Bacterias modificadas mediante un sistema dual y células dendríticas permiten una administración precisa de IL-12 dentro del tumor y generan una potente respuesta inmunitaria antitumoral.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, y las opciones terapéuticas son limitadas para los pacientes que no responden a la quimioterapia o a la terapia dirigida convencionales.^[1] Aunque el bloqueo de los puntos de control inmunitario ha logrado respuestas clínicas duraderas en un subconjunto de cánceres, su eficacia en el CCR, particularmente en tumores con microsatélites estables (MSS), ha sido en gran medida decepcionante.^[2],^[3] La principal barrera es el microambiente tumoral (MET) profundamente inmunosupresor e inmunológicamente “frío”, caracterizado por una escasa infiltración de células T, una presentación de antígenos defectuosa y programas mieloides supresores dominantes que, en conjunto, limitan la eficacia de la inmunidad antitumoral.^[4],^[5]

La interleucina-12 (IL-12) es un orquestador central de la inmunidad antitumoral, capaz de conectar las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas al promover la maduración de las células dendríticas (CD), la polarización Th1, la activación de las células T citotóxicas CD8+ y la producción sostenida de IFN-γ.^[6],^[7],^[8],^[9] Los estudios preclínicos han demostrado consistentemente la capacidad de la IL-12 para transformar tumores con un microambiente inmunitario pobre en lesiones inflamadas y ricas en células T. Sin embargo, la traslación clínica de la IL-12 se ha visto gravemente limitada por su estrecho margen terapéutico. La administración sistémica induce toxicidades limitantes de la dosis, incluyendo hepatotoxicidad y síndromes de liberación de citocinas, al tiempo que se logra una exposición intratumoral insuficiente y poco controlada.^[10],^[11] Estos desafíos ponen de manifiesto una paradoja fundamental: la IL-12 es inmunológicamente indispensable, pero farmacológicamente inmanejable cuando se administra por vía sistémica.

Las estrategias recientes han buscado superar esta limitación mediante la administración localizada de citocinas, incluyendo la electroporación plasmídica intratumoral, los enfoques basados en ARNm y los vectores virales que codifican la IL-12 o citocinas relacionadas.^[12],^[13] Si bien estos métodos mejoran parcialmente la restricción espacial, siguen estando limitados por la expresión transitoria, la penetración limitada en la enfermedad metastásica y la incapacidad de adaptar dinámicamente la producción de citocinas a las señales intrínsecas del tumor. Además, la mayoría de las plataformas actuales desacoplan la administración de citocinas de los estados de activación inmune en tiempo real dentro del MET, lo que limita su capacidad para mantener respuestas antitumorales productivas.

Las nuevas perspectivas sobre la inmunología tumoral sugieren que el control tumoral duradero requiere no solo una activación inmune transitoria, sino también una coordinación temporal entre la señalización temprana de las citocinas y los programas de células T de larga duración. En particular, la señalización de la IL-12 y el IFN-γ se ha relacionado con el establecimiento de células T de memoria residentes en los tejidos (TRM), una población que se reconoce cada vez más como un determinante crítico de la vigilancia tumoral a largo plazo y la persistencia inmune.^[14] En paralelo, los probióticos y los productos terapéuticos microbianos diseñados han demostrado una capacidad única para colonizar preferentemente los tumores y remodelar los paisajes inmunitarios locales.^[15],^[16],^[17] Sin embargo, los sistemas de administración microbiana existentes se basan principalmente en la expresión estática de la carga útil y carecen de un control programable sobre la amplitud o el tiempo de la citocina, lo que limita tanto la seguridad como la eficacia.

Estas limitaciones ponen de manifiesto una necesidad insatisfecha fundamental: un paradigma de administración capaz de sincronizar la liberación de citocinas restringida espacialmente con la activación y la persistencia inmune, al tiempo que se mantiene la seguridad sistémica. Para abordar este desafío, desarrollamos una plataforma inmunoterapéutica de doble ingeniería que integra vectores microbianos vivos con CD modificadas genéticamente. En este sistema, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) diseñada sirve como un amplificador de citocinas localizado en el tumor, mientras que las CD diseñadas (CD diseñadas) proporcionan una administración dirigida y un soporte inmunitario costimulador. Al combinar la producción de citocinas bacterianas dependiente de la densidad y la hipoxia^[18],^[19] con la presentación de antígenos mediada por CD^[20] y la costimulación de células T^[21], esta plataforma permite la administración intratumoral de IL-12 controlada por retroalimentación, alineada con el contexto inmunitario en evolución del tumor.^[22] Aquí, demostramos que esta estrategia de doble célula remodela eficazmente el microambiente inmunosupresor del CCR, suprime el crecimiento del tumor primario y la metástasis hepática, y provoca una robusta inmunidad antitumoral local y sistémica sin inducir toxicidad sistémica. En conjunto, nuestros hallazgos respaldan una interfaz microbiana-inmune programable para la administración espacialmente restringida de IL-12 y la activación inmune en tumores con un microambiente inmunitario pobre.

Resultado

La construcción de bacterias diseñadas EcN-IL-12 permite la administración de IL-12 restringida al tumor con una toxicidad sistémica mínima

La IL-12 es una citocina heterodimérica compuesta por las subunidades IL12A (p35) e IL12B (p40), que orquesta las respuestas inmunitarias del tipo Th1, la activación de las CD y la citotoxicidad de las células T CD8+.^[6] El análisis de los conjuntos de datos de The Cancer Genome Atlas reveló que la baja expresión de IL12A o IL12B está significativamente correlacionada con peores resultados clínicos en el CCR, incluso en pacientes que se someten a terapia de bloqueo de puntos de control inmunitario (Figuras S1A-S1D). La comparación pan-cáncer demostró además que la expresión de IL12A se reduce ampliamente en los tumores en relación con los tejidos normales correspondientes (Figura S1E), lo que subraya su papel como una citocina inmunostimulante potencialmente suprimida en los cánceres.

Para aprovechar la potente actividad antitumoral de la IL-12 y, al mismo tiempo, limitar la exposición sistémica, diseñamos la cepa probiótica EcN para que exprese condicionalmente la IL-12 en los MET hipóxicos, con el objetivo de lograr una administración de citocinas restringida espacialmente. Con este fin, el promotor inducible por hipoxia pvhb se fusionó con el péptido de señal PelB y se colocó aguas arriba de la secuencia codificante de IL-12. El promotor pvhb, regulado por los sistemas Fnr y ArcAB, exhibe la máxima actividad en condiciones de bajo contenido de oxígeno (∼1%-2% O2), mientras que permanece mínimamente activo en condiciones normóxicas o totalmente anaeróbicas, lo que limita así la expresión de IL-12 a las regiones tumorales hipóxicas.^[19] Se incluyó PelB para facilitar la translocación periplásmica y el plegamiento oxidativo, un requisito previo para la formación correcta de los enlaces disulfuro y la bioactividad de la IL-12.^[23]

Utilizando la recombinación λ-Red, el casete pvhb-PelB-IL12 se insertó en el locus lacZ de EcN, generando la cepa recombinante EcN-IL12 (Figura 1A). En condiciones de cultivo hipóxicas, la proteína IL-12 se detectó predominantemente en la fracción de pellets bacterianos, según se evaluó mediante tinción de Coomassie y análisis de Western blot. La SDS-PAGE reductora reveló una banda de aproximadamente 70 kDa, mientras que las condiciones no reductoras mostraron una especie de mayor peso molecular consistente con los complejos de IL-12 enlazados por disulfuro (Figuras 1B y S2A-S2C). DnaK sirvió como control de carga. Los análisis de ELISA y Western blot indicaron además que solo se detectaron cantidades mínimas de IL-12 en el sobrenadante de cultivo, mientras que la interrupción mecánica de los pellets bacterianos mediante sonicación liberó eficientemente la IL-12 intracelular (Figuras 1C y 1D).

Para determinar si la IL-12 producida por las bacterias conservaba la actividad biológica, las células T CD8+ OT-I se cocultivaron con células tumorales MC38 que expresaban OVA en presencia de IL-12 recombinante o lisados derivados de EcN-IL12. Ambas condiciones dieron como resultado un aumento significativo de la citotoxicidad tumoral mediada por las células T CD8+ a las 24 y 48 horas (Figuras 1E y 1F), lo que demuestra que la IL-12 producida por EcN diseñada sigue siendo funcional in vitro.

A continuación, evaluamos la biodistribución, el perfil de seguridad y la eficacia antitumoral de EcN-IL12 in vivo. Tras la administración intravenosa de EcN-IL12 (1 × 106 unidades formadoras de colonias [UFC]) en ratones con tumores MC38, la colonización bacteriana se enriqueció fuertemente dentro de los tejidos tumorales, con solo una recuperación transitoria y de bajo nivel observada en el bazo y una detección mínima en el hígado o el riñón (Figuras 1G-1I). Al día 7 después de la inyección, la carga bacteriana se limitó en gran medida al sitio tumoral, lo que indica una persistencia preferencial dentro del MET. Es importante destacar que los ratones tratados con EcN-IL12 mantuvieron un peso corporal estable y no mostraron mortalidad asociada al tratamiento durante el período de observación, en contraste con los ratones que recibieron proteína de IL-12 recombinante, que mostraron una rápida pérdida de peso y una importante letalidad, lo que es consistente con la toxicidad sistémica de las citocinas (Figuras 1J y 1K). El examen histopatológico de los órganos principales, incluyendo el corazón, los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones, no reveló daños tisulares evidentes en el grupo tratado con EcN-IL12 (Figura 1O). Si bien se observaron alteraciones leves en la arquitectura esplénica en las cohortes tratadas con IL-12, no se detectaron signos de toxicidad orgánica evidente. Coherente con su actividad restringida al tumor, el tratamiento con EcN-IL-12 redujo significativamente el crecimiento, el volumen y el peso del tumor en comparación con el control de EcN (Figuras 1L-1N). En conjunto, estos resultados demuestran que EcN diseñada para expresar IL-12 permite la administración localizada y biológicamente activa de IL-12 dentro de los tumores, logrando una robusta eficacia antitumoral, al tiempo que minimiza la toxicidad sistémica.

A continuación, evaluamos la biodistribución, el perfil de seguridad y la eficacia antitumoral de EcN-IL12 in vivo. Tras la administración intravenosa de EcN-IL12 (1 × 106 unidades formadoras de colonias [UFC]) en ratones con tumores MC38, la colonización bacteriana se enriqueció significativamente dentro de los tejidos tumorales, observándose solo una recuperación transitoria y de bajo nivel en el bazo y una detección mínima en el hígado o el riñón (Figuras 1G–1I). Al día 7 después de la inyección, la carga bacteriana se limitó en gran medida al sitio del tumor, lo que indica una persistencia preferencial dentro del microambiente tumoral (TME). Es importante destacar que los ratones tratados con EcN-IL12 mantuvieron un peso corporal estable y no mostraron mortalidad asociada al tratamiento durante el período de observación, en contraste con los ratones que recibieron proteína IL-12 recombinante, que mostraron una rápida pérdida de peso y una letalidad sustancial, lo que sugiere toxicidad sistémica por citoquinas (Figuras 1J y 1K). El examen histopatológico de los órganos principales, incluido el corazón, los pulmones, el hígado, el bazo y el riñón, no reveló daños tisulares evidentes en el grupo tratado con EcN-IL12 (Figura 1O). Si bien se observaron alteraciones leves en la arquitectura esplénica en las cohortes tratadas con IL-12, no se detectaron signos de toxicidad orgánica evidente. Coherente con su actividad restringida al tumor, el tratamiento con EcN-IL-12 redujo significativamente el crecimiento, el volumen y el peso del tumor en comparación con el control EcN (Figuras 1L–1N). En conjunto, estos resultados demuestran que la EcN-IL-12 modificada genéticamente permite la administración localizada y biológicamente activa de IL-12 dentro de los tumores, logrando una robusta eficacia antitumoral, al tiempo que minimiza la toxicidad sistémica.

Las bacterias modificadas genéticamente inhiben el crecimiento de tumores inmunológicamente "fríos" y promueven la activación inmune local

Para investigar si la administración localizada de IL-12 mediante EcN modificada genéticamente puede modular la supresión inmune en tumores poco inmunogénicos, utilizamos el modelo de carcinoma colorrectal CT26, que se caracteriza por una baja infiltración de células T basales y una respuesta limitada al bloqueo de puntos de control inmunitarios (Figura 2A). Los ratones con tumores fueron tratados con PBS, EcN de tipo salvaje, IL-12 recombinante o EcN-IL12. En todos los grupos de tratamiento, el peso corporal se mantuvo relativamente estable durante el curso del tratamiento y no se observaron signos evidentes de toxicidad sistémica en los ratones tratados con EcN-IL12 (Figura 2B), lo que coincide con las observaciones en el modelo MC38.

Se monitoreó el crecimiento tumoral longitudinalmente después del inicio del tratamiento. Durante la fase temprana de la progresión tumoral, la cinética de crecimiento fue comparable entre los grupos de tratamiento, lo que refleja la velocidad de crecimiento relativamente lenta de los tumores CT26. En momentos posteriores, los tumores tratados con EcN-IL12 mostraron una marcada reducción en el crecimiento en comparación con los controles de PBS y EcN, como se indica en las curvas de crecimiento tumoral, el volumen tumoral al final del estudio y los pesos tumorales (Figuras 2C–2E). La IL-12 recombinante también logró una fuerte supresión tumoral, mientras que EcN-IL12 produjo un efecto antitumoral comparable sin toxicidad sistémica detectable, lo que destaca la ventaja terapéutica de la administración de citoquinas restringida al tumor en este entorno inmunorresistente.

Para determinar si el control tumoral se correlaciona con la activación inmune local, examinamos a continuación la infiltración de células inmunitarias dentro de los tejidos tumorales. El análisis inmunohistoquímico reveló un aumento significativo en la densidad de células T CD8+ intratumorales después del tratamiento con EcN-IL12, alcanzando niveles comparables a los inducidos por la administración sistémica de IL-12 (Figuras 2F y 2G). También aumentó la infiltración de células T CD4+, aunque en menor medida que las células T CD8+ (Figuras 2H e 2I), lo que es consistente con una respuesta inmune predominantemente citotóxica y sesgada hacia Th1 inducida por IL-12.

A continuación, evaluamos la apoptosis de las células tumorales mediante la tinción para la caspasa-3 escindida. El tratamiento con EcN-IL12 resultó en un aumento significativo de las células positivas para la caspasa-3 dentro de los tejidos tumorales, lo que indica una mayor apoptosis de las células tumorales (Figuras 2J y 2K). En comparación con los controles de PBS y EcN, tanto los grupos de EcN-IL12 como los de IL-12 recombinante mostraron índices apoptóticos elevados, lo que es consistente con la actividad inmune citotóxica impulsada por IL-12.

Para caracterizar aún más el entorno de citoquinas asociado con el control tumoral mediado por IL-12, analizamos primero conjuntos de datos transcriptómicos de CRC humanos. La expresión de IL12A e IL12B se correlacionó positivamente con IFNG, TNF y GZMB y negativamente con TGFB1, lo que sugiere una asociación entre la señalización de IL-12 y los programas inmunitarios citotóxicos y proinflamatorios en el CRC humano (Figuras S3A–S3D). Coherente con estas observaciones, el análisis ELISA de los lisados tumorales de CT26 demostró niveles significativamente elevados de IL-12 intratumoral en los tumores tratados con EcN-IL12 (Figura 2L). Los niveles de TNF-α aumentaron en los grupos de EcN y EcN-IL12 (Figura 2M), lo que es consistente con la estimulación inmune innata por el chasis bacteriano. Como se esperaba, las concentraciones de IL-12 fueron elevadas en los tumores de los ratones tratados con IL-12 recombinante y EcN-IL12 (Figura 2N), lo que valida la administración eficaz de citoquinas. En particular, el tratamiento con EcN-IL12 condujo a un aumento significativo de los niveles de granzima B intratumoral (Figura 2O), mientras que los niveles de TGF-β se mantuvieron en gran medida sin cambios entre los grupos de tratamiento (Figura 2P), lo que indica una mayor citotoxicidad sin una mayor amplificación de la señalización inmunosupresora.

El circuito impulsado por el "quorum sensing" amplifica la producción de IL-12 intratumoral y mejora la eficacia antitumoral

Para mejorar aún más el control espacial y la inducibilidad de la expresión de IL-12 dentro de los tumores, diseñamos EcN con un módulo de "quorum sensing" (QS) integrado^[18] junto con un circuito sincronizado de lisis bacteriana^[24],^[25] (Figura 3A). Este módulo LuxI/LuxR responde a la acumulación de acil-homoserina lactona (AHL) y coordina la expresión de IL-12 dependiente de la densidad en las poblaciones bacterianas que colonizan el tumor, mientras que el módulo de lisis permite la liberación periódica de la citoquina extracelular una vez que la población alcanza un umbral crítico. El análisis de Western blot confirmó una robusta expresión de IL-12 tanto en las fracciones de pellets bacterianos como en el sobrenadante de la cepa de QS modificada (EcN-IL12-QS), mientras que no se observó ninguna señal detectable en los controles de EcN de tipo salvaje (Figura 3B). Para comparar la expresión constitutiva frente a la regulada por QS, cultivamos las cepas EcN-IL12 y EcN-IL12-QS en condiciones anóxicas, hipóxicas y normóxicas. Ambas cepas mostraron un crecimiento bacteriano mejorado en condiciones hipóxicas, lo que es consistente con el rango de actividad del promotor pvhb sensible a la hipoxia, con EcN-IL12-QS que mostró una cinética de crecimiento comparable o ligeramente acelerada (Figura S4A). Los análisis ELISA y de Western blot demostraron además que, en condiciones hipóxicas, los niveles totales de IL-12 liberados en el sobrenadante de cultivo fueron significativamente más altos en la cepa regulada por QS que en la cepa constitutiva, lo que es consistente con la liberación extracelular mediada por la lisis sincronizada de IL-12 después de la activación del circuito dependiente de la densidad (Figuras S4B y S4C). Estos datos indican que la regulación por QS mejora la producción de IL-12 en condiciones de oxígeno relevantes para el tumor, al tiempo que mantiene una baja expresión en condiciones de normoxia.

Para validar el comportamiento dinámico del circuito QS, utilizamos mCherry como un reportero independiente, inducido por IPTG. La citometría de flujo reveló patrones de fluorescencia oscilatorios a lo largo del tiempo, lo que es consistente con los ciclos de activación y lisis dependientes de la densidad (Figura 3C). A concentraciones más bajas de IPTG (0,5 mM), la fluorescencia exhibió un patrón característico de subida-bajada-subida, lo que indica una dinámica poblacional controlada por retroalimentación. En consecuencia, las mediciones de OD600 bacteriano mostraron oscilaciones sincronizadas, lo que confirma que la fluorescencia de mCherry refleja el comportamiento de crecimiento y lisis bacteriano en lugar de la expresión constitutiva (Figura S4D).

A continuación, evaluamos la consecuencia funcional de la liberación de IL-12 regulada por QS in vitro. En un sistema de cocultivo triple que consiste en células tumorales MC38-OVA, células T CD8+ OT-1 y bacterias modificadas genéticamente, EcN-IL12-QS indujo el nivel más alto de muerte de células tumorales en comparación con EcN-IL12 constitutiva o tratamientos de control (Figuras S4E y S4F). Estos resultados demuestran que la liberación pulsátil de IL-12 mediada por QS mejora la citotoxicidad de las células T CD8+ in vitro. Dada la importancia clínica de la reversibilidad y la bioseguridad, evaluamos la sensibilidad a los antibióticos de la cepa QS. Los ensayos in vitro mostraron que la administración de ciprofloxacina eliminó eficazmente EcN-IL12-QS en 24 horas, lo que confirma que la cepa modificada genéticamente sigue siendo susceptible a los antibióticos estándar (Figuras S4G y S4H).

A continuación, evaluamos la eficacia antitumoral de las bacterias modificadas genéticamente QS in vivo. Los ratones con tumores MC38 fueron tratados por vía intravenosa con PBS, IL-12 recombinante, EcN, EcN-QS (circuito QS sin IL-12) o EcN-IL12-QS en los días 7 y 14 después de la implantación del tumor (Figura 3D). La cuantificación de UFC demostró una colonización preferencial y sostenida de EcN-IL12-QS dentro de los tumores, con una carga bacteriana mínima detectada en el hígado, el bazo o el riñón (Figuras 3E y 3F), lo que indica que la modificación genética QS no compromete el tropismo tumoral.

El análisis del crecimiento tumoral reveló que tanto EcN-QS como EcN-IL12-QS retrasaron la progresión tumoral en relación con PBS y EcN de tipo salvaje, lo que refleja una contribución modesta de la estimulación inmune innata bacteriana (Figuras 3G–3I). Es importante destacar que solo el grupo de EcN-IL12-QS logró una regresión tumoral significativa, lo que demuestra que la amplificación de la expresión de IL-12 mediada por QS proporciona un beneficio terapéutico más allá de los efectos mediados por el vector solo.

Coherente con el control tumoral mejorado, el análisis inmunohistoquímico mostró aumentos marcados en los leucocitos intratumorales CD45+, las células T CD4+ y las células T CD8+ en el grupo tratado con EcN-IL12-QS, con las células T citotóxicas CD8+ que representan la población infiltrante dominante (Figuras 3J–3L). La proteína IL-12 marcada con His se detectó exclusivamente en los lisados tumorales de los ratones tratados con EcN-IL12-QS, lo que confirma la expresión localizada de citoquinas in vivo (Figura 3M). El análisis ELISA reveló además que las concentraciones intratumorales de IL-12 e IFN-γ fueron significativamente más altas en el grupo de EcN-IL12-QS que en todos los demás grupos de tratamiento (Figuras 3N y 3P). Los niveles de TNF-α aumentaron modestamente (Figura 3O), lo que es consistente con la activación inmune innata mediada por bacterias.

Para establecer un punto de referencia adecuado para la eficacia de IL-12, realizamos un estudio de escalamiento de dosis de IL-12 recombinante en el modelo de tumor CT26 (Figura S5A). Se evaluaron dosis bajas (5 μg), medias (10 μg) y altas (20 μg). Si bien la IL-12 de alta dosis logró una fuerte supresión tumoral, se asoció con una pérdida de peso corporal significativa, mientras que la IL-12 de baja dosis mostró una eficacia limitada (Figuras S5B–S5E). La dosis media (10 μg) logró efectos antitumorales comparables a EcN-IL12-QS sin toxicidad evidente y, por lo tanto, se utilizó como control positivo en experimentos posteriores (Figuras S5B–S5F).

A continuación, comparamos la expresión constitutiva frente a la regulada por QS de IL-12 in vivo (Figura S6A). En ratones con tumores MC38, EcN-IL12-QS demostró una supresión tumoral superior en comparación con EcN-IL12 constitutiva, logrando aproximadamente un 50% de regresión tumoral en relación con los controles de PBS (Figuras S6B–S6D). Ambas cepas modificadas genéticamente se acumularon preferentemente en los tumores, mientras que EcN no modificada exhibió una distribución más amplia (Figura S6E). Los niveles de IFN-α en suero se mantuvieron dentro del rango normal en todos los grupos (Figura S6F), lo que indica una seguridad sistémica preservada.

Finalmente, exploramos los posibles mecanismos subyacentes a la eficacia mejorada. El tratamiento con EcN-IL12-QS resultó en los niveles más altos de IL-12 e IFN-γ intratumorales (Figuras S6G y S6H). El análisis de RT-qPCR cuantitativa reveló la regulación a la baja de los genes asociados con la angiogénesis (Vegfa y Vegfr2) junto con la regulación al alza de las quimiocinas inducidas por IFN-γ Cxcl9 y Cxcl10 (Figura S6I). Estos cambios son consistentes con la remodelación vascular mediada por el sistema inmunitario, aunque no evaluamos directamente la oxigenación tumoral.

En un modelo de metástasis hepática de CT26, el tratamiento con EcN-IL12-QS redujo significativamente la carga de metástasis y mejoró la supervivencia (Figuras S6J–S6M), lo que apoya la conclusión de que la expresión de IL-12 regulada por QS mejora la eficacia terapéutica, al tiempo que preserva la seguridad y el control espacial.

Un sistema de ingeniería dual mejora la administración de IL-12 y promueve la interacción entre células dendríticas y células T

Para superar aún más las limitaciones en la distribución bacteriana en los tejidos y mejorar aún más la administración de citocinas dirigida al tumor, desarrollamos una estrategia de ingeniería dual que combina EcN productora de IL-12 con células dendríticas (cDC) modificadas genéticamente. En este sistema, las cDC están diseñadas para facilitar el transporte bacteriano y proporcionar soporte costimulatorio para la activación de las células T, en lugar de reemplazar la presentación de antígenos endógenos ^[26]. Las cDC derivadas de la médula ósea se transfectaron para expresar CDH17, una molécula de adhesión asociada a tumores gastrointestinales ^[20], y CD137 (4-1BB), un receptor costimulatorio bien establecido que participa en la activación de las células T CD8+ ^[21] (Figura 4A).

Para examinar específicamente la contribución de la costimulación mediada por CD137, establecimos un sistema de cocultivo de cDC y células T específicas para un antígeno, utilizando células T CD8+ OT-1 marcadas con CFSE. Las células T se cocultivaron con cDC de control, cDC que expresan OVA (cDC-OVA) o cDC que coexpresan OVA y CD137 (cDC-OVA-CD137). El análisis citométrico de flujo reveló un aumento de la dilución de CFSE en el grupo cDC-OVA-CD137, lo que indica una mayor proliferación de células T impulsada por el antígeno (Figura S7A). De manera consistente, el análisis RT-qPCR mostró un aumento significativo en la expresión de los transcritos de Ifn-γ, Tnf-α y Gzmb en las células T expuestas a la costimulación de CD137 (Figuras S7B–S7D). La mayor secreción de IFN-γ, TNF-α y granzima B se confirmó además mediante ELISA (Figuras S7E–S7G), y la tinción intracelular de citocinas corroboró estos hallazgos (Figuras S7H y S7I). En conjunto, estos resultados demuestran que la expresión de CD137 en las cDC proporciona una potente señal costimulatoria que mejora la expansión de células T CD8+ específicas para el antígeno y la diferenciación efectora in vitro.

A continuación, caracterizamos la capacidad de las cDC para internalizar bacterias modificadas. El marcado de la membrana con DiI y la fluorescencia basada en GFP confirmaron la modificación genética exitosa de las cDC y la captación eficiente de EcN-IL12-QS. El análisis citométrico de flujo mostró un aumento dependiente de la dosis de las cDC GFP+ con el aumento de las proporciones de carga bacteriana (Figura 4B). La microscopía de fluorescencia reveló la localización intracelular de EcN-IL12-QS dentro de las membranas de cDC marcadas con DiI y los núcleos teñidos con DAPI dentro de las 2 horas posteriores al cocultivo (Figura 4C). La microscopía electrónica de transmisión confirmó además la presencia de bacterias intactas encerradas dentro de estructuras vesiculares intracelulares (Figura 4D).

El análisis de la serie temporal demostró que EcN-IL12-QS permaneció viable dentro de las cDC durante varias horas, mientras que la viabilidad de las cDC se mantuvo en gran medida durante este período (Figuras 4E y 4F). Esta ventana de compatibilidad transitoria respalda la viabilidad de utilizar cDC como portadores bacterianos a corto plazo sin comprometer la integridad de las células huésped. Para evaluar las consecuencias funcionales de este sistema de ingeniería dual, las células eDC-EcN-IL12-QS se cocultivaron con células T CD8+, lo que resultó en un aumento significativo de la secreción de IL-12 e IFN-γ en comparación con las condiciones de control (Figuras 4G y 4H). Estos datos indican que la carga bacteriana intracelular no perjudica, y puede incluso mejorar, la capacidad inmunostimulatoria de las cDC in vitro.

Finalmente, evaluamos si esta interacción mejorada entre cDC y células T se tradujo en una mejor eliminación de las células tumorales. En un ensayo de citotoxicidad específico para el antígeno que utiliza células tumorales MC38 que expresan OVA, el cocultivo con eDC-EcN-IL12-QS y células T CD8+ marcadas con CFSE resultó en una extensa pérdida de células tumorales, como se visualizó mediante microscopía de fluorescencia (Figura 4I). El análisis cuantitativo confirmó una reducción significativa en la viabilidad de las células tumorales durante 48 horas en comparación con los grupos de control (Figura 4J). Estos resultados respaldan un modelo en el que la administración bacteriana mediada por cDC y la costimulación dependiente de CD137 actúan de manera cooperativa para mejorar la citotoxicidad mediada por las células T CD8+.

Un sistema de ingeniería dual suprime la metástasis hepática del cáncer colorrectal mediante la administración localizada de IL-12 y la activación inmune

Para evaluar directamente la contribución de las cDC como portadoras bacterianas, se trató a ratones con metástasis hepáticas de CT26 con cDC cargadas con EcN-IL12-QS o con la coadministración de cDC y EcN-IL12-QS (Figura S8A). Los ratones que recibieron bacterias cargadas en cDC exhibieron un número significativamente menor de nódulos metastásicos hepáticos en comparación con el grupo de coadministración (Figuras S8B y S8C). Este beneficio terapéutico se acompañó de una clara ventaja en la supervivencia, como lo indica un desplazamiento hacia la derecha en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura S8D).

El análisis inmunohistoquímico reveló además un aumento de las señales bacterianas intratumorales y una mayor infiltración de células inmunitarias, en particular células T CD8+, en el grupo cargado con cDC (Figura S8E). El análisis de biodistribución realizado en momentos tempranos y tardíos después del tratamiento demostró que la colonización bacteriana dentro de las metástasis hepáticas fue más de 3 veces mayor en el grupo cargado con cDC, mientras que la acumulación bacteriana fuera del objetivo en el riñón se redujo significativamente (Figura S8F). De manera consistente, el análisis ELISA mostró niveles marcadamente elevados de IL-12 e IFN-γ intratumorales en el grupo cargado con cDC (Figuras S8G y S8H). Es importante destacar que los niveles séricos de ALT y AST se mantuvieron dentro de los rangos fisiológicos normales en todos los grupos de tratamiento (Figura S8I), lo que indica que no hay evidencia de daño hepático evidente asociado con el tratamiento bacteriano en este modelo. En conjunto, estos datos indican que la carga intracelular de EcN-IL12-QS en cDC mejora la localización tumoral y la activación inmune en comparación con la coadministración.

Para analizar aún más las contribuciones funcionales de la orientación tumoral y la costimulación, se generaron cuatro variantes de cDC: cDC-EcN-IL12-QS (doble negativo), cDC-CDH17-EcN-IL12-QS (solo CDH17), cDC-CD137-EcN-IL12-QS (solo CD137) y cDC-EcN-IL12-QS de doble positividad (Figura S9A). En el modelo de metástasis hepática de CT26, el grupo de cDC-EcN-IL12-QS de doble positividad demostró el beneficio de supervivencia más pronunciado, superando tanto a los grupos de modificación única como al control solo bacteriano (Figura S9C).

El análisis de la carga metastásica mostró que el tratamiento con cDC-EcN-IL12-QS de doble positividad resultó en la mayor reducción de los nódulos metastásicos, mientras que las modificaciones de solo CDH17 o solo CD137 conferían un beneficio parcial (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7B, E). Los niveles de IL-12 intratumoral fueron más altos en el grupo de doble positividad, lo que se correlacionó con una mayor acumulación bacteriana dentro de los tejidos tumorales (Figura S9F). En particular, las cDC de solo CDH17 exhibieron una mayor localización bacteriana intratumoral que las cDC de solo CD137, lo que es consistente con un papel dominante de CDH17 en la orientación tumoral (Figura S9H). No se observaron cambios significativos en el peso corporal en los grupos de tratamiento con bacterias modificadas (Figura S9D), y los niveles séricos de ALT y AST se mantuvieron dentro de los rangos normales, lo que indica una seguridad hepática preservada (Figuras S9I–S9J).

Para caracterizar aún más la activación inmune dentro de las lesiones metastásicas, el análisis RT-qPCR reveló que los tumores del grupo de doble positividad exhibieron la mayor expresión de marcadores de activación de cDC y genes asociados con las células T CD8+, lo que es consistente con una mayor participación inmune local (Figura S9K). Estos hallazgos respaldan un modelo en el que la orientación tumoral (CDH17) y la señalización costimulatoria (CD137) actúan de manera cooperativa para maximizar la eficacia terapéutica en la enfermedad metastásica.

A continuación, evaluamos el rendimiento terapéutico del sistema de ingeniería dual en un modelo de metástasis hepática clínicamente relevante. Se trató a ratones BALB/c con metástasis hepáticas de CT26 por vía intravenosa a partir del día 7 con EcN, EcN-IL12-QS, cDC o sus combinaciones (Figura 5A). El análisis de Kaplan-Meier reveló que el tratamiento con cDC-EcN-IL12-QS prolongó significativamente la supervivencia en comparación con todos los demás grupos (Figura 5B). El examen macroscópico de los hígados mostró una extensa participación metastásica en los ratones tratados con PBS, EcN y solo cDC, mientras que el tratamiento con EcN-IL12-QS y cDC-EcN-IL12-QS redujo parcialmente la carga tumoral, y el grupo de ingeniería dual exhibió el menor número de lesiones metastásicas visibles (Figura 5C). El análisis histológico confirmó la reducción de la proliferación tumoral y el aumento de la infiltración de células inmunitarias en el grupo tratado de forma dual (Figura 5D). La tinción inmunohistoquímica demostró además una disminución de la positividad de Ki-67 y un aumento de las señales de IL-12 p70 en los tumores de los ratones tratados con cDC-EcN-IL12-QS (Figuras 5E–5G). El análisis cuantitativo mostró que tanto EcN-IL12-QS como cDC-EcN-IL12-QS redujeron significativamente el recuento de nódulos metastásicos y el peso del hígado, y el efecto más pronunciado se observó en el grupo de ingeniería dual (Figuras 5H e 5I). Las mediciones de ELISA confirmaron niveles elevados de IL-12 en los tejidos tumorales, mientras que las concentraciones de IFN-γ fueron más altas en el grupo de cDC-EcN-IL12-QS, lo que indica una robusta activación inmune de tipo Th1 (Figuras 5J–5L).

Un sistema de ingeniería dual activa la inmunidad antitumoral intratumoral y sistémica

Para dilucidar los mecanismos inmunes que impulsan la regresión tumoral, realizamos una inmunofenotipificación exhaustiva en el modelo de metástasis hepática de CT26 después del tratamiento con PBS, EcN, EcN-IL12-QS, cDC, cDC-EcN o cDC-EcN-IL12-QS (Figura 6A). El análisis citométrico de flujo de las células inmunitarias infiltrantes tumorales reveló que los ratones tratados con EcN productora de IL-12 exhibieron un aumento significativo de las cDC CD11c+ entre los leucocitos CD45+, y la frecuencia más alta se observó en el grupo de cDC-EcN-IL12-QS de ingeniería dual (Figura 6B). De manera consistente, la proporción de cDC CD11c+CD86+ activadas dentro de la población de cDC CD11c+ se elevó significativamente en este grupo (Figuras 6C y S10A), lo que indica una mayor activación local de las cDC.

A continuación, examinamos los estados de activación funcional de los subconjuntos inmunes dentro de las lesiones metastásicas hepáticas. Se detectó una mayor frecuencia de cDC CD11c+MHC-II+ en los tumores del grupo tratado de forma dual (Figuras 6D y S11A). En paralelo, las células T CD8+CD69+ activadas tempranamente (Figuras 6E, S10B y S11B) y los linfocitos T citotóxicos CD8+IFN-γ+ (Figuras 6F y S11C) se enriquecieron significativamente dentro de los tejidos metastásicos hepáticos después del tratamiento de ingeniería dual. Estos resultados indican la activación coordinada de las células presentadoras de antígenos y las células T citotóxicas dentro del microambiente tumoral (MET), en lugar de la expansión aislada de subconjuntos inmunes. Además de la remodelación inmune local, se observó una activación inmune sistémica en la sangre periférica. Los ratones tratados con EcN-IL12-QS o cDC-EcN-IL12-QS mostraron frecuencias significativamente aumentadas de cDC CD11c+MHC-II+ (Figuras 6G y S11D), células T CD4+ (Figuras 6H y S11E) y células T CD8+ (Figuras 6I y S11F) en la sangre periférica. Estos hallazgos sugieren que la administración localizada de IL-12 se asocia con una participación inmune sistémica más amplia, sin evidencia de toxicidad evidente impulsada por las citocinas.

Se examinó además la organización espacial de las células inmunitarias dentro de las lesiones metastásicas mediante inmunofluorescencia. Se encontró que las cDC CD11c+ y las cDC CD86+ activadas estaban en estrecha proximidad dentro de las regiones tumorales, lo que es consistente con los nichos de presentación de antígenos localizados (Figura 6J). Además, las células inmunitarias TNF-α+ se observaron con frecuencia adyacentes a las células T CD8+ (Figura 6K), lo que respalda la presencia de un microambiente inflamatorio activo en los sitios de control tumoral.

Como estrategia de terapia biológica viva, la capacidad de terminar la actividad bacteriana es fundamental para la seguridad clínica. Para evaluar la reversibilidad, se establecieron modelos de colonización de EcN-IL12-QS (bacterias libres) y cDC-EcN-IL12-QS (bacterias intracelulares), seguidos de la administración de ciprofloxacina (30 mg/kg) después de una localización bacteriana estable (Figura S12A). En los modelos de tumores subcutáneos, el tratamiento con antibióticos no afectó negativamente el peso corporal ni comprometió la eficacia antitumoral, según lo evaluado por el volumen tumoral y el peso tumoral (Figuras S12B–S12E). El análisis cuantitativo de las UFC demostró que las cargas bacterianas en los tumores y los órganos principales disminuyeron por debajo del límite de detección dentro de las 24 horas posteriores a la administración de antibióticos en ambos grupos libres y cargados en cDC (Figura S12F). De manera consistente, la tinción inmunohistoquímica para el antígeno O6 bacteriano confirmó la eliminación completa de las bacterias modificadas de los tejidos tumorales después del tratamiento con antibióticos (Figura S12G).

Se observaron hallazgos similares en el modelo de metástasis hepática CT26. La administración de antibióticos no disminuyó el beneficio en la supervivencia ni el control tumoral, al tiempo que eliminaba eficazmente las señales bacterianas de los tejidos hepáticos (Figuras S12H–S12K). El antígeno O6 bacteriano fue fácilmente detectable en los tumores antes del tratamiento con antibióticos, pero se volvió indetectable después de la administración de ciprofloxacina, independientemente de si las bacterias se administraron en forma libre o intracelular (Figuras S12I–S12L). Estos resultados demuestran que las cepas de EcN modificadas genéticamente pueden ser eliminadas de forma rápida y eficaz utilizando antibióticos estándar, lo que proporciona un mecanismo esencial de control de seguridad para una posible traslación clínica.

Discusión

Superar las limitaciones espacio-temporales de la administración de citocinas sigue siendo un desafío clave en el tratamiento de tumores inmunológicamente "fríos", como el CRC de tipo MSS. La IL-12 es una potente citocina inmunostimulante que une la inmunidad innata y adaptativa al activar las células dendríticas (DC) y promover las respuestas de las células T citotóxicas CD8+. Sin embargo, su utilidad clínica se ha visto gravemente limitada por toxicidades dependientes de la dosis, que incluyen inflamación hepática, trastornos hematológicos y síndromes similares a las tormentas de citocinas,^[6],^[27], lo que ha limitado tanto la flexibilidad de la dosis como la durabilidad terapéutica.

Para abordar estos desafíos, los esfuerzos recientes han explorado estrategias de administración de citocinas espacialmente restringidas, que incluyen Salmonella modificada para expresar IL-2,^[28], virus oncolíticos que codifican GM-CSF,^[29] y biomateriales sintéticos que permiten la liberación sostenida de citocinas.^[30] Si bien estos enfoques mejoran la exposición local a las citocinas, la mayoría siguen estando limitados por la cinética de expresión estática, la confinación incompleta a los tejidos tumorales o la coordinación insuficiente con los estados inmunitarios en evolución en el microambiente tumoral (TME). Además, aunque los vectores microbianos y celulares exhiben un tropismo tumoral intrínseco,^[31],^[32], pocas plataformas acoplan dinámicamente la liberación de citocinas a la densidad bacteriana, el contexto tisular y los umbrales de activación inmune.

En los últimos años, la inmunoterapia basada en IL-12 ha experimentado un cambio de paradigma, pasando de la administración sistémica de proteínas a sistemas de administración localizados modificados genéticamente, como se resume en múltiples revisiones exhaustivas.^[33],^[34],^[35] Dentro de este panorama, la modificación de las DC mediada por vectores virales ha surgido como una estrategia importante. Los vectores adenovirales (Ad) ofrecen una alta eficiencia de transducción y, lo que es importante, pueden activar los sensores antivirales del huésped, como las vías TLR9 y cGAS-STING, funcionando así como potentes adyuvantes intrínsecos que promueven la polarización Th1.^[36] Sin embargo, la traslación clínica de las plataformas basadas en Ad sigue estando limitada por la inmunidad preexistente contra el vector y la rápida inducción de anticuerpos neutralizantes, especialmente con dosis repetidas, lo que restringe la durabilidad terapéutica.^[37] Los sistemas lentivirales han mejorado la eficiencia de transducción de las DC a través de avances como las partículas similares a virus que contienen Vpx, que superan la restricción de SAMHD1,^[38], pero las preocupaciones sobre la mutagénesis insercional, la complejidad regulatoria y la fabricación con buenas prácticas de fabricación (GMP) siguen siendo barreras para el despliegue clínico a gran escala.

Aquí, describimos un sistema de administración de doble ingeniería que integra EcN secretora de IL-12 regulada por QS con DC modificadas genéticamente (DCm) que expresan CDH17 y CD137, lo que permite un control espacial, temporal e inmunológico coordinado. La EcN modificada genéticamente coloniza preferentemente las regiones tumorales hipóxicas y activa la expresión de IL-12 en condiciones microaerofílicas, mientras que la lisis mediada por QS impone una liberación de citocinas pulsátil dependiente de la densidad. Tanto los ensayos de reportero in vitro como los análisis in vivo demostraron una dinámica de expresión oscilatoria, consistente con el comportamiento cíclico de la población bacteriana que amplifica la exposición local a las citocinas, al tiempo que limita el desbordamiento sistémico (Figura 7).

El componente de DCm mejora aún más este sistema al proporcionar un homing tumoral activo a través de CDH17 y una activación sostenida de las células T a través de CD137.^[39],^[40] Cuando se combinan, estas características establecen una cascada coordinada de "activación-sostenimiento-memoria" que une la activación temprana de la inmunidad innata con la memoria adaptativa a largo plazo.^[41],^[42] Esto está respaldado por una mayor infiltración de células T CD8+ y la producción de IFN-γ, lo que indica la formación de células T de memoria residente (TRM).^[43] Si bien nuestros datos demuestran una mayor activación y persistencia de las células T efectoras dentro de los tejidos tumorales, el alcance en el que se establece la memoria inmunológica a largo plazo requiere una mayor investigación. En particular, la inducción de TRM se alinea con los conceptos emergentes de la histéresis inmune, en la que la exposición temprana a las citocinas da forma a fenotipos inmunitarios duraderos a través de la retroalimentación dependiente de IL-10R.^[14]

Este trabajo se basa en los avances recientes en la ingeniería de probióticos para la inmunoterapia contra el cáncer, pero extiende el paradigma al incorporar una lógica inmunológica programable dentro de los vehículos de administración vivos.^[32] El comportamiento oscilatorio conferido por el circuito QS introduce una capa adicional de control que puede mejorar el equilibrio entre seguridad y eficacia en relación con los diseños de liberación continua. Desde una perspectiva traslacional, ambos componentes de esta plataforma tienen precedentes clínicos favorables. EcN es un probiótico bien caracterizado con un historial de seguridad establecido en humanos,^[4],^[5], y las inmunoterapias celulares basadas en DC están bajo investigación clínica activa en múltiples indicaciones de tumores sólidos.^[44],^[45] No obstante, persisten desafíos prácticos, que incluyen la eliminación bacteriana mediada por el huésped, la posible colonización fuera del objetivo y la complejidad logística de la manipulación de las DC ex vivo.

Una de las principales fortalezas de esta plataforma radica en su modularidad y extensibilidad. Se podrían incorporar sensores ambientales adicionales, como el pH, la actividad de las proteasas o las señales metabólicas específicas del tumor, para refinar aún más la especificidad espacial y la capacidad de respuesta. Además, la combinación con el bloqueo de los puntos de control inmunitario, las vacunas contra el cáncer o las terapias celulares adoptivas puede producir beneficios sinérgicos, especialmente en contextos tumorales "desérticos" desde el punto de vista inmunitario. Más allá de la IL-12, este sistema podría adaptarse para administrar otras citocinas, quimiocinas o biológicos que activen el sistema inmunitario de manera similar y controlada.

En resumen, describimos una interfaz microbiana-celular inmune programable que coordina la administración localizada de citocinas con la activación inmune intratumoral y sistémica, al tiempo que mantiene un interruptor de seguridad clínicamente viable a través de la eliminación mediada por antibióticos. Esta estrategia de doble ingeniería aborda las limitaciones de larga data de la terapia con IL-12 y proporciona un marco conceptual para inmunoterapias espacialmente confinadas y controladas lógicamente, diseñadas para reprogramar los tumores "fríos".

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. Primero, aunque nuestros datos respaldan la actividad restringida al tumor de la plataforma EcN modificada genéticamente, no cuantificamos directamente los gradientes de oxígeno intratumorales ni la dinámica de lisis bacteriana in vivo a nivel de resolución de lesión única. En segundo lugar, si bien el sistema de doble ingeniería aumenta la activación de las células T efectoras y se asocia con características consistentes con las respuestas inmunitarias residentes en los tejidos, la memoria inmunológica a largo plazo no se prueba directamente a través de experimentos de reexposición. En tercer lugar, los estudios de metástasis hepática se realizan en modelos murinos, y el alcance en el que la distribución bacteriana, el tráfico de las DC y los perfiles de seguridad se traducirán a la enfermedad humana aún está por determinar. Finalmente, aunque la eliminación mediada por antibióticos proporciona un interruptor de seguridad importante, se requerirán estudios adicionales de farmacología, biodistribución y toxicología antes de la traslación clínica.

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. Primero, aunque nuestros datos respaldan la actividad restringida al tumor de la plataforma EcN modificada genéticamente, no cuantificamos directamente los gradientes de oxígeno intratumorales ni la dinámica de lisis bacteriana in vivo a nivel de resolución de lesión única. En segundo lugar, si bien el sistema de doble ingeniería aumenta la activación de las células T efectoras y se asocia con características consistentes con las respuestas inmunitarias residentes en los tejidos, la memoria inmunológica a largo plazo no se prueba directamente a través de experimentos de reexposición. En tercer lugar, los estudios de metástasis hepática se realizan en modelos murinos, y el alcance en el que la distribución bacteriana, el tráfico de las DC y los perfiles de seguridad se traducirán a la enfermedad humana aún está por determinar. Finalmente, aunque la eliminación mediada por antibióticos proporciona un interruptor de seguridad importante, se requerirán estudios adicionales de farmacología, biodistribución y toxicología antes de la traslación clínica.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, póngase en contacto con el contacto principal, Guohui Wan (wanguoh@mail.sysu.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Los plásmidos, las cepas bacterianas y los protocolos de DC modificadas genéticamente generados en este estudio están disponibles a solicitud y previa firma de los acuerdos de transferencia de materiales correspondientes.

Disponibilidad de datos y código

•Todos los datos que se presentan en este estudio están disponibles en el artículo y en la información suplementaria. Los datos brutos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el contacto principal a solicitud.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos de este trabajo está disponible en el contacto principal a solicitud.

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Disponibilidad de datos y código

•Todos los datos que se presentan en este estudio están disponibles en el artículo y en la información suplementaria. Los datos brutos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el contacto principal a solicitud.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos de este trabajo está disponible en el contacto principal a solicitud.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación Médica de Shenzhen (D2403006), 10.13039/501100001809 el Fondo Nacional de Ciencias Naturales de China (82325013, 82473938, U25A20110, U22A20315, 81972885, 82473359, -T2541044 y 82504184), el Proyecto del Fondo Provincial de Guangdong para la Investigación Básica y Aplicada (2025A1515012732), el Programa de Planificación Científica y Tecnológica de Guangzhou (2024A04J6479), 10.13039/501100012226 el Fondo de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (24ykzy003), el Programa de Investigación Clínica "5010" de la Universidad de Sun Yat-Sen (2025003) y el Programa de Ciencia Postdoctoral de China (2025M772127).

Contribuciones de los autores

G.W., Y.D. y H.L. concibieron la idea y diseñaron los experimentos. Y.D., H.L., A.H.W., C.L., J.L., S.Y., M.X., Q.Z., R.L., Z.Z., H.Z., H.C., C.F. y Q.Y. realizaron la mayoría de los experimentos y analizaron los datos; Y.D. y H.L. realizaron el análisis bioinformático. J.F., Q.W., J.H. y Z.W. proporcionaron administración y supervisión. S.N. contribuyó al refinamiento conceptual del estudio y revisó el manuscrito. G.W. redactó el manuscrito. Todos los autores participaron en la aprobación final de las versiones enviadas y publicadas.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Líneas celulares

Se utilizan en este estudio las células HEK293T (riñón embrionario humano), HL60 (leucemia promielocítica humana), CT26 (carcinoma colorrectal de ratón) y MC38 (adenocarcinoma de colon de ratón). Las células HEK293T, HL60 y CT26 se obtienen de ATCC, y las células MC38 se obtienen de Sigma. Las células HEK293T, HL60 y MC38 se mantienen en DMEM, mientras que las células CT26 se mantienen en RPMI 1640, cada uno suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, y se cultivan a 37 °C en 5% de CO2. Las líneas celulares se autentican mediante el perfilado STR y se comprueba rutinariamente que son negativas para la contaminación por micoplasma.

Células primarias

Las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) primarias se aíslan de los fémures y las tibias de ratones BALB/c de 7 a 8 semanas de edad y se cultivan en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal, GM-CSF, TNF-α y LPS, según se describe a continuación.

Cepas bacterianas

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN; DSM 6601) se utiliza como la cepa bacteriana parental para la ingeniería genética y se mantiene en medio LB a 37 °C con agitación.

Animales

Se utilizan ratones BALB/c y C57BL/6J hembra (de 5 a 6 semanas de edad) para los estudios de tumores subcutáneos, y se utilizan ratones BALB/c macho (de 5 semanas de edad) para los estudios de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal, según se describe en las subsecciones pertinentes a continuación. Se utilizan ratones transgénicos OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J) como fuente de células T CD8+ específicas para el antígeno. Todos los ratones se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos con acceso ad libitum a alimentos y agua en habitaciones con temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los procedimientos con animales son aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Sun Yat-sen (SYSU-IACUC-2023-B0755).

Detalles del método

Condiciones de cultivo de líneas celulares y cepas

Todas las líneas celulares de mamíferos utilizadas en este estudio, incluidas HEK293T, HL60, CT26 y MC38, se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares Americanos (ATCC). Las células HEK293T, HL60 y MC38 se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Corning), mientras que las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Corning). Todos los medios se suplementaron con un 10% de suero bovino fetal (FBS; Newzerum), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (GIBCO), y los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las líneas celulares se analizaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando un kit comercial de ensayo de tinción de micoplasma (C0296, Beyotime) y se confirmó que estaban libres de micoplasma durante todo el estudio. La identidad de la línea celular se validó mediante el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) utilizando el sistema GenePrint 10 (B9510, Promega) de acuerdo con las directrices del fabricante. Las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) primarias se aislaron de los fémures y las tibias de ratones BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. Las células de la médula ósea se lavaron con PBS frío, se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm para obtener una suspensión de células individuales y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS, GM-CSF (50 ng/mL), TNF-α (20 ng/mL), LPS (20 ng/mL) y un reactivo antimicoplasma (Yeasen, 40607ES03). Las células se incubaron a 37 °C en 5% de CO2 durante 5 a 7 días para inducir la maduración de las células dendríticas. La cepa probiótica Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) se obtuvo del banco de cepas de nuestro laboratorio y se cultivó en medio LB estándar a 37 °C con agitación. Las cepas de EcN modificadas genéticamente que expresan marcadores fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, EcN-CFSE) se construyeron mediante electroporación de plásmidos y se almacenaron en suspensiones de glicerol a -80 °C para su uso a largo plazo.

Construcción de plásmidos

Para construir el sistema de expresión de IL-12, las secuencias de cDNA murino para pvhb (M30794.1), pelB (amplificado del vector pET-22b, Addgene #84863), il12a (NM008351.4) e il12b (NM001303244.1) se amplificaron por PCR y se ensamblaron en una sola casete de expresión que codifica una fusión PelB-IL12A-enlazador-IL12B-6×His bajo el control del promotor pvhb inducible por hipoxia. Todos los constructos se verificaron mediante secuenciación y se subclonaron en plásmidos de soporte apropiados para la integración en el genoma bacteriano o la purificación de proteínas. Para la integración cromosómica en EcN, la casete pvhb-PelB-IL12 se insertó en el locus lacZ utilizando un sistema de recombinación λ-Red en conjunto con la selección mediada por CRISPR-Cas9. Las células DH5α electrocompetentes se transformaron con el plásmido pREDCas9 y se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 45 s, seguido de un período de recuperación en medio LB y se sembraron en agar selectivo. Posteriormente, la EcN que contenía pREDCas9 se indujo con 1 mM de IPTG a 30 °C para promover la expresión de la recombinasa Red. El plásmido donante que contenía la casete de expresión de IL-12 se amplificó por PCR, se purificó y se co-electroporó (180 V, 450 mA) en células EcN competentes. Las células transformadas se sembraron en agar LB que contenía los antibióticos, IPTG y X-gal apropiados. Las colonias que presentaban un fenotipo blanco se analizaron mediante PCR de colonias y los clones validados se designaron como EcN-IL12. Las cepas modificadas genéticamente se cultivaron en medio LB sellado en condiciones hipóxicas (32 °C, 80 rpm) durante 24 horas antes de las aplicaciones posteriores.

Para construir cepas reguladas por el sistema de comunicación bacteriana (QS) de IL-12 (EcN-IL12-QS), el gen de la ARN polimerasa T7 flanqueado por los brazos de homología lacZ se amplificó por PCR a partir de pUC57-T7 y se insertó en el genoma de EcN utilizando un cribado azul-blanco. Las colonias positivas se verificaron mediante PCR de colonias y secuenciación. La cepa EcN-T7 resultante se co-electroporó con pTuLys2CMR2 (plásmido de circuito de lisis bacteriana sincronizada), que proporciona un módulo de lisis bacteriana sincronizada, y pT7-IL12A-enlazador-IL12B-6×His para reconstituir el sistema de expresión de IL-12 inducible acoplado a QS/lisis. En este diseño, la activación dependiente de la densidad del circuito LuxI/LuxR impulsa la expresión de IL-12 mediada por T7, mientras que el módulo de lisis permite la liberación periódica extracelular de la carga intracelular de IL-12. Los transformantes se seleccionaron en agar LB que contenía cloranfenicol y kanamicina y se validaron posteriormente mediante PCR.

Para la sobreexpresión de CDH17 y CD137 en células dendríticas, las secuencias de cDNA murino para cdh17 (NM019753.4) y cd137 (NM011612.2) se amplificaron por PCR y se subclonaron en vectores lentivirales que contenían etiquetas 6×His en el extremo C-terminal. Tras la verificación de la secuencia, los plásmidos se transformaron en E. coli DH5α y se cultivaron en agar LB con selección de ampicilina. Se obtuvieron preparaciones de plásmidos libres de endotoxinas utilizando el kit Endo-free Plasmid Mini Kit I (D6943, Omega) y se almacenaron a -20 °C hasta su uso en el empaquetamiento lentiviral.

Producción de lentivirus

Los vectores lentivirales que codifican CDH17 o CD137 se empaquetaron en células HEK293T utilizando un sistema lentiviral de tercera generación. Brevemente, las células HEK293T se sembraron a una confluencia de aproximadamente el 70% y se cotransfectaron con el plásmido de la columna vertebral lentiviral (CDH17-OE o CD137-OE), psPAX2 (Addgene #12260) y pMD2.G (Addgene #12259) utilizando el reactivo de transfección Lipo8000 (C0533, Beyotime), siguiendo el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes virales se cosecharon a las 48 y 72 horas después de la transfección, se pasaron a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos celulares y se concentraron mediante precipitación con polietilenglicol (PEG8000) para aumentar el título viral. Las partículas virales concentradas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C. Para la transducción de células dendríticas, las BMDC se incubaron con sobrenadantes virales suplementados con 8 μg/mL de polibreno (H8761, Sorabio) durante 24 horas. Las células transducidas se seleccionaron utilizando puromicina (540411, Sigma-Aldrich) durante tres días consecutivos a una concentración optimizada para establecer una expresión estable. La expresión del transgen se confirmó mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Extracción de proteínas totales de E. coli

Para el aislamiento de proteínas bacterianas, los cultivos nocturnos de E. coli se cosecharon por centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sedimento bacteriano se resuspendió en 4 mL de tampón de lisis occidental suplementado con 50 μL de lisozima (100 mg/mL) y se incubó sobre hielo durante 15 a 20 minutos con una agitación suave cada 5 minutos para facilitar la digestión de la pared celular. Tras la lisis, la suspensión se centrifugó a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para separar las fracciones de proteínas solubles (supernatante) e insolubles (pellet). La concentración total de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (P0009, Beyotime) y la absorbancia a 562 nm se midió con un lector de microplacas. Las concentraciones se calcularon en base a una curva estándar generada utilizando estándares de albúmina sérica bovina (BSA) diluidos en serie. Todas las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C para su uso posterior.

Western blotting

Se realizó Western blotting para detectar IL-12 y las proteínas de control de carga en lisados bacterianos o de células de mamíferos. Las concentraciones totales de proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (P0009, Beyotime) y se utilizaron cantidades iguales de proteínas (normalmente 30 μg por carril) que se desnaturalizaron en tampón de carga SDS que contenía β-mercaptoetanol y se hirvieron a 95 °C durante 10 minutos. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 10-12%) a un voltaje constante de 180 V y, posteriormente, se transfirieron a membranas de PVDF (IPVH00010, Millipore). Las membranas se preactivaron en metanol, se enjuagaron en tampón de transferencia y se ensamblaron en un sándwich de transferencia para la transferencia en húmedo (400 mA, 45 min, temperatura ambiente). Tras la transferencia, las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% en TBST (tampón salino con Tween 20 al 0,1%, FD9061, Fdbio) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las incubaciones con anticuerpos primarios se realizaron durante la noche a 4 °C en tampón de bloqueo utilizando las siguientes diluciones: anti-IL-12 p70 (30756-1-AP, Proteintech, 1:2000) y anti-DnaK (ab69617, Abcam, 1:5000) como control de carga interno. Después de tres lavados en TBST (5 minutos cada uno), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (cabeza de cabra anti-conejo o cabeza de cabra anti-ratón, FDR007/FDM007, Fdbio, 1:5000) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las manchas se revelaron utilizando quimioluminiscencia mejorada (ECL; FD8000, Fdbio) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP en condiciones de exposición optimizadas. Se utilizó la tinción con azul de Coomassie para evaluar el contenido total de proteínas y la integridad del gel en paralelo.

SDS-PAGE no reductora para la detección de proteínas diméricas

Para evaluar la formación de dímeros enlazados por enlaces disulfuro de IL-12, se realizó SDS-PAGE no reductora. Los lisados de proteínas totales se recogieron sobre hielo y se mezclaron con tampón de carga SDS que no contenía agentes reductores (DTT o β-mercaptoetanol). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la desnaturalización, preservando al mismo tiempo los enlaces disulfuro. Las proteínas (30 μg por carril) se separaron en geles de poliacrilamida al 12% a un voltaje constante de 180 V durante 60 minutos. Tras la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250 para visualizar el contenido total de proteínas. La presencia de bandas de aproximadamente 140 kDa en condiciones no reductoras se interpretó como evidencia de la formación de dímeros de IL-12 enlazados por enlaces disulfuro.

Ensayo de activación y citotoxicidad de células T

Para evaluar la función inmunostimulante de la EcN modificada genéticamente y la IL-12 recombinante, realizamos ensayos de activación y citotoxicidad de células T específicas para antígenos utilizando ratones transgénicos OT-I. Se recolectaron esplenocitos de ratones OT-I de 8 semanas de edad y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm. Las células sanguíneas rojas se lisaron utilizando un tampón de cloruro de amonio (R1010, Sorabio), y las células T CD8+ se aislaron mediante separación magnética utilizando MicroBeads CD8 y Columnas MACS (130-117-044, Miltenyi Biotec). Las células T CD8+ purificadas se activaron durante la noche en un medio RPMI 1640 completo suplementado con 150 U/mL de IL-2 recombinante (CM39, NovoProtein) y 1 μg/mL de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la placa (11453D, Gibco). Las células T activadas se cocultivaron con células tumorales MC38 que expresan OVA a una relación efector:objetivo (E:O) de 5:1 en presencia de EcN modificada genéticamente (1 × 106 UFC/mL), EcN-IL12, eDC-EcN-IL12-QS o proteína IL-12 recombinante (10 ng/mL). Los cocultivos se incubaron durante 24 o 48 h, y se adquirieron imágenes de campo claro para evaluar la eliminación de las células tumorales. La viabilidad tumoral se cuantificó midiendo el área cubierta por las células tumorales en cada punto temporal utilizando el software ImageJ. La eficiencia de la eliminación de células se expresó como: Viabilidad tumoral (%) = 100 × (área de las células tumorales en el tiempo t)/(área de las células tumorales en el tiempo 0).

ELISA de citocinas en la cepa EcN-IL12 y el microambiente tumoral

Para cuantificar la IL-12 y las citocinas asociadas tanto en los cultivos bacterianos como en los tejidos tumorales, se realizaron ensayos ELISA siguiendo protocolos establecidos.

Cultivos bacterianos

Las cepas de EcN-IL12 modificadas genéticamente se cultivaron en condiciones hipóxicas, y las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 4.000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante resultante se concentró utilizando un dispositivo de ultrafiltración con un punto de corte de peso molecular de 30 kDa (UFC803024, Millipore) y se lavó con PBS para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular. La fracción de proteína concentrada se resuspendió en PBS y se utilizó para el ELISA.

Tejidos tumorales

Las muestras tumorales se pesaron (∼100 mg) y se homogeneizaron en 5 mL de PBS preenfriado utilizando un mortero y una maza sobre hielo. Los homogeneizados se sonicaron utilizando un disruptor ultrasónico de tipo sonda (5 s encendido, 3 s apagado, durante 30 minutos), y luego se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recolectaron los sobrenadantes y se almacenaron sobre hielo antes de la cuantificación.

Los niveles de citocinas, incluyendo IL-12 (MULTI SCIENCES, EK212), IFN-γ (MULTI SCIENCES, EK280), Granzima B (GZMB, Proteintech, EK2173), TGF-β (Proteintech, KE10005) y TNF-α (Proteintech, KE10002), se midieron utilizando kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante. Para cada citocina, se generaron curvas estándar utilizando diluciones seriadas de los estándares recombinantes proporcionados. La absorbancia se leyó a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones se calcularon en base a curvas de calibración ajustadas por regresión.

Cuantificación de la distribución de bacterias modificadas genéticamente en ratones con tumores

Para evaluar la biodistribución in vivo de las cepas de E. coli modificadas genéticamente, se realizaron ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC) en tumores y tejidos de órganos principales después de la administración sistémica. A los ratones con tumores se les inyectó por vía intravenosa con 1 × 106 UFC de las cepas de EcN modificadas genéticamente. En los días 1, 3 y 7 posteriores a la inyección, se sacrificaron los ratones por dislocación cervical en condiciones estériles. Los tumores, el hígado, el bazo y los riñones se recolectaron asépticamente y se pesaron (∼100 mg por muestra). Los tejidos se homogeneizaron en 1 mL de PBS estéril utilizando un mortero y una maza de porcelana preenfriados. Los homogeneizados se agitaron vigorosamente y se diluyeron en serie en PBS. Se tomaron alícuotas (200 μL) de cada dilución y se sembraron en placas de agar LB suplementadas con gentamicina para recuperar selectivamente las cepas modificadas genéticamente. Las placas se incubaron a 32°C durante 16-18 horas. Las colonias bacterianas se fotografiaron sobre un fondo oscuro y se enumeraron manualmente. Los resultados se expresaron como UFC por gramo de tejido. Todos los experimentos se realizaron en triplicado biológico. Los recuentos de UFC se transformaron logarítmicamente antes del análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), y las comparaciones intergrupales se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0.

Preparación de BMDC cargadas con EcN-IL12-QS

Las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) se generaron como se describió anteriormente y se co-incubaron con las cepas de EcN-IL12-QS modificadas genéticamente para generar células dendríticas cargadas con bacterias intracelulares. Las BMDC se sembraron en DMEM sin antibióticos suplementado con 10% de FBS y se cocultivaron con EcN-IL12-QS a una relación de infección (MOI) de 1:100 (bacterias:células) a 37°C durante los períodos de tiempo indicados. Después de la co-incubación, se aspiró el sobrenadante del cultivo y las células se lavaron tres veces con PBS estéril para eliminar las bacterias extracelulares. Para eliminar las bacterias extracelulares restantes y preservar la viabilidad intracelular, las células se incubaron en DMEM completo que contiene 50 μg/mL de gentamicina durante 60 minutos a 37°C. Esta concentración mata eficazmente las E. coli extracelulares sin comprometer la viabilidad bacteriana intracelular. Después del tratamiento con gentamicina, las células se lavaron tres veces con PBS y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos a 4°C. El pellet resultante se resuspendió en medio fresco y se designó como BMDC cargadas con EcN-IL12-QS para aplicaciones posteriores.

Ensayos de viabilidad de células dendríticas

Para evaluar la viabilidad de las células dendríticas después de la carga bacteriana, se realizó un ensayo de exclusión de azul de tripan. Se mezclaron volúmenes iguales de suspensiones celulares 1:1 con una solución de azul de tripan al 0,4% (Beyotime, C1313S), y se cargaron 10 μL de la mezcla en una lámina de conteo celular automatizada Countstar (Countstar, C0010101). Las láminas se insertaron en el analizador de células Countstar BioLab para determinar el número de células viables (no teñidas) y no viables (teñidas de azul). La viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células viables en relación con el recuento total de células. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

Modelos murinos de tumores

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Sun Yat-sen. Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con acceso ad libitum a alimentos y agua, y se mantuvieron en ambientes con temperatura y humedad controladas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. De acuerdo con las pautas del comité de cuidado y uso de animales (IACUC), se siguieron estrictamente los puntos finales humanitarios, y los animales fueron sacrificados si los tumores excedían los 1500 mm3, si presentaban distensión abdominal o si se observaron signos de angustia.

Modelos de tumores subcutáneos

Se obtuvieron ratones hembra BALB/c o C57BL/6J de 5 semanas de edad del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Sun Yat-sen y se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 5 por grupo). Las células de cáncer colorrectal CT26 (BALB/c) o MC38 (C57BL/6J) se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de ∼80%, se recolectaron y se lavaron tres veces en PBS estéril. Un total de 1 × 106 células tumorales suspendidas en 100 μL de PBS se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón. Regímenes de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12 (1 × 106 UFC por ratón, i.v.). Las dimensiones del tumor se midieron cada dos días utilizando calibradores digitales. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula estándar: Volumen (mm3) = 0,5 × longitud × ancho2. El peso corporal se registró simultáneamente para controlar la toxicidad asociada al tratamiento. El tratamiento con formulaciones bacterianas o de células dendríticas se inició una vez que los tumores alcanzaron un volumen de ∼50 mm3.

Modelo de metástasis hepática de cáncer colorrectal

Para establecer metástasis hepáticas, las células de cáncer colorrectal murino CT26 se cultivaron en condiciones estándar y se recolectaron al 80-90% de confluencia. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se resuspendieron a 1 × 107 células/mL. Se confirmó la viabilidad celular (>95%) mediante exclusión de azul de tripan. A los ratones macho BALB/c de 5 semanas de edad se les administró 2% de isoflurano en oxígeno. En condiciones estériles, se realizó una pequeña incisión en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Utilizando una jeringa de insulina de 29G, se inyectaron lentamente 1 × 106 células CT26 en 100 μL de PBS en el parénquima esplénico. Se aplicó una torunda de algodón estéril durante 1 minuto después de la inyección para evitar fugas y sangrado. Se cerró la pared abdominal y la piel con suturas absorbibles. Se monitorearon los ratones hasta su recuperación completa y se devolvieron a sus jaulas. Regímenes de tratamiento: Una semana después de la implantación de células tumorales, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12, EcN-QS o EcN-IL12-QS (1 × 105 UFC por ratón, i.v.); eDC, DC-EcN-IL12-QS, DC-CD137-EcN-IL12-QS, DC-CDH17-EcN-IL12-QS, eDC-EcN o eDC-EcN-IL12-QS (1 × 106 células por ratón, i.v.); IL-12 (Alta: 20 μg; Media: 10 μg; Baja: 5 μg por ratón, i.v.); DC+EcN-IL12-QS (1 × 106 células DC y 1 × 105 UFC de EcN-IL12-QS por ratón); Antibiótico (Ciprofloxacina, 30 mg/kg, i.p.). Las suspensiones bacterianas se prepararon a partir de cultivos LB de la noche, se lavaron tres veces con PBS y se estandarizaron a la UFC deseada utilizando mediciones de OD600 (1 OD ≈ 1 × 108 UFC/mL). Las inyecciones se administraron a través de la vena de la cola una vez por semana. Los ratones de control recibieron volúmenes equivalentes de PBS. Se monitorearon los ratones para detectar la carga tumoral, la pérdida de peso y los signos de angustia. Al final del estudio o cuando los tumores alcanzaron los límites éticos, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores y los órganos principales para su posterior análisis.

Inmunohistoquímica y tinción con hematoxilina y eosina de secciones de tumores

Para evaluar la infiltración de células inmunitarias, la expresión de citocinas, la apoptosis y la proliferación de células tumorales, se realizaron tinciones de inmunohistoquímica (IHC) y tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en secciones de tumores incluidos en parafina. Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído tamponado al 10% durante 48 horas a temperatura ambiente, se deshidrataron a través de una serie de etanol, se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones seriales de 4 μm utilizando un micrótomo rotatorio, se montaron en portaobjetos con carga positiva y se dejaron secar durante la noche a 37°C o durante 2 horas a 60°C. Los portaobjetos se desparafinaron en xileno (2 × 10 minutos), se rehidrataron a través de concentraciones descendentes de etanol (100%, 95%, 85%, 70%) y se enjuagaron en agua destilada. La recuperación del antígeno se realizó utilizando un tampón de citrato (10 mM, pH 6.0) o un tampón de EDTA (pH 8.0) calentando en una olla a presión o en un microondas durante 20 minutos, seguido de enfriamiento y lavado con PBS. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos. Se bloqueó la unión inespecífica utilizando suero de cabra normal al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios diluidos en diluyente de anticuerpos: Anti-CD4 (GB15064, Servicebio, 1:200); Anti-CD8 (GB15068, Servicebio, 1:200); Anti-Caspasa-3 (GB12532, Servicebio, 1:200); Anti-Ki67 (GB121141, Servicebio, 1:500); Anti-IL-12p70 (30756-1-AP, Proteintech, 1:200); Anti-CD45 (GB113886, Servicebio, 1:200); Anti-O6 (bs-0658R, Bioss, 1:200). Después de los lavados con PBS (3 × 5 minutos), los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las señales se desarrollaron utilizando la solución de sustrato DAB (Servicebio), y las secciones se contrateñieron con hematoxilina. Las secciones adyacentes se tiñeron con hematoxilina y eosina siguiendo los protocolos estándar para evaluar la histopatología tumoral. Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio Olympus BX63, y se realizó un análisis cuantitativo de las células teñidas positivamente en al menos tres campos de alto poder (20×) seleccionados aleatoriamente por muestra utilizando el software ImageJ.

Análisis de citometría de flujo de linfocitos infiltrantes tumorales y sangre

Para perfilar las poblaciones de células inmunitarias en los tumores y la sangre periférica, se realizó una citometría de flujo multicolor en suspensiones de células individuales derivadas de los tejidos tumorales y la sangre venosa.

Disociación tumoral y preparación de células

Los tumores extirpados se picaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm³ y se sometieron a digestión enzimática en un tampón de disociación de tejidos a 37 °C durante 1 hora con agitación (220 rpm). Los tejidos digeridos se rompieron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz de 70 μm para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando un tampón de lisis de cloruro de amonio (10 minutos a temperatura ambiente) y las células se lavaron dos veces con PBS.

Sangre periférica

Se recolectó sangre total del plexo venoso retro-orbital en tubos tratados con anticoagulante. Después de la centrifugación, los glóbulos rojos se lisaron como se describió anteriormente y los leucocitos restantes se lavaron con PBS.

Tinción superficial e intracelular

Después del bloqueo del receptor Fc, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad: CD45-PerCP (Elabscience, E-AB-F1136J); CD3-PE (E-AB-F1013D); CD4-FITC (E-AB-F1097C); CD8-APC (E-AB-F1104D); MHC II-PE (E-AB-F0990D); CD11c-FITC (E-AB-F0991C); CD86-APC (E-AB-F0994E). Para la tinción intracelular, las células se fijaron en un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos, se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 en PBS que contenía un 0,5% de BSA y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se tiñeron con: Granzima B-FITC (Biolegend, 372205); IFN-γ-FITC (Biolegend, 505805). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo equipado con los láseres apropiados. Se aplicó la compensación utilizando controles de tinción única. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Análisis citométrico de flujo de la lisis bacteriana

Para controlar la lisis bacteriana inducida por el quorum sensing y la dinámica de la expresión de proteínas, se utilizó la citometría de flujo para cuantificar la fluorescencia del reportero en cepas de *E. coli* modificadas genéticamente. Se realizó una dilución de 1:100 de la cultura bacteriana nocturna y se inoculó en 30 mL de medio LB fresco que contenía los antibióticos apropiados. La expresión del gen reportero mCherry se indujo con concentraciones variables de IPTG (0,5–2 mM). Se recolectaron muestras bacterianas cada hora durante un máximo de 5 horas después de la inducción. En cada punto temporal, se recolectó 0,5 mL de la suspensión bacteriana, se centrifugó a 12.000 rpm durante 2 minutos y se lavó tres veces con PBS estéril. La intensidad de la fluorescencia de mCherry se midió utilizando un citómetro de flujo equipado con un canal PE (excitación: 561–587 nm). La selección se basó en los perfiles de dispersión directa/lateral para excluir los desechos, y se registraron al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Se utilizó un umbral de intensidad de fluorescencia para determinar la activación del circuito de quorum sensing y la extensión de la expresión del reportero asociada a la lisis.

Microscopía electrónica de transmisión

Para visualizar las bacterias intracelulares dentro de las células dendríticas y evaluar las características ultraestructurales, se realizó la microscopía electrónica de transmisión (MET). Las co-culturas BMDC-EcN-IL12 se recolectaron a aproximadamente el 80% de confluencia, se separaron suavemente y se fijaron inmediatamente en un 2,5% de glutaraldehído (preparado en un tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,4) a 4 °C durante 2 horas. Las células se lavaron tres veces con tampón de fosfato frío y se post-fijaron en un 1% de óxido de osmio (OsO4) durante 2 horas a 4 °C para preservar la integridad de la membrana y el contraste. Las muestras se deshidrataron secuencialmente en etanol graduado (30%–100%) y luego se trataron dos veces con un 100% de óxido de propileno (15 minutos cada vez). Los especímenes deshidratados se infiltraron con resina epoxi:óxido de propileno (1:1) durante 2 horas, seguido de una incubación durante la noche en resina pura. La polimerización se llevó a cabo a 60 °C durante 48 horas. Se cortaron secciones ultrafinas (60–70 nm) utilizando un ultramicrotomo, se montaron en rejillas de cobre y se tiñeron con un 2% de acetato de uranilo y citrato de plomo. Las rejillas se examinaron en un MET que funcionaba a 80–100 kV, y se adquirieron imágenes digitales utilizando el software Olympus Viewer. Se identificaron y documentaron los compartimentos subcelulares que contenían bacterias intracelulares para la evaluación morfológica.

Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal

Para evaluar la internalización bacteriana, las interacciones entre las bacterias y las células dendríticas y la expresión de marcadores inmunitarios, se realizó la tinción de inmunofluorescencia en células vivas y en secciones de tumores congelados, seguida de la microscopía confocal.

Imagen basada en células

Las células HL60, las células dendríticas inmaduras y las células dendríticas maduras se cultivaron hasta alcanzar un 70–80% de confluencia, se lavaron con PBS y se tiñeron con 5 μM de DiI (Beyotime, C1036) en RPMI 1640 sin suero a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad. Las células teñidas se lavaron tres veces con medio completo y se sembraron en placas de fondo de vidrio para microscopía confocal para su adherencia. Las cepas de EcN-IL12 modificadas genéticamente se cultivaron hasta la fase logarítmica media, se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS que contenía 10 μM de CFSE (Invitrogen, C34554). Las bacterias se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, se apagó la reacción con un 10% de FBS y se lavaron tres veces con PBS. La densidad bacteriana se estandarizó a OD600 ≈ 1 (aproximadamente 1 × 108 UFC/mL). Las bacterias marcadas con CFSE se añadieron a las células marcadas con DiI en una proporción de 1:200 y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las células se lavaron a fondo para eliminar las bacterias no adheridas y se trataron con 100 μg/mL de gentamicina durante 30 minutos para eliminar las bacterias extracelulares. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante 15 minutos, se lavaron y se contratiñeron con DAPI (1 μg/mL, 5 minutos). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Olympus FV3000. Los fluorocromos se excitaban a las siguientes longitudes de onda: DiI (549 nm, rojo), CFSE (488 nm, verde), DAPI (405 nm, azul). Las imágenes se procesaron con Olympus Fluoview e ImageJ para el análisis de la intensidad de la fluorescencia y la colocalización.

Secciones de tejido tumoral

Los tejidos tumorales recién extirpados se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 24 horas, se crioprotegieron en sacarosa graduada (10%, 20%, 30%) y se incluyeron en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Los bloques congelados se cortaron en secciones de 8–10 μm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se permeabilizaron con un 0,2% de Triton X-100 durante 10 minutos, se bloquearon con un 5% de BSA durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios (1:200): CD11c (AiFang Biological, AFRM0294); CD86 (AFRM9023); CD4 (AFRM9419); CD8 (AFRM0004). Después de los lavados con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o 594 (Abcam, 1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos se contratiñeron con DAPI y los portaobjetos se montaron utilizando un medio anti-desvanecimiento (Beyotime, P0126). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal FV3000 en condiciones de adquisición consistentes.

Ensayo de co-estimulación in vitro de células T y células dendríticas

Construcción de células dendríticas

Las BMDC se indujeron y diferenciaron a partir de la médula ósea de ratones C57bl/6. Se utilizó un sistema de transducción lentiviral para construir células dendríticas que expresaran ovalbúmina (OVA) (DC-OVA) o células dendríticas que coexpresaran OVA y CD137 (DC-OVA-CD137).

Selección y marcaje de células T

Las células T CD8+ naive se seleccionaron negativamente a partir de los bazo de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec). Las células se marcaron con 5 μM de CFSE (Thermo Fisher) a 37 °C en la oscuridad durante 10 minutos, seguido de la terminación de la reacción con un medio que contenía suero.

Co-cultivo

Las células T marcadas se co-cultivaron con eDC en una proporción de 10:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 72 horas.

Análisis citométrico de flujo

Las células se recolectaron. La dilución de la intensidad de la fluorescencia de CFSE en la población CD8+ se detectó utilizando un citómetro de flujo para evaluar la proliferación.

Ensayo funcional

Las células se recolectaron para la detección posterior de la expresión de ARNm mediante RT-qPCR. Después de bloquear el transporte de Golgi con Brefeldin A y Monensin durante 4 horas, se realizó la tinción intracelular (IFN-γ, Granzima B). Las concentraciones de TNF-α, Granzima B e IFN-γ en el sobrenadante se detectaron mediante ELISA.

Lisis inducida por IPTG

EcN-IL12-QS se inoculó en medio líquido LB y se cultivó con agitación a 37 °C hasta que OD600 alcanzó 0,2. La cultura bacteriana se dividió en dos; el grupo experimental recibió IPTG a una concentración final de 0,5 mM, 1 mM y 2 mM, mientras que el grupo de control recibió el mismo volumen de disolvente. Se midió OD600 cada 2 horas utilizando un espectrofotómetro para trazar la curva de lisis.

Cultivo en hipoxia, anoxia y normoxia

Las cepas EcN-IL12 y EcN-IL12-QS se inocularon en diferentes condiciones de oxígeno. El grupo de normoxia se colocó en una incubadora estándar (21% de O2, 5% de CO2), el grupo de anoxia se colocó en un anaero pack, mientras que el grupo de hipoxia se colocó en una estación de hipoxia (Baker Ruskinn) con condiciones de gas establecidas en 1% de O2, 5% de CO2, 94% de N2. Los sobrenadantes se recolectaron después de 24 y 48 horas de cultivo.

Detección de ALT/AST

Se mezclaron 20 μL de muestra de suero con 80 μL de solución de matriz en una placa de 96 pocillos. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 20 μL de solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina a cada pocillo, y la placa se incubó a 37 °C durante 20 minutos adicionales. Finalmente, se añadieron 200 μL de solución de parada para terminar la reacción. La absorbancia se midió a 510 nm utilizando un lector de microplacas. Los niveles de actividad se calcularon en función de las curvas estándar generadas utilizando estándares de piruvato de sodio.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se aisló el ARN total de las células o tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras se lisaron en TRIzol y se mezclaron con cloroformo para la separación de fases. Después de la centrifugación a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. El ARN se precipitó con isopropanol y se lavó con etanol al 75%. El pellet de ARN se secó al aire y se disolvió en agua libre de RNasa. La concentración y la pureza del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La relación A260/A280 se mantuvo entre 1,8 y 2,0. El ADN complementario de cadena única se sintetizó a partir de 1 μg de ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADN complementario (Takara, Japón) según los procedimientos estándar. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green Master Mix en un sistema Bio-Rad CFX96. La mezcla de reacción contenía 10 μL de 2× SYBR Green Master Mix, 0,5 μL de los cebadores directo y reverso, 2 μL de la plantilla de ADN complementario y agua libre de RNasa. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 segundos, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 30 segundos. Los niveles de expresión relativa de los genes diana se calcularon utilizando el método 2−δδCt y se normalizaron con el control interno.

Análisis bioinformático de la correlación de la expresión génica y la supervivencia

Para investigar la relevancia clínica de la expresión de IL12A e IL12B en el cáncer colorrectal (CCR) y otros tipos de tumores, se analizaron conjuntos de datos transcriptómicos y clínicos disponibles públicamente utilizando las siguientes plataformas.

GEPIA2

Se analizó la expresión diferencial de IL12A e IL12B entre los tejidos tumorales y los tejidos normales adyacentes en los conjuntos de datos TCGA y GTEx. Se realizaron análisis de supervivencia general (SG) y supervivencia libre de enfermedad (SLE) utilizando el nivel de expresión medio como punto de corte. Se utilizó la prueba de rango logarítmico para evaluar la significación estadística (http://gepia2.cancer-pku.cn).

TIMER2.0

Para evaluar los correlatos inmunitarios, se correlacionó la expresión de IL12A e IL12B con los marcadores de los subconjuntos de células inmunitarias (células T CD4+, células T CD8+, células NK) en las muestras tumorales. Se utilizó la correlación de Spearman, y se consideraron significativos los valores de p < 0,05 (http://timer.cistrome.org).

Kaplan-Meier plotter

Para ampliar el análisis de supervivencia, se generaron curvas de Kaplan-Meier utilizando grupos de alta y baja expresión génica estratificados por los valores medios. Se informaron las razones de riesgo (HR), los intervalos de confianza del 95% (IC) y los valores de p de rango logarítmico. Todos los análisis se realizaron utilizando los parámetros predeterminados a menos que se especifique lo contrario (https://kmplot.com).

Cuantificación y análisis estadístico

No se utilizan métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Para los estudios con animales, los ratones se asignan aleatoriamente a los grupos de tratamiento después del establecimiento del tumor, a menos que se indique lo contrario. El valor de n representa réplicas biológicas independientes, definidas como ratones individuales para experimentos in vivo, cultivos celulares independientes para ensayos in vitro o muestras de tumor/tejido independientes para análisis bioquímicos, según se especifica en las leyendas de las figuras. Los datos cuantitativos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. Los análisis estadísticos se realizan utilizando GraphPad Prism 9.4.1. Las comparaciones entre dos grupos se realizan utilizando pruebas t de Student no pareadas de dos colas cuando sea apropiado. Las comparaciones entre múltiples grupos se realizan utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los análisis de la trayectoria de crecimiento tumoral se realizan utilizando ANOVA de dos vías con comparaciones múltiples cuando se indica. Las diferencias en la supervivencia se analizan utilizando el método de Kaplan-Meier con la prueba de rango logarítmico. Los análisis de correlación para conjuntos de datos públicos se realizan utilizando la correlación de Spearman. Los detalles estadísticos, incluido el test utilizado, el valor exacto de n y la definición de significación, se proporcionan en las leyendas de las figuras o se indican en las secciones de Resultados correspondientes. Se considera que un valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo. La significación se denota de la siguiente manera: ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 y ∗∗p < 0,0001.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Líneas celulares

Se utilizan en este estudio las líneas celulares HEK293T (riñón embrionario humano), HL60 (leucemia promielocítica humana), CT26 (carcinoma colorrectal de ratón) y MC38 (adenocarcinoma de colon de ratón). Las líneas celulares HEK293T, HL60 y CT26 se obtienen de ATCC, y las líneas celulares MC38 se obtienen de Sigma. Las líneas celulares HEK293T, HL60 y MC38 se mantienen en DMEM, mientras que las líneas celulares CT26 se mantienen en RPMI 1640, cada una suplementada con un 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, y se cultivan a 37 °C en 5% de CO2. Las líneas celulares se autentican mediante el perfilado STR y se comprueba rutinariamente que sean negativas para la contaminación por micoplasma.

Células primarias

Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) primarias se aíslan de los fémures y las tibias de ratones BALB/c de 7 a 8 semanas de edad y se cultivan en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal, GM-CSF, TNF-α y LPS, según se describe a continuación.

Cepas bacterianas

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN; DSM 6601) se utiliza como la cepa bacteriana parental para la ingeniería y se mantiene en medio LB a 37 °C con agitación.

Animales

Se utilizan ratones hembra BALB/c y C57BL/6J (de 5 a 6 semanas de edad) para los estudios de tumores subcutáneos, y se utilizan ratones macho BALB/c (de 5 semanas de edad) para los estudios de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal, según se describe en las subsecciones correspondientes a continuación. Los ratones transgénicos OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J) se utilizan como fuente de células T CD8+ específicas del antígeno. Todos los ratones se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos con acceso ad libitum a alimentos y agua en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas en salas con temperatura y humedad controladas. Todos los procedimientos con animales son aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Sun Yat-sen (SYSU-IACUC-2023-B0755).

Líneas celulares

Se utilizan en este estudio las líneas celulares HEK293T (riñón embrionario humano), HL60 (leucemia promielocítica humana), CT26 (carcinoma colorrectal de ratón) y MC38 (adenocarcinoma de colon de ratón). Las líneas celulares HEK293T, HL60 y CT26 se obtienen de ATCC, y las líneas celulares MC38 se obtienen de Sigma. Las líneas celulares HEK293T, HL60 y MC38 se mantienen en DMEM, mientras que las líneas celulares CT26 se mantienen en RPMI 1640, cada una suplementada con un 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, y se cultivan a 37 °C en 5% de CO2. Las líneas celulares se autentican mediante el perfilado STR y se comprueba rutinariamente que sean negativas para la contaminación por micoplasma.

Células primarias

Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) primarias se aíslan de los fémures y las tibias de ratones BALB/c de 7 a 8 semanas de edad y se cultivan en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal, GM-CSF, TNF-α y LPS, según se describe a continuación.

Cepas bacterianas

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN; DSM 6601) se utiliza como la cepa bacteriana parental para la ingeniería y se mantiene en medio LB a 37 °C con agitación.

Animales

Se utilizan ratones hembra BALB/c y C57BL/6J (de 5 a 6 semanas de edad) para los estudios de tumores subcutáneos, y se utilizan ratones macho BALB/c (de 5 semanas de edad) para los estudios de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal, según se describe en las subsecciones correspondientes a continuación. Los ratones transgénicos OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J) se utilizan como fuente de células T CD8+ específicas del antígeno. Todos los ratones se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos con acceso ad libitum a alimentos y agua en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas en salas con temperatura y humedad controladas. Todos los procedimientos con animales son aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Sun Yat-sen (SYSU-IACUC-2023-B0755).

Detalles del método

Condiciones de cultivo de las líneas celulares y cepas

Todas las líneas celulares de mamíferos utilizadas en este estudio, incluidas HEK293T, HL60, CT26 y MC38, se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares HEK293T, HL60 y MC38 se mantuvieron en medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM, Corning), mientras que las líneas celulares CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Corning). Todos los medios se suplementaron con un 10% de suero bovino fetal (FBS; Newzerum), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (GIBCO), y los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las líneas celulares se analizaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando un kit de ensayo comercial para micoplasma (C0296, Beyotime) y se confirmó que estaban libres de micoplasma durante todo el estudio. La identidad de la línea celular se validó mediante el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) utilizando el sistema GenePrint 10 (B9510, Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) primarias se aislaron de los fémures y las tibias de ratones BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. Las células de la médula ósea se lavaron con PBS frío, se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm para obtener una suspensión de células individuales y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS, GM-CSF (50 ng/mL), TNF-α (20 ng/mL), LPS (20 ng/mL) y reactivo antimicoplasma (Yeasen, 40607ES03). Las células se incubaron a 37 °C en 5% de CO2 durante 5 a 7 días para inducir la maduración de las células dendríticas. La cepa probiótica Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) se obtuvo del banco de cepas de nuestro laboratorio y se cultivó en medio LB estándar a 37 °C con agitación. Las cepas de EcN diseñadas que expresan marcadores fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, EcN-CFSE) se construyeron mediante electroporación de plásmidos y se almacenaron en suspensiones de glicerol a -80 °C para su uso a largo plazo.

Construcción de plásmidos

Para construir el sistema de expresión de IL-12, las secuencias de cDNA murino para pvhb (M30794.1), pelB (amplificado a partir del vector pET-22b, Addgene #84863), il12a (NM008351.4) e il12b (NM001303244.1) se amplificaron por PCR y se ensamblaron en una sola casete de expresión que codifica una fusión PelB-IL12A-enlace-IL12B-6×His bajo el control del promotor pvhb inducible por hipoxia. Todos los constructos se verificaron por secuenciación y se subclonaron en plásmidos de soporte apropiados para la integración en el genoma bacteriano o la purificación de proteínas. Para la integración cromosómica en EcN, la casete pvhb-PelB-IL12 se insertó en el locus lacZ utilizando un sistema de recombinación λ-Red en conjunto con la selección mediada por CRISPR-Cas9. Las células competentes DH5α se transformaron con el plásmido pREDCas9 y se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 45 s, seguido de recuperación en medio LB y siembra en agar selectivo. Posteriormente, EcN que contenía pREDCas9 se indujo con 1 mM de IPTG a 30 °C para promover la expresión de la recombinasa Red. El plásmido donante que contenía la casete de expresión de IL-12 se amplificó por PCR, se purificó y se co-electroporó (180 V, 450 mA) en células competentes de EcN. Las células transformadas se sembraron en agar LB que contenía los antibióticos, IPTG y X-gal apropiados. Las colonias que presentaban un fenotipo blanco se analizaron mediante PCR de colonias y los clones validados se designaron como EcN-IL12. Las cepas diseñadas se cultivaron en medio LB sellado en condiciones hipóxicas (32 °C, 80 rpm) durante 24 horas antes de las aplicaciones posteriores.

Para construir cepas reguladas por el sistema de comunicación bacteriana (QS) de IL-12 (EcN-IL12-QS), el gen de la ARN polimerasa T7 flanqueado por brazos de homología lacZ se amplificó por PCR a partir de pUC57-T7 y se insertó en el genoma de EcN utilizando el cribado azul-blanco. Las colonias positivas se verificaron mediante PCR de colonias y secuenciación. La cepa EcN-T7 resultante se co-electroporó con pTuLys2CMR2 (plásmido del circuito de lisis bacteriana sincronizada), que proporciona un módulo de lisis bacteriana sincronizada, y pT7-IL12A-enlace-IL12B-6×His para reconstituir el sistema de expresión de IL-12 inducible acoplado a QS/lisis. En este diseño, la activación dependiente de la densidad del circuito LuxI/LuxR impulsa la expresión de IL-12 mediada por T7, mientras que el módulo de lisis permite la liberación extracelular periódica de la carga intracelular de IL-12. Los transformantes se seleccionaron en agar LB que contenía cloranfenicol y canamicina y se validaron posteriormente mediante PCR.

Para la sobreexpresión de CDH17 y CD137 en células dendríticas, las secuencias de cDNA murino para cdh17 (NM019753.4) y cd137 (NM011612.2) se amplificaron por PCR y se subclonaron en vectores lentivirales que contenían etiquetas 6×His en el extremo C-terminal. Después de la verificación de la secuencia, los plásmidos se transformaron en E. coli DH5α y se cultivaron en agar LB con selección de ampicilina. Se obtuvieron preparaciones de plásmidos libres de endotoxinas utilizando el kit Endo-free Plasmid Mini Kit I (D6943, Omega) y se almacenaron a -20 °C hasta su uso en el empaquetamiento lentiviral.

Producción de lentivirus

Los vectores lentivirales que codifican CDH17 o CD137 se empaquetaron en células HEK293T utilizando un sistema lentiviral de tercera generación. Brevemente, las células HEK293T se sembraron a una confluencia de aproximadamente 70% y se transfectaron con el plásmido del vector lentiviral (CDH17-OE o CD137-OE), psPAX2 (Addgene #12260) y pMD2.G (Addgene #12259) utilizando el reactivo de transfección Lipo8000 (C0533, Beyotime), siguiendo el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes virales se cosecharon a las 48 y 72 horas posteriores a la transfección, se pasaron a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos celulares y se concentraron mediante precipitación con polietilenglicol (PEG8000) para aumentar el título viral. Las partículas virales concentradas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C. Para la transducción de células dendríticas, las BMDC se incubaron con sobrenadantes virales suplementados con 8 μg/mL de polibreno (H8761, Sorabio) durante 24 horas. Las células transducidas se seleccionaron utilizando puromicina (540411, Sigma-Aldrich) durante tres días consecutivos a una concentración optimizada para establecer la expresión estable. La expresión del transgen se confirmó mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Extracción de proteínas totales de E. coli

Para el aislamiento de proteínas bacterianas, los cultivos nocturnos de E. coli se cosecharon por centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sedimento bacteriano se resuspendió en 4 mL de tampón de lisis occidental suplementado con 50 μL de lisozima (100 mg/mL) y se incubó sobre hielo durante 15 a 20 minutos con una agitación suave cada 5 minutos para facilitar la digestión de la pared celular. Después de la lisis, la suspensión se centrifugó a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para separar las fracciones de proteínas solubles (supernatante) e insolubles (pellet). La concentración total de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (P0009, Beyotime) y la absorbancia a 562 nm se midió con un lector de microplacas. Las concentraciones se calcularon en base a una curva estándar generada utilizando estándares de albúmina sérica bovina (BSA) diluidos en serie. Todas las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C para aplicaciones posteriores.

Western blotting

Se realizó un Western blot para detectar IL-12 y las proteínas de control de carga en lisados de células bacterianas o de mamíferos. Las concentraciones totales de proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (P0009, Beyotime), y cantidades iguales de proteína (normalmente 30 μg por línea) se desnaturalizaron en tampón de carga SDS que contenía β-mercaptoetanol y se hirvieron a 95 °C durante 10 minutos. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 10-12%) a un voltaje constante de 180 V y, posteriormente, se transfirieron a membranas de PVDF (IPVH00010, Millipore). Las membranas se preactivaron en metanol, se enjuagaron en tampón de transferencia y se ensamblaron en un sándwich de transferencia para la transferencia en húmedo (400 mA, 45 min, temperatura ambiente). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% en TBST (tampón salino con Tris al 0,1% de Tween 20, FD9061, Fdbio) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las incubaciones con anticuerpos primarios se realizaron durante la noche a 4 °C en tampón de bloqueo, utilizando las siguientes diluciones: anti-IL-12 p70 (30756-1-AP, Proteintech, 1:2000) y anti-DnaK (ab69617, Abcam, 1:5000) como control de carga interno. Después de tres lavados en TBST (5 minutos cada uno), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (cabeza de cabra anti-conejo o cabeza de cabra anti-ratón, FDR007/FDM007, Fdbio, 1:5000) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las tiras se revelaron utilizando quimioluminiscencia mejorada (ECL; FD8000, Fdbio) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP bajo condiciones de exposición optimizadas. Se utilizó la tinción con azul brillante de Coomassie en paralelo para evaluar la carga total de proteínas y la integridad del gel.### SDS-PAGE no reductora para la detección de proteínas diméricas

Para evaluar la formación de dímeros de IL-12 unidos por enlaces disulfuro, se realizó SDS-PAGE no reductora. Los lisados proteicos totales se recogieron sobre hielo y se mezclaron con tampón de carga SDS que no contenía agentes reductores (DTT o β-mercaptoetanol). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la desnaturalización, preservando al mismo tiempo los enlaces disulfuro. Las proteínas (30 μg por línea) se separaron en geles de poliacrilamida al 12% a un voltaje constante de 180 V durante 60 minutos. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 para visualizar el contenido total de proteínas. La presencia de bandas de aproximadamente 140 kDa en condiciones no reductoras se interpretó como evidencia de la formación de dímeros de IL-12 unidos por enlaces disulfuro.### Ensayo de activación y citotoxicidad de células T

Para evaluar la función inmunostimulante de EcN modificada genéticamente e IL-12 recombinante, realizamos ensayos de activación y citotoxicidad de células T específicas para el antígeno utilizando ratones transgénicos OT-I. Se recolectaron esplenocitos de ratones OT-I de 8 semanas de edad y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando tampón de cloruro de amonio (R1010, Sorabio), y las células T CD8+ se aislaron mediante separación magnética utilizando MicroBeads CD8 y columnas MACS (130-117-044, Miltenyi Biotec). Las células T CD8+ purificadas se activaron durante la noche en medio RPMI 1640 completo suplementado con 150 U/mL de IL-2 recombinante (CM39, NovoProtein) y 1 μg/mL de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la placa (11453D, Gibco). Las células T activadas se cocultivaron con células tumorales MC38 que expresan OVA a una relación efector:objetivo (E:T) de 5:1 en presencia de EcN modificada genéticamente (1 × 106 UFC/mL), EcN-IL12, eDC-EcN-IL12-QS o proteína IL-12 recombinante (10 ng/mL). Los cocultivos se incubaron durante 24 o 48 horas, y se adquirieron imágenes de campo claro para evaluar la eliminación de las células tumorales. La viabilidad tumoral se cuantificó midiendo el área cubierta por las células tumorales en cada punto temporal utilizando el software ImageJ. La eficiencia de la muerte celular se expresó como: Viabilidad tumoral (%) = 100 × (área de las células tumorales en el tiempo t)/(área de las células tumorales en el tiempo 0).### ELISA de citocinas en la cepa EcN-IL12 y en el microambiente tumoral

Para cuantificar la IL-12 y las citocinas asociadas tanto en los cultivos bacterianos como en los tejidos tumorales, se realizaron ensayos ELISA siguiendo protocolos establecidos.

Cultivos bacterianos

Las cepas de EcN-IL12 modificadas genéticamente se cultivaron en condiciones hipóxicas, y las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 4000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante resultante se concentró utilizando un dispositivo de ultrafiltración con un punto de corte de peso molecular de 30 kDa (UFC803024, Millipore) y se lavó con PBS para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular. La fracción de proteínas concentrada se resuspendió en PBS y se utilizó para el ELISA.### Tejidos tumorales

Las muestras tumorales se pesaron (aproximadamente 100 mg) y se homogeneizaron en 5 mL de PBS preenfriado utilizando un mortero y una maza sobre hielo. Los homogeneizados se sonicaron utilizando un disruptor ultrasónico de tipo sonda (5 segundos encendido, 3 segundos apagado, durante 30 minutos), y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron sobre hielo antes de la cuantificación.

Los niveles de citocinas, incluyendo IL-12 (MULTI SCIENCES, EK212), IFN-γ (MULTI SCIENCES, EK280), Granzima B (GZMB, Proteintech, EK2173), TGF-β (Proteintech, KE10005) y TNF-α (Proteintech, KE10002), se midieron utilizando kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante. Para cada citocina, se generaron curvas estándar utilizando diluciones seriadas de los estándares recombinantes proporcionados. La absorbancia se leyó a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones se calcularon en función de las curvas de calibración ajustadas por regresión.### Cuantificación de la distribución de bacterias modificadas genéticamente en ratones con tumores

Para evaluar la biodistribución in vivo de las cepas de E. coli modificadas genéticamente, se realizaron ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC) en tumores y tejidos de órganos principales después de la administración sistémica. A los ratones con tumores se inyectó por vía intravenosa con 1 × 106 UFC de las cepas de EcN modificadas genéticamente. En los días 1, 3 y 7 posteriores a la inyección, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical bajo condiciones estériles. Los tumores, el hígado, el bazo y los riñones se recogieron asépticamente y se pesaron (aproximadamente 100 mg por muestra). Los tejidos se homogeneizaron en 1 mL de PBS estéril utilizando un mortero y una maza de porcelana preenfriados. Los homogeneizados se agitaron vigorosamente y se diluyeron en serie en PBS. Se colocaron alícuotas (200 μL) de cada dilución en placas de agar LB suplementadas con gentamicina para recuperar selectivamente las cepas modificadas genéticamente. Las placas se incubaron a 32 °C durante 16-18 horas. Las colonias bacterianas se fotografiaron sobre un fondo oscuro y se enumeraron manualmente. Los resultados se expresaron como UFC por gramo de tejido. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los recuentos de UFC se transformaron logarítmicamente antes del análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), y las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0.### Preparación de BMDC cargadas con EcN-IL12-QS

Las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) se generaron como se describió anteriormente y se co-incubaron con las cepas de EcN-IL12-QS modificadas genéticamente para generar células dendríticas cargadas con bacterias intracelulares. Las BMDC se sembraron en medio DMEM sin antibióticos suplementado con 10% de FBS y se cocultivaron con EcN-IL12-QS a una relación de infección (MOI) de 1:100 (bacterias:células) a 37 °C durante los períodos de tiempo indicados. Después de la co-incubación, se aspiró el sobrenadante del cultivo y las células se lavaron tres veces con PBS estéril para eliminar las bacterias extracelulares. Para eliminar las bacterias extracelulares restantes y preservar la viabilidad intracelular, las células se incubaron en medio DMEM completo que contenía 50 μg/mL de gentamicina durante 60 minutos a 37 °C. Esta concentración mata eficazmente las E. coli extracelulares sin afectar la viabilidad de las bacterias intracelulares. Después del tratamiento con gentamicina, las células se lavaron tres veces con PBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. El pellet resultante se resuspendió en medio fresco y se designó como BMDC cargadas con EcN-IL12-QS para aplicaciones posteriores.### Ensayos de viabilidad de células dendríticas

Para evaluar la viabilidad de las células dendríticas después de la carga bacteriana, se realizó un ensayo de exclusión de azul de tripan. Se mezclaron volúmenes iguales de suspensiones celulares 1:1 con una solución de azul de tripan al 0,4% (Beyotime, C1313S), y se cargaron 10 μL de la mezcla en una lámina de conteo celular automatizada Countstar (Countstar, C0010101). Las láminas se insertaron en el analizador de células BioLab Countstar para determinar el número de células viables (no teñidas) y no viables (teñidas de azul). La viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células viables en relación con el recuento total de células. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.### Modelos murinos de tumores

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Sun Yat-sen. Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con acceso ad libitum a alimentos y agua, y se mantuvieron en entornos con temperatura y humedad controladas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. De acuerdo con las directrices del comité de cuidado y uso de animales (IACUC), se siguieron estrictamente los puntos finales humanitarios, y los animales se sacrificaron si los tumores excedían los 1500 mm3, si presentaban distensión abdominal o si se observaban signos de angustia.

Modelos de tumores subcutáneos

Se obtuvieron ratones hembra BALB/c o C57BL/6J de 5 semanas de edad del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Sun Yat-sen y se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 5 por grupo). Las células de cáncer de colon CT26 (BALB/c) o MC38 (C57BL/6J) se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80%, se recogieron y se lavaron tres veces en PBS estéril. Un total de 1 × 106 células tumorales suspendidas en 100 μL de PBS se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón. Regímenes de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12 (1 × 106 UFC por ratón, i.v.). Las dimensiones del tumor se midieron cada dos días utilizando calibradores digitales. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula estándar: Volumen (mm3) = 0,5 × longitud × ancho2. El peso corporal se registró simultáneamente para controlar la toxicidad asociada al tratamiento. El tratamiento con formulaciones bacterianas o de células dendríticas se inició una vez que los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 50 mm3.### Modelo de metástasis hepática de cáncer colorrectal

Para establecer metástasis hepáticas, las células de cáncer colorrectal murino CT26 se cultivaron en condiciones estándar y se recogieron cuando alcanzaron una confluencia del 80-90%. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se resuspendieron a 1 × 107 células/mL. Se confirmó la viabilidad celular (>95%) mediante la exclusión de azul de tripan. Los ratones macho BALB/c de 5 semanas de edad se anestesiaron con un 2% de isoflurano en oxígeno. En condiciones estériles, se realizó una pequeña incisión en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Utilizando una jeringa de insulina de 29G, se inyectaron lentamente 1 × 106 células CT26 en 100 μL de PBS en el parénquima esplénico. Se aplicó una torunda de algodón estéril durante 1 minuto después de la inyección para evitar fugas y sangrado. Se cerró la pared abdominal y la piel con suturas absorbibles. Se vigiló a los ratones hasta que se recuperaron por completo y se devolvieron a sus jaulas. Regímenes de tratamiento: Una semana después de la implantación de las células tumorales, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12, EcN-QS o EcN-IL12-QS (1 × 105 UFC por ratón, i.v.); eDC, DC-EcN-IL12-QS, DC-CD137-EcN-IL12-QS, DC-CDH17-EcN-IL12-QS, eDC-EcN o eDC-EcN-IL12-QS (1 × 106 células por ratón, i.v.); IL-12 (Alta: 20 μg; Media: 10 μg; Baja: 5 μg por ratón, i.v.); DC+EcN-IL12-QS (1 × 106 células DC y 1 × 105 UFC de EcN-IL12-QS por ratón); Antibiótico (ciprofloxacina, 30 mg/kg, i.p.). Las suspensiones bacterianas se prepararon a partir de cultivos LB de la noche, se lavaron tres veces con PBS y se estandarizaron a la UFC deseada utilizando mediciones de OD600 (1 OD ≈ 1 × 108 UFC/mL). Las inyecciones se administraron a través de la vena de la cola una vez por semana. Los ratones de control recibieron volúmenes equivalentes de PBS. Se vigiló a los ratones para controlar la carga tumoral, la pérdida de peso y los signos de angustia. En el punto final o cuando los tumores alcanzaron los límites éticos, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tumores y los órganos principales para su posterior análisis.### Inmunohistoquímica y tinción con hematoxilina y eosina de secciones de tumores

Para evaluar la infiltración de células inmunitarias, la expresión de citocinas, la apoptosis y la proliferación de las células tumorales, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas (TIQ) y tinciones con hematoxilina y eosina (H&E) en secciones tumorales incluidas en parafina. Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído neutro tamponado al 10% durante 48 h a temperatura ambiente, se deshidrataron en etanol en gradación, se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones seriadas de 4 μm utilizando un micrótomo rotatorio, se montaron en portaobjetos con carga positiva y se dejaron secar durante la noche a 37 °C o durante 2 h a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinaron en xileno (2 × 10 min), se rehidrataron en concentraciones descendentes de etanol (100%, 95%, 85%, 70%) y se enjuagaron en agua destilada. La recuperación del antígeno se realizó utilizando tampón de citrato (10 mM, pH 6.0) o tampón de EDTA (pH 8.0) mediante calentamiento en una olla a presión o en un microondas durante 20 min, seguido de enfriamiento y lavado con PBS. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. La unión inespecífica se bloqueó utilizando suero de cabra normal al 5% durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en diluyente de anticuerpos: Anti-CD4 (GB15064, Servicebio, 1:200); Anti-CD8 (GB15068, Servicebio, 1:200); Anti-Caspasa-3 (GB12532, Servicebio, 1:200); Anti-Ki67 (GB121141, Servicebio, 1:500); Anti-IL-12p70 (30756-1-AP, Proteintech, 1:200); Anti-CD45 (GB113886, Servicebio, 1:200); Anti-O6 (bs-0658R, Bioss, 1:200). Después de los lavados con PBS (3 × 5 min), los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 45 min a temperatura ambiente. Las señales se desarrollaron utilizando la solución de sustrato DAB (Servicebio), y las secciones se contrateñeron con hematoxilina. Las secciones adyacentes se tiñeron con hematoxilina y eosina siguiendo los protocolos estándar para evaluar la histopatología tumoral. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Olympus BX63, y se realizó un análisis cuantitativo de las células teñidas positivamente en al menos tres campos de alto poder (20×) seleccionados aleatoriamente por muestra utilizando el software ImageJ.

Análisis citométrico de flujo de linfocitos infiltrantes tumorales y sangre

Para perfilar las poblaciones de células inmunitarias en los tumores y la sangre periférica, se realizó citometría de flujo multicolor en suspensiones de células individuales derivadas de los tejidos tumorales y la sangre venosa.

Disociación tumoral y preparación celular

Los tumores extirpados se picaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm3 y se digirieron enzimáticamente en tampón de disociación de tejidos a 37 °C durante 1 h con agitación (220 rpm). Los tejidos digeridos se rompieron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz de 70 μm para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio (10 min a temperatura ambiente), y las células se lavaron dos veces con PBS.

Sangre periférica

Se recolectó sangre total del plexo venoso retro-orbital en tubos tratados con anticoagulante. Después de la centrifugación, los glóbulos rojos se lisaron como se describió anteriormente, y los leucocitos restantes se lavaron con PBS.

Tinción superficial e intracelular

Después del bloqueo del receptor Fc, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos durante 30 min a 4 °C en la oscuridad: CD45-PerCP (Elabscience, E-AB-F1136J); CD3-PE (E-AB-F1013D); CD4-FITC (E-AB-F1097C); CD8-APC (E-AB-F1104D); MHC II-PE (E-AB-F0990D); CD11c-FITC (E-AB-F0991C); CD86-APC (E-AB-F0994E). Para la tinción intracelular, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS que contiene BSA al 0,5% y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se tiñeron con: Granzyme B-FITC (Biolegend, 372205); IFN-γ-FITC (Biolegend, 505805). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo equipado con las líneas láser apropiadas. Se aplicó la compensación utilizando controles de tinción única. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Análisis citométrico de flujo de la lisis bacteriana

Para controlar la lisis bacteriana inducida por el quorum sensing y la dinámica de la expresión de proteínas, se utilizó la citometría de flujo para cuantificar la fluorescencia del reportero en cepas de E. coli diseñadas. Se inoculó una dilución de 1:100 de la cultura bacteriana nocturna en 30 mL de medio LB fresco que contiene los antibióticos apropiados. La expresión del gen reportero mCherry se indujo con concentraciones variables de IPTG (0,5–2 mM). Se recolectaron muestras bacterianas cada hora durante un máximo de 5 h después de la inducción. En cada punto de tiempo, se recolectó 0,5 mL de la suspensión bacteriana, se centrifugó a 12.000 rpm durante 2 min y se lavó tres veces con PBS estéril. La intensidad de la fluorescencia de mCherry se midió utilizando un citómetro de flujo equipado con un canal PE (excitación: 561–587 nm). La selección se basó en los perfiles de dispersión directa/lateral para excluir los desechos, y se registraron al menos 10.000 eventos por muestra. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Se utilizó un umbral de intensidad de fluorescencia para determinar la activación del circuito de quorum sensing y el alcance de la expresión del reportero asociada a la lisis.

Microscopía electrónica de transmisión

Para visualizar las bacterias intracelulares dentro de las células dendríticas y evaluar las características ultraestructurales, se realizó microscopía electrónica de transmisión (MET). Las co-culturas BMDC-EcN-IL12 se recolectaron a aproximadamente el 80% de la confluencia, se separaron suavemente y se fijaron inmediatamente en glutaraldehído al 2,5% (preparado en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4) a 4 °C durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con tampón de fosfato frío y se postfijaron en óxido de osmio al 1% (OsO4) durante 2 h a 4 °C para preservar la integridad de la membrana y el contraste. Las muestras se deshidrataron secuencialmente en etanol en gradación (30%–100%) y luego se trataron dos veces con óxido de propileno al 100% (15 min cada una). Los especímenes deshidratados se infiltraron con resina epoxi:óxido de propileno (1:1) durante 2 h, seguido de incubación durante la noche en resina pura. La polimerización se llevó a cabo a 60 °C durante 48 h. Se cortaron secciones ultrafinas (60–70 nm) utilizando un ultramicrótomo, se montaron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo. Las rejillas se examinaron bajo un MET que funcionaba a 80–100 kV, y se adquirieron imágenes digitales utilizando el software Olympus Viewer. Se identificaron y documentaron los compartimentos subcelulares que contenían bacterias intracelulares para la evaluación morfológica.

Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal

Para evaluar la internalización bacteriana, las interacciones entre las células dendríticas y las bacterias, y la expresión de marcadores inmunitarios, se realizó la tinción de inmunofluorescencia en células vivas y secciones tumorales congeladas, seguida de la microscopía confocal.

Imagen basada en células

HL60, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras se cultivaron hasta el 70–80% de la confluencia, se lavaron con PBS y se tiñeron con 5 μM de DiI (Beyotime, C1036) en RPMI 1640 sin suero a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Las células teñidas se lavaron tres veces con medio completo y se sembraron en placas de fondo de vidrio para microscopía confocal para la adhesión. Las cepas de EcN-IL12 diseñadas se cultivaron hasta la fase logarítmica media, se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS que contenía 10 μM de CFSE (Invitrogen, C34554). Las bacterias se incubaron durante 20 min a 37 °C, se apagó la reacción con FBS al 10% y se lavaron tres veces con PBS. La densidad bacteriana se estandarizó a OD600 ≈ 1 (aproximadamente 1 × 108 UFC/mL). Las bacterias teñidas con CFSE se agregaron a las células teñidas con DiI en una proporción de 1:200 y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Las células se lavaron a fondo para eliminar las bacterias no adheridas y se trataron con 100 μg/mL de gentamicina durante 30 min para eliminar las bacterias extracelulares. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min, se lavaron y se contrateñeron con DAPI (1 μg/mL, 5 min). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Olympus FV3000. Los fluoróforos se excitaban a las siguientes longitudes de onda: DiI (549 nm, rojo), CFSE (488 nm, verde), DAPI (405 nm, azul). Las imágenes se procesaron con Olympus Fluoview e ImageJ para el análisis de intensidad de fluorescencia y colocalización.

Secciones de tejido tumoral

Los tejidos tumorales recién extirpados se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 h, se crioprotegieron en sacarosa en gradación (10%, 20%, 30%) y se incluyeron en compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Los bloques congelados se seccionaron con un grosor de 8–10 μm y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% durante 10 min, se bloquearon con BSA al 5% durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios (1:200): CD11c (AiFang Biological, AFRM0294); CD86 (AFRM9023); CD4 (AFRM9419); CD8 (AFRM0004). Después de los lavados con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o 594 (Abcam, 1:500) durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se contrateñeron con DAPI, y los portaobjetos se montaron utilizando medio anti-desvanecimiento (Beyotime, P0126). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal FV3000 bajo condiciones de adquisición consistentes.

Ensayo de coestimulación in vitro de células T y células dendríticas

Construcción de células dendríticas

Las BMDC se indujeron y diferenciaron a partir de la médula ósea de ratones C57bl/6. Se utilizó un sistema de transducción lentiviral para construir células dendríticas que expresaran ovalbúmina (DC-OVA) o células dendríticas que coexpresaran ovalbúmina y CD137 (DC-OVA-CD137).

Selección y etiquetado de células T

Las células T CD8+ ingenuas se seleccionaron negativamente a partir de los bazo de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección con cuentas magnéticas (Miltenyi Biotec). Las células se etiquetaron con 5 μM de CFSE (Thermo Fisher) a 37 °C en la oscuridad durante 10 min, seguida de la terminación de la reacción con medio que contenía suero.

Co-cultivo

Las células T etiquetadas se co-cultivaron con eDC en una proporción de 10:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 72 h.

Análisis citométrico de flujo

Se recolectaron las células. La dilución de la intensidad de la fluorescencia de CFSE en la población CD8+ se detectó utilizando un citómetro de flujo para evaluar la proliferación.

Ensayo funcional

Las células se recolectaron para la detección posterior de la expresión de ARNm mediante RT-qPCR. Después de bloquear el transporte de Golgi con Brefeldin A y Monensin durante 4 h, se realizó la tinción intracelular (IFN-γ, Granzyme B). Las concentraciones de TNF-α, Granzyme B e IFN-γ en el sobrenadante se detectaron mediante ELISA.

Lisis inducida por IPTG

EcN-IL12-QS se inoculó en medio líquido LB y se cultivó con agitación a 37 °C hasta que OD600 alcanzó 0,2. La cultura bacteriana se dividió en dos; el grupo experimental recibió IPTG a una concentración final de 0,5 mM, 1 mM y 2 mM, mientras que el grupo de control recibió el mismo volumen de disolvente. Se midió OD600 cada 2 h utilizando un espectrofotómetro para trazar la curva de lisis.

Cultivo de hipoxia, anoxia y normoxia

Las cepas EcN-IL12 y EcN-IL12-QS se inocularon en diferentes condiciones de oxígeno. El grupo de normoxia se colocó en una incubadora estándar (21% de O2, 5% de CO2), el grupo de anoxia se colocó en un anaero pack, mientras que el grupo de hipoxia se colocó en una estación de hipoxia (Baker Ruskinn) con condiciones de gas establecidas en 1% de O2, 5% de CO2, 94% de N2. Los sobrenadantes se recolectaron después de 24 y 48 h de cultivo.

Detección de ALT/AST

Se mezclaron 20 μL de la muestra de suero con 80 μL de solución de matriz en una placa de 96 pocillos. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Después de la incubación, se agregaron 20 μL de solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina a cada pocillo, y la placa se incubó a 37 °C durante 20 min adicionales. Finalmente, se agregó 200 μL de solución de parada para detener la reacción. La absorbancia se midió a 510 nm utilizando un lector de microplacas. Los niveles de actividad se calcularon en función de las curvas estándar generadas utilizando estándares de piruvato de sodio.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se aisló ARN total de células o tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras se lisaron en TRIzol y se mezclaron con cloroformo para la separación de fases. Después de la centrifugación a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. El ARN se precipitó con isopropanol y se lavó con etanol al 75%. El precipitado de ARN se secó al aire y se disolvió en agua libre de RNasas. La concentración y la pureza del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La relación A260/A280 se mantuvo entre 1,8 y 2,0. El ADN complementario de cadena única (cDNA) se sintetizó a partir de 1 μg de ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de cDNA (Takara, Japón) según los procedimientos estándar. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando SYBR Green Master Mix en un sistema Bio-Rad CFX96. La mezcla de reacción contenía 10 μL de 2× SYBR Green Master Mix, 0,5 μL de cebadores directos e inversos, 2 μL de plantilla de cDNA y agua libre de RNasas. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 segundos, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 30 segundos. Los niveles de expresión relativa de los genes diana se calcularon utilizando el método 2−δδCt y se normalizaron con el control interno.

Análisis bioinformático de la expresión génica y la correlación con la supervivencia

Para investigar la relevancia clínica de la expresión de IL12A e IL12B en el cáncer colorrectal (CCR) y otros tipos de tumores, se analizaron conjuntos de datos transcriptómicos y clínicos disponibles públicamente utilizando las siguientes plataformas.

GEPIA2

Se analizó la expresión diferencial de IL12A e IL12B entre los tejidos tumorales y los tejidos normales adyacentes en los conjuntos de datos TCGA y GTEx. Se realizaron análisis de supervivencia global (OS) y supervivencia libre de enfermedad (DFS) utilizando el nivel de expresión medio como punto de corte. Se utilizó la prueba de log-rank para evaluar la significación estadística (http://gepia2.cancer-pku.cn).

TIMER2.0

Para evaluar los correlatos inmunitarios, se correlacionó la expresión de IL12A e IL12B con los marcadores de los subconjuntos de células inmunitarias (células T CD4+, células T CD8+, células NK) en las muestras tumorales. Se utilizó la correlación de Spearman, y se consideraron significativos los valores de p 95%) mediante exclusión de azul de tripan. Los ratones macho BALB/c de 5 semanas de edad se anestesiaron con 2% de isoflurano en oxígeno. En condiciones estériles, se realizó una pequeña incisión en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Utilizando una jeringa de insulina de 29G, se inyectaron lentamente 1 × 106 células CT26 en 100 μL de PBS en el parénquima esplénico. Se aplicó una torunda de algodón estéril durante 1 minuto después de la inyección para evitar fugas y sangrado. Se cerró la pared abdominal y la piel con suturas absorbibles. Se controló a los ratones hasta su recuperación completa y se devolvieron a sus jaulas. Regímenes de tratamiento: Una semana después de la implantación de las células tumorales, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12, EcN-QS o EcN-IL12-QS (1 × 105 UFC por ratón, i.v.); eDC, DC-EcN-IL12-QS, DC-CD137-EcN-IL12-QS, DC-CDH17-EcN-IL12-QS, eDC-EcN o eDC-EcN-IL12-QS (1 × 106 células por ratón, i.v.); IL-12 (Alta: 20 μg; Media: 10 μg; Baja: 5 μg por ratón, i.v.); DC+EcN-IL12-QS (1 × 106 células DC y 1 × 105 UFC de EcN-IL12-QS por ratón); Antibiótico (Ciprofloxacina, 30 mg/kg, i.p.). Las suspensiones bacterianas se prepararon a partir de cultivos LB de la noche, se lavaron tres veces con PBS y se estandarizaron a la UFC deseada utilizando mediciones de OD600 (1 OD ≈ 1 × 108 UFC/mL). Las inyecciones se administraron por la vena de la cola una vez por semana. Los ratones de control recibieron volúmenes equivalentes de PBS. Se controló a los ratones para detectar la carga tumoral, la pérdida de peso y los signos de angustia. Al final del estudio o cuando los tumores alcanzaron los límites éticos, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores y los órganos principales para su posterior análisis.

Modelos de tumores subcutáneos

Se obtuvieron ratones hembra BALB/c o C57BL/6J de 5 semanas de edad del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Sun Yat-sen y se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 5 por grupo). Las células de cáncer colorrectal CT26 (BALB/c) o MC38 (C57BL/6J) se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de ∼80%, se recolectaron y se lavaron tres veces en PBS estéril. Un total de 1 × 106 células tumorales suspendidas en 100 μL de PBS se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón. Regímenes de tratamiento: PBS control; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12 (1 × 106 UFC por ratón, i.v.). Las dimensiones del tumor se midieron cada dos días utilizando calibradores digitales. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula estándar: Volumen (mm3) = 0,5 × longitud × ancho2. El peso corporal se registró simultáneamente para controlar la toxicidad asociada al tratamiento. El tratamiento con formulaciones bacterianas o de células dendríticas se inició una vez que los tumores alcanzaron un volumen de ∼50 mm3.

Modelo de metástasis hepática de cáncer colorrectal

Para establecer metástasis hepáticas, se cultivaron células de cáncer colorrectal murino CT26 en condiciones estándar y se recolectaron cuando alcanzaron una confluencia del 80-90%. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se resuspendieron a una concentración de 1 × 107 células/mL. Se confirmó la viabilidad celular (>95%) mediante la exclusión del azul de tripano. Se anestesiaron ratones BALB/c machos de cinco semanas de edad con un 2% de isoflurano en oxígeno. En condiciones estériles, se realizó una pequeña incisión en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Utilizando una jeringa de insulina de 29G, se inyectaron lentamente 1 × 106 células CT26 en 100 μL de PBS en el parénquima esplénico. Se aplicó un hisopo de algodón estéril durante 1 minuto después de la inyección para evitar fugas y sangrado. Se cerró la pared abdominal y la piel utilizando suturas absorbibles. Se monitorizaron los ratones hasta su completa recuperación y se devolvieron a sus jaulas. Regímenes de tratamiento: Una semana después de la implantación de las células tumorales, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos de tratamiento: control con PBS; IL-12 recombinante (10 μg por ratón, i.v.); EcN, EcN-IL12, EcN-QS o EcN-IL12-QS (1 × 105 UFC por ratón, i.v.); eDC, DC-EcN-IL12-QS, DC-CD137-EcN-IL12-QS, DC-CDH17-EcN-IL12-QS, eDC-EcN o eDC-EcN-IL12-QS (1 × 106 células por ratón, i.v.); IL-12 (Alta: 20 μg; Media: 10 μg; Baja: 5 μg por ratón, i.v.); DC+EcN-IL12-QS (1 × 106 células DC y 1 × 105 UFC de EcN-IL12-QS por ratón); Antibiótico (Ciprofloxacina, 30 mg/kg, i.p.). Las suspensiones bacterianas se prepararon a partir de cultivos LB de una noche, se lavaron tres veces con PBS y se estandarizaron a la UFC deseada utilizando mediciones de OD600 (1 OD ≈ 1 × 108 UFC/mL). Las inyecciones se administraron a través de la vena caudal una vez por semana. Los ratones de control recibieron volúmenes equivalentes de PBS. Se monitorizaron los ratones para evaluar la carga tumoral, la pérdida de peso y los signos de malestar. Al final del estudio o cuando los tumores alcanzaron los límites éticos, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores y los órganos principales para su posterior análisis.

Inmunohistoquímica y tinción con hematoxilina y eosina de secciones tumorales

Para evaluar la infiltración de células inmunitarias, la expresión de citocinas, la apoptosis y la proliferación de las células tumorales, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas (IHC) y tinciones con hematoxilina y eosina (H&E) en secciones tumorales incluidas en parafina. Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído neutro tamponado al 10% durante 48 h a temperatura ambiente, se deshidrataron en etanol graduado, se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones seriadas de 4 μm utilizando un micrótomo rotatorio, se montaron en portaobjetos con carga positiva y se dejaron secar durante la noche a 37 °C o durante 2 h a 60 °C. Los portaobjetos se desparafinaron en xileno (2 × 10 min), se rehidrataron en concentraciones descendentes de etanol (100%, 95%, 85%, 70%) y se enjuagaron en agua destilada. Se realizó la recuperación del antígeno utilizando tampón de citrato (10 mM, pH 6.0) o tampón de EDTA (pH 8.0) calentando en una olla a presión o en un microondas durante 20 min, seguido de enfriamiento y lavado con PBS. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. Se bloqueó la unión inespecífica utilizando suero de cabra normal al 5% durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en diluyente de anticuerpos: Anti-CD4 (GB15064, Servicebio, 1:200); Anti-CD8 (GB15068, Servicebio, 1:200); Anti-Caspasa-3 (GB12532, Servicebio, 1:200); Anti-Ki67 (GB121141, Servicebio, 1:500); Anti-IL-12p70 (30756-1-AP, Proteintech, 1:200); Anti-CD45 (GB113886, Servicebio, 1:200); Anti-O6 (bs-0658R, Bioss, 1:200). Después de los lavados con PBS (3 × 5 min), los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 45 min a temperatura ambiente. Las señales se desarrollaron utilizando la solución de sustrato DAB (Servicebio), y las secciones se contrateñeron con hematoxilina. Las secciones adyacentes se tiñeron con hematoxilina y eosina siguiendo los protocolos estándar para evaluar la histopatología tumoral. Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio Olympus BX63, y se realizó un análisis cuantitativo de las células teñidas positivamente en al menos tres campos de alto poder seleccionados aleatoriamente (20×) por muestra utilizando el software ImageJ.

Análisis de citometría de flujo de linfocitos infiltrantes tumorales y sangre

Para perfilar las poblaciones de células inmunitarias en los tumores y la sangre periférica, se realizó citometría de flujo multicolor en suspensiones de células individuales derivadas de los tejidos tumorales y la sangre venosa.

Disociación tumoral y preparación de células

Los tumores extirpados se picaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm3 y se digirieron enzimáticamente en tampón de disociación de tejidos a 37 °C durante 1 h con agitación (220 rpm). Los tejidos digeridos se rompieron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz de 70 μm para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio (10 min a temperatura ambiente), y las células se lavaron dos veces con PBS.

Sangre periférica

Se recolectó sangre total de la plexo venoso retro-orbital en tubos tratados con anticoagulante. Después de la centrifugación, los glóbulos rojos se lisaron como se describió anteriormente, y los leucocitos restantes se lavaron con PBS.

Tinción superficial e intracelular

Después del bloqueo de los receptores Fc, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos durante 30 min a 4 °C en la oscuridad: CD45-PerCP (Elabscience, E-AB-F1136J); CD3-PE (E-AB-F1013D); CD4-FITC (E-AB-F1097C); CD8-APC (E-AB-F1104D); MHC II-PE (E-AB-F0990D); CD11c-FITC (E-AB-F0991C); CD86-APC (E-AB-F0994E). Para la tinción intracelular, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS que contiene BSA al 0,5% y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se tiñeron con: Granzima B-FITC (Biolegend, 372205); IFN-γ-FITC (Biolegend, 505805). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo equipado con líneas láser apropiadas. Se aplicó la compensación utilizando controles de tinción única. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Disociación tumoral y preparación de células

Los tumores extirpados se picaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm3 y se digirieron enzimáticamente en tampón de disociación de tejidos a 37 °C durante 1 h con agitación (220 rpm). Los tejidos digeridos se rompieron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz de 70 μm para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio (10 min a temperatura ambiente), y las células se lavaron dos veces con PBS.

Sangre periférica

Se recolectó sangre total de la plexo venoso retro-orbital en tubos tratados con anticoagulante. Después de la centrifugación, los glóbulos rojos se lisaron como se describió anteriormente, y los leucocitos restantes se lavaron con PBS.

Tinción superficial e intracelular

Después del bloqueo de los receptores Fc, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos durante 30 min a 4 °C en la oscuridad: CD45-PerCP (Elabscience, E-AB-F1136J); CD3-PE (E-AB-F1013D); CD4-FITC (E-AB-F1097C); CD8-APC (E-AB-F1104D); MHC II-PE (E-AB-F0990D); CD11c-FITC (E-AB-F0991C); CD86-APC (E-AB-F0994E). Para la tinción intracelular, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS que contiene BSA al 0,5% y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se tiñeron con: Granzima B-FITC (Biolegend, 372205); IFN-γ-FITC (Biolegend, 505805). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo equipado con líneas láser apropiadas. Se aplicó la compensación utilizando controles de tinción única. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Análisis de citometría de flujo de la lisis bacteriana

Para controlar la lisis bacteriana inducida por el quorum sensing y la dinámica de la expresión de proteínas, se utilizó la citometría de flujo para cuantificar la fluorescencia del reportero en cepas de E. coli diseñadas. Se inoculó una dilución de 1:100 de cultivo bacteriano nocturno en 30 mL de medio LB fresco que contiene los antibióticos apropiados. La expresión del gen reportero mCherry se indujo con concentraciones variables de IPTG (0,5-2 mM). Se recolectaron muestras bacterianas cada hora durante un máximo de 5 h después de la inducción. En cada momento, se recolectó 0,5 mL de suspensión bacteriana, se centrifugó a 12 000 rpm durante 2 min y se lavó tres veces con PBS estéril. Se midió la intensidad de la fluorescencia de mCherry utilizando un citómetro de flujo equipado con un canal PE (excitación: 561-587 nm). La selección se basó en los perfiles de dispersión directa/lateral para excluir los desechos, y se registraron al menos 10 000 eventos por muestra. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Se utilizó un umbral de intensidad de fluorescencia para determinar la activación del circuito de quorum sensing y el alcance de la expresión del reportero asociada a la lisis.

Microscopía electrónica de transmisión

Para visualizar las bacterias intracelulares dentro de las células dendríticas y evaluar las características ultraestructurales, se realizó microscopía electrónica de transmisión (MET). Las coculturas BMDC-EcN-IL12 se recolectaron cuando alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 80%, se separaron suavemente y se fijaron inmediatamente en glutaraldehído al 2,5% (preparado en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4) a 4 °C durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con tampón de fosfato frío y se postfijaron en óxido de osmio al 1% (OsO4) durante 2 h a 4 °C para preservar la integridad de la membrana y el contraste. Las muestras se deshidrataron secuencialmente en etanol graduado (30%-100%) y luego se trataron dos veces con óxido de propileno al 100% (15 min cada una). Los especímenes deshidratados se infiltraron con resina epoxi:óxido de propileno (1:1) durante 2 h, seguido de incubación durante la noche en resina pura. La polimerización se llevó a cabo a 60 °C durante 48 h. Se cortaron secciones ultrafinas (60-70 nm) utilizando un ultramicrótomo, se montaron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo. Las rejillas se examinaron en un MET que funcionaba a 80-100 kV, y se adquirieron imágenes digitales utilizando el software Olympus Viewer. Se identificaron y documentaron los compartimentos subcelulares que contenían bacterias intracelulares para la evaluación morfológica.

Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal

Para evaluar la internalización bacteriana, las interacciones entre las células dendríticas y las bacterias, y la expresión de marcadores inmunitarios, se realizó la tinción de inmunofluorescencia en células vivas y en secciones tumorales congeladas, seguida de la microscopía confocal.

Imagen basada en células

Las células HL60, las células dendríticas inmaduras y las células dendríticas maduras se cultivaron hasta una confluencia del 70-80%, se lavaron con PBS y se tiñeron con 5 μM de DiI (Beyotime, C1036) en RPMI 1640 sin suero a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Las células teñidas se lavaron tres veces con medio completo y se sembraron en placas de fondo de vidrio para la adhesión. Las cepas de EcN-IL12 diseñadas se cultivaron hasta la fase logarítmica media, se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS que contenía 10 μM de CFSE (Invitrogen, C34554). Las bacterias se incubaron durante 20 min a 37 °C, se apagó la reacción con FBS al 10% y se lavaron tres veces con PBS. Se estandarizó la densidad bacteriana a OD600 ≈ 1 (aproximadamente 1 × 108 UFC/mL). Las bacterias teñidas con CFSE se añadieron a las células teñidas con DiI en una proporción de 1:200 y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Las células se lavaron a fondo para eliminar las bacterias no adheridas y se trataron con 100 μg/mL de gentamicina durante 30 min para eliminar las bacterias extracelulares. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min, se lavaron y se contrateñeron con DAPI (1 μg/mL, 5 min). Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Olympus FV3000. Los fluoróforos se excitaban a las siguientes longitudes de onda: DiI (549 nm, rojo), CFSE (488 nm, verde), DAPI (405 nm, azul). Las imágenes se procesaron con Olympus Fluoview e ImageJ para el análisis de la intensidad de la fluorescencia y la colocalización.

Secciones de tejido tumoral

Los tejidos tumorales recién extirpados se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 24 h, se crioprotegieron en una solución de sacarosa graduada (10%, 20%, 30%) y se incluyeron en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Los bloques congelados se cortaron en secciones de 8 a 10 μm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se permeabilizaron con un 0,2% de Triton X-100 durante 10 min, se bloquearon con un 5% de BSA durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios (1:200): CD11c (AiFang Biological, AFRM0294); CD86 (AFRM9023); CD4 (AFRM9419); CD8 (AFRM0004). Después de lavados con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o 594 (Abcam, 1:500) durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se contrateñeron con DAPI y los portaobjetos se montaron utilizando un medio antifade (Beyotime, P0126). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal FV3000 con ajustes de adquisición consistentes.

Imagenología basada en células

Las células HL60, las células dendríticas inmaduras y las células dendríticas maduras se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70-80%, se lavaron con PBS y se tiñeron con 5 μM de DiI (Beyotime, C1036) en RPMI 1640 sin suero a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Las células marcadas se lavaron tres veces con medio completo y se sembraron en placas de vidrio con fondo plano para su adherencia. Las cepas de EcN-IL12 modificadas genéticamente se cultivaron hasta la fase media logarítmica, se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en PBS que contenía 10 μM de CFSE (Invitrogen, C34554). Las bacterias se incubaron durante 20 min a 37 °C, se inactivaron con un 10% de FBS y se lavaron tres veces con PBS. La densidad bacteriana se estandarizó a OD600 ≈ 1 (∼1 × 108 UFC/mL). Las bacterias marcadas con CFSE se añadieron a las células marcadas con DiI en una proporción de 1:200 y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Las células se lavaron a fondo para eliminar las bacterias no adheridas y se trataron con 100 μg/mL de gentamicina durante 30 min para eliminar las bacterias extracelulares. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante 15 min, se lavaron y se contrateñeron con DAPI (1 μg/mL, 5 min). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido láser Olympus FV3000. Los fluoróforos se excitaban a las siguientes longitudes de onda: DiI (549 nm, rojo), CFSE (488 nm, verde), DAPI (405 nm, azul). Las imágenes se procesaron con Olympus Fluoview e ImageJ para el análisis de la intensidad de la fluorescencia y la colocalización.

Secciones de tejido tumoral

Los tejidos tumorales recién extirpados se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 24 h, se crioprotegieron en una solución de sacarosa graduada (10%, 20%, 30%) y se incluyeron en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Los bloques congelados se cortaron en secciones de 8 a 10 μm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se permeabilizaron con un 0,2% de Triton X-100 durante 10 min, se bloquearon con un 5% de BSA durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios (1:200): CD11c (AiFang Biological, AFRM0294); CD86 (AFRM9023); CD4 (AFRM9419); CD8 (AFRM0004). Después de lavados con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o 594 (Abcam, 1:500) durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se contrateñeron con DAPI y los portaobjetos se montaron utilizando un medio antifade (Beyotime, P0126). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal FV3000 con ajustes de adquisición consistentes.

Ensayo de coestimulación in vitro de células T y células dendríticas

Construcción de células dendríticas

Las BMDC se indujeron y diferenciaron a partir de la médula ósea de ratones C57bl/6. Se utilizó un sistema de transducción lentiviral para construir células dendríticas que expresaran ovalbúmina (OVA) (DC-OVA) o células dendríticas que coexpresaran OVA y CD137 (DC-OVA-CD137).

Selección y marcaje de células T

Las células T CD8+ naive se seleccionaron negativamente a partir del bazo de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec). Las células se marcaron con 5 μM de CFSE (Thermo Fisher) a 37 °C en la oscuridad durante 10 min, seguido de la terminación de la reacción con medio que contenía suero.

Cocultivo

Las células T marcadas se cocultivaron con eDC en una proporción de 10:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 72 h.

Análisis por citometría de flujo

Las células se recogieron. La dilución de la intensidad de la fluorescencia de CFSE en la población CD8+ se detectó utilizando un citómetro de flujo para evaluar la proliferación.

Ensayo funcional

Las células se recogieron para la posterior detección de la expresión de ARNm mediante RT-qPCR. Después de bloquear el transporte de Golgi con Brefeldin A y Monensin durante 4 h, se realizó la tinción intracelular (IFN-γ, Granzima B). Las concentraciones de TNF-α, Granzima B e IFN-γ en el sobrenadante se detectaron mediante ELISA.

Construcción de células dendríticas

Las BMDC se indujeron y diferenciaron a partir de la médula ósea de ratones C57bl/6. Se utilizó un sistema de transducción lentiviral para construir células dendríticas que expresaran ovalbúmina (OVA) (DC-OVA) o células dendríticas que coexpresaran OVA y CD137 (DC-OVA-CD137).

Selección y marcaje de células T

Las células T CD8+ naive se seleccionaron negativamente a partir del bazo de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec). Las células se marcaron con 5 μM de CFSE (Thermo Fisher) a 37 °C en la oscuridad durante 10 min, seguido de la terminación de la reacción con medio que contenía suero.

Cocultivo

Las células T marcadas se cocultivaron con eDC en una proporción de 10:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 72 h.

Análisis por citometría de flujo

Las células se recogieron. La dilución de la intensidad de la fluorescencia de CFSE en la población CD8+ se detectó utilizando un citómetro de flujo para evaluar la proliferación.

Ensayo funcional

Las células se recogieron para la posterior detección de la expresión de ARNm mediante RT-qPCR. Después de bloquear el transporte de Golgi con Brefeldin A y Monensin durante 4 h, se realizó la tinción intracelular (IFN-γ, Granzima B). Las concentraciones de TNF-α, Granzima B e IFN-γ en el sobrenadante se detectaron mediante ELISA.

Lisis inducida por IPTG

EcN-IL12-QS se inoculó en medio líquido LB y se cultivó con agitación a 37 °C hasta que OD600 alcanzó 0,2. La cultura bacteriana se dividió en dos; el grupo experimental recibió IPTG a una concentración final de 0,5 mM, 1 mM y 2 mM, mientras que el grupo de control recibió el mismo volumen de disolvente. Se midió OD600 cada 2 h utilizando un espectrofotómetro para trazar la curva de lisis.

Cultivo en condiciones de hipoxia, anoxia y normoxia

Las cepas EcN-IL12 y EcN-IL12-QS se inocularon en diferentes condiciones de oxígeno. El grupo de normoxia se colocó en una incubadora estándar (21% de O2, 5% de CO2), el grupo de anoxia se colocó en un anaero pack, mientras que el grupo de hipoxia se colocó en una estación de hipoxia (Baker Ruskinn) con condiciones de gas establecidas en 1% de O2, 5% de CO2, 94% de N2. Los sobrenadantes se recogieron después de 24 y 48 h de cultivo.

Detección de ALT/AST

Se mezclaron 20 μL de muestra de suero con 80 μL de solución de matriz en una placa de 96 pocillos. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Después de la incubación, se añadieron 20 μL de solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 20 min más. Finalmente, se añadieron 200 μL de solución de parada para detener la reacción. La absorbancia se midió a 510 nm utilizando un lector de microplacas. Los niveles de actividad se calcularon en función de las curvas estándar generadas utilizando estándares de piruvato de sodio.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se aisló el ARN total de las células o tejidos utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras se lisaron en TRIzol y se mezclaron con cloroformo para la separación de fases. Después de la centrifugación a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C, la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. El ARN se precipitó con isopropanol y se lavó con etanol al 75%. El precipitado de ARN se secó al aire y se disolvió en agua libre de RNasa. La concentración y la pureza del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La relación A260/A280 se mantuvo entre 1,8 y 2,0. El ADN complementario de cadena única se sintetizó a partir de 1 μg de ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADN complementario (Takara, Japón) según los procedimientos estándar. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green Master Mix en un sistema Bio-Rad CFX96. La mezcla de reacción contenía 10 μL de 2× SYBR Green Master Mix, 0,5 μL de los cebadores directo e inverso, 2 μL de la plantilla de ADN complementario y agua libre de RNasa. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Los niveles de expresión relativa de los genes diana se calcularon utilizando el método 2−δδCt y se normalizaron con el control interno.

Análisis bioinformático de la correlación entre la expresión génica y la supervivencia

Para investigar la relevancia clínica de la expresión de IL12A e IL12B en el cáncer colorrectal (CCR) y otros tipos de tumores, se analizaron conjuntos de datos transcriptómicos y clínicos disponibles públicamente utilizando las siguientes plataformas.

GEPIA2

Se analizó la expresión diferencial de IL12A e IL12B entre los tejidos tumorales y los tejidos normales adyacentes en los conjuntos de datos TCGA y GTEx. Se realizaron análisis de supervivencia general (OS) y supervivencia libre de enfermedad (DFS) utilizando el nivel de expresión medio como punto de corte. Se utilizó la prueba de rango logarítmico para evaluar la significación estadística (http://gepia2.cancer-pku.cn).

TIMER2.0

Para evaluar los correlatos inmunitarios, se correlacionó la expresión de IL12A e IL12B con los marcadores de los subconjuntos de células inmunitarias (células T CD4+, células T CD8+, células NK) en las muestras tumorales. Se utilizó la correlación de Spearman, y se consideraron significativos los valores de p