El ejercicio preoperatorio induce células de Kupffer con actividad antitumoral para prevenir la metástasis hepática del cáncer colorrectal, la cual se ve favorecida por el estrés quirúrgico.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado y ocupa el segundo lugar en muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo; aproximadamente el 50% de los pacientes con CCR desarrollan finalmente metástasis hepáticas.^[1] La resección quirúrgica de las metástasis hepáticas, cuando es factible, ofrece a alrededor del 15-20% de los pacientes la posibilidad de mejorar la supervivencia general y libre de enfermedad.^[2],^[3] Sin embargo, no todos los pacientes se benefician de la cirugía curativa, ya que el 50-60% de los pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (MHC) experimentan una recurrencia en el hígado tras la resección.^[4],^[5] Esta recurrencia a menudo se ve impulsada por el crecimiento de micrometástasis no detectadas o la diseminación de células tumorales durante el procedimiento quirúrgico, ambos influenciados por los cambios en el período perioperatorio.^[6],^[7],^[8] Las alteraciones inmunitarias inducidas por la cirugía pueden alterar el entorno inmunitario tumor-huésped, lo que puede facilitar la recurrencia tumoral.^[9] Tanto la inflamación sistémica como la local que se produce tras la cirugía se han relacionado directamente con peores resultados en el CCR.^[10],^[11] A pesar de estas correlaciones conocidas, nuestra comprensión de cómo la inflamación desencadenada por la cirugía potencia la recurrencia tumoral sigue siendo limitada.

Durante la resección hepática en pacientes con MHC, la maniobra de Pringle, una técnica de oclusión del flujo vascular que implica la compresión del pedículo hepático para controlar la hemorragia intraoperatoria, induce una lesión de isquemia/reperfusion (I/R) hepática.^[12] El daño isquémico directo y la inflamación excesiva que se produce tras la restauración del flujo sanguíneo^[13] aumentan significativamente el riesgo de recurrencia hepática tras la resección de MHC.^[14],^[15],^[16] La inflamación es un potente impulsor de la tumorigénesis, ya que promueve tanto la iniciación como la metástasis tumoral al cultivar un microentorno favorable para el tumor.^[17] Los sitios de lesión son áreas preferenciales para el crecimiento tumoral, y se ha demostrado que el trauma quirúrgico aumenta la metástasis locorregional.^[18] Por lo tanto, aliviar la inflamación hepática inducida por el estrés quirúrgico perioperatorio es crucial para reducir la recurrencia de MHC tras la cirugía.

El ejercicio regular se reconoce cada vez más como una estrategia terapéutica para el cáncer debido a su capacidad para modular la respuesta inmunitaria al mejorar la movilización y la infiltración de células inmunitarias antitumorales.^[19],^[20],^[21] Se ha asociado el ejercicio con un menor riesgo de mortalidad específica por CCR, tanto antes como después del diagnóstico de CCR.^[22] Se ha demostrado que la terapia con ejercicio preoperatorio (TEP) es eficaz para aliviar las complicaciones postoperatorias y mejorar los resultados clínicos en pacientes con cáncer sometidos a cirugía.^[23],^[24] Se ha demostrado que la supresión tumoral inducida por el ejercicio está relacionada con la inmunidad,^[25] y se ha demostrado que la TEP modula directamente el microentorno inmunitario hepático^[26]. Nuestro estudio previo demostró que solo cuatro semanas de TEP aeróbica atenuaron significativamente la inflamación y la lesión hepática derivadas de la lesión de I/R hepática. Específicamente, la TEP dirige a las células de Kupffer (CK) hacia un fenotipo antiinflamatorio con inmunidad entrenada a través de la reprogramación metabólica.^[27] Sin embargo, aún se desconoce si la TEP protege contra la lesión de I/R hepática que promueve la MHC. Obtener información sobre los mecanismos de la TEP podría allanar el camino para el desarrollo de miméticos farmacológicos del ejercicio, lo que podría ofrecer beneficios potenciales para los pacientes con MHC que no toleran el ejercicio.

Las CK, los macrófagos residentes del hígado, desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis hepática^[28] y exhiben funciones duales en la metástasis tumoral.^[29],^[30] Si bien las CK pueden eliminar directamente las células tumorales y secretar quimiocinas para reclutar células inmunitarias y mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral,^[31],^[32],^[33],^[34], también pueden facilitar la metástasis hepática al secretar citocinas pro-tumorales que crean un entorno favorable para el crecimiento tumoral.^[35] Estas funciones contrastantes de las CK están determinadas por el microentorno circundante y los estímulos externos.^[36] Comprender cómo modular la actividad de las CK es esencial para desarrollar estrategias para prevenir la metástasis hepática.

En este estudio, utilizamos un modelo de ratón clínicamente relevante de estrés quirúrgico que promueve la MHC, junto con un ensayo controlado aleatorio que involucra a pacientes con MHC sometidos a TEP, para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a los efectos de la TEP sobre la MHC promovida por el estrés quirúrgico. Los análisis exhaustivos del microentorno inmunitario hepático revelaron que 4 semanas de TEP reprogramaron las CK hacia un fenotipo antitumoral. Esta reprogramación se caracterizó por un aumento de la liberación de citocinas citotóxicas, que eliminaron directamente las células tumorales, así como por un aumento del reclutamiento y la activación de las células T CD8+ a través del eje CXCL9-CXCR3. Además, la acumulación de butirato inducida por la TEP aumentó la expresión de CXCL9 al inhibir la actividad de la histona desacetilasa 3 (HDAC3) en las CK. En particular, la TEP también elevó la expresión de CXCL9 en las CK y en la sangre periférica de los pacientes con MHC. Estos hallazgos dilucidan los mecanismos por los cuales la TEP modula la función antitumoral de las CK, lo que en última instancia mitiga la MHC promovida por el estrés quirúrgico.

Resultados

La TEP suprime la MHC promovida por el estrés quirúrgico y remodela el microentorno inmunitario del hígado

Para evaluar el impacto de la TEP en la MHC promovida por el estrés quirúrgico, empleamos un régimen de ejercicio de cinta de correr de intensidad moderada (12,5 metros/min, 60 min/día y 5 días/semana, durante 4 semanas) en un modelo de ratón de metástasis hepática promovida por el estrés quirúrgico.^[27],^[37] Implantamos células de CRC MC38 que expresan luciferasa en los hígados de ratones sedentarios (Sed) o sometidos a TEP mediante inyección en la vena porta, seguida de I/R hepática para simular el estrés quirúrgico (Figura 1A). Se monitorizó el crecimiento tumoral semanalmente mediante un sistema de imagen in vivo (IVIS). Descubrimos que la progresión de la metástasis se redujo significativamente en el grupo de TEP en comparación con los ratones Sed después de 2 semanas de la inyección del tumor (Figura 1B). En particular, los ratones sometidos a TEP mostraron una menor carga tumoral, evidenciada por la menor cantidad de nódulos metastásicos y la reducción de la relación hígado-peso corporal (Figuras 1C y 1D). En contraste, en ausencia de estrés quirúrgico (sin I/R hepática), los ratones sometidos a TEP y Sed mostraron una tasa de crecimiento tumoral y una carga tumoral comparables (Figuras S1A-S1D). Para validar aún más estos hallazgos, utilizamos células CT26, un modelo de líneas celulares de CRC poco inmunogénicas, en nuestro modelo. Sin embargo, la TEP no suprimió la MHC promovida por el estrés quirúrgico en el modelo de tumores de células CT26 (Figuras S1E-S1H).

Para investigar los efectos de la TEP en el microentorno inmunitario hepático en la MHC promovida por el estrés quirúrgico, realizamos un secuenciamiento de ARN unicelular imparcial (scRNA-seq) del microentorno inmunitario en los tejidos hepáticos de los ratones Sed y sometidos a TEP 3 semanas después del establecimiento del modelo. Utilizando la aproximación y proyección de múltiples UMAP, identificamos la distribución y las identidades de los grupos celulares. Tras el filtrado cualitativo y la exclusión de las células CD45-, obtuvimos 23.922 células con transcriptomas de alta calidad y las clasificamos en nueve tipos de células: CK, células dendríticas (CD), monocitos, neutrófilos, células B, células T CD4+, células T CD8+, células T asesinas naturales (NKT) y células asesinas naturales (NK) (Figura 1E). La TEP alteró significativamente el transcriptoma de las CK, caracterizado por una disminución de la abundancia del grupo de CK en la región inferior de UMAP y un aumento de la abundancia en la región superior. Además, la TEP aumentó la abundancia de los grupos de células B y NKT, al tiempo que redujo los grupos de neutrófilos y monocitos en comparación con el grupo Sed. Además, el análisis de genes expresados diferencialmente (DEG) en las células inmunitarias hepáticas reveló que el hígado sometido a TEP exhibió una regulación al alza de los genes antitumorales, incluidos Cxcl9^[38], Cd40Ig^[39], Ahnak^[40], Cxcl10^[41] y Ifngas1^[42] en las CK, las células T CD8+, las células B, las CD y las células NKT, respectivamente (Figura S1I). En conjunto, estos resultados sugieren que la TEP puede remodelar el microentorno inmunitario hepático y asociarse potencialmente con la inmunidad antitumoral en el contexto de la MHC promovida por el estrés quirúrgico.

Coherente con nuestros hallazgos anteriores de que 4 semanas de TEP modifican el fenotipo de las CK,^[27], observamos cambios transcriptómicos significativos en las CK tras la TEP en nuestro modelo tumoral. Para explorar aún más el papel de las CK, identificamos ocho poblaciones distintas de CK en el hígado en función de la expresión de marcadores (Figura 1F). Los grupos 2, 6 y 7, enriquecidos en genes relacionados con un fenotipo antitumoral (Cxcl9^[38], H2-Aa^[43], H2-Eb1^[43] y H2-Ab1^[43]), se observaron predominantemente en los ratones sometidos a TEP, mientras que los grupos 0, 1, 3 y 4, caracterizados por genes relacionados con fenotipos pro-tumorales o inmunosupresores (Apoc1^[44], Ccl24^[45], Fabp7^[46], Cd5l^[47] y Vsig4^[48]), se presentaron principalmente en los ratones Sed (Figuras 1G y S1J). Estos hallazgos sugieren que la TEP promueve la expresión de genes antitumorales al tiempo que suprime la expresión de genes pro-tumorales en las CK en la condición de MHC promovida por el estrés quirúrgico.

Las CK son esenciales para aliviar la MHC promovida por el estrés quirúrgico tras la TEP

Luego, hipotetizamos que el perfil transcriptómico antitumoral inducido por la TEP en las CK es potencialmente beneficioso para la MHC promovida por el estrés quirúrgico. Para evaluar la necesidad de las CK en los efectos protectores inducidos por la TEP, generamos ratones KC-DTR con expresión del receptor de toxina diftérica (DTR) específicamente en las CK. En comparación con los ratones de control R26LSL-DTR, la administración de toxina diftérica (DT) en los ratones KC-DTR resultó en una depleción casi completa de las CK en 24 horas, según lo confirmado por citometría de flujo (Figura S2A). Se administró DT por vía intraperitoneal a los ratones de control R26LSL-DTR y KC-DTR de los grupos Sed y TEP 24 horas antes de la inyección del tumor^[29] (Figura 2A). La depleción de las CK abolió los efectos protectores de la TEP, sin que se observara una diferencia significativa en el crecimiento tumoral entre los ratones Sed y TEP KC-DTR (Figuras 2B-2D y S2B).

Para validar aún más el papel de las CK en los efectos antitumorales inducidos por la TEP, realizamos experimentos de transferencia adoptiva. A los ratones KC-DTR Sed o sometidos a TEP, con depleción de CK, se les transfirió de forma adoptiva CK de tipo salvaje (WT) de ratones Sed o sometidos a TEP 12 horas antes de la inyección del tumor (Figura 2E). La transferencia adoptiva de CK de ratones WT sometidos a TEP protegió significativamente contra la MHC promovida por el estrés quirúrgico, independientemente del estado de ejercicio de los ratones receptores, mientras que la transferencia adoptiva de CK derivadas de Sed no tuvo ningún efecto protector (Figuras 2F-2H y S2C). Estos resultados demuestran que los efectos protectores de la TEP en el alivio de la MHC promovida por el estrés quirúrgico dependen de las CK.

La TEP mejora la inmunidad antitumoral de las CK al modular la secreción de citocinas

Para investigar cómo la TEP modula las CK en el modelo de MHC promovida por el estrés quirúrgico, primero evaluamos sus efectos sobre la abundancia de CK y no encontramos diferencias en el porcentaje de CK hepáticas entre los grupos Sed y TEP (Figura S2D). Posteriormente, exploramos las alteraciones moleculares y las vías involucradas en las CK asociadas a la TEP en comparación con las CK asociadas a Sed. El análisis de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) reveló que los DEG se enriquecieron en la interacción citocina-receptor de citocinas (Figura S2E); el análisis de la ontología génica (GO) identificó un enriquecimiento en términos relacionados con la migración y la quimiotaxis de los leucocitos (Figura S2F). Para investigar aún más cómo la TEP influye en la actividad antitumoral de las CK, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. El análisis reveló un enriquecimiento significativo de conjuntos de genes asociados con "vías en el cáncer" (Figura S2G). Además, el análisis de la vía de Reactome reveló un enriquecimiento de la vía de orientación co-traduccional dependiente de la partícula de reconocimiento de señales, que es esencial para mediar la secreción de proteínas^[49] (Figura S2H). En conjunto, estos datos relacionaron la TEP con la secreción de citocinas, el reclutamiento de células inmunitarias y las funciones antitumorales.

Las células de Kupffer (KCs) previenen la metástasis hepática al eliminar directamente las células tumorales mediante la fagocitosis y la liberación de moléculas citolíticas.^[30] Para investigar más a fondo el impacto del PEx en la secreción de citocinas por parte de las KCs, aislamos KCs de ratones Sed y PEx y los cocultivamos con células MC38-GFP^[50] para medir los niveles de citocinas antitumorales y pro-tumorales (Figura 2I). Curiosamente, las KCs-PEx produjeron niveles significativamente más bajos de citocinas pro-tumorales (interleucina [IL]-10 y factor de crecimiento transformante [TGF] β)^[51] y niveles más altos de citocinas antitumorales (interferón [IFN]-γ, factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α] e IL-12)^[34],^[52] en comparación con las KCs-Sed (Figuras 2J y 2K). Además, no detectamos una diferencia significativa en la actividad fagocítica de las KCs entre los grupos Sed y PEx (Figuras 2L y S2I). Estos resultados sugieren que el PEx ejerce su efecto protector en la CRLM promovida por el estrés quirúrgico modulando el perfil de secreción de citocinas de las KCs, en lugar de alterar su cantidad o actividad fagocítica contra las células tumorales.### El PEx aumenta la liberación de CXCL9 por parte de las KCs y promueve el reclutamiento de células CD8+ CXCR3+

Dado que las KCs también secretan quimiocinas y citocinas para reclutar y activar las células inmunitarias, amplificando así la respuesta antitumoral,^[30] utilizamos el análisis CellPhoneDB para examinar las diferencias en la comunicación celular entre las KCs y otras células inmunitarias. Esto reveló interacciones significativamente aumentadas entre las KCs y las células CD4+ T, las células CD8+ T, los neutrófilos y las células NK después del PEx (Figura 3A). El análisis scRNA-seq identificó Cxcl9, una quimiocina que regula la migración, diferenciación y activación de las células inmunitarias a través de su receptor CXCR3,^[53] como el DEG (gen diferencialmente expresado) más significativamente regulado al alza en las KCs-PEx en comparación con las KCs-Sed (Figura 1G). Cabe destacar que las células inmunitarias hepáticas CXCL9-expresoras en los ratones PEx eran predominantemente KCs de los clústeres 2, 6 y 7 específicos de PEx (Figuras 3B y S3A). Basándonos en estos hallazgos, hipotetizamos que las KCs-PEx reclutan células inmunitarias CXCR3+ a través de CXCL9 para ejercer efectos antitumorales. La citometría de flujo confirmó que el PEx aumentó la expresión de CXCL9 en las KCs (Figura 3C), y los niveles de CXCL9 circulantes y hepáticos fueron significativamente más altos en los ratones PEx en comparación con los ratones Sed 3 semanas después del establecimiento del modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figuras 3D y 3E). Estos resultados sugieren que el PEx estimula la secreción de CXCL9 por parte de las KCs.

Para validar estos hallazgos preclínicos en humanos, examinamos sueros de pacientes con CRLM sometidos a cirugía. Estos pacientes fueron incluidos en nuestro ensayo clínico aleatorizado y controlado (NCT04602026) que evaluaba un programa de prehabilitación destinado a mejorar los resultados postoperatorios en los tumores malignos gastrointestinales. Los pacientes incluidos en el grupo PEx completaron un programa de ejercicios personalizado de 4 semanas prescrito por un fisioterapeuta, basado en las evaluaciones realizadas durante su visita inicial y la evaluación subjetiva. Las características basales, incluido la carga tumoral, el estadio, el estado de mutación de RAS y BRAF, y el estado MSS/MSI, se resumen en la Tabla S1. Curiosamente, los pacientes con CRLM del grupo PEx mostraron niveles séricos de CXCL9 más altos después del ejercicio en comparación con sus niveles basales y los controles no PEx (Figuras 3F y S3B). Además, la expresión de CXCL9 en las KCs aisladas de los tejidos hepáticos peritumorales fue mayor en los pacientes del grupo PEx en comparación con el grupo no PEx (Figura 3G).

Nuestros datos de scRNA-seq revelaron que Cxcr3, que codifica el receptor de CXCL9, se enriqueció en las células CD8+ T, las células NKT y las células NK de los ratones PEx (Figura 3H). La citometría de flujo confirmó que el PEx aumentó el porcentaje de células CD8+ T, células NK y células NKT en el hígado (Figuras S3C y S3D) y reguló al alza la expresión de CXCR3 en estas células (Figuras 3I, S3E y S3F). Cabe destacar que las células CD8+ T mostraron el mayor aumento en la expresión de CXCR3, aumentando aproximadamente 6,12 veces, en comparación con 3,93 veces en las células NKT y 2,63 veces en las células NK. De manera similar, los pacientes con CRLM del grupo PEx mostraron niveles elevados de CXCR3 en las células CD8+ T periféricas en comparación con los controles no PEx (Figura 3J). El PEx también aumentó la infiltración de células CD8+ T en los tumores (Figura S3G) y mejoró su citotoxicidad tanto en el hígado como en el microambiente tumoral, como lo indica la mayor expresión de Granzima B, IFN-γ y TNF-α en el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figuras 3K y S3H). Estos hallazgos demuestran que el PEx promueve el reclutamiento y la activación de las células CD8+ T, mejorando su actividad antitumoral.### El eje CXCL9-CXCR3 es crucial para la protección mediada por PEx contra la CRLM promovida por el estrés quirúrgico

Para verificar el papel del eje CXCL9-CXCR3 en la protección mediada por PEx, establecimos el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico en ratones Cxcl9 knockout (KO) y ratones Cxcr3 KO (Figuras 4A y 4D). El PEx no logró conferir efectos protectores en los ratones Cxcl9 KO y Cxcr3 KO, que mostraron tasas de crecimiento tumoral similares (Figuras S4A y S5A) y cargas tumorales (Figuras 4B, 4C, 4E y 4F) en comparación con los ratones Cxcl9 KO Sed y los ratones Cxcr3 KO Sed, respectivamente. Además, el PEx no mejoró el reclutamiento de células CD8+ T ni su actividad antitumoral en los ratones Cxcl9 KO y Cxcr3 KO (Figuras S4B y S5B).

Para evaluar más a fondo el papel de las KCs que expresan CXCL9, realizamos experimentos de transferencia adoptiva en ratones Sed y PEx KC-DTR con depleción de KCs, transfiriendo KCs de ratones PEx WT y Cxcl9 KO de 4 semanas (Figura 4G). Los ratones que recibieron KCs WT mostraron un crecimiento tumoral significativamente más lento (Figura S4C) y una carga tumoral reducida (Figuras 4H e 4I) en comparación con los que recibieron KCs Cxcl9 KO, independientemente del estado de ejercicio del receptor. Además, la transferencia adoptiva de KCs WT aumentó la infiltración de células CD8+ T y mejoró su actividad antitumoral, mientras que las KCs Cxcl9 KO no lo hicieron (Figura S4D). Para evaluar si el PEx induce los efectos antitumorales a largo plazo en las KCs, los ratones Sed y PEx KC-DTR con depleción de KCs fueron transferidos adoptivamente con KCs de ratones PEx WT o Cxcl9 KO de 4 semanas, seguidos de regímenes Sed o PEx durante 4 semanas adicionales (Figura S4E). Cabe destacar que los ratones Sed que recibieron KCs WT mostraron una reducción significativa en la carga tumoral en comparación con los que recibieron KCs Cxcl9 KO. En contraste, este efecto estuvo ausente en los ratones PEx que recibieron KCs Cxcl9 KO (Figuras S4F y S4G). Dado el aumento significativo de CXCR3 en las células CD8+ T después del PEx, investigamos a continuación el papel de las células CD8+ T CXCR3+ en nuestro modelo. Aislamos células CD8+ T de ratones Sed WT o Cxcr3 KO y las transferimos a ratones Sed o PEx con depleción de células CD8+ T (Figura 4J). La transferencia de células CD8+ T WT a ratones PEx suprimió el crecimiento tumoral, aumentó la infiltración de células CD8+ T y mejoró su función antitumoral, mientras que la transferencia de células CD8+ T Cxcr3 KO no lo hizo (Figuras 4K, 4L, S5C y S5D). Confirmamos además el papel de CXCL9 neutralizándolo in vivo (Figura 4M). La administración de anticuerpo anti-CXCL9 abolió los efectos protectores inducidos por PEx, lo que condujo a tasas de crecimiento tumoral comparables (Figura S4H), cargas tumorales (Figuras 4N y 4O), reclutamiento de células CD8+ T y función antitumoral (Figura S4I) entre los ratones Sed y PEx. De manera similar, la inhibición farmacológica de CXCR3 con un antagonista específico^[54] eliminó la supresión del crecimiento tumoral, el reclutamiento de células CD8+ T y la actividad antitumoral inducidos por PEx (Figuras 4P-4R, S5E y S5F).

Para determinar si el eje CXCL9-CXCR3 media la interacción entre las KCs y las células CD8+ T in vitro, cocultivamos KCs WT y Cxcl9 KO con células CD8+ T utilizando un ensayo de transwell (Figura S6A). Los resultados mostraron que las KCs de los ratones PEx WT promovieron la migración y la función antitumoral de las células CD8+ T en comparación con las KCs Sed. Sin embargo, estos efectos se abolieron al agregar el anticuerpo anti-CXCL9 o al usar KCs Cxcl9 KO (Figuras S6B y S6C). A continuación, buscamos determinar si la expresión de CXCR3 en las células CD8+ T es igualmente crítica para esta interacción protectora. Cocultivamos células CD8+ T WT y Cxcr3 KO con KCs PEx utilizando un ensayo de transwell (Figura S6D). Los resultados revelaron que las células CD8+ T que carecían de CXCR3 mostraron una migración y una función antitumoral reducidas cuando se expusieron a KCs PEx in vitro, un fenotipo que se replicó al agregar un antagonista de CXCR3 a las células CD8+ T WT (Figuras S6E y S6F). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la interacción mediada por PEx entre las KCs y las células CD8+ T a través del eje CXCL9-CXCR3 es esencial para la protección mediada por PEx contra la CRLM promovida por el estrés quirúrgico, lo que impulsa el aumento del reclutamiento y la actividad antitumoral de las células CD8+ T.### CXCL9 mejora la actividad antitumoral de las células CD8+ T CXCR3+

Para investigar más a fondo si el PEx modula la actividad de las células CD8+ T a través de CXCL9, estimulamos las células CD8+ T hepáticas WT con suero de ratones Sed y PEx WT 3 semanas después de establecer el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figura 5A). Las células CD8+ T incubadas con suero PEx durante 24 horas mostraron una mayor producción de moléculas citotóxicas, incluidas la granzima B, el IFN-γ y el TNF-α, en comparación con las células estimuladas con suero Sed (Figura 5B). Este efecto se abolió cuando las células CD8+ T hepáticas WT se estimularon con suero de ratones Sed y PEx Cxcl9 KO (Figuras 5C y 5D) o cuando las células CD8+ T Cxcr3 KO se cultivaron con suero de ratones Sed y PEx WT (Figuras 5E y 5F). Además, la CXCL9 recombinante de ratón mejoró significativamente la actividad antitumoral de las células CD8+ T hepáticas (Figuras S7A y S7B).

Dado los distintos microambientes inmunitarios del hígado y el tumor, examinamos a continuación el efecto de CXCL9 en las células CD8+ T infiltrantes tumorales. Coherente con las células CD8+ T hepáticas, tanto el suero PEx como la CXCL9 recombinante mejoraron la actividad antitumoral de las células CD8+ T infiltrantes tumorales (Figuras 5G, 5H, S7C y S7D). En contraste, el suero de ratones PEx Cxcl9 KO no aumentó la actividad antitumoral de las células CD8+ T en comparación con el suero de ratones Cxcl9 KO Sed (Figuras 5I y 5J). De manera similar, el suero PEx no mejoró la función antitumoral de las células CD8+ T infiltrantes tumorales de los ratones Cxcr3 KO en comparación con el suero Sed (Figuras 5K y 5L).

Para verificar aún más el papel in vivo de CXCL9 en la promoción de la actividad antitumoral de las células CD8+ T, administramos CXCL9 recombinante o control (0,1% de albúmina sérica bovina en PBS) a ratones Sed o PEx después de la inyección del tumor^[41] (Figura S7E). La administración de CXCL9 recombinante en ratones Sed mejoró su respuesta antitumoral, lo que resultó en cargas tumorales comparables entre los ratones Sed y PEx (Figuras S7F y S7G).

Para extender estos hallazgos a los humanos, aislamos células CD8+ T periféricas de voluntarios sanos y las estimulamos con sueros pre y post-ejercicio del mismo paciente con CRLM (Figura 5M). El suero post-ejercicio mejoró la actividad antitumoral de las células CD8+ T en comparación con el suero pre-ejercicio (Figura 5N). De manera similar, la CXCL9 recombinante humana aumentó significativamente la actividad antitumoral de las células CD8+ T (Figuras S7H y S7I). En conjunto, estos resultados demuestran que la CXCL9 inducida por PEx mejoró la actividad antitumoral de las células CD8+ T a través del eje CXCL9-CXCR3, con efectos conservados en los sistemas murino y humano.### El remodelamiento de la microbiota intestinal inducido por PEx contribuye a aliviar la CRLM promovida por el estrés quirúrgico

A continuación, exploramos los mecanismos por los cuales PEx induce la secreción de CXCL9 en los KCs. Como se muestra en la Figura S2E, el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG reveló un enriquecimiento significativo de las vías metabólicas en los KCs de PEx en comparación con los KCs de Sed. Los procesos metabólicos en las células inmunitarias innatas son reguladores críticos de la reprogramación epigenética, ya que los metabolitos pueden influir en la expresión génica directa o indirectamente.^[55] Utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, realizamos un perfilado metabolómico no dirigido en estado estacionario de los KCs de Sed y PEx 3 semanas después de la inyección del tumor. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales dispersos reveló perfiles metabólicos intracelulares distintos en los KCs de PEx en comparación con los KCs de Sed (Figura 6A). Los análisis de enriquecimiento de vías identificaron el metabolismo de la arginina y la prolina, el metabolismo del butanoato y el metabolismo de la tirosina como las tres vías principales enriquecidas en los KCs de PEx en comparación con los KCs de Sed (Figura 6B), siendo el metabolismo del butanoato el que mostró la mayor proporción de enriquecimiento.

El butanoato, también conocido como butirato,^[56] es un ácido graso de cadena corta producido por la fermentación de la microbiota intestinal de las fibras dietéticas.^[57] Sirve tanto como fuente de energía para las células intestinales como como modulador de la expresión génica con propiedades antiinflamatorias y antitumorales.^[58] Para investigar si PEx ejerce efectos antitumorales en los KCs a través del butirato, recolectamos heces de ratones Sed y PEx antes y después de establecer el modelo de CRLM promovido por el estrés quirúrgico y realizamos una secuenciación de rRNA 16s para analizar la abundancia de bacterias productoras de butirato. Este análisis reveló un aumento significativo de las bacterias productoras de butirato, en particular Clostridia,^[59] en los ratones de PEx en comparación con los ratones de Sed, independientemente del establecimiento del modelo de CRLM promovido por el estrés quirúrgico (Figura 6C). También se detectaron niveles elevados de butirato en los núcleos de los KCs y en el suero de los ratones de PEx en comparación con los ratones de Sed (Figura 6D), así como en los KCs humanos y en las muestras de sangre periférica de los pacientes del grupo PEx en comparación con el grupo no PEx (Figura 6E).

Para evaluar el papel de los cambios en la microbiota inducidos por PEx en la atenuación del CRLM promovido por el estrés quirúrgico, administramos antibióticos (ABx) para agotar la microbiota intestinal antes del establecimiento del modelo (Figura 6F). El tratamiento con ABx abolió los efectos protectores de PEx, sin diferencias en la progresión tumoral entre los ratones de PEx y Sed (Figuras 6G y 6H). Curiosamente, el alojamiento conjunto de ratones Sed con ratones PEx redujo la carga tumoral en los ratones Sed a los niveles de los ratones PEx (Figuras 6I-6K), lo que sugiere que la remodelación de la microbiota inducida por PEx desempeñó un papel clave en la mediación de los efectos antitumorales.

PEx promueve la expresión de CXCL9 en los KCs a través de la inhibición de HDAC3 mediada por butirato

Dado que las bacterias productoras de butirato aumentaron después de PEx, verificamos si el butirato podía inhibir directamente el crecimiento de las células tumorales in vitro. Estos resultados revelaron que la estimulación con butirato de sodio (NaB) suprimió significativamente el crecimiento de las células tumorales de CRC MC38 y CT26 (Figuras S8A y S8B). Luego, administramos NaB o PBS diariamente mediante inyección intragástrica a ratones Sed después de la cirugía (Figura 7A). Los ratones tratados con NaB mostraron una supresión del crecimiento tumoral (Figura 7B) y una reducción de la carga tumoral (Figuras 7C y 7D) en comparación con los controles tratados con PBS, acompañado de un aumento de la expresión de CXCL9 en los KCs (Figura 7E).

Se sabe que el butirato actúa como un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), modulando la transcripción génica.^[60] Estudios previos han demostrado que la HDAC puede influir en la producción de quimiocinas y citocinas, y que la inhibición de HDAC3 aumenta la expresión de CXCL9 en los sinoviocitos similares a fibroblastos.^[61],^[62] Nuestros datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) identificaron HDAC3 como la HDAC más regulada a la baja en los KCs de PEx (Figura 7F). En consecuencia, confirmamos la reducción de la expresión de HDAC3 en los KCs de PEx en comparación con los KCs de Sed (Figura 7G). Para validar el papel de HDAC3 en la regulación de la expresión de CXCL9, administramos un inhibidor de HDAC3 (RGFP966) a ratones Sed después de la cirugía (Figura 7H). RGFP966 redujo el crecimiento tumoral (Figura 7I) y la carga tumoral (Figuras 7J y 7K) al tiempo que aumentó significativamente la expresión de CXCL9 en los KCs (Figura 7L). Además, RGFP966 inhibió directamente el crecimiento de las células tumorales de CRC in vitro (Figuras S8C y S8D). En conjunto, estos resultados revelan que el butirato inducido por PEx mejora la expresión de CXCL9 en los KCs al inhibir HDAC3, lo que contribuye a los efectos antitumorales de PEx en el CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

Para determinar si los efectos antitumorales de NaB y RGFP966 dependían de los KCs, administramos estos compuestos a ratones R26LSL-DTR y KC-DTR pretratados con DT después de la cirugía. Los ratones R26LSL-DTR tratados con PBS sirvieron como control negativo (Figuras S9A y S9E). El tratamiento con NaB suprimió significativamente el crecimiento tumoral y redujo la carga metastásica en los ratones R26LSL-DTR pretratados con DT; sin embargo, el efecto protector inducido por NaB se abolió en los ratones KC-DTR pretratados con DT (Figuras S9B-S9D). De manera similar, la administración de RGFP966 también atenuó la progresión tumoral en los ratones R26LSL-DTR pretratados con DT, pero no en los ratones KC-DTR pretratados con DT (Figuras S9F-S9H), lo que confirma que NaB y RGFP966 dependen de la presencia de KCs para ejercer su papel protector contra el CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

PEx suprime el CRLM altamente inmunogénico promovido por el estrés quirúrgico y remodela el microambiente inmunitario hepático

Para evaluar el impacto de PEx en el CRLM promovido por el estrés quirúrgico, empleamos un régimen de ejercicio moderado de carrera en cinta (12,5 metros/min, 60 min/día y 5 días/semana, durante 4 semanas) en un modelo murino de metástasis hepática promovido por el estrés quirúrgico.^[27],^[37] Implantamos células de CRC MC38 que expresan luciferasa en los hígados de ratones sedentarios (Sed) o PEx mediante inyección en la vena porta seguida de isquemia/reperfusion hepática (I/R) para simular el estrés quirúrgico (Figura 1A). El crecimiento tumoral se controló semanalmente mediante un sistema de imagen in vivo (IVIS). Descubrimos que la progresión de la metástasis se redujo significativamente en el grupo PEx en comparación con los ratones Sed después de 2 semanas de la inyección del tumor (Figura 1B). En particular, los ratones PEx mostraron una menor carga tumoral, evidenciada por la menor cantidad de nódulos metastásicos y la reducción de la relación peso del hígado/peso corporal (Figuras 1C y 1D). En contraste, en ausencia de estrés quirúrgico (sin I/R hepática), los ratones PEx y Sed mostraron una tasa de crecimiento tumoral y una carga tumoral comparables (Figuras S1A-S1D). Para validar aún más estos hallazgos, utilizamos células CT26, un modelo de líneas celulares de CRC poco inmunogénicas, en nuestro modelo. Sin embargo, PEx no suprimió el CRLM promovido por el estrés quirúrgico en el modelo de tumores de células CT26 (Figuras S1E-S1H).

Para investigar los efectos de PEx en el microambiente inmunitario hepático en el CRLM promovido por el estrés quirúrgico, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) imparcial de la población inmune en los tejidos hepáticos de ratones Sed y PEx 3 semanas después del establecimiento del modelo. Utilizando la aproximación y proyección de múltiples aproximaciones (UMAP), identificamos la distribución y las identidades de los grupos celulares. Después del filtrado cualitativo y la exclusión de las células CD45−, obtuvimos 23.922 células con transcriptomas de alta calidad y las clasificamos en nueve tipos de células: KCs, células dendríticas (DCs), monocitos, neutrófilos, células B, células T CD4+, células T CD8+, células T asesinas naturales (NKT) y células asesinas naturales (NK) (Figura 1E). PEx alteró significativamente el transcriptoma de los KCs, caracterizado por una disminución de la abundancia del grupo de KCs en la región inferior de UMAP y un aumento de la abundancia en la región superior. Además, PEx aumentó la abundancia de los grupos de células B y NKT, al tiempo que redujo los grupos de neutrófilos y monocitos en comparación con el grupo Sed. Además, el análisis de genes diferencialmente expresados (DEGs) en las células inmunitarias hepáticas reveló que el hígado de PEx exhibió una regulación al alza de los genes antitumorales, incluidos Cxcl9,^[38]
Cd40Ig,^[39]
Ahnak,^[40]
Cxcl10^[41] y Ifngas1^[42] en KCs, células T CD8+, células B, DCs y células NKT, respectivamente (Figura S1I). En conjunto, estos resultados sugieren que PEx puede remodelar el microambiente inmunitario hepático y posiblemente asociarse con la inmunidad antitumoral en el contexto del CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

Coherente con nuestros hallazgos previos de que 4 semanas de PEx cambian el fenotipo de los KCs,^[27], observamos cambios transcriptómicos significativos en los KCs después de PEx en nuestro modelo tumoral. Para explorar aún más el papel de los KCs, identificamos ocho poblaciones distintas de KCs en el hígado en función de la expresión de marcadores (Figura 1F). Los grupos 2, 6 y 7, enriquecidos en genes relacionados con el fenotipo antitumoral (Cxcl9^[38], H2-Aa,^[43]
H2-Eb1,^[43] y H2-Ab1^[43]), se observaron predominantemente en los ratones PEx, mientras que los grupos 0, 1, 3 y 4, caracterizados por genes relacionados con fenotipos pro-tumorales o inmunosupresores (Apoc1,^[44]
Ccl24,^[45]
Fabp7,^[46]
Cd5l,^[47] y Vsig4^[48]), se presentaron principalmente en los ratones Sed (Figuras 1G y S1J). Estos hallazgos sugieren que PEx promueve la expresión de genes antitumorales al tiempo que suprime la expresión de genes pro-tumorales en los KCs en la condición de CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

Los KCs son esenciales para atenuar el CRLM promovido por el estrés quirúrgico después de PEx

Luego, hipotetizamos que el perfil transcriptómico antitumoral inducido por PEx en los KCs es potencialmente beneficioso para el CRLM promovido por el estrés quirúrgico. Para evaluar la necesidad de los KCs en los efectos protectores inducidos por PEx, generamos ratones KC-DTR con expresión del receptor de la toxina diftérica (DTR) específicamente en los KCs. En comparación con los ratones de control R26LSL-DTR, la administración de toxina diftérica (DT) en los ratones KC-DTR resultó en una depleción casi completa de los KCs en 24 horas, según lo confirmado por citometría de flujo (Figura S2A). Se administró DT por vía intraperitoneal a los ratones R26LSL-DTR de control y KC-DTR de los grupos Sed y PEx 24 horas antes de la inyección del tumor (Figura 2A). La depleción de los KCs abolió los efectos protectores de PEx, sin diferencias significativas en el crecimiento tumoral entre los ratones Sed y PEx KC-DTR (Figuras 2B-2D y S2B).

Para validar aún más el papel de los KCs en los efectos antitumorales inducidos por PEx, realizamos experimentos de transferencia adoptiva. Los ratones KC-DTR de Sed o PEx con depleción de KCs se transfirieron adoptivamente con KCs de tipo salvaje (WT) de ratones Sed o PEx 12 horas antes de la inyección del tumor (Figura 2E). La transferencia adoptiva de KCs de ratones PEx WT protegió significativamente contra el CRLM promovido por el estrés quirúrgico, independientemente del estado de ejercicio de los ratones receptores, mientras que la transferencia adoptiva de KCs derivados de Sed no tuvo un efecto protector (Figuras 2F-2H y S2C). Estos resultados demuestran que los efectos protectores de PEx en la atenuación del CRLM promovido por el estrés quirúrgico dependen de los KCs.

PEx mejora la inmunidad antitumoral de los KCs modulando la secreción de citocinas

Para investigar cómo PEx modula los KCs en el modelo de CRLM promovido por el estrés quirúrgico, primero evaluamos sus efectos en la abundancia de KCs y no encontramos diferencias en el porcentaje de KCs hepáticos entre los grupos Sed y PEx (Figura S2D). Posteriormente, exploramos las alteraciones moleculares y las vías involucradas en los KCs asociados con PEx en comparación con los KCs asociados con Sed. El análisis de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) reveló que los DEGs se enriquecieron en la interacción citocina-receptor de citocinas (Figura S2E); el análisis de la ontología génica (GO) identificó el enriquecimiento en términos relacionados con la migración de leucocitos y la quimiotaxis (Figura S2F). Para investigar aún más cómo PEx influye en la actividad antitumoral de los KCs, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. El análisis reveló un enriquecimiento significativo de conjuntos de genes asociados con "vías en el cáncer" (Figura S2G). Además, el análisis de la vía Reactome reveló el enriquecimiento de la vía de orientación de proteínas co-traduccionales dependiente de la partícula de reconocimiento de señales al retículo endoplásmico, que es esencial para mediar la secreción de proteínas^[49] (Figura S2H). En conjunto, estos datos conectaron PEx con la secreción de citocinas, el reclutamiento de células inmunitarias y las funciones antitumorales.

Las células de Kupffer (KCs) previenen la metástasis hepática al eliminar directamente las células tumorales mediante la fagocitosis y la liberación de moléculas citolíticas.^[30] Para investigar más a fondo el impacto del PEx en la secreción de citocinas por parte de las KCs, aislamos KCs de ratones Sed y PEx y los cocultivamos con células MC38-GFP^[50] para medir los niveles de citocinas antitumorales y pro-tumorales (Figura 2I). Curiosamente, las KCs-PEx produjeron niveles significativamente más bajos de citocinas pro-tumorales (interleucina [IL]-10 y factor de crecimiento transformante [TGF] β)^[51] y niveles más altos de citocinas antitumorales (interferón [IFN]-γ, factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α] e IL-12)^[34],^[52] en comparación con las KCs-Sed (Figuras 2J y 2K). Además, no detectamos una diferencia significativa en la actividad fagocítica de las KCs entre los grupos Sed y PEx (Figuras 2L y S2I). Estos resultados sugieren que el PEx ejerce su efecto protector en la CRLM promovida por el estrés quirúrgico modulando el perfil de secreción de citocinas de las KCs, en lugar de alterar su cantidad o actividad fagocítica contra las células tumorales.

El PEx aumenta la liberación de CXCL9 por parte de las KCs y promueve el reclutamiento de células CD8+ CXCR3+

Dado que las KCs también secretan quimiocinas y citocinas para reclutar y activar las células inmunitarias, amplificando así la respuesta antitumoral,^[30] utilizamos el análisis CellPhoneDB para examinar las diferencias en la comunicación celular entre las KCs y otras células inmunitarias. Esto reveló interacciones significativamente aumentadas entre las KCs y las células CD4+ T, las células CD8+ T, los neutrófilos y las células NK después del PEx (Figura 3A). El análisis scRNA-seq identificó Cxcl9, una quimiocina que regula la migración, diferenciación y activación de las células inmunitarias a través de su receptor CXCR3,^[53] como el DEG (gen diferencialmente expresado) más significativamente regulado al alza en las KCs-PEx en comparación con las KCs-Sed (Figura 1G). En particular, las células inmunitarias hepáticas CXCL9-expresoras en los ratones PEx eran predominantemente KCs de los clústeres 2, 6 y 7 específicos de PEx (Figuras 3B y S3A). Basándonos en estos hallazgos, hipotetizamos que las KCs-PEx reclutan células inmunitarias CXCR3+ a través de CXCL9 para ejercer efectos antitumorales. La citometría de flujo confirmó que el PEx aumentó la expresión de CXCL9 en las KCs (Figura 3C), y los niveles de CXCL9 circulantes y hepáticos fueron significativamente más altos en los ratones PEx en comparación con los ratones Sed 3 semanas después del establecimiento del modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figuras 3D y 3E). Estos resultados sugieren que el PEx estimula la secreción de CXCL9 por parte de las KCs.

Para validar estos hallazgos preclínicos en humanos, examinamos sueros de pacientes con CRLM sometidos a cirugía. Estos pacientes fueron incluidos en nuestro ensayo clínico aleatorizado y controlado (NCT04602026) que evaluaba un programa de prehabilitación destinado a mejorar los resultados postoperatorios para las neoplasias gastrointestinales. Los pacientes incluidos en el grupo PEx completaron un programa de ejercicios personalizado de 4 semanas prescrito por un fisioterapeuta, basado en las evaluaciones realizadas durante su visita inicial y la evaluación subjetiva. Las características basales, incluido la carga tumoral, el estadio, el estado de mutación de RAS y BRAF, y el estado MSS/MSI, se resumen en la Tabla S1. Curiosamente, los pacientes con CRLM del grupo PEx mostraron niveles séricos de CXCL9 más altos después del ejercicio en comparación con sus niveles basales y los controles no PEx (Figuras 3F y S3B). Además, la expresión de CXCL9 en las KCs aisladas de los tejidos hepáticos peritumorales fue mayor en los pacientes del grupo PEx en comparación con el grupo no PEx (Figura 3G).

Nuestros datos de scRNA-seq revelaron que Cxcr3, que codifica el receptor de CXCL9, se enriqueció en las células CD8+ T, las células NKT y las células NK de los ratones PEx (Figura 3H). La citometría de flujo confirmó que el PEx aumentó el porcentaje de células CD8+ T, células NK y células NKT en el hígado (Figuras S3C y S3D) y reguló al alza la expresión de CXCR3 en estas células (Figuras 3I, S3E y S3F). En particular, las células CD8+ T mostraron el mayor aumento en la expresión de CXCR3, aumentando aproximadamente 6,12 veces, en comparación con 3,93 veces en las células NKT y 2,63 veces en las células NK. De manera similar, los pacientes con CRLM del grupo PEx mostraron niveles elevados de CXCR3 en las células CD8+ T periféricas en comparación con los controles no PEx (Figura 3J). El PEx también aumentó la infiltración de células CD8+ T en los tumores (Figura S3G) y mejoró su citotoxicidad tanto en el hígado como en el microambiente tumoral, como lo indica la expresión elevada de Granzima B, IFN-γ y TNF-α en el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figuras 3K y S3H). Estos hallazgos demuestran que el PEx promueve el reclutamiento y la activación de las células CD8+ T, mejorando su actividad antitumoral.

El eje CXCL9-CXCR3 es crucial para la protección mediada por PEx contra la CRLM promovida por el estrés quirúrgico

Para verificar el papel del eje CXCL9-CXCR3 en la protección mediada por PEx, establecimos el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico en ratones Cxcl9 knockout (KO) y Cxcr3 KO (Figuras 4A y 4D). El PEx no logró conferir efectos protectores en los ratones Cxcl9 KO y Cxcr3 KO, que mostraron tasas de crecimiento tumoral similares (Figuras S4A y S5A) y cargas tumorales (Figuras 4B, 4C, 4E y 4F) en comparación con los ratones Cxcl9 KO Sed y los ratones Cxcr3 KO Sed, respectivamente. Además, el PEx no mejoró el reclutamiento de células CD8+ T ni su actividad antitumoral en los ratones Cxcl9 KO y Cxcr3 KO (Figuras S4B y S5B).

Para evaluar aún más el papel de las KCs que expresan CXCL9, realizamos experimentos de transferencia adoptiva en ratones Sed y PEx KC-DTR con depleción de KCs, transfiriendo KCs de ratones PEx WT y Cxcl9 KO de 4 semanas (Figura 4G). Los ratones que recibieron KCs WT mostraron un crecimiento tumoral significativamente más lento (Figura S4C) y una carga tumoral reducida (Figuras 4H e 4I) en comparación con los que recibieron KCs Cxcl9 KO, independientemente del estado de ejercicio del receptor. Además, la transferencia adoptiva de KCs WT aumentó la infiltración de células CD8+ T y mejoró su actividad antitumoral, mientras que las KCs Cxcl9 KO no lo hicieron (Figura S4D). Para evaluar si el PEx induce los efectos antitumorales a largo plazo en las KCs, los ratones Sed y PEx KC-DTR con depleción de KCs fueron transferidos adoptivamente con KCs de ratones PEx WT o Cxcl9 KO de 4 semanas, seguidos de regímenes Sed o PEx durante 4 semanas adicionales (Figura S4E). En particular, los ratones Sed que recibieron KCs WT mostraron una reducción significativa en la carga tumoral en comparación con los que recibieron KCs Cxcl9 KO. En contraste, este efecto estuvo ausente en los ratones PEx que recibieron KCs Cxcl9 KO (Figuras S4F y S4G). Dado el aumento significativo de CXCR3 en las células CD8+ T después del PEx, investigamos a continuación el papel de las células CD8+ T CXCR3+ en nuestro modelo. Aislamos células CD8+ T de ratones Sed WT o Cxcr3 KO y las transferimos a ratones Sed o PEx con depleción de células CD8+ T (Figura 4J). La transferencia de células CD8+ T WT a ratones PEx suprimió el crecimiento tumoral, aumentó la infiltración de células CD8+ T y mejoró su función antitumoral, mientras que la transferencia de células CD8+ T Cxcr3 KO no lo hizo (Figuras 4K, 4L, S5C y S5D). Confirmamos además el papel de CXCL9 neutralizándolo in vivo (Figura 4M). La administración de un anticuerpo anti-CXCL9 abolió los efectos protectores inducidos por PEx, lo que condujo a tasas de crecimiento tumoral comparables (Figura S4H), cargas tumorales (Figuras 4N y 4O), reclutamiento de células CD8+ T y función antitumoral (Figura S4I) entre los ratones Sed y PEx. De manera similar, la inhibición farmacológica de CXCR3 con un antagonista específico^[54] eliminó la supresión del crecimiento tumoral, el reclutamiento de células CD8+ T y la actividad antitumoral inducidos por PEx (Figuras 4P-4R, S5E y S5F).

Para determinar si el eje CXCL9-CXCR3 media la interacción entre las KCs y las células CD8+ T in vitro, cocultivamos KCs WT y Cxcl9 KO con células CD8+ T utilizando un ensayo de transwell (Figura S6A). Los resultados mostraron que las KCs de los ratones PEx WT promovieron la migración y la función antitumoral de las células CD8+ T en comparación con las KCs Sed. Sin embargo, estos efectos se abolieron al agregar el anticuerpo anti-CXCL9 o al usar KCs Cxcl9 KO (Figuras S6B y S6C). A continuación, buscamos determinar si la expresión de CXCR3 en las células CD8+ T es igualmente crítica para esta interacción protectora. Cocultivamos células CD8+ T WT y Cxcr3 KO con KCs PEx utilizando un ensayo de transwell (Figura S6D). Los resultados revelaron que las células CD8+ T que carecían de CXCR3 mostraron una migración y una función antitumoral reducidas cuando se expusieron a las KCs PEx in vitro, un fenotipo que se replicó al agregar un antagonista de CXCR3 a las células CD8+ T WT (Figuras S6E y S6F). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la interacción mediada por PEx entre las KCs y las células CD8+ T a través del eje CXCL9-CXCR3 es esencial para la protección mediada por PEx contra la CRLM promovida por el estrés quirúrgico, lo que impulsa el aumento del reclutamiento y la actividad antitumoral de las células CD8+ T.

CXCL9 mejora la actividad antitumoral de las células CD8+ CXCR3+

Para investigar más a fondo si el PEx modula la actividad de las células CD8+ T a través de CXCL9, estimulamos las células CD8+ T hepáticas WT con suero de ratones Sed y PEx WT 3 semanas después de establecer el modelo de CRLM promovida por el estrés quirúrgico (Figura 5A). Las células CD8+ T incubadas con suero PEx durante 24 horas mostraron una mayor producción de moléculas citotóxicas, incluidas la granzima B, el IFN-γ y el TNF-α, en comparación con las células estimuladas con suero Sed (Figura 5B). Este efecto se abolió cuando las células CD8+ T hepáticas WT se estimularon con suero de ratones Sed y PEx Cxcl9 KO (Figuras 5C y 5D) o cuando las células CD8+ T Cxcr3 KO se cultivaron con suero de ratones Sed y PEx WT (Figuras 5E y 5F). Además, la CXCL9 recombinante de ratón mejoró significativamente la actividad antitumoral de las células CD8+ T hepáticas (Figuras S7A y S7B).

Dado los distintos microambientes inmunitarios del hígado y el tumor, examinamos a continuación el efecto de CXCL9 en las células CD8+ T infiltrantes tumorales. Coherente con las células CD8+ T hepáticas, tanto el suero PEx como la CXCL9 recombinante mejoraron la actividad antitumoral de las células CD8+ T infiltrantes tumorales (Figuras 5G, 5H, S7C y S7D). En contraste, el suero de ratones PEx Cxcl9 KO no aumentó la actividad antitumoral de las células CD8+ T en comparación con el suero de ratones Sed Cxcl9 KO (Figuras 5I y 5J). De manera similar, el suero PEx no mejoró la función antitumoral de las células CD8+ T infiltrantes tumorales de los ratones Cxcr3 KO en comparación con el suero Sed (Figuras 5K y 5L).

Para verificar aún más el papel in vivo de CXCL9 en la promoción de la actividad antitumoral de las células CD8+ T, administramos CXCL9 recombinante o control (0,1% de albúmina sérica bovina en PBS) a ratones Sed o PEx después de la inyección del tumor^[41] (Figura S7E). La administración de CXCL9 recombinante en ratones Sed mejoró su respuesta antitumoral, lo que resultó en cargas tumorales comparables entre los ratones Sed y PEx (Figuras S7F y S7G).

Para extender estos hallazgos a los humanos, aislamos células CD8+ T periféricas de voluntarios sanos y las estimulamos con sueros pre y post-ejercicio del mismo paciente con CRLM (Figura 5M). El suero post-ejercicio mejoró la actividad antitumoral de las células CD8+ T en comparación con el suero pre-ejercicio (Figura 5N). De manera similar, la CXCL9 recombinante humana aumentó significativamente la actividad antitumoral de las células CD8+ T (Figuras S7H y S7I). En conjunto, estos resultados demuestran que la CXCL9 inducida por PEx mejoró la actividad antitumoral de las células CD8+ T a través del eje CXCL9-CXCR3, con efectos conservados en los sistemas murino y humano.

El remodelamiento del microbioma intestinal inducido por PEx contribuye a aliviar la CRLM promovida por el estrés quirúrgico

A continuación, exploramos los mecanismos por los cuales PEx induce la secreción de CXCL9 en los hepatocitos (KCs). Como se muestra en la Figura S2E, el análisis de enriquecimiento de vías KEGG reveló un enriquecimiento significativo de las vías metabólicas en los KCs tratados con PEx en comparación con los KCs tratados con Sed. Los procesos metabólicos en las células inmunitarias innatas son reguladores críticos de la reprogramación epigenética, ya que los metabolitos pueden influir en la expresión génica directa o indirectamente.^[55] Utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, realizamos un perfilado metabolómico no dirigido en estado estacionario de los KCs tratados con Sed y PEx 3 semanas después de la inyección del tumor. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales dispersos reveló perfiles metabólicos intracelulares distintos en los KCs tratados con PEx en comparación con los KCs tratados con Sed (Figura 6A). Los análisis de enriquecimiento de vías identificaron el metabolismo de la arginina y la prolina, el metabolismo del butanoato y el metabolismo de la tirosina como las tres vías principales enriquecidas en los KCs tratados con PEx en comparación con los KCs tratados con Sed (Figura 6B), siendo el metabolismo del butanoato el que mostró la mayor proporción de enriquecimiento.

El butanoato, también conocido como butirato,^[56] es un ácido graso de cadena corta producido por la fermentación de la microbiota intestinal de las fibras dietéticas.^[57] Sirve tanto como fuente de energía para las células intestinales como como modulador de la expresión génica con propiedades antiinflamatorias y antitumorales.^[58] Para investigar si PEx ejerce efectos antitumorales en los KCs a través del butirato, recolectamos heces de ratones tratados con Sed y PEx antes y después de establecer el modelo de estrés quirúrgico que promueve la metástasis de cáncer colorrectal en el hígado (CRLM) y realizamos una secuenciación de rRNA 16s para analizar la abundancia de bacterias productoras de butirato. Este análisis reveló un aumento significativo de las bacterias productoras de butirato, en particular Clostridia,^[59] en los ratones tratados con PEx en comparación con los ratones tratados con Sed, independientemente del establecimiento del modelo de CRLM promovido por el estrés quirúrgico (Figura 6C). También se detectaron niveles elevados de butirato en los núcleos de los KCs y en el suero de los ratones tratados con PEx en comparación con los ratones tratados con Sed (Figura 6D), así como en los KCs humanos y en las muestras de sangre periférica de los pacientes del grupo PEx en comparación con el grupo no PEx (Figura 6E).

Para evaluar el papel de los cambios en la microbiota inducidos por PEx en la atenuación del CRLM promovido por el estrés quirúrgico, administramos antibióticos (ABx) para agotar la microbiota intestinal antes del establecimiento del modelo (Figura 6F). El tratamiento con ABx abolió los efectos protectores de PEx, sin diferencias en la progresión tumoral entre los ratones tratados con PEx y los ratones tratados con Sed (Figuras 6G y 6H). Curiosamente, el alojamiento conjunto de ratones tratados con Sed con ratones tratados con PEx redujo la carga tumoral en los ratones tratados con Sed a los niveles de los ratones tratados con PEx (Figuras 6I-6K), lo que sugiere que la remodelación de la microbiota inducida por PEx desempeñó un papel clave en la mediación de los efectos antitumorales.

PEx promueve la expresión de CXCL9 en los KCs a través de la inhibición de HDAC3 mediada por el butirato

Dado que las bacterias productoras de butirato aumentaron después de PEx, verificamos si el butirato podía inhibir directamente el crecimiento de las células tumorales in vitro. Estos resultados revelaron que la estimulación con butirato de sodio (NaB) suprimió significativamente el crecimiento de las células tumorales de CRC MC38 y CT26 (Figuras S8A y S8B). Luego, administramos NaB o PBS diariamente mediante inyección intragástrica a los ratones tratados con Sed después de la cirugía (Figura 7A). Los ratones tratados con NaB mostraron una supresión del crecimiento tumoral (Figura 7B) y una reducción de la carga tumoral (Figuras 7C y 7D) en comparación con los controles tratados con PBS, acompañado de un aumento de la expresión de CXCL9 en los KCs (Figura 7E).

Se sabe que el butirato actúa como un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), modulando la transcripción génica.^[60] Estudios previos han demostrado que la HDAC puede influir en la producción de quimiocinas y citocinas, y que la inhibición de HDAC3 aumenta la expresión de CXCL9 en los sinoviocitos similares a fibroblastos.^[61],^[62] Nuestros datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) identificaron HDAC3 como la HDAC más regulada a la baja en los KCs tratados con PEx (Figura 7F). En consecuencia, confirmamos la reducción de la expresión de HDAC3 en los KCs tratados con PEx en comparación con los KCs tratados con Sed (Figura 7G). Para validar el papel de HDAC3 en la regulación de la expresión de CXCL9, administramos un inhibidor de HDAC3 (RGFP966) a los ratones tratados con Sed después de la cirugía (Figura 7H). RGFP966 redujo el crecimiento tumoral (Figura 7I) y la carga tumoral (Figuras 7J y 7K) al tiempo que aumentó significativamente la expresión de CXCL9 en los KCs (Figura 7L). Además, RGFP966 inhibió directamente el crecimiento de las células tumorales de CRC in vitro (Figuras S8C y S8D). En conjunto, estos resultados revelan que el butirato inducido por PEx mejora la expresión de CXCL9 en los KCs al inhibir HDAC3, lo que contribuye a los efectos antitumorales de PEx en el CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

Para determinar si los efectos antitumorales de NaB y RGFP966 dependían de los KCs, administramos estos compuestos a ratones pretratados con DT R26LSL-DTR y KC-DTR después de la cirugía. Los ratones R26LSL-DTR tratados con PBS sirvieron como control negativo (Figuras S9A y S9E). El tratamiento con NaB suprimió significativamente el crecimiento tumoral y redujo la carga metastásica en los ratones R26LSL-DTR pretratados con DT; sin embargo, el efecto protector inducido por NaB se abolió en los ratones KC-DTR pretratados con DT (Figuras S9B-S9D). De manera similar, la administración de RGFP966 también atenuó la progresión tumoral en los ratones R26LSL-DTR pretratados con DT, pero no en los ratones KC-DTR pretratados con DT (Figuras S9F-S9H), lo que confirma que NaB y RGFP966 dependen de la presencia de KCs para ejercer su papel protector contra el CRLM promovido por el estrés quirúrgico.

Discusión

Las alteraciones inmunológicas inducidas por la cirugía pueden alterar el microambiente tumoral del huésped, promoviendo la recurrencia de la enfermedad.^[63],^[64],^[65] De hecho, tanto la inflamación sistémica como la local, junto con sus respuestas sostenidas después de la cirugía (por ejemplo, complicaciones, infecciones), se correlacionan directamente con los resultados del cáncer para el CRC ^[66],^[67],^[68],^[69] y otros tipos de cáncer.^[70],^[71]. Sin embargo, la comprensión mecanicista de la inflamación desencadenada por la cirugía en el aumento del riesgo de recurrencia tumoral aún está en sus primeras etapas. El presente estudio demuestra que el ejercicio aeróbico a corto plazo puede reprogramar de forma duradera el microambiente inmunitario del hígado. Específicamente, mostramos que 4 semanas de PEx mejoran el perfil transcripcional antitumoral de las células inmunitarias hepáticas, previniendo el CRLM promovido por el estrés quirúrgico. Cabe destacar que PEx no redujo el CRLM en ausencia de estrés quirúrgico, lo que enfatiza la naturaleza dependiente del contexto de este efecto protector.

El ejercicio es una intervención terapéutica segura y bien establecida en todo el continuo perioperatorio para los pacientes con CRC, con beneficios comprobados en la reducción de la recurrencia y la mortalidad.^[72] En nuestro estudio, la imagen in vivo no mostró diferencias en la metástasis hepática una semana después de la inyección del tumor; sin embargo, la progresión de la metástasis se redujo significativamente en el grupo PEx en comparación con los controles sedentarios después de dos semanas, lo que proporciona evidencia de que PEx es más probable que afecte el crecimiento de la metástasis que la siembra inicial. La intensidad y la duración del ejercicio son determinantes críticos de su eficacia.^[20] Por ejemplo, se ha demostrado que la actividad física moderada a vigorosa mejora las tasas de supervivencia en el CRC metastásico.^[73] Además, mantener una actividad física equivalente a caminar a paso ligero durante 150 minutos por semana durante el primer año postoperatorio se asocia con una mejora significativa de la supervivencia libre de enfermedad en los pacientes con CRLM.^[74] Con base en estas observaciones, nuestro estudio adoptó un régimen de ejercicio de intensidad moderada. Seleccionamos un protocolo de PEx de 4 semanas por dos razones principales. Primero, nuestro estudio previo demostró que las reducciones de PEx en la lesión y la inflamación hepáticas promovidas por el estrés quirúrgico fueron más pronunciadas después de 4 semanas, sin que se observara un beneficio adicional en duraciones más largas de hasta 16 semanas.^[27] En segundo lugar, la mayoría de los pacientes con CRLM se sometieron a quimioterapia neoadyuvante (QNA) antes de la cirugía, y un estudio previo sugirió un intervalo óptimo de 2 a 4 semanas entre la finalización de la QNA y la cirugía para maximizar la recuperación hepática y reducir las complicaciones postoperatorias.^[75]

En nuestro estudio, la única diferencia experimental entre los grupos Sed y PEx fue la implementación del régimen de ejercicio involuntario estructurado basado en la cinta de correr. No utilizamos el monitoreo de la actividad en la jaula para cuantificar el movimiento espontáneo; sin embargo, ambos grupos se alojaron en condiciones idénticas sin ruedas de correr ni enriquecimiento que pudiera promover la actividad voluntaria. Los trabajos previos indican que las intervenciones de ejercicio estructuradas, pero no la actividad física basal, producen los efectos inmunomoduladores sistémicos asociados con la disminución del crecimiento tumoral en ratones.^[76] Además, el ejercicio voluntario, como correr en una rueda, aumenta significativamente los niveles totales de actividad, mientras que la actividad espontánea estándar en la jaula permanece baja y estable en múltiples líneas de ratones.^[77]

El ejercicio ejerce sus efectos anticancerígenos, en parte, modulando el número y la función de las células inmunitarias.^[73] Los KCs hepáticos son reguladores críticos del desarrollo tumoral hepático, restringiendo el crecimiento tumoral durante la siembra metastásica temprana.^[78] Los KCs están confinados anatómicamente a los sinusoides hepáticos y generalmente permanecen en la periferia de las lesiones metastásicas, lo que hace que el contacto directo entre los KCs y el tumor sea poco frecuente durante la metástasis.^[29] Esta restricción espacial puede crear una "zona oscura" con pocos KCs alrededor de las metástasis que segrega las células tumorales de los KCs y las células T.^[78] Nuestros datos respaldan un modelo en el que PEx no requiere la infiltración de KCs en el tumor; en cambio, PEx reprograma los KCs sinusoides para que sirvan como centros de quimiocinas que reclutan y retienen las células CD8+ CXCR3+ en la interfaz sinusoide-tumor, donde las células T pueden acceder y controlar el crecimiento de la metástasis. Los trabajos previos muestran que la interrupción terapéutica de MafB/c-Maf puede reprogramar los KCs para que se desprendan de los sinusoides y se infiltren en los tumores, revirtiendo este nicho inmunitario excluido.^[78] Si bien nuestros hallazgos no requieren la infiltración de KCs, se alinean con el concepto más amplio de que el estado y la posición de los KCs son palancas tratables para superar las barreras inmunitarias espaciales. La transcriptómica espacial y la imagen futuras mapearán las distancias entre los KCs y las células T y probarán si PEx remodela estas relaciones espaciales in vivo. Nuestro análisis de scRNA-seq también reveló un aumento de los grupos de células NK en el hígado de los ratones tratados con PEx en comparación con los ratones tratados con Sed, lo que es consistente con los informes de que las citocinas y las catecolaminas inducidas por el ejercicio mejoran la movilización y la infiltración de las células NK.^[79] Si bien las células NK son mediadores bien reconocidos de la inmunidad antitumoral en el CRLM,^[80] nuestros hallazgos enfatizaron un papel más prominente para las células CD8+, que exhibieron una mayor interacción cruzada con los KCs, como lo indica el aumento de la expresión de CXCR3 después de PEx.

CXCL9 es una quimiocina estrechamente asociada con los pronósticos favorables en los pacientes con CRC, y una mayor expresión de CXCL9 se correlaciona con una mejor supervivencia general.^[81] Además, la CXCL9 derivada de los macrófagos es esencial para las respuestas inmunitarias antitumorales después de la inmunoterapia.^[38] Un hallazgo clave en nuestro estudio es la identificación de los KCs hepáticos como la fuente predominante de CXCL9 después de PEx. CXCL9 no solo recluta las células CD8+ CXCR3+, sino que también mejora directamente su actividad citotóxica al promover la producción de proteasas y citocinas antitumorales en las células CD8+. También demostramos que el suero de los ratones con CRLM y los ratones tratados con PEx, así como la CXCL9 recombinante, mejoran significativamente la actividad antitumoral de las células CD8+, lo que respalda el papel esencial de la interacción cruzada entre los KCs y las células CD8+ en la mediación de los efectos protectores de PEx. Además, la interrupción genética o farmacológica del eje CXCL9-CXCR3 exacerbó significativamente la carga de metástasis hepática tanto en los ratones tratados con Sed como en los ratones tratados con PEx. Esto se alinea con la evidencia previa de que la señalización CXCL9-CXCR3 es indispensable para el control inmunitario de los tumores MC38, principalmente a través del reclutamiento de células CD8+ y células NK antitumorales al microambiente hepático.^[38] De manera consistente con esto, PEx no logró mitigar la progresión de la metástasis en los modelos deficientes de CXCL9/CXCR3, lo que indica que PEx no compensa la pérdida de esta vía quimiotáctica fundamental. En conjunto, estos resultados respaldan que la señalización intacta de CXCL9-CXCR3 es un requisito no redundante para restringir las metástasis hepáticas, independientemente de las adaptaciones inducidas por el ejercicio.

Los efectos protectores inducidos por el ejercicio están mediados por una compleja red de factores que van más allá de los metabolitos. Aunque nuestro análisis metabólico identificó cambios en los niveles de butirato tras el ejercicio físico (PEx), otros factores inducidos por el ejercicio, como las citocinas y las proteínas secretadas, pueden contribuir a las funciones antitumores. Por ejemplo, el ejercicio induce la señalización aguda de IL-6, lo que puede promover la inmunidad adaptativa antitumoral al regular la activación de las células T en los órganos linfoides e inducir la migración de las células T citotóxicas a los ganglios linfáticos y los vasos tumorales.^[82] El ejercicio también se asocia con una mayor secreción de proteínas ácidas ricas en cisteína en humanos y modelos animales; esta proteína matricelular regula la función celular y la remodelación de los tejidos, al tiempo que inhibe la proliferación y promueve la apoptosis de una línea celular de cáncer de colon de ratón.^[83]

Además de modular las interacciones entre las células inmunitarias, el ejercicio mitiga el crecimiento tumoral al regular la comunicación interorgánica, siendo el eje intestino-hígado un papel fundamental en este proceso.^[84] Descubrimos que el PEx induce alteraciones en el microbioma intestinal, aumentando específicamente la abundancia de especies de Clostridia productoras de butirato. El butirato, transportado al hígado a través de la vena porta,^[58] actúa como un inhibidor de HDAC3, lo que impulsa la reprogramación epigenética en las células de Kupffer hepáticas (KCs) para promover un fenotipo antitumoral. Si bien estudios previos se han centrado principalmente en los efectos antiproliferativos del butirato en las células de CRC,^[85] nuestro estudio demuestra que el butirato puede inducir modificaciones epigenéticas en las KCs, mejorando así su capacidad para contrarrestar el estrés quirúrgico que promueve la metástasis en el hígado (CRLM).

En conclusión, nuestro estudio proporciona el marco intelectual para diseñar terapias de ejercicio basadas en mecanismos que mejoren los resultados quirúrgicos de los pacientes con cáncer, incluidos aquellos que no toleran el ejercicio. Demostramos que el PEx eleva los niveles de butirato en las KCs, induciendo su reprogramación y, posteriormente, el reclutamiento y la activación de las células T CD8+ mediadas por CXCL9-CXCR3. Nuestros hallazgos abren vías terapéuticas para integrar el ejercicio en la atención oncológica perioperatoria y demuestran el potencial de aprovechar la reprogramación sistémica inducida por el ejercicio para mejorar la eficacia del tratamiento.

Limitaciones del estudio

Una limitación de nuestro estudio es que nuestro modelo animal no replica completamente el entorno clínico. En nuestro modelo animal, el ejercicio se administró antes del estrés quirúrgico que promovió la tumorigénesis, mientras que en la práctica clínica, los pacientes con CRLM generalmente inician las intervenciones de PEx después del diagnóstico. A pesar de esta discrepancia, nuestro modelo actual se diseñó intencionalmente para investigar cómo el PEx reprograma el microambiente inmunitario hepático, en particular las KCs, para mejorar la inmunidad antitumoral durante la ventana perioperatoria, un período que se reconoce como altamente susceptible a la supresión inmunitaria y la diseminación metastásica. Una segunda limitación es la necesidad de aclarar si el ejercicio ejerce un efecto directo sobre la actividad antitumoral de las células T CD8+. Si bien nuestros datos sugieren que el PEx mejora la función de las células T CD8+, se necesita más investigación para determinar si este es un efecto primario o una consecuencia de la modulación inmunitaria ascendente. Además, el PEx mejoró la inmunidad antitumoral en un modelo de CRLM inmunogénico, pero no en modelos poco inmunogénicos, lo que limita la generalización inmediata a la población de CRC predominantemente pMMR/MSS. El trabajo futuro evaluará el PEx junto con estrategias de potenciación inmunogénica para determinar si la eficacia se puede ampliar en la CRC pMMR/MSS. Finalmente, aunque CXCL9 se reconoce como un marcador pronóstico favorable en la CRC, nuestro ensayo no estaba diseñado, dado el tamaño de muestra modesto y el seguimiento limitado, para determinar si los niveles perioperatorios de CXCL9 predicen la recurrencia postoperatoria de CRLM. Las interrupciones relacionadas con la pandemia (2020-2022) afectaron aún más la inclusión y la adherencia. Se necesitan cohortes más grandes y multicéntricas con un seguimiento más prolongado para establecer si los cambios en las frecuencias de CXCL9 y CXCR3+ CD8+ inducidos por el PEx y vinculados a las KCs están asociados con una reducción de la recurrencia y para informar el desarrollo de estrategias farmacológicas que imiten o potencien los efectos inmunomoduladores del ejercicio.

Limitaciones del estudio

Una limitación de nuestro estudio es que nuestro modelo animal no replica completamente el entorno clínico. En nuestro modelo animal, el ejercicio se administró antes del estrés quirúrgico que promovió la tumorigénesis, mientras que en la práctica clínica, los pacientes con CRLM generalmente inician las intervenciones de PEx después del diagnóstico. A pesar de esta discrepancia, nuestro modelo actual se diseñó intencionalmente para investigar cómo el PEx reprograma el microambiente inmunitario hepático, en particular las KCs, para mejorar la inmunidad antitumoral durante la ventana perioperatoria, un período que se reconoce como altamente susceptible a la supresión inmunitaria y la diseminación metastásica. Una segunda limitación es la necesidad de aclarar si el ejercicio ejerce un efecto directo sobre la actividad antitumoral de las células T CD8+. Si bien nuestros datos sugieren que el PEx mejora la función de las células T CD8+, se necesita más investigación para determinar si este es un efecto primario o una consecuencia de la modulación inmunitaria ascendente. Además, el PEx mejoró la inmunidad antitumoral en un modelo de CRLM inmunogénico, pero no en modelos poco inmunogénicos, lo que limita la generalización inmediata a la población de CRC predominantemente pMMR/MSS. El trabajo futuro evaluará el PEx junto con estrategias de potenciación inmunogénica para determinar si la eficacia se puede ampliar en la CRC pMMR/MSS. Finalmente, aunque CXCL9 se reconoce como un marcador pronóstico favorable en la CRC, nuestro ensayo no estaba diseñado, dado el tamaño de muestra modesto y el seguimiento limitado, para determinar si los niveles perioperatorios de CXCL9 predicen la recurrencia postoperatoria de CRLM. Las interrupciones relacionadas con la pandemia (2020-2022) afectaron aún más la inclusión y la adherencia. Se necesitan cohortes más grandes y multicéntricas con un seguimiento más prolongado para establecer si los cambios en las frecuencias de CXCL9 y CXCR3+ CD8+ inducidos por el PEx y vinculados a las KCs están asociados con una reducción de la recurrencia y para informar el desarrollo de estrategias farmacológicas que imiten o potencien los efectos inmunomoduladores del ejercicio.

Disponibilidad de recursos

Investigador principal

Para obtener información adicional o solicitar recursos y reactivos, comuníquese con el investigador principal, Hongji Zhang (jhn5wx@virginia.edu).

Disponibilidad de materiales

No se generaron nuevos reactivos únicos en este estudio.

Disponibilidad de datos y código

Los datos brutos de secuenciación de ARN de una sola célula y los archivos informados en este estudio se han depositado en la base de datos GEO con el número de acceso GEO: GSE290055. Los datos de metabolómica se han depositado en el repositorio MetaboLights con el identificador de estudio MTBLS13419. Los datos de secuenciación de ARNr 16S se han depositado en el NCBI SRA como PRJNA1372431.

Este artículo no informa sobre código original.

Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este trabajo está disponible al investigador principal previa solicitud.

Investigador principal

Para obtener información adicional o solicitar recursos y reactivos, comuníquese con el investigador principal, Hongji Zhang (jhn5wx@virginia.edu).

Disponibilidad de materiales

No se generaron nuevos reactivos únicos en este estudio.

Disponibilidad de datos y código

Los datos brutos de secuenciación de ARN de una sola célula y los archivos informados en este estudio se han depositado en la base de datos GEO con el número de acceso GEO: GSE290055. Los datos de metabolómica se han depositado en el repositorio MetaboLights con el identificador de estudio MTBLS13419. Los datos de secuenciación de ARNr 16S se han depositado en el NCBI SRA como PRJNA1372431.

Este artículo no informa sobre código original.

Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este trabajo está disponible al investigador principal previa solicitud.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por los 10.13039/100000002 Institutos Nacionales de la Salud R01-CA214865 y R01-GM95566 a A.T., Institutos Nacionales de la Salud R01-GM137203 a H.H., y financiación estatal dentro del 10.13039/100008457 Centro Oncológico Integral de la Universidad de Virginia "Premio piloto IDEA-Cancer" y "Premio piloto de terapias contra el cáncer (CRX)" a H.Z. Agradecemos a Xinghua Liao y Pengyan Fa por su asistencia técnica. Los gráficos de los diseños experimentales se crearon con BioRender.com.

Contribuciones de los autores

Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito. Conceptualización: H.Z. y A.T.; curación de datos: Yunwei Zhang, Yiyu Zhang, C.S., J.L. y H.Z.; validación: H.W., Y.W., Y.X., A.H. y M.E.M.; reclutamiento de pacientes: A.E.; investigación: K.C.C.; análisis formal: Yunwei Zhang, C.S. y J.B.; adquisición de financiación: H.Z., A.T. y H.H.; administración del proyecto: H.Z. y A.T.; recursos: H.Z. y A.T.; validación: C.S.; supervisión: H.Z. y A.T.; redacción del borrador original: Yunwei Zhang, C.C. y H.Z.; y revisión y edición: H.Z., H.H., A.T. y Yunwei Zhang.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Reclutamiento de pacientes y adquisición de muestras

Este ensayo controlado aleatorio (ECA), titulado "El ensayo RIOT: Redefiniendo la fragilidad y mejorando los resultados con la prehabilitación para el cáncer de páncreas, hígado o estómago" (ID de ClinicalTrials.gov: NCT04602026), se llevó a cabo en el Centro Médico Universitario de la Universidad Estatal de Ohio, Columbus, Ohio, Estados Unidos. El protocolo del ensayo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB #2020C0128). Se inscribieron un total de 17 pacientes con CRLM programados para una resección hepática en el estudio, con 11 asignados al grupo sedentario y 6 al grupo de PEx. La cohorte consistió en 9 hombres y 8 mujeres, con una edad media de 55,6 ± 9,8 años (rango: 35-69). Los pacientes se sometieron a una evaluación de seguridad, que incluyó una evaluación del riesgo de caídas y una prueba de caminata de 2 minutos, durante su cita con su médico. Según la evaluación clínica, 6 participantes fueron asignados a regímenes de ejercicio en el hogar. Estos ejercicios se realizaron en casa al menos 3 veces por semana durante el período de PEx. El cumplimiento se controló mediante diarios de auto-informe diarios, que se entregaron en el momento de la cirugía, las visitas postoperatorias o por correo mediante un sobre con franqueo pagado proporcionado a los pacientes. El personal del estudio realizó llamadas telefónicas semanales para garantizar la adherencia y abordar las preocupaciones de los pacientes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la extracción de sangre. Las muestras de sangre se extrajeron en el momento de la inscripción y el día de la cirugía. El tumor y el tejido peritumoral del hígado se recolectaron siguiendo el protocolo estándar de recolección de muestras biológicas. La participación en el estudio fue voluntaria, y se informó a los sujetos que podían retirarse del estudio en cualquier momento sin penalización.

Ratones

Todos los estudios con ratones utilizaron ratones machos de 8 a 10 semanas de edad. Los ratones WT macho (C57BL/6J, número de stock 000664), los ratones BALB/cJ (número de stock 000651), los ratones Clec4f-Cre (C57BL/6J-Clec4fem1(cre)Glass/J, número de stock 033296), los ratones B6-DTR (C57BL/6-Gt (ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J, número de stock 007900), los ratones Cxcr3 KO (B6.129P2-Cxcr3tm1Dgen/J, número de stock 005796) y los ratones Cxcl9 KO (B6.129S4-Cxcl9tm1Jmf/J, número de stock 030285) se compraron a The Jackson Laboratory (EE. UU.). Los ratones que expresan receptores de toxina diftérica en las KCs (designados en adelante como ratones KC-DTR) se produjeron cruzando ratones Clec4f-Cre con ratones B6-DTR. Los ratones machos de 8 a 10 semanas se asignaron aleatoriamente a un grupo Sed o PEx. Para el PEx, los ratones corrieron en una cinta de correr motorizada (Columbus Instrument, Columbus, OH) con un régimen de ejercicio moderado de 12,5 metros por minuto durante 60 minutos al día, 5 días a la semana durante 4 semanas. Los ratones Sed y PEx se alojaron juntos o por separado durante 4 semanas. Todos los animales se alojaron en el Centro de Medicina Comparada (CCM) de la Universidad de Virginia (UVA) en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UVA y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) para el cuidado y uso de animales.

Líneas celulares tumorales

Las células de carcinoma de colon MC38 y CT26 que expresan la luciferasa de luciérnaga (FLuc) y los genes GFP se generaron utilizando el lentivirus Firefly Luciferase (FLuc)-IRES-Puro (Biosettia). Las células MC38 y CT26 se cultivaron en medio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB) y 100 UI/mL de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2.

Detalles del método

Modelo de CRLM promovido por estrés quirúrgico

Para establecer el modelo de CRLM promovido por estrés quirúrgico, se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena porta, a ratones Sed o PEx de 4 semanas, 2 × 105 células MC38-Luc-GFP (C57BL/6J) o 1 × 105 células CT26-Luc-GFP (BALB/cJ) suspendidas en 50 μL de PBS. Después de que las células tumorales circularan durante 15 minutos, los ratones se sometieron a un procedimiento de isquemia y reperfusión segmentaria hepática (70%) no letal, que consistió en 1 hora de isquemia seguida de reperfusión. Los ratones se sacrificaron 3 semanas después de la inyección de las células tumorales.^[27],^[37]

Tratamiento de ratones portadores de tumores

En los estudios que involucraron la neutralización de CXCL9, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μg por ratón de anticuerpo anti-CXCL9 1 día antes de la cirugía, seguida de una inyección cada 3 días.^[86] Para administrar el antagonista de CXCR3, se inyectó a los ratones 5 mg/kg del antagonista de CXCR3 dos veces al día después de la cirugía.^[87] Para el tratamiento con CXCL9 recombinante, los ratones Sed recibieron una inyección intraperitoneal de CXCL9 recombinante (500 ng) después de la cirugía. Para el tratamiento con NaB, los ratones Sed recibieron una administración intragástrica diaria de NaB (350 mg/kg) después de la cirugía.^[88] Para el tratamiento con el inhibidor de HDAC3, los ratones Sed recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de 50 mg/kg de RGFP966 después de la cirugía.^[89]

Administración de antibióticos

El cóctel de ABx se preparó como se describió anteriormente.^[90] A los ratones del grupo pretratado con ABx se les administró un cóctel de antibióticos que consistió en ampicilina (0,1 g/kg), neomicina (0,1 g/kg), vancomicina (0,05 g/kg) y metronidazol (0,1 g/kg) por sonda oral dos veces al día durante 7 días antes de la inyección de las células tumorales, y luego se estableció el modelo de CRLM promovido por estrés quirúrgico.

Aislamiento y tratamiento de KCs

Las KCs se aislaron de las células no parenquimatosas (NPC) y se purificaron aún más mediante la clasificación por citometría de flujo secuencial con tinción anti-CD45 FITC y CLEC4F AF647 para las KCs utilizando el clasificador de células Sony MA900. Las células inmunitarias del hígado humano se aislaron mediante centrifugación de gradiente y las KCs se purificaron aún más utilizando microesferas magnéticas CD163+ como se describió anteriormente.^[91] Para el pretratamiento con el anticuerpo anti-CXCL9, las KCs (2 × 106 células por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se añadió 1 μg/mL del anticuerpo neutralizante anti-CXCL9^[92] al medio durante 24 horas. Posteriormente, las KCs se cocultivaron con células T CD8+ utilizando transwells.

Depleción y transferencia adoptiva de KCs

Los ratones Sed o PEx KC-DTR con depleción de KCs sirvieron como receptores. Las KCs de los ratones KC-DTR se agotaron mediante una inyección intraperitoneal de 200 ng de DT antes de la cirugía.^[29] Las KCs donantes se aislaron de los hígados de los ratones WT Sed o PEx como se describió anteriormente.^[27] Se transfirieron por vía intravenosa un total de 2 × 106 KCs de los donantes Sed o PEx a cada ratón receptor Sed o PEx 24 horas después de la depleción de las KCs. Posteriormente, los ratones receptores recibieron una inyección de tumor y se sometieron al modelo de I/R hepático 12 horas después de la transferencia adoptiva de las KCs donantes.

Aislamiento de los núcleos de las KCs

Los núcleos de las KCs se aislaron utilizando el protocolo de aislamiento de núcleos (10X Genomics cat# CG000169)^[93] en condiciones definidas. Brevemente, después de aislar las KCs, se eliminó el sobrenadante sin interrumpir el sedimento celular y las células se suspendieron en 1 mL de PBS + 0,04% de BSA. La mezcla se pipeteó suavemente 5 veces y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Después de centrifugar a 300 g durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante, las muestras se resuspendieron en tampón de lisis frío (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1% de Tween 20, 3 mM de MgCl2, 0,1% de NP-40, 0,01% de digitonina, 1% de BSA, 1 mM de DTT y 1 U/μL de inhibidor de la RNasa), pipeteando de arriba abajo 10 veces. Después de 3 minutos de lisis sobre hielo, se añadió 1 mL de tampón de lavado frío, se pipeteó la mezcla 5 veces y se centrifugó a 500 g durante 5 minutos a 4 °C. Después de 3 lavados, los núcleos se resuspendieron en tampón de núcleos diluido y se midió la concentración de núcleos tomando la media de dos recuentos separados utilizando azul de tripano (Thermo Fisher) y el instrumento Countess II (Thermo Fisher). Se observó menos del 5% de células viables cuando se visualizaron con el Countess.

Aislamiento y tratamiento de las células T CD8+

Las células T CD8+ del hígado y del tumor de ratón y las células T CD8+ humanas de las células mononucleares de la sangre periférica se aislaron utilizando un kit de aislamiento de células T CD8+^[94],^[95] y se cultivaron en medio RPMI-1640 con un 10% de SFB y un 1% de penicilina/estreptomicina. Se añadieron anticuerpos anti-CD3 (5 μg/mL) y anti-CD28 (5 μg/mL) durante 24 horas. Para la estimulación con suero o CXCL9 recombinante, las células T CD8+ (2 × 106 células por pocillo) se cocultivaron con 100 μL de suero de ratón o humano, o 50 ng/mL de CXCL9 recombinante durante 24 horas.^[96] Para el pretratamiento con el antagonista de CXCR3, las células T CD8+ (2 × 106 células por pocillo) se cocultivaron con 100 nM de AMG 487 durante 24 horas.^[97] Posteriormente, las células T CD8+ se cocultivaron con KCs utilizando transwells.

Transferencia adoptiva de células T CD8+

Para la transferencia adoptiva de células T CD8+, se administró por vía intraperitoneal a los ratones WT Sed y PEx un anticuerpo anti-CD8 (200 μg/ratón, BioXcell) el día -1. A continuación, se transfirieron por vía intravenosa 2 × 106 células T CD8+ WT o Cxcr3 KO a los ratones Sed o PEx. La depleción y la transferencia adoptiva se repitieron el día 5 y se continuaron dos veces por semana hasta 3 semanas después de la inyección del tumor.^[98]

IVIS

Para controlar el crecimiento tumoral, se anestesiaron los ratones con isoflurano inhalado seguido de una inyección intraperitoneal de luciferina de potasio (150 mg/kg en PBS). Después de 10 minutos, para permitir la distribución de la luciferina, se visualizaron los ratones utilizando el bioluminiscente Spectral Instruments Lago X según las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron utilizando el software de imagen Aura. Las regiones abdominales se seleccionaron manualmente y se cuantificó la señal de bioluminiscencia (fotones por segundo; p/s).^[99]

Citometría de flujo

Las NPC del hígado y del tumor de ratón se aislaron como se describió anteriormente.^[27] Se obtuvieron suspensiones de células individuales utilizando kits de disociación del hígado o del tumor y luego se pasaron por un tamiz celular de 70 μm. La centrifugación diferencial separó las NPC de los hepatocitos o las células tumorales (50 g durante 5 minutos, repetido dos veces). El sobrenadante se centrifugó de nuevo (300 g durante 10 minutos) para obtener las NPC. Antes de la tinción intracelular, se cocultivaron 2 × 106 células/mL de NPC con 4 μL del cóctel de activación celular durante 4 horas. Los receptores Fc del ratón se bloquearon incubando las células con anti-CD16/CD32 en PBS durante 30 minutos a 4 °C. Las NPC se incubaron con tinte de viabilidad fijable en PBS durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, se tiñeron las células en la superficie, seguida de la tinción intracelular utilizando el conjunto de tampón de factores de transcripción BD Pharmingen según las instrucciones del fabricante. Después de la tinción intracelular, las células se suspendieron en tampón FACS y se analizaron en el citómetro de flujo espectral Aurora 5L (Cytek). Los datos se analizaron utilizando FlowJo para obtener el porcentaje de células inmunitarias del hígado y del tumor.

ELISA

Para determinar los niveles de CXCL9, Granzima B, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10 y TGF-β, se añadieron 50-100 μL de suero y 100 μL del cóctel de anticuerpos a los pocillos correspondientes del kit ELISA y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar los pocillos 3 veces, se añadieron 100 μL de sustrato TMB y se dejaron incubar en la oscuridad durante 10 minutos. A continuación, se añadió 100 μL de solución de parada y se agitó la placa durante 1 minuto. Por último, se registró la densidad óptica (DO) a 450 nm.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Preparación de la muestra y de la biblioteca

Se sacrificaron los ratones Sed y PEx portadores de tumores MC38 3 semanas después de la inyección del tumor. Se recogió el hígado y se procesó para obtener suspensiones de células individuales como se describió anteriormente. Las células inmunitarias CD45+ se clasificaron utilizando cuentas CD45+ de estas suspensiones de células individuales, obteniendo una pureza superior al 90%. El control de calidad de la muestra y la secuenciación de ARN de una sola célula se realizaron en la Universidad de Virginia. Después de verificar la calidad de la muestra y la concentración celular, con el objetivo de capturar 6000 células, las muestras se transfirieron a una placa de 96 pocillos preenfriada, se sellaron con calor y se realizó la transcripción inversa utilizando un termociclador de 96 pocillos Veriti. Después de la transcripción inversa, el ADNc se extrajo utilizando el reactivo de recuperación (10x) y se purificó con una limpieza con Silane DynaBead como se describe en la guía del usuario. El ADNc purificado se amplificó a continuación durante 12 ciclos, se diluyó en una proporción de 4:1 (tampón de elución, Qiagen, a ADNc) y se analizó en un Bioanalyzer (Agilent Technologies) para medir la concentración de ADNc. Se prepararon las bibliotecas de ADNc utilizando el kit de biblioteca de células individuales 3′ y cuentas de gel 10X Chromium (10X Genomics, Cat# PN-1000075).

Secuenciación

La concentración molar de cada biblioteca se determinó en función del tamaño de la biblioteca determinado por un Bioanalyzer (Agilent Technologies) y los datos de amplificación de qPCR (Kappa/Roche). A continuación, se mezclaron las muestras y se normalizaron a 10 nM y se diluyeron a 2 nM con tampón de elución (Qiagen) que contenía un 0,1% de Tween 20. Se mezcló un volumen de 150 μL de cada mezcla de 2 nM con un volumen igual de 0,1 N de NaOH y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las bibliotecas se diluyeron a 20 pM utilizando HT-1 (Illumina) y luego se ajustaron a una concentración de carga final de 14 pM. Se dispensó un volumen de 150 μL de la mezcla de 14 pM en cada pocillo de una tira de tubos de 8 pocillos y luego se cargó en un cBot (Illumina) para la generación de cúmulos. Las bibliotecas completadas se secuenciaron en un HiSeq 2500 a una profundidad de 300 millones de lecturas apareadas cuando se apuntaba a 10 000 células, con los siguientes parámetros de ejecución: Lectura 1-26 ciclos, Lectura 2-98 ciclos, Índice 1-8 ciclos.

Análisis de la expresión génica

Los archivos Fastq se generaron utilizando Cell Ranger mkfastq (10x Genomics) y se analizaron con el software Cell Ranger v7.0.0 de 10x Genomics. El mapeo de los archivos FASTQ se realizó utilizando el genoma de referencia mm10 (GRCm38.91). Realizamos un análisis preliminar de los datos utilizando CellRanger count/aggr y generamos un archivo que contiene tablas de códigos de barras, tablas de genes y matrices de expresión génica. El análisis de la expresión génica se realizó utilizando R (versión 4.0.0) y el paquete R Seurat (versión 3.1). Se excluyeron las células con 2500 genes y un porcentaje de genes mitocondriales superior al 10%. Después de la normalización de los datos, se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) con genes variables como entrada, y se identificaron los componentes principales (PC) significativos basándose en la función jackStraw.

Anotación del tipo de célula

Se utilizó un agrupamiento de dos pasos para determinar los tipos de células en este estudio. Se asignaron identidades celulares amplias mediante un agrupamiento de baja resolución mediante la función ‘FindClusters’ con una resolución de 0,1 después de eliminar los dobletes y realizar un análisis de expresión diferencial mediante la función ‘FindAllMarkers’ con los parámetros predeterminados. Se generaron un total de 9 cúmulos. Los DEG entre los dos cúmulos se identificaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con un valor p ajustado de