Los nanomoduladores que interfieren con STAT3 revierten la quimiorresistencia asociada al metabolismo lipídico y potencian la inmunoterapia metálica en el cáncer de mama.

Durante las últimas cuatro décadas, la incidencia del cáncer de mama ha aumentado de manera alarmante, convirtiéndose en la segunda neoplasia más común y mortal en mujeres.^[1],^[2] Actualmente, las quimioterapias basadas en antraciclinas y paclitaxel siguen siendo la piedra angular del tratamiento clínico del cáncer de mama.^[3] Sin embargo, las células del cáncer de mama desarrollan resistencia a la quimioterapia a través de diversos mecanismos biológicos moleculares, lo que finalmente conduce a la recurrencia y la metástasis, con una tasa de supervivencia a cinco años de menos del ∼30% en pacientes con cáncer de mama avanzado.^[4],^[5] A pesar de la revolución que la inmunoterapia ha supuesto en el tratamiento contemporáneo del cáncer de mama, pocos pacientes con tumores sólidos se benefician de la terapia de bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB) debido a la naturaleza "fría" del microambiente tumoral (TME) del cáncer de mama, con baja inmunogenicidad e inmunosupresión.^[6],^[7] Por lo tanto, la "batalla" contra la resistencia a la quimioterapia y el TME inmunosupresor del cáncer de mama debe ser continua.

Evidencias recientes han demostrado que la reprogramación metabólica impulsa la resistencia a la quimioterapia de las células cancerosas.^[8],^[9],^[10],^[11] En general, las células tumorales adquieren resistencia terapéutica a través de la regulación al alza de vías de señalización metabólica específicas y la acumulación de metabolitos inmunosupresores.^[8],^[9],^[10],^[11] En el cáncer de mama, las alteraciones en el metabolismo de los lípidos provocan resistencia a la quimioterapia, lo cual está regulado principalmente por la transducción de señales del transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3).^[12],^[13],^[14] La sobreactivación de la señalización de STAT3 se ha identificado en múltiples tipos de cáncer, dominando la reprogramación metabólica, la resistencia a la muerte celular y la invasión tumoral.^[15],^[16] Estudios previos han demostrado que la señalización de STAT3 facilita la deposición de lípidos y la síntesis de ácidos grasos en las células del cáncer de mama, lo que conduce sinérgicamente al desarrollo de resistencia a los fármacos.^[14] Más importante aún, la β-oxidación (FAO) de ácidos grasos mitocondriales impulsada por STAT3 promueve la autorrenovación y la supervivencia de las células madre del cáncer de mama e induce resistencia a la quimioterapia y metástasis del tumor de mama.^[17] La inhibición de la señalización de STAT3 bloquea la expresión de diversos genes del metabolismo de los lípidos y sensibiliza a múltiples cánceres a la quimioterapia.^[14],^[18],^[19],^[20],^[21] Por lo tanto, la adicción a los lípidos impulsada por STAT3 puede ser una vulnerabilidad metabólica del cáncer de mama y un posible objetivo terapéutico. Aunque se han desarrollado varios inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a STAT3 y han entrado en ensayos clínicos, sigue siendo un gran desafío evitar los efectos secundarios y fuera de objetivo.^[22],^[23] Cabe destacar que el uso de biocomponentes endógenos permite la inhibición de STAT3, en la que el gas sulfuro de hidrógeno (H2S), un transmisor de señales gaseosas, promueve la señalización de STAT1 a través de la sulfhidración de la selenoproteína F (Sep15) y, por lo tanto, antagoniza la fosforilación de STAT3 para inhibir la diferenciación de las células Th17.^[24] En el carcinoma hepatocelular (CHC), el H2S exógeno bloquea directamente la vía de STAT3 y regula la captación y el metabolismo de los lípidos.^[25],^[26],^[27],^[28] También se ha demostrado que el gas H2S es esencial para mantener los patrones de hipometilación e inhibir las actividades de las metiltransferasas, lo que puede mejorar la expresión de moléculas inmunogénicas y dar como resultado un aumento de la inmunogenicidad tumoral.^[29],^[30],^[31],^[32] Estos hallazgos conducen a la hipótesis de que el H2S exógeno puede administrarse para regular la señalización de STAT3 y el metabolismo de los lípidos para potenciar la quimiosensibilidad y la inmunogenicidad del cáncer de mama. Además, la evidencia emergente ha demostrado que los iones de metales nutrientes, como participantes cruciales en las actividades vitales, ejercen efectos antitumorales para iniciar una respuesta inmune eficaz, denominado "metaloinmunoterapia".^[33],^[34],^[35] Los metales de transición, como el Mn, el Zn, el Cu, el Fe y el V, activan las vías inmunitarias innatas y regulan la muerte celular para convertir los tumores inmunológicamente "fríos" en "calientes".^[36],^[37],^[38],^[39],^[40] Sin embargo, aún quedan por investigar más mecanismos inmunológicos y paradigmas terapéuticos de los adyuvantes metálicos.

Aquí, mostramos que la señalización elevada de STAT3 y el metabolismo de los lípidos se correlacionaron con la progresión patológica e impulsaron la resistencia a la quimioterapia en el cáncer de mama. Con este fin, descubrimos que la administración de H2S exógeno reguló el metabolismo de los lípidos mediado por STAT3 para sensibilizar el cáncer de mama a la doxorrubicina (DOX), un fármaco de quimioterapia con antraciclinas de primera línea, y mejoró la inmunogenicidad al aliviar el patrón de hipermetilación después de la quimioterapia. Para abordar la administración controlada de H2S, diseñamos cuidadosamente una nanoplattaforma bioactiva basada en sulfuros de metales de transición que se integró con la liberación de H2S activada por "tiol-polisulfuro" y la metaloinmunoterapia, en la que se seleccionaron los iones de níquel (Ni2+) debido a su inducción de la piroptosis y su potencia similar a la de un adyuvante inmunitario. Después de la captación celular, las nanopartículas de sulfuro de níquel mineralizadas con albúmina (NiS@ALB) respondieron a la escisión del glutatión endógeno (GSH) para liberar Ni2+ y H2S, lo que se sinergizó con la quimioterapia para iniciar una respuesta inmune sistémica y aumentar la sensibilidad al ICB. Por lo tanto, la combinación adicional con αPD-1 aumentó la infiltración de células T y erradicó los tumores metastásicos. Nuestro trabajo propuso un paradigma terapéutico sinérgico de modulación metabólica-inmune para potenciar múltiples intervenciones clínicas del cáncer de mama.

Resultados

La señalización persistente de STAT3 y el metabolismo de los lípidos se correlacionan con la progresión y la resistencia a la quimioterapia del cáncer de mama

Los tumores de mama están fisiológicamente inmersos en un microambiente rico en grasas; primero realizamos una tinción de inmunofluorescencia de STAT3 fosforilado (p-STAT3) y genes clave involucrados en el metabolismo de los lípidos, incluidos CPT1A (FAO), ACACA (alias: ACC1, síntesis de ácidos grasos), ACLY (generación de acetil-CoA) y CD36 (captación de ácidos grasos), en una matriz de tejidos que contenía muestras de 136 pacientes con cáncer de mama (Figura 1A). Se analizaron las intensidades de fluorescencia de estos genes y se puntuaron para determinar su correlación con la señalización de STAT3 y los grados patológicos (Figura S1A). Al seleccionar aleatoriamente 10 campos visuales de tejidos de cáncer de mama, observamos una correlación positiva entre el metabolismo de los lípidos y los grados patológicos (Figuras 1B y 1C). El análisis del estadio tumor-ganglio-metástasis (TNM) y la puntuación del metabolismo de los lípidos de la matriz confirmó una correlación positiva entre la puntuación y los estadios TNM (Figura 1D). Además, encontramos que el grado de activación de p-STAT3 se correlacionó positivamente con la puntuación del metabolismo de los lípidos, lo que sugiere una posible interacción regulatoria y el impacto en la progresión dinámica del cáncer de mama y los indicadores clínicos clave (Figura 1E). El análisis de las bases de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) y Genotype-Tissue Expression (GTEx) confirmó resultados similares (Figura S1B). En comparación con los tejidos mamarios normales, la expresión de los genes involucrados en la síntesis y oxidación de lípidos fue significativamente mayor e indica un mal pronóstico en los pacientes con carcinoma invasivo de mama (BRCA). Además, en un análisis retrospectivo del análisis transcriptómico unicelular y espacialmente resuelto de cánceres de mama humanos (NCBI: GSE176078),^[41] encontramos que los genes involucrados en el metabolismo de los lípidos se expresan altamente en las células malignas, especialmente los genes relacionados con la síntesis y elongación de ácidos grasos, lo que indica que las células cancerosas son contribuyentes activos al metabolismo de los lípidos en el TME (Figura S1C). Dado que la quimioterapia basada en antraciclinas sigue siendo la opción de tratamiento clínico de primera línea para el cáncer de mama y que la resistencia a la quimioterapia ocurre con frecuencia, a continuación, realizamos un secuenciamiento del transcriptoma de tumores responsivos ("R") y no responsivos ("NR") a la DOX (Figuras 1F y 1G; Figuras S1D y S1E). El análisis de enriquecimiento de genes (GO) de los genes expresados diferencialmente (DEG) indicó enriquecimientos significativos en varios procesos de transporte, almacenamiento, metabolismo y biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, y regulación positiva de la fosforilación de la proteína STAT (Figura 1H). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) confirmó la regulación negativa de múltiples procesos de efectores inmunitarios, lo que sugiere la formación gradual de un TME inmunosupresor en los tumores resistentes a los fármacos (Figuras 1H; S1F y S1G). El análisis de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) demostró además vías metabólicas específicas de lípidos relacionadas con el metabolismo del ácido araquidónico, el ácido linolénico, los esfingolípidos, los lípidos éter y el ácido linoleico, incluido el metabolismo del HIF-1 relacionado con la hipoxia, la glucólisis y la gluconeogénesis (Figura 1I). Estos resultados indicaron colectivamente que la señalización elevada de STAT3 y el metabolismo de los lípidos promovieron la progresión y la resistencia a la quimioterapia del cáncer de mama.

El H2S regula el metabolismo de los lípidos mediado por STAT3 y potencia la quimiosensibilidad y la inmunogenicidad

Para dilucidar aún más la correlación entre la señalización de STAT3 y el metabolismo lipídico, incubamos células 4T1 con Stattic, un inhibidor de la fosforilación de STAT3, y detectamos una reducción en la captación, acumulación de lípidos y la actividad de la β-oxidación de ácidos grasos (FAO). (Figura S2A). Como se reveló mediante el ensayo de Western blotting (WB), NaSH (donante de gas H2S) disminuyó la fosforilación de STAT3 e incrementó la señalización de STAT1 a medida que aumentaban la concentración y el tiempo (Figuras 1J; S2B). La inhibición de STAT3 podría conducir a notables variaciones metabólicas. Detectamos una expresión reducida de CD36 y FABP5, que son proteínas celulares esenciales para la captación de ácidos grasos (Figuras 1K; S2B). Como resultado, el tinte con borón-dipirrometeno (BODIPY) 493/503 y Oil Red O sugirió una reducción en las gotículas de lípidos (Figuras 1L; S2C y S2D). El cotratamiento con el inhibidor de STAT1, fludarabina, no atenuó la inhibición de la fosforilación de STAT3, la captación de lípidos o la oxidación por H2S (Figura S2E). Considerando que la quimiorresistencia del cáncer de mama está estrechamente correlacionada con la acumulación de lípidos y el metabolismo de los ácidos grasos, construimos además un modelo con alto contenido de lípidos mediante la inducción con oleato de sodio.^[42] El aumento de la viabilidad celular indicó la dependencia de las células de cáncer de mama de los lípidos, y la regulación al alza de p-STAT3 y la actividad de la FAO debilitaron aún más la citotoxicidad de DOX (Figuras S2F–S2H). El tratamiento con oleato de sodio aumentó las gotículas de lípidos intracelulares, lo que se revirtió mediante la coincubación con NaSH (Figuras 1L y 1M). En consecuencia, también se detectó que la perilipina 2 (PLIN2), que participa en la formación y estabilidad de las gotículas de lípidos intracelulares, había disminuido (Figura 1N). La alteración de las gotículas de lípidos puede conducir a una reducción de la bioenergía. El nivel de acetil-CoA, un importante metabolito intermedio en el metabolismo energético, disminuyó después del tratamiento con NaSH (Figura 1O). En el metabolismo lipídico, el acetil-CoA es un precursor para la biosíntesis de varios ácidos grasos, catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC).^[43] Se midió además la disminución de la actividad de ACC (Figura 1P). Posteriormente, los ácidos grasos se transportan a las mitocondrias para la FAO con el fin de obtener energía.^[43] La carnitina palmitoil transferasa 1A (CPT1A), la enzima limitante de la FAO, se redujo después del tratamiento con NaSH (Figura 1Q). La tenue fluorescencia azul de la sonda FAOBlue y la disminución del consumo de oxígeno intracelular también reflejaron la disminución de la actividad de la FAO y la inhibición de la función mitocondrial, respectivamente (Figuras 1R y 1S; Figura S2I).^[44] Como se esperaba, la coincubación con NaSH mejoró la sensibilidad de las células cancerosas a los fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, DOX y CDDP [cisplatino]), lo que fue más significativo en condiciones de alto contenido de lípidos (Figuras S2J y S2K; Figura 1T). Además, la expresión de varias ADN metiltransferasas (DNMT) se reguló al alza en el cáncer de mama, el patrón de hipermetilación se mantuvo y la expresión de DFNA5/GSDME se redujo, lo que resultó en una disminución de la inmunogenicidad (Figura S2L). Se ha informado que el H2S está asociado con el proceso de desmetilación y una mayor inmunogenicidad,^[29],^[30],^[31],^[32], como lo demuestra la disminución de la actividad de DNMT y la regulación al alza de la expresión de DFNA5/GSDME (Figuras S2M y S2N). El producto aguas abajo de la desmetilación, la 5-hidroximetilcitosina (5-hmc), también aumentó (Figura S2O). Por lo tanto, el H2S alivió la hipermetilación mediada por la quimioterapia. La expresión de DNMT se suprimió después del cotratamiento con NaSH y DOX, y se detectó el fragmento N-terminal escindido de GSDME (Figura 1U). A continuación, realizamos un estudio in vivo para validar la quimioterapia sensibilizada por H2S (Figura 1V). La pérdida de peso fue un efecto secundario común de la quimioterapia con DOX en ratones (Figura S2P). Aunque el NaSH solo no inhibió el crecimiento tumoral, la administración combinada mejoró significativamente la eficacia terapéutica de DOX (Figuras 1W; S2Q y S2R), lo que se reflejó aún más en un menor número de nódulos metastásicos pulmonares (Figuras S2S y S2T). La tinción con hematoxilina-eosina (H&E) y Ki-67 reveló daño en el tejido tumoral e inhibición de la proliferación de las células cancerosas, respectivamente (Figura 1X). El análisis de inmunofluorescencia reveló una regulación al alza de la señalización de STAT3 y un aumento de la deposición de lípidos después de la quimioterapia, lo que mejoró después del tratamiento con NaSH (Figura 1Y). En resumen, demostramos que el H2S exógeno inhibió la señalización de STAT3 y promovió la señalización de STAT1, lo que resultó en la supresión de la captación de ácidos grasos y la β-oxidación. Además, la inhibición de la metilación mediada por H2S mejoró la inmunogenicidad, lo que sensibilizó sinérgicamente el cáncer de mama a la quimioterapia (Figura 1Z).

Selección de iones metálicos y construcción de NiS@ALB

Primero, seleccionamos iones metálicos esenciales típicos para los organismos con el fin de identificar posibles candidatos para la metalo-inmunoterapia, lo que resultó en una citotoxicidad diferencial hacia las células 4T1 y DC2.4 (Figuras 2A y 2B; Figura S3A). La microscopía óptica reveló una muerte celular similar a la piroptosis (hinchazón y formación de espuma) después del tratamiento con Co2+ y Ni2+ (Figura S3B). El ensayo de Western blotting (WB) sugirió que Fe2+, Co2+ y Ni2+ activaron el inflamasoma NLRP3 en las células 4T1, con la caspasa-1 (C-Cas-1) y el fragmento amino-terminal de GSDMD (GSDMD-N) más significativamente escindidos después del tratamiento con Ni2+ (Figura 2C). Sin embargo, la vía Cas-3-GSDME no se activó significativamente y puede estar asociada con el patrón de hipermetilación de DFNA5 en el cáncer de mama. La escisión significativa de Cas-3 inducida por Cu2+ puede conducir principalmente a la apoptosis, lo que es consistente con la morfología observada de redondeamiento y encogimiento (Figuras S3B y S3C). En comparación con los inhibidores de la apoptosis, la necroptosis o la ferroptosis, solo el VX-765 (un inhibidor de la caspasa-1) rescató la mayor cantidad de células que morían inducidas por Ni2+ (Figura S3D). Además, el Ni2+ reguló eficazmente la expresión de Myd88 en las células DC2.4 (Figura 2C). Para validar nuestros hallazgos, se extrajeron células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) para su incubación con iones metálicos. El Mn2+, un potente agonista de STING, primero estimuló la maduración de las DC, pero pareció ser tóxico a altas concentraciones. Como se esperaba, Co2+, Ni2+ y Cu2+ estimularon la maduración de las DC, y la proporción más alta de DC maduras se detectó después de la incubación con Ni2+ (Figuras 2D; S3E). También se capturó la fluorescencia más brillante de Myd88 en las DC tratadas con Ni2+ (Figura 2E). Estos resultados sugirieron que los iones metálicos tenían un gran potencial en la regulación positiva de la respuesta inmune antitumoral, en la que el Ni2+ podría activar los inflamasomas, desencadenar la muerte inflamatoria de las células cancerosas y estimular eficazmente la maduración de las DC a través del eje receptor tipo Toll (TLR)-Myd88, lo que los convierte en candidatos competitivos para la metalo-inmunoterapia.

A continuación, pretendimos construir una nanoplattaforma integrada con metalo-inmunoterapia y liberación estable de H2S. Se seleccionó un método simple de biomineralización asistida por ALB para sintetizar nanopartículas bioactivas de NiS@ALB. En resumen, la albúmina sérica bovina sirvió como plantilla para proporcionar sitios de unión y adsorber iones Ni2+, y luego se añadió Na2S en condiciones alcalinas. Después de la mineralización y el envejecimiento a temperatura ambiente, el NiS nucleó y creció en las nanocápsulas de albúmina, formando nanopartículas de NiS@ALB con abundantes polisulfuros que podrían responder a la escisión de GSH y liberar gas H2S a través del mecanismo de "tiol-polisulfuro" (Figura 2F).^[45],^[46],^[47],^[48] La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló una morfología esférica de las nanopartículas de NiS@ALB, donde el Ni y el S se distribuyeron uniformemente (Figuras 2G y 2H; Figura S3F). El diámetro hidrodinámico de NiS@ALB fue de ∼140 nm en diferentes medios, y el potencial zeta fue de −29,3 ± 1,51 mV, lo que garantiza la dispersión y la estabilidad en condiciones fisiológicas (Figura 2I). La difracción de rayos X (XRD) reveló la estructura amorfa de NiS@ALB (Figura S3G). El análisis de espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) sugirió múltiples estados químicos del níquel. El azufre existió principalmente en tres formas, incluido el sulfuro metálico (∼161,7 eV, atribuido a los enlaces Ni–S), el sulfuro orgánico (∼163,5 eV, incluidos C–S, S–S y polisulfuros) y el sulfato (∼167,8 eV) (Figuras 2J y 2K; Figura S3H). Debido a la susceptibilidad de los polisulfuros a la escisión por GSH, NiS@ALB agotó eficazmente el GSH con el tiempo y la concentración crecientes (Figuras 2L–2O), durante el cual se liberó gas H2S, como lo indica el papel indicador de acetato de plomo y la sonda WSP-1 (Figuras 2P y 2Q). El análisis de XPS indicó que el níquel fue parcialmente reducido por GSH. En particular, la disminución de la proporción de sulfuros orgánicos indicó la fragmentación de los polisulfuros por el ataque de GSH (Figuras 2R y 2S; Figura S3I). La espectroscopía Raman reveló que un pico de polisulfuro ubicado en ∼480 cm−1 se debilitó después del tratamiento con GSH (Figura 2T).^[49] Las sondas WSP-1 midieron la liberación acelerada de H2S con el aumento de la concentración de GSH (Figuras 2U; S3J). La liberación de H2S alcanzó su punto máximo en 1 h y se mantuvo significativamente más alta que en condiciones sin GSH durante 5 h (Figuras 2V; Figuras S3K y S3L). El método colorimétrico de azul de metileno (MB) cuantificó además el rendimiento de H2S, que aumentó con el aumento de la concentración y el tiempo de GSH (Figuras 2W y 2X; Figuras S3M–S3P). Además, NiS@ALB se degradó en una solución acuosa incolora y transparente (Figura 2Y). Las imágenes de TEM también revelaron el colapso de las nanoestructuras de NiS@ALB en nanopuntos ultrapequeños (Figura 2Z). En conjunto, los resultados anteriores demostraron la construcción exitosa de una nanoplattaforma activable para la codistribución de gas bioactivo e iones metálicos.

Los nanomoduladores gas-metabólicos potencian la quimiosensibilidad del cáncer de mama

Dadas las propiedades sobresalientes de NiS@ALB, se investigaron posteriormente los efectos biológicos in vitro en las células de cáncer de mama 4T1. Se detectó la generación intracelular de H2S mediante sondas WSP-1. La adición de 1 mM de GSH aumentó la intensidad de la fluorescencia, que disminuyó después del pretratamiento con N-etilmaleimida (NEM, un eliminador de tioles) (Figura 3A). El tinte JC-1 detectó un aumento de la fluorescencia verde de las mitocondrias anormales, lo que sugiere el colapso del potencial de membrana mitocondrial (Figuras 3B; S3Q). El ensayo de Western blotting (WB) reveló la regulación a la baja de la fosforilación de STAT3 y la expresión de CD36 y FABP5 después del tratamiento con NiS@ALB, principalmente atribuible a la liberación de H2S (Figura 3C). La inhibición de las gotículas de lípidos puede conducir a una disminución de la expresión de PLIN2 y la posterior alteración de la bioenergía. De manera similar, tanto el acetil-CoA como la ACC disminuyeron después del tratamiento con NiS@ALB (Figuras 3G–3I). Además, el acetil-CoA también es un precursor para la biosíntesis de colesterol.^[43] Se observó una débil fluorescencia azul del colesterol, como lo indica la tinción con Filipin Ⅲ (Figura S3R). Posteriormente, se detectaron la regulación a la baja de CPT1A y las actividades de la FAO, lo que también puede estar asociado con el daño mitocondrial mediado por H2S (Figuras 3J; S3S). Estos efectos dieron como resultado una reducción en el nivel de ATP intracelular (Figura 3K). Aunque la inducción con oleato de sodio aumentó el número de gotículas de lípidos intracelulares y la deposición de colesterol, NiS@ALB revirtió estos efectos (Figuras 3L–3N). Una mayor investigación de los indicadores del metabolismo lipídico también confirmó el potencial de NiS@ALB para regular el metabolismo de los ácidos grasos en condiciones de alto contenido de lípidos (Figuras 3O–3R). Como se esperaba, se detectaron una menor actividad de la FAO, niveles de ATP intracelular y tasas de consumo de oxígeno (Figuras 3S–3U; Figura S3T). En concentraciones que no causaron una citotoxicidad significativa, la coincubación con NiS@ALB aumentó la citotoxicidad de los fármacos quimioterapéuticos (Figuras S3U y S3V). Lo que es más importante, los modelos de alto contenido de lípidos mejoraron la resistencia de las células 4T1 a DOX, pero se volvieron más sensibles después del tratamiento con NiS@ALB (Figura 3V). En conjunto, estos datos sugirieron que NiS@ALB podría servir como un potente nanomodulador gas-metabólico para aumentar la quimiosensibilidad del cáncer de mama (Figura 3W).

La metalo-inmunoterapia induce la muerte celular pirotótica y moviliza las células inmunitarias

A continuación, evaluamos el potencial de NiS@ALB como agente metalo-inmunoterapéutico para mejorar la inmunogenicidad del cáncer de mama (Figura 4A). Los resultados de MTT sugirieron una citotoxicidad significativa en comparación con NaSH o Ni2+ solos (Figura 4B). La muerte celular inmunogénica se evaluó mediante la exposición de calreticulina (CRT), la liberación de proteína de unión al ADN de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) y la fuga de ATP (Figuras 4C y 4D). Para dilucidar aún más el mecanismo de muerte celular, se capturaron mediante microscopía óptica morfologías de piroptosis similares a hinchazón y formación de espuma, y se detectó una abundante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (Figuras S4A y S4B). El tinte con Annexin V-FITC/PI reveló burbujas gigantes en la membrana plasmática y permeabilidad al yoduro de propidio (PI) en las células tratadas con Ni2+ y NiS@ALB, lo que sugiere cambios en la permeabilidad de la membrana durante la muerte celular inflamatoria (Figura 4E). Los ensayos de Western blot detectaron el ensamblaje de los inflammasomas NLRP3 y la aparición de C-Cas-1 y GSDMD-N. Se maduraron y liberaron IL-1β e IL-18 (Figura 4F). Aunque el Ni2+ aumentó las especies reactivas del oxígeno dentro de las células, no se detectaron variaciones significativas en los niveles de peroxidación lipídica (LPO) (Figuras S4C y S4D). El co-tratamiento con inhibidores de la muerte celular confirmó aún más que la piroptosis fue la forma dominante de muerte celular (Figura S4E). A continuación, exploramos el potencial de NiS@ALB para sensibilizar las células de cáncer de mama a la quimioterapia. En comparación con la incubación con DOX solo, la co-incubación con NiS@ALB resultó en una fluorescencia de CRT más brillante (Figuras 4G y 4H), y se detectaron concentraciones más altas de HMGB1 y ATP en el sobrenadante celular (Figuras 4I y 4J). Además, la liberación de H2S podría mediar el proceso de desmetilación (Figura S4F). El ensayo de Western blot reveló que la regulación al alza de las metiltransferasas después del tratamiento con DOX se atenuó mediante la co-incubación con NiS@ALB, lo que indica que la resistencia a los fármacos inducida por la quimioterapia se inhibió eficazmente (Figura 4K). Por lo tanto, el aumento de la inmunogenicidad permitió que el DOX indujera la piroptosis mediada por GSDME, caracterizada por el aumento de la expresión de GSDME-N y C-Cas-3 (Figura 4K). Para dilucidar aún más los mecanismos terapéuticos subyacentes, se realizó un análisis del transcriptoma para revelar las variaciones de ARNm en las células 4T1 tratadas con NiS@ALB (Figuras 4L; S4G y S4H). En particular, los genes clave involucrados en el metabolismo de los lípidos, el proceso de FAO y la metilación se redujeron significativamente, mientras que los genes relacionados con la respuesta inflamatoria y el proceso de desmetilación se regularon al alza significativamente (Figura 4M). El análisis KEGG de todos los DEG sugirió el enriquecimiento de varias vías de señalización proinflamatorias (Figura 4N). El enriquecimiento GO indicó que los genes se distribuyeron principalmente en conjuntos de genes relacionados con la inflamación y el metabolismo, lo que sugiere la alteración de estos procesos biológicos (Figura 4O). GSEA confirmó los resultados anteriores y reveló la regulación positiva de varias respuestas inmunitarias antitumorales (Figura S4I).

Hasta ahora, hemos descubierto que NiS@ALB desencadenó una respuesta inflamatoria mediada por piroptosis. Dado que los iones Ni2+ son potentes agonistas inmunitarios, a continuación, investigamos su capacidad para movilizar las células inmunitarias. Como se esperaba, tanto el Ni2+ como el NiS@ALB maduraron las BMDC (Figuras 4P y 4Q) y promovieron la secreción de TNF-α e IL-12p70 (Figuras 4R; S4J). Una validación adicional indicó que el Ni2+ polarizó las células RAW264.7 hacia el fenotipo M1 (Figuras 4S; S4K) y elevó los niveles de varias citoquinas proinflamatorias en el sobrenadante celular (Figuras 4T; S4J). La inmunofluorescencia reveló los mecanismos por los cuales el Ni2+ aumentó la expresión de iNOS, Myd88 e IRF3, lo que posteriormente condujo a la ubiquitinación y la degradación proteasómica de IKBα, liberando a NF-κB para la translocación nuclear (Figuras 4U y 4V; Figura S4l). La evidencia anterior reveló que NiS@ALB sirvió como un potente metalo-adjuvante para activar el eje TLR-Myd88-NF-κB para movilizar las células inmunitarias (Figura 4W).

Después de identificar NiS@ALB como una nanoplattaforma multifuncional para modular la inmunoterapia metabólica, realizamos experimentos in vivo para estudiar su eficacia terapéutica y mecanismo (Figura 5A). El Ni2+ libre y el Stattic inhibieron marginalmente el crecimiento tumoral. En contraste, dos dosis de inyección de NiS@ALB suprimieron con éxito la progresión tumoral (Figuras 5B y 5C; Figuras S4M y S4N). Además, la imagen de los tumores después de la inyección de NiS@ALB reveló que grandes cantidades de H2S se liberaron en 24 horas y alcanzaron el nivel de referencia después de 72 horas. El grado de inhibición de p-STAT3 también se correlacionó fuertemente con la liberación de H2S in vivo (Figuras S4O–S4Q). La tinción de inmunofluorescencia reveló la supresión de p-STAT3 y los indicadores del metabolismo de los lípidos, y el aumento de NLRP3, C-Cas-1 y GSDMD-N después de 2 dosis de tratamiento con NiS@ALB (Figuras 5D; S4R). Además, no hubo fluctuaciones significativas en el peso de los ratones durante el período de tratamiento, y no se detectaron anomalías obvias en las funciones hepáticas o renales (Figuras S4S–S4U).

Se realizó una evaluación inmunitaria dos días después de la última administración (Figura 5E). La citometría de flujo reveló una maduración significativa de las DC en los tumores después de la sensibilización con Ni2+ (Figuras 5F; S5A). En particular, el Stattic tuvo ciertos efectos de activación inmunitaria, lo que sugiere el potencial de la inhibición de STAT3 en la inmunoterapia. Estimuladas por la presentación de antígenos de las DC maduras, el número de células T CD8+ casi se duplicó, y la proporción de células T CD4+ aumentó después del tratamiento con NiS@ALB, y el H2S también activó las células T, lo que fue consistente con estudios anteriores (Figuras 5G y 5H; Figuras S5B y S5C). La regulación al alza de las células T IFN-γ+ indicó la potente activación de las células T citotóxicas (Figuras 5I; S5D). Tanto el Ni2+ como el NiS@ALB sensibilizaron las células asesinas naturales (NK) (Figuras 5J; S5E) y polarizaron los macrófagos asociados al tumor (TAM) hacia el fenotipo M1 (Figuras 5K; S5F y S5G). En consecuencia, las células T reguladoras inmunosupresoras (Treg) se redujeron (Figuras 5L; S5H). Las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) dependen de la señalización de STAT3 para mantener su función inmunosupresora, lo que se alivió con los inhibidores de STAT3 H2S y Stattic. Sin embargo, el tratamiento con NiS@ALB reclutó MDSC, posiblemente para contrarrestar la intensa respuesta inflamatoria desencadenada por el Ni2+ (Figuras 5M; S5I). Como se demostró anteriormente, la regulación al alza de cxcl2 y la muerte celular por piroptosis podrían transmitir señales de reclutamiento a las MDSC para regular negativamente la respuesta inmunitaria (Figura 4M). Por lo tanto, se detectaron altos niveles de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-12p70 dentro del tumor (Figuras 5N; S5J). Además, detectamos proporciones más altas de DC linfáticas maduras y concentraciones de TNF-α después del tratamiento con NiS@ALB (Figura S5K), aunque los niveles de otras citocinas no difirieron significativamente debido a las limitaciones en el número de muestras (Figura S5L). La administración combinada de VX-765 (Belnacasan), un inhibidor específico de la caspasa-1, debilitó los efectos terapéuticos (Figuras 5O y 5P; Figura S5M), y se detectaron menos DC tumorales infiltrantes maduras, células T CD8+/CD4+ y células NK (Figuras 5Q–5T; Figuras S5N–S5Q). En particular, el co-tratamiento con VX-765 redujo la infiltración de MDSC dentro del tumor y redujo la expresión de Arg-1, un marcador efector inmunosupresor de MDSC, lo que demuestra aún más que la piroptosis inducida por NiS@ALB fue un desencadenante directo de la quimiotaxis de MDSC (Figuras 5U y 5V; Figura S5R). Por lo tanto, la combinación de anticuerpos αLy6G/Ly6C (Gr-1) con el tratamiento con NiS@ALB para eliminar las MDSC logró una mejor eficacia y promovió una mayor infiltración de células T (Figuras 5W–5Y; Figura S5S).

Dado que la resistencia a la quimioterapia es un desafío importante en el tratamiento del cáncer de mama, exploramos el potencial de NiS@ALB para sensibilizar el cáncer de mama a la DOX (Figura 6A). La resistencia a la DOX condujo a efectos antitumorales insignificantes, mientras que NiS@ALB simplemente suprimió el crecimiento tumoral en una etapa temprana. Sin embargo, la administración combinada inhibió el crecimiento tumoral en 20 días y resultó en el peso más bajo del bazo (Figuras 6B y 6C; Figuras S6A–S6C). Además, se observaron menos nódulos metastásicos pulmonares después del tratamiento combinado (Figuras 6D y 6E). La tinción con H&E y Ki-67 reveló una muerte generalizada de las células cancerosas y la inhibición de la proliferación tumoral en el grupo combinado (Figura 6F). La inmunofluorescencia reveló la activación de la señalización de STAT3 y un aumento posterior en la deposición de lípidos después de la quimioterapia, lo que podría ser la base para la adquisición de resistencia a los fármacos en las células de cáncer de mama y se revirtió después del tratamiento con NiS@ALB (Figura 6G).

A continuación, investigamos la iniciación de las respuestas inmunitarias sistémicas (Figura 6H). La DOX puede inducir la muerte celular inmunogénica y poseer ciertas propiedades de activación inmunitaria. Para nuestra sorpresa, se detectó una proporción más alta de DC migratorias maduras (MigDC) y DC residentes (ResDC) en los ganglios linfáticos después de la terapia combinada (Figuras 6I y 6J; Figuras S6D y S6E). En consecuencia, la maduración de las DC dentro del tumor aumentó (Figuras 6K; S6F). La regulación al alza de las MigDC presentadoras de antígenos y la posterior maduración de las ResDC marcaron el inicio eficaz de la respuesta inmunitaria antitumoral. Estas células presentadoras de antígenos presentan antígenos tumorales a través de las moléculas MHC-2 para guiar el reconocimiento de las células T helper, lo que desencadena una respuesta inmunitaria adaptativa. Por lo tanto, los porcentajes de células T CD8+ y CD4+ aumentaron significativamente (Figuras 6L y 6M; Figuras S6G y S6H). Además, la relación de macrófagos M1 a M2 aumentó en el grupo de terapia combinada (Figuras 6N; S6I–S6K). El número de MDSC permaneció alto en el TME, lo que indica una inflamación local grave (Figura S6L). Además, extrajimos el bazo para el análisis de linfocitos. En particular, el aumento en el número de células T CD8+ efectoras IFN-γ+ indicó la activación de la respuesta inmunitaria sistémica (Figuras 6O; Figuras S6M y S6N). Más importante aún, observamos una proporción elevada de células T CD44+ CD8+ y CD44+ CD4+ efectoras/de memoria en el bazo (Figuras 6P y 6Q; Figuras S6O y S6P). En consecuencia, se detectaron altas concentraciones de TNF-α, IFN-γ e IL-1β tanto en el suero como en el tumor (Figuras 6R–6T; Figura S6Q). Para demostrar aún más la generación de memoria inmunitaria, realizamos experimentos de retoterapia tumoral (Figura S7A). El grupo de quimioterapia sensibilizada con NiS@ALB exhibió un control tumoral significativo y la infiltración de células T, con más células T CD8+ efectoras IFN-γ+ detectadas en los tumores retotados (Figuras S7B–S7D). Mientras tanto, tanto las células T centrales de memoria CD8+/CD4+ (Tcm) como las células T de memoria efectoras (Tem) aumentaron en la sangre periférica (Figuras S7E y S7F). Finalmente, para evaluar las limitaciones de nuestra estrategia, detectamos una mayor expresión de PD-L1 después de la quimioinmunoterapia combinada, lo que entregó señales reguladoras negativas y aumentó la expresión de PD-1 (Figura 6U). La inducción de la expresión de PD-L1 puede deberse a la estimulación inmunitaria terapéutica y, en última instancia, podría dar lugar al agotamiento de las células T.

La combinación con la terapia ICB inhibe eficazmente el crecimiento y la metástasis del tumor.

Las señales de expresión aumentada de PD-L1 y PD-1 nos animaron a combinar aún más la terapia ICB para mejorar la eficacia, ya que esto sugería una posible sensibilidad al bloqueo de PD-L1/PD1. Dado que la combinación de pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) y quimioterapias ha sido aprobada como tratamiento de primera línea en pacientes con cáncer de mama triple negativo metastásico,^[56] se seleccionó αPD-1 para los ensayos de terapia combinada posteriores. Construimos modelos de tumores 4T1 bilaterales para la validación de la inmunidad sistémica antitumoral (Figura 7A). Tanto el DOX libre como el αPD-1 no lograron inhibir el crecimiento tumoral, y la terapia combinada con DOX y αPD-1 también mostró una eficacia deficiente, lo que es consistente con la pequeña proporción de pacientes que se benefician clínicamente. Aunque la administración de NiS@ALB + DOX suprimió con éxito la progresión del tumor primario, inhibió moderadamente el crecimiento del tumor distante. Sin embargo, la terapia triple combinada con αPD-1 controló significativamente tanto los tumores primarios como los distantes e inhibió eficazmente la metástasis pulmonar (Figuras 7B–7D; Figuras S7G y S7H). Debido al bloqueo de la expresión de PD-1, el número de células T CD8+ y CD4+ en los tumores primarios y distantes aumentó aún más (Figura 7E).

Dado que la terapia combinada con αPD-1 puede amplificar la inmunidad sistémica mediada por células T para superar los tumores bilaterales y metastásicos, construimos a continuación un modelo de tumor 4T1 ortotópico para simular mejor el microambiente fisiológico del cáncer de mama, en el que los nódulos metastásicos pueden formarse espontáneamente en múltiples órganos (Figura 7F). A través de la imagenología de bioluminiscencia in vivo, observamos que los ratones que recibieron la administración combinada de NiS@ALB y DOX exhibieron señales de bioluminiscencia más débiles que aquellos que recibieron solo quimioterapia o terapia ICB. Tanto los tumores primarios como los metastásicos se inhibieron dentro de los 25 días posteriores a la combinación adicional con el anticuerpo αPD-1 (Figuras 7G–7I; Figura S7I). La imagenología de bioluminiscencia de los pulmones de los ratones en cada grupo reveló menos nódulos metastásicos pulmonares en el grupo de tratamiento combinado (Figura 7J). En conjunto, estos resultados demostraron que la quimioterapia sensibilizada con NiS@ALB más la inmunoterapia αPD-1 pueden inhibir eficazmente la progresión del tumor de mama ortotópico y prevenir la metástasis pulmonar.

Potente capacidad antitumoral en un modelo de xenoinjerto resistente a fármacos

El modelo de xenoinjerto simula el entorno de crecimiento de los tumores humanos y refleja la sensibilidad a los fármacos experimentales. Con este fin, construimos un modelo de xenoinjerto resistente a fármacos mediante la inoculación subcutánea de células MCF-7/ADR (resistentes a la adriamicina) de cáncer de mama humano en el flanco derecho de ratones desnudos (Figura 7K). La escasa eficacia del tratamiento único con DOX indicó la resistencia de las células MCF-7/ADR a la quimioterapia. Aunque NiS@ALB inhibió moderadamente el crecimiento tumoral debido a una respuesta inmunitaria insuficiente en ratones desnudos inmunodeprimidos, el tratamiento combinado suprimió el crecimiento tumoral en 40 días (Figuras 7L y 7M). En general, los resultados anteriores indicaron que NiS@ALB puede sensibilizar los tumores humanizados resistentes a DOX a los agentes quimioterapéuticos.

La señalización persistente de STAT3 y el metabolismo lipídico se correlacionan con la progresión y la resistencia a la quimioterapia del cáncer de mama

Los tumores de mama están fisiológicamente inmersos en un microambiente rico en grasas; primero realizamos una tinción de inmunofluorescencia de STAT3 fosforilado (p-STAT3) y genes clave involucrados en el metabolismo lipídico, incluido CPT1A (FAO), ACACA (alias: ACC1, síntesis de ácidos grasos), ACLY (generación de acetil-CoA) y CD36 (captación de ácidos grasos), en una matriz de tejidos que contiene muestras de 136 pacientes con cáncer de mama (Figura 1A). Se analizaron y puntuaron las intensidades de fluorescencia de estos genes para determinar su correlación con la señalización de STAT3 y los grados patológicos (Figura S1A). Al seleccionar aleatoriamente 10 campos visuales de tejidos de cáncer de mama, observamos una correlación positiva entre el metabolismo lipídico y los grados patológicos (Figuras 1B y 1C). El análisis del estadio tumor-nodo-metástasis (TNM) y la puntuación del metabolismo lipídico de la matriz confirmó una correlación positiva entre la puntuación y los estadios TNM (Figura 1D). Además, encontramos que el grado de activación de p-STAT3 se correlacionó positivamente con la puntuación del metabolismo lipídico, lo que sugiere una posible interacción regulatoria y el impacto en la progresión dinámica del cáncer de mama y los indicadores clínicos clave (Figura 1E). El análisis de las bases de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) y Genotype-Tissue Expression (GTEx) confirmó resultados similares (Figura S1B). En comparación con los tejidos mamarios normales, la expresión de los genes involucrados en la síntesis y oxidación de lípidos fue significativamente mayor e indica un mal pronóstico en los pacientes con carcinoma invasivo de mama (BRCA). Además, en un análisis retrospectivo del análisis transcriptómico unicelular y espacialmente resuelto de cánceres de mama humanos (NCBI: GSE176078),^[41] encontramos que los genes involucrados en el metabolismo lipídico se expresan en gran medida en las células malignas, especialmente los genes relacionados con la síntesis y elongación de ácidos grasos, lo que indica que las células cancerosas son contribuyentes activos al metabolismo lipídico en el TME (Figura S1C). Dado que la quimioterapia basada en antraciclinas sigue siendo la opción de tratamiento clínico de primera línea para el cáncer de mama y que la resistencia a la quimioterapia ocurre con frecuencia, realizamos a continuación un secuenciamiento del transcriptoma de tumores responsivos (“R”) y no responsivos (“NR”) a DOX (Figuras 1F y 1G; Figuras S1D y S1E). El análisis de Gene Ontology (GO) de los genes expresados diferencialmente (DEG) indicó enriquecimientos significativos en varios procesos de transporte, almacenamiento, metabolismo y biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, y regulación positiva de la fosforilación de la proteína STAT de tirosina (Figura 1H). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) confirmó la regulación negativa de múltiples procesos de efectores inmunitarios, lo que sugiere la formación gradual de un TME inmunosupresor en los tumores resistentes a los fármacos (Figuras 1H; S1F y S1G). El análisis de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) demostró además vías metabólicas lipídicas específicas relacionadas con el ácido araquidónico, el ácido linolénico, los esfingolípidos, los lípidos éter y el metabolismo del ácido linoleico, incluidas las vías de señalización HIF-1 relacionadas con la hipoxia, la glucólisis y la gluconeogénesis (Figura 1I). En conjunto, estos resultados indicaron que la señalización de STAT3 elevada y el metabolismo lipídico promovieron la progresión y la resistencia a la quimioterapia del cáncer de mama.

H2S regula el metabolismo lipídico mediado por STAT3 y potencia la quimiosensibilidad y la inmunogenicidad

Para dilucidar aún más la correlación entre la señalización de STAT3 y el metabolismo lipídico, incubamos células 4T1 con Stattic, un inhibidor de la fosforilación de STAT3, y detectamos una reducción en la captación, acumulación y actividad de FAO de lípidos (Figura S2A). Como se reveló mediante el ensayo de Western blotting (WB), NaSH (donante de gas H2S) disminuyó la fosforilación de STAT3 y aumentó la señalización de STAT1 a medida que aumentaba la concentración y el tiempo (Figuras 1J; S2B). La inhibición de STAT3 puede conducir a variaciones metabólicas notables. Detectamos una expresión reducida de CD36 y FABP5, que son proteínas celulares esenciales para la captación de ácidos grasos (Figuras 1K; S2B). Como resultado, la tinción con borón-dipirrometeno (BODIPY) 493/503 y aceite rojo O sugirió una reducción en las gotas de lípidos (Figuras 1L; S2C y S2D). El cotratamiento con el inhibidor de STAT1, fludarabina, no atenuó la inhibición de la fosforilación de STAT3, la captación de lípidos o la oxidación por H2S (Figura S2E). Dado que la resistencia a la quimioterapia del cáncer de mama está estrechamente correlacionada con la acumulación de lípidos y el metabolismo de los ácidos grasos, construimos a continuación un modelo rico en lípidos mediante la inducción de oleato de sodio.^[42] El aumento de la viabilidad celular indicó la adicción de las células cancerosas a los lípidos, y la regulación al alza de p-STAT3 y la actividad de FAO debilitaron aún más la citotoxicidad de DOX (Figuras S2F–S2H). El tratamiento con oleato de sodio aumentó las gotas de lípidos intracelulares, lo que se revirtió mediante la coincubación con NaSH (Figuras 1L y 1M). En consecuencia, también se detectó que la perilipina 2 (PLIN2), que participa en la formación y estabilidad de las gotas de lípidos intracelulares, disminuyó (Figura 1N). La alteración de las gotas de lípidos puede conducir a una reducción de la bioenergía. El nivel de acetil-CoA, un importante intermedio metabólico en el metabolismo energético, disminuyó después del tratamiento con NaSH (Figura 1O). En el metabolismo lipídico, el acetil-CoA es un precursor para la biosíntesis de varios ácidos grasos, catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC).^[43] Se midió además la actividad reducida de ACC (Figura 1P). Posteriormente, los ácidos grasos se transportan a las mitocondrias para la FAO para obtener energía.^[43] La carnitina palmitoil transferasa 1A (CPT1A), la enzima limitante de la FAO, se redujo después del tratamiento con NaSH (Figura 1Q). La tenue fluorescencia azul de la sonda FAOBlue y la disminución del consumo de oxígeno intracelular también reflejaron la disminución de la actividad de la FAO y la inhibición de la función mitocondrial, respectivamente (Figuras 1R y 1S; Figura S2I).^[44] Como se esperaba, la coincubación con NaSH mejoró la sensibilidad de las células cancerosas a los fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, DOX y CDDP [cisplatino]), lo que fue más significativo en condiciones de alto contenido de lípidos (Figuras S2J y S2K; Figura 1T). Además, se observó que la expresión de varias ADN metiltransferasas (DNMT) se regulaba al alza en el cáncer de mama, el patrón de hipermetilación se mantenía y la expresión de DFNA5/GSDME se redujo, lo que resultó en una disminución de la inmunogenicidad (Figura S2L). Se ha informado que el H2S está asociado con el proceso de desmetilación y una mayor inmunogenicidad,^[29],^[30],^[31],^[32], como lo demuestra la disminución de la actividad de DNMT y la regulación al alza de la expresión de DFNA5/GSDME (Figuras S2M y S2N). El producto aguas abajo de la desmetilación, la 5-hidroximetilcitosina (5-hmc), también aumentó (Figura S2O). Por lo tanto, el H2S alivió la hipermetilación mediada por la quimioterapia. La expresión de DNMT se suprimió después del cotratamiento con NaSH y DOX, y se detectó el fragmento N-terminal escindido de GSDME (Figura 1U). A continuación, realizamos un estudio in vivo para validar la quimioterapia sensibilizada con H2S (Figura 1V). La pérdida de peso fue un efecto secundario común de la quimioterapia con DOX en ratones (Figura S2P). Aunque el NaSH solo no inhibió el crecimiento tumoral, la administración combinada mejoró significativamente la eficacia terapéutica del DOX (Figuras 1W; S2Q y S2R), lo que se reflejó aún más en menos nódulos metastásicos pulmonares (Figuras S2S y S2T). La tinción con hematoxilina-eosina (H&E) y Ki-67 reveló tejido tumoral dañado e inhibición de la proliferación de células cancerosas, respectivamente (Figura 1X). El análisis de inmunofluorescencia reveló una señalización de STAT3 elevada y una mayor deposición de lípidos después de la quimioterapia, lo que mejoró después del tratamiento con NaSH (Figura 1Y). En resumen, demostramos que el H2S exógeno inhibió la señalización de STAT3 y promovió la señalización de STAT1, lo que resultó en la supresión de la captación de ácidos grasos y la β-oxidación. Además, la inhibición mediada por H2S mejoró la inmunogenicidad, lo que sensibilizó sinérgicamente el cáncer de mama a la quimioterapia (Figura 1Z).

Cribado de iones metálicos y construcción de NiS@ALB

Primero, seleccionamos iones metálicos esenciales típicos para los organismos con el fin de identificar posibles candidatos para la metalo-inmunoterapia, lo que resultó en una citotoxicidad diferencial hacia las células 4T1 y DC2.4 (Figuras 2A y 2B; Figura S3A). La microscopía óptica reveló una muerte celular similar a la piroptosis (hinchazón y formación de espuma) después del tratamiento con Co2+ y Ni2+ (Figura S3B). Un ensayo de Western blot sugirió que Fe2+, Co2+ y Ni2+ activaron el inflamasoma NLRP3 en las células 4T1, con la caspasa-1 (C-Cas-1) y el fragmento amino-terminal de GSDMD (GSDMD-N) más significativamente escindidos detectados después del tratamiento con Ni2+ (Figura 2C). Sin embargo, la vía Cas-3-GSDME no se activó significativamente y puede estar asociada con el patrón de hipermetilación de DFNA5 en el cáncer de mama. La escisión significativa de Cas-3 inducida por Cu2+ puede conducir principalmente a la apoptosis, lo que es consistente con la morfología observada de redondeamiento y encogimiento (Figuras S3B y S3C). En comparación con los inhibidores de la apoptosis, la necroptosis o la ferroptosis, solo el VX-765 (un inhibidor de la caspasa-1) rescató la mayor cantidad de células que morían inducidas por Ni2+ (Figura S3D). Además, Ni2+ aumentó eficazmente la expresión de Myd88 en las células DC2.4 (Figura 2C). Para validar nuestros hallazgos, se extrajeron células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) para su incubación con iones metálicos. Mn2+, un potente agonista de STING, primero estimuló la maduración de las DC, pero pareció ser tóxico a altas concentraciones. Como se esperaba, Co2+, Ni2+ y Cu2+ estimularon la maduración de las DC, y la proporción más alta de DC maduras se detectó después de la incubación con Ni2+ (Figuras 2D; S3E). También se capturó la fluorescencia más brillante de Myd88 en las DC tratadas con Ni2+ (Figura 2E). Estos resultados sugirieron que los iones metálicos tienen un gran potencial en la regulación positiva de la respuesta inmune antitumoral, en la que Ni2+ puede activar los inflamasomas, desencadenar la muerte celular inflamatoria del cáncer y estimular eficazmente la maduración de las DC a través del eje receptor tipo Toll (TLR)-Myd88, lo que los convierte en candidatos competitivos para la metalo-inmunoterapia.

A continuación, pretendimos construir una nanoplattaforma integrada con metalo-inmunoterapia y liberación estable de H2S. Se seleccionó un método simple de biomineralización asistida por ALB para sintetizar nanopartículas bioactivas de NiS@ALB. En resumen, la albúmina sérica bovina sirvió como plantilla para proporcionar sitios de unión y adsorber iones Ni2+, y luego se añadió Na2S en condiciones alcalinas. Después de la mineralización y el envejecimiento a temperatura ambiente, el NiS se nucleó y creció en las nanocajas de albúmina, formando nanopartículas de NiS@ALB con abundantes polisulfuros que podían responder a la escisión de GSH y liberar gas H2S a través del mecanismo "tiol-polisulfuro" (Figura 2F).^[45],^[46],^[47],^[48] La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló una morfología esférica de las nanopartículas de NiS@ALB, donde el Ni y el S se distribuyeron uniformemente (Figuras 2G y 2H; Figura S3F). El diámetro hidrodinámico de NiS@ALB fue de ∼140 nm en diferentes medios, y el potencial zeta fue de −29,3 ± 1,51 mV, lo que garantiza la dispersión y la estabilidad en condiciones fisiológicas (Figura 2I). La difracción de rayos X (XRD) reveló la estructura amorfa de NiS@ALB (Figura S3G). El análisis de espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) sugirió múltiples estados químicos del níquel. El azufre existió principalmente en tres formas, incluyendo sulfuros metálicos (∼161,7 eV, atribuido a los enlaces Ni–S), sulfuros orgánicos (∼163,5 eV, incluyendo C–S, S–S y polisulfuros) y sulfatos (∼167,8 eV) (Figuras 2J y 2K; Figura S3H). Debido a la susceptibilidad de los polisulfuros a ser escindidos por GSH, NiS@ALB agotó eficazmente el GSH con el tiempo y la concentración crecientes (Figuras 2L–2O), durante el cual proceso se liberó gas H2S, como lo indica el papel indicador de acetato de plomo y la sonda WSP-1 (Figuras 2P y 2Q). El análisis de XPS indicó que el níquel fue parcialmente reducido por GSH. En particular, la disminución en la proporción de sulfuros orgánicos indicó la fragmentación de los polisulfuros por el ataque de GSH (Figuras 2R y 2S; Figura S3I). La espectroscopía Raman reveló que un pico de polisulfuro ubicado en ∼480 cm−1 se debilitó después del tratamiento con GSH (Figura 2T).^[49] Las sondas WSP-1 midieron la liberación acelerada de H2S con el aumento de la concentración de GSH (Figuras 2U; S3J). La liberación de H2S alcanzó su punto máximo en 1 hora y se mantuvo significativamente más alta que en condiciones sin GSH durante 5 horas (Figuras 2V; Figuras S3K y S3L). El método colorimétrico de azul de metileno (MB) cuantificó aún más el rendimiento de H2S, que aumentó con el aumento de la concentración y el tiempo de GSH (Figuras 2W y 2X; Figuras S3M–S3P). Además, NiS@ALB se degradó en una solución incolora y transparente en solución acuosa (Figura 2Y). Las imágenes de TEM también revelaron el colapso de las nanoestructuras de NiS@ALB en nanopuntos ultrapequeños (Figura 2Z). En conjunto, los resultados anteriores demostraron la construcción exitosa de una nanoplattaforma activable para la co-administración de gas bioactivo e iones metálicos.

Los nanomoduladores gas-metabólicos potencian la quimiosensibilidad del cáncer de mama

Dadas las propiedades sobresalientes de NiS@ALB, los efectos biológicos in vitro se investigaron posteriormente en células de cáncer de mama 4T1. La generación intracelular de H2S se detectó mediante sondas WSP-1. La adición de 1 mM de GSH aumentó la intensidad de la fluorescencia, que disminuyó después del pretratamiento con N-etilmaleimida (NEM, un eliminador de tioles) (Figura 3A). El tinte JC-1 detectó un aumento de la fluorescencia verde de las mitocondrias anormales, lo que sugiere el colapso del potencial de membrana mitocondrial (Figuras 3B; S3Q). Un ensayo de Western blot reveló la disminución de la fosforilación de STAT3 y la expresión de CD36, FABP5 después del tratamiento con NiS@ALB, principalmente atribuible a la liberación de H2S (Figura 3C). La inhibición de las gotas de lípidos podría conducir a una disminución en la expresión de PLIN2 y la posterior alteración de la bioenergía. De manera similar, tanto el acetil-CoA como la ACC disminuyeron después del tratamiento con NiS@ALB (Figuras 3G–3I). Además, el acetil-CoA también es un precursor para la biosíntesis de colesterol.^[43] Se observó una débil fluorescencia azul del colesterol, como lo indica el tinte Fillipin Ⅲ (Figura S3R). Posteriormente, se detectaron niveles reducidos de CPT1A y actividades de FAO, lo que también puede estar asociado con el daño mitocondrial mediado por H2S (Figuras 3J; S3S). Estos efectos finalmente resultaron en una reducción del nivel de ATP intracelular (Figura 3K). Aunque la inducción con oleato de sodio aumentó el número de gotas de lípidos intracelulares y la deposición de colesterol, NiS@ALB revirtió estos efectos (Figuras 3L–3N). Una mayor investigación de los indicadores del metabolismo de los lípidos también confirmó el potencial de NiS@ALB para regular el metabolismo de los ácidos grasos en condiciones de alto contenido de lípidos (Figuras 3O–3R). Como se esperaba, se detectaron niveles más bajos de actividad de FAO, niveles de ATP intracelular y tasas de consumo de oxígeno (Figuras 3S–3U; Figura S3T). En concentraciones que no causaron una citotoxicidad significativa, la coincubación con NiS@ALB aumentó la citotoxicidad de los fármacos quimioterapéuticos (Figuras S3U y S3V). Lo más importante, los modelos de alto contenido de lípidos mejoraron la resistencia de las células 4T1 a DOX, pero se volvieron más sensibles después del tratamiento con NiS@ALB (Figura 3V). En conjunto, estos datos sugirieron que NiS@ALB podría servir como un potente nanomodulador gas-metabólico para aumentar la quimiosensibilidad del cáncer de mama (Figura 3W).

La metalo-inmunoterapia induce la muerte celular pirotótica del cáncer y moviliza las células inmunitarias

A continuación, evaluamos el potencial de NiS@ALB como un agente de metalo-inmunoterapia para mejorar la inmunogenicidad del cáncer de mama (Figura 4A). Los resultados de MTT sugirieron una citotoxicidad significativa en comparación con la de NaSH o Ni2+ solos (Figura 4B). La muerte celular inmunogénica se evaluó mediante la exposición de calreticulina (CRT), la liberación de la proteína HMGB1 y la fuga de ATP (Figuras 4C y 4D). Para dilucidar aún más el mecanismo de muerte celular, se capturaron morfologías similares a la piroptosis con hinchazón y formación de espuma mediante microscopía óptica, y se detectó una abundante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (Figuras S4A y S4B). El tinte Annexin V-FITC/PI reveló burbujas gigantes en la membrana plasmática y permeabilidad al yoduro de propidio (PI) en las células tratadas con Ni2+ y NiS@ALB, lo que sugiere cambios en la permeabilidad de la membrana durante la muerte celular inflamatoria (Figura 4E). Los ensayos de Western blot detectaron el ensamblaje de los inflamasomas NLRP3 y la aparición de C-Cas-1 y GSDMD-N. IL-1β e IL-18 se maduraron y se liberaron (Figura 4F). Aunque Ni2+ aumentó las especies reactivas del oxígeno dentro de las células, no se detectaron variaciones significativas en los niveles de peroxidación lipídica (LPO) (Figuras S4C y S4D). El cotratamiento con inhibidores de la muerte celular confirmó aún más que la piroptosis fue la forma dominante de muerte celular (Figura S4E). A continuación, exploramos el potencial de NiS@ALB para sensibilizar las células de cáncer de mama a la quimioterapia. En comparación con la incubación con DOX solo, la coincubación con NiS@ALB resultó en una fluorescencia de CRT más brillante (Figuras 4G y 4H), y se detectaron concentraciones más altas de HMGB1 y ATP en el sobrenadante celular (Figuras 4I y 4J). Además, la liberación de H2S puede mediar el proceso de desmetilación (Figura S4F). Un ensayo de Western blot reveló que la regulación al alza de las metiltransferasas después del tratamiento con DOX se alivió mediante la coincubación con NiS@ALB, lo que indica que la resistencia a los fármacos inducida por la quimioterapia se inhibió eficazmente (Figura 4K). Por lo tanto, el aumento de la inmunogenicidad permitió que DOX indujera la piroptosis mediada por GSDME, caracterizada por el aumento de la expresión de GSDME-N y C-Cas-3 (Figura 4K). Para dilucidar aún más los mecanismos terapéuticos subyacentes, se realizó un análisis de transcriptómica para revelar las variaciones de ARNm en las células 4T1 tratadas con NiS@ALB (Figuras 4L; S4G y S4H). En particular, los genes clave involucrados en el metabolismo de los lípidos, el proceso de FAO y la metilación se redujeron significativamente, mientras que los genes relacionados con la respuesta inmune inflamatoria y el proceso de desmetilación se regularon al alza (Figura 4M). El análisis KEGG de todos los DEG sugirió el enriquecimiento de varias vías de señalización proinflamatorias (Figura 4N). El enriquecimiento GO indicó que los genes se distribuyeron principalmente en conjuntos de genes relacionados con la inflamación y el metabolismo, lo que sugiere la alteración de estos procesos biológicos (Figura 4O). GSEA confirmó los resultados anteriores y reveló la regulación positiva de varias respuestas inmunes antitumorales (Figura S4I).

Hasta ahora, descubrimos que NiS@ALB desencadenó una respuesta inflamatoria mediada por piroptosis. Dado que los iones Ni2+ son potentes agonistas inmunes, a continuación, investigamos su capacidad para movilizar las células inmunitarias. Como se esperaba, tanto Ni2+ como NiS@ALB maduraron las BMDC (Figuras 4P y 4Q) y promovieron la secreción de TNF-α e IL-12p70 (Figuras 4R; S4J). Una validación adicional indicó que Ni2+ polarizó las células RAW264.7 hacia el fenotipo M1 (Figuras 4S; S4K) y elevó los niveles de varias citocinas proinflamatorias en el sobrenadante celular (Figuras 4T; S4J). La inmunofluorescencia reveló los mecanismos por los cuales Ni2+ aumentó la expresión de iNOS, Myd88 e IRF3, lo que condujo posteriormente a la ubiquitinación y la degradación proteasómica de IKBα, liberando NF-κB para la translocación nuclear (Figuras 4U y 4V; Figura S4l). La evidencia anterior reveló que NiS@ALB sirvió como un potente adyuvante metalo para activar el eje TLR-Myd88-NF-κB para movilizar las células inmunitarias (Figura 4W).

Eficacia antitumoral in vivo y evaluación inmune

Tras identificar NiS@ALB como una nanoplattaforma multifuncional para modular la inmunoterapia metabólica, realizamos experimentos in vivo para estudiar su eficacia terapéutica y su mecanismo de acción (Figura 5A). El Ni2+ libre y el Stattic inhibieron marginalmente el crecimiento tumoral. En cambio, dos dosis de inyección de NiS@ALB suprimieron con éxito la progresión tumoral (Figuras 5B y 5C; Figuras S4M y S4N). Además, la imagen de los tumores después de la inyección de NiS@ALB reveló que se liberaron grandes cantidades de H2S en 24 horas y que los niveles volvieron a la línea de base después de 72 horas. El grado de inhibición de p-STAT3 también se correlacionó fuertemente con la liberación de H2S in vivo (Figuras S4O–S4Q). La tinción de inmunofluorescencia reveló la supresión de p-STAT3 y los indicadores del metabolismo lipídico, y el aumento de NLRP3, C-Cas-1 y GSDMD-N después de 2 dosis de tratamiento con NiS@ALB (Figuras 5D; S4R). Además, no hubo fluctuaciones significativas en el peso de los ratones durante el período de tratamiento, y no se detectaron anomalías evidentes en las funciones hepáticas o renales (Figuras S4S–S4U).

Se realizó una evaluación inmunitaria dos días después de la última administración (Figura 5E). La citometría de flujo reveló una maduración significativa de las células dendríticas (DCs) en los tumores después de la sensibilización con Ni2+ (Figuras 5F; S5A). En particular, el Stattic tuvo ciertos efectos de activación inmunitaria, lo que sugiere el potencial de la inhibición de STAT3 en la inmunoterapia. Estimuladas por la presentación de antígenos de las DCs maduras, el número de células T CD8+ casi se duplicó, y la proporción de células T CD4+ aumentó después del tratamiento con NiS@ALB, y el H2S también activó las células T, lo que fue consistente con estudios previos (Figuras 5G y 5H; Figuras S5B y S5C).^[50] La regulación al alza de las células T IFN-γ+ indicó la potente activación de los linfocitos T citotóxicos (Figuras 5I; S5D). Tanto el Ni2+ como el NiS@ALB sensibilizaron las células asesinas naturales (NK) (Figuras 5J; S5E) y polarizaron los macrófagos asociados al tumor (TAM) hacia el fenotipo M1 (Figuras 5K; S5F y S5G). En consecuencia, las células T reguladoras inmunosupresoras (Tregs) se redujeron (Figuras 5L; S5H). Las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSCs) dependen de la señalización de STAT3 para mantener su función inmunosupresora,^[51],^[52], lo que se alivió con los inhibidores de STAT3 H2S y Stattic. Sin embargo, el tratamiento con NiS@ALB reclutó MDSCs, posiblemente para contrarrestar la intensa respuesta inflamatoria desencadenada por el Ni2+ (Figuras 5M; S5I). Como se ha demostrado previamente, la regulación al alza de cxcl2 y la muerte celular pirotótica pueden transmitir señales de reclutamiento a las MDSCs para regular negativamente la respuesta inmunitaria (Figura 4M).^[53],^[54] Por lo tanto, se detectaron altos niveles de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-12p70 dentro del tumor (Figuras 5N; S5J). Además, detectamos proporciones más altas de DCs linfáticas maduras y concentraciones de TNF-α después del tratamiento con NiS@ALB (Figura S5K), aunque los niveles de otras citocinas no difirieron significativamente debido a las limitaciones en el número de muestras (Figura S5L). La administración combinada de VX-765 (Belnacasan), un inhibidor específico de la caspasa-1, debilitó los efectos terapéuticos (Figuras 5O y 5P; Figura S5M), y se detectaron menos DCs maduras infiltrantes tumorales, células T CD8+/CD4+ y células NK (Figuras 5Q–5T; Figuras S5N–S5Q). En particular, el cotratamiento con VX-765 redujo la infiltración de MDSCs dentro del tumor y redujo la expresión de Arg-1, un marcador efector inmunosupresor de las MDSCs, lo que demuestra aún más que la piroptosis inducida por NiS@ALB fue un desencadenante directo de la quimiotaxis de las MDSCs (Figuras 5U y 5V; Figura S5R). Por lo tanto, la combinación de anticuerpos αLy6G/Ly6C (Gr-1) con el tratamiento con NiS@ALB para eliminar las MDSCs logró una mejor eficacia y promovió una mayor infiltración de células T (Figuras 5W–5Y; Figura S5S).

NiS@ALB sensibiliza los tumores de mama a DOX y estimula una respuesta inmunitaria sistémica

Dado que la resistencia a la quimioterapia es un desafío importante en el tratamiento del cáncer de mama, exploramos el potencial de NiS@ALB para sensibilizar el cáncer de mama a DOX (Figura 6A). La resistencia a DOX condujo a efectos antitumorales insignificantes, mientras que NiS@ALB simplemente suprimió el crecimiento tumoral en las primeras etapas. Sin embargo, la administración combinada inhibió el crecimiento tumoral en 20 días y resultó en el menor peso del bazo (Figuras 6B y 6C; Figuras S6A–S6C). Además, se observaron menos nódulos metastásicos pulmonares después del tratamiento combinado (Figuras 6D y 6E). La tinción con H&E y Ki-67 reveló una muerte generalizada de las células cancerosas y la inhibición de la proliferación tumoral en el grupo combinado (Figura 6F). La inmunofluorescencia reveló la activación de la señalización de STAT3 y un aumento posterior en la deposición de lípidos después de la quimioterapia, lo que podría ser la base para la adquisición de resistencia a los fármacos en las células cancerosas de mama y se revirtió después del tratamiento con NiS@ALB (Figura 6G).

A continuación, investigamos la iniciación de las respuestas inmunitarias sistémicas (Figura 6H). DOX puede inducir la muerte celular inmunogénica y poseer ciertas propiedades de activación inmunitaria. Para nuestra sorpresa, se detectó una proporción más alta de DCs migratorias maduras (MigDCs) y DCs residentes (ResDCs) en los ganglios linfáticos después de la terapia combinada (Figuras 6I y 6J; Figuras S6D y S6E). En consecuencia, la maduración de las DCs dentro del tumor aumentó (Figuras 6K; S6F). La regulación al alza de las MigDCs presentadoras de antígenos y la posterior maduración de las ResDCs marcaron la iniciación efectiva de la respuesta inmunitaria antitumoral. Estas células presentadoras de antígenos presentan antígenos tumorales a través de las moléculas MHC-2 para guiar el reconocimiento de las células T helper, lo que desencadena una respuesta inmunitaria adaptativa. Por lo tanto, los porcentajes de células T CD8+ y CD4+ aumentaron significativamente (Figuras 6L y 6M; Figuras S6G y S6H). Además, la relación de macrófagos M1 a M2 aumentó en el grupo de terapia combinada (Figuras 6N; S6I–S6K). El número de MDSCs se mantuvo alto en el microambiente tumoral (TME), lo que indica una inflamación local grave (Figura S6L). Además, extrajimos el bazo para el análisis de linfocitos. En particular, el aumento en el número de células T CD8+ efectoras IFN-γ+ indicó la activación de la respuesta inmunitaria sistémica (Figuras 6O; Figuras S6M y S6N). Más importante aún, observamos una proporción elevada de células T CD44+ CD8+ y CD44+ CD4+ efectoras/de memoria en el bazo (Figuras 6P y 6Q; Figuras S6O y S6P). En consecuencia, se detectaron altas concentraciones de TNF-α, IFN-γ e IL-1β tanto en el suero como en el tumor (Figuras 6R–6T; Figura S6Q). Para demostrar aún más la generación de memoria inmunitaria, realizamos experimentos de retoterapia tumoral (Figura S7A). El grupo de quimioterapia sensibilizada con NiS@ALB exhibió un control tumoral significativo y la infiltración de células T, con más células T CD8+ efectoras IFN-γ+ detectadas en los tumores retoterapéuticos (Figuras S7B–S7D). Mientras tanto, tanto las células T de memoria central CD8+/CD4+ (Tcm) como las células T de memoria efectoras (Tem) aumentaron en la sangre periférica (Figuras S7E y S7F). Finalmente, para evaluar las limitaciones de nuestra estrategia, detectamos una mayor expresión de PD-L1 después de la quimioinmunoterapia combinada, lo que proporcionó señales reguladoras negativas y aumentó la expresión de PD-1 (Figura 6U). La inducción de la expresión de PD-L1 puede deberse a la estimulación inmunitaria terapéutica y podría resultar en última instancia en el agotamiento de las células T.^[55]

La combinación con la terapia ICB inhibe eficazmente el crecimiento y la metástasis tumoral

Las señales de regulación al alza de la expresión de PD-L1 y PD-1 nos animaron a combinar aún más la terapia ICB para obtener una mejor eficacia, ya que esto sugirió una posible sensibilidad al bloqueo de PD-L1/PD1. Dado que la combinación de pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) y las quimioterapias ha sido aprobada como tratamiento de primera línea en pacientes con cáncer de mama triple negativo metastásico,^[56], se seleccionó αPD-1 para los ensayos de terapia combinada posteriores. Construimos modelos de tumores 4T1 bilaterales para la validación de la inmunidad antitumoral sistémica (Figura 7A). Tanto DOX libre como αPD-1 no lograron inhibir el crecimiento tumoral, y la terapia combinada con DOX y αPD-1 también mostró una eficacia deficiente, lo que es consistente con la pequeña proporción de pacientes que se benefician clínicamente. Aunque la administración de NiS@ALB + DOX suprimió con éxito la progresión del tumor primario, inhibió moderadamente el crecimiento del tumor distante. Sin embargo, la terapia triple combinada con αPD-1 controló significativamente tanto los tumores primarios como los distantes e inhibió eficazmente la metástasis pulmonar (Figuras 7B–7D; Figuras S7G y S7H). Debido al bloqueo de la expresión de PD-1, los números de células T CD8+ y CD4+ en los tumores primarios y distantes aumentaron aún más (Figura 7E).

Dado que la terapia combinada con αPD-1 puede amplificar la inmunidad sistémica mediada por células T para superar los tumores bilaterales y metastásicos, construimos a continuación un modelo de tumor 4T1 ortotópico para simular mejor el microambiente fisiológico del cáncer de mama, en el que los nódulos metastásicos pueden formarse espontáneamente en múltiples órganos (Figura 7F). A través de la imagen in vivo de bioluminiscencia, observamos que los ratones que recibieron la administración combinada de NiS@ALB y DOX exhibieron señales de bioluminiscencia más débiles que aquellos que recibieron solo quimioterapia o terapia ICB. Tanto los tumores primarios como los distantes se inhibieron en 25 días después de la combinación adicional con el anticuerpo αPD-1 (Figuras 7G–7I; Figura S7I). La imagen de bioluminiscencia de los pulmones de los ratones en cada grupo reveló menos nódulos metastásicos pulmonares en el grupo de tratamiento combinado (Figura 7J). En conjunto, estos resultados demostraron que la quimioterapia sensibilizada con NiS@ALB más la inmunoterapia αPD-1 pueden inhibir eficazmente la progresión del tumor de mama ortotópico y prevenir la metástasis pulmonar.

Potente capacidad antitumoral en un modelo de xenoinjerto resistente a fármacos

El modelo de xenoinjerto simula el entorno de crecimiento de los tumores humanos y refleja la sensibilidad a los fármacos experimentales. Con este fin, construimos un modelo de xenoinjerto resistente a fármacos inoculando subcutáneamente células MCF-7/ADR (resistentes a la adriamicina) de cáncer de mama humano en el flanco derecho de ratones desnudos (Figura 7K). La escasa eficacia del tratamiento único con DOX indicó la resistencia de las células MCF-7/ADR a la quimioterapia. Aunque NiS@ALB inhibió moderadamente el crecimiento tumoral debido a una respuesta inmunitaria insuficiente en ratones desnudos inmunodeprimidos, el tratamiento combinado suprimió el crecimiento tumoral en 40 días (Figuras 7L y 7M). En general, los resultados anteriores indicaron que NiS@ALB puede sensibilizar los tumores humanizados resistentes a DOX a los agentes quimioterapéuticos.

Discusión

La evidencia extensa sugiere que la alteración metabólica, como una de las características fenotípicas más reconocidas en los tumores, está en gran medida orquestada por la señalización de STAT, que regula simultáneamente la expresión de múltiples genes a nivel transcripcional y epigenético.^[14],^[57] En el cáncer de mama, la activación excesiva de STAT3 promueve la supervivencia, el crecimiento y la invasión de las células cancerosas, lo que también está asociado con la progresión, la metástasis y la resistencia terapéutica.^[58] Se ha establecido la correlación entre la señalización de STAT3 y el metabolismo lipídico reprogramado.^[14] Las proteínas STAT3 no solo aumentan la importación de lípidos al actuar como factores de transcripción para aumentar la expresión de CD36 y FABPs, sino también la síntesis de lípidos y la FAO mitocondrial en las células tumorales de mama, lo que desempeña un papel crucial en la tumorigénesis y la resistencia a la quimioterapia.^[14],^[17],^[59]

Inspirados en la bioactividad de las moléculas de señalización gaseosa endógena, demostramos el potencial del H2S para sensibilizar el cáncer de mama a la quimioterapia. Aunque un estudio previo informó que el H2S mejoraba la eficacia quimioterapéutica al promover la penetración del fármaco,^[60] nuestro objetivo fue establecer un vínculo entre la modulación del metabolismo gaseoso y la mejora de la quimiosensibilidad. El H2S exógeno mantuvo la fosforilación de STAT1 y suprimió la activación de STAT3, promotor del cáncer, para regular el metabolismo lipídico mediante la reducción de la deposición de lípidos y la β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales (FAO). A pesar de la inhibición competitiva de STAT1 y STAT3, la adición de un inhibidor de STAT1 no revirtió la inhibición de STAT3 por el H2S, lo que sugiere que el H2S podría regular la señalización de STAT3 de forma independiente en el cáncer de mama. El efecto inhibidor directo del H2S sobre STAT3 se ha investigado en modelos que incluyen, entre otros, el CCH,^[25],^[26], las células microgliales,^[61], las células del músculo liso,^[62] y las células tubulares renales.^[63] Los mecanismos subyacentes están estrechamente relacionados con la inactivación de STAT3 mediada por la persulfidación de proteínas y la inhibición de la inflamación mediada por IL-6, mientras que la deficiencia endógena de H2S estimula la fosforilación de STAT3, lo que sugiere aún más la relevancia de los transmisores gaseosos para STAT3 en múltiples modelos de enfermedad.^[25],^[64],^[65] Además, el H2S alivió el patrón de hipermetilación posterior al tratamiento con DOX al inhibir la actividad de las DNMT para mejorar la inmunogenicidad tumoral, lo que condujo a una mayor expresión y escisión de GSDME. Aunque el H2S por sí solo no causó la muerte directa de las células tumorales, dado que la compleja red metabólica permite que el H2S aumente el flujo metabólico de la glucosa a través de vías de compensación energética,^[66], múltiples mecanismos indicaron que la exposición al H2S aumentó la sensibilidad de las células del cáncer de mama a los fármacos quimioterapéuticos, como se demostró tanto in vitro como in vivo.

Además, los iones de metales de transición son potentes agonistas de los TLR, que desempeñan funciones críticas en la respuesta inmune innata y adaptativa.^[33] Se ha identificado que Ni2+ y Co2+ son metales de contacto alergénicos que provocan reacciones inflamatorias.^[33],^[67] Seleccionamos los iones Ni2+ como candidatos potentes para la metalo-inmunoterapia, que podrían servir como metalo-adjuvantes eficaces para activar múltiples células inmunes y desencadenar la piroptosis de las células cancerosas dependiente de Cas-1-GSDMD. Aunque la activación de TLR4 humana inducida por Ni2+ es específica de la especie debido a la conformación de la proteína,^[68], el Ni2+ puede activar directamente MyD88 y la señalización del receptor IL-1 en ratones y desencadenar alergias,^[69], que son proteínas adaptadoras clave activadas por los TLR ascendentes para conectar la vía NF-κB descendente y promover la señalización inmune innata.

Basándonos en los hallazgos anteriores, se construyó NiS@ALB para la administración controlada de H2S con el fin de modular la señalización de STAT3 y reducir la captación, síntesis y oxidación de lípidos en las células del cáncer de mama. Aunque la síntesis de ácidos grasos mediada por ACC compite con el proceso de FAO mitocondrial, la co-regulación descendente puede ser un resultado sinérgico de la intervención de STAT3, ya que la señalización de STAT3 regula tanto la síntesis como la oxidación de lípidos.^[14],^[17] El H2S interrumpió la función mitocondrial, y la regulación descendente del sustrato co-metabólico acetil-CoA condujo al colapso sistémico del metabolismo energético intracelular, lo que sensibilizó sinérgicamente las células del cáncer de mama al DOX. Además, la metalo-inmunoterapia mediada por Ni2+ provocó la piroptosis de las células cancerosas y movilizó múltiples células inmunes para iniciar una fuerte inmunidad antitumoral. Aunque el H2S inhibió la infiltración intratumoral de MDSC, la intensa inflamación local posterior al tratamiento con NiS@ALB aumentó esta población celular. La inhibición de la piroptosis atenuó la supresión tumoral y redujo la quimiotaxis y la función inmunosupresora de los MDSC. La depleción in vivo de los MDSC mejoró la eficacia terapéutica y la infiltración de células T. En particular, los niveles de H2S después de la inyección del fármaco se correlacionaron positivamente con la inhibición de p-STAT3 in vivo. Las altas concentraciones de gas intratumoral dentro de las 12 a 24 horas inhibieron significativamente la señalización de STAT3, proporcionando una "ventana terapéutica" para la quimioterapia combinada posterior. Por lo tanto, NiS@ALB sensibilizó los tumores de mama a la quimioterapia y activó una respuesta inmune sistémica para erradicar los tumores metastásicos. La quimio-inmunoterapia combinada proporcionó protección inmune en ratones, inhibió fuertemente el crecimiento tumoral de reexposición y aumentó la memoria inmune y las poblaciones de células T efectoras. La sinergia con αPD-1 promovió aún más la infiltración de células T, lo que suprimió con éxito la progresión del tumor de mama bilateral y ortotópico e inhibió la metástasis pulmonar.

Nuestro estudio se centró en la reorganización metabólica para inducir resistencia a la quimioterapia y baja inmunogenicidad en el cáncer de mama, y propuso una estrategia bioactiva de gas-ión metálico para la modulación metabólica-inmune (Figura 7N). Múltiples modelos preclínicos confirmaron la robusta eficacia y el potencial traslacional de NiS@ALB. Estos hallazgos son fundamentales para el avance de las intervenciones clínicas actuales para la terapia del cáncer.

Limitaciones del estudio

Reconocemos ciertas limitaciones de este estudio. En primer lugar, aunque descubrimos que el transmisor de gas H2S puede inhibir la señalización de STAT3 y mantener la señalización de STAT1 para mejorar la sensibilidad a la quimioterapia en el cáncer de mama, el mecanismo específico sigue sin estar claro. Una mayor exploración de los sitios activos ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas más específicas. En segundo lugar, los modelos primarios in vivo empleados en este trabajo, que se basan principalmente en las líneas celulares 4T1 y MCF-7, pueden no reproducir completamente la heterogeneidad genética y fenotípica de los cánceres de mama humanos. El uso futuro de modelos de organoides o modelos de xenoinjerto derivados del paciente (PDX) ayudará a mejorar la relevancia de la investigación traslacional. En tercer lugar, dada la quimiotaxis de los MDSC generados por una fuerte estimulación inmune, se debe investigar la posibilidad de múltiples terapias combinadas, ya que la eliminación de esta población de células inmunosupresoras es crucial para la eficacia de la inmunoterapia a largo plazo. Por último, como validación conceptual, la administración local de fármacos puede no ajustarse completamente al escenario de tratamiento clínico. Los estudios futuros centrados en las vías de administración sistémica de fármacos acelerarían enormemente la traslación clínica. El enriquecimiento tumoral de los nanomedicamentos, la cinética de liberación de gas in vivo y la posible biosseguridad de los iones metálicos merecen una mayor investigación.

Limitaciones del estudio

Reconocemos ciertas limitaciones de este estudio. En primer lugar, aunque descubrimos que el transmisor de gas H2S puede inhibir la señalización de STAT3 y mantener la señalización de STAT1 para mejorar la sensibilidad a la quimioterapia en el cáncer de mama, el mecanismo específico sigue sin estar claro. Una mayor exploración de los sitios activos ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas más específicas. En segundo lugar, los modelos primarios in vivo empleados en este trabajo, que se basan principalmente en las líneas celulares 4T1 y MCF-7, pueden no reproducir completamente la heterogeneidad genética y fenotípica de los cánceres de mama humanos. El uso futuro de modelos de organoides o modelos de xenoinjerto derivados del paciente (PDX) ayudará a mejorar la relevancia de la investigación traslacional. En tercer lugar, dada la quimiotaxis de los MDSC generados por una fuerte estimulación inmune, se debe investigar la posibilidad de múltiples terapias combinadas, ya que la eliminación de esta población de células inmunosupresoras es crucial para la eficacia de la inmunoterapia a largo plazo. Por último, como validación conceptual, la administración local de fármacos puede no ajustarse completamente al escenario de tratamiento clínico. Los estudios futuros centrados en las vías de administración sistémica de fármacos acelerarían enormemente la traslación clínica. El enriquecimiento tumoral de los nanomedicamentos, la cinética de liberación de gas in vivo y la posible biosseguridad de los iones metálicos merecen una mayor investigación.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, póngase en contacto con el contacto principal, Liang Cheng (lcheng2@suda.edu.cn), quien atenderá y cumplirá las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con los códigos de acceso PRJNA1446327 y PRJNA1446736.
•Este estudio no informó sobre código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este documento está disponible en el contacto principal a petición.

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Disponibilidad de materiales

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•Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con los códigos de acceso PRJNA1446327 y PRJNA1446736.
•Este estudio no informó sobre código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este documento está disponible en el contacto principal a petición.

Agradecimientos

Este artículo contó con el apoyo parcial de la 10.13039/501100001809 Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U25A20246 y 52472288), la 10.13039/501100004608 Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Jiangsu (Proyecto de Ascenso, BK20250005), la 10.13039/501100004608 Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20255001), el 10.13039/501100012462 Centro de Innovación Colaborativa de Ciencia y Tecnología Nano de Suzhou, el 10.13039/501100013314111 Proyecto, el Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación de Materiales y Dispositivos Funcionales a Base de Carbono y el Programa de Investigación y Práctica de Posgrado de la Provincia de Jiangsu (KYCX25_3455). Los autores también agradecen al sitio web app.biorender.com por su ayuda en la creación de las ilustraciones esquemáticas.

Contribuciones de los autores

Z.P., N.Y. y L.C. concibieron el proyecto; Z.P. diseñó los experimentos y produjo el borrador original; Z.P., Y.Y., N.Y., S.S., N.J., F.Y., X.Z., J.N., Y.C., L.L., J.W., F.G. y M.C. realizaron las investigaciones experimentales y el análisis de datos; Y.Y. y W.L. brindaron apoyo clínico y experiencia técnica; y L.C. supervisó el proyecto en general, obtuvo financiación y supervisó la preparación del manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer de mama murino 4T1 y 4T1 con expresión de luciferasa, y los macrófagos de monocitos de leucemia murina RAW264.7 se obtuvieron de ATCC. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea murina DC2.4 se obtuvieron del Banco de Células, Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghái, Academia de Ciencias de China. Las células MCF-7/ADR se compraron a Shanghai Fuheng Biotechnology Co., Ltd. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR por el proveedor y se probaron de forma rutinaria para confirmar la ausencia de contaminación por micoplasma. Las células se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) de FBS, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/mL) en una cámara de incubación humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Se añadió DOX·HCl (500 ng/mL) al medio de cultivo de las células MCF-7/ADR para mantener un fenotipo resistente a los fármacos. Se añadió oleato de sodio (100 μM) al medio de cultivo de 4T1 para simular una condición de alto contenido de lípidos.

Animales y modelo tumoral

Se adquirieron ratones BALB/c y C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad, y ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad, de Hangzhou Qizhen Biological Technology Co. Ltd. Todos los procedimientos que involucran a ratones fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Soochow (Número de Protocolo: 202409A0811). Los ratones se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) en un ambiente controlado (temperatura: 22 ± 2 °C; humedad: 50 ± 10%; ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso libre a alimento estándar para roedores y agua autoclavada. Para establecer el modelo tumoral, se inyectaron por vía subcutánea 2 × 106 células 4T1 en PBS (50 μL) en el lado derecho de la espalda de cada ratón. Para el modelo tumoral bilateral, se inyectaron 2 × 106 células 4T1 en el lado derecho de la espalda de cada ratón en el día -7 para el tumor primario, y posteriormente se inyectaron 1 × 106 células en el lado izquierdo para el tumor distante. Para el modelo tumoral ortotópico de mama, se inyectaron 2 × 106 células 4T1-Luc en el tejido adiposo mamario de los ratones. Para el modelo tumoral xenógeno, se inyectaron 1 × 107 células MCF-7/ADR por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones desnudos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales después de la inoculación de células tumorales y la confirmación de la formación de un tumor palpable.### Nota sobre el sexo de los animales

Este estudio utilizó ratones hembra para los modelos tumorales. Dado que se utilizaron cohortes de un solo sexo para cada modelo animal, no se realizó un análisis formal de la influencia del sexo en los resultados informados. Esto representa una limitación para la generalización de los hallazgos.### Construcción y análisis de la matriz de tejidos

La muestra humana consistió en 136 pacientes con cáncer de mama (mujeres de Asia Oriental, edad media de 54,8 ± 9,1 años, rango de 33 a 76) con diagnóstico clínico y consentimiento informado. Sus tejidos tumorales de mama postoperatorios fueron confirmados patológicamente y recolectados para construir la matriz de tejidos, que se adquirió de Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de la Universidad de Soochow (Número de Aprobación: SUDA20260120H01). La matriz de tejidos de cáncer de mama humano se tiñó posteriormente con p-STAT3 (570), CPT1A (520), CD36 (690), ACLY (620), ACACA/ACC1 (480) y DAPI para inmunofluorescencia en Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Posteriormente, los indicadores del metabolismo lipídico (CPT1A, CD36, ACLY, ACACA/ACC1) y p-STAT3 se puntuaron como negativos (−), débiles (+), moderados (++) y positivos (+++) respectivamente por dos patólogos experimentados según la intensidad de la fluorescencia.### Detalles del método

Análisis de bases de datos públicas

El conjunto de datos GSE176078 se obtuvo de la base de datos GEO de NCBI.^[41] Los datos y resultados de anotación de una sola célula correspondientes se descargaron en formato .h5 de TISCH (BRCA_GSE176078). El software R MAESTRO y Seurat se utilizaron para procesar y analizar los datos de una sola célula. El método t-SNE se utilizó para volver a agrupar las células. Se obtuvieron y analizaron los genes relacionados con el metabolismo lipídico y la información pronóstica de BRCA a partir de Gene Expression Profiling Interactive Analysis (gepia.cancer-pku.cn) basándose en las bases de datos TCGA y GTEx (corte de log2|FC|: 0,585, corte de valor p: 0,05).### Síntesis de nanopartículas NiS@ALB

Las nanopartículas NiS@ALB se sintetizaron mediante un método simple de mineralización a temperatura ambiente. Primero, se añadió gota a gota 1 mL de solución acuosa de Ni(CH3COO)2 (100 mM) a 6 mL de solución de BSA (10 mg/mL) bajo agitación magnética. Después de una mezcla completa, el pH se ajustó lentamente a 8-9 mediante la adición de NaOH (1 M). Luego, se añadió gota a gota otros 2 mL de solución acuosa de Na2S (100 mM) a la mezcla. El sistema se convirtió inmediatamente en una solución de color negro intenso, lo que indica la formación exitosa de precipitados de NiS. Se permitió que la reacción anterior continuara durante 12 horas para mineralizar y formar nanopartículas NiS@ALB. Para purificar las NiS@ALB sintetizadas, la solución se transfirió a un tubo de ultrafiltración (100.000 MWCO) y se centrifugó a 4500 rpm durante 30 minutos para eliminar los componentes no reaccionados. Después de repetirlo tres veces, las nanopartículas NiS@ALB se resuspendieron en agua y se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.### Caracterización

Las imágenes TEM se tomaron en un FEI Tecnai F20 TEM a un voltaje de aceleración de 200 kV. La medición XPS se realizó con un instrumento PHI Quantera SXM equipado con una fuente de excitación de rayos X de Al (1486,6 eV). Los patrones de difracción de rayos X en polvo se recolectaron en un difractómetro de rayos X PANalytical. Los espectros de absorción UV-Vis-NIR se obtuvieron con un espectrofotómetro UV-Vis de PerkinElmer. La dispersión dinámica de la luz (DLS) y el potencial zeta de las nanopartículas se registraron utilizando un MAL VERN ZEN3690. Los contenidos absolutos de níquel se midieron mediante espectrometría de emisión óptica atómica inducida por plasma (ICP-OES). La solución acuosa utilizada en el experimento se preparó a partir de agua desionizada de un sistema de purificación de agua Milli-Q.### Consumo de GSH

Las nanopartículas NiS@ALB se incubaron con GSH (1 mM) en solución acuosa a 37 °C. Después de diferentes tiempos de incubación, el sistema anterior (20 μL) se inyectó en una solución de PBS (480 μL). Luego, se añadieron 2,5 μL (20 mM) de DTNB a la mezcla. Se analizó la absorbancia a ∼412 nm mediante espectroscopía UV-Vis-NIR.### Determinación cualitativa y cuantitativa de la liberación de H2S

Se incubó WSP-1, una sonda sensible al H2S (10 μM), con varias mezclas de reacción, y se generó una curva estándar de NaSH durante 3 horas a 37 °C. La fluorescencia se observó a Ex/Em 465/515 nm mediante un lector de microplacas. Además, se adhirió un trozo de papel de prueba de acetato de plomo a la parte superior de los pequeños platos de Petri y se co-incubó con diferentes sistemas de reacción que contenían NiS@ALB o GSH a 37 °C durante 3 horas para observar el cambio de color del trozo de papel de prueba. Se utilizó el método colorimétrico de MB para la determinación cuantitativa del contenido de H2S. La solución acuosa de NiS@ALB y GSH se co-incubaron durante diferentes tiempos a 37 °C y se centrifugó para obtener el sobrenadante (solución A). Se mezclaron acetato de zinc (40 mM) y acetato de sodio (10 mM) para formar la solución B. Luego, se mezclaron 1 mL de la solución A y 1 mL de la solución B durante 30 minutos. Finalmente, se añadieron 20 μL de FeCl3 y N,N-dimetil-p-fenilendiamina dihidrocloruro (DMPD·2HCl, 0,15 mol/L) respectivamente al sistema durante otros 30 minutos de incubación a 37 °C para formar MB azul. Se detectó la absorbancia a ∼664 nm. Se estableció una curva estándar con diferentes concentraciones de solución de NaSH para calcular la relación lineal entre la concentración y la absorbancia.### Citotoxicidad

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo estándar MTT. En resumen, se sembraron 2 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en condiciones normales o de alto contenido de lípidos durante la noche para la adhesión. Después de varios tratamientos, se retiró el medio de cultivo y se añadió MTT. Después de la incubación durante 4 horas, se utilizó DMSO para disolver el formazán. Se determinó la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La morfología celular se observó con un microscopio óptico. Para determinar el efecto sinérgico de H2S y DOX, las células se pretrataron con NaSH (250 μM) durante 12 horas y luego se co-trataron con NaSH (250 μM) y DOX durante otras 12 horas en condiciones normales y de alto contenido de lípidos. Para determinar la citotoxicidad de varios iones metálicos, las células 4T1 y DC2.4 se co-trataron con MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2 y CuCl2 durante 12 horas de incubación. Para determinar la citotoxicidad de NiS@ALB, las células se trataron con diferentes concentraciones de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB y se incubaron durante la noche. Para determinar el efecto sinérgico de NiS@ALB y DOX, se co-trataron NiS@ALB (100 μM) y DOX en condiciones normales y de alto contenido de lípidos y se incubaron durante la noche. Para determinar la forma de muerte celular, se co-incubaron 10 μM de diferentes inhibidores, incluido el inhibidor de la apoptosis Ac-DEVD-CHO, el inhibidor de la necroptosis Nec-1, el inhibidor de la ferroptosis Fer-1 y el inhibidor de la piroptosis VX-765, con NiCl2 (500 μM) y NiS@ALB (200 μM) durante 12 horas.### Análisis del transcriptoma

Se realizó el secuenciamiento y análisis del mRNA en células 4T1 del grupo NiS@ALB y del grupo no tratado (500 μM durante 12 h, n = 3). Se extrajo el mRNA total de las células con el reactivo TRIzol. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento de los mRNA y se analizaron los mRNA en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 1 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05. Para el secuenciamiento del transcriptoma de los tejidos tumorales, se inyectaron por vía intravenosa ratones con tumores 4T1 con DOX (5 mg/kg) en los días 0 y 3. En el día 10, se extrajeron los tumores 4T1 responsivos (“R”) y no responsivos (“NR”) (n = 3), se cortaron en trozos pequeños (2 mm × 2 mm × 2 mm) y luego se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento con “NR” frente a “R” en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China, y los datos se analizaron a través de https://www.bioinformatics.com.cn, una plataforma en línea para el análisis y la visualización de datos. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 0,585 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05.### Análisis de Western blotting

Las células 4T1 o DC2.4 se sembraron en platos de cultivo de 5 cm y se trataron con 500 μM de MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2, CuCl2, NaSH, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante la incubación durante la noche. Además, se co-trataron NaSH (500 μM) o NiS@ALB (250 μM) con DOX (100 μM) durante 12 horas de incubación, respectivamente. Las proteínas se recolectaron con tampón de lisis que contiene inhibidor de proteasas (PMSF, 1 mM). Después de añadir cantidades iguales de proteína y separación por SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con 5% de BSA durante 2 horas. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C y anticuerpos secundarios durante 4 horas. Después de lavar con PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió el reactivo de quimioluminiscencia y se expusieron las membranas.### Tinción de 5-hmc

Se sembraron 2 × 105 células 4T1 en una placa de 12 pocillos durante la noche, se incubaron con diferentes concentraciones de NaSH durante 12 horas, o con 250 μM de NaSH durante diferentes tiempos, o con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 horas. Luego, las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. Para la tinción de 5-mC o 5-hmC, las células permeabilizadas con 0,1% de Triton X-100 se desnaturalizaron con 2 N de HCl durante 15 minutos y luego se neutralizaron con 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5) durante 10 minutos. Después de bloquear con 5% de BSA durante 1 hora, las células se tiñeron con un anticuerpo primario anti-5-hmc durante 2 horas y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otras 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con PBS y teñir con DAPI, se adquirieron imágenes mediante microscopía confocal láser de barrido (CLSM).### Tinción de lípidos y colesterol

Para la tinción con Oil Red O y BODIPY 493/503, se sembraron 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de una noche de adhesión, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h de incubación. Se utilizó NaSH (∼500 μM) para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. Además, se añadieron diferentes concentraciones de NaSH durante 12 o 24 h de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se tiñeron con un kit de tinción comercial Oil Red O según los protocolos del fabricante y se observaron bajo un microscopio óptico. Posteriormente, se añadió isopropanol para extraer el colorante Oil Red O de cada grupo, y se midió la absorbancia a 500 nm para la cuantificación. Para la tinción con BODIPY 493/503, se co-incubaron 10 μM de la sonda fluorescente con las células tratadas durante 30 min. Después de la tinción con DAPI, se utilizó CLSM para la visualización. Se utilizó Fillipin Ⅲ para la tinción de colesterol. Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h de incubación. Las células se tiñeron con Fillipin Ⅲ (0,1 mg/mL, 1 h) para la visualización con CLSM.### Ensayo de JC-1 y FAO

Se utilizó JC-1 para evaluar la función de las mitocondrias. Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM), GSH (1 mM) o CCCP (10 μM) durante 6 h. Las células se lavaron y se tiñeron con JC-1 (10 μM) durante 30 min. La fluorescencia se analizó mediante CLSM y citometría de flujo. Para detectar la actividad de FAO, se aplicó FAOBlue, una sonda fluorescente intracelular de FAO. Se sembraron uniformemente 2 × 105 células 4T1 en un plato confocal para una noche de adhesión y se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB, Stattic (10 μM) o NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h de incubación. Se utilizó 500 μM de NaSH para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se lavaron y se tiñeron con 10 μM de FAOBlue para la visualización directa con CLSM a Ex/Em 405/460 nm. Para detectar el consumo de oxígeno intracelular, las células de cada grupo tratado según lo descrito anteriormente se tiñeron con la sonda sensible al oxígeno [Ru(dpp)3]Cl2 (10 μM) durante 30 min, cuya fluorescencia puede ser atenuada por el oxígeno intracelular. Después de la fijación y la tinción con DAPI, la fluorescencia roja se detectó mediante CLSM.### Detección de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A

Se sembraron 4T1 (2 × 105) en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de una noche de adhesión, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM), así como con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h de incubación. Las células se trataron con 500 μM de NaSH en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. A continuación, todas las células se lisaron y se recogieron los sobrenadantes para el análisis ELISA de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A utilizando un kit comercial.### Detección de H2S, ROS y LPO intracelulares

Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM) y GSH (1 mM) durante 3 h a 37 °C. Los tioles de las células se eliminaron con N-etilmaleimida (NEM, 1 mM), que se utilizó para un pretratamiento de 30 min de las células adheridas. Se utilizó una sonda fluorescente sensible al H2S comercial, WSP-1 (50 μM), para la tinción de las células a 37 °C durante 30 min. Para la detección de ROS intracelulares, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h y, a continuación, se tiñeron con DCFH-DA (20 μM) durante 30 min. Después de la tinción con DAPI, las células se observaron mediante CLSM. Para la detección de LPO, las células se tiñeron con Liperfluo (10 μM) durante 30 min y, a continuación, se lavaron para el análisis por citometría de flujo.### Tinción de la piroptosis

Se sembraron uniformemente un total de 2 × 105 células 4T1 en un plato confocal para una noche de adhesión y se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Las células se tiñeron con anexina V-FITC e yoduro de propidio (PI) durante 30 min. La morfología de las células pirotóticas se adquirió mediante CLSM.### Detección de CRT y HMGB1

Se sembraron un total de 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 12 h. Las células se incubaron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído y se trataron con una solución de 0,1% de Triton X-100/PBS para la tinción de CRT y una solución de 1% de Triton X-100/PBS para la tinción de HMGB1. Después de bloquear con un 5% de BSA, las células se trataron con anticuerpos primarios anti-calreticulina y anti-HMGB1 durante 2 h y, a continuación, se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488/647 durante otra hora a temperatura ambiente. Las células lavadas se tiñeron posteriormente con DAPI antes de la visualización con CLSM. Para la citometría de flujo, las células se trataron con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante 8 h. Las células se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo siguiendo los pasos anteriores sin fijación con paraformaldehído y tinción con DAPI. Para la detección de la liberación de HMGB1, se recogió el sobrenadante celular para un ensayo con un kit comercial.### Detección de ATP

Para la detección de ATP intracelular, las células 4T1 sembradas en una placa de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante 12 h, así como con 250 μM de NiS@ALB en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h. Para la detección de ATP liberado, las células 4T1 sembradas en una placa de 12 pocillos se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 y NiS@ALB, o con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante una noche de incubación. Posteriormente, tanto el sobrenadante como el lisado celular se recogieron para la detección de ATP mediante un kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante.### Maduración de las células dendríticas y polarización de los macrófagos

Se obtuvieron células madre de la médula ósea de los huesos de las patas de ratones hembra C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad y se estimularon posteriormente con 20 ng/mL de GM-CSF para diferenciar en BMDC durante 6 días. A continuación, las DC se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y se trataron con diferentes grupos (varios iones metálicos, NaSH, NiCl2, NiS@ALB y lipopolisacárido (LPS, 1000 ng/mL)) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis ELISA, y las DC se tiñeron con anticuerpos de FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86 para detectar las DC maduras (DC CD80+ CD86+ en DC CD11c+) mediante citometría de flujo. Además, las células RAW264.7 se sembraron uniformemente y se trataron con NaSH, NiCl2, NiS@ALB y LPS (1000 ng/mL) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis ELISA, y las células se tiñeron con anticuerpos de FITC-F4/80, PE-CD80 y APC-CD206 para detectar los macrófagos M1 (células CD80+ F4/80+) y los macrófagos M2 (células CD206+ F4/80+) mediante citometría de flujo.### Inmunofluorescencia de iNOS, Myd88, NF-κB, IKBα y p-IRF3

Las células RAW264.7 se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o LPS (1000 ng/mL) durante 12 h. Las BMDC se trataron con 500 μM de diferentes iones metálicos durante 12 h. Para el ensayo de inmunofluorescencia, las BMDC o las células RAW264.7 fijadas con un 4% de paraformaldehído se permeabilizaron con un 0,1% de Triton X-100 (1% de Triton X-100 para la tinción de NF-κB) y se bloquearon con un 5% de BSA durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos primarios durante 2 h y con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otra hora a temperatura ambiente. Después de la tinción con DAPI, se utilizó CLSM para la visualización.### Estudio in vivo

Los fármacos se administraron cuando el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente los 100 mm3, y el tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se controlaron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × anchura2/2. Para el tratamiento combinado con H2S y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NaSH (i.t.) + DOX (i.v.). Se inyectó NaSH en los días 0, 3 y 6 a una dosis de 5 mg/kg, y se inyectó DOX en los días 1, 4 y 7 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción histopatológica e inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Además, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para visualizar la difusión espacial del H2S dentro del tumor, se empleó la sonda fluorescente Sulfidefluor-7 AM (SF7-AM). En resumen, se recogieron tejidos tumorales frescos (n = 4) en momentos clave (antes de la inyección de NiS@ALB, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección), y se cortaron inmediatamente en la sección más grande y se tiñeron con 20 μM de SF7-AM durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada protegida de la luz. Se adquirieron y cuantificaron imágenes de fluorescencia con ajustes de adquisición idénticos utilizando un sistema de imagen de fluorescencia in vivo IVIS Lumina III. El exceso de tejido tumoral se fijó y se sometió a la tinción de inmunofluorescencia de p-STAT3. Para determinar la eficacia antitumoral de NiS@ALB, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) NiCl2 (i.t.); (G4) NiS@ALB (i.t. el día 0); (G5) NiS@ALB (i.t. los días 0 y 3); y (G6) Stattic (i.t.). La concentración de NiS@ALB se fijó en 0,5 μmol por ratón, y las cantidades molares de NaSH, NiCl2 y Stattic fueron consistentes con las de NiS@ALB. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de H&E, Ki-67, WSP-1, NLRP3, caspasa-1 escindida y GSDMD-N. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y VX-765, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); y (G3) NiS@ALB (i.t.) + VX-765 (i.p.). Se inyectó NiS@ALB y VX-765 en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol y 30 mg/kg por ratón, respectivamente. Para el agotamiento de las MDSC in vivo, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.). Se inyectó NiS@ALB en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y se inyectó αLy6G/Ly6C (Gr-1) en los días 1 y 4 a una dosis de 200 μg por ratón. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción de inmunofluorescencia del tumor de CD8 y CD4. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). Se inyectó NiS@ALB en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y se inyectó DOX en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción histopatológica e inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Después de todos los tratamientos, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para el modelo de tumor de rechallenge, se reinocularon por vía subcutánea otros 2 × 106 células 4T1 en el lado opuesto en los ratones con una carga tumoral leve después del tratamiento combinado dos días después de la última administración. Se controló el crecimiento del tumor y se seleccionaron aleatoriamente secciones tumorales para la tinción de CD8/CD4.### Evaluación inmunitaria

Para determinar los efectos inmunológicos de NiS@ALB, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se agruparon y se les administró el tratamiento según lo descrito anteriormente. Los ratones se sacrificaron en el día 5 para la evaluación inmunológica. Se extrajeron los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección por citometría de flujo (células dendríticas: FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; Tregs: FITC-CD3, APC-CD4, PerCP-CD45 y PE-Foxp3; células NK: FITC-CD3, APC-CD49b y PerCP-CD45; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSCs: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). Además, se recogieron los sobrenadantes de los tumores y los ganglios linfáticos para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-12p70, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado con VX-765, los ratones se sacrificaron en el día 5 para recoger los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores. Las suspensiones de células individuales se tiñeron para la evaluación de células dendríticas, células T, células NK y MDSCs (FITC-CD11b, APC-Gr-1, PE-Arg-1 y PerCP-CD45). Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se agruparon y se les administró el tratamiento según lo descrito anteriormente. Todos los ratones se sacrificaron en el día 6. Se extrajeron los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección por citometría de flujo (células dendríticas linfáticas: FITC-CD11c, APC-CD86, PE-MHC-2 y PerCP/Cyanine5.5-CD80; células dendríticas tumorales: FITC-CD11c, APC-CD86 y PerCP/Cyanine5.5-CD80; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+ del bazo: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; células T CD44+ del bazo: FITC-CD44, APC-CD3, PE-CD8 y PerCP-CD4; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSCs: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). Se centrifugó la sangre periférica de los ratones a 4500 rpm durante 15 minutos a 4 °C para la separación del suero. Se recogió el suero y los sobrenadantes de los tumores para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β e IFN-γ, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación de la memoria inmunológica, se recogió sangre periférica de los ratones dos días después del re-inoculación del tumor para el análisis de las células T de memoria inmunológica (FITC-CD3, PE-CD8, PE-CD4, APC-CD62L y PerCP-CD44). Al final del estudio, se recogieron todos los tumores de los ratones para el análisis de las células T efectoras (FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45). Las estrategias de selección de poblaciones se presentan en la Figura S8.

Modelo de tumor bilateral en combinación con terapia αPD-1

Cuando el tumor primario alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor primario en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó intraperitonealmente en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se registraron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de CD8 y CD4. Después de todos los tratamientos, se extrajeron los pulmones para la evaluación del número de nódulos metastásicos.

Modelo de tumor de mama ortotópico

Cuando el tumor 4T1-Luc ortotópico alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó intraperitonealmente en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño del tumor se registró cada dos días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2. Para la imagen de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron e se inyectó intraperitonealmente una solución salina de sal de D-luciferina (1,5 mg/mL, 200 μL por ratón). Se obtuvieron las imágenes de bioluminiscencia de los ratones y los nódulos pulmonares metastásicos con un sistema de imagen in vivo de fluorescencia IVIS Lumina III.

Modelo de tumor xenógeno resistente a fármacos

Cuando el tamaño del tumor MCF-7/ADR alcanzó aproximadamente 50 mm3, todos los ratones desnudos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. El tamaño del tumor se registró cada cuatro días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2.

Cuantificación y análisis estadístico

Los datos se presentaron como valores medios ± DE. Los datos de citometría de flujo se analizaron con FlowJo X y se cuantificaron mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF). El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 8. Se utilizaron la prueba t no pareada, la prueba de comparación ANOVA de un factor y la prueba de comparación ANOVA de dos factores para comparar las diferencias entre los grupos, según el diseño experimental y la estructura de los datos.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer de mama murino 4T1 y 4T1 con expresión de luciferasa, y los macrófagos de monocitos de leucemia murina RAW264.7 se obtuvieron de ATCC. Las células dendríticas derivadas de médula ósea murina DC2.4 se obtuvieron del Banco de Células, Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghái, Academia China de Ciencias. Las células MCF-7/ADR se compraron a Shanghai Fuheng Biotechnology Co., Ltd. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR por el proveedor y se analizaron de forma rutinaria para confirmar la ausencia de contaminación por micoplasma. Las células se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) de FBS, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/mL) en una cámara de incubación humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Se añadió DOX·HCl (500 ng/mL) al medio de cultivo de las células MCF-7/ADR para mantener un fenotipo resistente a los fármacos. Se añadió oleato de sodio (100 μM) al medio de cultivo 4T1 para simular una condición de alto contenido de lípidos.

Animales y modelo tumoral

Se compraron ratones hembra BALB/c, ratones C57BL/6 y ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad a Hangzhou Qizhen Biological Technology Co. Ltd. Todos los procedimientos que involucraron a ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Soochow (Número de protocolo: 202409A0811). Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en un ambiente controlado (temperatura: 22 ± 2 °C; humedad: 50 ± 10%; ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso libre a alimento estándar para roedores y agua autoclavada. Para establecer el modelo tumoral, se inyectaron 2 × 106 células 4T1 en PBS (50 μL) por vía subcutánea en el lado derecho de la espalda de cada ratón. Para el modelo de tumor bilateral, se inyectaron 2 × 106 células 4T1 en el lado derecho de la espalda de cada ratón en el día -7 para el tumor primario, y posteriormente se inyectaron otras 1 × 106 células en el lado izquierdo para el tumor distante. Para el modelo de tumor de mama ortotópico, se inyectaron 2 × 106 células 4T1-Luc en el cojín adiposo mamario de los ratones. Para el modelo de tumor xenógeno, se inyectaron 1 × 107 células MCF-7/ADR por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones desnudos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales después de la inoculación de células tumorales y la confirmación de la formación de un tumor palpable.

Nota sobre el sexo de los animales

Este estudio utilizó ratones hembra para los modelos tumorales. Dado que se utilizaron cohortes de un solo sexo para cada modelo animal, no se realizó un análisis formal de la influencia del sexo en los resultados informados. Esto representa una limitación para la generalización de los hallazgos.

Construcción y análisis de la matriz de tejidos

La muestra humana consistió en 136 pacientes con cáncer de mama (mujeres de Asia oriental, edad media 54,8 ± 9,1 años, rango 33-76) con diagnóstico clínico y consentimiento informado. Sus tejidos tumorales de mama postoperatorios se confirmaron patológicamente y se recogieron para construir la matriz de tejidos, que se compró a Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de la Universidad de Soochow (Número de aprobación: SUDA20260120H01). La matriz de tejidos de cáncer de mama humano se tiñó posteriormente con p-STAT3 (570), CPT1A (520), CD36 (690), ACLY (620), ACACA/ACC1 (480) y DAPI para inmunofluorescencia en Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Posteriormente, los indicadores del metabolismo de los lípidos (CPT1A, CD36, ACLY, ACACA/ACC1) y p-STAT3 se puntuaron como negativos (−), débiles (+), moderados (++) y positivos (+++) respectivamente por dos patólogos experimentados según la intensidad de la fluorescencia.

La muestra humana consistió en 136 pacientes con cáncer de mama (mujeres de Asia Oriental, edad media de 54,8 ± 9,1 años, rango de 33 a 76) con diagnóstico clínico y consentimiento informado. Los tejidos tumorales de mama postoperatorios fueron confirmados patológicamente y recolectados para construir el microarreglo tisular, el cual fue adquirido de Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de la Universidad de Soochow (Número de Aprobación: SUDA20260120H01). El microarreglo tisular de cáncer de mama humano fue teñido adicionalmente con p-STAT3 (570), CPT1A (520), CD36 (690), ACLY (620), ACACA/ACC1 (480) y DAPI para inmunofluorescencia en Hunan Aifang Biotechnology Co., Ltd. Posteriormente, los indicadores del metabolismo lipídico (CPT1A, CD36, ACLY, ACACA/ACC1) y p-STAT3 fueron puntuados como negativos (−), débiles (+), moderados (++) y positivos (+++), respectivamente, por dos patólogos experimentados según la intensidad de la fluorescencia.

Detalles del método

Análisis de bases de datos públicas

El conjunto de datos GSE176078 fue obtenido de la base de datos GEO de NCBI.^[41] Los datos y resultados de anotación de una sola célula correspondientes fueron descargados en formato .h5 de TISCH (BRCA_GSE176078). El software R MAESTRO y Seurat se utilizaron para procesar y analizar los datos de una sola célula. El método t-SNE se utilizó para reclustrar las células. Los genes relacionados con el metabolismo lipídico y la información pronóstica de BRCA se obtuvieron y analizaron a partir de Gene Expression Profiling Interactive Analysis (gepia.cancer-pku.cn) basándose en las bases de datos TCGA y GTEx (límite de log2|FC|: 0,585, límite de valor p: 0,05).

Síntesis de nanopartículas NiS@ALB

Las nanopartículas NiS@ALB se sintetizaron mediante un método simple de mineralización a temperatura ambiente. Primero, 1 mL de solución acuosa de Ni(CH3COO)2 (100 mM) se añadió gota a gota a 6 mL de solución de BSA (10 mg/mL) bajo agitación magnética. Después de una mezcla completa, el pH se ajustó lentamente a 8-9 mediante la adición de NaOH (1 M). Luego, se añadió gota a gota otros 2 mL de solución acuosa de Na2S (100 mM) a la mezcla. El sistema se convirtió inmediatamente en una solución de color negro intenso, lo que indica la formación exitosa de precipitados de NiS. Se permitió que la reacción anterior continuara durante 12 horas para mineralizar y formar nanopartículas NiS@ALB. Para purificar las NiS@ALB sintetizadas, la solución se transfirió a un tubo de ultrafiltración (100.000 MWCO) y se centrifugó a 4500 rpm durante 30 minutos para eliminar los componentes no reaccionados. Después de repetir tres veces, las nanopartículas NiS@ALB se resuspendieron en agua y se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.

Caracterización

Las imágenes TEM se tomaron en un FEI Tecnai F20 TEM a un voltaje de aceleración de 200 kV. La medición XPS se realizó con un instrumento PHI Quantera SXM equipado con una fuente de excitación de rayos X de Al (1486,6 eV). Los patrones de difracción de rayos X en polvo se recolectaron en un difractómetro de rayos X PANalytical. Los espectros de absorción UV-Vis-NIR se obtuvieron con un espectrofotómetro UV-Vis PerkinElmer. La dispersión dinámica de la luz (DLS) y el potencial zeta de las nanopartículas se registraron utilizando un MAL VERN ZEN3690. Los contenidos absolutos de níquel se midieron mediante espectrometría de emisión óptica de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES). La solución acuosa utilizada en el experimento se preparó a partir de agua desionizada de un sistema de purificación de agua Milli-Q.

Consumo de GSH

Las nanopartículas NiS@ALB se incubaron con GSH (1 mM) en solución acuosa a 37 °C. Después de diferentes tiempos de incubación, el sistema anterior (20 μL) se inyectó en una solución de PBS (480 μL). Luego, se añadieron 2,5 μL (20 mM) de DTNB a la mezcla. La absorbancia a ∼412 nm se analizó mediante espectroscopía UV-vis-NIR.

Determinación cualitativa y cuantitativa de la liberación de H2S

WSP-1, una sonda sensible al H2S (10 μM), se incubó con varias mezclas de reacción, y se generó una curva estándar de NaSH durante 3 horas a 37 °C. La fluorescencia se observó a Ex/Em 465/515 nm mediante un lector de microplacas. Además, se adhirió un trozo de papel de prueba de acetato de plomo a la parte superior de los pequeños platos de Petri y se co-incubó con diferentes sistemas de reacción que contenían NiS@ALB o GSH a 37 °C durante 3 horas para observar el cambio de color del trozo de papel de prueba. Se utilizó el método colorimétrico de MB para la determinación cuantitativa del contenido de H2S. La solución acuosa de NiS@ALB y GSH se co-incubaron durante diferentes tiempos a 37 °C, y se centrifugó para obtener el sobrenadante (solución A). El acetato de zinc (40 mM) y el acetato de sodio (10 mM) se mezclaron para formar la solución B. Luego, se mezclaron 1 mL de la solución A y 1 mL de la solución B durante 30 minutos. Finalmente, se añadieron 20 μL de FeCl3 y N,N-dimetil-p-fenilendiamina dihidrocloruro (DMPD·2HCl, 0,15 mol/L) al sistema respectivamente durante otros 30 minutos de incubación a 37 °C para formar MB azul. Se detectó la absorbancia a ∼664 nm. Se estableció una curva estándar con diferentes concentraciones de solución de NaSH para calcular la relación lineal entre la concentración y la absorbancia.

Citotoxicidad

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo estándar MTT. En resumen, se sembraron 2 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos para la adhesión durante la noche. Después de varios tratamientos, se eliminó el medio de cultivo y se añadió MTT. Después de la incubación durante 4 horas, se utilizó DMSO para disolver el formazán. La absorbancia se determinó a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La morfología celular se observó con un microscopio óptico. Para determinar el efecto sinérgico de H2S y DOX, las células se pretrataron con NaSH (250 μM) durante 12 horas y luego se co-trataron con NaSH (250 μM) y DOX durante otras 12 horas en condiciones normales y con alto contenido de lípidos. Para determinar la citotoxicidad de varios iones metálicos, las células 4T1 y DC2.4 se co-trataron con MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2 y CuCl2 durante 12 horas de incubación. Para determinar la citotoxicidad de NiS@ALB, las células se trataron con diferentes concentraciones de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB y se incubaron durante la noche. Para determinar el efecto sinérgico de NiS@ALB y DOX, NiS@ALB (100 μM) y DOX se co-trataron en condiciones normales y con alto contenido de lípidos y se incubaron durante la noche. Para determinar la forma de muerte celular, se co-incubaron 10 μM de diferentes inhibidores, incluido el inhibidor de la apoptosis Ac-DEVD-CHO, el inhibidor de la necroptosis Nec-1, el inhibidor de la ferroptosis Fer-1 y el inhibidor de la piroptosis VX-765, con NiCl2 (500 μM) y NiS@ALB (200 μM) durante 12 horas.

Análisis del transcriptoma

Se realizó el secuenciamiento y análisis del mRNA en células 4T1 del grupo NiS@ALB y del grupo no tratado (500 μM durante 12 h, n = 3). Se extrajo el mRNA total de las células con el reactivo TRIzol. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento de los mRNA, y los mRNA se analizaron en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 1 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05. Para el secuenciamiento del transcriptoma de tejidos tumorales, se inyectaron por vía intravenosa ratones portadores de tumores 4T1 con DOX (5 mg/kg) en los días 0 y 3. El día 10, se extrajeron los tumores 4T1 responsivos (“R”) y no responsivos (“NR”) (n = 3), se cortaron en pequeños trozos (2 mm × 2 mm × 2 mm) y luego se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento con “NR” frente a “R” en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China, y los datos se analizaron mediante https://www.bioinformatics.com.cn, una plataforma en línea para el análisis y la visualización de datos. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 0,585 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05.

Análisis de Western blotting

Las células 4T1 o DC2.4 se sembraron en platos de cultivo de 5 cm y se trataron con 500 μM de MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2, CuCl2, NaSH, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante la incubación durante la noche. Además, se co-trataron NaSH (500 μM) o NiS@ALB (250 μM) con DOX (100 μM) durante 12 horas de incubación, respectivamente. Las proteínas se recolectaron con un tampón de lisis que contiene inhibidor de proteasas (PMSF, 1 mM). Después de añadir cantidades iguales de proteína y separación por SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con 5% de BSA durante 2 horas. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C y anticuerpos secundarios durante 4 horas. Después de lavar con PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió el reactivo de quimioluminiscencia y se expusieron las membranas.

Tinción de 5-hmc

Se sembraron 2 × 105 células 4T1 en una placa de 12 pocillos para la adhesión durante la noche, se incubaron con diferentes concentraciones de NaSH durante 12 horas, o con 250 μM de NaSH durante diferentes tiempos, o con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 horas. Luego, las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. Para la tinción de 5-mC o 5-hmC, las células permeabilizadas con 0,1% de Triton X-100 se desnaturalizaron con 2 N de HCl durante 15 minutos y luego se neutralizaron con 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5) durante 10 minutos. Después de bloquear con 5% de BSA durante 1 hora, las células se tiñeron con un anticuerpo primario anti-5-hmc durante 2 horas y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otras 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con PBS y teñir con DAPI, se adquirieron imágenes mediante microscopía confocal láser de barrido (CLSM).

Tinción de lípidos y colesterol

Para la tinción con Oil Red O y BODIPY 493/503, se sembraron 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de la adhesión durante la noche, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 horas de incubación. Se utilizó NaSH (∼500 μM) para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 horas, y se añadió 500 μM adicionales de NaSH al medio de cultivo después de 12 horas de incubación. Además, se añadieron diferentes concentraciones de NaSH durante 12 o 24 horas de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se tiñeron con un kit de tinción comercial de Oil Red O según los protocolos del fabricante y se observaron bajo un microscopio óptico. Posteriormente, se añadió isopropanol para extraer el tinte de Oil Red O de cada grupo, y se midió la absorbancia a 500 nm para la cuantificación. Para la tinción con BODIPY 493/503, se co-incubaron 10 μM de la sonda fluorescente con las células tratadas durante 30 minutos. Después de la tinción con DAPI, se utilizó CLSM para la visualización. Se utilizó Fillipin Ⅲ para la tinción de colesterol. Las células 4T1 adheridas en una placa de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 horas de incubación. Las células se tiñeron con Fillipin Ⅲ (0,1 mg/mL, 1 h) para la visualización con CLSM.

Ensayo de JC-1 y FAO

Se utilizó JC-1 para evaluar la función de las mitocondrias. Las células 4T1 adheridas en una placa de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM), GSH (1 mM) o CCCP (10 μM) durante 6 horas. Las células se lavaron y se tiñeron con JC-1 (10 μM) durante 30 minutos. La fluorescencia se analizó mediante CLSM y citometría de flujo. Para detectar la actividad de FAO, se aplicó FAOBlue, una sonda fluorescente intracelular de FAO. Se sembraron uniformemente 2 × 105 células 4T1 en un plato confocal para la adhesión durante la noche y se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB, Stattic (10 μM), o NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 horas de incubación. Se utilizó 500 μM de NaSH para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 horas, y se añadió 500 μM adicionales de NaSH al medio de cultivo después de 12 horas de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se lavaron y se tiñeron con 10 μM de FAOBlue para la visualización directa con CLSM a Ex/Em 405/460 nm. Para detectar el consumo de oxígeno intracelular, las células de cada grupo tratado como se describió anteriormente se tiñeron con la sonda sensible al oxígeno [Ru(dpp)3]Cl2 (10 μM) durante 30 minutos, cuya fluorescencia puede ser atenuada por el oxígeno intracelular. Después de la fijación y la tinción con DAPI, se detectó la fluorescencia roja mediante CLSM.

Detección de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A

Se sembraron células 4T1 (2 × 105) en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de una noche de adhesión, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM), así como con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h de incubación. Las células se trataron con 500 μM de NaSH en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y el medio de cultivo se suplementó con 500 μM adicionales de NaSH después de 12 h de incubación. A continuación, todas las células se lisaron y se recogieron los sobrenadantes para el análisis ELISA de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A utilizando un kit comercial.

Detección de H2S, ROS y LPO intracelulares

Las células 4T1 adheridas a placas de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM) y GSH (1 mM) durante 3 h a 37 °C. Los tioles de las células se eliminaron con N-etilmaleimida (NEM, 1 mM), que se utilizó para un pretratamiento de 30 minutos de las células adheridas. Se utilizó una sonda fluorescente sensible al H2S comercial, WSP-1 (50 μM), para la tinción de las células a 37 °C durante 30 minutos. Para la detección de ROS intracelulares, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h, y luego se tiñeron con DCFH-DA (20 μM) durante 30 minutos. Después de la tinción con DAPI, las células se observaron mediante CLSM. Para la detección de LPO, las células se tiñeron con Liperfluo (10 μM) durante 30 minutos y luego se lavaron para el análisis por citometría de flujo.

Tinción de piroptosis

Se sembraron uniformemente un total de 2 × 105 células 4T1 en un portaobjetos confocal para una noche de adhesión y se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) durante 30 minutos. La morfología de las células en piroptosis se adquirió mediante CLSM.

Detección de CRT y HMGB1

Se sembraron un total de 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 12 h. Las células se incubaron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron con un 4 % de paraformaldehído y se trataron con una solución de 0,1 % de Triton X-100/PBS para la tinción de CRT y una solución de 1 % de Triton X-100/PBS para la tinción de HMGB1. Después de bloquear con un 5 % de BSA, las células se trataron con anticuerpos primarios anti-calreticulina y anti-HMGB1 durante 2 h y luego se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488/647 durante otra hora a temperatura ambiente. Las células lavadas se tiñeron posteriormente con DAPI antes de la visualización mediante CLSM. Para la citometría de flujo, las células se trataron con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante 8 h. Las células se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo siguiendo los pasos anteriores sin la fijación con paraformaldehído y la tinción con DAPI. Para la detección de la liberación de HMGB1, se recogió el sobrenadante celular para un ensayo con un kit comercial.

Detección de ATP

Para la detección de ATP intracelular, las células 4T1 sembradas en placas de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante 12 h, así como con 250 μM de NiS@ALB en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 12 h. Para la detección de ATP liberado, las células 4T1 sembradas en placas de 12 pocillos se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 y NiS@ALB, o con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante una incubación nocturna. Posteriormente, tanto el sobrenadante como el lisado celular se recogieron para la detección de ATP mediante un kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante.

Maduración de células dendríticas y polarización de macrófagos

Se obtuvieron células madre de la médula ósea de los huesos de las patas de ratones hembra C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad y se estimularon posteriormente con 20 ng/mL de GM-CSF para diferenciarlas en BMDC durante 6 días. A continuación, las DC se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y se trataron con diferentes grupos (varios iones metálicos, NaSH, NiCl2, NiS@ALB y lipopolisacárido (LPS, 1000 ng/mL)) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis ELISA, y las DC se tiñeron con anticuerpos de FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86 para detectar las DC maduras (DC CD80+ CD86+ en DC CD11c+) mediante citometría de flujo. Además, las células RAW264.7 se sembraron uniformemente y se trataron con NaSH, NiCl2, NiS@ALB y LPS (1000 ng/mL) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis ELISA, y las células se tiñeron con anticuerpos de FITC-F4/80, PE-CD80 y APC-CD206 para detectar los macrófagos M1 (células CD80+ F4/80+) y los macrófagos M2 (células CD206+ F4/80+) mediante citometría de flujo.

Inmunofluorescencia de iNOS, Myd88, NF-κB, IKBα y p-IRF3

Las células RAW264.7 se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o LPS (1000 ng/mL) durante 12 h. Las BMDC se trataron con 500 μM de diferentes iones metálicos durante 12 h. Para el ensayo de inmunofluorescencia, las BMDC o las células RAW264.7 fijadas con un 4 % de paraformaldehído se permeabilizaron con un 0,1 % de Triton X-100 (1 % de Triton X-100 para la tinción de NF-κB) y se bloquearon con un 5 % de BSA durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos primarios durante 2 h y con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otra hora a temperatura ambiente. Después de la tinción con DAPI, se utilizó CLSM para la visualización.

Estudio in vivo

Los fármacos se administraron cuando el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, y el tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se controlaron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × anchura2/2. Para el tratamiento combinado con H2S y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NaSH (i.t.) + DOX (i.v.). El NaSH se inyectó en los días 0, 3 y 6 a una dosis de 5 mg/kg, y el DOX se inyectó en los días 1, 4 y 7 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el estudio histopatológico y la tinción de inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Además, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para visualizar la difusión espacial del H2S dentro del tumor, se empleó la sonda fluorescente Sulfidefluor-7 AM (SF7-AM). En resumen, se recogieron tejidos tumorales frescos (n = 4) en momentos clave (antes de la inyección de NiS@ALB, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección), y se cortaron inmediatamente en la sección más grande y se tiñeron con 20 μM de SF7-AM durante 30 minutos a 37 °C en una cámara humidificada protegida de la luz. Se adquirieron y cuantificaron imágenes de fluorescencia con ajustes de adquisición idénticos utilizando un sistema de imagen de fluorescencia in vivo IVIS Lumina III. El exceso de tejido tumoral se fijó y se sometió a la tinción de inmunofluorescencia de p-STAT3. Para determinar la eficacia antitumoral de NiS@ALB, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) NiCl2 (i.t.); (G4) NiS@ALB (i.t. en el día 0); (G5) NiS@ALB (i.t. en los días 0 y 3); y (G6) Stattic (i.t.). La concentración de NiS@ALB se fijó en 0,5 μmol por ratón, y las cantidades molares de NaSH, NiCl2 y Stattic fueron consistentes con las de NiS@ALB. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de H&E, Ki-67, WSP-1, NLRP3, caspasa-1 escindida y GSDMD-N. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y VX-765, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); y (G3) NiS@ALB (i.t.) + VX-765 (i.p.). El NiS@ALB y el VX-765 se inyectaron en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol y 30 mg/kg por ratón, respectivamente. Para la depleción in vivo de MDSC, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.). El NiS@ALB se inyectó en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y el αLy6G/Ly6C (Gr-1) se inyectó en los días 1 y 4 a una dosis de 200 μg por ratón. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción de inmunofluorescencia del tumor de CD8 y CD4. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). El NiS@ALB se inyectó en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y el DOX se inyectó en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el estudio histopatológico y la tinción de inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Después de todos los tratamientos, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para el modelo de tumor de rechallenge, se reinocularon por vía subcutánea otros 2 × 106 células 4T1 en el lado opuesto dos días después de la última administración en los ratones con una carga tumoral leve después del tratamiento combinado. Se controló el crecimiento del tumor y se seleccionaron aleatoriamente secciones tumorales para la tinción de CD8/CD4.

Evaluación inmunológica

Para determinar los efectos inmunológicos de NiS@ALB, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, se agruparon los ratones y se trataron como se describió anteriormente. Los ratones se sacrificaron en el día 5 para la evaluación inmunológica. Se extrajeron los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección mediante citometría de flujo (DC: FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; Tregs: FITC-CD3, APC-CD4, PerCP-CD45 y PE-Foxp3; células NK: FITC-CD3, APC-CD49b y PerCP-CD45; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSC: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). Además, se recogieron los sobrenadantes de los tumores y los ganglios linfáticos para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-12p70, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado con VX-765, se sacrificaron los ratones en el día 5 para recoger los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores. Las suspensiones de células individuales se tiñeron para la evaluación de DC, células T, células NK y MDSC (FITC-CD11b, APC-Gr-1, PE-Arg-1 y PerCP-CD45). Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, se agruparon los ratones y se les administró el tratamiento de la misma manera que se describió anteriormente. Todos los ratones se sacrificaron en el día 6. Se extrajeron los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección mediante citometría de flujo (DC linfáticas: FITC-CD11c, APC-CD86, PE-MHC-2 y PerCP/cianina 5.5-CD80; DC tumorales: FITC-CD11c, APC-CD86 y PerCP/cianina 5.5-CD80; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+ del bazo: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; células T CD44+ del bazo: FITC-CD44, APC-CD3, PE-CD8 y PerCP-CD4; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSC: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). El plasma sanguíneo periférico de los ratones se centrifugó a 4500 rpm durante 15 minutos a 4 °C para la separación del suero. Se recogieron el suero y los sobrenadantes de los tumores para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β e IFN-γ, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación de la memoria inmunológica, se recogió sangre periférica de los ratones dos días después del rechallenge tumoral para el análisis de las células T de memoria inmunológica (FITC-CD3, PE-CD8, PE-CD4, APC-CD62L y PerCP-CD44). Todos los tumores de los ratones se recogieron al final para el análisis de las células T efectoras (FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45). Las estrategias de selección se presentan en la Figura S8.

Modelo de tumor bilateral en combinación con terapia αPD-1

Cuando el tumor primario alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor primario en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó por vía intraperitoneal en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño de los tumores y el peso corporal de los ratones se registraron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de CD8 y CD4. Después de todos los tratamientos, se extrajeron los pulmones para evaluar el número de nódulos metastásicos.### Modelo de tumor mamario ortotópico

Cuando el tumor 4T1-Luc ortotópico alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó por vía intraperitoneal en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño de los tumores se registró cada dos días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2. Para la imagen de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron e se inyectó por vía intraperitoneal una solución salina de sal de D-luciferina (1,5 mg/mL, 200 μL por ratón). Las imágenes de bioluminiscencia de los ratones y los nódulos pulmonares metastásicos se obtuvieron con un sistema de imagen de fluorescencia in vivo IVIS Lumina III.### Modelo de tumor xenógeno resistente a fármacos

Cuando el tamaño del tumor MCF-7/ADR alcanzó aproximadamente 50 mm3, todos los ratones desnudos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. El tamaño de los tumores se registró cada cuatro días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho2/2.

Análisis de bases de datos públicas

El conjunto de datos GSE176078 se obtuvo de la base de datos GEO de NCBI.^[41] Los datos y resultados de anotación de una sola célula correspondientes se descargaron en formato .h5 de TISCH (BRCA_GSE176078). El software R MAESTRO y Seurat se utilizaron para procesar y analizar los datos de una sola célula. El método t-SNE se utilizó para volver a agrupar las células. Se obtuvieron y analizaron los genes relacionados con el metabolismo lipídico y la información pronóstica de BRCA a partir de Gene Expression Profiling Interactive Analysis (gepia.cancer-pku.cn) basándose en las bases de datos TCGA y GTEx (límite de corte log2|FC|: 0,585, límite de corte del valor p: 0,05).

Síntesis de nanopartículas NiS@ALB

Las nanopartículas NiS@ALB se sintetizaron mediante un método simple de mineralización a temperatura ambiente. Primero, se añadió gota a gota 1 mL de solución acuosa de Ni(CH3COO)2 (100 mM) a 6 mL de solución de BSA (10 mg/mL) bajo agitación magnética. Después de una mezcla completa, el pH se ajustó lentamente a 8-9 mediante la adición de NaOH (1 M). Luego, se añadió gota a gota otros 2 mL de solución acuosa de Na2S (100 mM) a la mezcla. El sistema se convirtió inmediatamente en una solución de color negro intenso, lo que indica la formación exitosa de precipitados de NiS. Se permitió que la reacción anterior continuara durante 12 horas para mineralizar y formar nanopartículas NiS@ALB. Para purificar NiS@ALB sintetizado, la solución se transfirió a un tubo de ultrafiltración (100.000 MWCO) y se centrifugó a 4500 rpm durante 30 minutos para eliminar los componentes no reaccionados. Después de repetirlo tres veces, las nanopartículas NiS@ALB se resuspendieron en agua y se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.

Caracterización

Las imágenes TEM se tomaron en un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai F20 a un voltaje de aceleración de 200 kV. La medición XPS se realizó con un instrumento PHI Quantera SXM equipado con una fuente de excitación de rayos X de Al (1486,6 eV). Los patrones de difracción de rayos X en polvo se recogieron en un difractómetro de rayos X PANalytical. Los espectros de absorción UV-Vis-NIR se obtuvieron con un espectrofotómetro UV-Vis de PerkinElmer. La dispersión de luz dinámica (DLS) y el potencial zeta de las nanopartículas se registraron utilizando un MAL VERN ZEN3690. Los contenidos absolutos de níquel se midieron mediante espectrometría de emisión óptica de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES). La solución acuosa utilizada en el experimento se preparó a partir de agua desionizada de un sistema de purificación de agua Milli-Q.

Consumo de GSH

Las nanopartículas NiS@ALB se incubaron con GSH (1 mM) en solución acuosa a 37 °C. Después de diferentes tiempos de incubación, el sistema anterior (20 μL) se inyectó en una solución PBS (480 μL). Luego, se añadieron 2,5 μL (20 mM) de DTNB a la mezcla. La absorbancia a ∼412 nm se analizó mediante espectroscopia UV-Vis-NIR.

Determinación cualitativa y cuantitativa de la liberación de H2S

WSP-1, una sonda sensible al H2S (10 μM), se incubó con varias mezclas de reacción, y se generó una curva estándar de NaSH durante 3 horas a 37 °C. La fluorescencia se observó a Ex/Em 465/515 nm mediante un lector de microplacas. Además, se adhirió un trozo de papel indicador de acetato de plomo a la parte superior de los pequeños platos de Petri y se co-incubó con diferentes sistemas de reacción que contenían NiS@ALB o GSH a 37 °C durante 3 horas para observar el cambio de color del trozo de papel indicador. Se utilizó el método colorimétrico de MB para la determinación cuantitativa del contenido de H2S. La solución acuosa de NiS@ALB y GSH se co-incubaron durante diferentes tiempos a 37 °C, y se centrifugó para obtener el sobrenadante (solución A). El acetato de zinc (40 mM) y el acetato de sodio (10 mM) se mezclaron para formar la solución B. Luego, se mezclaron 1 mL de la solución A y 1 mL de la solución B durante 30 minutos. Finalmente, se añadieron 20 μL de FeCl3 y N,N-dimetil-p-fenilendiamina dihidrocloruro (DMPD·2HCl, 0,15 mol/L) al sistema respectivamente durante otros 30 minutos de incubación a 37 °C para formar MB azul. Se detectó la absorbancia a ∼664 nm. Se estableció una curva estándar con diferentes concentraciones de solución de NaSH para calcular la relación lineal entre la concentración y la absorbancia.

Citotoxicidad

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo estándar MTT. En resumen, se sembraron 2 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en condiciones normales o de alto contenido lipídico para la adhesión durante la noche. Después de varios tratamientos, se retiró el medio de cultivo y se añadió MTT. Después de la incubación durante 4 horas, se utilizó DMSO para disolver el formazán. La absorbancia se determinó a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La morfología celular se observó con un microscopio óptico. Para determinar el efecto sinérgico de H2S y DOX, las células se pretrataron con NaSH (250 μM) durante 12 horas y luego se co-trataron con NaSH (250 μM) y DOX durante otras 12 horas en condiciones normales y de alto contenido lipídico. Para determinar la citotoxicidad de varios iones metálicos, las células 4T1 y DC2.4 se co-trataron con MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2 y CuCl2 durante 12 horas de incubación. Para determinar la citotoxicidad de NiS@ALB, las células se trataron con diferentes concentraciones de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB y se incubaron durante la noche. Para determinar el efecto sinérgico de NiS@ALB y DOX, NiS@ALB (100 μM) y DOX se co-trataron en condiciones normales y de alto contenido lipídico y se incubaron durante la noche. Para determinar la forma de muerte celular, se co-incubaron 10 μM de diferentes inhibidores, incluido el inhibidor de la apoptosis Ac-DEVD-CHO, el inhibidor de la necroptosis Nec-1, el inhibidor de la ferroptosis Fer-1 y el inhibidor de la piroptosis VX-765, con NiCl2 (500 μM) y NiS@ALB (200 μM) durante 12 horas.

Análisis del transcriptoma

Se realizó el secuenciamiento y análisis del ARNm en células 4T1 del grupo NiS@ALB y del grupo no tratado (500 μM durante 12 h, n = 3). Se extrajo el ARNm total de las células con el reactivo TRIzol. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento de los ARNm, y los ARNm se analizaron en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 1 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05. Para el secuenciamiento del transcriptoma de los tejidos tumorales, se inyectaron por vía intravenosa a ratones portadores de tumores 4T1 DOX (5 mg/kg) en los días 0 y 3. El día 10, se extrajeron los tumores 4T1 responsivos (“R”) y no responsivos (“NR”) (n = 3), se cortaron en trozos pequeños (2 mm × 2 mm × 2 mm) y luego se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Se realizó el secuenciamiento de alto rendimiento con “NR” frente a “R” en GENEWIZ Co., Ltd. Suzhou, China, y los datos se analizaron mediante https://www.bioinformatics.com.cn, una plataforma en línea para el análisis y la visualización de datos. La expresión diferencial significativa de los genes se analizó estadísticamente mediante log2|FC| ≥ 0,585 y valor q (FDR, p adj) ≤ 0,05.

Análisis de Western blotting

Las células 4T1 o DC2.4 se sembraron en platos de cultivo de 5 cm y se trataron con 500 μM de MnCl2, FeCl2, CoCl2, NiCl2, CuCl2, NaSH, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante la incubación durante la noche. Además, se co-trataron NaSH (500 μM) o NiS@ALB (250 μM) con DOX (100 μM) durante 12 horas de incubación, respectivamente. Las proteínas se recogieron con tampón de lisis que contiene inhibidor de proteasas (PMSF, 1 mM). Después de añadir cantidades iguales de proteína y separación por SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con 5% de BSA durante 2 horas. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C y anticuerpos secundarios durante 4 horas. Después de lavar con PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió el reactivo de quimioluminiscencia y se expusieron las membranas.

Tinción de 5-hmc

Se sembraron 2 × 105 células 4T1 en una placa de 12 pocillos para la adhesión durante la noche, se incubaron con diferentes concentraciones de NaSH durante 12 horas, o con 250 μM de NaSH durante diferentes tiempos, o con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 horas. Luego, las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. Para la tinción de 5-mC o 5-hmC, las células permeabilizadas con 0,1% de Triton X-100 se desnaturalizaron con 2 N de HCl durante 15 minutos y luego se neutralizaron con 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5) durante 10 minutos. Después de bloquear con 5% de BSA durante 1 hora, las células se tiñeron con un anticuerpo primario anti-5-hmc durante 2 horas y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otras 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con PBS y teñir con DAPI, se adquirieron imágenes mediante microscopía confocal láser de barrido (CLSM).

Tinción de lípidos y colesterol

Para la tinción con Rojo de Aceite y BODIPY 493/503, se sembraron 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de una noche de adhesión, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h de incubación. Se utilizó NaSH (∼500 μM) para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. Además, se añadieron diferentes concentraciones de NaSH durante 12 o 24 h de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se tiñeron con un kit de tinción comercial con Rojo de Aceite según los protocolos del fabricante y se observaron bajo un microscopio óptico. Posteriormente, se añadió isopropanol para extraer el colorante Rojo de Aceite de cada grupo y se midió la absorbancia a 500 nm para la cuantificación. Para la tinción con BODIPY 493/503, se co-incubaron 10 μM de la sonda fluorescente con las células tratadas durante 30 min. Después de la tinción con DAPI, se utilizó un microscopio de confocal para la visualización. Se utilizó Filipina Ⅲ para la tinción del colesterol. Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB y Stattic (10 μM), o con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h de incubación. Las células se tiñeron con Filipina Ⅲ (0,1 mg/mL, 1 h) para la visualización con microscopio de confocal.

Ensayo de JC-1 y FAO

Se utilizó JC-1 para evaluar la función de las mitocondrias. Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM), GSH (1 mM) o CCCP (10 μM) durante 6 h. Las células se lavaron y se tiñeron con JC-1 (10 μM) durante 30 min. La fluorescencia se analizó mediante microscopio de confocal y citometría de flujo. Para detectar la actividad de FAO, se aplicó FAOBlue, una sonda fluorescente intracelular de FAO. Se sembraron uniformemente 2 × 105 células 4T1 en un portaobjetos de confocal para una noche de adhesión y se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB, Stattic (10 μM) o NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h de incubación. Se utilizó 500 μM de NaSH para tratar las células en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. Después de todos los tratamientos, las células se lavaron y se tiñeron con 10 μM de FAOBlue para la visualización directa con microscopio de confocal a Ex/Em 405/460 nm. Para detectar el consumo de oxígeno intracelular, las células de cada grupo tratado según lo descrito anteriormente se tiñeron con la sonda sensible al oxígeno [Ru(dpp)3]Cl2 (10 μM) durante 30 min, cuya fluorescencia puede ser atenuada por el oxígeno intracelular. Después de la fijación y la tinción con DAPI, la fluorescencia roja se detectó mediante microscopio de confocal.

Detección de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A

Se sembraron 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos en condiciones normales o con alto contenido de lípidos. Después de una noche de adhesión, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM), así como con NiS@ALB (250 μM) en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h de incubación. Las células se trataron con 500 μM de NaSH en condiciones normales o con alto contenido de lípidos durante 24 h, y se añadió un suplemento adicional de 500 μM de NaSH al medio de cultivo después de 12 h de incubación. A continuación, todas las células se lisaron y se recogieron los sobrenadantes para el análisis de ELISA de PLIN2, acetil-CoA, ACC y CPT1A utilizando un kit comercial.

Detección de H2S, ROS y LPO intracelulares

Las células 4T1 adheridas a la placa de 12 pocillos se trataron con NiS@ALB (250 μM) y GSH (1 mM) durante 3 h a 37 °C. Los tioles de las células se eliminaron con N-etilmaleimida (NEM, 1 mM), que se utilizó para un pretratamiento de 30 min de las células adheridas. Se utilizó una sonda fluorescente sensible al H2S comercial, WSP-1 (50 μM), para la tinción de las células a 37 °C durante 30 min. Para la detección de ROS intracelulares, las células se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h y, a continuación, se tiñeron con DCFH-DA (20 μM) durante 30 min. Después de la tinción con DAPI, las células se observaron mediante microscopio de confocal. Para la detección de LPO, las células se tiñeron con Liperfluo (10 μM) durante 30 min y, a continuación, se lavaron para el análisis por citometría de flujo.

Tinción de la piroptosis

Se sembraron uniformemente un total de 2 × 105 células 4T1 en un portaobjetos de confocal para una noche de adhesión y se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Las células se tiñeron con anexina V-FITC e yoduro de propidio (PI) durante 30 min. La morfología de las células pirotóticas se adquirió mediante microscopio de confocal.

Detección de CRT y HMGB1

Se sembraron un total de 2 × 105 células 4T1 en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 12 h. Las células se incubaron con 250 μM de NaSH, NiCl2 o NiS@ALB durante 12 h. Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído y se trataron con una solución de 0,1% de Triton X-100/PBS para la tinción de CRT y una solución de 1% de Triton X-100/PBS para la tinción de HMGB1. Después de bloquear con 5% de BSA, las células se trataron con anticuerpos primarios anti-calreticulina y anti-HMGB1 durante 2 h y, a continuación, se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488/647 durante otra hora a temperatura ambiente. Las células lavadas se tiñeron posteriormente con DAPI antes de la visualización con microscopio de confocal. Para la citometría de flujo, las células se trataron con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante 8 h. Las células se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo siguiendo los pasos anteriores sin fijación con paraformaldehído y tinción con DAPI. Para la detección de la liberación de HMGB1, se recogió el sobrenadante celular para un ensayo con un kit comercial.

Detección de ATP

Para la detección de ATP intracelular, las células 4T1 sembradas en placas de 12 pocillos se trataron con 250 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o Stattic (10 μM) durante 12 h, así como con 250 μM de NiS@ALB en condiciones normales o con alto contenido de lípidos, durante 12 h. Para la detección de ATP liberado, las células 4T1 sembradas en placas de 12 pocillos se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2 y NiS@ALB, o con NiS@ALB (250 μM) y DOX (100 μM) durante una noche de incubación. Posteriormente, tanto el sobrenadante como el lisado celular se recogieron para la detección de ATP mediante un kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante.

Maduración de células dendríticas y polarización de macrófagos

Se obtuvieron células madre de la médula ósea de los huesos de las patas de ratones hembra C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad y se estimularon posteriormente con 20 ng/mL de GM-CSF para diferenciar en BMDC durante 6 días. A continuación, las DC se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y se trataron con diferentes grupos (varios iones metálicos, NaSH, NiCl2, NiS@ALB y lipopolisacárido (LPS, 1000 ng/mL)) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis de ELISA, y las DC se tiñeron con anticuerpos de FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86 para detectar las DC maduras (DC CD80+ CD86+ en DC CD11c+) mediante citometría de flujo. Además, las células RAW264.7 se sembraron uniformemente y se trataron con NaSH, NiCl2, NiS@ALB y LPS (1000 ng/mL) durante 16 h. El sobrenadante se recogió para el análisis de ELISA, y las células se tiñeron con anticuerpos de FITC-F4/80, PE-CD80 y APC-CD206 para detectar los macrófagos M1 (células CD80+ F4/80+) y los macrófagos M2 (células CD206+ F4/80+) mediante citometría de flujo.

Inmunofluorescencia de iNOS, Myd88, NF-κB, IKBα y p-IRF3

Las células RAW264.7 se trataron con 500 μM de NaSH, NiCl2, NiS@ALB o LPS (1000 ng/mL) durante 12 h. Las BMDC se trataron con 500 μM de diferentes iones metálicos durante 12 h. Para el ensayo de inmunofluorescencia, las BMDC o las células RAW264.7 fijadas con 4% de paraformaldehído se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 (1% de Triton X-100 para la tinción de NF-κB) y se bloquearon con 5% de BSA durante 1 h. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos primarios durante 2 h y con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante otra hora a temperatura ambiente. Después de la tinción con DAPI, se utilizó un microscopio de confocal para la visualización.

Estudio in vivo

Los fármacos se administraron cuando el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm3, y el tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se controlaron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × anchura2/2. Para el tratamiento combinado con H2S y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NaSH (i.t.) + DOX (i.v.). Se inyectó NaSH en los días 0, 3 y 6 a una dosis de 5 mg/kg, y se inyectó DOX en los días 1, 4 y 7 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción histopatológica e inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Además, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para visualizar la difusión espacial del H2S dentro del tumor, se empleó la sonda fluorescente Sulfidefluor-7 AM (SF7-AM). En resumen, se recogieron tejidos tumorales frescos (n = 4) en puntos clave (antes de la inyección de NiS@ALB, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección), y se cortaron inmediatamente en la sección más grande y se tiñeron con 20 μM de SF7-AM durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada protegida de la luz. Se adquirieron y cuantificaron las imágenes de fluorescencia con ajustes de adquisición idénticos utilizando un sistema de imagen de fluorescencia in vivo IVIS Lumina III. El exceso de tejido tumoral se fijó y se sometió a la tinción de inmunofluorescencia de p-STAT3. Para determinar la eficacia antitumoral de NiS@ALB, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NaSH (i.t.); (G3) NiCl2 (i.t.); (G4) NiS@ALB (i.t. en el día 0); (G5) NiS@ALB (i.t. en los días 0 y 3); y (G6) Stattic (i.t.). La concentración de NiS@ALB se fijó en 0,5 μmol por ratón, y las cantidades molares de NaSH, NiCl2 y Stattic fueron consistentes con las de NiS@ALB. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de H&E, Ki-67, WSP-1, NLRP3, caspasa-1 clivada y GSDMD-N. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y VX-765, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); y (G3) NiS@ALB (i.t.) + VX-765 (i.p.). Se inyectó NiS@ALB y VX-765 en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol y 30 mg/kg por ratón, respectivamente. Para la depleción in vivo de MDSC, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + αLy6G/Ly6C (Gr-1) (i.p.). Se inyectó NiS@ALB en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y se inyectó αLy6G/Ly6C (Gr-1) en los días 1 y 4 a una dosis de 200 μg por ratón. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción de inmunofluorescencia del tumor de CD8 y CD4. Para el tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) NiS@ALB (i.t.); (G3) DOX (i.v.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). Se inyectó NiS@ALB en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón, y se inyectó DOX en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. Los ratones se sacrificaron aleatoriamente para la tinción histopatológica e inmunofluorescencia de H&E, Ki-67, p-STAT3 y BODIPY 493/503 después de la última administración. Después de todos los tratamientos, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus pulmones para la tinción con H&E con el fin de evaluar el número de nódulos metastásicos. Para el modelo de tumor de rechallenge, se reinocularon por vía subcutánea otros 2 × 106 células 4T1 en el lado opuesto en los ratones con una carga tumoral leve después del tratamiento combinado, dos días después de la última administración. Se controló el crecimiento del tumor y se seleccionaron aleatoriamente secciones tumorales para la tinción de CD8/CD4.

Evaluación inmunitaria

Para determinar los efectos inmunológicos de NiS@ALB, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm³, los ratones se agruparon y se les administró el tratamiento según lo descrito anteriormente. Los ratones fueron sacrificados en el día 5 para la evaluación inmunológica. Se extrajeron los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección por citometría de flujo (células dendríticas: FITC-CD11c, APC-CD80 y PE-CD86; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; Tregs: FITC-CD3, APC-CD4, PerCP-CD45 y PE-Foxp3; células NK: FITC-CD3, APC-CD49b y PerCP-CD45; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSCs: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). Además, se recogieron los sobrenadantes de los tumores y los ganglios linfáticos para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-12p70, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado con VX-765, los ratones fueron sacrificados en el día 5 para recoger los tumores y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores. Las suspensiones de células individuales se tiñeron para la evaluación de células dendríticas, células T, células NK y MDSCs (FITC-CD11b, APC-Gr-1, PE-Arg-1 y PerCP-CD45). Para la evaluación inmunológica del tratamiento combinado de NiS@ALB y DOX, una vez que el volumen del tumor 4T1 alcanzó aproximadamente 100 mm³, los ratones se agruparon y se les administró el tratamiento según lo descrito anteriormente. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 6. Se extrajeron los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos cercanos a los tumores y se procesaron para obtener suspensiones de células individuales. Las muestras se tiñeron con anticuerpos para la detección por citometría de flujo (células dendríticas linfáticas: FITC-CD11c, APC-CD86, PE-MHC-2 y PerCP/Cyanine5.5-CD80; células dendríticas tumorales: FITC-CD11c, APC-CD86 y PerCP/Cyanine5.5-CD80; células T: FITC-CD3, APC-CD4, PE-CD8 y PerCP-CD45; células T IFN-γ+ del bazo: FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45; células T CD44+ del bazo: FITC-CD44, APC-CD3, PE-CD8 y PerCP-CD4; macrófagos: FITC-F4/80, APC-CD206, PE-CD80 y PerCP-CD45; MDSCs: FITC-CD45, APC-Gr-1 y PE-CD11b). Se centrifugó la sangre periférica de los ratones a 4500 rpm durante 15 minutos a 4 °C para la separación del suero. Se recogió el suero y los sobrenadantes de los tumores para el análisis ELISA de TNF-α, IL-1β e IFN-γ, siguiendo los protocolos del fabricante. Para la evaluación de la memoria inmunológica, se recogió sangre periférica de los ratones dos días después del re-inoculación del tumor para el análisis de las células T de memoria inmunológica (FITC-CD3, PE-CD8, PE-CD4, APC-CD62L y PerCP-CD44). Al final, se recogieron todos los tumores de los ratones para el análisis de las células T efectoras (FITC-CD3, PE-CD8, APC-IFN-γ y PerCP-CD45). Las estrategias de selección se presentan en la Figura S8.

Modelo de tumor bilateral en combinación con terapia αPD-1

Cuando el tumor primario alcanzó aproximadamente 100 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor primario en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó por vía intraperitoneal en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se registraron cada dos días. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho²/2. Después de la última administración, los ratones se sacrificaron aleatoriamente para el análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de CD8 y CD4. Después de todos los tratamientos, se extrajeron los pulmones para la evaluación del número de nódulos metastásicos.

Modelo de tumor mamario ortotópico

Cuando el tumor 4T1-Luc ortotópico alcanzó aproximadamente 100 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) αPD-1 (i.p.); (G4) DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.); (G5) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.); y (G6) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.) + αPD-1 (i.p.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. αPD-1 se inyectó por vía intraperitoneal en los días 2 y 5 a una dosis de 200 μg por ratón. El tamaño del tumor se registró cada dos días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho²/2. Para la imagen de bioluminiscencia, los ratones se anestesiaron y se inyectaron por vía intraperitoneal con una solución salina de sal de D-luciferina (1,5 mg/mL, 200 μL por ratón). Se obtuvieron las imágenes de bioluminiscencia de los ratones y los nódulos pulmonares metastásicos con un sistema de imagen in vivo de fluorescencia IVIS Lumina III.

Modelo de tumor xenógeno resistente a fármacos

Cuando el tamaño del tumor MCF-7/ADR alcanzó aproximadamente 50 mm³, todos los ratones desnudos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 5): (G1) no tratado; (G2) DOX (i.v.); (G3) NiS@ALB (i.t.); y (G4) NiS@ALB (i.t.) + DOX (i.v.). NiS@ALB se inyectó en el tumor en los días 0 y 3 a una dosis de 0,5 μmol por ratón. DOX se inyectó en la vena de la cola en los días 1 y 4 a una dosis de 5 mg/kg. El tamaño del tumor se registró cada cuatro días, y los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = longitud × ancho²/2.

Cuantificación y análisis estadístico

Los datos se presentaron como valores medios ± DE. Los datos de citometría de flujo se analizaron con FlowJo X y se cuantificaron mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF). El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 8. Se utilizaron la prueba t no pareada, la prueba de comparación ANOVA de un factor y la prueba de comparación ANOVA de dos factores para comparar las diferencias entre los grupos, según el diseño experimental y la estructura de los datos.