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La inmunoterapia basada en metabolitos fúngicos supera la inmunosupresión de los macrófagos asociados al tumor.

Cell Reports Medicine

22 de Mayo de 2026

PMID: 42173096

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Los macrófagos asociados al tumor (MAT) son elementos clave en la inducción de la inmunosupresión en el microambiente tumoral, pero las estrategias eficaces para reprogramarlos siguen siendo limitadas. En el presente estudio, desarrollamos una estrategia basada en un precursor exógeno que facilita la producción de metabolitos fúngicos (ePAFM), lo que genera metabolitos fúngicos bioactivos, e identificamos IM502, un compuesto similar a una meroterpeno, como un potente modulador de los MAT. A nivel mecanístico, IM502 inhibe principalmente PI3Kγ y redirige la señalización STAT, pasando de la dominancia de STAT3/6 a la de STAT1/2, lo que revierte la inmunosupresión mediada por los MAT y mejora sustancialmente la abundancia y la calidad funcional de las células asesinas naturales (NK) y las células T. En particular, IM502 reprograma los MAT del cáncer colorrectal humano, restaurando la proliferación de las células T CD8+.

Suprime los tumores y las metástasis establecidos en múltiples tipos de cáncer, demostrando una eficacia superior a la de otros agentes dirigidos a los macrófagos, con efectos comparables a los de los fármacos clínicos y la capacidad de superar la resistencia al bloqueo de PD-1. Este trabajo establece la plataforma ePAFM para la generación de metabolitos y destaca el potencial de IM502 para la inmunoterapia del cáncer.

PubMed Central ~19,365 palabras · 97 min de lectura

El microambiente tumoral (MET) es un ecosistema complejo que determina la progresión tumoral y la respuesta terapéutica.^[1],^[2],^[3],^[4] Dentro del MET, los macrófagos asociados al tumor (MAT) emergen como la población mieloide inmunosupresora más abundante, y su alta infiltración se correlaciona fuertemente con un mal pronóstico en la mayoría de los cánceres sólidos.^[5],^[6] En los tumores, los MAT se diferencian para convertirse en los principales arquitectos de un nicho inmunosupresor.^[7],^[8],^[9],^[10] Despliegan múltiples mecanismos para suprimir la inmunidad antitumoral, incluyendo la secreción de citocinas inhibidoras (por ejemplo, IL-10 y TGF-β), la expresión de ligandos de puntos de control inmunitario como PD-L1 y el agotamiento de aminoácidos esenciales como la arginina a través de la arginasa 1 (Arg1), paralizando efectivamente a las células T citotóxicas CD8+.^[11]

Dado su papel pro-tumorigénico, los MAT se han convertido en un objetivo terapéutico prometedor.^[6],^[7] Sin embargo, la traslación clínica de estrategias centradas en los MAT ha enfrentado importantes obstáculos.^[7] Los enfoques dirigidos a agotar los MAT o bloquear su reclutamiento (por ejemplo, inhibidores de CSF-1R o CCR2) han mostrado una eficacia limitada como monoterapia.^[7] Estos obstáculos incluyen la notable plasticidad y diversidad de los fagocitos mononucleares en los tumores, junto con mecanismos compensatorios como la acumulación de otras células mieloides inmunosupresoras como los neutrófilos, lo que destaca la redundancia dentro del sistema de quimiocinas.

Estas limitaciones han impulsado el interés en estrategias alternativas que buscan reprogramar, en lugar de eliminar, los MAT.^[2],^[7] Un enfoque prometedor es dirigirse a las vías de señalización intracelular que controlan la polarización y la función de los MAT. Central para esta reprogramación se encuentran los principales nodos de señalización como el eje PI3Kγ/Akt y la familia STAT de factores de transcripción, que en conjunto orquestan el fenotipo de los MAT y, de manera crítica, su estado metabólico.^[12],^[13],^[14],^[15] Los macrófagos polarizados hacia un estado inmunosupresor (tipo M2) dependen en gran medida de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), mientras que los macrófagos inmunostimulantes (tipo M1) participan en la glucólisis.^[16] Esta reprogramación metabólica no es simplemente una consecuencia, sino un impulsor fundamental de su función; la OXPHOS apoya un fenotipo antiinflamatorio y reparador, mientras que la glucólisis proporciona la capacidad bioenergética y biosintética rápida necesaria para la activación proinflamatoria.^[11],^[17] La activación de las vías de señalización STAT1/2 y STAT3/6 orquesta el fenotipo, el metabolismo y la función de los macrófagos tipo M1 y tipo M2, que, respectivamente, promueven y suprimen las respuestas inmunitarias antitumorales.^[12] PI3Kγ, una fosfoinositido 3-quinasa de clase I expresada predominantemente en macrófagos y otras células mieloides, impulsa la evasión inmune tumoral.^[18],^[19] Su papel, sin embargo, no es meramente facilitador, sino más bien central para la identidad inmunosupresora de los MAT.^[19] PI3Kγ actúa como un centro de señalización clave, integrando las entradas de varios factores derivados del tumor (como CSF1, CCL2 y componentes de la matriz extracelular) para mantener un programa transcripcional y metabólico que suprime la inmunidad antitumoral.^[14],^[20] La inhibición genética o farmacológica de PI3Kγ en las células mieloides es suficiente para interrumpir este programa, reprogramando los MAT a un estado proinflamatorio que, a su vez, restaura la citotoxicidad de las células T CD8+ e inhibe el crecimiento tumoral.^[13],^[14],^[15],^[21] Por lo tanto, dirigirse a los principales reguladores intracelulares como PI3Kγ representa un enfoque prometedor para remodelar terapéuticamente el MET.^[5],^[7],^[22],^[23],^[24]

El metabolismo secundario de los hongos es una fuente reconocida de agentes clínicos, como la rapamicina, y un testimonio de las propiedades similares a los fármacos de los andamios de productos naturales.^[25],^[26],^[27],^[28] Esto se ejemplifica con los inmunosupresores y los fármacos anticancerígenos derivados directamente de los hongos. Los análogos de la rapamicina (rapalogos), como el temsirolimus y el everolimus, son inhibidores de la vía mTOR que se utilizan en el tratamiento del carcinoma de células renales y otras neoplasias.^[29] De manera similar, la clase de antifúngicos de las equinocandinas, incluido el caspofungin, se originó a partir de las neumocandinas fúngicas.^[30] Más allá de estos éxitos, los metabolitos fúngicos continúan revelando complejas actividades inmunomoduladoras, como se observa con la ciclosporina A, un metabolito de Trichoderma polysporum, que se utiliza después del trasplante de órganos y en enfermedades autoinmunes.^[28] Estos ejemplos subrayan la inmensa capacidad del metabolismo fúngico para producir moléculas sofisticadas con potentes actividades biológicas relevantes para la terapia. Estos complejos metabolitos se ensamblan mediante grupos de genes dedicados. Un cuello de botella significativo, sin embargo, es la latencia metabólica, causada con frecuencia por la pérdida evolutiva de los genes necesarios para producir precursores endógenos esenciales.^[31],^[32] Esta limitación impide el descubrimiento de moléculas bioactivas a partir de estas vías silenciosas. Para superar esto, desarrollamos una estrategia de metabolitos fúngicos asistida por precursores exógenos (ePAFM). Este enfoque evita el problema común de la latencia metabólica en los hongos al proporcionar un precursor exógeno a las cepas que son deficientes en la síntesis de precursores, pero que conservan la maquinaria enzimática sofisticada para transformarlos, desbloqueando así la producción de metabolitos bioactivos.

Aquí, aplicamos la plataforma ePAFM para descubrir agentes de reprogramación de MAT. La aplicación de la estrategia ePAFM al hongo comestible Agrocybe pediades con geranilhidroquinona (GHQ), un precursor conocido en especies medicinales,^[32],^[33], condujo a la generación de un conjunto de compuestos similares a los merotepénidos. IM502 se identificó como el candidato principal para la reprogramación de MAT. Luego, investigamos cómo funciona IM502, demostramos que es eficaz en modelos preclínicos de cáncer y destacamos su potencial para la inmunoterapia. Este trabajo representa un esfuerzo por aprovechar los principios del metabolismo microbiano natural para generar metabolitos fúngicos que reprogramen las funciones inmunosupresoras de los MAT, abordando una necesidad insatisfecha importante en la terapia del cáncer.

Resultados

IM502 disminuye el fenotipo y la función inmunosupresores de los macrófagos in vitro

Para descubrir agentes de reprogramación de MAT, empleamos el flujo de trabajo ePAFM, que abarca la generación de compuestos, el cribado funcional en co-cultivos de macrófagos y células T, y la validación in vivo de los compuestos líderes (Figura 1A). Cultivamos el hongo comestible Agrocybe pediades—que es deficiente en la síntesis de precursores pero competente en su metabolismo—con diferentes compuestos precursores (Figura S1A) para generar compuestos similares a los productos naturales (NP) (Figuras S1B y S1C). Se estableció un modelo de imitación de MAT in vitro polarizando macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con medio acondicionado de células tumorales (TCM), lo que confirió un fenotipo supresor que inhibió la proliferación de células T CD8+ OT-I (Figuras S2A y S2B).^[34] El cribado inicial de soluciones de fermentación no fraccionadas (FS) demostró que GHQ-FS aliviaba la función inmunosupresora de los macrófagos polarizados con TCM, mejorando notablemente la proliferación de células T CD8+ (Figuras S2C–S2E) y la producción de IFNγ (Figura S2F). El fraccionamiento guiado por la bioactividad de GHQ∗FS (Figura S2G) identificó a IM502 como el compuesto responsable. La aplicación de IM502 a los macrófagos cultivados con TCM promovió significativamente la división de las células T CD8+ (Figuras 1B y 1C), aumentó el rendimiento de las células T (Figura 1D) y aumentó la secreción de IFNγ en 2 veces (Figura 1E).

Basado en su potencia y abundancia en GHQ∗FS, IM502 se priorizó para una mayor caracterización. Primero, determinamos la dosis óptima de actividad biológica, identificando 10 μM como la concentración que maximiza la recuperación de la función de las células T (Figuras 1F–1H). El efecto inmunostimulante de IM502 no estaba restringido al antígeno, ya que también revirtió la supresión de los macrófagos en cultivos estimulados con anti-CD3 (Figuras S2H–S2J) y mejoró la fagocitosis de células tumorales por parte de los macrófagos (Figuras S2K–S2M). Para comprender el mecanismo subyacente a esta reprogramación funcional, analizamos el fenotipo de los macrófagos. El tratamiento con IM502 aumentó significativamente las moléculas coestimuladoras CD86 y CD80, con niveles de expresión (intensidad media de fluorescencia geométrica) que aumentaron en 2 veces (Figuras 1I–1K). Este cambio hacia un fenotipo inmunostimulante se corroboró a nivel transcripcional, donde IM502 redujo la expresión de los principales genes inmunosupresores (Arg1, Tgfb e Il10) y aumentó la expresión de los genes proinflamatorios (Nos2, Il6 y Cxcl9) (Figura S2N).

Para determinar el potencial traslacional de IM502, investigamos sus efectos en un modelo de células primarias humanas. Se estableció un ensayo de co-cultivo con macrófagos derivados de monocitos humanos y células T CD8+ (Figura 1L). Utilizando el medio acondicionado de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 para polarizar los macrófagos, encontramos que IM502 aliviaba constantemente la supresión mediada por los macrófagos humanos, como lo demuestra la restauración de la proliferación de las células T (Figuras 1M y 1N) y la producción de citocinas (Figura 1O). Además, IM502 indujo un cambio paralelo en el perfil transcripcional de los macrófagos humanos hacia un estado proinflamatorio (Figura 1P), lo que indica un mecanismo de acción conservado entre especies.

IM502 demuestra una potente y bien tolerada actividad antitumoral in vivo

A continuación, determinamos el potencial terapéutico de IM502 en un modelo de tumor hepático ortotópico en ratones.^[34] Un estudio de rango de dosis (Figura 2A) reveló que la administración intravenosa de IM502 (1,5–6 mg/kg) inhibió significativamente la carga tumoral primaria, según el número y el tamaño de los nódulos tumorales (Figuras 2B–2D). Las reducciones concomitantes en la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) en suero indicaron una mejora de la función hepática (Figura 2E). El tratamiento con IM502 también limitó sustancialmente la diseminación metastásica a los pulmones (Figuras 2F y 2G). Críticamente, esta eficacia se logró sin toxicidad evidente, ya que el peso corporal, la histología hepática y el peso del bazo no se vieron afectados (Figuras S3A–S3C). Las actividades antitumoral y antimetastásica se recapitularon mediante la administración de la mezcla original de GHQ∗FS (Figuras 2H e 2I).

Para establecer la amplia eficacia de IM502, lo probamos en cuatro modelos de tumores sinérgicos inmunocompetentes (Figuras 2J–2N). IM502 redujo significativamente el crecimiento tumoral no solo en el modelo de tumor hepático Hepa1-6BL (Figura 2K), sino también en los modelos de tumor de melanoma B16F10 y de tumor de colon CT26 y MC38 (Figuras 2L–2N). Es importante destacar que, para determinar si la eficacia se extendía más allá del crecimiento subcutáneo dependiente de las células T, probamos IM502 en un modelo de colonización metastásica de melanoma B16F10 in vivo.^[34] El tratamiento con IM502 redujo la metástasis pulmonar de B16F10 en más del 50 % (Figura 2O), lo que subraya su actividad antitumoral multifacética.

Para dilucidar el mecanismo de acción, interrogamos la contribución de la inmunidad del huésped, ya que IM502 carece de actividad tumoricida directa (Figuras S3D–S3G). La eficacia antitumoral de IM502 dependía críticamente de un sistema inmunitario intacto, ya que se abolió en ratones deficientes en Rag2, que carecen de inmunidad adaptativa (Figura 2P). La citocina IFNγ y las células asesinas naturales (NK) se identificaron como mediadores esenciales, y la eficacia se perdió tras la neutralización de IFNγ (Figuras 2Q y 2R) o la depleción de las células NK (Figuras 2S y 2T). Para caracterizar la distribución tisular de IM502, realizamos un estudio farmacocinético tras la administración intravenosa. IM502 exhibió propiedades farmacocinéticas favorables con una acumulación tumoral significativa (AUCtumor/AUCplasma = 4,2) y una retención tumoral prolongada (t1/2 = 12,79 h) (Figura S4). Estos datos sugieren que IM502 llega y persiste eficazmente dentro del MET, lo que se alinea con sus efectos inmunomoduladores y antitumorales sostenidos.

IM502 mejora el perfil efector de las células T y NK infiltrantes tumorales

Inicialmente, evaluamos los cambios en la infiltración de células inmunitarias mediante citometría de flujo. El tratamiento con IM502 condujo a un aumento significativo en la abundancia y frecuencia de leucocitos CD45+, células T CD4+, células T CD8+ y células NK en los tumores Hepa1-6BL (Figuras 3A–3D; estrategia de selección en la Figura S5). Para delimitar los cambios subyacentes con mayor resolución, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD45+ intratumorales (Figura S6). El agrupamiento no supervisado identificó 13 subpoblaciones transcriptómicas diferentes (Figura 3E; Figuras S6 y S7), que se anotaron como siete tipos principales de células inmunitarias (Figura 3F). La cuantificación de la abundancia de los grupos reveló una remodelación coordinada del microambiente tumoral (TME), caracterizada por un aumento proporcional en los subconjuntos de células T y NK y una disminución concomitante en los macrófagos (Figura 3G).

El análisis transcriptómico reveló que IM502 orquesta un cambio profundo hacia la activación inmunitaria. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) indicó la regulación al alza de las vías citotóxicas y proliferativas, y la regulación a la baja de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), en las células T y NK (Figura 3H; Figura S8A), con mejoras específicas de la línea celular en la migración (células T CD8+) y la citotoxicidad (células NK; Figuras 3I y 3J). Se analizó el repertorio de receptores de células T, ya que la clonalidad de las células T es un indicador del estado funcional y predice la eficacia de la inmunoterapia.^[35],^[36] El tratamiento con IM502 se asoció con una ampliación del repertorio de receptores de células T, caracterizada por un aumento de los clonotipos únicos y una mayor proporción de clones de frecuencia media y baja, como se muestra en los índices de diversidad y la distribución clonal (Figuras S8B–S8F). Estos cambios moleculares se tradujeron en función: los tumores tratados con IM502 exhibieron un aumento en los linfocitos citotóxicos productores de citocinas, en particular las células IFNγ (Figura 3K). La mayor infiltración y activación de los linfocitos efectores se basa en una sinergia celular necesaria. La depleción de las células T CD8+ abolió la eficacia de IM502, confirmando su papel esencial (Figura S9A). En esencia, el aumento de la infiltración tumoral y la producción de IFNγ por las células NK o las células T CD8+ inducido por IM502 dependió estrictamente de la presencia del otro subconjunto (Figuras S9B–S9G). Esta necesidad recíproca define un bucle sinérgico. In vitro, los macrófagos reprogramados por IM502 mejoraron al máximo la proliferación de las células T CD8+ y la producción de IFNγ solo cuando estaban presentes las células NK (Figuras S10A–S10D). Por lo tanto, IM502 fomenta un eje NK-células T CD8+ interdependiente para una inmunidad antitumoral óptima.

Se observaron ganancias similares en la infiltración y la producción de efectores en los tumores MC38 subcutáneos (Figuras S11A–S11I). El hallazgo fundamental de que la administración local (intratumoral) y sistémica produjo una eficacia comparable (Figuras S11A–S11I) localizó firmemente el sitio de acción de IM502 en el TME. En los bazo de los ratones con tumores, la composición de las células inmunitarias no cambió, pero aumentaron las células T CD4+ y CD8+ productoras de IFNγ (Figuras S12A–S12E). La ausencia de cualquier efecto directo sobre la proliferación, la citotoxicidad, la secreción de citocinas o la expresión de marcadores de agotamiento de las células T CD4+ o CD8+ in vitro (Figuras S13A–S13G) contrastó con el aumento de las células T IFNγ+ en el bazo y los tumores, lo que subraya que IM502 potencia indirectamente la inmunidad antitumoral de las células T.### IM502 suprime el crecimiento tumoral reprogramando los TAM

Para definir el mecanismo por el cual IM502 modula el TME, analizamos el intercambio celular. Los datos de scRNA-seq revelaron que IM502 mejoró las interacciones inmunoestimulantes y debilitó la señalización inmunosupresora de TGFβ dentro de la red macrófago-célula T-célula NK (Figuras S14A y S14B). Centrándonos en el compartimento mieloide, se agruparon en macrófagos (Fcgr2b), células dendríticas ([DCs], Itgax y Cd86), neutrófilos (Cd63 y S100a6) y monocitos que expresan genes marcadores de macrófagos en niveles bajos. Los macrófagos comprendieron tres poblaciones distintas: Ly6CLow (grupo 0, Apoe), Ly6CHigh (grupo 1, Plac8) y macrófagos residentes en los tejidos (grupo 6, Cd81 y C1qb) (Figuras 3E y 3F). IM502 redujo la proporción de macrófagos intratumorales, el subconjunto de macrófagos Ly6CLow. Sin embargo, a pesar de esta reducción en la proporción, el número de macrófagos aumentó, de forma concomitante con un aumento general en la infiltración total de células inmunitarias (Figuras 4A y 4B; Figura S15A). Lo más importante es que IM502 inició una reprogramación funcional de los TAM, redirigiendo su transcriptoma hacia funciones inmunoestimulantes (presentación de antígenos, fagocitosis) y alejándolo del metabolismo oxidativo y la inmunosupresión (Figuras 4C–4E). Este cambio molecular se confirmó a nivel de proteínas y a nivel metabólico. El nivel de arginasa 1 disminuyó en los tejidos tumorales y los macrófagos tratados con IM502 (Figuras 4F y 4G; Figuras S15B–S15D), con una reducción en los metabolitos de la arginina (niveles de ornitina, prolina y creatina; Figuras 4H–4J). La regulación a la baja de VEGFA correspondió a menos vasos tumorales (Figuras S15E–S15H). Los datos de citometría de flujo mostraron niveles elevados de CD80 y CD86 en los TAM en los tumores tratados con IM502 (Figuras S16A y S16B). La consecuencia funcional fue la pérdida de la supresión mediada por TAM de las células T CD8+ (Figuras S16C–S16G). La infiltración y activación de las DCs in vivo (Figuras S17A y S17B) probablemente representan una consecuencia secundaria de la reprogramación de los TAM, ya que IM502 no tuvo ningún efecto directo sobre la expresión de CD80 y CD86 y la capacidad de presentación de antígenos de las DCs in vitro (Figuras S17C–S17E). En conjunto, estos datos señalan la reprogramación de los TAM como un mecanismo central que subyace a la eficacia antitumoral de IM502.

Para probar directamente la relevancia humana de nuestro mecanismo, aislamos los TAM de muestras clínicas de cáncer colorrectal (Figura 4K). IM502 revirtió constantemente la función inmunosupresora de estos TAM derivados de pacientes, mejorandoPotentemente la proliferación de las células T CD8+ autólogas cultivadas en co-cultivo (Figura 4L). La ausencia de un efecto directo sobre las células T (Figura 4M) confirmó que el compuesto actúa a través de las células mieloides. Caracterizamos aún más los efectos inmunomoduladores sistémicos de IM502, encontrando patrones distintos de expansión y activación de las células inmunitarias en los ganglios linfáticos drenantes y no drenantes (Figuras S18A–S18J). En los ratones tratados con IM502, los ganglios linfáticos drenantes exhibieron agrandamiento y expansión de las células inmunitarias, sin cambios en el número de macrófagos y DCs (Figuras S18A–S18D). La expresión de CD86 y MHC II disminuyó ligeramente en los macrófagos, pero aumentó en las DCs (Figura S18C–S18E). En contraste, los ganglios linfáticos no drenantes mostraron un aumento en el número de macrófagos y DCs después del tratamiento con IM502, junto con una mayor expresión de CD86 en los macrófagos (Figuras S18F–S18J). La evidencia fundamental provino de un estudio de depleción de macrófagos, que demostró que los macrófagos son necesarios para la actividad antitumoral de IM502, ya que la depleción de macrófagos abolió por completo su efecto terapéutico (Figuras 4N–4Q). Por lo tanto, la reprogramación de los TAM de células inmunosupresoras a células inmunoestimulantes no solo es un mecanismo conservado entre especies, sino también esencial para la eficacia antitumoral de IM502.### IM502 se dirige a PI3Kγ y redirige la señalización STAT

Buscamos definir el mecanismo de IM502 identificando su objetivo molecular directo. Un cribado virtual inverso contra 2765 proteínas, priorizado por la puntuación de acoplamiento y la expresión específica de macrófagos, nominó la subunidad catalítica p110γ de PI3Kγ (PIK3CG) como el candidato principal, un hallazgo corroborado por el análisis de enriquecimiento de vías (Figuras S19A y S19B). El modelado estructural localizó IM502 en el sitio de unión a ATP de PI3Kγ (Figura 5A). Luego, validamos esta predicción bioquímicamente: IM502 inhibió directamente la actividad quinasa de PI3Kγ con alta potencia (IC50 61,7 nM), mientras que su actividad contra PI3Kα (252,3 nM), PI3Kβ (532,5 nM) y PI3Kδ (407,9 nM) fue sustancialmente menor (Figura 5B). Bloqueó de forma dependiente de la concentración la fosforilación de Akt/S6 en macrófagos sin alterar la señalización de PTEN o MAPK (Figuras 5C–5E; Figura S19C). El vínculo funcional crucial se estableció mediante experimentos de pérdida de función. El silenciamiento de PI3Kγ previno por completo que IM502 inhibiera la fosforilación de Akt (Figura 5F), aumentara CD80 y aliviara la supresión mediada por macrófagos de las células T (Figuras 5G–5K). Por lo tanto, identificamos la inhibición de PI3Kγ como el evento molecular iniciador de la reprogramación de macrófagos inducida por IM502.

Para comprender la base estructural de la actividad de IM502, comparamos su postura de unión con la de IPI549. Este análisis reveló una diferencia fundamental. Como se describió anteriormente,^[24] IPI549 adopta una forma de hélice plana, anclando su aminopirazolopirimidina a Val882 a través de enlaces de hidrógeno bidentados y apilando su quinazolinona contra Trp812 (Figura S19D). Sin embargo, IM502 asume una conformación más profunda, en forma de barco, formando tres enlaces de hidrógeno con Lys833, Glu880 y Asp964 (Figuras 5A; Figura S19E). Esta interacción distinta sugiere un mecanismo específico para alterar la conformación de la quinasa y la señalización posterior.

A continuación, investigamos la maquinaria de transcripción gobernada por IM502. El análisis de la actividad de los factores en los TAM destacó la pronunciada activación del complejo sensible a los interferones ISGF3 (STAT1/STAT2/IRF9)^[37] junto con Spi1 y Junb (Figura 5L). Mecánicamente, IM502 moduló recíprocamente la fosforilación de STAT. La activación de STAT1 (Ser727) se produjo a través de un eje AKT-p38 MAPK-STAT1 definido iniciado por la inhibición de PI3Kγ, como lo evidencian la supresión concurrente de AKT y la activación de p38/STAT1, y la abolición de la fosforilación de STAT1 por la inhibición de p38 (Figura 5M; Figuras S20A–S20C). Esta vía también sustentó los cambios fenotípicos inducidos por IM502 en los macrófagos (Figuras S20D y S20E) y se involucró de manera similar mediante el inhibidor de PI3Kγ IPI549. En paralelo, IM502 inhibió las vías inmunosupresoras mediadas por STAT3 (Ser727) y STAT6 (Tyr641) (Figura 5M). Esta redirección selectiva de STAT se reflejó en la regulación al alza de la expresión de los genes regulados por ISGF3 involucrados en la activación inmunitaria y la reprogramación metabólica (Figura 5N). En conjunto, estos datos establecen que IM502, a través de su participación en PI3Kγ, orquesta un cambio transcripcional en los macrófagos al reequilibrar la actividad de STAT para favorecer un fenotipo antitumoral.### IM502 reprograma el metabolismo de los macrófagos y alivia el estrés oxidativo

STAT3 controla la función de las mitocondrias y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en los macrófagos.^[38] Hipotetizamos que la inhibición de la señalización PI3Kγ/STAT por IM502 afectaría directamente al metabolismo central. El perfilado de scRNA-seq reveló un cambio fundamental de OXPHOS a glucólisis en los TAM tratados con IM502 (Figuras 4C–4E). El análisis funcional de Seahorse confirmó que IM502 revirtió el estado hiper-OXPHOS inducido por TCM, normalizando las tasas de consumo de oxígeno y la producción de ATP (Figuras S21A y S21B). Este cambio metabólico se vinculó funcionalmente a la señalización de STAT, ya que los inhibidores de STAT1 y STAT3 atenuaron el aumento de la producción de lactato, el consumo de glucosa, la expresión de los genes asociados a la glucólisis y los cambios funcionales inducidos por IM502 (Figuras S21C–S21H). Además, la inhibición farmacológica de la glucólisis con 2-desoxi-D-glucosa abolió la reprogramación inmunoestimulante de los macrófagos por IM502, lo que demuestra que este cambio metabólico es necesario para la activación inmunitaria funcional (Figura S22).

A continuación, nos centramos en el desequilibrio redox asociado. Se sabe que los macrófagos "educados" por el tumor mantienen altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). ^[39] El tratamiento con IM502 revirtió eficazmente este fenotipo, reduciendo los ROS mitocondriales (Figuras S23A y S23B) y disminuyendo la expresión de programas transcripcionales relacionados con la producción de ROS (Figura S23C). El superóxido se origina principalmente en las mitocondrias, los peroxisomas y las NADPH oxidasas (NOX). ^[40] Mecánicamente, IM502 suprimió la expresión de los sistemas generadores de superóxido, incluidas las NADPH oxidasas (Nox1 y Nox2) y los componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (Figura S23D). Esto se acompañó de una restauración del antioxidante glutatión (GSH), que está disminuido en los macrófagos asociados al tumor (TAM) (Figura S23E). El exceso de ROS impulsa la peroxidación de lípidos y el daño de la membrana. ^[40], ^[41] El efecto neto de esta remodelación metabólica fue una reducción significativa del daño oxidativo, evidenciada por la disminución de la peroxidación de lípidos (Figura S23F) y la recuperación del potencial de membrana mitocondrial tanto en macrófagos murinos como humanos (Figuras S23G y S23H). Por lo tanto, IM502 induce una reprogramación metabólica coherente que contrarresta la firma de estrés oxidativo pro-tumorigénico de los TAM.

IM502 se asemeja a los fármacos clínicos y supera la resistencia al bloqueo de PD-1

Una titulación de dosis adicional estableció 1,5 mg/kg como una dosis eficaz de IM502, reduciendo significativamente la carga tumoral hepática ortotópica, mientras que 0,375 mg/kg mostró solo una tendencia no significativa (Figuras 6A y 6B). Las comparaciones directas con los puntos de referencia clínicos relevantes revelaron su perfil competitivo. IM502 a 1,5 mg/kg logró un efecto antitumoral comparable al de una dosis mucho mayor de IPI549 (12 mg/kg), un inhibidor de PI3Kγ en fase clínica, y 1,5 mg/kg de IPI549 por sí solo fue ineficaz (Figuras 6C-6E). El fármaco clínico PLX3397 (pexidartinib), un inhibidor de CSF1R (expresado principalmente en macrófagos), no mostró actividad a la dosis estándar de 10 mg/kg, mientras que IM502 (1,5 mg/kg) redujo nuevamente la carga tumoral (Figuras 6F-6I). IM502 logró una eficacia comparable a la de la quimioterapia de primera línea (FOLFOX) en el cáncer colorrectal (Figuras 6J-6M).

Luego, evaluamos IM502 en el contexto de la resistencia a la inmunoterapia. Sorprendentemente, la monoterapia con IM502 fue eficaz tanto en el modelo de tumor hepático ortotópico como en los modelos de melanoma sinérgico que eran completamente refractarios al bloqueo del punto de control anti-PD-1 (Figuras 6N-6S). En consecuencia, probamos una estrategia de combinación racional. La combinación de IM502 con el anticuerpo anti-PD-1 actuó de forma sinérgica, suprimiendo el crecimiento del tumor hepático ortotópico y reduciendo el número de nódulos grandes (>2 mm) y metástasis pulmonares espontáneas en hasta un 60% y un 80%, respectivamente (Figuras 7A-7G). Sorafenib, un tratamiento estándar para el carcinoma hepatocelular avanzado, se sabe que promueve paradójicamente la hipoxia intratumoral y la polarización de los TAM tipo M2, creando un microambiente inmunosupresor que limita su propia eficacia. Dado que IM502 reprograma los TAM hacia un estado tipo M1 inmunostimulante, hipotetizamos que la combinación de IM502 con sorafenib podría contrarrestar la inmunosupresión inducida por sorafenib y lograr una actividad antitumoral sinérgica. Como se muestra en las Figuras 7H-7M, la combinación produjo de hecho una eficacia superior en comparación con la monoterapia. Estas comparaciones exhaustivas subrayan el potencial de IM502 no solo para igualar las terapias existentes, sino también para abordar los mecanismos críticos de resistencia en los modelos probados.

IM502 disminuye el fenotipo y la función inmunosupresores de los macrófagos in vitro

Para descubrir agentes de reprogramación de TAM, empleamos el flujo de trabajo ePAFM, que abarca la generación de compuestos, el cribado funcional en co-cultivos de macrófagos y células T, y la validación in vivo de los compuestos principales (Figura 1A). Cultivamos el hongo comestible Agrocybe pediades (que es deficiente en la síntesis de precursores, pero eficiente en su metabolismo) con diferentes compuestos precursores (Figura S1A) para generar compuestos similares a productos naturales (NP) (Figuras S1B y S1C). Se estableció un modelo in vitro de imitación de TAM polarizando macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con medio acondicionado por células tumorales (TCM), lo que confirió un fenotipo supresor que inhibió la proliferación de células T CD8+ OT-I (Figuras S2A y S2B). ^[34] El cribado inicial de soluciones de fermentación no fraccionadas (FS) demostró que GHQ-FS aliviaba la función inmunosupresora de los macrófagos polarizados con TCM, mejorando notablemente la proliferación de células T CD8+ (Figuras S2C-S2E) y la producción de IFNγ (Figura S2F). El fraccionamiento guiado por la bioactividad de GHQ*FS (Figura S2G) identificó a IM502 como el compuesto responsable. La aplicación de IM502 a macrófagos cultivados con TCM promovió significativamente la división de células T CD8+ (Figuras 1B y 1C), aumentó el rendimiento de células T (Figura 1D) y aumentó la secreción de IFNγ en 2 veces (Figura 1E).

Basándose en su potencia y abundancia en GHQ*FS, IM502 se priorizó para una mayor caracterización. Primero, determinamos la dosis óptima de actividad biológica, identificando 10 μM como la concentración que rescató al máximo la función de las células T (Figuras 1F-1H). El efecto inmunostimulante de IM502 no estaba restringido al antígeno, ya que también revirtió la supresión de los macrófagos en cultivos estimulados con anti-CD3 (Figuras S2H-S2J) y mejoró la fagocitosis de células tumorales por parte de los macrófagos (Figuras S2K-S2M). Para comprender el mecanismo subyacente a esta reprogramación funcional, analizamos el fenotipo de los macrófagos. El tratamiento con IM502 aumentó significativamente las moléculas co-estimuladoras CD86 y CD80, con niveles de expresión (intensidad media de fluorescencia geométrica) que aumentaron en 2 veces (Figuras 1I-1K). Este cambio hacia un fenotipo inmunostimulante se corroboró a nivel transcripcional, donde IM502 redujo la expresión de los principales genes inmunosupresores (Arg1, Tgfb e Il10) y aumentó la expresión de los genes proinflamatorios (Nos2, Il6 y Cxcl9) (Figura S2N).

Para determinar el potencial traslacional de IM502, investigamos sus efectos en un modelo de células primarias humanas. Se estableció un ensayo de co-cultivo con macrófagos derivados de monocitos humanos y células T CD8+ (Figura 1L). Utilizando el medio acondicionado por el carcinoma hepatocelular humano HepG2 para polarizar los macrófagos, encontramos que IM502 aliviaba constantemente la supresión mediada por macrófagos humanos, como lo evidenciaba la restauración de la proliferación de células T (Figuras 1M y 1N) y la producción de citocinas (Figura 1O). Además, IM502 indujo un cambio paralelo en el perfil transcripcional de los macrófagos humanos hacia un estado proinflamatorio (Figura 1P), lo que indica un mecanismo de acción conservado entre las especies.

IM502 demuestra una potente y bien tolerada actividad antitumoral in vivo

A continuación, determinamos el potencial terapéutico de IM502 en un modelo murino de tumor hepático ortotópico. ^[34] Un estudio de rango de dosis (Figura 2A) reveló que IM502 intravenoso (1,5-6 mg/kg) inhibió significativamente la carga tumoral primaria, según el número y el tamaño de los nódulos tumorales (Figuras 2B-2D). Las reducciones concomitantes en la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) en suero indicaron una mejora de la función hepática (Figura 2E). El tratamiento con IM502 también limitó sustancialmente la diseminación metastásica a los pulmones (Figuras 2F y 2G). Fundamentalmente, esta eficacia se logró sin toxicidad evidente, ya que el peso corporal, la histología hepática y el peso del bazo no se vieron afectados (Figuras S3A-S3C). Las actividades antitumorales y antimestásicas se recapitularon mediante la administración de la mezcla original GHQ*FS (Figuras 2H y 2I).

Para establecer la eficacia de amplio espectro de IM502, lo probamos en cuatro modelos de tumores sinérgicos inmunocompetentes (Figuras 2J-2N). IM502 redujo significativamente el crecimiento tumoral no solo en el modelo de tumor hepático Hepa1-6BL (Figura 2K), sino también en los modelos de tumor de melanoma B16F10 y de tumor colorrectal CT26 y MC38 (Figuras 2L-2N). Es importante destacar que, para determinar si la eficacia se extendía más allá del crecimiento subcutáneo dependiente de las células T, probamos IM502 en un modelo de colonización de metástasis de melanoma B16F10 in vivo. ^[34] El tratamiento con IM502 redujo la metástasis pulmonar de B16F10 en más del 50% (Figura 2O), lo que subraya su actividad antitumoral multifacética.

Para dilucidar el mecanismo de acción, interrogamos la contribución de la inmunidad del huésped, ya que IM502 carece de actividad tumoricida directa (Figuras S3D-S3G). La eficacia antitumoral de IM502 dependía críticamente de un sistema inmunitario intacto, ya que se abolió en ratones deficientes en Rag2, que carecen de inmunidad adaptativa (Figura 2P). La citocina IFNγ y las células asesinas naturales (NK) se identificaron como mediadores esenciales, y la eficacia se perdió con la neutralización de IFNγ (Figuras 2Q y 2R) o la depleción de células NK (Figuras 2S y 2T). Para caracterizar la distribución tisular de IM502, realizamos un estudio farmacocinético tras la administración intravenosa. IM502 exhibió propiedades farmacocinéticas favorables con una acumulación tumoral significativa (AUCtumor/AUCplasma = 4,2) y una retención tumoral prolongada (t1/2 = 12,79 h) (Figura S4). Estos datos respaldan que IM502 llega y persiste eficazmente dentro del microambiente tumoral (TME), lo que se alinea con sus efectos inmunomoduladores y antitumorales sostenidos.

IM502 mejora el perfil efector de las células T y NK infiltrantes tumorales

Primero, evaluamos los cambios en la infiltración de células inmunitarias mediante citometría de flujo. El tratamiento con IM502 condujo a un aumento significativo en la abundancia y la frecuencia de leucocitos CD45+, células T CD4+ y células T CD8+ y células NK en los tumores Hepa1-6BL (Figuras 3A-3D; estrategia de clasificación en la Figura S5). Para delinear los cambios subyacentes a mayor resolución, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD45+ intratumorales (Figura S6). El agrupamiento no supervisado identificó 13 subpoblaciones diferentes a nivel transcripcional (Figura 3E; Figuras S6 y S7), que se anotaron como siete tipos principales de células inmunitarias (Figura 3F). La cuantificación de las abundancias de los grupos reveló una remodelación coordinada del TME, caracterizada por un aumento proporcional de los subconjuntos de células T y NK y una disminución concomitante de los macrófagos (Figura 3G).

El análisis transcripcional reveló que IM502 orquesta un cambio profundo hacia la activación inmunitaria. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) indicó la regulación al alza de las vías citotóxicas y proliferativas, y la regulación a la baja de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), en las células T y NK (Figura 3H; Figura S8A), con mejoras específicas de la línea en la migración (células T CD8+) y la citotoxicidad (células NK; Figuras 3I y 3J). Se analizó el repertorio de receptores de células T, ya que la clonalidad de las células T es un indicador del estado funcional y predice la eficacia de la inmunoterapia. ^[35], ^[36] El tratamiento con IM502 se asoció con una ampliación del repertorio de receptores de células T, caracterizada por un aumento de los clonotipos únicos y una mayor proporción de clones de frecuencia media y baja, como lo demuestran los índices de diversidad y la distribución clonal (Figuras S8B-S8F). Estos cambios moleculares se tradujeron en la función: los tumores tratados con IM502 exhibieron un aumento de los linfocitos citotóxicos productores de citocinas, en particular las células IFNγ (Figura 3K). El aumento de la infiltración y la activación de los linfocitos efectores se sustenta en una sinergia celular necesaria. La depleción de las células T CD8+ abolió la eficacia de IM502, lo que confirmó su papel esencial (Figura S9A). Fundamentalmente, el aumento de la infiltración tumoral y la producción de IFNγ por parte de las células NK o CD8+ inducido por IM502 dependió estrictamente de la presencia del otro subconjunto (Figuras S9B-S9G). Esta necesidad recíproca define un bucle sinérgico. In vitro, los macrófagos reprogramados por IM502 mejoraron al máximo la proliferación de células T CD8+ y la producción de IFNγ solo cuando estaban presentes las células NK (Figuras S10A-S10D). Por lo tanto, IM502 fomenta un eje NK-CD8+ interdependiente para una inmunidad antitumoral óptima.

Se observaron ganancias similares en la infiltración y la producción de efectores en tumores MC38 subcutáneos (Figuras S11A–S11I). El hallazgo fundamental de que la administración local (intratumoral) y sistémica (intravenosa) produjo una eficacia comparable (Figuras S11A–S11I) localizó firmemente el sitio de acción de IM502 en el microambiente tumoral (TME). En los bazo de ratones con tumores, la composición de las células inmunitarias no cambió, pero aumentaron las células T CD4+ y CD8+ productoras de IFNγ (Figuras S12A–S12E). La ausencia de cualquier efecto directo sobre la proliferación, la citotoxicidad, la secreción de citocinas o la expresión de marcadores de agotamiento de las células T CD4+ o CD8+ in vitro (Figuras S13A–S13G) contrastó con el aumento de las células T IFNγ+ en el bazo y los tumores, lo que subraya que IM502 potencia indirectamente la inmunidad antitumoral mediada por las células T.

IM502 suprime el crecimiento tumoral reprogramando los TAM

Para definir el mecanismo por el cual IM502 modula el TME, analizamos la interacción celular. Los datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) revelaron que IM502 mejoró las interacciones inmunoestimulantes y debilitó la señalización inmunosupresora de TGFβ dentro de la red de macrófagos, células T y células NK (Figuras S14A y S14B). Centrándonos en el compartimento mieloide, se agruparon en macrófagos (Fcgr2b), células dendríticas ([DCs], Itgax y Cd86), neutrófilos (Cd63 y S100a6) y monocitos que expresan genes marcadores de macrófagos en niveles bajos. Los macrófagos comprendieron tres poblaciones distintas: Ly6CLow (clúster 0, Apoe), Ly6CHigh (clúster 1, Plac8) y macrófagos residentes en el tejido (clúster 6, Cd81 y C1qb) (Figuras 3E y 3F). IM502 redujo la proporción de macrófagos intratumorales, el subconjunto de macrófagos Ly6CLow. Sin embargo, a pesar de esta reducción en la proporción, el número de macrófagos aumentó, concomitantemente con un aumento general en la infiltración total de células inmunitarias (Figuras 4A y 4B; Figura S15A). Lo más importante es que IM502 inició una reprogramación funcional de los TAM, redirigiendo su transcriptoma hacia funciones inmunoestimulantes (presentación de antígenos, fagocitosis) y alejándolo del metabolismo oxidativo y la inmunosupresión (Figuras 4C–4E). Este cambio molecular se confirmó a nivel de proteínas y a nivel metabólico. El nivel de arginasa 1 disminuyó en los tejidos tumorales y los macrófagos tratados con IM502 (Figuras 4F y 4G; Figuras S15B–S15D), con una reducción en los metabolitos de la arginina (niveles de ornitina, prolina y creatina; Figuras 4H–4J). La disminución de VEGFA correspondió a menos vasos tumorales (Figuras S15E–S15H). Los datos de citometría de flujo mostraron un aumento de CD80 y CD86 en los TAM en los tumores tratados con IM502 (Figuras S16A y S16B). La consecuencia funcional fue la pérdida de la supresión mediada por TAM de las células T CD8+ (Figuras S16C–S16G). La infiltración y activación de las DCs in vivo (Figuras S17A y S17B) probablemente representan una consecuencia secundaria de la reprogramación de los TAM, ya que IM502 no tuvo ningún efecto directo sobre la expresión de CD80 y CD86 y la capacidad de presentación de antígenos de las DCs in vitro (Figuras S17C–S17E). En conjunto, estos datos señalan la reprogramación de los TAM como un mecanismo central que subyace a la eficacia antitumoral de IM502.

Para probar directamente la relevancia clínica de nuestro mecanismo, aislamos los TAM de muestras clínicas de cáncer colorrectal (Figura 4K). IM502 revirtió consistentemente la función inmunosupresora de estos TAM derivados de pacientes, mejorandoPotentemente la proliferación de las células T CD8+ autólogas cocultivadas (Figura 4L). La ausencia de un efecto directo sobre las células T (Figura 4M) confirmó que el compuesto actúa a través de las células mieloides. Caracterizamos aún más los efectos inmunomoduladores sistémicos de IM502, encontrando patrones distintos de expansión y activación de las células inmunitarias en los ganglios linfáticos drenantes y no drenantes (Figuras S18A–S18J). En los ratones tratados con IM502, los ganglios linfáticos drenantes exhibieron agrandamiento y expansión de las células inmunitarias, sin cambios en el número de macrófagos y DCs (Figuras S18A–S18D). La expresión de CD86 y MHC II disminuyó ligeramente en los macrófagos, pero aumentó en las DCs (Figura S18C–S18E). En contraste, los ganglios linfáticos no drenantes mostraron un aumento en el número de macrófagos y DCs después del tratamiento con IM502, junto con una mayor expresión de CD86 en los macrófagos (Figuras S18F–S18J). La evidencia fundamental provino de un estudio de depleción de macrófagos, que demostró que los macrófagos son necesarios para la actividad antitumoral de IM502, ya que la depleción de macrófagos abolió por completo su efecto terapéutico (Figuras 4N–4Q). Por lo tanto, la reprogramación de los TAM de células inmunosupresoras a células inmunoestimulantes no solo es un mecanismo conservado entre especies, sino también esencial para la eficacia antitumoral de IM502.

IM502 se dirige a PI3Kγ y redirige la señalización STAT

Buscamos definir el mecanismo de IM502 identificando su objetivo molecular directo. Un cribado virtual inverso contra 2765 proteínas, priorizado por la puntuación de acoplamiento y la expresión específica de macrófagos, nominó la subunidad catalítica p110γ de PI3Kγ (PIK3CG) como el candidato principal, un hallazgo corroborado por el análisis de enriquecimiento de vías (Figuras S19A y S19B). El modelado estructural localizó IM502 en el sitio de unión a ATP de PI3Kγ (Figura 5A). Luego validamos esta predicción bioquímicamente: IM502 inhibió directamente la actividad quinasa de PI3Kγ con alta potencia (IC50 61,7 nM), mientras que su actividad contra PI3Kα (252,3 nM), PI3Kβ (532,5 nM) y PI3Kδ (407,9 nM) fue sustancialmente menor (Figura 5B). Bloqueó de forma dependiente de la concentración la fosforilación de Akt/S6 en macrófagos sin alterar la señalización de PTEN o MAPK (Figuras 5C–5E; Figura S19C). El vínculo funcional crucial se estableció a través de experimentos de pérdida de función. La eliminación de PI3Kγ previno por completo que IM502 inhibiera la fosforilación de Akt (Figura 5F), aumentara CD80 y aliviara la supresión mediada por macrófagos de las células T (Figuras 5G–5K). Por lo tanto, identificamos la inhibición de PI3Kγ como el evento molecular iniciador de la reprogramación de macrófagos inducida por IM502.

A continuación, investigamos la maquinaria de transcripción gobernada por IM502. El análisis de la actividad de los factores en los TAM destacó la pronunciada activación del complejo sensible a los interferones ISGF3 (STAT1/STAT2/IRF9)^[37] junto con Spi1 y Junb (Figura 5L). Mecánicamente, IM502 moduló recíprocamente la fosforilación de STAT. La activación de STAT1 (Ser727) se produjo a través de un eje AKT-p38 MAPK-STAT1 definido iniciado por la inhibición de PI3Kγ, como lo evidencian la supresión concurrente de AKT y la activación de p38/STAT1, y la abolición de la fosforilación de STAT1 por la inhibición de p38 (Figura 5M; Figuras S20A–S20C). Esta vía también sustentó los cambios fenotípicos inducidos por IM502 en los macrófagos (Figuras S20D y S20E) y fue utilizada de manera similar por el inhibidor de PI3Kγ IPI549. En paralelo, IM502 inhibió las vías inmunosupresoras mediadas por STAT3 (Ser727) y STAT6 (Tyr641) (Figura 5M). Esta redirección selectiva de STAT se reflejó en la expresión aumentada de los genes regulados por ISGF3 involucrados en la activación inmunitaria y la reprogramación metabólica (Figura 5N). En conjunto, estos datos establecen que IM502, a través de su interacción con PI3Kγ, orquesta un cambio transcripcional en los macrófagos al reequilibrar la actividad de STAT para favorecer un fenotipo antitumoral.

IM502 reprograma el metabolismo de los macrófagos y alivia el estrés oxidativo

STAT3 controla la función de las mitocondrias y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en los macrófagos.^[38] Hipotetizamos que la inhibición de la señalización PI3Kγ/STAT por IM502 impactaría directamente en el metabolismo central. El perfilado de scRNA-seq reveló un cambio fundamental de OXPHOS a glucólisis en los TAM tratados con IM502 (Figuras 4C–4E). El análisis funcional de Seahorse confirmó que IM502 revirtió el estado de hiper-OXPHOS inducido por TCM, normalizando las tasas de consumo de oxígeno y la producción de ATP (Figuras S21A y S21B). Este cambio metabólico se vinculó funcionalmente a la señalización de STAT, ya que los inhibidores de STAT1 y STAT3 atenuaron el aumento de la producción de lactato, el consumo de glucosa, la expresión de genes asociados a la glucólisis y los cambios funcionales inducidos por IM502 (Figuras S21C–S21H). Además, la inhibición farmacológica de la glucólisis con 2-desoxi-D-glucosa abolió la reprogramación inmunoestimulante de los macrófagos por IM502, lo que demuestra que este cambio metabólico es necesario para la activación inmunitaria funcional (Figura S22).

A continuación, nos centramos en el desequilibrio redox asociado. Se sabe que los macrófagos educados por tumores sostienen altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS).^[39] El tratamiento con IM502 revirtió eficazmente este fenotipo, reduciendo las ROS mitocondriales (Figuras S23A y S23B) y disminuyendo los programas de transcripción relacionados con la producción de ROS (Figura S23C). El superóxido se origina principalmente de las mitocondrias, los peroxisomas y las NADPH oxidasas (NOX).^[40] Mecánicamente, IM502 suprimió la expresión de los sistemas generadores de superóxido, incluidas las NADPH oxidasas (Nox1 y Nox2) y los componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales (Figura S23D). Esto se acopló con una restauración del antioxidante glutatión (GSH), que se agota en los TAM (Figura S23E). El exceso de ROS impulsa la peroxidación de lípidos y el daño de la membrana.^[40],^[41] El efecto neto de esta reprogramación metabólica fue una reducción significativa del daño oxidativo, evidenciado por la disminución de la peroxidación de lípidos (Figura S23F) y la recuperación del potencial de la membrana mitocondrial en los macrófagos murinos y humanos (Figuras S23G y S23H). Por lo tanto, IM502 induce una reprogramación metabólica coherente que contrarresta la firma de estrés oxidativo pro-tumorigénico de los TAM.

IM502 se asemeja a los fármacos clínicos y supera la resistencia al bloqueo de PD-1

Una titulación de dosis adicional estableció 1,5 mg/kg como una dosis eficaz de IM502, reduciendo significativamente la carga tumoral ortotópica del hígado, mientras que 0,375 mg/kg mostró solo una tendencia no significativa (Figuras 6A y 6B). Las comparaciones directas con puntos de referencia clínicos relevantes revelaron su perfil competitivo. IM502 a 1,5 mg/kg logró un efecto antitumoral comparable a una dosis mucho mayor de IPI549 (12 mg/kg), un inhibidor de PI3Kγ en etapa clínica, y 1,5 mg/kg de IPI549 por sí solo fue ineficaz (Figuras 6C–6E). El fármaco clínico PLX3397 (pexidartinib), un inhibidor de CSF1R (expresado principalmente en macrófagos), no mostró actividad a la dosis estándar de 10 mg/kg, mientras que IM502 (1,5 mg/kg) redujo nuevamente la carga tumoral (Figuras 6F–6I). IM502 logró una eficacia comparable a la quimioterapia de primera línea (FOLFOX) en el cáncer colorrectal (Figuras 6J–6M).

A continuación, evaluamos IM502 en el contexto de la resistencia a la inmunoterapia. Sorprendentemente, la monoterapia con IM502 fue eficaz tanto en modelos de tumores hepáticos ortotópicos como en modelos de melanoma sinérgicos que eran completamente refractarios al bloqueo del punto de control anti-PD-1 (Figuras 6N–6S). En consecuencia, probamos una estrategia de combinación racional. La combinación de IM502 con el anticuerpo anti-PD-1 actuó de forma sinérgica, suprimiendo el crecimiento del tumor hepático ortotópico y reduciendo el número de nódulos grandes (>2 mm) y metástasis pulmonares espontáneas hasta en un 60% y un 80%, respectivamente (Figuras 7A–7G). El sorafenib, un tratamiento estándar para el carcinoma hepatocelular avanzado, se sabe que promueve paradójicamente la hipoxia intratumoral y la polarización de los TAM tipo M2, creando un microambiente inmunosupresor que limita su propia eficacia. Dado que IM502 reprograma los TAM hacia un estado M1 de tipo inmunostimulante, hipotetizamos que la combinación de IM502 con sorafenib podría contrarrestar la inmunosupresión inducida por el sorafenib y lograr una actividad antitumoral sinérgica. Como se muestra en las Figuras 7H–7M, la combinación produjo, de hecho, una eficacia superior en comparación con la monoterapia. Estas comparaciones exhaustivas subrayan el potencial de IM502 no solo para igualar las terapias existentes, sino también para abordar mecanismos críticos de resistencia en los modelos probados.

Discusión

Los TAM constituyen una población inmunosupresora dominante en la mayoría de los tumores sólidos. Restringen las células T y NK citotóxicas tanto en los sitios primarios como en los metastásicos, impidiendo así la inmunidad antitumoral espontánea e inducida por la terapia.^[7],^[10],^[42] A pesar de los intensos esfuerzos, la traslación clínica de las terapias dirigidas a los TAM se ha visto obstaculizada por las limitaciones de los agentes existentes.^[7],^[43] Aquí, presentamos una solución derivada del metabolismo fúngico: IM502, una meroterpenoide que reprograma eficazmente los TAM, en lugar de eliminarlos. Al inhibir simultáneamente PI3Kγ y modular la señalización STAT, IM502 invierte la inmunosupresión mediada por los TAM, lo que conduce a una inmunidad antitumoral robusta, inhibición de la metástasis y la capacidad de superar la resistencia al bloqueo de PD-1 en múltiples modelos preclínicos, todo ello con un programa de dosificación y un perfil de toxicidad favorables.

El descubrimiento de IM502 se facilitó gracias a nuestra estrategia ePAFM. Esta aprovecha la capacidad biosintética innata de los hongos, lo que la diferencia de los enfoques de biología sintética que a menudo se basan en una extensa remodelación genética.^[44],^[45] Al proporcionar simplemente un precursor exógeno a un hongo que conserva la maquinaria enzimática descendente necesaria, generamos IM502, un compuesto que logra una inhibición nanomolar de la PI3Kγ humana y una potente actividad antitumoral. Una ventaja clave del enfoque ePAFM es su escalabilidad; la alimentación de precursores se integra a la perfección en los procesos de fermentación estándar, evitando la necesidad de una ingeniería genética compleja y facilitando la producción a escala industrial.

El efecto antitumoral de IM502 está inequívocamente mediado por el sistema inmunitario del huésped, y los macrófagos se identifican como el principal objetivo celular. La abolición completa de la eficacia de IM502 tras la depleción de macrófagos mediada por el cloronato confirma este mecanismo. Además, la ausencia de cualquier efecto citotóxico directo sobre las células tumorales en concentraciones farmacológicamente relevantes subraya que la actividad antitumoral de IM502 está mediada por el sistema inmunitario. Esto subraya su importante potencial de traslación como inmunoterapia tumoral.

IM502 remodela el fenotipo de los TAM a través de un impacto coordinado en los nodos de señalización clave y el metabolismo celular. En primer lugar, su principal acción es la inhibición de PI3Kγ, lo que conduce a una reducción de la actividad de Akt. Esto reduce directamente la fosforilación de STAT3 en Ser727, un impulsor clave del programa inmunosupresor tipo M2.^[12],^[46] Simultáneamente, la inhibición del eje PI3Kγ-Akt activa una cascada de señalización p38 MAPK-STAT1, proporcionando una vía directa a la activación de STAT1/2 independiente de la modulación de STAT3. Cabe destacar que esta vía Akt-p38-STAT1 también fue inducida por el inhibidor de PI3Kγ IPI549, lo que subraya su papel central en la reprogramación dirigida a PI3Kγ. En segundo lugar, la disminución de la actividad de STAT3 alivia su conocida inhibición recíproca de STAT1, facilitando así un cambio robusto hacia un programa de señalización dominado por STAT1/STAT2/IRF9 que promueve la polarización tipo M1, la presentación de antígenos y la producción de citocinas proinflamatorias.^[10],^[12],^[37],^[38] Además, este cambio de señalización desencadena una reprogramación metabólica esencial del eje OXPHOS a la glucólisis, que es fundamental para mantener la identidad de los TAM.^[38],^[47] Este cambio metabólico está funcionalmente relacionado con la reprogramación de STAT concomitante, ya que la inhibición de STAT1 atenuó la mejora del flujo glucolítico inducido por IM502. Esta reprogramación metabólica no es un evento aislado; está intrínsecamente relacionada con los cambios de señalización. Por un lado, está impulsada por los cambios en la red de señalización (por ejemplo, a través de STAT). Por otro lado, proporciona la energía y los intermediarios biosintéticos necesarios (por ejemplo, para la producción de citocinas) para respaldar el programa de expresión génica inmunostimulante y el fenotipo funcional, un paradigma bien establecido en la biología de los macrófagos. IM502 reduce la generación de ROS mitocondriales, un conocido contribuyente a la disfunción de las células T en el TME.^[40] Nuestros datos de secuenciación de ARN de una sola célula corroboran este cambio, mostrando un cambio transcripcional lejos de las vías asociadas a M2 hacia aquellas involucradas en la activación inmunitaria. El resultado neto de esta remodelación molecular y metabólica es un cambio fundamental en la función de los TAM, que culmina en su mayor capacidad para estimular la proliferación de células T CD8+ y potenciar la citotoxicidad de las células NK. Reconocemos que IM502 se identificó mediante un cribado fenotípico, y su objetivo principal se determinó principalmente mediante el acoplamiento virtual inverso seguido de la validación bioquímica. Si bien este enfoque identificó con éxito PI3Kγ, se realizará un cribado de selectividad exhaustivo contra un amplio panel de quinasas en estudios futuros para descartar sistemáticamente posibles efectos fuera del objetivo.

Una ventaja traslacional clave de IM502 es su potente eficacia in vivo, que se logra con un programa de dosificación poco frecuente (cuatro dosis intravenosas) en un amplio rango terapéutico (0,75–6 mg/kg). Este perfil es particularmente notable dada su distinción estructural de los inhibidores de PI3Kγ en etapa clínica como IPI549.^[15],^[18],^[21],^[48] La discrepancia de concentración entre la IC50 bioquímica (61,7 nM) y la potencia funcional celular (1–10 μM) se encuentra dentro del rango que se observa comúnmente para los inhibidores de quinasas de moléculas pequeñas, lo que refleja las barreras celulares inherentes, que incluyen la permeabilidad de la membrana, la unión de proteínas intracelulares y la estabilidad metabólica, que están ausentes en los sistemas enzimáticos purificados. Es importante destacar que la robusta actividad antitumoral lograda con la baja dosis de IM502 intravenoso (0,75 mg/kg) confirma que se logra una participación suficiente del objetivo en el TME, lo que demuestra que esta diferencia de concentración no compromete su eficacia terapéutica. En apoyo de esto, el análisis farmacocinético reveló una distribución tumoral favorable, con una relación del área bajo la curva (AUC) tumor-plasma de 4,2 y una vida media tumoral prolongada. Esta acumulación significativa y la retención prolongada probablemente sustentan su participación sostenida del objetivo y su actividad antitumoral duradera a pesar de la dosificación poco frecuente. La potencia de IM502 es significativamente mayor, ya que una comparación directa mostró que se requirieron 1,5 mg/kg de IM502 para lograr el efecto antitumoral de 12 mg/kg de IPI549, una dosis a la que el propio IPI549 era ineficaz. Esta diferencia de potencia de una magnitud mayor apoya aún más un mecanismo de acción cualitativamente superior, que potencialmente implica una participación del objetivo más sostenida. La eficacia duradera observada con un régimen de dosificación limitado es consistente con un perfil farmacocinético propicio para una cobertura del objetivo prolongada y un efecto farmacodinámico sostenido, lo que mejora su utilidad terapéutica.^[49]

Nuestros hallazgos demuestran que IM502 induce una remodelación integral del TME, catalizando una respuesta inmunitaria antitumoral coordinada. Esto se caracteriza por la mayor infiltración y activación funcional de las poblaciones efectoras clave: células T CD8+, células T CD4+ y células NK, lo que culmina en un estado de potente citotoxicidad.^[50] Las células T CD4+ coordinan las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, favoreciendo las respuestas de las células T CD8+ antitumorales.^[50],^[51] La evidencia reciente sugiere que las células T CD4+ también pueden poseer capacidades citotóxicas directas,^[52], lo que plantea la posibilidad de que estas células contribuyan de forma independiente al control tumoral en los modelos tratados con IM502. La mayor infiltración de células NK se correlaciona con una mejor supervivencia en varios tumores sólidos.^[53]

Un resultado significativo del tratamiento con IM502 es la reversión de la disfunción de las células NK en el TME. En los tumores sólidos, las células NK históricamente han sido difíciles de explotar terapéuticamente debido a su escasa infiltración basal^[54],^[55] y al rápido agotamiento funcional al entrar en el TME.^[56] Al reprogramar los TAM, IM502 logra lo que muchas inmunoterapias no pueden: mejora la infiltración de las células NK, previene el agotamiento y restaura la función citotóxica, involucrando así un brazo crítico de la inmunidad innata que a menudo se descuida en el tratamiento de tumores sólidos. Este efecto dual es significativo: más allá de su capacidad de matar tumores directamente, las células NK activadas orquestan una respuesta antitumoral más amplia al licenciar la presentación cruzada de células T CD8+ y al impulsar el reclutamiento de efectores inmunitarios adicionales en el TME.^[57],^[58]

Identificamos la IFNγ como la citocina no redundante que sustenta esta respuesta. El requisito simultáneo de células NK, células T CD8+ e IFNγ revela que la eficacia de IM502 depende de fomentar la sinergia innata-adaptativa, probablemente a través de la IFNγ derivada de las células NK que licencia una respuesta eficaz de las células T. Esto se alinea con un estudio previo que muestra que la IFNγ derivada de las células NK prepara las células T CD8+ específicas del tumor; la depleción de las células NK o la IFNγ dificulta el rechazo tumoral mediado por las células T CD8+, y las células NK deficientes en IFNγ no activan las células T CD8+.^[59] Más allá de tender un puente entre la inmunidad innata y adaptativa, la IFNγ regula PD-L1 en las células tumorales y los TAM, lo que podría restringir las células T CD8+ a través de la unión PD-1.^[60] Esto proporciona una justificación mecanicista para la sinergia observada con la terapia anti-PD-1 y posiciona a IM502 como un socio lógico para superar la resistencia al bloqueo del punto de control inmunitario.^[61]

Dado que la enfermedad metastásica sigue siendo la principal causa de muerte relacionada con el cáncer, las terapias capaces de involucrar tanto la inmunidad innata como la adaptativa pueden abordar una necesidad clínica insatisfecha.^[55] Al potenciar la función de las células NK y activar simultáneamente las respuestas de las células T, IM502 podría complementar las inmunoterapias existentes que se centran predominantemente en la inmunidad adaptativa. Los estudios futuros deben dilucidar las vías moleculares precisas por las que IM502 promueve el reclutamiento y la activación de las células NK dentro del TME. Estos conocimientos pueden informar las estrategias de combinación racionales diseñadas para mejorar aún más la funcionalidad de las células NK y superar los desafíos de larga data de la terapia basada en células NK en tumores sólidos.

Pexidartinib (PLX3397), el único inhibidor de CSF-1R aprobado por la FDA para el tumor de células gigantes tenosinovial, reduce o reprograma los TAM mediante la inhibición del eje CSF-1/CSF-1R^[62] y se encuentra en fase de ensayo clínico para el cáncer de hígado. El anticuerpo anti-PD-1 y el sorafenib siguen siendo terapias de primera línea estándar para diversos tumores, respectivamente. En el modelo de metástasis de tumor hepático Hepa1-6BL, la monoterapia con IM502 superó a pexidartinib, el bloqueo de PD-1 y el sorafenib, reduciendo la carga tumoral y la metástasis, al tiempo que superaba la resistencia a la inmunoterapia y potenciaba el efecto del sorafenib. Además, IM502 mostró una actividad similar a la de FOLFOX en un modelo colo-rectal sinérgico, lo que destaca su amplio potencial traslacional. Los datos ex vivo revelaron que IM502 reprograma los TAM humanos aislados del tejido de cáncer colorrectal y modifica el fenotipo de los macrófagos, lo que coincide con las observaciones en modelos murinos. Estos resultados respaldan la traslación clínica de IM502 para las neoplasias hepáticas y colorrectales. La evidencia emergente de que ciertas leucemias dependen de PI3Kγ para la supervivencia^[63] justifica la evaluación de IM502 en neoplasias hematológicas.

Si bien PI3Kγ está críticamente involucrado en la capacidad migratoria de varias células mieloides, incluidas las células dendríticas (DC), su función en las DC parece distinta de su función en otras líneas celulares, como los macrófagos.^[64],^[65],^[66],^[67],^[68] Nuestros datos, que coinciden con la literatura previa, indican que la deficiencia de PI3Kγ o su inhibición con IM502 no alteran intrínsecamente las funciones básicas de las DC, como la maduración, la captación de antígenos o la presentación directa de péptidos a las células T in vitro.^[66],^[69] Sin embargo, se revela un papel más complejo en contextos específicos; por ejemplo, PI3Kγ puede influir en la activación de las células T cuando las DC presentan antígenos a través de complejos inmunitarios, y estudios recientes destacan que la inhibición de PI3Kγ mejora la fagocitosis de macrófagos, pero no de DC, dentro del microambiente tumoral (TME).^[69],^[48] Esta dicotomía subraya que los efectos inmunomoduladores de IM502 observados in vivo probablemente no sean el resultado directo de la alteración de la presentación de antígenos por parte de las DC, sino que más bien se derivan de la alteración de la compleja interacción celular dentro del TME. Por lo tanto, los modelos de eliminación condicional serán esenciales para definir de manera definitiva las contribuciones específicas de cada tipo celular de PI3Kγ a la actividad antitumoral general de IM502.

En resumen, IM502 emerge como un potente candidato terapéutico derivado de una plataforma de metabolitos fúngicos. Actúa a través de un mecanismo coherente: la reprogramación de los TAM mediante la inhibición de PI3Kγ/STAT, para resolver la inmunosupresión e iniciar un ataque inmunitario potente y coordinado. Su convincente perfil preclínico lo convierte en un candidato para el desarrollo como una inmunoterapia de nueva generación, ya sea sola o en combinación, para cánceres difíciles de tratar.

Nuestros datos también proporcionan información para la traslación clínica de IM502. La administración intravenosa e intratumoral mostró una eficacia comparable en el control del crecimiento tumoral y la reprogramación del microambiente inmunitario, lo que indica que la administración sistémica es eficaz. Los estudios farmacocinéticos confirman que IM502 administrado por vía intravenosa se acumula y se retiene en los tumores. Por lo tanto, una formulación intravenosa representa una vía de desarrollo práctica y ampliamente aplicable, especialmente para regímenes de combinación con inmunoterapia o terapias dirigidas. Los hallazgos actuales respaldan directamente la traslación clínica de una formulación intravenosa de IM502, reservando estrategias de administración avanzadas para estudios futuros.

Limitaciones del estudio

Varias limitaciones merecen atención. En primer lugar, si bien los modelos murinos proporcionan información crucial, no pueden replicar completamente la complejidad y la heterogeneidad de los tumores humanos. Los estudios futuros que utilicen organoides derivados de pacientes inmunocompetentes o modelos de ratón humanizados serán fundamentales para modelar mejor el TME humano. En segundo lugar, el número de muestras de TAM derivadas de pacientes analizadas fue limitado. Para fortalecer la relevancia clínica de nuestros hallazgos, los estudios futuros requerirán la validación en una cohorte más amplia y diversa de muestras humanas. En tercer lugar, aunque nuestros datos respaldan firmemente que los TAM son el principal objetivo de IM502, no podemos descartar por completo los posibles efectos secundarios en otros tipos de células dentro del complejo TME. Las investigaciones futuras que utilicen modelos de eliminación específica de cada tipo celular serán esenciales para definir con precisión los objetivos celulares de IM502. En cuarto lugar, el potencial desarrollo de resistencia a los fármacos, un desafío común en la terapia contra el cáncer, no se abordó en el estudio actual. Además, es necesario un perfil farmacocinético completo de IM502 para optimizar los regímenes de dosificación. Además, la exploración de formulaciones alternativas, como la administración oral, representa un objetivo importante para mejorar la practicidad clínica y la adherencia del paciente. Por último, el perfil de seguridad a largo plazo de IM502 y los posibles mecanismos de resistencia deben investigarse sistemáticamente en estudios futuros de dosificación crónica.

Limitaciones del estudio

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Las solicitudes de información y recursos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Juming Yan (jumingyan@xzhmu.edu.cn), quien las atenderá.

Disponibilidad de materiales

IM502 y los metabolitos fúngicos se informaron previamente^[32] y se aislaron de la fermentación de Agrocybe pediades utilizando los procedimientos descritos en los Métodos STAR. Los compuestos generados en este estudio estarán disponibles a pedido, pero es posible que requiramos un pago y/o un acuerdo de transferencia de materiales (MTA) completo si existe un potencial de aplicación comercial. La línea celular de carcinoma hepatocelular murino Hepa1-6BL se derivó y caracterizó previamente en nuestro laboratorio.^[34] Esta línea celular está disponible del contacto principal a pedido, sujeto a la finalización de un MTA.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula informados en este artículo se han depositado en el Genome Sequence Archive^[70] en el National Genomics Data Center,^[71] China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, bajo el número de acceso GSA: CRA017676.
•Los datos de metabolómica se han depositado en la base de datos OMIX bajo el número de acceso OMIX: OMIX016192.
•Este artículo no informa sobre código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este artículo está disponible del contacto principal a pedido.

Contacto principal

Las solicitudes de información y recursos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Juming Yan (jumingyan@xzhmu.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Disponibilidad de datos y código

Agradecimientos

Los autores agradecen a Hongli Liu, Xiangyang Li, Bo Zhang y Wanpeng Chen. También agradecemos a los colaboradores, como Ankang Hu, que trabaja en el Centro de Animales de la Universidad Médica de Xuzhou, responsable del cuidado de los ratones, y al Dr. Fuxing Dong del Centro de Investigación Experimental Público por su entusiasta ayuda en los experimentos con el microscopio confocal de escaneo láser. J.Y. cuenta con financiación de la 10.13039/501100001809 National Natural Science Foundation of China (82472992), Starting Foundation for Talents of Xuzhou Medical University (D2020062), Innovation Program for Young Scholar of Xuzhou Medical University (TD202202), Major Project of Natural Science Research of Jiangsu Higher Education Institutions (25KJA310008) y Open Competition Grant de 10.13039/501100012217 Xuzhou Medical University (JBGS202202); J.H. por la NSFC para jóvenes investigadores (82203541) y Starting Foundation for Talents of Xuzhou Medical University (D2020066); D.Y. por el Postgraduate Research and Practice Innovation Program of Jiangsu Province (KYCX23-2996); y Yongqiang Chen por el Medical Youth Reserve Talents Training Program de la Comisión de Salud de Xuzhou, China (XWRCHT20220006).

Contribuciones de los autores

Conceptualización y diseño del estudio, J.Y., J.H., Y.-L.Y. y B.D.; investigación, J.H., X.J., K.T., D.Y., Yan Chen, X.S., L.K., Z.F., S.K., S.S., Yongqiang Chen, G.S., S.Z., H.Z., Y. Liu, H.Y., Y.Q., X. Dong y X.L.; análisis y visualización de datos, J.H., X.J., D.Y., K.T., Y.-L.Y, Y.M., L.K., Yongqiang Chen y Z.Z; redacción del borrador original, J.H., J.Y., Y.-L.Y., Yongqiang Chen, M.W.L.T. y X.S.; revisión y edición de la redacción, J.Y., J.H., Y. Li, Y.Z., B.D., Y.-L.Y., X. Deng y Yongqiang Chen; adquisición de financiación, J.Y., J.H. y Yongqiang Chen; recursos, J.Y., J.H., B.D., Yongqiang Chen, C.T., Y.X., H.C., H.H., R.T. y K.Z.; supervisión y administración del proyecto, J.Y. y J.H.

Declaración de intereses

J.H., J.Y. y Y.-L.Y. son los inventores nombrados en la solicitud de patente (ZL 202410949019.4) que involucra la actividad de IM502 en la supresión de la progresión tumoral y la regulación de las respuestas inmunitarias, propiedad de la Universidad Médica de Xuzhou, China.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Ratones y muestras humanas

Se adquirieron ratones adultos C57BL/6J de tipo salvaje (WT), Rag2−/−, OT-1 (con fondo C57BL/6) y ratones Balb/C WT de Cyagen Biosciences, Inc. (Guangzhou, China). Todos los ratones se alojaron en el Centro de Animales de la Universidad Médica de Xuzhou (Xuzhou, Jiangsu, China) a una temperatura ambiente de 24 °C con un ciclo de luz de 12 horas y 12 horas de oscuridad, y con acceso libre a alimentos y agua. Se utilizaron ratones de entre 8 y 12 semanas de edad, con edades y sexos similares, en todos los experimentos. A lo largo del estudio, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales. Se incluyeron ambos sexos y no se observaron diferencias significativas relacionadas con el sexo en los análisis preliminares. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron estrictamente de acuerdo con las Directrices para Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Xuzhou y la Guía Nacional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Xuzhou (202209S041).

Se obtuvieron muestras de tejido tumoral humano y muestras de sangre del Hospital Central de Xuzhou, cumpliendo con las normas del Comité de Ética del Hospital Central de Xuzhou (XZXY-LK-20240108-0006). Los pacientes y/o el público no participaron en el diseño, la realización, la elaboración de informes o los planes de difusión de esta investigación. El consentimiento del paciente para su publicación no es aplicable.

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal MC38 y CT26, y la línea celular de melanoma B16F10; y la línea celular humana de hepatocitos HepG2 y la línea celular de carcinoma colorrectal HCT116 se cultivaron en DMEM, y la línea celular de hepatocitos de ratón Hepa1-6BL (derivada de las células Hepa1-6) en medio RPMI 1640, respectivamente, conteniendo 10% de suero bovino fetal (FBS, Umedium He Fei China), 100 U de penicilina/mL y 100 μg/mL de estreptomicina. Todas las líneas celulares se analizaron rutinariamente para detectar micoplasma, y la autenticación de las líneas celulares se realizó de forma rutinaria. La línea celular Hepa1-6BL se derivó de las células Hepa1-6, como se describió anteriormente.34 Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Los reactivos y los kits para los ensayos biológicos se enumeran en la tabla de recursos clave.

Un total de 3 × 106 células Hepa1-6BL, HepG2 y HCT116 se cultivaron en una placa de 10 cm durante 36 horas, respectivamente. Posteriormente, se recogió el sobrenadante del cultivo celular y se designó como medio acondicionado tumoral (TCM).

Modelos tumorales

Para los modelos tumorales subcutáneos, se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) ratones C57BL/6J WT o Rag2−/− con células tumorales Hepa1-6BL (7 × 105), MC38 (5 × 105) o B16F10 (2 × 105), y ratones Balb/C WT con CT26 (2 × 105), para establecer tumores subcutáneos, respectivamente. Se utilizaron células con más del 95% de viabilidad para los experimentos. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 17 mm2, lo que ocurrió alrededor del día 6 o el día 7, los ratones recibieron la dosis indicada de IM502 en las figuras, 4 veces cada dos días. Los ratones portadores de tumores B16F10 recibieron cIg o anticuerpo anti-PD-1 (100 μg/ratón, i.p.) en los días 7, 10 y 13. Los tamaños de los tumores subcutáneos se determinaron mediante mediciones con calibrador y se calcularon como el producto de dos diámetros perpendiculares, y los datos se presentaron como media ± SEM (mm2) para cada grupo o tamaño tumoral individual.

Para el modelo experimental de metástasis pulmonares, se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) ratones C57BL/6J WT con células tumorales B16F10 (2 × 105), para permitir la colonización de las células tumorales en los pulmones y evaluar las metástasis pulmonares. Los ratones se agruparon aleatoriamente y se trataron con diluyente de control o IM502 (6 mg/kg, i.v.) en los días 0 y 3 en relación con la inoculación del tumor. El día 14, se perfundieron los pulmones y se cuantificó la carga metastásica contando las colonias en la superficie de los pulmones, como se describió anteriormente.^[72],^[73]

El modelo ortotópico hepático se estableció inyectando por vía intravenosa células Hepa1-6BL (5 × 105) en la vena caudal mediante inyección hidrodinámica en la vena caudal, como se describió en nuestro estudio anterior.^[34],^[74] Los ratones se agruparon aleatoriamente y se trataron con diluyente de control, IM502, PLX3397, sorafenib o anti-PD-1, según se indica en las leyendas de las figuras; o se les administró por vía oral una solución de fermentación de control (CFS) o una solución de fermentación del precursor GHQ (PFS) (200 μL/ratón) en los días 6, 8, 10, 12 y 14; o anticuerpo anti-IFNγ o anticuerpo de control cIg (i.p. 250 μg/ratón, i.p.) en los días 4, 8, 12, o anticuerpo anti-NK1.1 o anticuerpo cIg (i.p. 100 μg/ratón) en los días 2, 6, 10 y 14, o liposomas o liposomas de clodronato (i.p., 1 mg/ratón) en los días 3, 9 y 14, en relación con la inoculación del tumor. Los ratones portadores de tumores recibieron cIg o anticuerpo anti-PD-1 (100 μg/ratón, i.p.) en los días 9, 12 y 15, en relación con la inoculación del tumor. Los ratones se sacrificaron en los días 18-21 y se recogieron el hígado, los pulmones y la sangre. Se pesó todo el tejido hepático y se cuantificó la carga tumoral ortotópica hepática y la carga metastásica pulmonar espontánea contando las colonias en la superficie del hígado y los pulmones, respectivamente.

Todos los experimentos in vivo se aleatorizaron de forma ciega para distribuir uniformemente la carga tumoral entre los diferentes grupos experimentales en el momento del inicio del tratamiento. Se utilizaron ratones de ambos sexos en diferentes experimentos. Siguiendo los principios de las 3R, se utilizaron entre 5 y 7 ratones en cada grupo para lograr una significación estadística. Todos los ratones del estudio se mantuvieron en el mismo lugar del centro de animales.

Detalles del método

Preparación de compuestos y soluciones de fermentación

Todos los productos químicos se compraron a Sigma-Aldrich, a menos que se indique lo contrario. Los datos espectroscópicos de RMN se registraron en un Bruker Avance III-400 y Bruker Avance NEO 600, a 298 K con TMS como estándar interno. La gel de sílice (200-300 malla) para cromatografía en columna (CC) y GF 254 (10-20 mm) para cromatografía en capa fina (TLC) se produjeron en Qingdao Marine Chemical Company, China. La gel de sílice ODS (50 μm) se compró a YMC Co., Ltd, Japón, y Sephadex LH-20 a Pharmacia Biotech, Suecia. La purificación de los compuestos se realizó en HPLC semipreparativa (SHIMADZU LC-20A) con una columna C18 (10 μm, 250 × 10 mm).

Síntesis química de geranilhidroquinona

Se colocaron fenol (15,0 g, 159,4 mmol) y virutas de Al(OPh)3 (1,5 g, 55,6 mmol) en un matraz de dos bocas equipado con un termómetro y un condensador, y se calentaron a 170 °C. Después de que las virutas de aluminio se disolvieran por completo en el fenol, la solución se enfrió a 40 °C y se trató con hidroquinona (70,0 g, 635,7 mmol) y geraniol (44 g, 285,0 mmol). La reacción se llevó a cabo a 180 °C durante 24 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. A continuación, la mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (PE/EtOAc = 10/1) para obtener geranilhidroquinona (25,2 g, 36% de rendimiento).

La geranilhidroquinona, un aceite amarillo pálido, se analizó utilizando RMN de 1H (400 MHz, CDCl3), como se describió anteriormente.^[32]

Alimentación del cultivo con geranilhidroquinona y análisis HPLC de los extractos

La cepa Agrocybe pediades se aisló del cultivo de tejidos de sus cuerpos fructíferos recogidos en las montañas Xing-Long, provincia de Gansu, República Popular China, y se identificó mediante análisis de la secuencia de ITS, como se describió.^[32] Se inoculó micelio fresco de la cepa Agrocybe pediades en un matraz de 1 L que contenía 500 mL de medio de levadura y malta (glucosa 4,0 g/L, extracto de malta 10,0 g/L y extracto de levadura 4,0 g/L). Después de una incubación de 7 días a 28 °C con una agitación de 140 rpm, se añadió al cultivo compuesto precursor geranilhidroquinona disuelta en etanol hasta una concentración final de 2 mM. Después de crecer durante los siguientes 2 días en un matraz Erlenmeyer de 1 L, se filtró el cultivo (solución de fermentación) y el filtrado del caldo se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo. El extracto seco se disolvió en 0,5 mL de metanol y se analizó mediante un sistema HPLC SHIMADZU LC-20A utilizando una columna C18 (250 × 4,6 mm, Shim-pack GIST, 5 μm; detector: UV) con una velocidad de flujo de 1 mL/min. La fase móvil consistió en H2O (A) y MeCN (B) utilizando una elución en gradiente del 5% al 100% de B de 0 a 30 min y del 100% de B de 30 a 35 min.

Un litro de solución de fermentación filtrada se concentró mediante un evaporador rotatorio a unos 45 °C hasta obtener una solución de fermentación de 200 mL para su uso en ensayos biológicos. El cultivo de A. pediades, sin añadir el compuesto precursor geranilhidroquinona, se utilizó como solución de fermentación de control.

Aislamiento de compuestos y elucidación de la estructura

El extracto crudo (60 L, 16,5 g) se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice con un gradiente de petróleo-acetona (20:1, 10:1, 4:1, 7:3, 3:2, v/v) y acetona para obtener seis fracciones (A-F). La fracción A (1,3 g) se sometió a una columna de gel de sílice con elución con un gradiente de petróleo/EtOAc (20:1-2:1) seguido de HPLC en fase inversa semipreparativa con elución con 65% de MeCN en H2O para obtener el compuesto Conidiona (IM20) (10 mg). La fracción C (2,8 g) se sometió a una columna de gel de sílice con elución con petróleo-acetato de etilo (10:1) seguida de cromatografía en Sephadex LH-20 con elución con metanol y HPLC en fase inversa semipreparativa con elución con 35% de MeCN en H2O para obtener los compuestos Pabagrocybona D (IM10) (40,0 mg), Epiconicol (IM13) (16 mg) y Conitriol (IM11) (12 mg). La fracción E (4,8 g) se sometió a una columna de gel de sílice con elución con petróleo-acetato de etilo (7:3) seguida de cromatografía en Sephadex LH-20 con elución con metanol y HPLC en fase inversa semipreparativa con elución con 60% de MeCN en H2O para obtener los compuestos Pabagrocybol D (IM16) (54,0 mg), Pabagrocybol E (IM17) (72,2 mg), Pabgraminona B (IM18) (132,5 mg) y Pabgraminona C (IM502) (508,0 mg). Las estructuras se elucidaron con espectro de masas (MS) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) (Figuras S24, S25, S26, S27, S28, S29, S30, S31, S32, S33, S34, S35, S36, S37, S38, S39, S40, S41, S42, S43, S44, S45, S46, S47 y S48), como se describió anteriormente.^[32]

Pabagrocybol D (IM16):
RMN de 1H (600 MHz, CD3OD) δ 6,58 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 9,9, 5,4 Hz, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (m, 1H), 1,28 (s, 3H).
RMN de 13C (150 MHz, (CD3)2CO) δ 208,4, 149,5, 146,9, 129,6, 129,5, 122,4, 122,1, 117,3, 114,3, 47,1, 41,8, 38,4, 29,8, 28,1, 25,3, 25,2.

Pabagrocybone D (IM10):
RMN de 1H (600 MHz, (CD3)2CO) δ 6,79 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 9,9, 5,4 Hz, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (m, 1H), 1,28 (s, 3H).
RMN de 13C (150 MHz, (CD3)2CO) δ 208,4, 149,5, 146,9, 129,6, 129,5, 122,4, 122,1, 117,3, 114,3, 47,1, 41,8, 38,4, 29,8, 28,1, 25,3, 25,2.

Pabagrocybol E (IM17):
RMN de 1H (600 MHz, (CD3)2CO) δ 6,79 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 9,9, 5,4 Hz, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (m, 1H), 1,28 (s, 3H).
RMN de 13C (150 MHz, (CD3)2CO) δ 208,4, 149,5, 146,9, 129,6, 129,5, 122,4, 122,1, 117,3, 114,3, 47,1, 41,8, 38,4, 29,8, 28,1, 25,3, 25,2.

Pabgraminona B (IM18):
RMN de 1H (600 MHz, (CD3)2CO) δ 6,79 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 9,9, 5,4 Hz, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (m, 1H), 1,28 (s, 3H).
RMN de 13C (150 MHz, (CD3)2CO) δ 208,4, 149,5, 146,9, 129,6, 129,5, 122,4, 122,1, 117,3, 114,3, 47,1, 41,8, 38,4, 29,8, 28,1, 25,3, 25,2.

Pabgraminona C (IM502):
RMN de 1H (600 MHz, (CD3)2CO) δ 6,79 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 9,9, 5,4 Hz, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (m, 1H), 1,28

Epiconicol (IM13):
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,75 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,57 (dd, J = 8,7, 2,5 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 3,48 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,97 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,69 (s, 3H), 1,41 (s, 3H), 1,25 (s, 3H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ 149,3, 145,9, 135,4, 125,8, 121,9, 117,9, 114,8, 114,4, 75,7, 39,5, 32,6, 31,1, 26,6, 25,5, 23,7, 20,0.

Conidiona (IM20):
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,83 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 5,07 (dd, J = 8,7, 2,6 Hz, 1H), 3,44 (s, 1H), 2,84 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 2,77 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 1,95 (m, 2H), 1,71 (m, 2H), 1,39 (tdd, J = 13,4, 11,6, 6,2 Hz, 1H), 1,66 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,19 (s, 3H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ 197, 196,6, 141,1, 140,7, 139,0, 116,4, 86,9, 84,7, 50,5, 46,1, 41,8, 29,3, 29,1, 24,3, 23,7, 22,1.

Conitriol (IM11):
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,72 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 8,5, 3,0 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 3,91 (m, 1H), 2,11 (m, 2H), 1,99 (m, 1H), 1,70 (s, 3H), 1,63 (m, 2H), 1,28 (s, 3H), 0,57 (s, 3H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ 149,2, 148,0, 133,1, 131,0, 125,5, 119,1, 118,1, 114,4, 75,1, 49,4, 34,5, 32,0, 31,5, 23,4, 23,0, 20,8.

Los compuestos se disolvieron en DMSO para los ensayos in vitro y en PBS que contiene 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5% de Tween 80 y 4% de PEG300 (MedChemExpress, EE. UU.) para los experimentos in vivo.

Citometría de flujo

Se prepararon suspensiones de células simples a partir de tumores, ganglios linfáticos o bazo de ratón, y se tiñeron y analizaron mediante citometría de flujo según se describe en nuestro estudio anterior.^[34],^[74] El número de células se contó añadiendo cuentas de recuento de células a las muestras teñidas. Se calcularon y se presentaron los números de células en 200 mg de tejido tumoral. Los anticuerpos de citometría de flujo utilizados, incluidos sus detalles de origen y dilución, se enumeran en la Tabla de recursos clave.

Ensayo citométrico de cuentas BD (CBA)

Las citocinas IFNγ e IL-2 se midieron utilizando el kit Easy MagPlex Human Cytokine. Para realizar la prueba, se añadieron 50 μL de anticuerpo de captura de citocinas recubierto con microesferas fluorescentes y 50 μL de sobrenadante celular a los tubos de ensayo. La mezcla se incubó durante 1 h, agitando y protegiéndola de la luz. Después del lavado, se añadieron 100 μL de anticuerpos de detección de citocinas marcados con ficoeritrina (PE) y se incubó durante 1 h, agitando a temperatura ambiente. Se añadió 500 μL de tampón de lavado a cada tubo, se agitó brevemente y se centrifugó a 500 g durante 5 min. Finalmente, se añadió 200 μL de tampón de lavado a cada tubo y se realizó el análisis de citometría de flujo en un citómetro de flujo DxFLEX (Beckman Coulter) y se analizó según la curva estándar.

ELISA

El nivel de IFNγ de ratón en el sobrenadante de cultivo de nuestros ensayos de cocultivo se determinó utilizando un kit ELISA (Elabscience) según el protocolo del fabricante.

Ensayo de viabilidad y apoptosis de células tumorales

Las células MC38 y Hepa1-6BL se sembraron en placas de 96 pocillos (2 × 103 células/pocillo). Las células se trataron con diferentes concentraciones de IM502 según se indica en la figura. A continuación, las células tratadas se incubaron con el reactivo CCK8 durante 1 h y se analizó la viabilidad de las células mediante un ensayo inmunoenzimático. Para medir la apoptosis, las células MC38 y Hepa1-6BL se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con IM502 (10 μM) durante 48 h. A continuación, se recogieron las células y se tiñeron para el análisis de apoptosis según se describe en nuestro estudio anterior.^[34]

Generación de macrófagos (BMDM) y células dendríticas (BMDC) derivados de médula ósea

Las células de la médula ósea se obtuvieron según se describe en nuestro estudio anterior.^[34] Las células de la médula ósea se cultivaron en un medio completo RPMI 1640 suplementado con 5% de sobrenadante de células L929 durante 5 días para generar BMDM o suplementado con 10 ng/mL de GM-CSF de ratón durante 6 días para generar BMDC.

Generación de macrófagos y células dendríticas humanas

Las células mononucleares (CD45+CD14+7AAD−) se clasificaron a partir de PBMCs humanas de la sangre de donantes sanos. Las células mononucleares se cultivaron en un medio completo RPMI 1640 que contiene M-CSF (25 ng/mL) durante 5 días o GM-CSF (25 ng/mL) durante 6 días para generar macrófagos y células dendríticas, respectivamente. Los macrófagos derivados de células THP-1 humanas se generaron mediante la estimulación con PMA (100 ng/mL) durante 12 h.

Clasificación de poblaciones de células inmunitarias

Se recogieron los bazo de ratones OT-1 y se trituraron a través de un tamiz de células de 70 μm. Las células rojas de la sangre se lisaron con tampón ACK. Las células del bazo se bloquearon con anticuerpo de bloqueo de Fc antes de teñirlas con anticuerpos anti-CD8α, anti-CD4 y anti-TCRβ, y Zombie aqua o 7AAD. Las células T CD8+ (TCRβ+ CD8+) y las células T CD4+ (TCRβ+ CD4+) vivas se clasificaron en un Aria III.

Para obtener TAM, se recogieron los tumores Hepa1-6BL de ratones C57BL/6 WT de los grupos de control y tratados con IM502 al final del experimento, según se describe en la sección del modelo tumoral y el tratamiento de los métodos. Se prepararon suspensiones de células simples de tumores y se tiñeron con anticuerpos tras el bloqueo de Fc y se clasificaron mediante citometría de flujo para obtener TAM (CD45.2+CD11b+F4/80+7AAD−) según la estrategia de la Figura S5. Las células clasificadas con una pureza superior al 95% se utilizaron en experimentos posteriores.

Se prepararon PBMCs humanas a partir de sangre total de donantes sanos mediante tratamiento con Ficoll. Las PBMCs se bloquearon con anticuerpo de bloqueo de Fc antes de teñirlas con anticuerpos anti-CD8α, anti-CD45 y 7AAD. Las células T CD8+ (CD45+ CD8+) vivas se clasificaron en un citómetro de flujo Aria III.

Para obtener TAM humanos a partir de tejidos de CRC (Tabla S1), se recogieron inmediatamente los tejidos de CRC humanos tras la cirugía. El tejido tumoral se picó finamente y se digirió en 3 mL de solución de digestión (1 mg/mL de colagenasa IV, 20 μg/mL de DNasa I y 1% de FBS en medio RPMI 1640) en un agitador a 37 °C y 150 rpm durante 35 min. Tras la digestión, el tejido tumoral se filtró a través de un tamiz de 70 μm y se suspendió en medio RPMI 1640. Las células se preincubaron con anticuerpo de bloqueo de Fc antes de teñirlas con anticuerpos anti-CD45, anti-CD14, anti-CD68 y 7AAD. Los macrófagos vivos (CD45+CD14+CD68+ 7AAD−) se clasificaron en un citómetro de flujo Aria III.

Ensayo de cocultivo de macrófagos y células dendríticas con células T CD8+

El ensayo de cocultivo se realizó según se describe en nuestro estudio anterior.^[34] Las células T de ratón se marcaron con CellTrace Violet (CTV) según las instrucciones del fabricante. Los BMDM o BMDC se trataron con medio fresco (FM) o medio acondicionado de células tumorales Hepa1-6BL (TCM) durante 12 h, seguido de tratamiento con los compuestos indicados (10 μM) o las concentraciones indicadas de IM502 durante 24 h. A continuación, las células se pulsaron con 100 ng/mL de péptido ovalbúmina (OVA) (SIINFEKL) durante 2 h. Los BMDM y las células T CD8+ marcadas con CTV se cocultivaron en una proporción de 1:10. Del mismo modo, se añadió un anticuerpo anti-CD3 (2 μg/mL) a las células T y los BMDM cocultivados para los ensayos sin pulsación de péptido OVA. La proliferación de las células T se midió 2 días después mediante citometría de flujo. En algunos experimentos, se recogieron los sobrenadantes para la detección de IFNγ mediante ELISA.

Las células T humanas de la sangre de donantes sanos se marcaron con CellTrace Violet (CTV). Los macrófagos y las células dendríticas derivadas de monocitos de PBMCs humanas se trataron con medio fresco o TCM de células tumorales humanas HepG2 durante 12 h, seguido de tratamiento con 10 μM de IM502 durante 24 h. A continuación, los macrófagos o las células dendríticas humanas se cocultivaron con células T CD8+ humanas marcadas con CTV en una proporción de 1:10, en presencia de un anticuerpo anti-CD3 (2 μg/mL). La proliferación de las células T se midió 3 días después mediante citometría de flujo. En algunos experimentos, se recogieron los sobrenadantes para la medición de IFNγ e IL-2 mediante CBA.

Función inmunosupresora de los TAM

La función inmunosupresora de los TAM de ratón se determinó según se describe en nuestro estudio anterior.^[34] En resumen, los TAM clasificados se pulsaron con 100 ng/mL de péptido OVA durante 2 h y, a continuación, se cocultivaron con células T CD8+ OT-1 marcadas con CTV en una proporción de 1:10 durante 2 días. La proliferación de las células T CD8+ se determinó directamente mediante citometría de flujo. La expresión de la granzima B se determinó tras la estimulación con PMA (0,8 μM) e ionomicina (1 ng/mL) en presencia del inhibidor del transporte de proteínas brefeldina A (10 μM) durante 6 h. Tras el cocultivo con los TAM, se añadieron las células T CD8+ a células tumorales Hepa1-6BL marcadas con 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) en una proporción de 5:1 durante 24 h, y se detectó la apoptosis de Hepa1-6BL con anexina V mediante citometría de flujo, para medir la capacidad citolítica de las células T CD8+.

Los TAM humanos de tejidos de cáncer colorrectal (CRC) se trataron con IM502 (10 μM, 24 h), suplementados con M-CSF humano (25 ng/mL) y TCM de HCT116 (50%) para mantener la supervivencia y el fenotipo supresor. A continuación, los TAM se cocultivaron con células T CD8+ humanas marcadas con CellTrace Violet (CTV) aisladas de PBMCs en presencia de un anticuerpo anti-CD3 (2 μg/mL) en una proporción de 1:10 durante 3 días. Las células T se analizaron con citometría de flujo, y el número total se calculó en función de las cuentas de recuento.

Proliferación de células T

Las células T CD4+ y CD8+ de ratón se clasificaron a partir del bazo de ratones vírgenes y, a continuación, se marcaron con CTV. Las células T se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con IM502 (10 μM) en presencia de anti-CD3/CD28 (2 μg/mL) e IL-2 (100 U/ml), y se cultivaron en medio fresco (FM) o medio acondicionado de células tumorales Hepa1-6BL (TCM) durante 2 días. La proliferación de las células T se determinó mediante citometría de flujo.

Las células T CD8+ humanas se clasificaron a partir de PBMCs tras el tratamiento con Ficoll de sangre total de donantes sanos. Las células T CD8+ se tiñeron con CTV y, a continuación, se colocaron en una placa de 96 pocillos precoatada con anticuerpo anti-CD3 en presencia de anticuerpo anti-CD28 (2 μg/mL) e IL-2 humano (100 U/ml) durante 3 días. La proliferación de las células T se determinó mediante citometría de flujo, y el número se calculó en función de las cuentas de recuento.

Ensayo de fagocitosis

La capacidad de fagocitosis de las células BMDM de ratón se determinó mediante el cocultivo con células Hepa1-6BL marcadas con CFSE en una proporción de 10:1 en presencia o ausencia de 10 μM de IM502 durante 12 h, según se describe anteriormente.^[34]

Tinción e análisis histológico de tejidos tumorales

Según se describe anteriormente,^[34] se prepararon secciones de tejido incluidas en parafina (4 μm) a partir de muestras fijadas en 4% de formaldehído tamponado con fosfato neutro (Beyotime, Jiangsu, China). Tras la desparafinación y la rehidratación, se realizó la recuperación del antígeno calentando las láminas en un tampón de citrato de 10 mM (pH 6,0) a 95 °C durante 15 min. La actividad peroxidasa endógena se eliminó con 3% de H2O2 durante 10 min, seguida de tres lavados con PBS. Se bloqueó la unión inespecífica con 10% de suero de cabra normal durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario.

Para la tinción de inmunofluorescencia, tras tres lavados de 10 min con PBS, se aplicó anticuerpo secundario fluoresceínico (especie y fluorocromo especificados en la Tabla de recursos clave) durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se contrateñeron con DAPI (1 μg/mL) (VICMED, VS1008) y se analizaron con un microscopio de fluorescencia. Se midió la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada célula utilizando el software ImageJ.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante una prueba t de Student o un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de una prueba post hoc de Tukey. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.

En cuanto a la tinción inmunohistoquímica, después de tres lavados con PBS de 10 minutos, la muestra se incubó con 1-3 gotas de anticuerpos secundarios biotinilados durante 30-60 minutos. Después del lavado con PBS, se añadió DAB (1:200, ZSGB-BIO, Beijing, China) como enzima-sustrato. El tejido se tiñó con el contracolorante nuclear hematoxilina para una mejor visualización de la morfología del tejido y se cubrió con un cubreobjetos de tamaño adecuado, y se colocó sobre papel de filtro o una toalla para eliminar el exceso de medio de montaje y permitir que se seque. Se capturaron aleatoriamente al menos tres campos no superpuestos por sección bajo condiciones de iluminación y exposición idénticas (Olympus BX53×, objetivo de 20×, Japón). Se aplicó la deconvolución de color (vector H-DAB) para aislar la señal de DAB. Después de aplicar un umbral constante al canal DAB, se midió la densidad óptica integrada (IOD = suma de las intensidades de los píxeles dentro del área positiva) con ImageJ v1.53t. La positividad de la proteína diana se informa como (área DAB-positiva/área total del tejido) × 100%.

Ensayo OXPHOS

Como se describió previamente en nuestro estudio,^[74] se midió la tasa de consumo de oxígeno (OCR, pmol O2/min) utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XF96 para evaluar el OXPHOS. Se sembraron BMDM (1,5 × 104) en placas de microtitulación Seahorse de 96 pocillos en 100 μL de medio de cultivo y se trataron con medio fresco o medio acondicionado de células tumorales Hepa1-6BL (TCM) durante 12 h antes de la adición de IM502 (10 μM) durante otras 6 h. Las células se lavaron 1 h antes del ensayo y se cultivaron durante 30 min en medio de ensayo Seahorse que contenía 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 10 mM de glucosa a 37 °C en una atmósfera humidificada sin CO2. Se midió el OCR en los puntos temporales indicados en la figura y después de la inyección de oligomicina (2 μM), FCCP (1 μM) y rotenona/antimicina A (0,5 μM). Se calcularon las medidas de respiración máxima, capacidad de respiración de reserva, producción de ATP y respiración basal.

Detección de ROS y glutatión (GSH)

Se sembraron BMDM en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 × 105 células/pocillo. Las BMDM se trataron con TCM de Hepa1-6BL durante 12 h y se incubaron durante otras 6 h en presencia o ausencia de IM502 (10 μM). Las células se tiñeron con CM-H2DCFDA (10 μM), Thiolite Green (10 μM) durante 30 min o indicador de superóxido mitocondrial MitoSOX Red (1 μM) para detectar los niveles de ROS, GSH y ROS mitocondriales, respectivamente, según las instrucciones del fabricante, como se describió previamente.^[34]

Potencial de membrana mitocondrial

Se sembraron macrófagos derivados de THP-1 humanos o BMDM murinos en una placa de 48 pocillos (1 × 105 células/pocillo). Las células se incubaron durante 12 h en presencia o ausencia de TCM de HepG2 o Hepa1-6BL y luego se trataron con IM502 (10 μM) durante 6 h. Las células se lavaron e incubaron con el colorante JC-1 (dilución 500 veces) durante 20 min en la oscuridad. El cambio de fluorescencia de rojo (agregados de JC-1) a verde (monómeros de JC-1) se determinó mediante citometría de flujo. Se calculó la relación gMFI de monómero de JC-1 a agregado de JC-1 para evaluar el cambio en el potencial de membrana mitocondrial.

Peroxidación lipídica

Brevemente, se cultivaron BMDM en TCM de Hepa1-6BL durante 12 h y luego se trataron con IM502 (10 μM) durante otras 6 h. Las células de BMDM se incubaron con el sensor de peroxidación lipídica en el medio de cultivo celular en una cámara humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 30 min. Después de la incubación, las células se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo. La fluorescencia del sensor cambia de rojo a verde tras la peroxidación en las células. La detección del cambio dependiente de la peroxidación permite la medición ratiométrica de la peroxidación lipídica.

Western blotting

En el experimento que midió la proteína ARG1, las BMDM murinas se expusieron a TCM de Hepa1-6BL durante 12 h, seguido de IM502 (10 μM) durante 24 h. En otros experimentos, las BMDM murinas o los macrófagos derivados de monocitos THP-1 humanos se expusieron a TCM de Hepa1-6BL o HepG2 durante 30 min, seguido de tratamiento con las concentraciones indicadas de IM502 durante 30 min u 8 h. Se prepararon las muestras y se detectaron los niveles de proteína como se describió previamente.^[34],^[74] La fuente y la información de dilución de los anticuerpos primarios utilizados en el análisis de western blot se proporcionan en la tabla de recursos clave.

qPCR

Se recolectaron BMDM y BMDC después de un tratamiento de 6 h con IM502 (10 μM) en presencia de medio acondicionado de células tumorales Hepa1-6BL (TCM). Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 humanos se trataron con IM502 (10 μM, 6 h) en presencia de medio acondicionado de células tumorales HepG2 humanas (TCM). Se extrajo el ARN total y se determinaron los niveles de ARNm de los genes utilizando SYBR Green I Master Mix en un sistema Light Cycler 480 (Roche Group, BSL, CH) como se describió previamente.^[34] Las secuencias de los cebadores de qPCR se enumeraron en la tabla de recursos clave.

Detección de ALT y AST

Se recolectaron muestras de suero de ratones con tumores hepáticos ortotópicos el día 21 en relación con la inoculación de células tumorales, como se describe en la sección anterior del método. Los niveles de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se evaluaron determinando la actividad de ALT y AST utilizando un kit de ensayo de actividad según las instrucciones del fabricante.

Estudios farmacocinéticos

Se realizaron estudios farmacocinéticos en ratones C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) con tumores MC38 subcutáneos. Después de un ayuno de 12 h, los ratones recibieron una sola dosis intravenosa de IM502 (1,5 mg/kg). Se recolectó sangre (∼0,2 mL) y tejido tumoral en puntos temporales especificados (5 min, 15 min, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 24 y 48 h después de la dosis; n = 3 ratones por punto temporal). El plasma se separó por centrifugación (4000 rpm, 10 min). Las muestras de tumor se pesaron, se homogeneizaron en metanol y se centrifugaron en las mismas condiciones. Los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de IM502 en plasma y homogenados de tumor se cuantificaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Los análisis se realizaron en un sistema UPLC Agilent 1290 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6470B. La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2,1 mm × 50 mm, 1,8 μm) mantenida a 30 °C. La fase móvil consistió en ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B) a un caudal de 0,2 mL/min, con el siguiente gradiente: 0-1 min, 5% B; 1-6 min, 5% → 70% B; 6-6,1 min, 70% → 90% B; 6,1-7 min, 90% B; 7-7,1 min, 90% → 5% B; 7,1-11 min, 5% B. El volumen de inyección fue de 5 μL. La detección se realizó en modo de electrospray negativo (ESI-) utilizando el monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Los parámetros farmacocinéticos se calcularon con el software WinNonlin (Certara).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Los ratones con tumores (6 ratones por grupo) se trataron con IM502 como se describe en la sección del modelo tumoral y el tratamiento de los métodos. Se generaron suspensiones de células individuales del tejido tumoral y se tiñeron como se describió anteriormente, y las células CD45.2+ se clasificaron en un FACS Aria III. Las suspensiones celulares que contenían aproximadamente diez mil células por muestra se cargaron en un instrumento 10x Genomics GemCode Single-cell que genera perlas de gel de una sola célula en emulsión (GEM). Se generaron bibliotecas y se secuenciaron a partir de los ADNc con los kits de reactivos Chromium Next GEM Single Cell 5′ (v3.1). Como se describió en nuestro estudio anterior,^[34],^[74] las bibliotecas se prepararon y secuenciaron posteriormente utilizando un secuenciador NovaSeq (Illumina). El software Cell Ranger de 10x Genomics (versión 3.1.0) se utilizó para convertir los archivos BCL brutos en archivos FASTQ, alineación y cuantificación de recuentos. Brevemente, las lecturas con códigos de barras y UMIs de baja calidad se filtraron y luego se mapearon al genoma de referencia del ratón (versión 106 de Ensembl). Los datos de expresión génica de cada muestra se importaron individualmente en Seurat versión 2.2.1 para el análisis posterior. Se excluyeron las células con menos de 200 genes detectados o >5% de transcritos mitocondriales. Los datos de expresión se normalizaron con la función NormalizeData, utilizando el enfoque "LogNormalize", y luego se escalaron por profundidad de secuenciación. Las muestras de control e IM502 tratadas se corrigieron con efectos de lote antes de combinarse para el análisis utilizando el método "harmony" en el paquete Seurat en R v3.6.0. El agrupamiento de células basado en la expresión génica se realizó en todas las células de ambas condiciones con los parámetros predeterminados (función FindClusters), así como un análisis de marcadores específicos del grupo (función FindAllMarkers), utilizando solo los genes que se expresaron en al menos el 25% de las células para cada grupo. Se asignaron diferentes tipos de células a los grupos en función de los marcadores génicos conocidos que se expresan en gran medida en el grupo de células en particular y que se encontraron como marcadores significativos (FDR 5% de transcritos mitocondriales. Los datos de expresión se normalizaron con la función NormalizeData, utilizando el enfoque "LogNormalize", y luego se escalaron por profundidad de secuenciación. Las muestras de control e IM502 tratadas se corrigieron con efectos de lote antes de combinarse para el análisis utilizando el método "harmony" en el paquete Seurat en R v3.6.0. El agrupamiento de células basado en la expresión génica se realizó en todas las células de ambas condiciones con los parámetros predeterminados (función FindClusters), así como un análisis de marcadores específico del grupo (función FindAllMarkers), utilizando solo los genes que se expresaron en al menos el 25% de las células para cada grupo. Se asignaron diferentes tipos de células a los grupos en función de los marcadores génicos conocidos que se expresan en el grupo de células particular y que se encontraron como marcadores significativos (FDR 5% de transcritos mitocondriales se excluyeron. Los datos de expresión se normalizaron con la función NormalizeData, utilizando el enfoque "LogNormalize", y luego se escalaron por profundidad de secuenciación. Las muestras de control y tratadas con IM502 se corrigieron con efectos de lote antes de combinarse para el análisis utilizando el método "harmony" en el paquete Seurat en R v3.6.0. El agrupamiento de células basado en la expresión génica se realizó en todas las células de ambas condiciones con los parámetros predeterminados (función FindClusters), así como un análisis de marcadores específicos del grupo (función FindAllMarkers), utilizando solo los genes que se expresaron en al menos el 25% de las células para cada grupo. Se asignaron diferentes tipos de células a los grupos en función de los marcadores génicos conocidos que se expresan en gran medida en el grupo de células en particular y que se encontraron como marcadores significativos (FDR

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La inmunoterapia basada en metabolitos fúngicos supera la inmunosupresión de los macrófagos asociados al tumor.

¿Qué significa esto para los pacientes?

Resultados

IM502 disminuye el fenotipo y la función inmunosupresores de los macrófagos in vitro

IM502 demuestra una potente y bien tolerada actividad antitumoral in vivo

IM502 mejora el perfil efector de las células T y NK infiltrantes tumorales

IM502 se asemeja a los fármacos clínicos y supera la resistencia al bloqueo de PD-1

IM502 disminuye el fenotipo y la función inmunosupresores de los macrófagos in vitro

IM502 demuestra una potente y bien tolerada actividad antitumoral in vivo

IM502 mejora el perfil efector de las células T y NK infiltrantes tumorales

IM502 suprime el crecimiento tumoral reprogramando los TAM

IM502 se dirige a PI3Kγ y redirige la señalización STAT

IM502 reprograma el metabolismo de los macrófagos y alivia el estrés oxidativo

IM502 se asemeja a los fármacos clínicos y supera la resistencia al bloqueo de PD-1

Discusión

Limitaciones del estudio

Limitaciones del estudio

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Disponibilidad de materiales

Disponibilidad de datos y código

Contacto principal

Disponibilidad de materiales

Disponibilidad de datos y código

Agradecimientos

Contribuciones de los autores

Declaración de intereses

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Ratones y muestras humanas

Líneas celulares

Modelos tumorales

Detalles del método

Preparación de compuestos y soluciones de fermentación

Síntesis química de geranilhidroquinona

Alimentación del cultivo con geranilhidroquinona y análisis HPLC de los extractos

Aislamiento de compuestos y elucidación de la estructura

Citometría de flujo

Ensayo citométrico de cuentas BD (CBA)

ELISA

Ensayo de viabilidad y apoptosis de células tumorales

Generación de macrófagos (BMDM) y células dendríticas (BMDC) derivados de médula ósea

Generación de macrófagos y células dendríticas humanas

Clasificación de poblaciones de células inmunitarias

Ensayo de cocultivo de macrófagos y células dendríticas con células T CD8+

Función inmunosupresora de los TAM

Proliferación de células T

Ensayo de fagocitosis

Tinción e análisis histológico de tejidos tumorales

Análisis estadístico

Ensayo OXPHOS

Detección de ROS y glutatión (GSH)

Potencial de membrana mitocondrial

Peroxidación lipídica

Western blotting

qPCR

Detección de ALT y AST

Estudios farmacocinéticos

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