro más largo de las 5 lesiones objetivo como una estimación.

Para la validación de los hallazgos clínicos utilizando datos del mundo real, se realizó una solicitud de datos al Registro Nacional del Cáncer de los Países Bajos, que fue aprobada por su comité científico. Se solicitaron datos de respuesta de todos los pacientes adultos con CRC metastásico MMR-d (diagnosticados entre 2018 y 2023) que recibieron inmunoterapia de primera línea (nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab) y en los que se determinó la presencia de LM en la línea de base. Se excluyeron de los análisis los pacientes si: 1) se sometieron a un tratamiento quirúrgico de las metástasis hepáticas antes de la inmunoterapia, o 2) se administraron regímenes de inmunoterapia combinados (por ejemplo, anti-PD1 + anti-VEGF o TKI + anti-PD1). La respuesta al tratamiento fue evaluada por el médico tratante. Para estos pacientes, el estado de reparación del desajuste se determinó mediante diagnósticos de rutina; sin embargo, no se dispuso de datos de WGS para su validación.

Preparación de la biblioteca y NGS

Las muestras se procesaron según lo descrito previamente en una instalación centralizada y estandarizada.^[28] Brevemente, el ADN se extrajo de las muestras de biopsia y sangre utilizando un sistema automatizado (QiaSymphony) siguiendo los protocolos del fabricante (Qiagen). El ADN de la sangre se aisló con el kit DSP DNA Midi, mientras que el ADN del tejido se obtuvo utilizando el kit QIAsymphony DSP DNA Mini. Antes de la extracción de ADN del tejido, las biopsias se homogeneizaron en 100 mL de agua libre de nucleasas con el Qiagen TissueLyzer y se dividieron en dos porciones iguales para la extracción paralela automatizada de ADN y ARN utilizando QiaSymphony. El ARN se aisló con el kit QIAGEN QIAsymphony RNA, se procesó con el kit KAPA RNA Hyper + RiboErase HMR y se sometió a secuenciación de doble extremo en la plataforma Illumina NextSeq550 (2 × 75 pb) o en la plataforma Illumina NovaSeq6000 (2 × 150 pb).

Análisis de WGS

La secuenciación del genoma completo y el análisis de datos posterior se realizaron por la Hartwig Medical Foundation, según lo descrito previamente,^[28], donde las lecturas se mapearon contra el genoma de referencia GRCh37. PURPLE (v.3.7.1), una herramienta del conjunto de herramientas HMFtools, se utilizó para calcular la carga mutacional tumoral (número de variantes de sentido por muestra) y la carga mutacional tumoral (número de variantes que cumplen los criterios por Mb).

Análisis de datos de ARN

Los datos de ARN-seq se procesaron utilizando Cutadapt para retener las lecturas de más de 35 nucleótidos y eliminar los adaptadores TruSeq. Las lecturas filtradas se alinearon a continuación al genoma de referencia GRCh38 (Gencode v35) utilizando STAR (v2.7.10a) en modo de 2 pasos y se cuantificaron con featureCounts del paquete Subread (v2.0.1)^[60].

Los paquetes R edgeR^[58] (v.4.0.16) y limma^[55] (v.3.58.1) se utilizaron para probar los genes diferencialmente abundantes. Primero, la función normLibSizes de EdgeR se utilizó para calcular los factores de normalización para generar recuentos log2 por millón de lecturas (CPM) con la función voom de limma. A continuación, la expresión diferencial de los genes se calculó utilizando un modelo lineal de Limma con suavizado bayesiano empírico de los errores estándar. Se generó una matriz de contraste para definir las comparaciones pertinentes. Se utilizó la siguiente fórmula de diseño para el modelo lineal: Expresión ∼ CBLM + linfonodo + [intersección]. Aquí, CBLM fue un factor que combinó el estado de LM y el beneficio clínico (CB). Debido a la gran cantidad de diferentes tipos de tumores en la cohorte, el tipo de tumor no se incluyó como covariable en el modelo lineal. Sin embargo, se corrigió para el muestreo de la biopsia del ganglio linfático, mediante el factor categórico linfonodo, ya que esta variable podría oscurecer los resultados relacionados con los genes y las firmas de las células inmunitarias.

Se siguió el mismo enfoque para el análisis de abundancia diferencial entre los pacientes IL18-alto (los que expresan el tercio superior) y los pacientes IL18-bajo (el tercio inferior). En este caso, se utilizó la siguiente fórmula de diseño: Expresión ∼ IL18.status + linfonodo + pureza + tumorGroups. Los genes se clasificaron en función de la diferencia del cambio logarítmico entre las muestras IL18-alto e IL18-bajo para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Esto se realizó con la función fgsea() del paquete fgsea^[57] (v.1.28.0), y los conjuntos de genes del conjunto Hallmark se obtuvieron con el paquete msigdbr (v.7.5.1).

Análisis de células individuales

Se utilizaron datos disponibles públicamente para el análisis de células individuales. Se descargaron los datos de células inmunitarias procesados y anotados del portal de datos del Human Cell Atlas^[29] para visualizar la expresión génica de las células GD1 del intestino (Gut-VD1), del hígado (Liv-VD1) u otros órganos (Non-Gut-VD1). Primero, se seleccionaron manualmente las células anotadas como células de memoria residentes en el tejido (Trm_Tgd) o células GD que expresan CRTAM (Tgd-CRTAM+) del conjunto de datos. A continuación, se seleccionaron las células que expresan TRDV1, un gen que codifica para el TCR VD1+. A continuación, se clasificaron las células GD en función de la variable de metadatos Organ. Las células originarias del ciego (CAE), el duodeno (DUO), el íleon (ILE), el yeyuno proximal (JEJUPI), el yeyuno proximal inferior (JEJLP), el colon sigmoide (SCL) y el colon transverso (TCL) se clasificaron como Gut-VD1, el hígado (LIV) se clasificó como Liv-VD1, mientras que la médula ósea (BMA) y el pulmón (LNG) se clasificaron como otras-VD1.

Procesamiento de muestras de tejido

Las lesiones de tumores sólidos se seleccionaron macroscópicamente del material tumoral resecado y se recogieron partes del tejido en un medio de recolección frío Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM Ultraglutamine I (Lonza), 10 mM HEPES (GIBCO) y 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina (GIBCO)). Los materiales de tejido recolectados se procesaron inmediatamente mediante la disociación mecánica manual en pequeños fragmentos. Después del procesamiento, los fragmentos se congelaron en viales criogénicos que contenían 1 ml de FBS con 10% de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich). Todos los fragmentos de tejido se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.

Digestión de las muestras de tejido y análisis citométrico de flujo de las células inmunitarias residentes en el tejido

Los viales con fragmentos de tejido crioconservados se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y, a continuación, se lavaron en un medio HBSS (Gibco) caliente, enjuagándolos varias veces en un filtro celular en una placa de 6 pocillos. A continuación, los fragmentos se procesaron en suspensiones de células individuales mediante la digestión enzimática en una mezcla de digestión (HBSS (Gibco) con 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco), 12,6 μg/ml de Pulmozyme (Roche) y 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich)) durante 45-60 minutos a 37 °C y bajo una lenta rotación. La actividad enzimática se neutralizó mediante la adición de HBSS frío. A continuación, las muestras se lavaron con HBSS (Gibco), se filtraron a través de un filtro de malla de 40 μm y las estructuras de tejido restantes se trituraron. A continuación, se eliminó la fracción de células epiteliales mediante centrifugación (50 g durante 4 min) y los restos celulares se eliminaron mediante separación por gradiente de densidad con el kit de eliminación de restos (Miltenyi biotech). Para la inmunofenotipificación, las células se resuspendieron directamente en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente de bloqueo de receptores Fc (eBioscience), seguido de la tinción de viabilidad con un tinte de viabilidad IR cercano (Life Technologies) durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron, se resuspendieron en 150 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: CD4-BUV805 (BD biosciences, 1:200), CD8-BUV563 (BD Biosciences, 1:200), CD56-BUV395 (BD Biosciences, 1:100), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40), VD2-TCR-FITC (Biolegend 1:50), CD3-BB700 (BD biosciences, 1:160), TCR VA24-Ja18-BV421 (Biolegend, 1:50), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), IL18R1-APC (eBiosciences, 1:50).

Para los experimentos de estimulación de citocinas, las células se cultivaron durante 24 horas en un medio de células T γδ (IMDM (Gibco) + 10% de suero humano (Sigma-Aldrich), suplementado con 150 u/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15) con la adición de combinaciones de citocinas de interés, a saber, IL-12 recombinante (Peprotech, 10 ng/ml) e IL18 (Peprotech, 10 ng/ml). A continuación, se recogió una parte del sobrenadante para los ensayos de citocinas. A continuación, se añadió Golgi-Plug (1:1000, BD) y Golgi-Stop (1:1500, BD) y se continuó el cultivo durante 3 horas más. A continuación, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente de bloqueo de receptores Fc (eBioscience) y, a continuación, con LIVE/DEAD IR Dye (Life Sciences) durante 20 minutos a 4 °C cada uno. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción: VD1-TCR-FITC (Invitrogen, 1:20), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), SIGIRR-PE (Invitrogen, 1:50), IFNγ-APC (BD biosciences, 1:40), IL-2-BV750 (BD biosciences, 1:50), CD107-PE-Cy7 (Biolegend, 1:50). Antes de la tinción, las células se lavaron, se resuspendieron en 50 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos mencionados anteriormente y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces, seguido de la fijación y la permeabilización utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), y luego se realizó la tinción de las proteínas intracelulares. Todos los experimentos se realizaron utilizando un citómetro BD FACSymphony con el software Diva. Los análisis de los datos de citometría de flujo se realizaron con el software FlowJo versión 10.10.

Análisis de las citocinas inflamatorias en el plasma de los pacientes

Las muestras de plasma de los pacientes se recogieron como parte del estudio DRUP^[26] y se analizaron mediante el panel de inflamación humana Legendplex (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron muestras de plasma pretratamiento de muestras de sangre total (Streck). Los resultados se obtuvieron utilizando un iQue 3 (Sartorius) con el software Forecyt estándar. El análisis de los datos de citometría de flujo se realizó con el software de análisis de datos LEGENDplex proporcionado.

Para medir la IL18BP en el plasma de los pacientes, se utilizaron las mismas muestras que para las mediciones de IL18. Las mediciones se realizaron utilizando el kit ELISA Human IL-18BP (ThermoFisher scientific #EHIL18BP) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.

Cultivo de organoides

Se derivaron organoides tumorales de pacientes con CRC MMR-d a partir de muestras de resección, según se informó previamente.^[48],^[49] Los pacientes eran elegibles si las pruebas moleculares de rutina demostraban MMR-d mediante la pérdida de tinción de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) mediante inmunohistoquímica (IHC) o MSI-H mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de próxima generación basada en paneles (NGS) o secuenciación del genoma completo (WGS) del tumor original del paciente. El muestreo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del NKI-AvL (NL48824.031.14) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. En resumen, el tejido tumoral se disoció mecánicamente y se digirió con 1,5 mg/mL de colagenasa II (Sigma-Aldrich), 10 μg/mL de hialuronidasa tipo IV (Sigma-Aldrich) y 10 μM de Y-27632 (Sigma-Aldrich). Las células se sembraron en Cultrex RGF BME tipo 2 (3533-005-02, R&D systems) y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos, y luego se añadió el medio de organoides de CRC. El medio se utilizó según se describió previamente y se compone de Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 10 mM de HEPES (GIBCO), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina (GIBCO), 10% de medio acondicionado con noggin, 20% de medio acondicionado con R-spondin1, 1× suplemento B27 sin vitamina A (GIBCO), 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich), 50 ng/mL de EGF humano recombinante (Peprotech), 500 nM de A83-01 (Tocris), 3 μM de SB202190 (Cayman Chemicals) y 10 nM de prostaglandina E2 (Cayman Chemicals). Los organoides se pasaron cada semana, mediante disociación enzimática con TrypLE Express (Gibco), lavado y posterior inclusión en BME. Los organoides se autenticaron mediante un array de SNP, se analizaron mensualmente para detectar Mycoplasma utilizando Mycoplasma PCR43 y el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert (LT07-318). En las dos primeras semanas del cultivo de organoides, se añadió 1× Primocin (Invivogen) para prevenir la contaminación microbiana.### Selección y expansión de células γδ T de PBMC de donantes sanos

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de leucocitos de donantes sanos utilizando separación por gradiente de densidad de Ficoll-Paque (medio de separación de células Lympholyte-H, Tebubio) y se crioconservaron hasta su uso posterior. Las PBMC se descongelaron en un medio de descongelación de células T precalentado compuesto por RPMI 1640 (Gibco), suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 100/100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco) y 10% de FC. Posteriormente, las células se trataron con 25 U/mL de benzonasa (Merck) durante 15 minutos, se lavaron y se resuspendieron en 2×106 células/mL de medio de cultivo de células T (IMDM 1640 suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I, 100/100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 10% de suero humano) en presencia de 150 U/mL de IL-2 (Peprotech). A continuación, las células γδ T se preenriquecieron antes de la clasificación utilizando el kit de aislamiento de células T TCR γ/δ+ (Miltenyi biotec) mediante clasificación celular asistida por campos magnéticos, según el protocolo del fabricante. A continuación, todo el conjunto de células γδ T se tiñó con NiR live dead, CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40) durante 25 minutos a 4 °C. Las células simples, vivas, CD3+, TCRa/b-, TCR YD+ y Vδ1+ se clasificaron en el FACS Aria III 4L (BD Biosciences) en condiciones estériles para su posterior cultivo celular. Posteriormente, las células se expandieron en un medio que contenía células alimentadoras irradiadas. Se añadieron 1 μg de fitohemaglutinina-L (PHA), 1000 U/mL de IL-2 y 10 ng/mL de IL-15 durante dos o tres semanas. El medio con citocinas se renovó después de los primeros 7 días y, posteriormente, cada 2 días. Después del protocolo de expansión, se evaluó la pureza de las células γδ Vδ1+ mediante citometría de flujo y las células se crioconservaron en FCS con 10% de DMSO. En las dos primeras semanas del cultivo de organoides, se añadió 1× Primocin (Invivogen) para prevenir la contaminación microbiana.### Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar la citotoxicidad mediada por las células γδ T contra los organoides tumorales y las líneas celulares, los organoides y las líneas celulares se transfectaron previamente con el gen reportero de la luciferasa utilizando pLenti CMV Puro LUC (w168-1; Plasmid #17477; Addgene). Tres días antes del ensayo de citotoxicidad, las células γδ T expandidas de PBMC se descongelaron y se dejaron en reposo durante tres días en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con 150 u/mL de IL-2 y 5 ng/mL de IL-15. Después de tres días, los organoides se aislaron de geltrex y se disociaron en células individuales y se contaron. Las células se sembraron en una proporción efector/objetivo de 1:1 en un medio de células γδ T. Para los organoides, se sembraron 50.000 células por pocillo, y para la línea celular, se sembraron 25.000 células por pocillo. Para evaluar el efecto de diferentes citocinas sobre la capacidad de citotoxicidad, se añadió IL-12 recombinante (10 ng/mL) e IL18 (10 ng/mL) (que permanecieron presentes durante el resto del cocultivo). Después de 24 horas, se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante un ensayo de reportero de luciferasa utilizando 3 μg/mL de luciferina y se midió con un lector Tecan (1000 ms de exposición).

Para los ensayos de citotoxicidad de células inmunitarias basados en Incucyte, los organoides se disociaron con enzima TrypLE Express (ThermoFisher) y se sembraron 50.000 células en un medio de células γδ T de IMDM suplementado con 1:1000 de Pen Strep (ThermoFisher scientific), 1:1000 de glutamina estable (Capricorn scientific) y 10% de suero humano. Las células se preestimularon con 20 ng/mL de IFNγ y se incubaron con 1 μg/mL de anticuerpo anti-humano IL18BP Ultra-LEAF purificado (BioLegend) o 1 μg/mL de anticuerpo recombinante Ultra-LEAF purificado de isotipo IgG4 humano (BioLegend) durante 24 horas. Después de 24 horas, se sembraron 20.000 células en un medio de células GDT. Las células se estimularon con 10 ng/mL de IL-12 (PeproTech) y 1 ng/mL de IL18 (Peprotech). Para visualizar la citotoxicidad, se añadió el reactivo CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes (ThermoFisher scientific) en una concentración de 30 μL por 1 mL de medio. Inmediatamente después, las placas se colocaron en el sistema de análisis de células vivas Sartorius Incucyte S3. Se utilizó el software Sartorius Incucyte con la configuración estándar del tipo de escaneo. Se realizó un escaneo por pocillo cada hora durante 24 horas. La señal de fondo medida en los pocillos donde solo se añadió IFN-γ a los organoides tumorales se restó de las condiciones. Las células cancerosas solas y las células cancerosas solas con caspasa-3/7 se utilizaron como controles negativos.### Ensayo de reactividad para el cocultivo de células γδ T y organoides

Para las estimulaciones de citocinas durante el monocultivo y el cocultivo, las células γδ T expandidas de PBMC se cultivaron en presencia o ausencia de PDTO MSI-3 en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 u/mL). Las células se estimularon con IL18 (1 ng/mL), IL12 (10 ng/mL) o ambos durante 24 horas. Para el experimento de bloqueo de IL18BP, las células se preestimularon con una dosis baja de IFNγ (20 ng/mL) antes del cocultivo y, posteriormente, se cultivaron durante 24 horas en IMDM suplementado con 10% de suero humano, IL-2 (150 u/mL), IL-12 (10 ng/mL) y anticuerpo de bloqueo de IL18BP (Biolegend, 1 μg/mL) o control de isotipo (Biolegend, 1 μg/mL). Después de 24 horas, se añadió 1 μg/mL de IL18 recombinante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora. A continuación, se añadieron células γδ T de diferentes donantes a las diferentes condiciones (a 50.000 células por pocillo). Para el experimento de bloqueo de IL18, las células γδ T expandidas de PBMC se cocultivaron con PDTO MSI-3 en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 u/mL) e IL12 (10 ng/mL), en presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo de IL18 (MBL, clon 125-2H, 0,1 μg/mL).

Para todos los experimentos, las células se estimularon con 50 ng/mL de phorbol-12-miristato-13-acetato (Sigma-Aldrich) y 1 μg/mL de ionomicina (Sigma-Aldrich) como control positivo. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, se añadieron GolgiSTOP (BD Biosciences, 1:1500) y GolgiPlug (BD Biosciences, 1:1000). Después de 4 horas de incubación, las células se lavaron y se incubaron con bloqueador de receptores Fc humano (BioLegend, 1:200) durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos de superficie celular: CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR Vδ1 – FITC (Invitrogen, 1:20), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40) y un tinte de viabilidad de infrarrojo cercano 1:1000 (Life Technologies). A continuación, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando tampón de fijación y tampón de lavado de permeabilización de tinción intracelular (BioLegend), y las células se tiñeron posteriormente con un anti-IFNG-APC (Biolegend, 1:40) durante 20 minutos a 4 °C. La compensación se realizó utilizando CompBeads (BD Biosciences) y la citometría de flujo se realizó en un citómetro BD FACSymphony utilizando el software Diva. Los análisis de datos se realizaron con el software FlowJo versión 10.10.### Preparación de muestras para la secretómica

La secretómica se realizó utilizando un método de etiquetado metabólico publicado previamente basado en un aminoácido no canónico derivado de la treonina (THRONCAT).^[64] En resumen, se sembraron cuatro organoides de CRC MMR-d/MSI en un medio de cultivo completo de CRC en duplicado a 1,6×106 células por réplica. Cinco días después, se añadió 0,5 mM de β-etinilserina (βES) al medio de cultivo completo durante 24 horas para etiquetar metabólicamente las proteínas recién sintetizadas. Simultáneamente, se añadió 20 ng/mL de IFNγ a la mitad de las muestras. Después de 24 horas, se recogió el medio de cultivo y se centrifugó durante 5 minutos a 1000×g para eliminar las células restantes. Se recogió el sobrenadante y se añadieron inhibidor de proteasas (1:100, HaltTM) e inhibidor de fosfatasas (1:100, HaltTM) al medio de cultivo antes de almacenar las muestras a -80 °C. El material de entrada para el análisis de secretoma se normalizó a la cantidad total de proteína, midiendo la densidad óptica del contenido total de proteína de cada muestra en una máquina Beckman Coulter. Para el análisis de secretoma, el medio de cultivo se procesó y se midió como se describió previamente,^[65], con la excepción de que, dependiendo del volumen de medio recogido, se utilizaron filtros de ultrafiltración Amicon Ultra de 3 kDa de 15 mL o 50 mL (Merck Millipore UFC900324; UFC800308) según el protocolo del fabricante.### Espectrometría de masas

Antes del análisis de espectrometría de masas, los péptidos se reconstituyeron en un 2% de ácido fórmico. Las mezclas de péptidos se analizaron en el espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Scientific) conectado a un sistema de cromatografía líquida nano-LC Vanquish Neo (Thermo Scientific). El Vanquish Neo se operó en modo de trampa y elución, y los péptidos se cargaron en una columna de trampa Pepmap 100 C18 de 5 μm (300 μm × 5 mm, Thermo Scientific) antes de la separación en la columna analítica (AUR325075C18TS, 1,7 μm/75 μm × 250 mm, Ionopticks o ES906, 2,0 μm/150 μm × 15 cm, Thermo Scientific). El disolvente A fue un 0,1% de ácido fórmico/agua y el disolvente B fue un 0,1% de ácido fórmico/80% de acetonitrilo. Los péptidos se analizaron en un método de LC-MS de 30 muestras por día con un gradiente no lineal. El Orbitrap Astral se ejecutó en modo de adquisición independiente de datos (DIA).### Análisis de datos de secretómica

Los datos brutos se analizaron con DIA-NN (versión 1.9.2)^[59] sin una biblioteca espectral y con la opción "Deep learning" habilitada. Se añadió la base de datos Swissprot Human (DIA-NN 1.9.2: 20.435, versión 2024_08) para la búsqueda sin biblioteca. La estrategia de cuantificación se estableció en Robust LC (alta precisión) para la versión 1.8.1 de DIA-NN y, para la versión 1.9.2 de DIA-NN, la estrategia de cuantificación se estableció en QuantUMS (alta precisión). Se habilitó la opción MBR y se mantuvieron todos los demás ajustes en los valores predeterminados. El informe de grupos de proteínas de DIA-NN se utilizó para el análisis posterior en Perseus (versión: 2.0.10.0 o posterior).^[66] Los valores se transformaron logarítmicamente (log2), después de lo cual se filtraron las proteínas para que tuvieran al menos un 66% de valores válidos en al menos un grupo de muestras. Los valores faltantes se reemplazaron mediante la imputación basada en una distribución normal utilizando un ancho de 0,3 y un desplazamiento mínimo hacia abajo de 2,4. Para centrarnos en las proteínas verdaderamente secretadas, en lugar de la liberación inespecífica debido a la muerte celular, eliminamos las proteínas que no están anotadas como secretadas según el atlas de proteínas humanas.^[67] Las proteínas expresadas diferencialmente se determinaron utilizando un modelo lineal mixto con corrección para réplicas (umbral mínimo: valor p ajustado ≤ 0,05). La expresión diferencial de IL18BP entre los organoides MSI de CRC ± estimulación con IFNγ se calculó utilizando una prueba t de Student pareada.### ELISA de IL18BP PDTO

En resumen, se sembraron tres organoides de CRC MMR-d/MSI y un organoide de colon sano en medio completo AdDF+++ en duplicado, a una concentración de 1,0 × 10^6 células por réplica, con 20 ng/mL de IFNγ durante 24 horas. Al día siguiente, las células se transfirieron mediante centrifugación y filtración, y se recolectó y crioconservó el medio acondicionado hasta el momento del ensayo. Las mediciones de IL18BP se realizaron utilizando ELISA con el kit Human IL-18BP ELISA Kit (ThermoFisher scientific #EHIL18BP) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.### Cuantificación y análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos para los análisis clínicos y bioinformáticos se realizaron utilizando R versión 4.2.2 o Python versión 3.8. Las características de los pacientes y las respuestas tumorales se resumieron utilizando estadísticas descriptivas. Las diferencias en CB entre los grupos metastásicos se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher (variables categóricas), la prueba de Wilcoxon (variables continuas) y la prueba de asociación lineal por lineal (variables ordinales). Se utilizaron los métodos de Kaplan-Meier para estimar el PFS (calculado desde el inicio del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad o la muerte por cualquier causa, excluyendo a los pacientes que se mantienen vivos sin progresión). Para los análisis de expresión génica diferencial, se utilizaron regresiones basadas en limma-voom de dos colas con corrección para pruebas múltiples.

Para los análisis translacionales e in vitro, los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 10.4.1. El tamaño de los grupos y la definición de las barras de error se indican en las leyendas de las figuras. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t de Student de dos colas. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos; los valores de significación se indican como * (p < 0,05), (p < 0,01) y * (p < 0,001).

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Dentro de la cohorte de la Hartwig Medical Foundation, se incluyeron pacientes con cáncer avanzado sin otras opciones de tratamiento como parte de los estudios clínicos CPCT-02 (NCT01855477) y DRUP (NCT02925234), que fueron aprobados por los comités de ética médica (METC) del University Medical Center Utrecht y del Netherlands Cancer Institute, respectivamente. Se obtuvo el consentimiento informado para la secuenciación del genoma completo (WGS) y para el intercambio de datos con fines de investigación. Los análisis clínicos se realizaron utilizando datos del estudio DRUP, que fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Netherlands Cancer Institute en Ámsterdam y se lleva a cabo de acuerdo con las directrices de Buenas Prácticas Clínicas y los principios éticos de la Declaración de Helsinki para la investigación médica. Todos los pacientes tenían más de 18 años y un estado funcional de 0-2; se proporcionan más características basales, incluido el género y la edad, en las tablas 1 y S3. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes incluidos. DRUP está registrado en ClinicalTrials.gov, número NCT02925234.

Para los ensayos de tejidos ex vivo, se recolectaron muestras de tumores y tejidos no malignos de individuos con cáncer colorrectal que se sometieron a tratamiento quirúrgico en el Netherlands Cancer Institute-Antoni van Leeuwenhoekziekenhuis (NKI-AVL). El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del NKI-AVL (IRBdm24-078) y se llevó a cabo en cumplimiento de todas las regulaciones éticas pertinentes. Todos los pacientes consintieron el uso de los materiales para investigación que no son necesarios para fines de diagnóstico, ya sea mediante un procedimiento de exclusión voluntaria o mediante un consentimiento informado previo por escrito (después del 23 de mayo de 2018). Los organoides tumorales derivados del paciente se generaron previamente; se proporciona una descripción general de los organoides en la tabla S2. El muestreo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del NKI-AvL (NL48824.031.14) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. El uso de organoides para fines de investigación adicionales se incluyó en el consentimiento informado. Los organoides se controlaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasma y se autenticaron mediante un análisis de SNP, como se describió anteriormente.^[49]

Detalles del método

Análisis de datos clínicos

El Drug Rediscovery Protocol (DRUP) es un ensayo clínico prospectivo, multicéntrico y no aleatorizado en curso, en el que los pacientes con tumores sólidos avanzados o metastásicos que han agotado todas las opciones de tratamiento estándar son tratados en función del perfil molecular de su tumor con terapias dirigidas o inmunoterapias aprobadas fuera de su indicación registrada.^[26] Para los análisis clínicos, incluimos a pacientes con cánceres MMR-d tratados con bloqueo de PD-(L)1 de tres cohortes completadas con MMR-d/MSI-alto como un objetivo accionable.^[14],^[61] Para los pacientes en los que se dispuso de WGS (que son todos los pacientes incluidos en el análisis de biomarcadores basado en la transcriptómica), se confirmó el estado de microsatélite y se excluyeron de los análisis clínicos y de biomarcadores los pacientes con resultados discordantes de los diagnósticos de rutina. Se consideró que los pacientes eran elegibles según el protocolo del estudio si la respuesta era radiológicamente o clínicamente evaluable, si recibían al menos una (durvalumab) o dos (nivolumab) administraciones de tratamiento. La presencia de metástasis hepáticas se determinó en función de las lesiones (no) objetivo según las directrices RECIST v1.1 en la imagen de referencia. Para los análisis actuales, la medida de resultado primaria fue el PFS, todo ello evaluado según las directrices RECIST v1.1^[62] o Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO).^[63] Para todos los pacientes con LM sin beneficio clínico, se analizó el patrón de progresión de la enfermedad. Tras la confirmación inicial de la enfermedad progresiva según RECIST 1.1, los pacientes se clasificaron como "progresión hepática aislada" si 1) desarrollaban nuevas lesiones hepáticas sin nuevas lesiones en otros sitios, o 2) progresión de las metástasis hepáticas existentes, pero no en otros sitios. Si los pacientes presentaban un aumento del volumen tumoral de las lesiones extrahepáticas o desarrollaban nuevas lesiones fuera del hígado, se clasificaron como "progresión sistémica". La carga tumoral se evaluó en la línea de base siguiendo el procedimiento RECIST v1.1, que toma la suma del diámetro más largo de las 5 lesiones objetivo como una estimación.

Para la validación de los hallazgos clínicos utilizando datos del mundo real, se realizó una solicitud de datos al Netherlands Cancer Registry, que fue aprobada por su comité científico. Se solicitaron datos de respuesta de todos los pacientes adultos con CRC metastásico MMR-d (diagnosticados entre 2018 y 2023) que recibieron inmunoterapia de primera línea (nivolumab, pembrolizumab, atetolizumab, avelumab, durvalumab) y en los que se determinó la presencia de LM en la línea de base. Se excluyeron de los análisis los pacientes si: 1) se sometieron a un tratamiento quirúrgico de las metástasis hepáticas antes de la inmunoterapia, o 2) se administraron regímenes de inmunoterapia combinados (por ejemplo, anti-PD1 + anti-VEGF o TKI + anti-PD1). La respuesta al tratamiento fue evaluada por el médico tratante. Para estos pacientes, el estado de reparación del desajuste se determinó mediante diagnósticos de rutina, sin embargo, no se dispuso de datos de WGS para su validación.### Preparación de bibliotecas y NGS

Las muestras se procesaron según lo descrito anteriormente en una instalación centralizada y estandarizada.^[28] Brevemente, el ADN se extrajo de las muestras de biopsia y sangre utilizando un sistema automatizado (QiaSymphony) siguiendo los protocolos del fabricante (Qiagen). El ADN de la sangre se aisló con el kit DSP DNA Midi, mientras que el ADN del tejido se obtuvo utilizando el kit QIAsymphony DSP DNA Mini. Antes de la extracción de ADN del tejido, las biopsias se homogeneizaron en 100 mL de agua libre de nucleasas con el Qiagen TissueLyzer y se dividieron en dos porciones iguales para la extracción automatizada paralela de ADN y ARN utilizando QiaSymphony. El ARN se aisló con el kit QIAGEN QIAsymphony RNA, se procesó con el kit KAPA RNA Hyper + RiboErase HMR y se sometió a secuenciación de doble extremo en la plataforma Illumina NextSeq550 (2 × 75 pb) o en la plataforma Illumina NovaSeq6000 (2 × 150 pb).### Análisis de WGS

La secuenciación del genoma completo y el análisis de datos posteriores se realizaron por la Hartwig Medical Foundation, como se describió anteriormente,^[28], donde las lecturas se mapearon al genoma de referencia GRCh37. PURPLE (v.3.7.1), una herramienta del conjunto de herramientas HMFtools, se utilizó para calcular la carga mutacional tumoral (número de variantes con cambio de sentido por muestra) y la carga mutacional tumoral (número de variantes que cumplen los criterios por Mb).### Análisis de datos de ARN

Los datos de ARN-seq se procesaron utilizando Cutadapt para retener las lecturas de más de 35 nucleótidos y para eliminar los adaptadores TruSeq. Las lecturas filtradas se alinearon a continuación al genoma de referencia GRCh38 (Gencode v35) utilizando STAR (v2.7.10a) en modo de 2 pasos y se cuantificaron con featureCounts del paquete Subread (v2.0.1)^[60].

Los paquetes R edgeR^[58] (v.4.0.16) y limma^[55] (v.3.58.1) se utilizaron para probar los genes diferencialmente abundantes. Primero, la función normLibSizes de EdgeR se utilizó para calcular los factores de normalización para generar los recuentos log2 por millón de lecturas (CPM) con la función voom de limma. A continuación, la expresión diferencial de los genes se calculó utilizando un modelo lineal de Limma con suavizado bayesiano empírico de los errores estándar. Se generó una matriz de contraste para definir las comparaciones pertinentes. Se utilizó la siguiente fórmula de diseño para el modelo lineal: Expresión ∼ CBLM + linfonodo + [intersección]. Aquí, CBLM fue un factor que combinó el estado de LM y el beneficio clínico (CB). Debido a la gran cantidad de diferentes tipos de tumores en la cohorte, el tipo de tumor no se incluyó como covariable en el modelo lineal. Sin embargo, se corrigió para el muestreo de la biopsia del ganglio linfático, mediante el factor categórico linfonodo, ya que esta variable podría oscurecer los resultados relacionados con los genes y las firmas de las células inmunitarias.

Se siguió el mismo enfoque para el análisis de abundancia diferencial entre los pacientes IL18-alto (los que expresan el tercio superior) y los pacientes IL18-bajo (el tercio inferior). En este caso, se utilizó la siguiente fórmula de diseño: Expresión ∼ IL18.estado + linfonodo + pureza + grupos tumorales. Los genes se clasificaron en función de la diferencia del cambio logarítmico en la expresión entre las muestras IL18-alto e IL18-bajo para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Esto se realizó con la función fgsea() del paquete fgsea^[57] (v.1.28.0) y los conjuntos de genes de la colección Hallmark recuperados con el paquete msigdbr (v.7.5.1).### Análisis de células individuales

Se utilizaron datos disponibles públicamente para el análisis de células individuales. Se descargaron datos de células inmunitarias procesados y anotados del portal de datos del Human Cell Atlas^[29] para visualizar la expresión génica de las células GD1 del intestino (Gut-VD1), del hígado (Liv-VD1) u otros órganos (Non-Gut-VD1). Primero, seleccionamos manualmente las células anotadas como células de memoria residentes en el tejido (Trm_Tgd) o células GD que expresan CRTAM (Tgd-CRTAM+) del conjunto de datos. A continuación, seleccionamos las células que expresan TRDV1, un gen que codifica el TCR VD1+. A continuación, clasificamos las células GD en función de la variable de metadatos Organ. Las células originarias del íleon (CAE), duodeno (DUO), íleon (ILE), yeyuno proximal (JEJUPI), yeyuno proximal inferior (JEJLP), colon sigmoide (SCL) y colon transverso (TCL) se clasificaron como Gut-VD1, el hígado (LIV) se clasificó como Liv-VD1, mientras que la médula ósea (BMA) y el pulmón (LNG) se clasificaron como otros-VD1.### Procesamiento de muestras de tejido

Las lesiones tumorales sólidas se seleccionaron macroscópicamente del material tumoral resecado y se recolectaron partes del tejido en un medio de recolección frío Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 10 mM de HEPES (GIBCO) y 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina (GIBCO)). Los materiales de tejido recolectados se procesaron inmediatamente mediante la disociación mecánica manual en pequeños fragmentos. Después del procesamiento, los fragmentos se congelaron en viales criogénicos que contenían 1 ml de FBS con 10 % de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich). Todos los fragmentos de tejido se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.### Digestión de muestras de tejido y análisis citométrico de flujo de células inmunitarias residentes en el tejido

Se descongelaron viales que contenían fragmentos de tejido criopreservado en un baño de agua a 37 °C y, posteriormente, se lavaron en un medio HBSS (Gibco) caliente, enjuagándolos varias veces en un tamiz celular en una placa de 6 pocillos. A continuación, los fragmentos se procesaron para obtener suspensiones de células individuales mediante digestión enzimática en una mezcla de digestión (HBSS (Gibco) con 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco), 12,6 μg/mL de Pulmozyme (Roche) y 1 mg/mL de colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich)) durante 45 a 60 minutos a 37 °C y bajo una rotación lenta. La actividad enzimática se neutralizó mediante la adición de HBSS frío. A continuación, se lavaron las muestras con HBSS (Gibco), se filtraron a través de un filtro de malla de 40 μm y se trituraron las estructuras de tejido restantes. A continuación, se eliminó la fracción de células epiteliales mediante centrifugación (50 g durante 4 minutos) y se eliminaron los restos celulares mediante separación por gradiente de densidad con el kit de eliminación de restos (Miltenyi biotech). Para la inmunofenotipificación, las células se resuspendieron directamente en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente bloqueador del receptor Fc (eBioscience), seguido de la tinción de viabilidad con un tinte de viabilidad IR cercano (Life Technologies) durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, se lavaron las células, se resuspendieron en 150 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: CD4-BUV805 (BD Biosciences, 1:200), CD8-BUV563 (BD Biosciences, 1:200), CD56-BUV395 (BD Biosciences, 1:100), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40), VD2-TCR-FITC (Biolegend, 1:50), CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR VA24-Ja18-BV421 (Biolegend, 1:50), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), IL18R1-APC (eBiosciences, 1:50).

Para los experimentos de estimulación con citocinas, las células se cultivaron durante 24 horas en un medio de células γδ T (IMDM (Gibco) + 10% de suero humano (Sigma-Aldrich), suplementado con 150 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15) con la adición de combinaciones de citocinas de interés, a saber, IL-12 recombinante (Peprotech, 10 ng/ml) e IL18 (Peprotech, 10 ng/ml). A continuación, se recogió una parte del sobrenadante para los ensayos de citocinas. A continuación, se añadió Golgi-Plug (1:1000, BD) y Golgi-Stop (1:1500, BD) y se continuó el cultivo durante 3 horas más. A continuación, se lavaron las células dos veces y se resuspendieron en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente bloqueador del receptor Fc (eBioscience) y, posteriormente, con un tinte LIVE/DEAD IR (Life Sciences) durante 20 minutos a 4 °C. Los siguientes anticuerpos se utilizaron para la tinción: VD1-TCR-FITC (Invitrogen, 1:20), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), SIGIRR-PE (Invitrogen, 1:50), IFNγ-APC (BD Biosciences, 1:40), IL-2-BV750 (BD Biosciences, 1:50), CD107-PE-Cy7 (Biolegend, 1:50). Antes de la tinción, se lavaron las células, se resuspendieron en 50 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos mencionados anteriormente y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Se lavaron las células dos veces, seguido de la fijación y permeabilización utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), y luego se realizó la tinción de las proteínas intracelulares. Todos los experimentos se realizaron utilizando un citómetro BD FACSymphony con el software Diva. Los análisis de datos se realizaron con el software FlowJo versión 10.10.### Análisis de las citocinas inflamatorias en el plasma de los pacientes

Las muestras de plasma de los pacientes se recogieron como parte del estudio DRUP^[26] y se analizaron mediante el panel Legendplex Human Inflammation Panel 1 (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma se obtuvieron antes del tratamiento a partir de muestras de sangre total (Streck). Los resultados se obtuvieron utilizando un iQue 3 (Sartorius) con el software Forecyt estándar. El análisis de los datos de citometría de flujo se realizó en el software LEGENDplex Data Analysis Software Suite proporcionado.

Para medir la IL18BP en el plasma de los pacientes, se utilizaron las mismas muestras que para las mediciones de IL18. Las mediciones se realizaron utilizando el kit ELISA Human IL-18BP (ThermoFisher scientific #EHIL18BP) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.### Cultivo de organoides

Los organoides tumorales se derivaron de pacientes con CRC con MMR-d a partir de muestras de resección, como se informó anteriormente.^[48],^[49] Los pacientes eran elegibles si las pruebas moleculares de rutina demostraban MMR-d mediante la pérdida de tinción de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) mediante inmunohistoquímica (IHC) o MSI-H mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de próxima generación basada en paneles (NGS) o secuenciación del genoma completo (WGS) del tumor original del paciente. El muestreo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del NKI-AvL (NL48824.031.14) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. En resumen, el tejido tumoral se disoció mecánicamente y se digirió con 1,5 mg/ml de colagenasa II (Sigma-Aldrich), 10 μg/ml de hialuronidasa tipo IV (Sigma-Aldrich) y 10 μM de Y-27632 (Sigma-Aldrich). Las células se colocaron en Cultrex RGF BME tipo 2 (3533-005-02, R&D systems) y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos, y luego se añadió el medio de organoides de CRC. El medio se utilizó como se describió anteriormente y se compone de Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 10 mM de HEPES (GIBCO), 100 U/ml de cada uno de penicilina y estreptomicina (GIBCO), 10% de medio acondicionado con noggin, 20% de medio acondicionado con R-spondin1, 1× suplemento B27 sin vitamina A (GIBCO), 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich), 50 ng/ml de EGF humano recombinante (Peprotech), 500 nM de A83-01 (Tocris), 3 μM de SB202190 (Cayman Chemicals) y 10 nM de prostaglandina E2 (Cayman Chemicals). Los organoides se pasaron cada semana, mediante disociación enzimática con TrypLE Express (Gibco), lavado y posterior inclusión en BME. Los organoides se autenticaron mediante un microarreglo de SNPs, se analizaron mensualmente para detectar Mycoplasma mediante PCR de Mycoplasma 43 y el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert (LT07-318). En las dos primeras semanas del cultivo de organoides, se añadió 1× Primocin (Invivogen) para evitar la contaminación microbiana.### Selección y expansión de células γδ T de PBMCs de donantes sanos

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de leucocitos de donantes sanos utilizando la separación por gradiente de densidad con Ficoll-Paque (medio de separación de células Lympholyte-H, Tebubio) y se criopreservaron hasta su uso posterior. Las PBMCs se descongelaron en un medio de descongelación de células T precalentado compuesto por RPMI 1640 (Gibco), suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco) y 10% de FC. A continuación, las células se trataron con 25 U/ml de benzonasa (Merck) durante 15 minutos, se lavaron y se resuspendieron en 2x106 células/ml de medio de cultivo de células T (IMDM 1640 suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I, 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina y 10% de suero humano) en presencia de 150 U/ml de IL-2 (Peprotech). A continuación, las células γδ T se preenriquecieron antes de la clasificación utilizando el kit de aislamiento de células T TCR γ/δ+ (Miltenyi biotec) utilizando la clasificación celular asistida por campos magnéticos, según el protocolo del fabricante. A continuación, todo el conjunto de células gamma delta T se tiñó con NiR live dead, CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40) durante 25 minutos a 4 °C. Las células simples, vivas, CD3+, TCRa/b-, TCR YD+, Vδ1+ se clasificaron en el FACS Aria III 4L (BD Biosciences) en condiciones estériles para su posterior cultivo celular. A continuación, las células se expandieron en un medio que contenía células alimentadoras irradiadas. Se añadió 1 μg de fitohemaglutinina-L (PHA), 1000 U/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-15 durante dos o tres semanas. El medio con citocinas se renovó después de los primeros 7 días y, posteriormente, cada 2 días. Después del protocolo de expansión, se evaluó la pureza de las células Vδ1+ γδ T mediante citometría de flujo y las células se criopreservaron en FCS con 10% de DMSO.### Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar la citotoxicidad mediada por las células gamma-delta T de los organoides tumorales y las líneas celulares, los organoides y las líneas celulares se transfectaron previamente con el gen del reportero de la luciferasa utilizando pLenti CMV Puro LUC (w168-1; Plasmid #17477; Addgene). Tres días antes del ensayo de citotoxicidad, las PBMCs expandidas de células γδ T se descongelaron y se dejaron en reposo durante tres días en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con 150 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Después de tres días, los organoides se aislaron de geltrex y se disociaron en células individuales y se contaron. Las células se sembraron en una proporción efector-objetivo de 1:1 en un medio de células γδ T. Para los organoides, se sembraron 50.000 células por pocillo, y para la línea celular, se sembraron 25.000 células por pocillo. Para evaluar el efecto de diferentes citocinas sobre la capacidad de citotoxicidad, se añadió IL-12 recombinante (10 ng/ml) e IL18 (10 ng/ml) (que permanecieron presentes durante el resto del cocultivo). Después de 24 horas, se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante un ensayo del reportero de la luciferasa utilizando 3 μg/ml de luciferina y se midió con un lector Tecan.

Para los ensayos de citotoxicidad de células inmunitarias basados en Incucyte, los organoides se disociaron con la enzima TrypLE Express (ThermoFisher) y se sembraron 50.000 células en un medio de células γδ T de IMDM suplementado con 1:1000 de Pen Strep (ThermoFisher scientific), 1:1000 de glutamina estable (Capricorn scientific) y 10% de suero humano. Las células se preestimularon con 20 ng/ml de IFNγ y se incubaron con 1 μg/ml de anticuerpo anti-humano IL18BP Ultra-LEAF (BioLegend) o 1 μg/ml de anticuerpo recombinante Ultra-LEAF de isotipo IgG4 humano (BioLegend) durante 24 horas. Después de 24 horas, se sembraron 20.000 células en un medio de células GDT. Las células se estimularon con 10 ng/ml de IL-12 (PeproTech) y 1 ng/ml de IL18 (Peprotech). Para visualizar la citotoxicidad, se añadió el reactivo CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes (ThermoFisher scientific) en una concentración de 30 μl por 1 ml de medio. Inmediatamente después, las placas se colocaron en el sistema de análisis de células vivas Sartorius Incucyte S3. Se utilizó el software Sartorius Incucyte con la configuración estándar del tipo de escaneo. Se realizó un escaneo por pocillo cada hora durante 24 horas. La señal de fondo medida en los pocillos donde solo se añadió IFN-γ a los organoides tumorales se restó de las condiciones. Las células cancerosas solas y las células cancerosas solas con caspasa-3/7 se utilizaron como controles negativos.### Ensayo de reactividad para el cocultivo de células gamma delta T y organoides

Para las estimulaciones con citocinas durante el monocultivo y el cocultivo, las PBMCs expandidas de células γδ T se cultivaron en presencia o ausencia de PDTO MSI-3 en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 U/ml). Las células se estimularon con IL18 (1 ng/ml), IL12 (10 ng/ml) o ambos durante 24 horas. Para el experimento de bloqueo de IL18BP, las células se preestimularon con una dosis baja de IFNγ (20 ng/ml) antes del cocultivo y, posteriormente, se cultivaron durante 24 horas en IMDM suplementado con 10% de suero humano, IL-2 (150 U/ml), IL-12 (10 ng/ml) y anticuerpo bloqueador de IL18BP (Biolegend, 1 μg/ml) o control de isotipo (Biolegend, 1 μg/ml). Después de 24 horas, se añadió 1 μg/ml de IL18 recombinante a cada pocillo y se incubó durante 1 hora. A continuación, se añadieron células gamma delta T de diferentes donantes a las diferentes condiciones (a 50.000 células por pocillo). Para el experimento de bloqueo de IL18, las PBMCs expandidas de células γδ T se cocultivaron con PDTO MSI-3 en un medio de células γδ T (IMDM +10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 U/ml) e IL12 (10 ng/ml), en presencia o ausencia de un anticuerpo bloqueador de IL18 (MBL, clon 125-2H, 0,1 μg/ml).

Para todos los experimentos, las células se estimularon con 50 ng/mL de phorbol-12-miristato-13-acetato (Sigma-Aldrich) y 1 μg/mL de ionomicina (Sigma-Aldrich) como control positivo. Después de 1 h de incubación a 37 °C, se añadieron GolgiSTOP (BD Biosciences, 1:1500) y GolgiPlug (BD Biosciences, 1:1000). Después de 4 h de incubación, las células se lavaron e incubaron con un bloqueador del receptor Fc humano (BioLegend, 1:200) durante 20 min a 4 °C. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos de superficie celular: CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR Vδ1 – FITC (Invitrogen, 1:20), TCR AB-BV421 (Biolegend, 1:40) y un tinte de viabilidad de infrarrojo cercano (Life Technologies) en una proporción de 1:1000. A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando un tampón de fijación y un tampón de lavado de permeabilización para la tinción intracelular (BioLegend), y posteriormente se tiñeron con un anti-IFNG-APC (Biolegend, 1:40) durante 20 min a 4 °C. Se realizó la compensación utilizando CompBeads (BD Biosciences) y la citometría de flujo se realizó en un citómetro BD FACSymphony utilizando el software Diva. Para el análisis de los datos, se utilizó el software FlowJo versión 10.10.### Preparación de muestras para la secretómica

La secretómica se realizó utilizando un método de etiquetado metabólico publicado previamente, basado en una etiqueta de aminoácido no canónico derivado de la treonina (THRONCAT).^[64] En resumen, se sembraron cuatro organoides de CRC MMR-d/MSI en un medio de cultivo completo para CRC en duplicado, a una concentración de 1,6 × 10^6 células por réplica. Cinco días después, se añadió 0,5 mM de β-etinilserina (βES) al medio de cultivo completo durante 24 h para etiquetar metabólicamente las proteínas recién sintetizadas. Simultáneamente, se añadió 20 ng/mL de IFNγ a la mitad de las muestras. Después de 24 h, se recogió el medio de cultivo y se centrifugó durante 5 min a 1000 × g para sedimentar las células restantes. Se recogió el sobrenadante y se añadieron un inhibidor de proteasas (1:100, HaltTM) y un inhibidor de fosfatasas (1:100, HaltTM) al medio de cultivo antes de almacenar las muestras a -80 °C. Para el análisis del secretoma, se normalizó la cantidad total de proteína, midiendo la densidad óptica del contenido total de proteína de cada muestra en un equipo Beckman Coulter. Para el análisis del secretoma, se procesaron y midieron los medios de cultivo según lo descrito previamente,^[65], con la excepción de que, dependiendo del volumen de medio recogido, se utilizaron filtros de ultrafiltración Amicon Ultra de 3 kDa, de 15 mL o 50 mL (Merck Millipore UFC900324; UFC800308) según el protocolo del fabricante.### Espectrometría de masas

Antes del análisis por espectrometría de masas, los péptidos se reconstituyeron en un 2% de ácido fórmico. Las mezclas de péptidos se analizaron en el espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Scientific) conectado a un sistema de cromatografía líquida nano-LC Vanquish Neo (Thermo Scientific). El Vanquish Neo se operó en modo de "trampa y elución" y los péptidos se cargaron en una columna de trampa Pepmap 100 C18 de 5 μm (300 μm × 5 mm, Thermo Scientific), antes de la separación en la columna analítica (AUR325075C18TS, 1,7 μm/75 μm × 250 mm, Ionopticks o ES906, 2,0 μm/150 μm × 15 cm, Thermo Scientific). El disolvente A fue 0,1% de ácido fórmico/agua y el disolvente B fue 0,1% de ácido fórmico/80% de acetonitrilo. Los péptidos se analizaron en un método de LC-MS de 30 muestras por día (30SPD) con un gradiente no lineal. El Orbitrap Astral se ejecutó en modo de adquisición independiente de datos (DIA).### Análisis de datos de secretómica

Los datos brutos se analizaron con DIA-NN (versión 1.9.2)^[59] sin una biblioteca espectral y con la opción "Deep learning" habilitada. Se añadió la base de datos Swissprot Human (DIA-NN 1.9.2: 20.435, versión 2024_08) para la búsqueda sin biblioteca. La estrategia de cuantificación se estableció en Robust LC (alta precisión) para la versión 1.8.1 de DIA-NN y, para la versión 1.9.2 de DIA-NN, la estrategia de cuantificación se estableció en QuantUMS (alta precisión). Se habilitó la opción MBR y se mantuvieron todos los demás ajustes en los valores predeterminados. El informe de grupos de proteínas de DIA-NN se utilizó para el análisis posterior en Perseus (versión: 2.0.10.0 o posterior).^[66] Los valores se transformaron en log2, después de lo cual se filtraron las proteínas para que tuvieran al menos el 66% de valores válidos en al menos un grupo de muestras. Los valores faltantes se reemplazaron mediante la imputación basada en una distribución normal, utilizando una anchura de 0,3 y un desplazamiento mínimo hacia abajo de 2,4. Para centrarse en las proteínas verdaderamente secretadas, en lugar de la liberación inespecífica debido a la muerte celular, se filtraron las proteínas que no estaban anotadas como secretadas según el atlas de proteínas humanas.^[67] Las proteínas expresadas diferencialmente se determinaron utilizando un modelo lineal mixto con corrección para las réplicas (umbral mínimo: valor p ajustado ≤ 0,05). La expresión diferencial de IL18BP entre los organoides de CRC MSI ± estimulación con IFNγ se calculó utilizando una prueba t de Student pareada.### ELISA de IL18BP PDTO

En resumen, se sembraron tres organoides de CRC MMR-d/MSI y un organoide de colon sano en un medio completo AdDF+++ en duplicado, a una concentración de 1,0 × 10^6 células por réplica, con 20 ng/mL de IFNγ durante 24 h. Al día siguiente, las células se transfirieron mediante centrifugación y filtración, y se recogió y crioconservó el medio acondicionado hasta el ensayo. Las mediciones de IL18BP se realizaron utilizando ELISA según las instrucciones del fabricante del kit ELISA Human IL-18BP (ThermoFisher scientific #EHIL18BP). Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.

Análisis de datos clínicos

El Protocolo de Redescubrimiento de Fármacos (DRUP) es un ensayo clínico prospectivo, multicéntrico y no aleatorizado en curso, en el que los pacientes con tumores sólidos avanzados o metastásicos que han agotado todas las opciones de tratamiento estándar reciben tratamiento basado en el perfil molecular de su tumor con terapias dirigidas o inmunoterapias aprobadas fuera de su indicación registrada.^[26] Para los análisis clínicos, incluimos a pacientes con cánceres MMR-d tratados con bloqueo de PD-(L)1 de tres cohortes completadas con MMR-d/MSI-hi como un objetivo accionable.^[14],^[61] Para los pacientes en los que se dispuso de datos de secuenciación del genoma completo (WGS) (que son todos los pacientes incluidos en el análisis de biomarcadores basado en la transcriptómica), se confirmó el estado de microsatélite y se excluyeron de los análisis clínicos y de biomarcadores los pacientes con resultados discordantes de los diagnósticos de rutina. Se consideró que los pacientes eran evaluables según el protocolo del estudio si la respuesta era radiológica o clínicamente evaluable, si recibían al menos una (durvalumab) o dos (nivolumab) administraciones de tratamiento. La presencia de metástasis hepáticas se determinó en función de las lesiones (no) objetivo según las pautas RECIST v1.1 en la imagen basal. Para los análisis actuales, la medida de resultado primaria fue la supervivencia libre de progresión (SLP), todas evaluadas según las pautas RECIST v1.1^[62] o la Evaluación de la Respuesta en Neuro-Oncología (RANO).^[63] Para todos los pacientes con LM sin beneficio clínico, se analizó el patrón de progresión de la enfermedad. Tras la confirmación inicial de la enfermedad progresiva según RECIST 1.1, los pacientes se clasificaron como "progresión hepática aislada" si 1) desarrollaban nuevas lesiones hepáticas sin nuevas lesiones en otros sitios, o 2) progresión de las metástasis hepáticas existentes, pero no en otros sitios. Si los pacientes presentaban un aumento del volumen tumoral de las lesiones extrahepáticas o desarrollaban nuevas lesiones fuera del hígado, se clasificaron como "progresión sistémica". La carga tumoral se evaluó en la línea de base siguiendo el procedimiento RECIST v1.1, que toma la suma del diámetro más largo de las 5 lesiones objetivo como una estimación.

Para la validación de los hallazgos clínicos utilizando datos del mundo real, se realizó una solicitud de datos al Registro Nacional del Cáncer de los Países Bajos, que fue aprobada por su comité científico. Se solicitaron datos de respuesta de todos los pacientes adultos con CRC MMR-d (diagnosticados entre 2018 y 2023) que recibieron tratamiento de primera línea con ICB (nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab) y en los que se determinó la presencia de LM en la línea de base. Se excluyeron de los análisis los pacientes si: 1) se sometieron a un tratamiento quirúrgico de las metástasis hepáticas antes de la inmunoterapia, o 2) se administraron regímenes de inmunoterapia combinados (por ejemplo, anti-PD1 + anti-VEGF o TKI + anti-PD1). La respuesta al tratamiento fue evaluada por el médico tratante. Para estos pacientes, el estado de reparación de errores de emparejamiento se determinó mediante diagnósticos de rutina, sin embargo, no se dispuso de datos de WGS para su validación.

Preparación de bibliotecas y NGS

Las muestras se procesaron según lo descrito previamente en una instalación centralizada y estandarizada.^[28] En resumen, el ADN se extrajo de las muestras de biopsia y sangre utilizando un sistema automatizado (QiaSymphony) siguiendo los protocolos del fabricante (Qiagen). El ADN de la sangre se aisló con el kit DSP DNA Midi, mientras que el ADN del tejido se obtuvo utilizando el kit QIAsymphony DSP DNA Mini. Antes de la extracción de ADN del tejido, las biopsias se homogeneizaron en 100 mL de agua libre de nucleasas con el Qiagen TissueLyzer y se dividieron en dos porciones iguales para la extracción paralela de ADN y ARN utilizando QiaSymphony. El ARN se aisló con el kit QIAGEN QIAsymphony RNA, se procesó con el kit KAPA RNA Hyper + RiboErase HMR y se sometió a secuenciación de apareamiento en la plataforma Illumina NextSeq550 (2 × 75 pb) o en la plataforma Illumina NovaSeq6000 (2 × 150 pb).

Análisis de WGS

La secuenciación del genoma completo y el análisis de datos posterior se realizaron por la Hartwig Medical Foundation según lo descrito previamente,^[28], donde las lecturas se mapearon al genoma de referencia GRCh37. PURPLE (v.3.7.1), una herramienta del conjunto de herramientas HMF, se utilizó para calcular la carga mutacional tumoral (número de variantes de cambio de sentido por muestra) y la carga mutacional tumoral (número de variantes que cumplen los criterios por Mb).

Análisis de datos de ARN

Los datos de ARN-seq se procesaron utilizando Cutadapt para retener las lecturas de más de 35 nucleótidos y para eliminar los adaptadores TruSeq. Las lecturas filtradas se alinearon al genoma de referencia GRCh38 (Gencode v35) utilizando STAR (v2.7.10a) en modo de 2 pasos y se cuantificaron con featureCounts del paquete Subread (v2.0.1)^[60].

Los paquetes R edgeR^[58] (v.4.0.16) y limma^[55] (v.3.58.1) se utilizaron para probar los genes expresados diferencialmente. Primero, la función normLibSizes de EdgeR se utilizó para calcular los factores de normalización para generar los recuentos log2 por millón de lecturas (CPM) con la función voom de limma. A continuación, la expresión diferencial de los genes se calculó utilizando un modelo lineal de Limma con suavizado bayesiano empírico de los errores estándar. Se generó una matriz de contraste para definir las comparaciones pertinentes. Se utilizó la siguiente fórmula de diseño para el modelo lineal: Expresión ∼ CBLM + linfonodo + [intercepción]. Aquí, CBLM fue un factor que combinó el estado de LM y el beneficio clínico (CB). Debido a la gran cantidad de diferentes tipos de tumores en la cohorte, el tipo de tumor no se incluyó como covariable en el modelo lineal. Sin embargo, se corrigió para el muestreo de la biopsia del ganglio linfático, mediante el factor categórico linfonodo, ya que esta variable podría oscurecer los resultados relacionados con los genes y las firmas de las células inmunitarias.

Se siguió el mismo enfoque para el análisis de abundancia diferencial entre los pacientes IL18-alto (los que expresan el tercio superior) y los pacientes IL18-bajo (el tercio inferior), utilizando la siguiente fórmula de diseño: Expresión ∼ IL18.status + linfonodo + pureza + tumorGroups. Los genes se clasificaron en función de la diferencia del logaritmo de la relación de probabilidades entre las muestras IL18-alto e IL18-bajo para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Esto se realizó con la función fgsea() del paquete fgsea^[57] (v.1.28.0) y los conjuntos de genes de la colección Hallmark recuperados con el paquete msigdbr (v.7.5.1).

Análisis de células individuales

Se utilizaron datos de acceso público para el análisis de células individuales. Se descargaron datos de células inmunitarias procesados y anotados del portal de datos del Human Cell Atlas^[29] para visualizar la expresión génica de las células GD1 del intestino (Gut-VD1), del hígado (Liv-VD1) u otros órganos (Non-Gut-VD1). Primero, se seleccionaron manualmente las células anotadas como células T de memoria residentes en el tejido (Trm_Tgd) o células gd que expresan CRTAM (Tgd-CRTAM+) del conjunto de datos. A continuación, se seleccionaron las células que expresan TRDV1, un gen que codifica el TCR GD1+ VD1. Luego, se clasificaron las células gd en función de la variable de metadatos Organ. Las células originadas del ciego (CAE), duodeno (DUO), íleon (ILE), yeyuno proximal (JEJUPI), yeyuno proximal inferior (JEJLP), colon sigmoide (SCL) y colon transverso (TCL) se clasificaron como Gut-VD1, las del hígado (LIV) se clasificaron como Liv-VD1, mientras que las del médula ósea (BMA) y el pulmón (LNG) se clasificaron como other-VD1.

Procesamiento de muestras de tejido

Las lesiones de tumores sólidos se seleccionaron macroscópicamente del material tumoral resecado y se recogieron partes del tejido en un medio de recolección frío Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 10 mM de HEPES (GIBCO) y 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina (GIBCO)). Los materiales de tejido recogidos se procesaron inmediatamente mediante disociación mecánica manual en fragmentos pequeños. Después del procesamiento, los fragmentos se congelaron en crioviales que contenían 1 ml de FBS con 10% de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich). Todos los fragmentos de tejido se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.

Digestión de muestras de tejido y análisis citométrico de flujo de células inmunitarias residentes en el tejido

Los viales con fragmentos de tejido crioconservados se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y, posteriormente, se lavaron en un medio HBSS (Gibco) caliente, enjuagándolos varias veces en un tamiz celular en una placa de 6 pocillos. A continuación, los fragmentos se procesaron en suspensiones de células individuales mediante digestión enzimática en una mezcla de digestión (HBSS (Gibco) con 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco), 12,6 μg/ml de Pulmozyme (Roche) y 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich)) durante 45-60 minutos a 37 °C y bajo una rotación lenta. La actividad enzimática se neutralizó mediante la adición de HBSS frío. A continuación, las muestras se lavaron con HBSS (Gibco), se filtraron a través de una malla de filtro de 40 μm y las estructuras de tejido restantes se trituraron. A continuación, se eliminó la fracción de células epiteliales mediante centrifugación (50 g durante 4 minutos) y los restos celulares se eliminaron mediante separación por gradiente de densidad con el kit de eliminación de restos (Miltenyi biotech). Para la inmunofenotipificación, las células se resuspendieron directamente en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente bloqueador del receptor Fc (eBioscience), seguido de una tinción de viabilidad con un tinte de viabilidad IR cercano (Life Technologies) durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron, se resuspendieron en 150 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: CD4-BUV805 (BD Biosciences, 1:200), CD8-BUV563 (BD Biosciences, 1:200), CD56-BUV395 (BD Biosciences, 1:100), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40), VD2-TCR-FITC (Biolegend 1:50), CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR VA24-Ja18-BV421 (Biolegend, 1:50), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), IL18R1-APC (eBiosciences, 1:50).

Para los experimentos de estimulación con citocinas, las células se cultivaron durante 24 horas en un medio de células T γδ (IMDM (Gibco) + 10% de suero humano (Sigma-Aldrich), suplementado con 150 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15) con la adición de combinaciones de citocinas de interés, a saber, IL-12 recombinante (Peprotech, 10 ng/ml) e IL18 (Peprotech, 10 ng/ml). Se recogió una parte del sobrenadante para los ensayos de citocinas. A continuación, se añadió Golgi-Plug (1:1000, BD) y Golgi-Stop (1:1500, BD) y se continuó el cultivo durante 3 horas más. A continuación, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en 50 μl de PBS y se incubaron con un agente bloqueador del receptor Fc (eBioscience) y, posteriormente, con un tinte LIVE/DEAD IR (Life Sciences) durante 20 minutos a 4 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción: VD1-TCR-FITC (Invitrogen, 1:20), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), CD45-AF700 (Biolegend, 1:50), SIGIRR-PE (Invitrogen, 1:50), IFNγ-APC (BD Biosciences, 1:40), IL-2-BV750 (BD Biosciences, 1:50), CD107-PE-Cy7 (Biolegend, 1:50). Antes de la tinción, las células se lavaron, se resuspendieron en 50 μl de tampón de tinción (PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich), EDTA) que contenía los anticuerpos mencionados anteriormente y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces, seguido de la fijación y permeabilización utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), y luego se realizó la tinción de las proteínas intracelulares. Todos los experimentos se realizaron utilizando un citómetro BD FACSymphony con el software Diva. Los análisis de los datos de citometría de flujo se realizaron con el software FlowJo versión 10.10.

Análisis de citocinas inflamatorias en el plasma de los pacientes

Las muestras de plasma de los pacientes se recogieron como parte del estudio DRUP^[26] y se analizaron mediante el panel de inflamación humana Legendplex (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma se obtuvieron antes del tratamiento a partir de muestras de sangre total (Streck). Las lecturas se realizaron utilizando un iQue 3 (Sartorius) con el software Forecyt estándar. El análisis de los datos de citometría de flujo se realizó en el conjunto de software de análisis de datos LEGENDplex proporcionado.

Para medir IL18BP en el plasma de los pacientes, se utilizaron las mismas muestras que para las mediciones de IL18. Las mediciones se realizaron utilizando el kit ELISA Human IL-18BP (ThermoFisher scientific #EHIL18BP) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.

Cultivo de organoides

Los organoides tumorales se derivaron de pacientes con CRC MMR-d a partir de especímenes de resección, como se informó anteriormente.^[48],^[49] Los pacientes eran elegibles si las pruebas moleculares de rutina demostraban MMR-d mediante la pérdida de tinción de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2) mediante inmunohistoquímica (IHC) o MSI-H mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de próxima generación basada en paneles (NGS) o secuenciación del genoma completo (WGS) del tumor original del paciente. El muestreo fue aprobado por el Comité de Ética Médica del NKI-AvL (NL48824.031.14) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. En resumen, el tejido tumoral se disoció mecánicamente y se digirió con 1,5 mg/ml de colagenasa II (Sigma-Aldrich), 10 μg/ml de hialuronidasa tipo IV (Sigma-Aldrich) y 10 μM de Y-27632 (Sigma-Aldrich). Las células se colocaron en Cultrex RGF BME tipo 2 (3533-005-02, R&D systems) y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos, y luego se añadió el medio de organoides de CRC. El medio se utilizó como se describió anteriormente y se compone de Ad-DF+++ (Advanced DMEM/F12 (GIBCO) suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 10 mM de HEPES (GIBCO), 100 U/ml de cada uno de penicilina y estreptomicina (GIBCO), 10% de medio acondicionado con noggin, 20% de medio acondicionado con R-spondin1, 1× suplemento B27 sin vitamina A (GIBCO), 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 10 mM de nicotinamida (Sigma-Aldrich), 50 ng/ml de EGF humano recombinante (Peprotech), 500 nM de A83-01 (Tocris) y 10 nM de prostaglandina E2 (Cayman Chemicals). Los organoides se pasaron cada semana, mediante disociación enzimática con TrypLE Express (Gibco), lavado y posterior inclusión en BME. Los organoides se autenticaron mediante un array de SNP, se probaron mensualmente para detectar Mycoplasma mediante PCR de Mycoplasma 43 y el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert (LT07-318). En las dos primeras semanas del cultivo de organoides, se añadió 1× Primocin (Invivogen) para prevenir la contaminación microbiana.

Selección y expansión de células T γδ de PBMCs de donantes sanos

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de leucocitos de donantes sanos utilizando la separación por gradiente de densidad de Ficoll-Paque (medio de separación de células Lympholyte-H, Tebubio) y se crioconservaron hasta su uso posterior. Las PBMCs se descongelaron en un medio de descongelación de células T precalentado compuesto por RPMI 1640 (Gibco), suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I (Lonza), 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco) y 10% de FC. A continuación, las células se trataron con 25 U/ml de benzonasa (Merck) durante 15 minutos, se lavaron y se resuspendieron en 2x106 células/ml de medio de cultivo de células T (IMDM 1640 suplementado con 2 mM de Ultraglutamina I, 100/100 U/ml de penicilina/estreptomicina y 10% de suero humano) en presencia de 150 U/ml de IL-2 (Peprotech). A continuación, las células T γδ se preenriquecieron antes de la clasificación utilizando el kit de aislamiento de células T TCR γ/δ+ (Miltenyi biotec) utilizando la clasificación celular asistida por campos magnéticos, según el protocolo del fabricante. A continuación, todo el conjunto de células T gamma delta se tiñó con NiR live dead, CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR-AB-BV421 (Biolegend, 1:40), VD1-TCR-PE-Cy7 (Invitrogen; 1:40) durante 25 minutos a 4 °C. Las células simples, vivas, CD3+, TCRa/b-, TCR YD+, Vδ1+ se clasificaron en el FACS Aria III 4L (BD Biosciences) en condiciones estériles para el cultivo posterior de células. A continuación, las células se expandieron en un medio que contenía células alimentadoras irradiadas. Se añadió 1 μg de fitohemaglutinina-L (PHA), 1000 U/ml de IL-2 y 10 ng/ml de IL-15 durante dos o tres semanas. El medio con citocinas se renovó después de los primeros 7 días y, posteriormente, cada 2 días. Después del protocolo de expansión, se evaluó la pureza de las células T γδ Vδ1+ mediante citometría de flujo y las células se crioconservaron en FCS con 10% de DMSO.

Ensayo de citotoxicidad

Para evaluar la citotoxicidad mediada por las células T gamma-delta de los organoides tumorales y las líneas celulares, los organoides y las líneas celulares se transfectaron previamente con el gen del reportero de la luciferasa utilizando pLenti CMV Puro LUC (w168-1; Plasmid #17477; Addgene). Tres días antes del ensayo de citotoxicidad, las PBMCs expandidas de células T γδ se descongelaron y se dejaron en reposo durante tres días en un medio de células T γδ (IMDM +10% de suero humano, suplementado con 150 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15). Después de tres días, los organoides se aislaron de geltrex y se disociaron en células individuales y se contaron. Las células se sembraron en una proporción efector/objetivo de 1:1 en un medio de células T γδ. Para los organoides, se sembraron 50.000 células por pocillo, y para la línea celular, se sembraron 25.000 células por pocillo. Para evaluar el efecto de las diferentes citocinas sobre la capacidad de citotoxicidad, se añadió IL-12 recombinante (10 ng/ml) e IL18 (10 ng/ml) (que permanecieron presentes durante el resto del cocultivo). Después de 24 horas, se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante un ensayo del reportero de la luciferasa utilizando 3 μg/ml de luciferina y se midió con un lector Tecan.

Para los ensayos de citotoxicidad de células inmunitarias basados en Incucyte, los organoides se disociaron con la enzima TrypLE Express (ThermoFisher) y se sembraron 50.000 células en un medio de células T γδ de IMDM suplementado con 1:1000 de Pen Strep (ThermoFisher scientific), 1:1000 de glutamina estable (Capricorn scientific) y 10% de suero humano. Las células se preestimularon con 20 ng/ml de IFNγ y se incubaron con 1 μg/ml de anticuerpo anti-humano IL18BP Ultra-LEAF purificado (BioLegend) o 1 μg/ml de anticuerpo recombinante Ultra-LEAF purificado IgG4 isotipo control humano (BioLegend) durante 24 horas. Después de 24 horas, se sembraron 20.000 células en un medio de células T γδ. Las células se estimularon con 10 ng/ml de IL-12 (PeproTech) y 1 ng/ml de IL18 (Peprotech). Para visualizar la citotoxicidad, se añadió el reactivo CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes (ThermoFisher scientific) en una concentración de 30 μl por 1 ml de medio. Inmediatamente después, las placas se colocaron en el sistema de análisis de células vivas Sartorius Incucyte S3. Se utilizó el software Sartorius Incucyte con la configuración estándar del tipo de escaneo. Se realizó un escaneo por pocillo cada hora durante 24 horas. Se restó la señal de fondo medida en los pocillos donde solo se añadió IFN-γ a los organoides tumorales de las condiciones. Las células cancerosas solas y las células cancerosas solas con caspasa-3/7 se utilizaron como controles negativos.

Ensayo de reactividad para el cocultivo de células T gamma-delta y organoides

SPANISH TRANSLATION:

Para las estimulaciones con citocinas durante los cultivos de monocapa y cocultivo, las células γδ T expandidas de las PBMC se cultivaron en presencia o ausencia de PDTO MSI-3 en un medio de cultivo de células γδ T (IMDM + 10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 u/ml). Las células se estimularon con IL18 (1 ng/ml), IL12 (10 ng/ml) o ambos durante 24 horas. Para el experimento de bloqueo de IL18BP, las células se preestimularon con una dosis baja de IFNγ (20 ng/ml) antes del cocultivo, y posteriormente se cultivaron durante 24 horas en IMDM suplementado con 10% de suero humano, IL-2 (150 u/ml), IL-12 (10 ng/ml) y el anticuerpo de bloqueo de IL18BP (Biolegend, 1 μg/ml) o el control isotípico (Biolegend, 1 μg/ml). Después de 24 horas, se añadió 1 μg/ml de IL18 recombinante a cada pocillo e se incubó durante 1 hora. A continuación, se añadieron células γ delta T de diferentes donantes a las diferentes condiciones (a 50.000 células por pocillo). Para el experimento de bloqueo de IL18, las células γδ T expandidas de las PBMC se cocultivaron junto con PDTO MSI-3 en un medio de cultivo de células γδ T (IMDM + 10% de suero humano), suplementado con IL-2 (150 u/ml) e IL12 (10 ng/ml), en presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo de IL18 (MBL, clon 125-2H, 0,1 μg/ml).

Para todos los experimentos, las células se estimularon con 50 ng/ml de phorbol-12-miristato-13-acetato (Sigma-Aldrich) y 1 μg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich) como control positivo. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, se añadieron GolgiSTOP (BD Biosciences, 1:1500) y GolgiPlug (BD Biosciences, 1:1000). Después de 4 horas de incubación, las células se lavaron e incubaron con el bloqueador del receptor Fc humano (BioLegend, 1:200) durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos de superficie celular: CD3-BB700 (BD Biosciences, 1:160), TCR Vδ1 – FITC (Invitrogen, 1:20), TCR AB-BV421 (Biolegend, 1:40) y un tinte de viabilidad de infrarrojo cercano 1:1000 (Life Technologies). A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando un tampón de fijación y un tampón de lavado de permeabilización para la tinción intracelular (BioLegend), y posteriormente se tiñeron con un anti-IFNG-APC (Biolegend, 1:40) durante 20 minutos a 4 °C. La compensación se realizó utilizando CompBeads (BD Biosciences) y la citometría de flujo se realizó en un citómetro BD FACSymphony utilizando el software Diva. Los análisis de datos se realizaron con el software FlowJo versión 10.10.

Preparación de muestras para la secretómica

La secretómica se realizó utilizando un método de etiquetado metabólico publicado previamente basado en una etiqueta de aminoácido no canónico derivado de la treonina (THRONCAT).^[64] En resumen, se sembraron cuatro organoides de CRC MMR-d/MSI en un medio de cultivo completo de CRC en duplicado a 1,6 × 10^6 células por réplica. Cinco días después, se añadió 0,5 mM de β-etinilserina (βES) al medio de cultivo completo durante 24 horas para etiquetar metabólicamente las proteínas sintetizadas recientemente. Simultáneamente, se añadió 20 ng/ml de IFNγ a la mitad de las muestras. Después de 24 horas, se recogió el medio de cultivo y se centrifugó durante 5 minutos a 1000 × g para separar las células restantes. Se recogió el sobrenadante y se añadieron un inhibidor de proteasas (1:100, HaltTM) y un inhibidor de fosfatasas (1:100, HaltTM) al medio de cultivo antes de almacenar las muestras a -80 °C. El material de entrada para el análisis del secretoma se normalizó a la cantidad total de proteína, midiendo la densidad óptica del contenido total de proteína de cada muestra en un equipo Beckman Coulter. Para el análisis del secretoma, el medio de cultivo se procesó y se midió como se describió anteriormente,^[65] con la excepción de que, dependiendo del volumen de medio recogido, se utilizaron filtros de ultrafiltración Amicon Ultra de 3 kDa de 15 ml o 50 ml (Merck Millipore UFC900324; UFC800308) según el protocolo del fabricante.

Espectrometría de masas

Antes del análisis por espectrometría de masas, los péptidos se reconstituyeron en un 2% de ácido fórmico. Las mezclas de péptidos se analizaron en el espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Scientific) conectado a un sistema de cromatografía líquida nano-LC Vanquish Neo (Thermo Scientific). El Vanquish Neo se operó en modo de "trampa y elución" y los péptidos se cargaron en una columna de trampa Pepmap 100 C18 de 5 μm (300 μm × 5 mm, Thermo Scientific), antes de la separación en la columna analítica (AUR325075C18TS, 1,7 μm/75 μm × 250 mm, Ionopticks o ES906, 2,0 μm/150 μm × 15 cm, Thermo Scientific). El disolvente A fue 0,1% de ácido fórmico/agua y el disolvente B fue 0,1% de ácido fórmico/80% de acetonitrilo. Los péptidos se analizaron en un método de LC-MS de 30 muestras por día (30SPD) con un gradiente no lineal. El Orbitrap Astral se ejecutó en modo de adquisición independiente de datos (DIA).

Análisis de datos de secretómica

Los datos brutos se analizaron con DIA-NN (versión 1.9.2)^[59] sin una biblioteca espectral y con la opción "aprendizaje profundo" habilitada. Se añadió la base de datos Swissprot Human (DIA-NN 1.9.2: 20.435, versión 2024_08) para la búsqueda sin biblioteca. La estrategia de cuantificación se estableció en Robust LC (alta precisión) para la versión 1.8.1 de DIA-NN y, para la versión 1.9.2 de DIA-NN, la estrategia de cuantificación se estableció en QuantUMS (alta precisión). Se habilitó la opción MBR y el resto de los ajustes se mantuvieron en los valores predeterminados. El informe de grupos de proteínas de DIA-NN se utilizó para el análisis posterior en Perseus (versión: 2.0.10.0 o posterior).^[66] Los valores se transformaron en log2, tras lo cual se filtraron las proteínas para que tuvieran al menos un 66% de valores válidos en al menos un grupo de muestras. Los valores faltantes se reemplazaron mediante la imputación basada en una distribución normal utilizando un ancho de 0,3 y un desplazamiento mínimo hacia abajo de 2,4. Para centrarse en las proteínas verdaderamente secretadas, en lugar de la liberación inespecífica debido a la muerte celular, se filtraron las proteínas que no estaban anotadas como secretadas según el atlas de proteínas humanas.^[67] Las proteínas expresadas diferencialmente se determinaron utilizando un modelo lineal mixto con corrección para las réplicas (umbral mínimo: valor p ajustado ≤ 0,05). La expresión diferencial de IL18BP entre los organoides de CRC MSI ± estimulación con IFNγ se calculó utilizando una prueba t de Student pareada.

ELISA de IL18BP PDTO

En resumen, se sembraron tres organoides de CRC MMR-d/MSI y un organoide de colon sano en un medio completo AdDF+++ en duplicado a 1,0 × 10^6 células por réplica, con 20 ng/ml de IFNγ durante 24 horas. Al día siguiente, las células se transfirieron mediante centrifugación y filtración, y se recogió el medio acondicionado y se crioconservó hasta el ensayo. Las mediciones de IL18BP se realizaron utilizando ELISA según las instrucciones del fabricante del kit ELISA para IL-18BP humano (ThermoFisher scientific #EHIL18BP). Se utilizó un lector de placas Tecan Infinite M200 para la lectura de la absorbancia a 450 nm.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos para los análisis clínicos y bioinformáticos se realizaron utilizando R versión 4.2.2 o Python versión 3.8. Las características de los pacientes y las respuestas tumorales se resumieron utilizando estadísticas descriptivas. Las diferencias en CB entre los grupos metastásicos se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher (variables categóricas), la prueba de Wilcoxon (variables continuas) y la prueba de asociación lineal por lineal (variables ordinales). Se utilizaron los métodos de Kaplan-Meier para estimar la supervivencia libre de progresión (SLP) (calculada desde el inicio del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad o la muerte por cualquier causa, censurando a los pacientes que estaban vivos sin progresión). Para los análisis de expresión génica diferencial, se utilizaron regresiones basadas en limma-voom de dos colas con corrección para pruebas múltiples.

Para los análisis traslacionales e in vitro, los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 10.4.1. El tamaño de los grupos y la definición de las barras de error se indican en las leyendas de las figuras. Se realizó un análisis estadístico utilizando una prueba t de Student de dos colas. Los valores p < 0,05 se consideraron significativos; los valores de significación se indican como * (p < 0,05), (p < 0,01) y * (p < 0,001).