Fragmentómica del ADN mitocondrial libre circulante para la detección temprana del cáncer gástrico y las lesiones precancerosas.

El cáncer gástrico (CG), que es el quinto tumor más común y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, sigue siendo un desafío crítico en oncología.^[1],^[2] La persistente alta tasa de mortalidad asociada con el CG se debe en gran medida al hecho de que la mayoría de los casos de CG se diagnostican en etapas avanzadas de la enfermedad, y más de dos tercios de los pacientes presentan lesiones localmente avanzadas o metastásicas en el momento del diagnóstico inicial.^[3] La identificación eficaz de lesiones precancerosas, como la displasia de alto grado (DHG) y el CG en etapa temprana (CGET), y las intervenciones tempranas para estas lesiones son fundamentales para reducir la carga de la enfermedad.^[4] En particular, la DHG, que representa la lesión precursora más avanzada e inmediata del CG, es un objetivo crítico para la intervención, ya que su eliminación puede prevenir eficazmente la progresión maligna. La endoscopia sigue siendo el estándar de oro indispensable para diagnosticar definitivamente el CG y sus lesiones precursoras, incluida la DHG. Sin embargo, la naturaleza invasiva de la endoscopia conlleva inherentemente el riesgo de complicaciones y puede disuadir la aceptación del paciente, lo que hace necesario el desarrollo de modalidades de diagnóstico no invasivas que puedan identificar de manera confiable a los pacientes con DHG o CGET. Los biomarcadores séricos, como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno 19-9 (CA19-9) y el antígeno 72-4 (CA72-4), presentan un rendimiento deficiente en la detección del CGET y son en gran medida ineficaces para identificar lesiones precancerosas como la DHG,^[5] principalmente debido a una sensibilidad y especificidad insuficientes, lo que refleja una limitación fundamental de los enfoques actuales.^[6],^[7]

La biopsia líquida, una modalidad de diagnóstico para detectar biomarcadores como las células tumorales circulantes (CTC), el ADN tumoral circulante (ctDNA) y los pequeños ARN no codificantes (sncRNA), ofrece un avance tecnológico no invasivo para el cribado y el diagnóstico temprano del CG.^[8],^[9] Sin embargo, las bajas concentraciones y la variabilidad en la detección limitan los roles diagnósticos de las CTC y el ctDNA. Además, los sncRNA, en particular los microARN (miARN), son biomarcadores bien establecidos en la biopsia líquida.^[1],^[10],^[11] Su atractivo radica en su alta abundancia, su excepcional estabilidad en la circulación y su compatibilidad con métodos de detección estandarizados y rentables, como la PCR cuantitativa de transcripción inversa, lo que facilita la traslación clínica. Si bien los estudios han demostrado el rendimiento diagnóstico preciso de las firmas de miARN para detectar el CG,^[12],^[13],^[14], persisten los desafíos. Estos incluyen la falta de paneles estandarizados, una especificidad biológica insuficiente y la influencia confusa de las afecciones no malignas en los perfiles de miARN.^[15],^[16] En este sentido, los avances recientes en la fragmentómica del ADN libre en plasma (cfDNA) han dado lugar a enfoques alternativos para interpretar los patrones de fragmentos de ADN para el desarrollo de métodos de diagnóstico potentes, particularmente para la detección temprana del cáncer.^[17],^[18],^[19] En particular, basándose en los datos de secuenciación del genoma completo (WGS), Song et al. demostraron que el perfil de fragmentación del ADN nuclear libre en plasma (cf-nDNA), el motivo terminal y las variaciones del número de copias en todo el genoma lograron una alta sensibilidad para la detección del CGET.^[20] Estudios recientes han validado aún más la utilidad de la fragmentómica en los cánceres gastrointestinales (GI).^[7],^[21] Sin embargo, la repetibilidad de los perfiles de fragmentación del cfDNA requiere una mayor validación, particularmente dada su baja cobertura de secuenciación, lo que puede limitar su aplicación traslacional.

Además del cf-nDNA, el plasma contiene ADN mitocondrial libre en plasma (cf-mtDNA), que se caracteriza por su pequeño tamaño y su alto número de copias.^[22],^[23] El cf-mtDNA circulante (ccf-mtDNA) ofrece distintas ventajas para la detección temprana del cáncer: su alto número de copias proporciona una señal más fuerte en entornos con baja carga tumoral,^[24] su susceptibilidad al daño oxidativo produce patrones de fragmentación sensibles al estrés celular,^[25] y la disfunción mitocondrial es un evento temprano en la carcinogénesis, lo que convierte al ccf-mtDNA en un analito biológicamente relevante para capturar la transformación maligna incipiente.^[26] A un costo comparable con el de la WGS, desarrollamos un método basado en la captura por hibridación para el análisis del ccf-mtDNA para lograr una mayor profundidad de secuenciación y permitir una caracterización más completa de las características fragmentómicas del ccf-mtDNA.^[27] Nuestro estudio ha demostrado el potencial diagnóstico del perfilado fragmentómico del ccf-mtDNA para la detección temprana del cáncer en múltiples tumores y la clasificación del tejido de origen.^[24] En particular, las evidencias emergentes han destacado el rendimiento diagnóstico superior de la fragmentómica del ccf-mtDNA en las neoplasias en etapa temprana, incluido el carcinoma hepatocelular (CHC), el cáncer colorrectal (CCR) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y este enfoque supera a los biomarcadores séricos convencionales en términos de sensibilidad y especificidad.^[19],^[28],^[29]

Aquí, se utilizó la secuenciación de próxima generación (NGS) basada en la captura de mtDNA para analizar las características fragmentómicas del ccf-mtDNA en 1951 muestras de plasma de pacientes con CG/DHG y controles sin CG. Se desarrolló un modelo de detección de CG (GD) basado en el aprendizaje automático utilizando las características fragmentómicas del ccf-mtDNA y se validó posteriormente en dos cohortes retrospectivas independientes y una cohorte prospectiva. También evaluamos la precisión del modelo para identificar a los pacientes con DHG. Se utilizó una cohorte que incluía pacientes con otros cinco cánceres gastrointestinales para evaluar la especificidad del modelo GD. En conjunto, nuestro estudio presenta hallazgos empíricos que demuestran las ventajas del análisis basado en las características fragmentómicas del ccf-mtDNA para la detección temprana del CG y la DHG.

Resultados

Diseño del estudio y características de los participantes

Como se muestra en la Figura 1, se analizaron un total de 1951 muestras de plasma de ocho cohortes, que incluyen la cohorte de entrenamiento (n = 505), la cohorte de validación interna (n = 217), las cohortes de validación externas 1 y 2 (n = 359 y 390, respectivamente), la cohorte de DHG (n = 72), la cohorte de otros cánceres GI (n = 194), la cohorte prospectiva (n = 84) y la cohorte de minorías chinas (n = 130). La profundidad de cobertura del mtDNA obtenida se resume en las Tablas S3 y S4. Basándose en las características fragmentómicas del ccf-mtDNA, se desarrolló el modelo GD utilizando un algoritmo de aprendizaje automático. También realizamos una evaluación sistemática del modelo. Además, las características clinicopatológicas detalladas (como la edad, el sexo, los niveles de biomarcadores séricos, las etapas tumorales y la ubicación del tumor) de todos los participantes se resumen en las Tablas S1 y S2. Los grupos de control sano (CS), enfermedad gástrica benigna (EGB) y CG se emparejaron rigurosamente por edad y sexo en el momento del reclutamiento. Como se muestra en la Figura S1, no se encontraron diferencias significativas en la edad (todas p < 0,05) o la distribución de género entre los tres grupos en la cohorte de entrenamiento.

Análisis de las características fragmentómicas del ccf-mtDNA en los CS y los pacientes con EGB, DHG o CG

Para abordar la necesidad crítica de biomarcadores no invasivos que puedan permitir la detección temprana del CG y la discriminación de sus etapas precancerosas, analizamos de manera integral las características fragmentómicas del ccf-mtDNA utilizando datos de NGS basados en la captura. Este análisis abarcó un continuo clínicamente relevante que incluye CS, pacientes con EGB y pacientes con CG confirmados reclutados del Hospital Xijing. Como se muestra en la Figura 2A, se observó una diferencia significativa entre los grupos CS, EGB y CG (p < 0,05). Dado que los fragmentos de ADN derivados del tumor son más cortos, se realizó un análisis agrupado (ventanas de 10 pb) que comparaba el CG frente a los controles sin CG. Este análisis identificó dos intervalos diferenciales críticos: los fragmentos dentro de los rangos de 70-80 pb (p < 0,05) y 80-90 pb (p < 0,05) mostraron distribuciones significativamente alteradas en los pacientes con CG en comparación con los controles sin CG (Figura S2). Además, en comparación con los grupos CS y EGB, el grupo CG mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtDNA entre 70 y 90 pb (todas p < 0,05; Figura 2B). Coherente con la mayor heterogeneidad observada en el perfil de fragmentación del ccf-mtDNA del grupo CG, encontramos un debilitamiento progresivo de la correlación entre los perfiles de fragmentación del ccf-mtDNA y el perfil medio del CS de los CS, desde los CS hasta los grupos EGB y CG (todas p < 0,05; Figuras 2C y 2D). Esto se acompañó de un aumento continuo en el número total de picos y nuevos picos (todas p < 0,05; Figuras 2E y 2F). Además, se observaron diferencias significativas en la preferencia de la base del extremo 5′ entre los tres grupos (Figura 2G). Específicamente, los pacientes con CG mostraron una subrepresentación del extremo T y una sobrerrepresentación del extremo C en comparación con los CS. En comparación con los pacientes con EGB, los pacientes con CG mostraron una sobrerrepresentación del extremo C y una subrepresentación de los extremos A y T (todas p < 0,05; Figura 2G). Además, en comparación con los grupos CS y EGB, el grupo CG mostró una mayor puntuación de diversidad del motivo del extremo 5′ (MDS) (todas p < 0,05; Figura 2H), pero no se observó diferencia entre los grupos CS y EGB.

Luego, analizamos las diferencias en las características fragmentómicas del ccf-mtDNA entre diferentes subgrupos de pacientes con CG. Como se muestra en las Figuras S3 y S4, no se observaron diferencias significativas en el tamaño del fragmento del ccf-mtDNA, los perfiles de fragmentación, la preferencia de la base del extremo 5′ y el MDS del extremo 5′ entre los grupos categorizados por edad y sexo (todas p > 0,05). En particular, el grupo de CG en etapa avanzada (AGC) mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtDNA entre 70 y 90 pb que el grupo de CGET y otras características fragmentómicas del ccf-mtDNA no mostraron diferencias significativas entre los dos grupos (todas p > 0,05; Figura S5). Estudios previos han demostrado diferencias significativas en las características moleculares entre el cáncer de la unión gastroesofágica (GEJ) y los CG no GEJ del cuerpo gástrico.^[30] El grupo no GEJ mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtDNA entre 70 y 90 pb que el grupo GEJ. Sin embargo, el análisis comparativo de otras características fragmentómicas del ccf-mtDNA no reveló diferencias significativas (todas p > 0,05; Figura S6). De manera similar, entre los pacientes con CG estratificados por grado tumoral o tipo de Lauren, la mayoría de las características fragmentómicas no mostraron diferencias significativas (todas p > 0,05; Figuras S7 y S8), con la excepción del número de nuevos picos. En conjunto, estos resultados demuestran características fragmentómicas aberrantes del ccf-mtDNA en los pacientes con CG, lo que destaca su potencial como biomarcador para la detección de CG.

Construcción y validación del modelo GD

SPANISH TRANSLATION:

Para abordar la importante carencia en la detección temprana del CGE, desarrollamos un enfoque de detección que utiliza características fragmentómicas aberrantes del ccf-mtDNA. Para determinar el modelo óptimo para la detección de CGE, evaluamos y comparamos sistemáticamente el rendimiento de los seis algoritmos candidatos (Figura S9; véase Métodos complementarios). Como se muestra en la Figura S10, el algoritmo de bosque aleatorio (RF) logró el mayor rendimiento, con un área bajo la curva (AUC) de 0,9784 y un equilibrio óptimo de sensibilidad (90,12%) y especificidad (94,84%) en la cohorte de entrenamiento. En consecuencia, el algoritmo RF fue seleccionado para el desarrollo del modelo, y se calculó la puntuación de CGE, que representa la probabilidad de la presencia de CGE. Las contribuciones de las características resultantes se presentaron en la Tabla S5. Como se muestra en la Figura S11, las puntuaciones de CGE fueron significativamente más altas en los pacientes con CGE que en los pacientes con DGE y controles sanos dentro de la cohorte de entrenamiento. El modelo de CGE demostró una alta capacidad para distinguir a los pacientes con CGE de los individuos sin CGE (incluyendo tanto los grupos de DGE como de controles sanos), con un AUC de 0,9784. En particular, el modelo discriminó eficazmente entre los pacientes con CGE y DGE (AUC = 0,9752), así como entre los pacientes con CGE y controles sanos (AUC = 0,9848). Basándose en el índice de Youden, se determinó un valor de corte óptimo de 0,5020. Utilizando la cohorte de entrenamiento, también calculamos los valores de corte para una sensibilidad del 99%, 95% y 90%, respectivamente. Como se muestra en la Figura S12, a medida que el umbral de sensibilidad se ajustó del 99% (valor de corte de 0,39) al 95% (valor de corte de 0,46) y luego al 90% (valor de corte de 0,504), la especificidad para el grupo de controles sanos aumentó del 72,6% (intervalo de confianza [IC] del 95%: 62,3%–81,0%) al 89,3% (IC del 95%: 80,9%–94,3%) y, finalmente, al 97,6% (IC del 95%: 91,7%–99,3%). Para el grupo de DGE, la especificidad aumentó correspondientemente del 66,7% (IC del 95%: 59,2%–73,4%) al 84,5% (IC del 95%: 78,3%–89,2%) y luego al 93,5% (IC del 95%: 88,7%–96,3%). Para evitar el sobreajuste, se evaluó el rendimiento del modelo de CGE en la cohorte de validación interna. Los resultados revelaron que los pacientes con CGE mostraron puntuaciones de CGE significativamente más altas que los controles (Figura 3A), con un excelente rendimiento diagnóstico, un AUC de 0,9855 (IC del 95%: 0,9745–0,9964), una sensibilidad del 93,58% y una especificidad del 93,52% (Figuras 3B y 3C; Tabla S6). Además, el modelo de CGE mostró valores de AUC de 0,9800 y 0,9964 para discriminar el CGE del DGE (especificidad = 90,28%) y de los controles sanos (especificidad = 100%). Las métricas de rendimiento detalladas, incluido el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) con IC del 95% para todas las cohortes de validación, se proporcionan en la Tabla S7.

Para evaluar la generalizabilidad y el potencial en el mundo real del modelo, evaluamos el modelo de CGE utilizando dos cohortes de validación externa retrospectivas. De manera similar a los hallazgos de la cohorte de validación interna, la puntuación de CGE mostró un aumento notable desde los controles sanos hasta los pacientes con CGE en ambas cohortes de validación externa (Figuras 3D y 3G). Además, los resultados demostraron la notable capacidad del modelo de CGE para distinguir a los pacientes con CGE de aquellos sin CGE en las cohortes de validación externa 1 y 2 (AUC = 0,9874 y 0,9889, sensibilidad = 92,50% y 93,85%, y especificidad = 95,40% y 93,85%, respectivamente). Estos resultados indicaron el alto rendimiento constante del modelo de CGE en las cohortes de entrenamiento, validación interna y validación externa independiente, lo que subraya su sólida generalizabilidad y su preparación para evaluaciones clínicas adicionales.

Análisis de subgrupos para el rendimiento del modelo de CGE

Para establecer la utilidad clínica y la robustez de nuestro modelo en diversas poblaciones de pacientes y presentaciones de la enfermedad, realizamos análisis exhaustivos de los subgrupos estratificados por factores demográficos y clinicopatológicos clave en las cohortes de validación combinadas. Específicamente, analizamos el rendimiento de la detección para los pacientes con CGE en diferentes etapas, que fue nuestro principal objetivo. Como se muestra en la Figura 4A, la puntuación de CGE, el AUC y la sensibilidad aumentaron progresivamente con el avance de la etapa del tumor. Específicamente, en los pacientes con CGE en etapa I (n = 90), el modelo demostró un AUC de 0,9808 y una sensibilidad del 90,68% al distinguir entre CGE y no CGE (controles sanos y DGE). Tanto en los grupos de unión gastroesofágica (GEJ) como en los no GEJ, el modelo de CGE exhibió un excelente rendimiento, logrando altos valores de AUC de 0,9851 y 0,9833, respectivamente, y altos valores de sensibilidad de 91,03% y 93,24%, respectivamente (Figura 4B). Es importante destacar que un análisis adicional no reveló diferencias significativas en las puntuaciones de CGE en todos los grados o subgrupos de tipo de Lauren (p > 0,05). En esencia, el modelo mantuvo constantemente un alto rendimiento en todos los subgrupos, incluidos los diferentes estadios tumorales, las localizaciones tumorales, los grados tumorales y los tipos de Lauren (Figuras 4C y 4D). Por lo tanto, nuestro modelo demostró una robustez inquebrantable en todos los subgrupos, con una excelente capacidad de detección para el CGE. Esto respaldó su fiabilidad en diversos escenarios de despliegue clínico.

Para evaluar el modelo de CGE en comparación con los métodos no invasivos establecidos y evaluar el potencial de sinergia diagnóstica mediante la integración, comparamos su rendimiento con el de los biomarcadores séricos (CEA, CA19-9 y CA72-4) y analizamos posteriormente su utilidad combinada (Figura S13A). Como se muestra en la Figura S13B, la puntuación de CGE exhibió una mayor sensibilidad que los biomarcadores séricos (93,31% frente a 40,11%, p < 0,001). Sorprendentemente, la integración de la puntuación de CGE con los biomarcadores séricos solo mejoró ligeramente la sensibilidad (94,43%). Evaluamos además el VPP y el VPN para abordar las necesidades clínicas críticas en la detección de CGE. Como se muestra en la Figura S13C, la integración de la puntuación de CGE con los biomarcadores séricos logró un VPN comparable al del modelo de CGE solo. Sin embargo, solo el modelo de CGE independiente mostró el VPP más alto. Para evaluar aún más el valor diagnóstico complementario de nuestro enfoque, evaluamos el rendimiento del modelo de CGE en los pacientes con CGE que eran positivos o negativos para los biomarcadores séricos. En las cohortes de validación combinadas, el modelo de CGE identificó con éxito al 89,77% (193/215) de los pacientes con CGE que dieron negativo en todos los biomarcadores séricos (Figura S13D). Esto demuestra su potente capacidad para detectar cánceres que serían pasados por alto por las pruebas serológicas estándar. Estos hallazgos, en conjunto, indican que la combinación de la puntuación de CGE con los biomarcadores optimiza la sensibilidad general y el VPN, mientras que el modelo de CGE independiente representa la herramienta más eficiente desde el punto de vista clínico para minimizar los procedimientos invasivos innecesarios debido a su superior VPP.

Para posicionar el modelo de CGE en relación con el estado del arte, evaluamos su rendimiento diagnóstico en comparación con cinco métodos establecidos para la detección de CGE (Figura S14A). Sorprendentemente, el modelo de CGE demostró el AUC, la sensibilidad y la especificidad más altos entre todos los enfoques evaluados (Figuras S14B y S14C). En conjunto, estos hallazgos destacan la notable superioridad del modelo de CGE sobre la mayoría de los métodos actuales en la entrega de alta precisión en la detección de CGE.

Para evaluar directamente la generalizabilidad entre poblaciones de nuestro modelo, lo validamos en una cohorte independiente de 130 individuos uigures y kazajos, una población con una mezcla genética distinta de la cohorte principal china Han. En la cohorte de la minoría china, el modelo mantuvo un fuerte rendimiento, logrando un AUC de 0,9841 (IC del 95%: 0,9695–0,9988), una sensibilidad del 83,33% (IC del 95%: 72,57%–90,43%) y una especificidad del 96,88% (IC del 95%: 89,30%–99,44%) para discriminar el CGE del no CGE (Figura S15). Este resultado fue muy consistente con el rendimiento observado en las cohortes chinas Han, lo que proporciona evidencia preliminar de la robustez de nuestro enfoque en diversos orígenes genéticos.

Rendimiento del modelo de CGE en una cohorte prospectiva

Se utilizó una cohorte prospectiva de 84 muestras para evaluar si el modelo de CGE detecta el CGE temprano antes del diagnóstico clínico. El modelo de CGE reveló una puntuación de CGE significativamente más alta en los pacientes que desarrollaron CGE que en aquellos que no lo hicieron antes del diagnóstico clínico, con un AUC de 0,9087, una sensibilidad del 76,19% y una especificidad del 88,10% (p < 0,001; Figuras 5A, 5B, S16A y S16B). En el valor de corte de 0,5020, el modelo de CGE identificó al 85,71% (IC de bootstrap del 95%: 64,29%–100,00%), 75,00% (IC de bootstrap del 95%: 55,00%–90,00%) y 62,50% (IC de bootstrap del 95%: 25,00%–87,50%) de los pacientes con CGE dentro de 3 años antes del diagnóstico clínico, respectivamente (Figura 5C; Tabla S8). Estos hallazgos exploratorios y generadores de hipótesis sugieren el potencial para la detección preclínica, pero requieren validación en cohortes prospectivas más grandes. Además, la sensibilidad del modelo de CGE para la detección preclínica de CGE mantuvo la tendencia creciente a lo largo de los intervalos de tiempo de >3 años a 3 años: AUC = 0,8906; Figura S16C). El análisis de la curva de decisión reveló que el beneficio neto del modelo excedió ambas líneas de referencia (línea azul, estrategia de tratar a todos; línea verde, estrategia de no tratar a nadie) cuando el umbral de riesgo osciló entre el 5% y el 20%, lo que indica que el uso del modelo para guiar las decisiones de endoscopia dentro de este rango produjo beneficios clínicos (Figura 5E). Para evaluar aún más la capacidad del modelo para identificar las primeras firmas moleculares antes de las manifestaciones clínicas, realizamos un análisis longitudinal de muestras de plasma emparejadas obtenidas de pacientes con CGE (n = 8) en el momento del diagnóstico y antes del diagnóstico. Este diseño evalúa específicamente si el modelo de CGE puede detectar la transformación maligna incipiente durante la ventana prediagnóstica clínicamente silenciosa. En un análisis retrospectivo de las muestras de plasma prediagnósticas, el modelo de CGE no detectó señales malignas en dos de los ocho pacientes con CGE. En particular, como se muestra en la Figura 5F, uno de los dos casos inicialmente no detectados se volvió positivo para CGE en el momento del diagnóstico clínico (Paciente 3), mientras que el otro permaneció indetectable durante todo el período de observación (Paciente 8). En conclusión, estos hallazgos exploratorios sugieren que nuestro modelo tiene el potencial de detectar el CGE temprano en poblaciones de alto riesgo antes del diagnóstico clínico.

Sensibilidad del modelo de CGE en la detección de pacientes con DGE

Dado que aproximadamente el 70%–85% de los pacientes con DGE progresarán a CGE, evaluamos aún más el rendimiento del modelo de CGE en la detección de pacientes con DGE. Como se muestra en la Figura 6A, nuestros datos indicaron que la puntuación de CGE de los pacientes con DGE fue significativamente más alta que la de los controles sanos y los pacientes con DGE en la cohorte de validación combinada (todos p < 0,001). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa entre los grupos de DGE y CGE (p > 0,05). Como se muestra en la Figura 6B, la puntuación de CGE exhibió valores de AUC superiores de 0,9290, 0,9378 y 0,9141 al distinguir a los pacientes con DGE (n = 72) de aquellos sin CGE (n = 454), controles sanos (n = 285) y pacientes con DGE (n = 169). Además, la sensibilidad de nuestro modelo de CGE en el valor de corte de 0,5020 fue superior a la de los biomarcadores séricos en la detección de pacientes con DGE (83,10% frente a 25,00%; Figura 6C). En conjunto, estos resultados demuestran que el modelo de CGE proporciona una alta sensibilidad y discriminación para la detección de DGE, una lesión preinvasiva crítica con un alto riesgo de progresión, lo que destaca su potencial para la intercepción temprana de la carcinogénesis gástrica.

Especificidad del modelo de CGE

Para evaluar la especificidad del modelo GD frente a condiciones clínicamente relevantes evaluadas en el diagnóstico diferencial del CGE, analizamos su rendimiento utilizando muestras de plasma de pacientes con otros cánceres gastrointestinales, incluidos el carcinoma de células escamosas esofágico (CCEE) (n = 60), el adenocarcinoma esofágico (CAE) (n = 20), el CRC (n = 46), el CHC (n = 38) y el adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP) (n = 30). Como se muestra en la Figura 6D, la puntuación GD fue significativamente menor en el grupo de otros cánceres gastrointestinales que en el grupo de CGE (p < 0,001). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los subgrupos de CCEE, CAE, CRC, CHC y ADCP (Figura S17A). El modelo GD demostró una precisión diagnóstica significativamente mayor para el CGE (AUC = 0,9924) que para otros cánceres gastrointestinales (AUC = 0,7477; Figuras 6E y S17B). En el valor de corte de 0,5020, el 70,10% de los casos no CGE se clasificaron correctamente como verdaderos negativos, mientras que el 29,90% fueron falsos positivos (clasificados erróneamente como CGE). Los falsos positivos incluyeron 8 (40,00%), 13 (34,21%), 15 (28,33%), 5 (16,67%) y 17 (17,02%) casos de CAE, CHC, CRC, ADCP y CCEE, respectivamente (Figuras 6F y S17C). En conjunto, estos datos sugieren que el modelo GD tiene una especificidad preferencial para el CGE en comparación con otras neoplasias gastrointestinales, en particular el CCEE. Se justifica una validación adicional en cohortes más amplias para optimizar la especificidad del modelo para los diferentes tipos de cáncer.

Diseño del estudio y características de los participantes

Como se muestra en la Figura 1, se analizaron un total de 1951 muestras de plasma de ocho cohortes, que incluyen la cohorte de entrenamiento (n = 505), la cohorte de validación interna (n = 217), las cohortes de validación externa 1 y 2 (n = 359 y 390, respectivamente), la cohorte de HGD (n = 72), la cohorte de otros cánceres gastrointestinales (n = 194), la cohorte prospectiva (n = 84) y la cohorte china (n = 130). La profundidad de cobertura de la mtADN lograda se resume en las Tablas S3 y S4. Basándose en las características fragmentómicas de la ccf-mtADN, se desarrolló el modelo GD utilizando un algoritmo de aprendizaje automático. También realizamos una evaluación sistemática del modelo. Además, las características clinicopatológicas detalladas (como la edad, el sexo, los niveles de biomarcadores séricos, los estadios tumorales y la ubicación del tumor) de todos los participantes se resumen en las Tablas S1 y S2. Los grupos de control sano (CS), enfermedad gástrica benigna (EGB) y CGE se emparejaron rigurosamente para la edad y el sexo en el momento del reclutamiento. Como se muestra en la Figura S1, no se encontraron diferencias significativas en la edad (todos los p < 0,05) o la distribución por sexo entre los tres grupos en la cohorte de entrenamiento.

Análisis de las características fragmentómicas de la ccf-mtADN en los CS y los pacientes con EGB, HGD o CGE

Para abordar la necesidad crítica de biomarcadores no invasivos que puedan permitir la detección temprana del CGE y la discriminación de sus etapas precancerosas, analizamos exhaustivamente las características fragmentómicas de la ccf-mtADN utilizando datos de NGS basados en la captura. Este análisis abarcó un continuo clínicamente relevante que incluye CS, pacientes con EGB y pacientes con CGE confirmados reclutados del Hospital Xijing. Como se muestra en la Figura 2A, se observó una diferencia significativa entre los grupos de CS, EGB y CGE (p < 0,05). Dado que los fragmentos de ADN derivados del tumor son más cortos, se realizó un análisis agrupado (ventanas de 10 pb) que comparaba el CGE frente a los controles no CGE. Este análisis identificó dos intervalos diferenciales críticos: los fragmentos dentro de los rangos de 70-80 pb (p < 0,05) y 80-90 pb (p < 0,05) mostraron distribuciones significativamente alteradas en los pacientes con CGE en comparación con los controles no CGE (Figura S2). Además, en comparación con los grupos de CS y EGB, el grupo de CGE mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtADN entre 70 y 90 pb (todos los p < 0,05; Figura 2B). Coherente con la mayor heterogeneidad observada en el perfil de fragmentación de la ccf-mtADN del grupo de CGE, encontramos un debilitamiento progresivo de la correlación entre los perfiles de fragmentación de la ccf-mtADN y el perfil medio de los CS desde los CS hasta los grupos de EGB y CGE (todos los p < 0,05; Figuras 2C y 2D). Esto se acompañó de un aumento continuo en el número total de picos y nuevos picos (todos los p < 0,05; Figuras 2E y 2F). Además, se observaron diferencias significativas en la preferencia de la base del extremo 5′ entre los tres grupos (Figura 2G). Específicamente, los pacientes con CGE mostraron una subrepresentación del extremo T y una sobrerrepresentación del extremo C en comparación con los CS. En comparación con los pacientes con EGB, los pacientes con CGE mostraron una sobrerrepresentación del extremo C y una subrepresentación de los extremos A y T (todos los p < 0,05; Figura 2G). Además, en comparación con los grupos de CS y EGB, el grupo de CGE mostró una mayor proporción de fragmentos de ccf-mtADN entre 70 y 90 pb (todos los p < 0,05; Figura 2H), pero no se observó diferencia entre los grupos de CS y EGB.

Luego, analizamos las diferencias en las características fragmentómicas de la ccf-mtADN entre los diferentes subgrupos de pacientes con CGE. Como se muestra en las Figuras S3 y S4, no se observaron diferencias significativas en el tamaño de los fragmentos de ccf-mtADN, los perfiles de fragmentación, la preferencia de la base del extremo 5′ y el MDS del extremo 5′ entre los grupos categorizados por edad y sexo (todos los p > 0,05). Notablemente, el grupo de CGE en estadio avanzado (CGEA) mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtADN entre 70 y 90 pb que el grupo de CGE temprano (CGET), y otras características fragmentómicas de la ccf-mtADN no mostraron diferencias significativas entre los dos grupos (todos los p > 0,05; Figura S5). Estudios previos han demostrado diferencias significativas en las características moleculares entre el cáncer de la unión gastroesofágica (CGEU) y los CGE del cuerpo gástrico no CGEU.^[30] El grupo no CGEU mostró una proporción significativamente mayor de fragmentos de ccf-mtADN entre 70 y 90 pb que el grupo CGEU. Sin embargo, el análisis comparativo de otras características fragmentómicas de la ccf-mtADN no reveló diferencias significativas (todos los p > 0,05; Figura S6). De manera similar, entre los pacientes con CGE estratificados por estadio tumoral o tipo de Lauren, la mayoría de las características fragmentómicas no mostraron diferencias significativas (todos los p > 0,05; Figuras S7 y S8), con la excepción del número de nuevos picos. En conjunto, estos resultados demuestran características fragmentómicas aberrantes de la ccf-mtADN en los pacientes con CGE, lo que destaca su potencial como biomarcador para la detección temprana del CGE.

Construcción y validación del modelo GD

Para abordar la importante brecha en la detección temprana del CGE, desarrollamos un enfoque de detección que utiliza características fragmentómicas aberrantes de la ccf-mtADN. Para determinar el modelo óptimo para la detección del CGE, evaluamos y comparamos sistemáticamente el rendimiento de los seis algoritmos candidatos (Figura S9; consulte Métodos STAR). Como se muestra en la Figura S10, el algoritmo de bosque aleatorio (RF) logró el mayor rendimiento, con un área bajo la curva (AUC) de 0,9784 y un equilibrio óptimo de sensibilidad (90,12%) y especificidad (94,84%) en la cohorte de entrenamiento. En consecuencia, se seleccionó el algoritmo RF para el desarrollo del modelo, y se calculó la puntuación GD, que representa la probabilidad de la presencia de CGE. Las contribuciones de las características resultantes se presentan en la Tabla S5. Como se muestra en la Figura S11, las puntuaciones GD fueron significativamente más altas en los pacientes con CGE que en los pacientes con EGB y CS dentro de la cohorte de entrenamiento. El modelo GD demostró una alta capacidad para distinguir a los pacientes con CGE de los individuos no CGE (que abarcan tanto los grupos de EGB como de CS), con una AUC de 0,9784. En particular, el modelo discriminó eficazmente entre los pacientes con CGE y EGB (AUC = 0,9752) y entre los pacientes con CGE y CS (AUC = 0,9848). Basándose en el índice de Youden, se determinó un valor de corte óptimo de 0,5020. Utilizando la cohorte de entrenamiento, también calculamos los valores de corte para una sensibilidad del 99%, 95% y 90%, respectivamente. Como se muestra en la Figura S12, a medida que se ajustó el umbral de sensibilidad del 99% (valor de corte 0,39) al 95% (valor de corte 0,46) y luego al 90% (valor de corte 0,504), la especificidad para el grupo de CS aumentó del 72,6% (intervalo de confianza del 95% [IC]: 62,3%-81,0%) al 89,3% (IC del 95%: 80,9%-94,3%) y finalmente al 97,6% (IC del 95%: 91,7%-99,3%). Para el grupo de EGB, la especificidad aumentó correspondientemente del 66,7% (IC del 95%: 59,2%-73,4%) al 84,5% (IC del 95%: 78,3%-89,2%) y luego al 93,5% (IC del 95%: 88,7%-96,3%). Para evitar el sobreajuste, se evaluó el rendimiento del modelo GD en la cohorte de validación interna. Los resultados revelaron que los pacientes con CGE mostraron puntuaciones GD significativamente más altas que los controles (Figura 3A), con un excelente rendimiento diagnóstico, una AUC de 0,9855 (IC del 95%: 0,9745-0,9964), una sensibilidad del 93,58% y una especificidad del 93,52% (Figuras 3B y 3C; Tabla S6). Además, el modelo GD mostró valores de AUC de 0,9800 y 0,9964 para discriminar el CGE de EGB (especificidad = 90,28%) y CS (especificidad = 100%). Los indicadores de rendimiento detallados, incluidos el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) con IC del 95% para todas las cohortes de validación, se proporcionan en la Tabla S7.

Para evaluar la generalizabilidad y el potencial en el mundo real del modelo, evaluamos el modelo GD utilizando dos cohortes de validación externa retrospectivas. De manera similar a los hallazgos de la cohorte de validación interna, la puntuación GD mostró un aumento notable de los CS a los pacientes con CGE en ambas cohortes de validación externa (Figuras 3D y 3G). Además, los resultados demostraron la notable capacidad del modelo GD para distinguir a los pacientes con CGE de aquellos sin CGE en las cohortes de validación externa 1 y 2 (AUC = 0,9874 y 0,9889, sensibilidad = 92,50% y 93,85%, y especificidad = 95,40% y 93,85%, respectivamente). Estos resultados indicaron el rendimiento consistentemente alto del modelo GD en las cohortes de entrenamiento, validación interna y validación externa independiente, lo que subraya su sólida generalizabilidad y preparación para una mayor evaluación clínica.

Análisis de subgrupos para el rendimiento del modelo GD

Para establecer la utilidad clínica y la solidez de nuestro modelo en diversas poblaciones de pacientes y presentaciones de la enfermedad, realizamos análisis exhaustivos de los subgrupos estratificados por factores demográficos y clinicopatológicos clave en las cohortes de validación combinadas. Específicamente, analizamos el rendimiento de la detección para los pacientes con CGE en diferentes estadios, que fue nuestro principal objetivo. Como se muestra en la Figura 4A, la puntuación GD, la AUC y la sensibilidad aumentaron progresivamente con el avance del estadio tumoral. Específicamente, en los pacientes con CGE en estadio I (n = 90), el modelo demostró una AUC de 0,9808 y una sensibilidad del 90,68% al distinguir entre CGE y no CGE (CS y EGB). En los grupos de CGEU y no CGEU, el modelo GD exhibió un excelente rendimiento, logrando valores de AUC altos de 0,9851 y 0,9833, respectivamente, y valores de sensibilidad altos de 91,03% y 93,24%, respectivamente (Figura 4B). Es importante destacar que el análisis adicional reveló que no hubo diferencias significativas en las puntuaciones GD entre todos los grupos de grados o tipos de Lauren (todos los p > 0,05). En esencia, el modelo mantuvo un rendimiento alto en todos los subgrupos, incluidos los diferentes estadios tumorales, las ubicaciones tumorales, los grados tumorales y los tipos de Lauren (Figuras 4C y 4D). Por lo tanto, nuestro modelo demostró una solidez inquebrantable en todos los subgrupos, con una excelente capacidad de detección para el CGET. Esto respaldó su fiabilidad en diversos escenarios de despliegue clínico.

Para evaluar el modelo GD en comparación con métodos no invasivos establecidos y evaluar la posible sinergia diagnóstica mediante la integración, comparamos su rendimiento con el de los biomarcadores séricos (CEA, CA19-9 y CA72-4) y analizamos posteriormente su utilidad combinada (Figura S13A). Como se muestra en la Figura S13B, la puntuación GD exhibió una mayor sensibilidad que los biomarcadores séricos (93,31% frente a 40,11%, p < 0,001). Notablemente, la integración de la puntuación GD con los biomarcadores séricos solo mejoró ligeramente la sensibilidad (94,43%). Evaluamos además el VPP y el VPN para abordar necesidades clínicas críticas en el contexto del GD. Como se muestra en la Figura S13C, la integración de la puntuación GD con los biomarcadores séricos logró un VPN comparable al de la puntuación GD por sí sola. Sin embargo, solo la puntuación GD independiente mostró el VPP más alto. Para evaluar aún más el valor diagnóstico complementario de nuestro enfoque, evaluamos el rendimiento del modelo GD en pacientes con GC que eran positivos o negativos para los biomarcadores séricos. En las cohortes de validación combinadas, el modelo GD identificó con éxito el 89,77% (193/215) de los pacientes con GC que dieron negativo en todos los biomarcadores séricos (Figura S13D). Esto demuestra su potente capacidad para detectar cánceres que pasarían desapercibidos con las pruebas serológicas estándar. Estos hallazgos, en conjunto, indican que la combinación de la puntuación GD con los biomarcadores optimiza la sensibilidad general y el VPN, mientras que la puntuación GD independiente representa la herramienta clínicamente más eficiente para minimizar los procedimientos invasivos innecesarios debido a su superior VPP.

Para posicionar el modelo GD en relación con el estado actual del arte, evaluamos su rendimiento diagnóstico en comparación con cinco métodos establecidos para la detección de GC (Figura S14A). Notablemente, el modelo GD demostró el AUC, la sensibilidad y la especificidad más altos entre todos los enfoques evaluados (Figuras S14B y S14C). En conjunto, estos hallazgos destacan la notable superioridad del modelo GD sobre la mayoría de los métodos actuales en la obtención de una alta precisión en la detección de GC.

Para evaluar directamente la generalizabilidad de nuestro modelo en diferentes poblaciones, lo validamos en una cohorte independiente de 130 individuos uigures y kazajos, una población con una composición genética distinta de la cohorte principal de chinos han. En la cohorte de minoría china, el modelo mantuvo un buen rendimiento, logrando un AUC de 0,9841 (IC del 95%: 0,9695–0,9988), una sensibilidad del 83,33% (IC del 95%: 72,57%–90,43%) y una especificidad del 96,88% (IC del 95%: 89,30%–99,44%) para discriminar el GC del no-GC (Figura S15). Este resultado fue muy consistente con el rendimiento observado en las cohortes de chinos han, lo que proporciona evidencia preliminar de la robustez de nuestro enfoque en diversos orígenes genéticos.

Rendimiento del modelo GD en una cohorte prospectiva

Se utilizó una cohorte prospectiva de 84 muestras para evaluar si el modelo GD detecta el GC en estadio temprano antes del diagnóstico clínico. El modelo GD reveló una puntuación GD significativamente más alta en los pacientes que desarrollaron GC en comparación con aquellos que no lo hicieron antes del diagnóstico clínico, con un AUC de 0,9087, una sensibilidad del 76,19% y una especificidad del 88,10% (p < 0,001; Figuras 5A, 5B, S16A y S16B). En el valor de corte de 0,5020, el modelo GD identificó el 85,71% (IC de bootstrap del 95%: 64,29%–100,00%), el 75,00% (IC de bootstrap del 95%: 55,00%–90,00%) y el 62,50% (IC de bootstrap del 95%: 25,00%–87,50%) de los pacientes con GC dentro de 3 años antes del diagnóstico clínico, respectivamente (Figura 5C; Tabla S8). Estos hallazgos exploratorios, que generan hipótesis, sugieren el potencial para la detección preclínica, pero requieren validación en cohortes prospectivas más grandes. Además, la sensibilidad del modelo GD para el GD preclínico mantuvo la tendencia creciente a lo largo de los intervalos de tiempo de >3 años a 3 años: AUC = 0,8906; Figura S16C). El análisis de la curva de decisión reveló que el beneficio neto del modelo superó ambas líneas de referencia (línea azul, estrategia de tratar a todos; línea verde, estrategia de no tratar a nadie) cuando el umbral de riesgo osciló entre el 5% y el 20%, lo que indica que el uso del modelo para guiar las decisiones de endoscopia dentro de este rango produjo beneficios clínicos (Figura 5E). Para evaluar aún más la capacidad del modelo para identificar las firmas moleculares tempranas antes de las manifestaciones clínicas, realizamos un análisis longitudinal de muestras de plasma emparejadas obtenidas de pacientes con GC (n = 8) en el momento del diagnóstico y antes del diagnóstico. Este diseño evalúa específicamente si el modelo GD puede detectar la transformación maligna incipiente durante la ventana prediagnóstica clínicamente silenciosa. En un análisis retrospectivo de las muestras de plasma prediagnósticas, el modelo GD no detectó señales malignas en dos de los ocho pacientes con GC. Notablemente, como se muestra en la Figura 5F, uno de los dos casos que inicialmente no se detectaron se volvió GD-positivo en el momento del diagnóstico clínico (Paciente 3), mientras que el otro permaneció indetectable durante todo el período de observación (Paciente 8). En conclusión, estos hallazgos exploratorios sugieren que nuestro modelo tiene el potencial de detectar el GC en estadio temprano en poblaciones de alto riesgo antes del diagnóstico clínico.

Sensibilidad del modelo GD en la detección de pacientes con HGD

Dado que aproximadamente el 70%–85% de los pacientes con HGD progresarán a GC, evaluamos aún más el rendimiento del modelo GD en la detección de pacientes con HGD. Como se muestra en la Figura 6A, nuestros datos indicaron que la puntuación GD de los pacientes con HGD fue significativamente más alta que la de los controles sanos y los pacientes con BGD en la cohorte de validación combinada (todos p < 0,001). Sin embargo, no se observó una diferencia significativa entre los grupos de HGD y GC (p > 0,05). Como se muestra en la Figura 6B, la puntuación GD exhibió valores de AUC superiores de 0,9290, 0,9378 y 0,9141 al distinguir a los pacientes con HGD (n = 72) de aquellos sin GC (n = 454), controles sanos (n = 285) y pacientes con BGD (n = 169). Además, la sensibilidad de nuestro modelo GD en el valor de corte de 0,5020 fue superior a la de los biomarcadores séricos en la detección de pacientes con HGD (83,10% frente a 25,00%; Figura 6C). En conjunto, estos resultados demuestran que el modelo GD proporciona una alta sensibilidad y discriminación para la detección de HGD, una lesión preinvasiva crítica con un alto riesgo de progresión, lo que destaca su potencial para la intercepción temprana de la carcinogénesis gástrica.

Especificidad del modelo GD

Para evaluar la especificidad del modelo GD frente a afecciones clínicamente relevantes evaluadas en el diagnóstico diferencial del GC, evaluamos su rendimiento utilizando muestras de plasma de pacientes con otros cánceres gastrointestinales, incluido el carcinoma de células escamosas esofágico (CCEE) (n = 60), el adenocarcinoma esofágico (CAE) (n = 20), el CCRC (n = 46), el CHC (n = 38) y el adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP) (n = 30). Como se muestra en la Figura 6D, la puntuación GD fue significativamente más baja en el grupo de otros cánceres gastrointestinales que en el grupo de GC (p < 0,001). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los subgrupos de CCEE, CAE, CCRC, CHC y ADCP (Figura S17A). El modelo GD demostró una precisión diagnóstica significativamente mayor para el GC (AUC = 0,9924) que para otros cánceres gastrointestinales (AUC = 0,7477; Figuras 6E y S17B). En el valor de corte de 0,5020, el 70,10% de los casos de no-GC se clasificaron correctamente como verdaderos negativos, mientras que el 29,90% fueron falsos positivos (clasificados erróneamente como GC). Los falsos positivos incluyeron 8 (40,00%), 13 (34,21%), 15 (28,33%), 5 (16,67%) y 17 (17,02%) casos de CAE, CHC, CCRC, ADCP y CCEE, respectivamente (Figuras 6F y S17C). En conjunto, estos datos sugieren que el modelo GD tiene una especificidad preferencial para el GC sobre otras neoplasias gastrointestinales, en particular el CCEE. Se justifica una validación adicional en cohortes más grandes para optimizar la especificidad del modelo para los tipos de cáncer individuales.

Discusión

Este estudio caracteriza de manera integral los perfiles fragmentómicos de ccf-mtDNA en controles sanos, BGD y pacientes con GC. Aprovechando estas características distintas, desarrollamos y validamos un modelo GD. Este modelo distingue con precisión a los pacientes con GC en estadio temprano de los individuos sin cáncer en cohortes de validación internas, externas independientes y prospectivas. Nuestro trabajo demuestra la aplicación pionera y el potencial sustancial de la fragmentómica de ccf-mtDNA para el cribado no invasivo del GC con el fin de mejorar el diagnóstico temprano.

Como se informó anteriormente,^[24] los pacientes con GC presentan características significativamente aberrantes de la fragmentómica de ccf-mtDNA en plasma, independientemente de la edad o el sexo. Nuestro trabajo anterior demostró preliminarmente que la generación del perfil de fragmentación de ccf-mtDNA está asociada con la unión de proteínas al genoma mitocondrial.^[24] Además, propusimos que el estado de la enfermedad puede alterar la actividad de las nucleasas plasmáticas, lo que da como resultado características fragmentómicas distintas de ccf-mtDNA.^[31] Esto apoya nuestra hipótesis de que el cáncer ejerce efectos sistémicos, que potencialmente modulan la unión de proteínas al genoma mitocondrial o el microambiente plasmático, lo que influye en la fragmentómica de ccf-mtDNA. Además de la unión de proteínas y la actividad de las nucleasas, probablemente contribuyen otros factores, como el desequilibrio de la fisión y fusión mitocondrial,^[32] las vías de señalización inducidas por el estrés mecánico que afectan la homeostasis celular,^[33] la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial,^[34] y la desregulación epigenética.^[35],^[36] Notablemente, el aumento significativo de los fragmentos de ccf-mtDNA de 70 a 90 pares de bases en los pacientes con GC sugiere un daño mitocondrial exacerbado. Dado que el ADNmt no es nucleosomal, su fragmentación probablemente refleja el estrés mitocondrial. Proponemos que la alta actividad metabólica y la carga de especies reactivas de oxígeno en el GC causan un daño acumulativo al ADNmt, lo que podría provocar una escisión preferencial en fragmentos de 70 a 90 pares de bases a través de mecanismos como la activación de la endonucleasa G o la ruptura en puntos calientes de daño oxidativo. Este hallazgo subraya el valor de la fragmentómica de ccf-mtDNA para sondear la disfunción mitocondrial asociada con el cáncer. Además, la observación de que los tumores de la unión gastroesofágica (GEJ) albergan menos fragmentos de 70 a 90 pares de bases que los GC no GEJ puede reflejar sus orígenes tisulares distintos, una noción respaldada por la ausencia de asociaciones entre los patrones de fragmentación y la edad, el sexo o la clasificación de Lauren. Se justifica que los estudios futuros confirmen la influencia del origen tumoral en los perfiles de fragmentación de ccf-mtDNA.

En el diagnóstico clínico del GC, el principal desafío no es distinguir a los individuos malignos de los sanos, sino distinguir con precisión los GC de los BGD. Esta tarea se complica aún más por la prevalencia de afecciones premalignas, incluida la metaplasia intestinal y la gastritis atrófica crónica, que dificultan la detección no invasiva del GC en estadio temprano.^[37] Para abordar esto, establecimos el modelo GD basado en la fragmentómica de ccf-mtDNA. A diferencia de los estudios anteriores que utilizaron solo controles sanos,^[5] nuestro modelo se desarrolló y validó en una cohorte clínicamente representativa que incluyó tanto controles sanos como pacientes con BGD. Esta innovación de diseño abordó directamente el dilema diagnóstico central al integrar a los pacientes con BGD en una cohorte de control para aislar las firmas fragmentómicas específicas del cáncer y, al mismo tiempo, filtrar el ruido patológico benigno. Los resultados demuestran una excepcional potencia discriminatoria para el GC en estadio temprano frente al BGD (AUC >0,89), lo que reduce significativamente los falsos positivos de lesiones benignas que provocan innecesariamente endoscopias. Clínicamente, esto permitiría un triaje preciso a través de la estratificación cuantitativa del riesgo: los pacientes de bajo riesgo pueden evitar de forma segura las biopsias endoscópicas, mientras que los individuos de alto riesgo pueden recibir una confirmación invasiva prioritaria, optimizando así la asignación de recursos clínicos. En la implementación clínica futura, este ensayo podría servir como una herramienta de triaje para priorizar a los individuos de alto riesgo para la evaluación endoscópica y, al mismo tiempo, retrasar de forma segura los procedimientos invasivos en los pacientes de bajo riesgo, lo que mejoraría la eficiencia y la rentabilidad de los programas de detección del GC.

Para posicionar el modelo GD en relación con el estado actual del arte, evaluamos su rendimiento diagnóstico en comparación con cinco métodos establecidos para la detección de GC (Figura S14A). Notablemente, el modelo GD demostró el AUC, la sensibilidad y la especificidad más altos entre todos los enfoques evaluados (Figuras S14B y S14C). En conjunto, estos hallazgos destacan la notable superioridad del modelo GD sobre la mayoría de los métodos actuales en la obtención de una alta precisión en la detección de GC.

Para evaluar directamente la generalizabilidad de nuestro modelo en diferentes poblaciones, lo validamos en una cohorte independiente de 130 individuos uigures y kazajos, una población con una composición genética distinta de la cohorte principal de chinos han. En la cohorte de minoría china, el modelo mantuvo un buen rendimiento, logrando un AUC de 0,9841 (IC del 95%: 0,9695–0,9988), una sensibilidad del 83,33% (IC del 95%: 72,57%–90,43%) y una especificidad del 96,88% (IC del 95%: 89,30%–99,44%) para discriminar el GC del no-GC (Figura S15). Este resultado fue muy consistente con el rendimiento observado en las cohortes de chinos han, lo que proporciona evidencia preliminar de la robustez de nuestro enfoque en diversos orígenes genéticos.

Rendimiento del modelo GD en una cohorte prospectiva

Se utilizó una cohorte prospectiva de 84 muestras para evaluar si el modelo GD detecta el GC en estadio temprano antes del diagnóstico clínico. El modelo GD reveló una puntuación GD significativamente más alta en los pacientes que desarrollaron GC en comparación con aquellos que no lo hicieron antes del diagnóstico clínico, con un AUC de 0,9087, una sensibilidad del 76,19% y una especificidad del 88,10% (p < 0,001; Figuras 5A, 5B, S16A y S16B). En el valor de corte de 0,5020, el modelo GD identificó el 85,71% (IC de bootstrap del 95%: 64,29%–100,00%), el 75,00% (IC de bootstrap del 95%: 55,00%–90,00%) y el 62,50% (IC de bootstrap del 95%: 25,00%–87,50%) de los pacientes con GC dentro de 3 años antes del diagnóstico clínico, respectivamente (Figura 5C; Tabla S8). Estos hallazgos exploratorios, que generan hipótesis, sugieren el potencial para la detección preclínica, pero requieren validación en cohortes prospectivas más grandes. Además, la sensibilidad del modelo GD para el GD preclínico mantuvo la tendencia creciente a lo largo de los intervalos de tiempo de >3 años a 3 años: AUC = 0,8906; Figura S16C). El análisis de la curva de decisión reveló que el beneficio neto del modelo superó ambas líneas de referencia (línea azul, estrategia de tratar a todos; línea verde, estrategia de no tratar a nadie) cuando el umbral de riesgo osciló entre el 5% y el 20%, lo que indica que el uso del modelo para guiar las decisiones de endoscopia dentro de este rango produjo beneficios clínicos (Figura 5E). Para evaluar aún más la capacidad del modelo para identificar las firmas moleculares tempranas antes de las manifestaciones clínicas, realizamos un análisis longitudinal de muestras de plasma emparejadas obtenidas de pacientes con GC (n = 8) en el momento del diagnóstico y antes del diagnóstico. Este diseño evalúa específicamente si el modelo GD puede detectar la transformación maligna incipiente durante la ventana prediagnóstica clínicamente silenciosa. En un análisis retrospectivo de las muestras de plasma prediagnósticas, el modelo GD no detectó señales malignas en dos de los ocho pacientes con GC. Notablemente, como se muestra en la Figura 5F, uno de los dos casos que inicialmente no se detectaron se volvió GD-positivo en el momento del diagnóstico clínico (Paciente 3), mientras que el otro permaneció indetectable durante todo el período de observación (Paciente 8). En conclusión, estos hallazgos exploratorios sugieren que nuestro modelo tiene el potencial de detectar el GC en estadio temprano en poblaciones de alto riesgo antes del diagnóstico clínico.

Sensibilidad del modelo GD en la detección de pacientes con HGD

Dado que aproximadamente el 70%–85% de los pacientes con HGD progresarán a GC, evaluamos aún más el rendimiento del modelo GD en la detección de pacientes con HGD. Como se muestra en la Figura 6A, nuestros datos indicaron que la puntuación GD de los pacientes con HGD fue significativamente más alta que la de los controles sanos y los pacientes con BGD en la cohorte de validación combinada (todos p < 0,001). Sin embargo, no se observó una diferencia significativa entre los grupos de HGD y GC (p > 0,05). Como se muestra en la Figura 6B, la puntuación GD exhibió valores de AUC superiores de 0,9290, 0,9378 y 0,9141 al distinguir a los pacientes con HGD (n = 72) de aquellos sin GC (n = 454), controles sanos (n = 285) y pacientes con BGD (n = 169). Además, la sensibilidad de nuestro modelo GD en el valor de corte de 0,5020 fue superior a la de los biomarcadores séricos en la detección de pacientes con HGD (83,10% frente a 25,00%; Figura 6C). En conjunto, estos resultados demuestran que el modelo GD proporciona una alta sensibilidad y discriminación para la detección de HGD, una lesión preinvasiva crítica con un alto riesgo de progresión, lo que destaca su potencial para la intercepción temprana de la carcinogénesis gástrica.

Especificidad del modelo GD

Para evaluar la especificidad del modelo GD frente a afecciones clínicamente relevantes evaluadas en el diagnóstico diferencial del GC, evaluamos su rendimiento utilizando muestras de plasma de pacientes con otros cánceres gastrointestinales, incluido

Nuestro estudio empleó aprendizaje automático interpretable (RF), priorizando su aplicabilidad clínica. El modelo resultante logró un rendimiento discriminatorio excepcional (AUC > 0,97) en los conjuntos de entrenamiento, validación interna y dos cohortes externas, superando significativamente a los biomarcadores séricos. Sin embargo, reconocemos que el CEA, el CA19-9 y el CA72-4 no son específicos del CGE y se elevan en múltiples neoplasias. Por lo tanto, superar a estos marcadores por sí solo no establece una detección específica del CGE. Se justifican estudios futuros que incorporen paneles más amplios de neoplasias no CGE para definir de manera definitiva el perfil de especificidad tisular de nuestro enfoque basado en la fragmentómica. Su sensibilidad transformadora (>90%) para la detección del CGE temprano aborda las limitaciones de los métodos actuales: la endoscopia enfrenta barreras de accesibilidad, mientras que las biopsias líquidas basadas en mutaciones de ctDNA tienen dificultades con la baja fracción tumoral en el CGE. Amplios análisis de subgrupos confirmaron una robusta generalizabilidad, con un rendimiento estable en las estratificaciones clínicamente relevantes, lo que demuestra su resistencia a los factores de confusión y su amplia aplicabilidad. El robusto rendimiento de nuestros modelos GD en la cohorte minoritaria china valida su generalizabilidad y respalda su potencial aplicabilidad a otros grupos de población nacionales. Si bien actualmente es más costoso que las pruebas de biomarcadores séricos, nuestro ensayo de secuenciación basado en captura demuestra una mayor precisión para la detección temprana del CGE, lo que justifica su aplicación clínica. La rápida disminución de los costos de secuenciación, los flujos de trabajo automatizados y los paneles optimizados mejorarán la escalabilidad y la rentabilidad en el futuro. Proponemos su integración como herramienta de triaje dentro de los programas de detección estratificados para guiar la derivación endoscópica en poblaciones de alto riesgo, mejorando la eficiencia y la accesibilidad de la detección temprana.

La validación prospectiva estableció la validez clínica de nuestro modelo de detección de CGE. El modelo GD detectó señales de CGE antes del diagnóstico clínico, logrando una sensibilidad del 75,00% de 2 a 3 años antes del diagnóstico, que aumentó al 85,71% en un plazo de 2 años. Esto destaca su capacidad para predecir el CGE en individuos asintomáticos. El aumento de las puntuaciones GD que se acercan al diagnóstico indica que los cambios en el ccf-mtDNA preceden a la morfología tumoral. El análisis de la curva de decisión confirmó una utilidad clínica significativa: el uso del modelo GD dentro del umbral de riesgo del 5% al 20% para las decisiones de endoscopia produjo un beneficio neto. El seguimiento longitudinal mostró que el modelo rastreó la evolución maligna en la mayoría (6/8) de los casos. Estos resultados sugieren que nuestro enfoque es una prometedora estrategia de detección preclínica del CGE, lo que justifica los ensayos prospectivos para validar la reducción de la mortalidad y explorar una aplicación más amplia. Aunque nuestro seguimiento longitudinal en un subconjunto de pacientes reveló patrones intrigantes de fluctuación de la puntuación GD en el momento del diagnóstico, este análisis se realizó en un tamaño de muestra muy pequeño (n = 8). Por lo tanto, estos hallazgos preliminares no pueden respaldar conclusiones definitivas con respecto a la utilidad del modelo para el seguimiento de la respuesta al tratamiento o la recurrencia temprana. Se necesitan urgentemente estudios prospectivos más amplios con muestreos seriados para validar estas observaciones iniciales.

También debe tenerse en cuenta que las estimaciones de sensibilidad dependientes del tiempo en nuestra cohorte prospectiva, aunque alentadoras, se basan en tamaños de muestra relativamente pequeños después de la estratificación por tiempo hasta el diagnóstico. Los amplios intervalos de confianza del 95%, especialmente para la ventana de >3 años (25,00%–87,50%), resaltan la incertidumbre inherente a estas estimaciones puntuales. Por lo tanto, estos hallazgos deben considerarse exploratorios y generadores de hipótesis, lo que subraya la necesidad de estudios prospectivos más amplios con un seguimiento prolongado para cuantificar con precisión la capacidad de detección preclínica del modelo.

Una de las principales fortalezas de nuestro modelo es su capacidad para detectar lesiones gástricas precancerosas, en particular la HGD, un precursor neoplásico crítico con un alto potencial maligno que con frecuencia progresa a carcinoma invasivo.^[38] El modelo identifica estos precursores de alto riesgo con una precisión sustancial (sensibilidad = 83,10%), lo que permite una estratificación de riesgos más temprana, una vigilancia dirigida y, potencialmente, intervenciones preventivas para interceptar la carcinogénesis antes de que se desarrolle el carcinoma invasivo. Los estudios futuros que incluyan cohortes específicas de HGD no solo pueden refinar los umbrales de detección actuales, sino también permitir el desarrollo de modelos de predicción de HGD dedicados.

Para abordar las lagunas críticas en el desarrollo de la biopsia líquida y los riesgos de reactividad cruzada con neoplasias molecularmente relacionadas, evaluamos la especificidad del modelo frente a cinco de los cánceres gastrointestinales más prevalentes (CECG, EAC, HCC, CRC, PDAC) utilizando 194 casos confirmados histológicamente. Esto aborda directamente las preocupaciones traslacionales sobre las señales falsas positivas derivadas de alteraciones moleculares compartidas. A diferencia de los métodos que se basan en comparaciones pre-/postratamiento, nuestro análisis excluyó intencionalmente los datos pareados debido a la justificación biológica de que las características fragmentómicas reflejan cambios sistémicos asociados con el cáncer en la liberación y la dinámica de procesamiento del cfDNA.^[28] En consecuencia, el uso de muestras postratamiento (en las que las señales derivadas del tumor pueden disminuir o estar ausentes) inflaría artificialmente las estimaciones de especificidad y representaría erróneamente la verdadera capacidad discriminatoria del modelo en un entorno de diagnóstico. Cabe destacar que el EAC exhibió la especificidad más baja, probablemente debido a los orígenes embriológicos compartidos con el CGE y a la proximidad anatómica del esófago/estómago, lo que provoca la superposición de las características fragmentómicas del cfDNA. Por el contrario, el CECG logró la especificidad más alta debido a su divergencia histológica como carcinoma de células escamosas, presentando perfiles genómicos/fragmentómicos distintos en comparación con las neoplasias gastrointestinales glandulares. El modelo mantuvo una especificidad general del 72,93% para estos factores de confusión biológicamente similares. Cabe destacar que los cánceres gastrointestinales proximales (EAC) mostraron tasas de falsos positivos más altas que las neoplasias distales (CRC/PDAC), lo que proporciona una justificación biológica para el desarrollo de un clasificador del origen tumoral del tracto gastrointestinal. Esta observación sugiere que la firma fragmentómica puede reflejar un estado más amplio de "transformación adenomatosa del tracto gastrointestinal superior" en lugar de una estricta especificidad de órgano, capturando procesos biológicos comunes en los tejidos adyacentes. Estas observaciones no solo validan la plausibilidad biológica de nuestro enfoque fragmentómico, sino que también proporcionan una justificación convincente para el desarrollo de un clasificador de origen tumoral de próxima generación capaz de rastrear la fuente de los tejidos en las neoplasias gastrointestinales.

En resumen, la fragmentómica del ccf-mtDNA muestra ser prometedora como un enfoque pionero para la detección no invasiva del CGE y la detección temprana de lesiones premalignas. El desarrollo de métodos de perfilado rentables y la integración multiómica serán fundamentales para traducir estos hallazgos en la práctica clínica con el fin de reducir la morbilidad y la mortalidad por CGE a través de intervenciones preventivas. Además de permitir la detección temprana, nuestro enfoque de fragmentómica del ccf-mtDNA puede permitir el seguimiento longitudinal de la evolución fragmentómica en condiciones premalignas para la estratificación del riesgo de progresión, lo que podría identificar los puntos de inflexión moleculares antes de la aparición de la malignidad. Además, el seguimiento de los cambios fragmentómicos dinámicos durante la terapia podría proporcionar indicadores tempranos de resistencia semanas antes de la progresión clínica, lo que abriría vías transformadoras para las estrategias de tratamiento adaptativas.

Limitaciones del estudio

Se deben considerar varias limitaciones. Todos los participantes fueron reclutados de un solo centro en China, y se necesita una validación multicéntrica adicional en poblaciones geográficas y étnicas más diversas para fortalecer la generalizabilidad de nuestros hallazgos. La cohorte prospectiva fue relativamente pequeña, y los amplios intervalos de confianza en los análisis estratificados por tiempo significan que los resultados de la detección preclínica siguen siendo exploratorios y requieren confirmación en estudios longitudinales más amplios y a largo plazo. Si bien el modelo GD exhibió una alta especificidad para el CGE frente a otras neoplasias gastrointestinales, se observaron tasas de falsos positivos notables en el EAC, lo que indica la necesidad de una mayor optimización para mejorar la discriminación específica del órgano. Los mecanismos moleculares precisos que subyacen a los patrones aberrantes de fragmentación del ccf-mtDNA en la carcinogénesis gástrica, incluidos las nucleasas y las vías reguladoras relevantes, aún deben dilucidarse por completo. El pequeño número de muestras longitudinales pareadas restringe las conclusiones con respecto a la utilidad de este modelo para el seguimiento de la progresión de la enfermedad o la respuesta al tratamiento. Además, el enfoque de secuenciación basado en captura es relativamente costoso en comparación con los biomarcadores séricos de rutina, y se necesitan plataformas más económicas para respaldar la aplicación clínica a gran escala.

Limitaciones del estudio

Se deben considerar varias limitaciones. Todos los participantes fueron reclutados de un solo centro en China, y se necesita una validación multicéntrica adicional en poblaciones geográficas y étnicas más diversas para fortalecer la generalizabilidad de nuestros hallazgos. La cohorte prospectiva fue relativamente pequeña, y los amplios intervalos de confianza en los análisis estratificados por tiempo significan que los resultados de la detección preclínica siguen siendo exploratorios y requieren confirmación en estudios longitudinales más amplios y a largo plazo. Si bien el modelo GD exhibió una alta especificidad para el CGE frente a otras neoplasias gastrointestinales, se observaron tasas de falsos positivos notables en el EAC, lo que indica la necesidad de una mayor optimización para mejorar la discriminación específica del órgano. Los mecanismos moleculares precisos que subyacen a los patrones aberrantes de fragmentación del ccf-mtDNA en la carcinogénesis gástrica, incluidos las nucleasas y las vías reguladoras relevantes, aún deben dilucidarse por completo. El pequeño número de muestras longitudinales pareadas restringe las conclusiones con respecto a la utilidad de este modelo para el seguimiento de la progresión de la enfermedad o la respuesta al tratamiento. Además, el enfoque de secuenciación basado en captura es relativamente costoso en comparación con los biomarcadores séricos de rutina, y se necesitan plataformas más económicas para respaldar la aplicación clínica a gran escala.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, comuníquese con el contacto principal, Jinliang Xing (xingjl@fmmu.edu.cn), quien atenderá y cumplirá con las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de fragmentómica de mtDNA procesados se han depositado en ArrayExpress como ArrayExpress: E-MTAB-16905 y están disponibles públicamente a partir de la fecha de publicación. El conjunto de datos se puede acceder directamente a través de https://doi.org/10.6019/E-MTAB-16905.

•Todo el código original utilizado para los análisis y visualizaciones en este estudio se ha depositado en Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.19329293 y está disponible públicamente a partir de la fecha de publicación.

•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible en el contacto principal a pedido.

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, comuníquese con el contacto principal, Jinliang Xing (xingjl@fmmu.edu.cn), quien atenderá y cumplirá con las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de fragmentómica de mtDNA procesados se han depositado en ArrayExpress como ArrayExpress: E-MTAB-16905 y están disponibles públicamente a partir de la fecha de publicación. El conjunto de datos se puede acceder directamente a través de https://doi.org/10.6019/E-MTAB-16905.

•Todo el código original utilizado para los análisis y visualizaciones en este estudio se ha depositado en Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.19329293 y está disponible públicamente a partir de la fecha de publicación.

•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible en el contacto principal a pedido.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 82330073, 82402731, 82273704, 82202837 y 82020108023) (10.13039/501100001809), el Plan de Ascenso de la Autoridad de Hospitales de Beijing (DFL20241102), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2024M760152) (10.13039/501100002858), el Programa de Becas Postdoctorales de CPSF (GZB20250192), el Proyecto Nacional de Ciencia y Tecnología para Enfermedades Crónicas No Transmisibles (2023ZD0501400 y 2025ZD0545200) y el Centro de Investigación Clínica Médica para el Cáncer Gástrico en la Ciudad de Wuwei (2023LC5011).

Contribuciones de los autores

J.X., Yang Liu y Y.N. concibieron y diseñaron el proyecto. M.D., S.W., H.Z., W.L., L.L., Yue Liu, H.J., W.Y., F.P., H.X., X.G., F.L., K.D. y R.L. realizaron la selección de pacientes, la recolección de muestras y datos clínicos, y el secuenciamiento de ADNmt. M.D., S.W., H.Z., H.J. y Yue Liu analizaron los datos de secuenciamiento. M.D., S.W., H.Z., J.X., Yang Liu y Y.N. redactaron el manuscrito. Todos los coautores revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito. J.X., Yang Liu y Y.N. actuaron como garantes.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Inclusión de participantes

Entre enero de 2024 y abril de 2025, se reclutaron participantes de cohortes retrospectivas de los hospitales Xijing y Tangdu de la Cuarta Universidad Militar Médica (FMMU) y del Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) edad entre 18 y 85 años; (2) los sujetos del grupo de cáncer gástrico (CG)/displasia de alto grado (DHG) fueron diagnosticados patológicamente con adenocarcinoma gástrico/DHG, respectivamente; (3) los sujetos del grupo de enfermedad benigna gástrica (EBG) fueron diagnosticados según los hallazgos endoscópicos e histopatológicos, de acuerdo con los criterios de diagnóstico pertinentes descritos en las guías de la Sociedad Americana de Endoscopia Gastrointestinal/Sociedad Europea de Endoscopia Gastrointestinal (ASGE/ESGE), y no tenían antecedentes de cáncer; (4) los sujetos del grupo de otros cánceres gastrointestinales fueron diagnosticados patológicamente con carcinoma de células escamosas esofágico (CCEE), adenocarcinoma esofágico (CAE), cáncer colorrectal (CCR), carcinoma hepatocelular (CHC) o adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP); (5) los controles sanos no presentaban evidencia de cáncer o anomalías gástricas, según lo confirmado por el examen físico, la gastroscopia, los marcadores tumorales séricos normales, la ausencia de antecedentes familiares de cáncer y un período de seguimiento de 6 meses sin anomalías; (6) los sujetos estaban dispuestos a cooperar con este estudio y proporcionaron muestras de sangre periférica según lo requerido. Los controles (CS y EBG) se emparejaron por edad y sexo en una proporción de 1:1 con los casos de cáncer gástrico utilizando el algoritmo de vecino más cercano (paquete R MatchIt). Se excluyeron los participantes si cumplían alguno de los siguientes criterios: (1) sangrado gastrointestinal activo en los últimos 3 meses; (2) uso regular de antiinflamatorios no esteroideos (AINE) con una dosis acumulada de ≥30 dosis diarias definidas en los últimos 3 meses; (3) antecedentes de gastrectomía parcial o total; (4) neoplasias concomitantes en otros sistemas, enfermedades sistémicas crónicas significativas o enfermedades infecciosas graves.

Además, en dos regiones de alta incidencia de CG en China: el condado de Linqu, provincia de Shandong (junio de 2019 a junio de 2022) y la ciudad de Wuwei, provincia de Gansu (marzo de 2019 a julio de 2021), se incluyeron un total de 84 individuos en un estudio de casos y controles anidados prospectivo en el marco del Programa Nacional de Detección Temprana del Cáncer del Tracto Gastrointestinal Superior (UGCED). En el momento de la inclusión, todos los participantes se sometieron a una gastroscopia con biopsia para la evaluación histopatológica de las lesiones gástricas basales. Aquellos que presentaban lesiones precancerosas (gastritis atrófica crónica o metaplasia intestinal) se consideraron con un mayor riesgo de progresión a CG y, por lo tanto, constituyeron la cohorte de riesgo. Todos los participantes proporcionaron muestras de sangre para el análisis de ccf-ADNmt en el momento de la inclusión y se les realizó un seguimiento prospectivo. Durante el seguimiento, 34 participantes de Linqu (mediana de 29 meses) y 8 de Wuwei (mediana de 31 meses) desarrollaron CG incidente. Tras la finalización del seguimiento, para controlar posibles factores de confusión al tiempo que se preservaba la naturaleza prospectiva de la medición de la exposición, cada caso se emparejó 1:1 con un control libre de cáncer de la misma cohorte en función de la edad, el sexo, las lesiones histológicas basales y la duración del seguimiento. Los 34 controles emparejados de Linqu fueron diagnosticados en la línea de base con gastritis atrófica crónica y/o metaplasia intestinal y permanecieron libres de cáncer durante el seguimiento; de manera similar, se seleccionaron 8 controles emparejados de la cohorte de Wuwei.

Además, se recolectó una cohorte china minoritaria de etnias uigur y kazaja del Hospital Oncológico Afiliado a la Universidad Médica de Xinjiang (julio de 2025 a septiembre de 2025), Urumqi, China.

Los tumores se clasificaron según la novena edición del sistema de estadificación TNM del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC). El CG temprano (CGE) se definió como CG en estadio I o II, y el CG avanzado (CGA) se definió como CG en estadio III o IV. Según la clasificación de la OMS de 2019, el adenocarcinoma de la unión esofagogástrica (AEG) incluye tumores centrados a 5 cm proximal o distal de la línea Z. Los tumores se clasificaron en grupos GEJ (adenocarcinomas Siewert II/III ≤5 cm distal a la línea Z) y no GEJ (adenocarcinomas gástricos >5 cm distal a la línea Z en el fondo, el cuerpo o el antro) en función de la ubicación anatómica en relación con la línea Z. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El protocolo del estudio fue aprobado conjuntamente por los comités de ética de todos los centros participantes. Las características demográficas y patológicas de los participantes se presentan en las tablas S1 y S2.

Características de género y edad

En las cohortes principales del estudio (retrospectiva y prospectiva), los participantes tenían una edad media de 61 años (rango de 20 a 89), con predominio de hombres. Las distribuciones de edad y sexo fueron comparables entre los grupos. Las características demográficas y clinicopatológicas detalladas se resumen en las tablas S1 y S2.

Participación del paciente y del público

Debido a la naturaleza retrospectiva de este estudio, que implicó el análisis de muestras de plasma recolectadas longitudinalmente y preexistentes de biobancos multiinstitucionales, no fue apropiado ni posible involucrar a los pacientes o al público en ninguna etapa. En consecuencia, el desarrollo de la pregunta de investigación y las medidas de resultado se basó en la literatura clínica y científica en lugar de en la información directa de los pacientes; los pacientes no participaron en el diseño, la selección o la realización del estudio. Los resultados se difundirán a la comunidad científica en general mediante la publicación, pero no directamente a los donantes originales de las muestras, según lo estipulado por las aprobaciones éticas que rigen el uso de las muestras de los biobancos.

Líneas celulares

No se utilizaron líneas celulares en este estudio.

Modelos animales

No se utilizaron modelos animales en este estudio.

Detalles del método

Recolección de muestras, extracción de ADN, construcción de bibliotecas y secuenciación

En la cohorte retrospectiva, todas las muestras de los participantes se recolectaron antes del inicio del tratamiento. En la cohorte prospectiva, se recolectaron muestras basales de todos los participantes en el momento de la inclusión. Además, se obtuvieron muestras de plasma emparejadas en el momento del diagnóstico clínico del CG para los 8 pacientes con CG identificados de la ciudad de Wuwei. Se recolectaron muestras de sangre periférica (5 mL cada una) de todos los participantes y se recolectaron en tubos K2-EDTA. Dentro de las 2 horas posteriores a la recolección, el plasma se separó utilizando un protocolo estándar de centrifugación en dos pasos y luego se almacenó a -80 °C hasta la extracción de ADN. El ADNcf se extrajo del plasma utilizando un kit de aislamiento de ADNcf circulante VAMNE MagUltra (Vazyme, China), siguiendo el protocolo del fabricante y se cuantificó utilizando Qubit 4.0 (Thermo Fisher, EE. UU.). Posteriormente, se prepararon bibliotecas NGS utilizando 10-20 ng de ADNcf y se hibridaron con sondas de captura de ADNmt biotiniladas hechas a medida que cubren todo el genoma mitocondrial (NC_012920.1), según se detalla en informes anteriores. Las sondas se diseñaron como oligonucleótidos de ARN biotinilados de 120 mer dispuestos en una densidad de 1× en todo el genoma mitocondrial, lo que garantiza un enriquecimiento completo y uniforme de los fragmentos de ADNmt. Finalmente, las bibliotecas de ADNmt capturadas de las muestras de ADNcf se secuenciaron en una plataforma Illumina Novaseq 6000 utilizando PE 150. Quince lotes de la biblioteca de captura de ccf-ADNmt se prepararon para todas las muestras. Cada lote incluyó una combinación de muestras de pacientes con cáncer y participantes sin cáncer.

Para controlar la consistencia entre lotes, se incluyó un estándar de ADNcf combinado derivado de diez individuos sanos en cada lote de secuenciación. Después del secuenciación, los perfiles fragmentómicos de este estándar interno se compararon entre lotes utilizando el análisis de correlación de Pearson para evaluar la reproducibilidad y evaluar los posibles efectos de lote.

Análisis de las características fragmentómicas del ccf-ADNmt

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando Fastp (v0.20.0) para recortar los adaptadores de Illumina y las bases de baja calidad (puntuación de calidad 5 cm distal a la línea Z en el fondo, cuerpo o antro) según su ubicación anatómica en relación con la línea Z. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El protocolo del estudio fue aprobado conjuntamente por los comités de ética de todos los centros participantes. Las características demográficas y patológicas de los participantes se presentan en las tablas S1 y S2.

Características de género y edad

En las principales cohortes del estudio (retrospectiva y prospectiva), los participantes tenían una edad media de 61 años (rango de 20 a 89), con predominio masculino. Las distribuciones de edad y género fueron comparables entre los grupos. Las características demográficas y clinicopatológicas detalladas se resumen en las tablas S1 y S2.

Participación del paciente y del público

Debido a la naturaleza retrospectiva de este estudio, que implicó el análisis de muestras de plasma preexistentes recogidas longitudinalmente de biobancos multiinstitucionales, no fue apropiado ni posible involucrar a pacientes o al público en ninguna etapa. En consecuencia, el desarrollo de la pregunta de investigación y las medidas de resultado se basó en la literatura clínica y científica en lugar de en la información directa de los pacientes; los pacientes no participaron en el diseño, el reclutamiento o la realización del estudio. Los resultados se difundirán a la comunidad científica en general a través de la publicación, pero no directamente a los donantes originales de las muestras, según lo estipulado por las aprobaciones éticas que rigen el uso de las muestras de los biobancos.

Líneas celulares

No se utilizaron líneas celulares en este estudio.

Modelos animales

No se utilizaron modelos animales en este estudio.

Reclutamiento de participantes

Entre enero de 2024 y abril de 2025, los participantes de las cohortes retrospectivas fueron reclutados en los hospitales Xijing y Tangdu de la Cuarta Universidad Militar Médica (FMMU) y en el Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) edad entre 18 y 85 años; (2) los sujetos del grupo de cáncer gástrico (CG)/displasia de alto grado (DHG) fueron diagnosticados patológicamente como adenocarcinoma gástrico/DHG, respectivamente; (3) los sujetos del grupo de enfermedad benigna gástrica (EBG) fueron diagnosticados en base a los hallazgos endoscópicos e histopatológicos, de acuerdo con los criterios diagnósticos pertinentes descritos en las guías de la Sociedad Americana de Endoscopia Gastrointestinal/Sociedad Europea de Endoscopia Gastrointestinal (ASGE/ESGE), y no tenían antecedentes de cáncer; (4) los sujetos del grupo de otros cánceres gastrointestinales fueron diagnosticados patológicamente con carcinoma de células escamosas esofágico (CCEE), adenocarcinoma esofágico (CAE), cáncer colorrectal (CCR), carcinoma hepatocelular (CHC) o adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP); (5) los controles sanos no presentaban evidencia de cáncer o anomalías gástricas, según lo confirmado por el examen físico, la gastroscopia, los marcadores tumorales séricos normales, la ausencia de antecedentes familiares de cáncer y un período de seguimiento de 6 meses sin anomalías; (6) los sujetos estaban dispuestos a cooperar con este estudio y proporcionaron muestras de sangre periférica según lo requerido. Los controles (CS y EBG) se emparejaron 1:1 con los casos de cáncer gástrico en cuanto a edad y sexo, utilizando el algoritmo del vecino más cercano (paquete R MatchIt). Los participantes fueron excluidos si se cumplía alguna de las siguientes condiciones: (1) sangrado gastrointestinal activo en los últimos 3 meses; (2) uso regular de antiinflamatorios no esteroideos (AINE) con una dosis acumulada de ≥30 dosis diarias definidas en los últimos 3 meses; (3) antecedentes de gastrectomía parcial o total; (4) neoplasias concomitantes en otros sistemas, enfermedades sistémicas crónicas significativas o enfermedades infecciosas graves.

Además, se reclutaron un total de 84 individuos en un estudio prospectivo de casos y controles anidados, en el marco del Programa Nacional de Detección Temprana del Cáncer de la Parte Superior del Tracto Gastrointestinal (UGCED), provenientes de dos regiones de China con alta incidencia de Cáncer Gástrico (CG): el condado de Linqu, provincia de Shandong (junio de 2019 a junio de 2022) y la ciudad de Wuwei, provincia de Gansu (marzo de 2019 a julio de 2021). En el momento del reclutamiento, todos los participantes se sometieron a una gastroscopia con biopsia para la evaluación histopatológica de las lesiones gástricas basales. Aquellos en los que se identificaron lesiones precancerosas (gastritis atrófica crónica o metaplasia intestinal) se consideraron con un riesgo elevado de progresión a CG y, por lo tanto, constituyeron la cohorte de riesgo. Todos los participantes proporcionaron muestras de sangre para el análisis de ccf-mtDNA en el momento del reclutamiento y se realizó un seguimiento prospectivo. Durante el seguimiento, 34 participantes de Linqu (mediana de 29 meses) y 8 de Wuwei (mediana de 31 meses) desarrollaron CG incidente. Tras la finalización del seguimiento, para controlar posibles factores de confusión y preservar la naturaleza prospectiva de la medición de la exposición, cada caso se emparejó 1:1 con un control sin cáncer de la misma cohorte, basándose en la edad, el sexo, las lesiones histológicas basales y la duración del seguimiento. Los 34 controles emparejados de Linqu fueron diagnosticados en la línea de base con gastritis atrófica crónica y/o metaplasia intestinal y permanecieron sin cáncer durante el seguimiento; de manera similar, se seleccionaron 8 controles emparejados de la cohorte de Wuwei.

Además, se recogió una cohorte china minoritaria de etnias uigur y kazaja del Hospital Oncológico afiliado a la Universidad Médica de Xinjiang (julio de 2025 a septiembre de 2025), Urumqi, China.

Los tumores se clasificaron según la 9ª edición del sistema de estadificación TNM del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC). El CG temprano (CGT) se definió como CG en estadio I o II, y el CG avanzado (CGA) se definió como CG en estadio III o IV. Según la clasificación de la OMS de 2019, el adenocarcinoma de la unión esofagogástrica (AEG) incluye tumores centrados a 5 cm proximal o distal de la línea Z. Los tumores se clasificaron en grupos GEJ (adenocarcinomas Siewert II/III ≤5 cm distal a la línea Z) y no GEJ (adenocarcinomas gástricos >5 cm distal a la línea Z en el fondo, cuerpo o antro) según su ubicación anatómica en relación con la línea Z. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El protocolo del estudio fue aprobado conjuntamente por los comités de ética de todos los centros participantes. Las características demográficas y patológicas de los participantes se presentan en las tablas S1 y S2.

Detalles del método

Recolección de muestras, extracción de ADN, construcción de bibliotecas y secuenciación

En la cohorte retrospectiva, todas las muestras de los participantes se recogieron antes del inicio del tratamiento. En la cohorte prospectiva, se recogieron muestras basales de todos los participantes en el momento del reclutamiento. Además, se obtuvieron muestras de plasma emparejadas en el momento del diagnóstico clínico del CG para los 8 pacientes con CG identificados en la ciudad de Wuwei. Se recogieron muestras de sangre periférica (5 mL cada una) de todos los participantes y se colocaron en tubos K2-EDTA. Dentro de las 2 horas posteriores a la recolección, el plasma se separó utilizando un protocolo estándar de centrifugación en dos pasos y luego se almacenó a -80 °C hasta la extracción del ADN. El cfDNA se extrajo del plasma utilizando un kit de aislamiento de ADN circulante VAMNE MagUltra (Vazyme, China), siguiendo el protocolo del fabricante, y se cuantificó utilizando Qubit 4.0 (Thermo Fisher, EE. UU.). Posteriormente, se prepararon bibliotecas NGS utilizando de 10 a 20 ng de cfDNA y se hibridaron con sondas de captura de mtDNA biotiniladas caseras que cubren todo el genoma mitocondrial (NC_012920.1), según se detalla en informes anteriores. Las sondas se diseñaron como oligonucleótidos de ARN biotinilados de 120 mer dispuestos en una densidad de 1× en todo el genoma mitocondrial, lo que garantiza un enriquecimiento completo y uniforme de los fragmentos de ccf-mtDNA. Finalmente, las bibliotecas de mtDNA capturadas de las muestras de cfDNA se secuenciaron en una plataforma Illumina Novaseq 6000 utilizando PE 150. Se prepararon quince lotes de la biblioteca de captura de ccf-mtDNA para todas las muestras. Cada lote incluyó una combinación de muestras de pacientes con cáncer y participantes de control sin cáncer.

Para controlar la consistencia entre lotes, se incluyó un estándar de cfDNA agrupado derivado de diez individuos sanos en cada lote de secuenciación. Después de la secuenciación, los perfiles fragmentómicos de este estándar interno se compararon entre lotes utilizando el análisis de correlación de Pearson para evaluar la reproducibilidad y evaluar los posibles efectos de lote.

Análisis de las características fragmentómicas de ccf-mtDNA

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando Fastp (v0.20.0) para eliminar los adaptadores de Illumina y las bases de baja calidad (puntuación de calidad