La apoptosis mitocondrial mediada por nanopartículas lipídicas de ARNm potencia la inmunoterapia adoptiva con células T.

La terapia adoptiva de células T (ACT) ha surgido como una inmunoterapia contra el cáncer altamente prometedora en las últimas décadas y ha logrado éxito clínico en el tratamiento de neoplasias hematológicas. Sin embargo, su eficacia clínica contra tumores sólidos sigue siendo limitada,^[1],^[2],^[3], en gran medida debido al microambiente tumoral inmunosupresor y a la resistencia intrínseca de las células cancerosas, ambos de los cuales dificultan la citotoxicidad mediada por las células T y conducen a la disfunción de las células T.^[4],^[5],^[6],^[7] Una estrategia prometedora para mejorar la eficacia de la ACT implica sensibilizar las células cancerosas mediante la modulación de su apoptosis mitocondrial intrínseca (mtApoptosis), lo que sinergiza con las células T citotóxicas al involucrar mecanismos no superpuestos.^[8],^[9],^[10],^[11]

La vía de la mtApoptosis está regulada por las interacciones entre tres grupos de proteínas de la familia BCL-2: proteínas pro-supervivencia (por ejemplo, BCL-2, BCL-XL y MCL-1), proteínas BH3 pro-apoptóticas, que se subdividen aún más en activadoras (por ejemplo, BIM, PUMA y tBID) y sensibilizadoras (por ejemplo, BAD y NOXA), y las proteínas efectoras de la muerte (BAX y BAK).^[12],^[13] Durante la mtApoptosis, la activación de BAK/BAX representa un paso crítico que está estrictamente regulado por el equilibrio entre las señales pro-supervivencia y pro-apoptóticas. Tras la activación, BAK/BAX sufre una oligomerización conformacional, lo que conduce a una permeabilización irreversible de la membrana externa mitocondrial (MOMP) y a la posterior iniciación de cascadas apoptóticas descendentes que desmantelan las células.^[14],^[15],^[16] Las terapias actuales basadas en la mtApoptosis, que incluyen los miméticos de BH3 y los péptidos derivados de BH3, están diseñadas para antagonizar selectivamente los miembros específicos de la familia BCL-2 pro-supervivencia.^[17],^[18],^[19],^[20],^[21] Sin embargo, la mayoría de estas terapias han mostrado una eficacia subóptima como agentes únicos contra tumores sólidos debido a la redundancia funcional entre los múltiples miembros de la familia BCL-2 pro-supervivencia,^[22],^[23], lo que hace que el antagonismo de un solo objetivo sea insuficiente.^[24] Lo que es más importante, simplemente liberar el "freno" inhibitorio impuesto por los miembros de la familia BCL-2 pro-supervivencia sin proporcionar una "aceleración" pro-apoptótica directa suficiente no logra desencadenar cascadas apoptóticas eficaces. Estas limitaciones subrayan la urgente necesidad de desarrollar estrategias potentes basadas en la mtApoptosis para aumentar la inmunidad antitumoral con la ACT.

Las terapias basadas en ARNm han surgido como alternativas potentes a las moléculas pequeñas y los péptidos, lo que permite una expresión de proteínas transitoria pero sostenida. Además, el ARNm posee propiedades inmunostimulantes intrínsecas, actuando como un adyuvante para remodelar el microambiente tumoral.^[25],^[26],^[27],^[28],^[29],^[30],^[31] Basándonos en esto, buscamos aprovechar el ARNm que codifica los dominios funcionales derivados de las proteínas pro-apoptóticas para superar la resistencia mencionada anteriormente. Específicamente, estos dominios están diseñados no solo para aliviar las limitaciones inhibitorias impuestas por los miembros redundantes de la familia BCL-2 pro-supervivencia^[32],^[33], sino también para activar directamente los efectores de la muerte, lo que promueve así cascadas de mtApoptosis robustas y respuestas inmunitarias antitumorales eficaces.^[34],^[35],^[36]

En el presente estudio, se desarrolló una estrategia combinatoria basada en ARNm que emplea nanopartículas lipídicas de ARNm (LNP) que codifican los dominios BH3 de las proteínas de tipo activador para desencadenar una mtApoptosis robusta, lo que aumenta así la inmunidad antitumoral con la ACT. La formulación de ARNm/LNP induce preferentemente la muerte celular inmunogénica (ICD) en las células cancerosas y remodela el microambiente tumoral inmunosupresor. De manera notable, su combinación con la ACT mejora sinérgicamente la muerte de las células cancerosas in vitro al reducir su umbral apoptótico. Este efecto sinérgico se confirmó in vivo, donde la terapia combinada reveló además un efecto sinérgico pronunciado en el aumento de la eficacia terapéutica al promover el tráfico y la polifuncionalidad de las células T efectoras infiltrantes. Esta respuesta inmunitaria mejorada se logró mediante una división funcional del trabajo, lo que aumentó simultáneamente la citotoxicidad de las células T endógenas y alivió la disfunción de las células T transferidas. El análisis de una sola célula reveló además que esta terapia combinada reprogramó las células T efectoras hacia un perfil transcripcional más similar a la memoria con una diversidad ampliada del TCR. En conjunto, este estudio no solo implementa una estrategia combinatoria basada en ARNm, sino que también proporciona información mecanicista sobre el aumento de la muerte de las células T a través de la activación de la mtApoptosis.

Resultados

Diseño e ingeniería de ARNm/LNP que codifican dominios BH3 distintos

Para inducir la mtApoptosis, se diseñaron construcciones de ARNm para codificar dominios funcionales de dos subgrupos distintos de proteínas BH3: activadores directos (Bim y Puma) y sensibilizadores (Bad y Noxa). Esta estrategia de diseño evita la citotoxicidad generalizada asociada con las proteínas de longitud completa.^[37] Estos ARNm se sintetizaron mediante transcripción in vitro con el recubrimiento ARCA y se encapsularon en LNP compuestas por el lípido ionizable SM-102, el colesterol CHO-HP, el DSPC y el DMG-PEG2000,^[38], denominadas colectivamente mBH3@NP (Figura 1A). Este sistema LNP ampliamente utilizado es conocido por su alto potencial de traducción, lo que proporciona una plataforma de administración robusta para nuestras construcciones de ARNm. Las mBH3@NP exhibieron una morfología y una distribución del tamaño hidrodinámico uniformes, según lo confirmado por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de luz dinámica (DLS) (Figuras 1B y 1C), y mantuvieron la estabilidad física y funcional en diversas condiciones patológicas (Figuras 1D y 1E).

Cada dominio BH3 se fusionó con un andamio de cuádruple aptámero de Stefin A para estabilizar y restringir espacialmente su conformación, logrando así una interacción óptima con las proteínas de la familia BCL-2 pro-supervivencia^[39],^[40] (Figura 1F). El ensayo de gel de agarosa confirmó el tamaño y la integridad del ARNm con o sin el andamio (Figura S1A). En las células de melanoma, las mBH3@NP (particularmente las mPuma@NP y las mBim@NP) indujeron la mtApoptosis dependiente de la dosis, evidenciada por los cuerpos apoptóticos, la formación de burbujas celulares y la tinción con anexina V/PI (Figuras 1G, 1H y S1B). Entre las cuatro mBH3@NP, los dominios BH3 de los activadores directos (PUMA y BIM) mostraron una actividad pro-apoptótica superior en comparación con los sensibilizadores (Noxa y Bad), probablemente debido a su amplia afinidad por las proteínas BCL-2 pro-supervivencia y a su capacidad de activación directa independiente de los dominios de orientación C-terminal^[41],^[42] (Figuras 1I y 1J). La fusión del andamio mejoró aún más la actividad pro-apoptótica, particularmente para Puma, lo que es consistente en las líneas celulares de cáncer de colon (Figuras 1I, 1J y S1C). Con base en estos resultados, este estudio seleccionó los dominios BH3 diseñados con andamios derivados del subgrupo activador (Bim y Puma)^[43],^[44] para una mayor investigación en la inmunoterapia de tumores sólidos.

Las mBH3@NP indujeron preferentemente la mtApoptosis y la muerte celular inmunogénica en las células cancerosas

Se evaluó la eficacia pro-apoptótica de las mBH3@NP tanto en líneas celulares cancerosas como no cancerosas, ya que, en teoría, las células cancerosas que expresan altos niveles de las proteínas BCL-2 pro-supervivencia son más susceptibles a los estímulos apoptóticos mediados por BH3.^[45] En particular, tanto las mBH3@NP (mPuma@NP y mBim@NP) indujeron eficazmente la apoptosis en las líneas celulares de melanoma murino (B16-F10) y carcinoma de colon (CT-26), al tiempo que exhibían una toxicidad mínima hacia las líneas celulares no cancerosas (T293 y bEnd3) (Figuras 2A, S2A y S2B), lo que apoya el potencial de la terapia de ARNm mediada por dominios BH3 como una inmunoterapia contra el cáncer con un perfil de seguridad favorable.^[46] Para dilucidar aún más los posibles mecanismos subyacentes a los efectos antitumorales de las mBH3@NP in vitro, se evaluaron los marcadores clave de la vía de la mtApoptosis mediante Western blot y tinción de inmunofluorescencia. La elevación de la relación Bax/Bcl-2 después de la transfección de mBH3@NP refleja un cambio hacia la apoptosis, lo que desencadena la cascada de clivaje descendente de las caspasas efectoras, incluidas la caspasa-3 y la caspasa-9 (Figura 2B). La marcada reducción observada de Mcl-1 probablemente resultó de la degradación proteasómica mediada por ubiquitina, lo que sirvió como un efecto secundario de la activación de la apoptosis^[47] (Figura 2B). En particular, estos fenómenos fueron más pronunciados con las mBim@NP, lo que indica su potencia superior como activadores de la apoptosis. Además, ambas mBH3@NP indujeron la pérdida del potencial de la membrana externa mitocondrial en las células cancerosas, como se demostró mediante la tinción con JC-1 (Figura 2C), y promovieron rápidamente la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que desencadenó la liberación de citocromo c de las mitocondrias, eventos clave necesarios para iniciar la mtApoptosis (Figuras 2D y S2C). En conjunto, estos resultados indicaron que las mBH3@NP desencadenaron preferentemente la mtApoptosis en las células cancerosas in vitro.

Para investigar si las mBH3@NP inducen la ICD mediante la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño (DAMP), se detectaron los biomarcadores clave de la ICD, que incluyen la calreticulina superficial (CRT), la HMGB1 extracelular y el ATP secretado.^[48] En particular, las mBH3@NP aumentaron notablemente la exposición de CRT (una señal de "cómeme"), junto con la liberación de HMGB1 y ATP, que representan las señales de "peligro" y "encuéntrame", respectivamente (Figuras 2F y S2D). La cocultivo de células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) con células cancerosas pretratadas con mBH3@NP mejoró la estimulación inmunitaria de las DC, lo que se manifestó como una mayor expresión de los marcadores de costimulación CD80 y CD86 (Figura 2G), lo que indica que la liberación de DAMP mediada por mBH3@NP promovió la maduración de las células dendríticas. En conjunto, las mBH3@NP indujeron preferentemente tanto la mtApoptosis como la ICD en las células cancerosas.

Las mBH3@NP indujeron una inmunidad antitumoral eficaz y remodelaron el microambiente tumoral

Para investigar la eficacia terapéutica in vivo de las mBH3@NP, se administraron intratumoralmente en un modelo de melanoma subcutáneo (Figura 3A). Los estudios complementarios de biodistribución realizados utilizando ARNm de reportero que codifica Nluc demostraron además que la formulación se retuvo predominantemente dentro del tejido tumoral (Figuras S3A y S3B). Tanto las mBim@NP como las mPuma@NP suprimieron el crecimiento tumoral, y las mBim@NP exhibieron efectos terapéuticos superiores (Figuras 3B, 3C y S4A), lo que es consistente con su actividad pro-apoptótica observada in vitro. Mecánicamente, los tumores tratados con mBH3@NP exhibieron un aumento notable de las relaciones Bax/Bcl-2 y Bak/Bcl-2, junto con niveles reducidos de pro-caspasa-3 y pro-caspasa-9 (Figura 3D), lo que confirmó una activación robusta de la apoptosis. Mientras tanto, los niveles de expresión endógenos de las proteínas BH3 correspondientes (PUMA y BIM) permanecieron en gran medida sin cambios después de la transfección (Figura 3D). La tinción con TUNEL validó aún más la activación de la apoptosis (Figura 3E, panel superior). Además, la inmunofluorescencia mostró una mayor infiltración de células T CD8+ en ambos grupos tratados con mBH3@NP en comparación con los controles (Figura 3E, panel central). En particular, el tratamiento con mBim@NP indujo una mayor exposición de CRT y liberación de HMGB1 (Figuras 3E, panel inferior, y 3F), lo que indica una inducción más potente de la ICD in vivo.

Para comprender mejor sus efectos inmunomoduladores, se analizaron las citocinas inflamatorias tumorales y los perfiles de células inmunitarias. Tanto mPuma@NPs como mBim@NPs elevaron significativamente los niveles secretados de granzima B (GrB), interferón gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) dentro de los tumores (Figura 3G). El perfilamiento inmunitario reveló un marcado enriquecimiento de las células T infiltrantes tumorales (particularmente las células T citotóxicas CD8+) en los tumores tratados con mBH3@NPs, acompañado de una reducción concurrente en las poblaciones de células inmunosupresoras, incluidas las células T reguladoras inhibitorias (Tregs), las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSCs) y los macrófagos asociados al tumor de tipo M2 (M2-TAMs) (Figura 3H). Estos cambios probablemente fueron el resultado de una activación inmunitaria a gran escala impulsada por la ICD y la regulación a la baja de las proteínas clave pro-supervivencia, esenciales para la supervivencia de las células supresoras.^[49],^[50] Cabe destacar que los efectos inmunomoduladores fueron más pronunciados en el grupo tratado con mBim@NPs, lo que indica su mayor capacidad para aliviar el microambiente tumoral inmunosupresor (TME). Además, mBim@NPs mejoró notablemente la maduración de las células dendríticas en los ganglios linfáticos de drenaje tumoral (TdLNs) (Figura 3H), lo que sugiere una mayor activación inmunitaria sistémica. Es importante destacar que no se observó una pérdida significativa de peso corporal, hepatotoxicidad ni daño orgánico (Figuras S3C–S3F), lo que indica una bioseguridad sistémica favorable. Evaluamos además la eficacia de mBH3@NPs en el modelo tumoral MC-38 (Figuras S4A–S4C). En comparación con el modelo de melanoma, estos indujeron una inhibición moderada del crecimiento tumoral. La tinción de inmunohistoquímica de Ki67 y TUNEL confirmó la disminución de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis en los tumores tratados con mBH3@NPs (Figuras S4D y S4E). Estas observaciones sugieren que mBH3@NPs por sí solo pueden retrasar la progresión tumoral, pero puede que no sean suficientes para controlar la progresión tumoral agresiva.

En general, mBH3@NPs mejoró la exposición de las señales de ICD y promovió la maduración de las células dendríticas y el "cross-priming" de las células T efectoras, remodelando así el TME inmunosupresor e iniciando ciclos de inmunidad antitumoral.### mBH3@NPs sinergizó la citotoxicidad mediada por células T in vitro

Dado el potencial de las terapias basadas en la mtApoptosis para aumentar las inmunoterapias,^[8],^[9],^[10], evaluamos si la terapia de ARNm mediada por el dominio BH3 desarrollada podría sinergizar con las células T citotóxicas in vitro. Se realizaron ensayos de cocultivo utilizando células B16-OVA como objetivo y células efectoras derivadas de OT-1 (Figura 4A). Los linfocitos T citotóxicos (CTLs) preactivados con CD3/CD28 mostraron resistencia a la apoptosis inducida por mBH3@NPs (Figura 4B), probablemente debido a un umbral de mtApoptosis elevado impulsado por la regulación al alza de las proteínas pro-supervivencia y pro-apoptóticas (Figura 4C). Esta resistencia intrínseca en los CTLs preactivados proporcionó una base para la seguridad de combinar mBH3@NPs con la terapia de células T.

A continuación, se evaluaron los efectos sinérgicos de dos mBH3@NPs (mPuma@NPs y mBim@NPs) sobre la citotoxicidad mediada por células T en diferentes proporciones efector/objetivo (E:T). Ambas formulaciones mejoraron la eliminación mediada por células T, haciendo que las células objetivo fueran más susceptibles al ataque de los CTLs (Figura 4D). Sorprendentemente, la inducción apoptótica comparativamente moderada por mPuma@NPs permitió una mayor mejora de la eliminación mediada por células T, lo que resultó en un efecto sinérgico más pronunciado a proporciones E:T más altas (Figura 4D). En contraste, la inducción de apoptosis más fuerte por mBim@NPs puede haber llevado a una saturación casi completa del efecto sinérgico. Además, la sinergia fue más evidente a proporciones E:T más bajas (1:4 o 1:2) y disminuyó a proporciones más altas (4:1 o 10:1), lo que es consistente con los hallazgos previos en la terapia basada en células asesinas naturales (NK).^[9] Estos resultados sugieren que la citotoxicidad mediada por células T depende más de la activación apoptótica intrínseca a proporciones E:T más bajas, mientras que la función citotóxica tiende a saturarse a proporciones más altas. Cabe destacar que esta terapia combinada logra una eficacia de eliminación comparable a la de las células T solas a proporciones altas (10:1), incluso a proporciones E:T más bajas, lo que sugiere su potencial para cambiar el equilibrio E:T a favor de las células T y reducir la dosis celular necesaria para las aplicaciones clínicas. Dado que las proporciones E:T más bajas imitan mejor las condiciones inmunosupresoras del microambiente tumoral sólido,^[51], se examinaron los efectos sinérgicos de las diferentes dosis de mBH3@NPs a proporciones E:T bajas (1:4 y 1:2). Sorprendentemente, dosis extremadamente bajas de mBH3@NPs fueron suficientes para aumentar la citotoxicidad mediada por células T al llevar a las células cancerosas más allá de su umbral de apoptosis, y dosis más altas no proporcionaron beneficios adicionales. Esta respuesta dosis-dependiente no lineal sugirió que la terapia combinada podría reducir los requisitos de ARNm y los costos asociados (Figura 4E). Además, nuestro índice de combinación (CI) calculado se mantuvo constantemente por debajo de 1 (Figuras S5A y S5B).

Dentro del microambiente tumoral con privación de nutrientes y supresión metabólica, las células T a menudo sufren una reprogramación metabólica disfuncional, lo que finalmente conduce al agotamiento.^[52],^[53] Para dilucidar aún más el mecanismo molecular subyacente a la sinergia entre mBH3@NPs y las células T, se investigaron las alteraciones en el estado metabólico de las células T y la función mitocondrial. Se descubrió que las células T cocultivadas con células tumorales pretratadas con mBH3@NPs exhibieron una reducción significativa en la captación de glucosa, como lo demuestra la regulación a la baja de la expresión de Glut-1 y la disminución de la incorporación de 2-NBDG (Figuras 4F y 4G). Al mismo tiempo, estas células T mostraron un alivio marcado del estrés oxidativo, caracterizado por una mayor relación GSH/GSSG, niveles reducidos de ROS y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial (Figuras 4H–4J). Estas alteraciones metabólicas están estrechamente acopladas con un cambio funcional: la expresión de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 se redujo significativamente (Figura 4K), mientras que la proporción de células T CD62L+ con potencial de memoria aumentó (Figura 4L). mBH3@NPs también mejoró la secreción de factores citotóxicos, incluidos GrB e IFN-γ (Figuras S5C y S5D), lo que confirmó la mejora en la función de las células T (Figura S5E). En conjunto, nuestros datos demuestran que mBH3@NPs no solo sensibilizan a las células tumorales a la apoptosis, sino que también remodelan el ambiente metabólico hostil de las células T, mejorando así su estado físico metabólico, retrasando el agotamiento y promoviendo la diferenciación de la memoria.### mBH3@NPs promovió el reclutamiento de células T transferidas de forma adoptiva

La infiltración inadecuada de células T es una barrera importante que limita la eficacia terapéutica de la terapia celular adoptiva (ACT) en tumores sólidos.^[54] Dado que la monoterapia con mBH3@NPs indujo una ICD potente e inició un ciclo de inmunidad antitumoral in vivo, este estudio investigó si podrían mejorar el reclutamiento de células T transferidas de forma adoptiva. En un ensayo de Transwell, los fluidos recogidos de los tumores tratados con mBH3@NPs aumentaron significativamente la migración de las células OT-1 marcadas con CFSE hacia las células B16-OVA, con un aumento de 2 y 1,5 veces observado en los grupos de mPuma@NPs y mBim@NPs, respectivamente (Figuras 5A y 5B). Basándonos en estas observaciones in vitro, evaluamos además la infiltración de células T in vivo inyectando por vía intravenosa células OT-1 preactivadas marcadas con Cy5 un día después de la administración de mBH3@NPs (Figura 5C). La imagen in vivo mostró un aumento de la acumulación tumoral de las células T marcadas con Cy5 en los grupos tratados con mBH3@NPs, aunque no fue estadísticamente significativo (Figura 5D). El análisis citométrico de flujo de los tumores extirpados confirmó además un aumento significativo del recuento de células T OT-1 en los grupos de mPuma@NPs y mBim@NPs (Figura 5E).

Para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes, se realizaron análisis transcriptómicos. El mapa de calor reveló la regulación al alza de las interleucinas (ILs), quimiocinas y granzimas proinflamatorias (mediadores clave del reclutamiento y la activación de las células T) en los grupos tratados con mBH3@NPs (Figura 5F). El análisis de enriquecimiento de vías respaldó aún más estos hallazgos, destacando la mejora de las vías de señalización relacionadas con la inmunidad, en particular aquellas involucradas en la activación, migración y proliferación de las células T (Figura 5G). Coherente con los datos transcriptómicos, los ensayos de citocinas múltiples confirmaron niveles elevados de proteínas de las quimiocinas proinflamatorias clave (CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5) y las citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-1β) en los tumores tratados con mBH3@NPs (Figura 5H). Entre estos, el eje CCL4/CCL5-CCR5 se ha identificado como un fuerte correlato de la infiltración de células T CD8+.^[55],^[56],^[57] Basado en este eje, el cocultivo de células tumorales tratadas con mBH3@NPs con BMDCs condujo a una mayor secreción de CCL4 y CCL5 en los grupos de mPuma@NPs y mBim@NPs (Figuras S6A y S6B). Además, los ensayos de migración de Transwell mostraron que los sobrenadantes de las células tratadas con mBim@NPs indujeron la mayor migración de células T CD8+ (Figura S6C), lo que subraya el papel fundamental de CCL4 y CCL5 en el tráfico de las células T. En conjunto, estos resultados sugieren que mBH3@NPs mejoran el reclutamiento de células T transferidas de forma adoptiva al estimular la secreción de quimiocinas y citocinas clave dentro del microambiente tumoral.### La combinación de mBH3@NPs y terapia celular adoptiva mejoró los efectos terapéuticos

A continuación, evaluamos los efectos terapéuticos in vivo de la combinación de mBH3@NPs con ACT. Se empleó el modelo de melanoma B16-F10 que expresa el antígeno gp100. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 100 mm3, se administraron mBH3@NPs (mPuma@NPs y mBim@NPs) de forma intratumoral, seguido de la infusión intravenosa de células PMEL gp100-específicas preactivadas al día siguiente (Figura 6A). Esta separación temporal se diseñó para minimizar cualquier posible efecto adverso sobre la viabilidad de las células T infundidas. Si bien la monoterapia con mBH3@NPs o células T inhibió moderadamente el crecimiento tumoral, las terapias combinadas mostraron una supresión tumoral marcadamente mejorada (Figuras 6B, S7A y S7B). Cabe destacar que la combinación de mBim@NPs y células T exhibió el efecto antitumoral más fuerte (Figura 6B). El análisis de supervivencia confirmó además el beneficio terapéutico, con una supervivencia significativamente prolongada en los grupos de combinación (Figura 6C) y sin cambios notables en el peso corporal (Figura S7C). Estos efectos sinérgicos también fueron evidentes en el modelo de melanoma B16-OVA que utiliza células T OT-1 (Figura 6D), donde la terapia combinada suprimió significativamente la progresión tumoral y mejoró la supervivencia en comparación con la monoterapia con células T (Figuras 6E, 6F y S8A–S8C).

Para dilucidar los mecanismos que subyacen a la respuesta antitumoral mejorada, analizamos la proporción, la cantidad absoluta, el fenotipo y la función de las células T CD8+ infiltrantes en el tumor. En comparación con la terapia celular adoptiva (ACT) sola, el cotratamiento con mBH3@NPs aumentó notablemente el número absoluto de células T efectoras infiltrantes en el tumor, incluidas tanto las poblaciones endógenas como las transferidas de PMEL, junto con un aumento de los recuentos de los subconjuntos Teff y Tcm, lo que es consistente con una expansión genuina en lugar de un cambio proporcional (Figuras S7D y S7E). Se observó un aumento predominante en la proporción de células T PMEL transferidas (CD90.1) (Figura 6G). Si bien la terapia combinada promovió un cambio general de las células T CD8+ infiltrantes en el tumor, desde un estado de memoria central (CD44highCD62Lhigh) a un fenotipo de memoria efectora (CD44highCD62Llow) (Figura 6G), parece que fomentó una división funcional del trabajo, mejorando la citotoxicidad inmediata de las células endógenas al tiempo que preservaba la persistencia a largo plazo al mantener un fenotipo de memoria central en las células T PMEL transferidas, particularmente cuando se combinaba con mBim@NPs (Figura S7F). La terapia combinada mejoró la polifuncionalidad de las células T CD8+ infiltrantes en el tumor. Cabe destacar que este efecto fue más pronunciado dentro del compartimento de células T endógenas, donde observamos un aumento marcado en la expresión de moléculas citotóxicas clave, incluidas GrB y la perforina (Figuras 6H y S7G). Además, la combinación de células T con mBim@NPs aumentó aún más la secreción de GrB por las células T esplénicas tras la restimulación ex vivo (Figura 6H), lo que indica una mayor citotoxicidad sistémica. Además de promover la función citotóxica, la combinación de células T con mBim@NPs también se asoció con una expresión modulada de moléculas clave de los puntos de control inmunitario. Se observaron niveles reducidos de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y LAG-3 tanto en las células T CD8+ endógenas como en las transferidas (Figuras 6I y S7H). Teniendo en cuenta los puntos de tiempo del análisis y la mejora concomitante en la función efectora de las células T, esta reducción puede reflejar un cambio general hacia un estado más funcional. En contraste, la ausencia de un perfil de puntos de control inmunitario modulado observado en la combinación de células T con mPuma@NPs (Figuras 6I y S7H) puede correlacionarse con el resultado terapéutico superior de la combinación de mBim@NPs, lo que sugiere el establecimiento de un entorno inmunomodulador más favorable. Para validar aún más la solidez de esta estrategia combinatoria, se llevaron a cabo experimentos similares en el modelo de melanoma B16-OVA. De manera similar a los hallazgos anteriores, la terapia combinada de células T con mBH3@NPs mejoró la infiltración de células T CD8+ y la polifuncionalidad, incluido el aumento de la citotoxicidad y la reducción de la disfunción (Figuras S8D–S8G). La imagen de inmunofluorescencia confirmó aún más la mayor acumulación de células T CD8+ en tumores y ganglios linfáticos en los grupos combinados, acompañada de un estado efector aumentado, que se manifestó por una mayor expresión de IFN-γ y una reducción del punto de control inhibidor PD-1 (Figuras 6J y S9A–S9C). Para visualizar y resolver espacialmente las células T con potencial de memoria y adaptación tisular, se realizó una tinción multiplex para CD8, CD44, CCR7 y CD69. Este análisis espacial reveló que la terapia combinada enriqueció las células T CD8+ infiltrantes en el tumor que coexpresaban CD44, CCR7 y CD69 (Figuras 6J y S9A). El fenotipo observado sugiere que la terapia combinada indujo un estado de diferenciación que combina el potencial de tráfico asociado a la memoria con características de adaptación tisular, lo que podría contribuir a una respuesta inmunitaria más sostenida. No se observó un cambio significativo en los marcadores de la función hepática y renal (ALT, AST, TBIL y CR), y solo se notó una ligera reducción en los niveles de urea en el grupo de combinación de células T y mBim@NPs (Figura S8H). Además, el monitoreo sistemático de las citocinas séricas relacionadas con el síndrome de liberación de citocinas (IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ) no reveló aumentos significativos, lo que indica un bajo riesgo de eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (Figura S8I). En general, estos hallazgos subrayan la mayor potenciación de la polifuncionalidad de las células T mediante la combinación de ACT con mBH3@NPs, especialmente con mBim@NPs.

Para evaluar aún más el rendimiento de nuestra plataforma, se realizó una comparación directa con el mimético de BH3 utilizado clínicamente, ABT-199 (Venetoclax), en combinación con la terapia celular adoptiva. Los resultados mostraron que tanto la monoterapia con ABT-199 como su combinación con células T mostraron una eficacia moderada, mientras que mBH3@NPs (mPuma@NPs o mBim@NPs) combinados con células T inhibieron significativamente el crecimiento tumoral, prolongaron la supervivencia y mejoraron la infiltración de células T (Figuras S10A–S10E). Esta comparación directa destaca el potencial superior de la plataforma de ARNm/LNP para permitir una inmunoterapia eficaz en neoplasias sólidas.

Para evaluar aún más el potencial traslacional, se estableció un modelo de xenoinjerto humanizado utilizando células HeLa-NY-ESO-1 (Figuras S11A y S11B). En un ensayo de cocultivo ex vivo, el pretratamiento de las células tumorales con mPuma@NPs y mBim@NPs mejoró su susceptibilidad a la muerte mediada por células T-R. Este efecto sinérgico se evidenció por un aumento de la apoptosis observado en ambas proporciones bajas y altas de E:T (Figura S11C). De manera consistente con esto, en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de HeLa-NY-ESO-1 en ratones NSG, la combinación de mBH3@NPs con células T-R mejoró significativamente la eficacia antitumoral en comparación con las células T solas (Figuras S11D–S11G). En conjunto, estos resultados demostraron que mBH3@NPs sinergizan con las células T específicas del antígeno para mejorar la eliminación de las células tumorales tanto en ensayos basados en células humanas como en modelos in vivo.

La terapia combinada dirigió las células T CD8+ hacia estados similares a la memoria con una diversidad ampliada del TCR

Los resultados anteriores demostraron distintos estados polifuncionales de las células T CD8+ infiltrantes en el tumor entre la monoterapia con ACT y la terapia combinada con mBH3@NPs. Para dilucidar las disparidades del paisaje transcripcional, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en estas células T (Figura 7A). La integración y la agrupación no supervisada de 68.176 células T CD8+ de tres condiciones resolvieron 12 grupos transcripcionalmente distintos: células T reguladoras Foxp3+ (grupo 1), células de memoria efectoras o efectoras diferenciadas terminalmente (Temra, grupo 2), células T precursoras agotadas Tcf+ (Tcf+ Tpex, grupo 3), células T invariantes asociadas a la mucosa/células T invariantes NK (MAIT/iNKT, grupo 4), células T estimuladas por genes de interferón (Tisg, grupo 5), células T agotadas Xcl1+ (Xcl1+ Tex, grupo 6), células T de respuesta al estrés (Tstr, grupo 7), células T ingenuas (Tnaive, grupo 8), células T similares a las innatas Fcer1g+ (ILTCK, grupo 9), células T proliferantes (grupo 10), células de memoria tisular Gzmk+ (Gzmk+ Trm, grupo 11) y células T agotadas terminales (Tex, grupo 12) (Figuras 7B–7D).^[58],^[59],^[60]

El análisis de los fenotipos de los linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL) reveló que la combinación basada en mBim@NPs indujo una reorganización más pronunciada del paisaje de los TIL CD8+ en comparación con el grupo de mPuma@NPs (Figura 7B). Se observaron distintas distribuciones de subconjuntos de células T CD8+ entre los grupos de tratamiento. Los respondedores de la monoterapia con ACT estaban dominados por Tex y células T proliferantes, con este último grupo coexpresando altos niveles de marcadores mitóticos (Mki67 y Stmn1) y marcadores de agotamiento (Pdcd1, Tigit y Havcr2), lo que indica una hiperproliferación y disfunción crónica impulsadas por el antígeno. Por el contrario, los respondedores de la terapia combinada exhibieron frecuencias aumentadas de células T ingenuas, Gzmk+ Trm y células Temra, con estos dos últimos subconjuntos enriquecidos con genes asociados con una función citotóxica y migratoria robusta (Cx3cr1, Itgb1 y Ccl5) (Figuras 7B y 7C). Estos cambios pueden derivar de la activación de vías de apoptosis intrínsecas mediadas por mBH3@NPs, lo que impulsa tanto las transiciones composicionales como fenotípicas dentro del compartimento de células T CD8+ hacia subconjuntos menos diferenciados y más funcionales. Sorprendentemente, mBim@NPs indujo aún más una expansión significativa de las células T similares a las innatas con potencial citotóxico (ILTCK) cuando se combinó con células T (Figuras 7B y 7C), que es un subtipo CD8+ similar a las innatas residente en el tumor que exhibe una amplia reactividad a los autoantígenos no mutados^[58],^[61] (Figuras 7B y 7C). Esta expansión puede estar impulsada por una mayor cascada de presentación de antígenos mediada por células dendríticas convencionales (cDC), desencadenada por la robusta inmunogenicidad celular inducida por mBim@NPs.^[62] Además, la combinación de mBH3@NPs y ACT reprogramó las células T agotadas e hiperproliferativas hacia un fenotipo similar a un progenitor caracterizado por una citotoxicidad reducida (Figuras 7E y 7F). El análisis de la expresión diferencial reveló la regulación al alza de los genes relacionados con la citotoxicidad (Gzmm y Gzma), los marcadores de memoria (Sell, Tcf7) y los factores de transcripción que responden a una señalización eficaz del TCR (Klf2, Fos y Jun), junto con la regulación a la baja de los genes inmunosupresores (Pdcd1 y Tigit) dentro del microentorno tumoral (TME) en comparación con ACT solo (Figura 7G). Estos cambios transcripcionales fueron impulsados principalmente por la exposición al antígeno tumoral facilitada por las APC, particularmente las cDC de tipo I.^[63] En conjunto, estos resultados demostraron que la terapia combinada reprogramó el paisaje transcripcional de las células T CD8+, impulsando su reconfiguración funcional y fenotípica. Además, la terapia combinada remodeló indirectamente el paisaje de las células T CD4+ a través de efectos secundarios (Figuras S12A y S12B). En particular, el tratamiento redujo la Treg desregulada al tiempo que aumentó la proporción y la diversidad clonal de las células Trm CD4+ funcionales (Figuras S12B y S12C), lo que sugiere una población de células T CD4+ más diversa, duradera y funcionalmente competente dentro del TME.

La integración de los datos del TCR pareado reveló distintos patrones de diversidad del repertorio entre los tratamientos. La terapia combinada con mPuma@NPs (TP) y mBim@NPs (TB) mejoró la diversidad del TCR dentro de los principales subconjuntos de CD8+, particularmente los subconjuntos Gzmk+ Trm y Tnaive, lo que indica un reclutamiento más amplio del repertorio de células T endógenas^[64] (Figura 7H). En general, las combinaciones de mBH3@NPs (especialmente mBim@NPs) ampliaron notablemente la diversidad del repertorio del TCR de las células T CD8+ en lugar de las células T CD4+, como lo refleja la entropía de Shannon elevada (Figura 7I). El análisis de la entropía de Shannon normalizada en los subconjuntos confirmó una distribución más equilibrada de la diversidad del TCR en los grupos combinados, con aumentos significativos en los subconjuntos Tex y CD8+ proliferantes (Figura 7J), que exhibieron una menor diversidad y oligoclonalidad, lo que refleja la especificidad del antígeno tumoral bajo la monoterapia con ACT (Figura 7J). Estas observaciones sugieren que la combinación mitiga el dominio clonal de los subconjuntos reactivos al antígeno, ampliando tanto la amplitud clonal como la heterogeneidad funcional del repertorio de células T antitumorales. En conjunto, todos estos análisis revelaron que la terapia combinada dirigió las células T CD8+ hacia estados similares a la memoria con una diversidad ampliada del TCR.

Diseño e ingeniería de ARNm/LNP que codifican distintos dominios de BH3

Para inducir la apoptosis, se diseñaron construcciones de ARNm para codificar dominios funcionales de dos subgrupos distintos de proteínas BH3: activadores directos (Bim y Puma) y sensibilizadores (Bad y Noxa). Esta estrategia de diseño evita la citotoxicidad generalizada asociada con las proteínas de longitud completa.^[37] Estos ARNm se sintetizaron mediante transcripción in vitro con encapsulación ARCA y se encapsularon en LNP compuestos por el lípido ionizable SM-102, el colesterol CHO-HP, el DSPC y el DMG-PEG2000,^[38], denominados colectivamente mBH3@NPs (Figura 1A). Este sistema de LNP ampliamente utilizado es conocido por su alto potencial de traducción, lo que proporciona una plataforma de administración robusta para nuestras construcciones de ARNm. Los mBH3@NPs exhibieron una morfología uniforme y una distribución del tamaño hidrodinámico, como se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de luz dinámica (DLS) (Figuras 1B y 1C), y mantuvieron la estabilidad física y funcional en diversas condiciones patológicas (Figuras 1D y 1E).

Cada dominio BH3 se fusionó a un andamio de cuádruple aptámero Stefin A para estabilizar y restringir espacialmente su conformación, logrando así una interacción óptima con las proteínas pro-supervivencia de la familia BCL-2^[39],^[40] (Figura 1F). El ensayo en gel de agarosa confirmó el tamaño y la integridad del ARNm con o sin el andamio (Figura S1A). En las células de melanoma, los mBH3@NPs (particularmente mPuma@NPs y mBim@NPs) indujeron apoptosis dependiente de la dosis, evidenciada por cuerpos apoptóticos, abultamiento celular y tinción con anexina V/PI (Figuras 1G, 1H y S1B). De los cuatro mBH3@NPs, los dominios BH3 de los activadores directos (PUMA y BIM) mostraron una actividad pro-apoptótica superior en comparación con los sensibilizadores (Noxa y Bad), probablemente debido a su amplia afinidad por las proteínas pro-supervivencia BCL-2 y su capacidad de activación directa independiente de los dominios de direccionamiento C-terminal^[41],^[42] (Figuras 1I y 1J). La fusión del andamio mejoró aún más la actividad pro-apoptótica, particularmente para Puma, de manera consistente en las líneas celulares de cáncer de colon (Figuras 1I, 1J y S1C). Con base en estos resultados, este estudio seleccionó los dominios BH3 diseñados con andamios derivados del subgrupo de activadores (Bim y Puma)^[43],^[44] para una mayor investigación en inmunoterapia de tumores sólidos.

Los mBH3@NPs indujeron preferentemente la apoptosis y la muerte celular inmunogénica en las células cancerosas

Se evaluó la eficacia pro-apoptótica de los mBH3@NPs tanto en líneas celulares cancerosas como no cancerosas, ya que, teóricamente, las células cancerosas que expresan altos niveles de las proteínas pro-supervivencia BCL-2 son más susceptibles a los estímulos apoptóticos mediados por BH3.^[45] En particular, tanto los mBH3@NPs (mPuma@NPs y mBim@NPs) indujeron eficazmente la apoptosis en las líneas celulares de melanoma murino (B16-F10) y carcinoma colorrectal (CT-26), al tiempo que exhibían una toxicidad mínima hacia las líneas celulares no cancerosas (T293 y bEnd3) (Figuras 2A, S2A y S2B), lo que respalda el potencial de la terapia con ARNm mediada por el dominio BH3 como una inmunoterapia contra el cáncer con un perfil de seguridad favorable.^[46] Para dilucidar aún más los posibles mecanismos subyacentes a los efectos antitumorales de los mBH3@NPs in vitro, se evaluaron los principales marcadores de la vía de la apoptosis mediante Western blot y tinción de inmunofluorescencia. El aumento de la relación Bax/Bcl-2 después de la transfección de mBH3@NPs refleja un cambio hacia la apoptosis, lo que inicia la cascada de escisión de las caspasas efectoras, incluidas la caspasa-3 y la caspasa-9 (Figura 2B). La marcada disminución observada de Mcl-1 probablemente resultó de la degradación proteasómica mediada por ubiquitina, lo que sirvió como un efecto secundario de la activación de la apoptosis^[47] (Figura 2B). En particular, estos fenómenos fueron más pronunciados con los mBim@NPs, lo que indica su mayor potencia como activadores de la apoptosis. Además, ambos mBH3@NPs indujeron la pérdida del potencial de la membrana externa mitocondrial en las células cancerosas, como se demostró mediante la tinción con JC-1 (Figura 2C), y promovieron rápidamente la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que desencadenó la liberación de citocromo c de las mitocondrias, eventos clave necesarios para iniciar la apoptosis (Figuras 2D y S2C). En conjunto, estos resultados indicaron que los mBH3@NPs desencadenaron preferentemente la apoptosis en las células cancerosas in vitro.

Para investigar si los mBH3@NPs inducen la muerte celular inmunogénica (DCI) a través de la liberación de patrones moleculares asociados al daño (PAMD), se detectaron los principales biomarcadores de la DCI, incluido el calreticulín (CRT) de la superficie, el HMGB1 extracelular y el ATP secretado.^[48] En particular, los mBH3@NPs aumentaron notablemente la exposición de CRT (una señal de "cómeme"; Figura 2E), junto con la liberación de HMGB1 y ATP, que representan las señales de "peligro" y "encuéntrame", respectivamente (Figuras 2F y S2D). La cocultivo de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) con células cancerosas pretratadas con mBH3@NPs mejoró la estimulación inmune de las DC, lo que se manifestó como una mayor expresión de los marcadores costimuladores CD80 y CD86 (Figura 2G), lo que indica que la liberación de PAMD mediada por mBH3@NPs promovió la maduración de las células dendríticas. En conjunto, los mBH3@NPs indujeron preferentemente tanto la apoptosis como la DCI en las células cancerosas.

Los mBH3@NPs indujeron una inmunidad antitumoral eficaz y remodelaron el microambiente tumoral

Para investigar la eficacia terapéutica in vivo de los mBH3@NPs, se administraron intratumoralmente en un modelo de melanoma subcutáneo (Figura 3A). Los estudios complementarios de biodistribución realizados utilizando ARNm reportero que codifica Nluc demostraron aún más que la formulación se retuvo predominantemente dentro del tejido tumoral (Figuras S3A y S3B). Tanto los mBim@NPs como los mPuma@NPs suprimieron el crecimiento tumoral, y los mBim@NPs exhibieron efectos terapéuticos superiores (Figuras 3B, 3C y S4A), lo que es consistente con su actividad pro-apoptótica observada in vitro. Mecánicamente, los tumores tratados con mBH3@NPs exhibieron un aumento notable de las relaciones Bax/Bcl-2 y Bak/Bcl-2, junto con niveles reducidos de pro-caspasa-3 y pro-caspasa-9 (Figura 3D), lo que confirmó una activación robusta de la apoptosis. Mientras tanto, los niveles de expresión endógenos de las proteínas BH3 correspondientes (PUMA y BIM) permanecieron en gran medida sin cambios después de la transfección (Figura 3D). La tinción con TUNEL validó aún más la activación de la apoptosis (Figura 3E, panel superior). Además, la inmunofluorescencia mostró una mayor infiltración de células T CD8+ en ambos grupos tratados con mBH3@NPs en comparación con los controles (Figura 3E, panel central). En particular, el tratamiento con mBim@NPs indujo una mayor exposición de CRT y liberación de HMGB1 (Figuras 3E, panel inferior, y 3F), lo que indica una inducción más potente de la DCI in vivo.

Para comprender mejor sus efectos inmunomoduladores, se analizaron los perfiles de citocinas inflamatorias tumorales y las células inmunitarias. Tanto los mPuma@NPs como los mBim@NPs elevaron significativamente los niveles secretados de granzima B (GrB), interferón gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) dentro de los tumores (Figura 3G). El perfil inmunológico reveló un enriquecimiento marcado de las células T infiltrantes tumorales (particularmente las células T citotóxicas CD8+), en los tumores tratados con mBH3@NPs, acompañado de una reducción concurrente de las poblaciones celulares inmunes supresoras, incluidas las células T reguladoras (Treg) inhibidoras, las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) y los macrófagos asociados al tumor tipo M2 (M2-TAM) (Figura 3H). Estos cambios probablemente resultaron de una amplia activación inmune impulsada por la DCI y la regulación a la baja de las proteínas pro-supervivencia clave esenciales para la supervivencia de las células supresoras.^[49],^[50] En particular, los efectos inmunomoduladores fueron más pronunciados en el grupo tratado con mBim@NPs, lo que indica su mayor capacidad para aliviar el microambiente tumoral inmunosupresor (MTI). Además, los mBim@NPs mejoraron notablemente la maduración de las células dendríticas en los ganglios linfáticos regionales del tumor (GLRT) (Figura 3H), lo que sugiere una mayor activación inmune sistémica. Es importante destacar que no se observó una pérdida significativa de peso corporal, hepatotoxicidad ni daño orgánico (Figuras S3C–S3F), lo que indica una bios seguridad sistémica favorable. También evaluamos la eficacia de los mBH3@NPs en el modelo tumoral MC-38 (Figuras S4A–S4C). En comparación con el modelo de melanoma, estos indujeron una inhibición moderada del crecimiento tumoral. La inmunohistoquímica de Ki67 y TUNEL confirmó la disminución de la proliferación celular y el aumento de la apoptosis en ambos tumores tratados con mBH3@NPs (Figuras S4D y S4E). Estas observaciones sugieren que los mBH3@NPs por sí solos pueden retrasar la progresión tumoral, pero pueden ser insuficientes para controlar la progresión tumoral agresiva.

En general, los mBH3@NPs mejoraron la exposición de las señales de DCI y promovieron la maduración de las células dendríticas y la activación cruzada de las células T efectoras, remodelando así el MTI inmunosupresor e iniciando ciclos de inmunidad antitumoral.

Los mBH3@NPs sinergizaron la citotoxicidad mediada por las células T in vitro

Dado el potencial de las terapias basadas en la apoptosis para aumentar las inmunoterapias,^[8],^[9],^[10], evaluamos si la terapia con ARNm mediada por el dominio BH3 que desarrollamos podría sinergizar con las células T citotóxicas in vitro. Se realizaron ensayos de cocultivo utilizando células B16-OVA como objetivo y células OT-1 derivadas como efectoras (Figura 4A). Las células T linfocíticas citotóxicas (CTL) preactivadas con CD3/CD28 mostraron resistencia a la apoptosis inducida por mBH3@NPs (Figura 4B), probablemente debido a un umbral de apoptosis más elevado impulsado por la regulación al alza de las proteínas pro-supervivencia y pro-apoptóticas (Figura 4C). Esta resistencia intrínseca en las CTL preactivadas proporcionó una base para la seguridad de la combinación de mBH3@NPs con la terapia celular T.

A continuación, se evaluaron los efectos sinérgicos de dos mBH3@NPs (mPuma@NPs y mBim@NPs) sobre la citotoxicidad mediada por las células T a diferentes relaciones efector-objetivo (E:O). Ambas formulaciones mejoraron la muerte celular mediada por las células T, lo que hizo que las células objetivo fueran más susceptibles al ataque de las CTL (Figura 4D). Sorprendentemente, la inducción apoptótica relativamente moderada por los mPuma@NPs permitió una mayor mejora de la muerte celular mediada por las células T, lo que resultó en un efecto sinérgico más pronunciado a relaciones E:O más altas (Figura 4D). En contraste, la inducción de apoptosis más fuerte por los mBim@NPs puede haber llevado a una saturación casi completa del efecto sinérgico. Además, la sinergia fue más evidente a relaciones E:O más bajas (1:4 o 1:2) y disminuyó a relaciones más altas (4:1 o 10:1), lo que es consistente con los hallazgos previos en la terapia basada en células asesinas naturales (NK).^[9] Estos resultados sugieren que la citotoxicidad mediada por las células T depende más de la preparación apoptótica intrínseca a relaciones E:O más bajas, mientras que la función citotóxica tiende a saturarse a relaciones más altas. En particular, esta terapia combinada logra una eficacia de muerte comparable a la de las células T solas a relaciones altas (10:1), incluso a relaciones E:O más bajas, lo que sugiere su potencial para cambiar el equilibrio E:O a favor de las células T y reducir la dosis celular requerida para aplicaciones clínicas. Dado que las relaciones E:O más bajas se asemejan mejor a las condiciones inmunosupresoras del microambiente tumoral sólido,^[51], se examinaron los efectos sinérgicos de las diferentes dosis de mBH3@NPs a relaciones E:O bajas (1:4 y 1:2). Sorprendentemente, dosis extremadamente bajas de mBH3@NPs fueron suficientes para aumentar la citotoxicidad mediada por las células T al llevar a las células cancerosas más allá de su umbral de apoptosis, y dosis más altas no produjeron beneficios adicionales. Esta respuesta dosis no lineal sugirió que la terapia combinada podría reducir los requisitos de ARNm y los costos asociados (Figura 4E). Además, nuestro índice de combinación (IC) calculado se mantuvo constantemente por debajo de 1 (Figuras S5A y S5B).

Dentro del microambiente tumoral con deficiencia de nutrientes y supresión metabólica, las células T a menudo sufren una reprogramación metabólica disfuncional, lo que finalmente conduce al agotamiento.^[52],^[53] Para dilucidar aún más el mecanismo molecular subyacente a la sinergia entre los mBH3@NPs y las células T, se investigaron las alteraciones en el estado metabólico de las células T y la función mitocondrial. Se descubrió que las células T cocultivadas con células tumorales pretratadas con mBH3@NPs exhibieron una reducción significativa de la captación de glucosa, como lo evidenció la regulación a la baja de la expresión de Glut-1 y la disminución de la incorporación de 2-NBDG (Figuras 4F y 4G). Al mismo tiempo, estas células T mostraron un alivio marcado del estrés oxidativo, caracterizado por una relación GSH/GSSG elevada, niveles reducidos de ROS y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial (Figuras 4H–4J). Estas alteraciones metabólicas están estrechamente acopladas con un cambio funcional: la expresión de los marcadores de agotamiento PD-1 y LAG-3 se redujo significativamente (Figura 4K), mientras que la proporción de células T CD62L+ con potencial de memoria aumentó (Figura 4L). Los mBH3@NPs también mejoraron la secreción de factores citotóxicos, incluido GrB e IFN-γ (Figuras S5C y S5D), lo que confirmó la mejora de la función de las células T (Figura S5E). En conjunto, nuestros datos demuestran que los mBH3@NPs no solo sensibilizan a las células tumorales a la apoptosis, sino que también remodelan el ambiente metabólico hostil de las células T, mejorando así su estado metabólico, retrasando el agotamiento y promoviendo la diferenciación de la memoria.

Los mBH3@NPs promovieron el reclutamiento de las células T transferidas adoptivamente

La infiltración inadecuada de células T es una barrera importante que limita la eficacia terapéutica de la terapia celular adoptiva (ACT) en tumores sólidos.^[54] Dado que la monoterapia con mBH3@NPs indujo una potente respuesta de muerte celular programada (ICD) e inició un ciclo inmunitario antitumoral in vivo, este estudio investigó si podrían mejorar el reclutamiento de células T transferidas de forma adoptiva. En un ensayo de Transwell, los fluidos recogidos de tumores tratados con mBH3@NPs aumentaron significativamente la migración de células OT-1 marcadas con CFSE hacia las células B16-OVA, con un aumento de 2 y 1,5 veces observado en los grupos mPuma@NPs y mBim@NPs, respectivamente (Figuras 5A y 5B). Basándose en estas observaciones in vitro, evaluamos además la infiltración de células T in vivo inyectando por vía intravenosa células OT-1 preactivadas marcadas con Cy5 un día después de la administración de mBH3@NPs (Figura 5C). La imagen in vivo mostró un aumento de la acumulación tumoral de células T marcadas con Cy5 en los grupos tratados con mBH3@NPs, aunque no fue estadísticamente significativo (Figura 5D). El análisis citométrico de flujo de los tumores extirpados confirmó además un aumento significativo del recuento de células T OT-1 en los grupos mPuma@NPs y mBim@NPs (Figura 5E).

Para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes, se realizaron análisis transcriptómicos. El mapa de calor reveló una regulación al alza de interleucinas (IL), quimiocinas y granzimas proinflamatorias (mediadores clave del reclutamiento y la activación de las células T) en los grupos tratados con mBH3@NPs (Figura 5F). El análisis de enriquecimiento de vías respaldó aún más estos hallazgos, destacando la mejora de las vías de señalización relacionadas con la inmunidad, en particular aquellas implicadas en la activación, la migración y la proliferación de las células T (Figura 5G). En consonancia con los datos transcriptómicos, los ensayos de citocinas multiplex confirmaron niveles elevados de proteínas de quimiocinas proinflamatorias clave (CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5) y citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-1β) en los tumores tratados con mBH3@NPs (Figura 5H). Entre estas, el eje CCL4/CCL5-CCR5 se ha identificado como un correlato sólido de la infiltración de células T CD8+.^[55],^[56],^[57] Basándose en este eje, la cocultivo de células tumorales tratadas con mBH3@NPs con BMDC condujo a una mayor secreción de CCL4 y CCL5 en los grupos mPuma@NPs y mBim@NPs (Figuras S6A y S6B). Además, los ensayos de migración de Transwell mostraron que los sobrenadantes de las células tratadas con mBim@NPs indujeron la mayor migración de células T CD8+ (Figura S6C), lo que subraya el papel fundamental de CCL4 y CCL5 en el tráfico de las células T. En conjunto, estos resultados sugieren que mBH3@NPs mejoran el reclutamiento de células T transferidas de forma adoptiva al estimular la secreción de quimiocinas y citocinas clave dentro del microambiente tumoral.

La combinación de mBH3@NPs y terapia celular adoptiva mejoró los efectos terapéuticos

A continuación, evaluamos los efectos terapéuticos in vivo de la combinación de mBH3@NPs con ACT. Se empleó el modelo de melanoma B16-F10 que expresa el antígeno gp100. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 100 mm3, se administraron mBH3@NPs (mPuma@NPs y mBim@NPs) de forma intratumoral, seguido de una infusión intravenosa de células PMEL gp100-específicas preactivadas al día siguiente (Figura 6A). Esta separación temporal se diseñó para minimizar cualquier posible efecto adverso sobre la viabilidad de las células T infundidas. Si bien la monoterapia con mBH3@NPs o células T inhibió moderadamente el crecimiento tumoral, las terapias combinadas mostraron una supresión tumoral marcadamente mejorada (Figuras 6B, S7A y S7B). En particular, la combinación de mBim@NPs y células T exhibió el efecto antitumoral más fuerte (Figura 6B). El análisis de supervivencia confirmó además el beneficio terapéutico, con una supervivencia significativamente prolongada en los grupos combinados (Figura 6C) y sin cambios notables en el peso corporal (Figura S7C). Estos efectos sinérgicos también fueron evidentes en el modelo de melanoma B16-OVA que utiliza células T OT-1 (Figura 6D), donde la terapia combinada suprimió significativamente la progresión tumoral y mejoró la supervivencia en comparación con la monoterapia con células T (Figuras 6E, 6F y S8A–S8C).

Para dilucidar los mecanismos que sustentan la respuesta antitumoral mejorada, analizamos la proporción, la cantidad absoluta, el fenotipo y la función de las células CD8+ infiltrantes tumorales. En comparación con la ACT sola, el cotratamiento con mBH3@NPs aumentó marcadamente el número absoluto de células T efectoras infiltrantes tumorales, incluidas tanto las poblaciones endógenas como las transferidas de PMEL, junto con un aumento de los recuentos de los subconjuntos Teff y Tcm, lo que es consistente con una expansión genuina en lugar de un cambio proporcional (Figuras S7D y S7E). Se observó un aumento predominante en la proporción de células T PMEL transferidas (CD90.1) (Figura 6G). Si bien la terapia combinada promovió un cambio general de las células CD8+ infiltrantes tumorales desde un fenotipo de memoria central (CD44highCD62Lhigh) a un fenotipo de memoria efectora (CD44highCD62Llow) (Figura 6G), parecía fomentar una división funcional del trabajo, mejorando la citotoxicidad inmediata de las células endógenas al tiempo que se preservaba la persistencia a largo plazo al mantener un fenotipo de memoria central en las células T PMEL transferidas, particularmente cuando se combinaba con mBim@NPs (Figura S7F). La terapia combinada mejoró la polifuncionalidad de las células CD8+ infiltrantes tumorales. En particular, este efecto fue más pronunciado dentro del compartimento de células T endógenas, donde observamos un aumento marcado en la expresión de moléculas citotóxicas clave, incluidas GrB y la perforina (Figuras 6H y S7G). Además, la combinación de células T con mBim@NPs aumentó aún más la secreción de GrB por las células T esplénicas tras la restimulación ex vivo (Figura 6H), lo que indica una mayor citotoxicidad sistémica. Además de promover la función citotóxica, la combinación de células T con mBim@NPs también se asoció con una expresión modulada de moléculas clave de los puntos de control inmunitario. Se observaron niveles reducidos de proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y LAG-3 en las células CD8+ endógenas y transferidas (Figuras 6I y S7H). Teniendo en cuenta los puntos de tiempo del análisis y la mejora concomitante en la función efectora de las células T, esta reducción puede reflejar un cambio general hacia un estado más funcional. En contraste, la ausencia de un perfil de punto de control modulado observado en la combinación de células T con mPuma@NPs (Figuras 6I y S7H) puede correlacionarse con el resultado terapéutico superior de la combinación de mBim@NPs, lo que sugiere el establecimiento de un paisaje inmunomodulador más favorable. Para validar aún más la solidez de esta estrategia combinatoria, se llevaron a cabo experimentos similares en el modelo de melanoma B16-OVA. De manera similar a los hallazgos anteriores, la terapia combinada de células T con mBH3@NPs mejoró la infiltración de células CD8+ y la polifuncionalidad, incluida una mayor citotoxicidad y una menor disfunción (Figuras S8D–S8G). La imagen de inmunofluorescencia confirmó además una mayor acumulación de células CD8+ en tumores y ganglios linfáticos en los grupos combinados, acompañada de un estado efector mejorado, que se manifiesta por una mayor expresión de IFN-γ y una reducción del punto de control inhibitorio PD-1 (Figuras 6J y S9A–S9C). Para visualizar y resolver espacialmente las células T con potencial de memoria y adaptación tisular, se realizó una tinción multiplex para CD8, CD44, CCR7 y CD69. Este análisis espacial reveló que la terapia combinada enriqueció las células CD8+ infiltrantes tumorales que coexpresan CD44, CCR7 y CD69 (Figuras 6J y S9A). El fenotipo observado sugiere que la terapia combinada indujo un estado de diferenciación que combina el potencial de tráfico asociado a la memoria con características de adaptación tisular, lo que podría contribuir a una respuesta inmunitaria más sostenida. No se observó ningún cambio significativo en los marcadores de la función hepática y renal (ALT, AST, TBIL y CR), y solo se notó una ligera reducción en los niveles de urea en el grupo de combinación de células T y mBim@NPs (Figura S8H). Además, el monitoreo sistemático de las citocinas séricas relacionadas con el síndrome de liberación de citocinas (IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ) no reveló aumentos significativos, lo que indica un bajo riesgo de eventos adversos relacionados con la inmunidad (Figura S8I). En general, estos hallazgos subrayan la mejora de la potenciación de la polifuncionalidad de las células T mediante la combinación de ACT con mBH3@NPs, especialmente con mBim@NPs.

Para evaluar aún más el rendimiento de nuestra plataforma, se realizó una comparación directa con el mimético de BH3 ABT-199 (Venetoclax) utilizado clínicamente en combinación con la terapia celular adoptiva. Los resultados mostraron que tanto la monoterapia con ABT-199 como su combinación con células T mostraron una eficacia moderada, mientras que mBH3@NPs (mPuma@NPs o mBim@NPs) combinados con células T inhibieron significativamente el crecimiento tumoral, prolongaron la supervivencia y mejoraron la infiltración de células T (Figuras S10A–S10E). Esta comparación directa destaca el potencial superior de la plataforma mRNA-LNP para permitir una inmunoterapia eficaz en neoplasias sólidas.

Para evaluar aún más el potencial traslacional, se estableció un modelo de xenoinjerto humanizado utilizando células HeLa-NY-ESO-1 (Figuras S11A y S11B). En un ensayo de cocultivo ex vivo, el pretratamiento de las células tumorales con mPuma@NPs y mBim@NPs mejoró su susceptibilidad a la muerte mediada por células T-R. Este efecto sinérgico se evidenció por un aumento de la apoptosis observado en ambas proporciones E:T bajas y altas (Figura S11C). En consonancia con esto, en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de HeLa-NY-ESO-1 en ratones NSG, la combinación de mBH3@NPs con células T-R mejoró significativamente la eficacia antitumoral en comparación con las células T solas (Figuras S11D–S11G). En conjunto, estos resultados demostraron que mBH3@NPs sinergizan con las células T específicas del antígeno para mejorar la eliminación de las células tumorales tanto en ensayos basados en células humanas como en modelos in vivo.

La terapia combinada dirigió a las células CD8+ hacia estados similares a la memoria con una diversidad expandida del TCR

Los resultados anteriores demostraron distintos estados polifuncionales de las células CD8+ infiltrantes tumorales entre la monoterapia ACT y la terapia combinada con mBH3@NPs. Para dilucidar las disparidades del paisaje transcripcional, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en estas células T (Figura 7A). La integración y la agrupación no supervisada de 68.176 células CD8+ de tres condiciones resolvieron 12 grupos transcripcionalmente distintos: células T reguladoras Foxp3+ (grupo 1), células de memoria efectora o efectoras diferenciadas terminalmente (Temra, grupo 2), células T precursoras agotadas Tcf+ (Tcf+ Tpex, grupo 3), células T invariantes asociadas a la mucosa/células T invariantes NK (MAIT/iNKT, grupo 4), células T con genes estimulados por el interferón (Tisg, grupo 5), células T agotadas Xcl1+ (Xcl1+ Tex, grupo 6), células T de respuesta al estrés (Tstr, grupo 7), células T ingenuas (Tnaive, grupo 8), células T similares a la innata Fcer1g+ (ILTCK, grupo 9), células T proliferantes (grupo 10), células de memoria tisular Gzmk+ (Gzmk+ Trm, grupo 11) y células T agotadas terminales (Tex, grupo 12) (Figuras 7B–7D).^[58],^[59],^[60]

Análisis de los fenotipos de los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) reveló que la combinación basada en mBim@NPs indujo una reorganización más pronunciada del paisaje de los TIL CD8+ en comparación con el grupo mPuma@NPs (Figura 7B). Se observaron distintas distribuciones de subconjuntos de células T CD8+ entre los grupos de tratamiento. Los respondedores a la monoterapia con ACT estaban dominados por Tex y células T proliferativas, siendo este último grupo el que coexpresaba altos niveles de marcadores mitóticos (Mki67 y Stmn1) y marcadores de agotamiento (Pdcd1, Tigit y Havcr2), lo que indica una hiperproliferación crónica impulsada por antígenos y disfunción. Por el contrario, los respondedores a la terapia combinada mostraron frecuencias aumentadas de Tnaive, células Trm Gzmk+ y células Temra, siendo los dos últimos subconjuntos los que presentaban una mayor proporción de genes asociados con una robusta función citotóxica y migratoria (Cx3cr1, Itgb1 y Ccl5) (Figuras 7B y 7C). Estos cambios pueden deberse a la activación de las vías de apoptosis intrínseca mediada por mBH3@NPs, lo que impulsa tanto las transiciones composicionales como fenotípicas dentro del compartimento de células T CD8+ hacia subconjuntos menos diferenciados y más funcionales. Sorprendentemente, mBim@NPs indujo además una expansión significativa de células T de tipo innato con potencial citotóxico (ILTCK) cuando se combinó con células T (Figuras 7B y 7C), que es un subtipo CD8+ de tipo innato residente en el tumor que exhibe una amplia reactividad a autoantígenos no mutados^[58],^[61] (Figuras 7B y 7C). Esta expansión puede estar impulsada por una mejora de las cascadas de presentación de antígenos mediadas por células dendríticas convencionales (cDC), desencadenadas por la robusta ICD inducida por mBim@NPs.^[62] Además, la combinación de mBH3@NPs y ACT reprogramó las células T CD8+ agotadas e hiperproliferativas hacia un fenotipo similar a un progenitor con una menor citotoxicidad (Figuras 7E y 7F). El análisis de la expresión diferencial reveló una regulación al alza de los genes relacionados con la citotoxicidad (Gzmm y Gzma), los marcadores de memoria (Sell, Tcf7) y los factores de transcripción que responden a una señalización eficaz del TCR (Klf2, Fos y Jun), junto con una regulación a la baja de los genes inmunosupresores (Pdcd1 y Tigit) dentro del microambiente tumoral (TME) en comparación con ACT solo (Figura 7G). Estos cambios transcripcionales fueron impulsados principalmente por la exposición al antígeno tumoral facilitada por las APC, en particular las cDC de tipo I.^[63] En conjunto, estos resultados demostraron que la terapia combinada reprogramó el paisaje transcripcional de las células T CD8+, impulsando su reconfiguración funcional y fenotípica. Además, la terapia combinada remodeló indirectamente el paisaje de las células T CD4+ a través de efectos secundarios (Figuras S12A y S12B). En particular, el tratamiento redujo la desregulación de las Treg al tiempo que aumentaba tanto la proporción como la diversidad clonal de las células Trm CD4+ funcionales (Figuras S12B y S12C), lo que sugiere una población de células T CD4+ más diversa, duradera y funcionalmente competente dentro del TME.

La integración de datos de TCR emparejados reveló distintos patrones de diversidad del repertorio entre los tratamientos. La terapia combinada con mPuma@NPs (TP) y mBim@NPs (TB) mejoró la diversidad del TCR dentro de los principales subconjuntos de CD8+, en particular los subconjuntos Gzmk+ Trm y Tnaive, lo que indica un reclutamiento más amplio del repertorio de células T endógenas^[64] (Figura 7H). En general, las combinaciones de mBH3@NPs (especialmente mBim@NPs) ampliaron notablemente la diversidad del repertorio de TCR de las células T CD8+ en lugar de las células T CD4+, como se refleja en una mayor entropía de Shannon (Figura 7I). El análisis normalizado de la entropía de Shannon en los subconjuntos confirmó una distribución más equilibrada de la diversidad del TCR en los grupos combinados, con aumentos significativos en los subconjuntos Tex y CD8+ proliferativos (Figura 7J), que exhibieron una menor diversidad y oligoclonalidad, lo que refleja la especificidad del antígeno tumoral en la monoterapia con ACT (Figura 7J). Estas observaciones sugieren que la combinación mitiga el dominio clonal de los subconjuntos reactivos a los antígenos, ampliando tanto la amplitud clonal como la heterogeneidad funcional del repertorio de células T antitumorales. En conjunto, todos estos análisis revelaron que la terapia combinada impulsó las células T CD8+ hacia estados similares a la memoria con una mayor diversidad del TCR.

Discusión

En este estudio, demostramos que la mtApoptosis mediada por LNP de ARNm induce una inmunidad antitumoral eficaz y mejora sinérgicamente la eficacia terapéutica de ACT. Evaluamos principalmente dos formulaciones derivadas de proteínas BH3 solo de tipo activador (mPuma@NPs y mBim@NPs), que indujeron preferentemente ICD en las células cancerosas, aliviando así el TME inmunosupresor. El tratamiento combinado con mBH3@NPs y ACT produjo efectos antitumorales sinérgicos en varios modelos de tumores sólidos. Los análisis de scRNA-seq revelaron además que esta estrategia combinatoria facilitó el tráfico de células T, alivió la disfunción de las células T y aumentó la citotoxicidad. En conjunto, este estudio no solo implementa una estrategia combinatoria basada en ARNm, sino que también proporciona información mecanicista para aumentar la capacidad de las células T para matar a través de la activación de la mtApoptosis.

Para la traslación clínica, la terapia con ARNm mediada por el dominio BH3 representa una estrategia eficaz, ya sea como monoterapia o en combinación con otras inmunoterapias, para superar los desafíos que actualmente enfrentan las terapias basadas en mtApoptosis en tumores sólidos, incluidos los miméticos de BH3 y los péptidos derivados de BH3.^[17],^[19] Estos ARNm terapéuticos ofrecen varias ventajas clave. En particular, exhiben capacidades de unión de amplio espectro para neutralizar múltiples proteínas BCL-2 pro-supervivencia,^[32],^[33], lo que intrínsecamente evita la resistencia impulsada por la regulación al alza de proteínas pro-supervivencia no objetivo.^[65] Además, funcionan como activadores directos para iniciar cascadas de mtApoptosis robustas. Además, la modalidad de ARNm en sí posee propiedades inmunostimulantes inherentes, funcionando como un adyuvante para remodelar el TME.^[29],^[30] En particular, la combinación de mBH3@NPs con CTL a proporciones E:T más bajas logró una citotoxicidad en comparación con el uso de CTL solo con proporciones E:T más altas, lo que indica un cambio en el equilibrio E:T a favor de las células T efectoras. Esto puede reducir la dosis de células T requerida, lo que reduciría el costo y la complejidad de ACT en aplicaciones clínicas. Es importante destacar que la sincronización de esta administración combinada es crucial, ya que ayuda no solo a definir una ventana terapéutica óptima, sino también a proteger las células T transferidas de la posible toxicidad inducida por mBH3@NPs.^[11],^[66]

Estudios previos han demostrado que la activación de la mtApoptosis puede actuar en sinergia con ACT para provocar respuestas antitumorales más duraderas que cualquiera de los tratamientos por sí solos.^[8],^[9],^[10],^[11],^[67] Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo esquivos. Esta sinergia puede depender de la activación de la vía de apoptosis intrínseca, que amplifica la acumulación de daños subletales que surgen de las interacciones entre efectores y objetivos.^[9],^[11],^[68] En particular, este efecto es más pronunciado a proporciones E:T más bajas, donde una citotoxicidad de células T más débil o menos frecuente es suficiente para llevar a las células cancerosas al "acantilado de la apoptosis".^[11] Nuestros datos in vitro se alinean en gran medida con estos hallazgos, destacando que la activación de la mtApoptosis mediada por LNP de ARNm proporciona un enfoque fisiológicamente relevante para amplificar las señales de muerte en tumores sólidos, donde las células CTL reactivas al tumor a menudo se encuentran con una proporción E:T más baja debido a una mayor carga tumoral. Lo que es más importante, nuestro estudio reveló una capa de sinergia lograda a través de la modulación del paisaje inmunitario. En particular, la pre-administración de mBH3@NPs mejoró el TME inmunosupresor, creando así un "campo de batalla" más permisivo para el ACT posterior. Promovió el tráfico de células T efectoras endógenas y transferidas y mejoró su polifuncionalidad, incluida una mejor citotoxicidad y el alivio del agotamiento. El mayor aumento de la función efectora se observó en las células T endógenas en lugar de las células T transferidas, lo que se atribuyó a los efectos apoptóticos intrínsecos inducidos directamente por la administración in situ de mBH3@NPs. Mientras tanto, las células T metastásicas altamente proliferativas sufren un cambio hacia un fenotipo similar a un progenitor/memoria, posiblemente impulsado por un nicho inmunológicamente más permisivo. A pesar de una proporción reducida de células T altamente proliferativas y expandidas clonalmente, este subtipo exhibió una restauración de un estado altamente agotado a un estado más sostenido y capaz de vigilancia. Este cambio fenotípico puede iniciar un ciclo de retroalimentación positiva que respalde la persistencia a largo plazo de las células T y la inmunidad antitumoral duradera.^[69],^[70]

Además, nuestros hallazgos revelaron perfiles de eficacia diferenciales de mBH3@NPs derivados de distintas proteínas de la familia BH3 solo (PUMA, BIM, NOXA y BAD). Entre estos, los dominios de las proteínas de tipo activador (PUMA y BIM) indujeron una mtApoptosis más fuerte como monoterapia, probablemente debido a su amplia afinidad de unión por múltiples proteínas BCL-2 pro-supervivencia y su capacidad para activar directamente BAX/BAK.^[33],^[39],^[71] Por el contrario, los dominios derivados de las proteínas de tipo sensibilizador (NOXA y BAD) exhibieron efectos pro-apoptóticos más débiles, posiblemente debido a una interacción limitada con el objetivo y una localización subcelular incorrecta.^[41] La optimización adicional puede centrarse en la ingeniería de orientación a la membrana para mejorar su actividad funcional. En particular, mBim@NPs indujo una ICD más robusta y una respuesta inmunostimulante más fuerte en comparación con mPuma@NPs tanto in vitro como in vivo. Esto se asoció con una mayor maduración de las células dendríticas, una mejor presentación de antígenos y un alivio más eficaz del TME inmunosupresor, lo que contribuyó a una mayor eficacia antitumoral. En particular, los análisis de scRNA-seq revelaron que mBim@NPs combinados con ACT promovieron el reclutamiento de ILTCK, posiblemente impulsado por un aumento de la secreción de IL-15 de las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, cDC),^[61], lo que facilitó la diferenciación de las células T en estados de memoria de larga duración.^[72],^[73] Estos resultados subrayan el potencial terapéutico de codificar activadores directos como BIM o tBID, que se dirigen ampliamente a las proteínas anti-apoptóticas. Sin embargo, para ciertos tumores sólidos que dependen de proteínas pro-supervivencia específicas (por ejemplo, MCL-1),^[74], los dominios de otras proteínas BH3 solo (NOXA) pueden ofrecer una mayor selectividad y eficacia. El perfilado dinámico de BH3 puede permitir un diseño terapéutico personalizado al predecir la sensibilidad tumoral específica a la apoptosis mediada por el dominio BH3.^[46],^[75],^[76] También observamos que la eficacia terapéutica varió sustancialmente entre los diferentes modelos de tumores. En comparación con el modelo MC-38, la respuesta superior observada en los modelos de melanoma puede deberse a sus distintas dependencias de proteínas específicas de la familia BCL-2 anti-apoptóticas. El melanoma exhibe una alta dependencia de BCL-2,^[77], lo que potencialmente los hace más vulnerables a la apoptosis inducida por el dominio BH3. Los cánceres de colon, incluido el modelo MC-38, exhiben una mayor dependencia de BCL-xL y MCL-1,^[78],^[79], un perfil anti-apoptótico redundante que no se aborda eficazmente con la formulación actual. Además, a pesar de clasificarse como un tumor inmunológicamente "frío", el melanoma a menudo exhibe una alta carga mutacional tumoral (TMB).^[80], lo que mejora la liberación de diversos neoantígenos tras la muerte celular inmunogénica inducida por mBH3@NPs, lo que permite una activación eficaz de las respuestas inmunitarias antitumorales.

Limitaciones del estudio

A pesar de estos resultados alentadores, se necesitan más esfuerzos para abordar las limitaciones que dificultan la traslación clínica. La combinación en una sola administración de mBH3@NPs con células T adoptivas retrasó eficazmente la progresión del tumor y remodeló el microambiente inmunitario, pero no logró la erradicación completa del tumor. Este resultado se alinea con el desafío bien reconocido de inducir respuestas sostenidas en la inmunoterapia de tumores sólidos, lo cual a menudo se ve obstaculizado por factores como la heterogeneidad tumoral y la evasión inmune. Los hallazgos actuales sugieren además que pueden ser necesarios regímenes de tratamiento repetidos o continuados para traducir la modulación inmune en una eliminación tumoral duradera. Además, este estudio empleó principalmente modelos tumorales definidos por epítopos (B16-F10 y B16-OVA) y herramientas inmunológicas clásicas (PMEL y OT-1). Se justifica una mayor validación en diversos tipos de tumores y modalidades alternativas de terapia celular adoptiva (ACT) (CAR-T y TIL). Aunque la administración intratumoral es clínicamente factible para ciertos tumores de superficie accesible (por ejemplo, melanoma) y algunos tumores internos (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal),^[81] los esfuerzos futuros deberían priorizar la mejora de la especificidad de direccionamiento de los sistemas de administración.^[82]

Limitaciones del estudio

A pesar de estos resultados alentadores, se necesitan más esfuerzos para abordar las limitaciones que dificultan la traslación clínica. La combinación en una sola administración de mBH3@NPs con células T adoptivas retrasó eficazmente la progresión del tumor y remodeló el microambiente inmunitario, pero no logró la erradicación completa del tumor. Este resultado se alinea con el desafío bien reconocido de inducir respuestas sostenidas en la inmunoterapia de tumores sólidos, lo cual a menudo se ve obstaculizado por factores como la heterogeneidad tumoral y la evasión inmune. Los hallazgos actuales sugieren además que pueden ser necesarios regímenes de tratamiento repetidos o continuados para traducir la modulación inmune en una eliminación tumoral duradera. Además, este estudio empleó principalmente modelos tumorales definidos por epítopos (B16-F10 y B16-OVA) y herramientas inmunológicas clásicas (PMEL y OT-1). Se justifica una mayor validación en diversos tipos de tumores y modalidades alternativas de terapia celular adoptiva (ACT) (CAR-T y TIL). Aunque la administración intratumoral es clínicamente factible para ciertos tumores de superficie accesible (por ejemplo, melanoma) y algunos tumores internos (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal),^[81] los esfuerzos futuros deberían priorizar la mejora de la especificidad de direccionamiento de los sistemas de administración.^[82]

Disponibilidad de recursos

Investigador principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, diríjase al investigador principal, Yongfeng Jin (jinyf@zju.edu.cn), quien se encargará de atender y satisfacer las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

Los datos de secuencia sin procesar de los datos de secuenciación de ARN masivo generados en este estudio se han depositado en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) con los números de acceso SRA: PRJNA1268331. Los datos de secuencia sin procesar de los datos de secuenciación de ARN de célula única y TCR se han depositado en la base de datos SRA con el número de acceso SRA: PRJNA1269318. Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones se presentan en el artículo y/o en la información complementaria. Este artículo no genera ni informa sobre código. Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este trabajo está disponible a través del investigador principal, previa solicitud.

Investigador principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, diríjase al investigador principal, Yongfeng Jin (jinyf@zju.edu.cn), quien se encargará de atender y satisfacer las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

Los datos de secuencia sin procesar de los datos de secuenciación de ARN masivo generados en este estudio se han depositado en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) con los números de acceso SRA: PRJNA1268331. Los datos de secuencia sin procesar de los datos de secuenciación de ARN de célula única y TCR se han depositado en la base de datos SRA con el número de acceso SRA: PRJNA1269318. Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones se presentan en el artículo y/o en la información complementaria. Este artículo no genera ni informa sobre código. Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este trabajo está disponible a través del investigador principal, previa solicitud.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de investigación del 10.13039/501100012166Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2023YFC2604300), el Plan de Investigación Principal de la 10.13039/501100001809Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (92581117), el programa de I+D "10.13039/100004502Pionero" y "Líder" de Zhejiang (n.º 2025C01138) y la 10.13039/501100004731Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LZ25C050001) y los 10.13039/501100012226Fondos de Investigación Básica para las Universidades Centrales (n.º K20220228) y el Fondo Científico Starry Night en el Instituto de Estudios Avanzados de 10.13039/501100004835la Universidad de Zhejiang (SN-ZJU-SIAS-009). Agradecemos a los miembros del laboratorio de Jin por sus sugerencias y comentarios durante el desarrollo de este trabajo.

Contribuciones de los autores

Y.J. contribuyó a la concepción de este proyecto. J.F., Y.L., Z.Z., B.C., L.R., Z.G., Y.M. y Y.J. contribuyeron al diseño y a los experimentos. J.F., Y.L., Z.Z. y N.B. contribuyeron a los análisis de datos. Y.J., J.F., H.D., R.P., J.W. y Y.M. contribuyeron a la redacción del manuscrito. Todos los autores contribuyeron con los resultados y ofrecieron comentarios y aportaron a la discusión del manuscrito.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Declaración sobre el uso de IA generativa y tecnologías de IA asistida en el proceso de redacción

Durante la preparación de este trabajo, los autores no utilizaron IA generativa ni tecnologías de IA asistida.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Materiales y reactivos

RPMI 1640 básico, medio de cultivo Dulbecco modificado (DMEM), suero fetal bovino (SFB) y penicilina estreptomicina se compraron a Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). SM-102, colesterol CHO-HP, DSPC y DMG-PEG2000 se compraron a AVT Co. Ltd., Shanghái, China. NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen y los plásmidos NY-ESO-1 TCR fueron un regalo de R. Pan (Universidad de Zhejiang). Los plásmidos psPAX2 y pMD2.G fueron un regalo de X. Zhang (Universidad de Zhejiang).

Líneas celulares y animales

B16-F10, CT-26, bEnd3, HEK 293T y HeLa se compraron a Hai Xing Biosciences (Suzhou, China). B16-OVA fue un regalo de Y. Ping (Universidad de Zhejiang). MC-38 fue un regalo de H. Zhu (Universidad de Zhejiang). B16-F10, B16-OVA, MC-38, bEnd3, HEK 293T y HeLa se cultivaron en medio DMEM que contiene un 10 % de suero fetal bovino (SFB) y un 1 % de penicilina/estreptomicina. CT-26 se cultivó en medio RPMI 1640 que contiene un 10 % de suero fetal bovino y un 1 % de penicilina/estreptomicina. Se analizaron las células para garantizar la ausencia de contaminación por micoplasma.

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (de 4 a 6 semanas de edad) de Qi Zhen laboratory animal Tech Co. Ltd., China, y se utilizaron para la evaluación del efecto antitumoral. Se obtuvieron ratones NSG hembra de 6 semanas de edad del Shanghai Model Organism Center, Inc. y se utilizaron para modelos de xenoinjerto murino de tumores humanos.

Los ratones Thy1.1+ pmel-1 (PMEL) con un TCR transgénico que reconoce gp100(25-33) y los ratones OT-1 con un TCR transgénico que reconoce el péptido ovalbúmina (OVA257-264) se compraron originalmente a Qi Zhen laboratory animal Tech Co. Ltd., China, y se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos de la EPFL para su uso en terapia celular adoptiva. Los animales se asignaron aleatoriamente a jaulas en una habitación mantenida a 22 ± 2,0 °C y 50 ± 10 % de humedad y se sometieron a un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad antes del estudio. Todos los ratones tuvieron acceso a una dieta estándar y agua del grifo. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Servicio de Salud Pública de China para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se confirmó el sexo de todos los ratones mediante la inspección visual de los genitales externos. Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de la Universidad de Zhejiang y el comité de uso de la Universidad de Zhejiang (ZJU20240885).

Detalles del método

Síntesis de ARNm

Para el ARNm de BH3, codifica para dominios de proteínas proapoptóticas BH3, que incluyen Bim, Puma, Bad y Noxa (Tabla S1). Los dominios BH3 se fusionaron con el andamio cuádruple de aptámeros de Stefin A para anclar y presentar la estructura del dominio BH3 y permitir o no la función fisiológica.^[40] Luego, los fragmentos objetivo completos se conectaron a vectores plantilla linealizados (Takara Biotech Co. Ltd., China) mediante un clonaje perfecto para construir plásmidos para reacciones de transcripción in vitro posteriores. El ARNm se sintetizó utilizando métodos estándar de transcripción in vitro. Los plásmidos que codificaban antígenos específicos se digirieron durante la noche con HindIII para obtener una plantilla linealizada, seguida de la producción de ARNm utilizando el kit de cotranscripción EasyCap T7 con el trímero CAG (Vazyme Biotech Co. Ltd., China), según las instrucciones del fabricante. Y luego el ARNm se purificó con el kit de purificación de ARN EasyPure (Transgen Biotech Co. Ltd., China). Todos los ARNm se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se almacenaron congelados a −80 °C.

Preparación y caracterización de mBH3@NPs

La formulación de mBH3@NPs se basó en la receta divulgada por Moderna.^[83] Específicamente, el lípido ionizable SM-102, el colesterol CHO-HP, el DSPC y el DMG-PEG2000 (AVT Co. Ltd., Shanghái, China) se mezclaron en una relación de masa de 50:10:38,5:1,5 con etanol absoluto. Se suspendieron tres volúmenes de ARNm que codifican antígenos [1:25 (p/p) ARNm a lípidos, relación nitrógeno/fosfato (N/P) = 6] en tampón de citrato de sodio (pH 4,5). Luego, las dos soluciones se mezclaron mediante una rápida pipeteo y se transfirieron a un diálisis durante la noche a 4 °C en PBS. Las partículas en PBS se utilizaron para una mayor caracterización. El tamaño de distribución y el potencial zeta de mBH3@NPs se determinaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). La morfología se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Para verificar la estabilidad de la formulación de nanopartículas de ARNm, se evaluaron los diámetros después de la incubación tanto a temperatura ambiente como a 4 °C durante varias horas.

Evaluación de la citotoxicidad in vitro

Las células B16-F10, CT-26, HEK 293T y bEnd3 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1×104, respectivamente, y se cultivaron con un medio que contiene un 10 % de suero fetal bovino durante 24 horas. Luego, se incubaron durante 24 horas con mBH3@NPs a concentraciones de 0, 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ng/mL, respectivamente. Finalmente, se añadió 10 μL de solución del kit Cell-Counting-Kit-8 (APExBIO Tech, China) a cada pocillo y se detectó la viabilidad celular a 450 nm después de una incubación de 1 hora.

Ensayo de apoptosis

Las células cancerosas se trataron con diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron, se tiñeron con anexina V conjugada con FITC y PI a 4 °C durante 10 minutos y se analizaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.). Los datos se analizaron con el software Flowjo v10.8.1.

Análisis de Western blot

Las células B16-F10 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo. Después de que las células alcanzaron una confluencia del 70-80 %, se trataron con nanopartículas, ARNm desnudo, mPuma@NPs y mBH3@NPs. Las muestras de proteínas se extrajeron de las células lisadas con tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasas. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con un 5 % de BSA. El anticuerpo primario diluido de la vía de la apoptosis, que incluye Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Caspase-3, Caspase-3 clivada, Caspase-9, Caspase-9 clivada, se incubó con las membranas durante la noche, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario durante 2 horas a 37 °C. Después de lavar tres veces con TBST (20 mM Tris, 160 mM NaCl, 0,1 % de Tween 20), se utilizó el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad) para detectar las señales de quimioluminiscencia. La beta-actina se utilizó como control de carga.

Ensayo de captación de glucosa

La captación de glucosa se evaluó mediante citometría de flujo utilizando el análogo de glucosa fluorescente 2-NBDG (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y el anticuerpo monoclonal anti-Glut-1 (CST, 73015). Brevemente, las células T CD8+ OT-1 preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Después del cocultivo, las células T se recolectaron e incubaron para un análisis dual: las células se incubaron con 2-NBDG durante 1 h a 37 °C; las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-Glut-1 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Dylight488. El porcentaje de poblaciones de células T 2-NBDG-positivas y Glut-1-positivas se determinó mediante citometría de flujo para cada grupo.

Medición del glutatión

Los niveles de glutatión y glutatión oxidado (GSSG) se determinaron utilizando el kit de ensayo GSH/GSSG de Solarbio. Brevemente, las células T CD8+ OT-1 preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Para cada grupo, se lisaron 2 × 106 células T en 200 μL del tampón de lisis proporcionado. Después de la centrifugación a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C, se recolectó el sobrenadante para su análisis. Se preparó una curva estándar utilizando estándares. Se midió la absorbancia a 412 nm y se determinaron las concentraciones de glutatión total y GSSG, y posteriormente se derivó la relación GSH/GSSG.

Detección de ROS, JC-1, ATP y HMGB1

Las células CT-26 y B16-F10 (2 × 105 por pocillo) se sembraron en una placa de 12 pocillos, se trataron con PBS, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg mL−1) durante 12 h. El nivel de ROS y el potencial de membrana mitocondrial en las células se detectaron utilizando el kit de ensayo de ROS y el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Solarbio Science Technology Co., Ltd.), respectivamente. Se recolectó el medio de cultivo celular para el ensayo de ATP extracelular (Beyotime Biotechnology) y el análisis de HMGB1 (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). Se recolectó el lisado celular para el ensayo de ATP intracelular y el análisis de HMGB1.

Tinción inmunofluorescente de células

Las células B16-F10 y CT-26 se sembraron en portaobjetos en placas de 6 pocillos y se trataron con PBS, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg mL−1) durante 12 h. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente. Luego, las células se permeabilizaron con PBS al 0,1 % de Triton X-100 (PBST) y se bloquearon con una solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron en el anticuerpo diluido contra CRT (1:200) durante la noche a 4 °C. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces e incubaron en anticuerpo secundario con dylight488 durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces y se tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min y se obtuvieron imágenes utilizando CLSM (Leica FLUOVIEW FV3000 CLSM, Olympus, Japón).

Estimulación in vitro de células dendríticas

Las BMDC se aislaron de la médula ósea de ratones C57BL/6 hembra según lo descrito previamente.^[84] Brevemente, se prepararon suspensiones celulares simples, se pasaron a través de tamices celulares de 45 μm y se cultivaron en medio completo RPMI 1640 suplementado con 20 ng mL−1 de GM-CSF y 10 ng mL−1 de IL-4 (Peprotech) durante una semana. Las células B16-F10 se pretrataron con PBS (control), NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs durante 12 h. Posteriormente, se cocultivaron con BMDC durante 48 h. Los biomarcadores de maduración de las DC (CD80 y CD86) se evaluaron mediante citometría de flujo, con selección en células CD11c+.

Preparación y activación de células CD8+ PMEL y OT-1

El bazo de los ratones PMEL y OT-1 se esterilizó en la campana de bioseguridad y luego se trituró mecánicamente a través de un tamiz de 45 μm para obtener una suspensión celular simple. Después de la lisis con tampón de lisis de glóbulos rojos durante 3 min, las células se resuspendieron en DPBS. Se utilizó el kit de aislamiento de células T CD8a+ (Selleck) para obtener una suspensión de células T CD8+ purificadas. Después de eso, se resuspendieron 1 × 106 células T nativas purificadas en una placa de 24 pocillos con medio RPMI suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, 10 % de FBS certificado inactivado por calor y 50 μM de β-mercaptoetanol, así como 30 UI mL−1 de IL-2 murino (Peprotech), hpg10025-33 (Genscript) o OVA257-264 (Solarbio) para la activación. Se añadieron 25 μL de cuentas magnéticas activadoras de células T murinas CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific Inc.) y se incubaron las células T a 37 °C durante 72 h. Después de la estimulación, las células se juntaron en matraces para su expansión. La mitad del medio se reemplazó con medio fresco para mantener la densidad celular en aproximadamente 2 × 106 células mL−1 durante otros 72 h de incubación.

Aislamiento de células CD8+ humanas

Las células CD8+ humanas se aislaron de las PBMCs utilizando el kit de selección negativa de células T CD8+ humanas (MedChemExpress, #HY-KO351). Las células enriquecidas se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, 10 % de FBS certificado inactivado por calor y 50 μM de β-mercaptoetanol, así como 30 UI/mL de IL-2 humano (Proteintech). Las células se activaron en una placa de 48 pocillos a 2 × 106/mL con cuentas Dynabeads CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific, #11161D) (cuentas:células = 1:1), y luego se transfirieron a matraces y se mantuvieron a 1 × 106 células/mL con cambios de medio semiregulares cada 2 a 3 días.

Transducción lentiviral

El lentivirus específico de NY-ESO-1 se empaquetó en células HEK-293T utilizando los plásmidos de empaquetamiento de tercera generación psPAX2 y pMD2.G. El sobrenadante viral se recolectó 48 y 72 h después de la transfección, se concentró y se tituló. Las placas de 24 pocillos no tratadas con tejido se recubrieron durante la noche a 4 °C con RetroNectin (25 μg/mL; Takara), se bloquearon con 2 % de BSA y se lavaron. Se añadieron partículas lentivirales y se centrifugaron en la placa (2.000 g, 2 h, 32 °C). Después de retirar el sobrenadante y lavarlo, se añadieron 0,5 × 106 células CD8+ activadas por pocillo en medio que contenía 10 μg/mL de sulfato de protamina. Las placas se centrifugaron (500 g, 20 min) y se incubaron durante 72 h. Las células se recolectaron, se tiñeron con el anticuerpo anti-HA (#901509, BioLegend) y se clasificaron por FACS para purificar las poblaciones TCR-positivas. Las células T clasificadas se mantuvieron en medio completo con 30 UI/mL de IL-2, y se dividieron según fuera necesario para mantener la densidad entre 1 × 106 células/mL.

Generación de células HeLa que expresan NY-ESO-1

Las células HeLa que expresan el antígeno NY-ESO-1 se generaron mediante transducción lentiviral. El lentivirus se produjo mediante la cotransfección de células HEK-293T con el plásmido de transferencia (NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen), los plásmidos de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando el reactivo de transfección NB (#NB02). El sobrenadante viral se recolectó 48 y 72 h después de la transfección. Para la infección, las células HeLa se resuspendieron en el caldo viral (5 × 105 células/mL) y se centrifugaron (1.000 g, 45 min, 30 °C). Después de una segunda ronda de adición de virus y centrifugación, las células se incubaron durante 1 h a 37 °C, se lavaron dos veces para eliminar el polibreno y se devolvieron al cultivo. Después de aproximadamente dos períodos de duplicación, las células positivas para ZsGreen se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Eliminación de células CD8+ in vitro

Las células B16-OVA se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 7 × 104 células por pocillo durante la noche. Luego, las células se trataron con 500 μL de medio que contenía diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 h de incubación y diferentes proporciones E:T de células T CD8+ OT-1 activadas durante otras 24 h de incubación. Después de la incubación, las células tumorales se recolectaron y se analizaron utilizando el kit ANNEXIN V-FITC/PI (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). El software CompuSyn se utilizó para calcular el índice de combinación (CI en ED50) si existe una sinergia de mBH3@NPs y las células T. El porcentaje de eficiencia de eliminación se calculó como 100 % - células normalizadas (Annexin V− PI− %). Se recolectaron los sobrenadantes de las células para evaluar el IFN-γ y la granzima B utilizando el kit de ELISA (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). Las células T CD8+ se recolectaron para la citometría de flujo para evaluar el IFN-γ, GrB, PD-1 y LAG-3.

Modelos tumorales

Para la administración de mBH3@NPs, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8 semanas de edad con la línea celular B16-F10 o MC-38, 1 × 106 en 200 μL de PBS. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón), según se muestra en la línea de tiempo de la Figura 6A. Para los ratones tratados con ABT-199, el compuesto se preparó en un vehículo que consistía en 10 % de etanol, 30 % de polietilenglicol-400 y 60 % de phosal 50 propilenglicol. Se administraron ABT-199 a las dosis y los horarios indicados en la Figura S10. Para la terapia combinada de mBH3@NPs y terapia ACT, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8 semanas de edad con 2 × 106 células de melanoma B16-OVA o B16-F10. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, se inyectaron por vía intravenosa las células T CD8+ preactivadas (2 × 106 en 100 μL de PBS) de ratones OT-1 o PMEL en la vena caudal de los ratones portadores del tumor, respectivamente. Se determinaron las longitudes y los anchos de los tumores cada 2-3 días mediante medición con calibrador digital y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2. Para todos los estudios, se sacrificaron los ratones una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 15 mm.

Para los modelos de xenoinjerto tumoral en ratones, se inyectaron por vía subcutánea ratones NSG hembra de 6 semanas de edad (Shanghai Model Organism Center, Inc) con 4 × 106 células HeLa-NY-ESO-1 resuspendidas en una mezcla 50:50 de PBS frío y Matrix (Vazyme Biotech Co. Ltd., China). Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos y se inyectaron intratumoralmente con mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, se inyectaron por vía intravenosa las células T CD8+ transducidas con TCR NY-ESO-1 (2 × 106 en 100 μL de PBS). Se determinaron las longitudes y los anchos de los tumores cada 2-3 días mediante medición con calibrador digital y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2.

Ensayo de migración de células T

Para el ensayo de migración in vitro de células T, se trataron ratones con tumores de aproximadamente 100 mm3 de células B16-OVA con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). Al segundo día, se recolectaron los tumores y se trituraron directamente sobre un tamiz de 45 μm y se suplementaron con medio de cultivo DMEM completo (5 × 105 mL−1). Luego, las células se centrifugaron a 12.000 × g durante 30 min para obtener el fluido intersticial del tumor. Se sembraron 2 × 105 células B16-OVA con 400 μL de fluido intersticial tumoral diluido en el pocillo inferior, y 5 × 105 células T OT-1 aisladas en 200 μL se tiñeron con CFDA, SE (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) durante 30 min y luego se colocaron en el pocillo superior (5 μm, Corning) para una cocultivación de 24 h. Se recolectaron las células de los pocillos inferiores y se añadieron cuentas de recuento (BioLegend) para analizar el porcentaje de migración de las células T OT-1. Para el ensayo de migración in vivo de células T, se implantaron ratones C57BL/6 con B16-OVA, y una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, se tiñeron las células T CD8+ preactivadas (2 × 106) de ratones OT-1 con un marcador celular (Solar Fluor 647, Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones portadores del tumor. Después de 6 h, se obtuvo la imagen de la fluorescencia de los ratones utilizando el sistema de imagen In Vivo (IVIS Spectrum, Caliper, EE. UU.).

Análisis de citometría de flujo

Los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos se cortaron en trozos. Para la digestión de los tejidos tumorales, se añadieron medios RPMI 1640 que contenían un 10% de FBS, colagenasa IV (1 mg/mL), hialuronidasa (0,2 mg/mL) y DNasa (0,1 mg/mL) durante 20-30 minutos en baños de agua a 37 °C. A continuación, la suspensión de tejido se pasó a través de una membrana de filtro de 45 μm para formar suspensiones de células individuales. Después de la eritrolisis con tampón 1×RBC, las células se bloquearon con el anticuerpo TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) durante 20 minutos a 4 °C y, a continuación, se tiñeron sobre hielo con anticuerpos conjugados con fluorescencia durante 30 minutos. Después del tinte, las células se resuspendieron con 200 μL de tampón FACS y, finalmente, se evaluaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.) y se analizaron utilizando FlowJo (v10.8.1). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en los Métodos STAR. La estrategia de selección para las principales células inmunitarias en este estudio se muestra en la Figura S13.

Inmunofluorescencia y tinción con H&E

Después del tratamiento tumoral, se sacrificaron los ratones. Se recogieron los tejidos tumorales y varios órganos (pulmón, corazón, hígado, riñón y bazo) y se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante la noche. Todos los órganos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de espesor. A continuación, se tiñeron con H&E para detectar posibles cambios patológicos. Para la tinción de inmunofluorescencia, las muestras se incubaron con diferentes anticuerpos marcados fluorescentemente (TUNEL, Ki67, CD8, CRT, IFN-γ, PD-1, CD44, CCR7, CD69, DAPI) y las láminas se visualizaron mediante un escáner de corte digital (3D Histech).

Ensayo multi-citoquínico

Brevemente, el tejido tumoral se homogeneizó y se recogió el sobrenadante celular de cada grupo de tratamiento para el ensayo de citoquinas utilizando un kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China). Las citoquinas seleccionadas incluyeron Granzima B, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-12. Para el ensayo multi-citoquínico, los sobrenadantes del homogenado tumoral se analizaron utilizando el kit de ensayo ABplex Mouse Cytokine 15-Plex (ABclonal Biotechnology Co., Ltd.).

Pruebas de sangre y serológicas

Para garantizar la bioseguridad de esta terapia, se recuperó suero mediante centrifugación a 3.000 rpm durante 20 minutos. Se determinaron las concentraciones de aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, bilirrubina total, creatinina y urea en suero. Las citoquinas séricas relacionadas con el síndrome de liberación de citoquinas (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ) se determinaron mediante un kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China).

Construcción de bibliotecas y secuenciación

Se extrajo el ARN total utilizando TRIzol (Thermo Fisher, 15596018) siguiendo el procedimiento del fabricante. Después de la extracción del ARN total, el ARNm se purificó a partir del ARN total utilizando Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, EE. UU.) con dos rondas de purificación. Tras la purificación, el ARNm se fragmentó en fragmentos cortos utilizando cationes divalentes a temperaturas elevadas (NEB, cat. e6150, EE. UU.). Los fragmentos de ARN escindidos se transcribieron a la inversa para crear ADNc utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, cat. 1896649, EE. UU.), que posteriormente se utilizó para sintetizar ADNs de doble cadena marcados con U con E. coli ADN polimerasa I (NEB, cat. m0209, EE. UU.), RNasa H (NEB, cat. m0297, EE. UU.) y solución de dUTP (Thermo Fisher, cat. R0133, EE. UU.). Se añadió una base A para la ligación a los adaptadores indexados. Cada adaptador contenía una sobreextensión de base T para ligar el adaptador al ADN fragmentado con cola A. Se ligaron adaptadores de doble índice a los fragmentos y se realizó la selección del tamaño con cuentas AMPureXP. Después del tratamiento con la enzima UDG lábil al calor (NEB, cat. m0280, EE. UU.), los productos ligados se amplificaron. El tamaño medio de inserción para las bibliotecas de ADNc finales fue de 300 ± 50 pb. Finalmente, realizamos una secuenciación de apareamiento de 2 × 150 pb (PE150) en una Illumina Novaseq 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China). Las bibliotecas de ADNc construidas se secuenciaron posteriormente en la plataforma de secuenciación Illumina Novaseq 6000. Utilizando el enfoque de secuenciación de ARN de apareamiento de Illumina, se secuenció el transcriptoma, generando un total de millones de lecturas de apareamiento de 2 × 150 pb. Las lecturas se filtraron posteriormente utilizando Cutadapt (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/). La calidad de la secuencia se verificó utilizando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9), incluyendo el Q20, Q30 y el contenido de GC de los datos limpios.

Disociación de células individuales

Los ratones portadores de B16-F10 se trataron primero con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2 × 10^6 en 100 μL de PBS) de ratones PMEL se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones portadores de tumores. Los tejidos tumorales se recogieron seis días después. A continuación, se realizó una secuenciación de ARN de célula única en el laboratorio de Lc-Bio Technologies (Hangzhou) Co., Ltd. Los tejidos tumorales obtenidos se picaron en trozos de 0,5 mm² y se digirieron en un disolvente de disociación (0,35% de colagenasa IV, 2 mg/mL de papaína, 120 U/mL de DNasa I) durante 20 minutos. Tras la digestión, los especímenes se filtraron a través de tamices celulares de 70 micrómetros para obtener suspensiones de células individuales. Las suspensiones celulares se trataron a continuación con tampón de lisis de eritrocitos (MACS 130-094-183, 10×) durante 10 minutos. Después de la lisis, las células se centrifugaron y el precipitado celular se resuspendió en tampón de citometría de flujo. Se añadieron 100 μL de microesferas de eliminación de células muertas (MACS130-090-101) para una incubación de 15 minutos. Al final de la incubación, se añadió tampón de unión a las columnas MS (130-042-201) para eliminar los reactivos. Se utilizaron APC Anti-ratón CD45 (BioLegend, número de catálogo 147708) y PE Anti-ratón CD3 (BioLegend, número de catálogo 100206) para marcar la superficie celular. Las células se marcaron durante 30 minutos a 4 °C, protegidas de la luz. Posteriormente, se extrajeron y analizaron las células CD45+/CD3+ de cada espécimen. La viabilidad celular se evaluó utilizando el método de tinción con azul de tripan, con una viabilidad requerida de >85%. El número de células se contó utilizando un contador de células automatizado Countess II y se ajustó la concentración celular a 700-1200 células/μL.

Secuenciación de células individuales

La suspensión de células individuales se añadió al chip 10× Chromium según las instrucciones del kit 10× Genomics Chromium Single-Cell 3′ (V3), con el objetivo de capturar 8.000 células. Las bibliotecas se ejecutaron en el HiSeq4000 para la secuenciación de Illumina. La amplificación del ADNc y la construcción de bibliotecas se realizaron según los protocolos estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en LC-Bio Technology (Hangzhou, China) en un sistema de secuenciación Illumina NovaSeq 6000 (secuenciación de doble extremo, 150 pb) con una profundidad mínima de 20.000 lecturas por célula.

Análisis estadístico de los datos de ARN de célula única

Los resultados de la secuenciación de Illumina fuera de línea se convirtieron al formato FASTQ utilizando el software bcl2fastq (versión 5.0.1). Los datos de secuenciación de ARN de célula única se compararon con el genoma de referencia utilizando el software CellRanger, y se identificaron y contaron los transcriptos de extremo 3′ celulares e individuales en las muestras secuenciadas (Cell-ranger, versión 9.0.1). La matriz de expresión CellRanger resultante se cargó en Seurat (v3) para filtrar las células de baja calidad de los datos de secuenciación de ARN de célula única, seguida de la reducción de escala y la agrupación. Las células de baja calidad se filtraron reteniendo solo las células con al menos 500 recuentos totales y más de 200 genes detectados. Los genes anotados como ribosómicos (RPS, RPL), mitocondriales (MT-) o miembros de la familia DnaJ/Hsp40 (DNAJ) se excluyeron del análisis posterior basándose en sus símbolos génicos. Para fines de visualización, proyectamos el embedding latente obtenido en un espacio bidimensional utilizando la función UMAP. Los DEG dentro de cada grupo de células se calcularon mediante la función scanpy.tl.rankgenesgroups (método = 't test'). Para evaluar la diversidad del repertorio de TCR, utilizamos el cálculo de la entropía de Shannon utilizando la función scirpy.tl.alpha_diversity.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los datos estadísticos se representaron gráficamente y se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., EE. UU.) e ImageJ. Los resultados cuantitativos se presentan como medias ± DE. Los tamaños de muestra para cada análisis estadístico se indican en las leyendas de las figuras. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student no pareada de dos colas. Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía con una prueba de comparación múltiple de Tukey. *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001; NS, no significativo. Las barras de error en las representaciones gráficas corresponden a las medias ± DE.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Materiales y reactivos

RPMI 1640 básico, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) y penicilina estreptomicina se compraron a Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). SM-102, colesterol CHO-HP, DSPC y DMG-PEG2000 se compraron a AVT Co. Ltd., Shanghái, China. Los plásmidos NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen y NY-ESO-1 TCR fueron un regalo de R. Pan (Universidad de Zhejiang). Los plásmidos psPAX2 y pMD2.G fueron un regalo de X. Zhang (Universidad de Zhejiang).

Líneas celulares y animales

Las líneas celulares B16-F10, CT-26, bEnd3, HEK 293T y HeLa se compraron a Hai Xing Biosciences (Suzhou, China). La línea celular B16-OVA fue un regalo de Y. Ping (Universidad de Zhejiang). La línea celular MC-38 fue un regalo de H. Zhu (Universidad de Zhejiang). Las líneas celulares B16-F10, B16-OVA, MC-38, bEnd3, HEK 293T y HeLa se cultivaron en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina. La línea celular CT-26 se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina. Se comprobó que las células no estuvieran contaminadas por micoplasma.

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (de 4 a 6 semanas de edad) de Qi Zhen laboratory animal Tech Co. Ltd., China, y se utilizaron para la evaluación del efecto antitumoral. Se obtuvieron ratones NSG hembra de 6 semanas de edad de Shanghai Model Organism Center, Inc. y se utilizaron para modelos de xenoinjerto de tumores humanos en ratones.

Los ratones Thy1.1+ pmel-1 (PMEL) con un TCR transgénico que reconoce gp100(25-33) y los ratones OT-1 con un TCR transgénico que reconoce el péptido ovalbúmina (OVA257-264) se compraron originalmente a Qi Zhen laboratory animal Tech Co. Ltd., China, y se mantuvieron en la instalación libre de patógenos de EPFL para su uso en terapia adoptiva con células T. Los animales se asignaron aleatoriamente a jaulas en una habitación mantenida a 22 ± 2,0 °C y 50 ± 10% de humedad y se sometieron a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas antes del estudio. A todos los ratones se les proporcionó acceso a una dieta estándar y agua del grifo. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Servicio de Salud Pública de China para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se confirmó el sexo de todos los ratones mediante la inspección visual de los genitales externos. Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de la Universidad de Zhejiang y el comité de uso de la Universidad de Zhejiang (ZJU20240885).

Materiales y reactivos

RPMI 1640 básico, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) y penicilina estreptomicina se compraron a Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). SM-102, colesterol CHO-HP, DSPC y DMG-PEG2000 se compraron a AVT Co. Ltd., Shanghái, China. Los plásmidos NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen y NY-ESO-1 TCR fueron un regalo de R. Pan (Universidad de Zhejiang). Los plásmidos psPAX2 y pMD2.G fueron un regalo de X. Zhang (Universidad de Zhejiang).

Líneas celulares y animales

Las líneas celulares B16-F10, CT-26, bEnd3, HEK 293T y HeLa se compraron a Hai Xing Biosciences (Suzhou, China). La línea celular B16-OVA fue un regalo de Y. Ping (Universidad de Zhejiang). La línea celular MC-38 fue un regalo de H. Zhu (Universidad de Zhejiang). Las líneas celulares B16-F10, B16-OVA, MC-38, bEnd3, HEK 293T y HeLa se cultivaron en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina. La línea celular CT-26 se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina. Se comprobó que las células no estuvieran contaminadas por micoplasma.

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (de 4 a 6 semanas de edad) de Qi Zhen laboratory animal Tech Co. Ltd., China, y se utilizaron para la evaluación del efecto antitumoral. Se obtuvieron ratones NSG hembra de 6 semanas de edad de Shanghai Model Organism Center, Inc. y se utilizaron para modelos de xenoinjerto de tumores humanos en ratones.

Los ratones Thy1.1+ pmel-1 (PMEL) con un TCR transgénico que reconoce gp100(25-33) y los ratones OT-1 con un TCR transgénico que reconoce el péptido ovalbúmina (OVA257-264) se adquirieron originalmente en el laboratorio Qi Zhen de tecnología animal, China, y se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos de la EPFL para su uso en terapia adoptiva con células T. Los animales se asignaron aleatoriamente a jaulas en una sala mantenida a 22 ± 2,0 °C y 50 ± 10 % de humedad, y se sometieron a un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad antes del estudio. A todos los ratones se les proporcionó acceso a una dieta estándar y agua del grifo. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Servicio Público de Salud de China para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se confirmó el sexo de todos los ratones mediante el examen visual de los genitales externos. Todos los protocolos de experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Zhejiang y el comité de uso de la Universidad de Zhejiang (ZJU20240885).

Detalles del método

Síntesis de ARNm

Para el ARNm de BH3, codifica para dominios de proteínas proapoptóticas BH3, que incluyen Bim, Puma, Bad y Noxa (Tabla S1). Los dominios BH3 se fusionaron con el andamiaje de aptámero cuádruple de Stefin A para anclar y presentar la estructura del dominio BH3 y permitir o no su función fisiológica.^[40] Luego, se conectaron todos los fragmentos objetivo a vectores plantilla linealizados (Takara Biotech Co. Ltd., China) mediante la clonación perfecta para construir plásmidos para las reacciones de transcripción in vitro posteriores. El ARNm se sintetizó utilizando métodos estándar de transcripción in vitro. Los plásmidos que codificaban antígenos específicos se digirieron durante la noche utilizando HindIII para obtener una plantilla linealizada, seguida de la producción de ARNm utilizando el kit de cotranscripción EasyCap T7 (Vazyme Biotech Co. Ltd., China) según las instrucciones del fabricante. Y luego, el ARNm se purificó mediante el kit de purificación de ARN EasyPure (Transgen Biotech Co. Ltd., China). Todos los ARNm se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se almacenaron congelados a −80 °C.

Preparación y caracterización de mBH3@NPs

La formulación de mBH3@NPs se basó en la receta divulgada por Moderna.^[83] Específicamente, el lípido ionizable SM-102, el colesterol CHO-HP, el DSPC y el DMG-PEG2000 (AVT Co. Ltd., Shanghai, China) se mezclaron en una relación de masa de 50:10:38,5:1,5 con etanol absoluto. Tres volúmenes de ARNm que codifica antígenos [1:25 (p/p) ARNm a lípido, relación nitrógeno/fosfato (N/P) = 6] se suspendieron en un tampón de citrato de sodio (pH 4,5). Luego, las dos soluciones se mezclaron mediante una rápida pipeteo y se transfirieron a un dializador durante la noche a 4 °C en PBS. Las partículas en PBS se utilizaron para una mayor caracterización. La distribución del tamaño y el potencial zeta de mBH3@NPs se determinaron mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). La morfología se evaluó utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para verificar la estabilidad de la formulación de nanopartículas de ARNm, se evaluaron los diámetros después de la incubación tanto a temperatura ambiente como a 4 °C durante varias horas.

Evaluación de la citotoxicidad in vitro

Las células B16-F10, CT-26, HEK 293T y bEnd3 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104, respectivamente, y se cultivaron con un medio que contenía un 10 % de suero bovino fetal durante 24 horas. Luego, se incubaron durante 24 horas con mBH3@NPs a concentraciones de 0, 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ng/mL, respectivamente. Finalmente, se añadió 10 μL de solución del kit de conteo celular-8 (APExBIO Tech, China) a cada pocillo y se detectó la viabilidad celular a 450 nm después de una incubación de 1 hora.

Ensayo de apoptosis

Las células cancerosas se trataron con diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron, se tiñeron con anexina V conjugada con FITC y PI a 4 °C durante 10 minutos y se analizaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.). Los datos se analizaron con el software Flowjo v10.8.1.

Análisis de Western blot

Las células B16-F10 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo. Después de que las células alcanzaron una confluencia del 70-80 %, se trataron con nanopartículas, ARNm desnudo, mPuma@NPs y mBH3@NPs. Las muestras de proteínas se extrajeron de las células lisadas con un tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasas. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con un 5 % de BSA. El anticuerpo primario diluido de la vía de la apoptosis, que incluye Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Caspase-3, Caspase-3 clivada, Caspase-9, Caspase-9 clivada, se incubó con las membranas durante la noche, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario durante 2 horas a 37 °C. Después de lavar tres veces con TBST (20 mM Tris, 160 mM NaCl, 0,1 % de Tween 20), se utilizó el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad) para detectar las señales de quimiluminiscencia. La beta-actina se utilizó como control de carga.

Ensayo de captación de glucosa

La captación de glucosa se evaluó mediante citometría de flujo utilizando el análogo de glucosa fluorescente 2-NBDG (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y el anticuerpo monoclonal anti-Glut-1 (CST, 73015). Brevemente, las células OT-1 CD8+ T preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Después del cocultivo, las células T se recogieron y se incubaron para un análisis dual: las células se incubaron con 2-NBDG durante 1 hora a 37 °C; las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-Glut-1 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Dylight488. El porcentaje de poblaciones de células T positivas para 2-NBDG y positivas para Glut-1 se determinó mediante citometría de flujo para cada grupo.

Medición del glutatión

Los niveles de glutatión y glutatión oxidado (GSSG) se determinaron utilizando un kit de ensayo GSH/GSSG de Solarbio. Brevemente, las células OT-1 CD8+ T preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Para cada grupo, se lisaron 2 × 106 células T en 200 μL del tampón de lisis proporcionado. Después de la centrifugación a 12 000 × g durante 10 minutos a 4 °C, se recogió el sobrenadante para su análisis. Se preparó una curva estándar utilizando estándares. Se midió la absorbancia a 412 nm y se determinaron las concentraciones de glutatión total y GSSG en consecuencia, y luego se derivó la relación GSH/GSSG.

Detección de ROS, JC-1, ATP y HMGB1

Las células CT-26 y B16-F10 (2 × 105 por pocillo) se sembraron en una placa de 12 pocillos, se trataron con PBS, nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg/mL) durante 12 horas. El nivel de ROS y el potencial de membrana mitocondrial en las células se detectaron utilizando el kit de ensayo de ROS y el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Solarbio Science Technology Co. Ltd.), respectivamente. El medio de cultivo celular se recogió para el ensayo de ATP extracelular (Beyotime Biotechnology) y el análisis de HMGB1 (Solarbio Science Technology Co. Ltd.). El lisado celular se recogió para el ensayo de ATP intracelular y el análisis de HMGB1.

Tinción inmunofluorescente de células

Las células B16-F10 y CT-26 se sembraron en portaobjetos en placas de 6 pocillos y se trataron con PBS, nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg/mL) durante 12 horas. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con 4 % de paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se permeabilizaron con PBS con 0,1 % de Triton X-100 (PBST) y se bloquearon con una solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron en el anticuerpo diluido contra CRT (1:200) durante la noche a 4 °C. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces y se incubaron en el anticuerpo secundario con dylight488 durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces y se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 minutos y se obtuvieron imágenes utilizando CLSM (Leica FLUOVIEW FV3000 CLSM, Olympus, Japón).

Estimulación in vitro de células dendríticas

Las BMDC se aislaron de la médula ósea de ratones hembra C57BL/6 como se describió anteriormente.^[84] Brevemente, se prepararon suspensiones de células individuales, se pasaron a través de tamices de células de 45 μm y se cultivaron en medio RPMI 1640 completo suplementado con 20 ng/mL de GM-CSF y 10 ng/mL de IL-4 (Peprotech) durante una semana. Las células B16-F10 se pretrataron con PBS (control), nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs durante 12 horas. Posteriormente, se cocultivaron con BMDC durante 48 horas. Los biomarcadores de maduración de las DC (CD80 y CD86) se evaluaron mediante citometría de flujo, con compuerta en células CD11c+.

Preparación y activación de células CD8+ PMEL y OT-1

El bazo de los ratones PMEL y OT-1 se esterilizó en la campana de bioseguridad y luego se molió mecánicamente a través de un tamiz de células de 45 μm para obtener una suspensión de células individuales. Después de la lisis con tampón de lisado de glóbulos rojos durante 3 minutos, las células se resuspendieron en DPBS. Utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ (Selleck) para obtener una suspensión de células T CD8+ purificadas. Después de eso, se resuspendieron 1 × 106 células T nativas purificadas en una placa de 24 pocillos con medio RPMI suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, 10 % de FBS inactivado por calor certificado, 50 μM de beta-mercaptoetanol, así como 30 UI/mL de IL-2 murino (Peprotech), hpg10025-33 (Genscript) o OVA257-264 (Solarbio) para la activación. Se añadieron 25 μL de cuentas magnéticas activadoras de células T murinas CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific Inc.) y se incubaron las células a 37 °C durante 72 horas. Después de la estimulación, las células se juntaron en matraces para la expansión. La mitad del medio se reemplazó con medio fresco para mantener la densidad celular de aproximadamente 2 × 106 células/mL durante otros 72 horas de incubación.

Aislamiento de células CD8+ humanas

Las células CD8+ humanas se aislaron de las PBMCs utilizando el kit de selección negativa de células CD8+ humanas (MedChemExpress, #HY-KO351). Las células enriquecidas se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, 10 % de FBS inactivado por calor certificado, 50 μM de beta-mercaptoetanol, así como 30 UI/mL de IL-2 humano (Proteintech). Las células se activaron en una placa de 48 pocillos a 2 × 106/mL con cuentas Dynabeads CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific, #11161D) (cuentas: células = 1:1), luego se transfirieron a matraces y se mantuvieron a 1 × 106 células/mL con cambios de medio cada 2-3 días.

Transducción lentiviral

El lentivirus específico de NY-ESO-1 se empaquetó en células HEK-293T utilizando los plásmidos de empaquetamiento de tercera generación psPAX2 y pMD2.G. El sobrenadante viral se recogió 48 y 72 horas después de la transfección, se concentró y se tituló. Las placas no tratadas con tejido se recubrieron durante la noche a 4 °C con RetroNectin (25 μg/mL; Takara), se bloquearon con una solución de bloqueo al 2 % y se lavaron. Se añadieron partículas lentivirales y se centrifugaron en la placa (2000 g, 2 h, 32 °C). Después de retirar el sobrenadante y lavar, se añadieron 0,5 × 106 células T CD8+ activadas por pocillo en medio que contenía 10 μg/mL de sulfato de protamina. Las placas se centrifugaron (500 g, 20 min) y se incubaron durante 72 horas. Las células se recogieron, se tiñeron con el anticuerpo anti-HA (#901509, BioLegend) y se clasificaron mediante FACS para purificar las poblaciones positivas para TCR. Las células T clasificadas se mantuvieron en medio completo con 30 UI/mL de IL-2, se dividieron según fuera necesario para mantener una densidad entre 1 × 106 células/mL.

Generación de células HeLa que expresan NY-ESO-1

Las células HeLa que expresan el antígeno NY-ESO-1 se generaron mediante transducción lentiviral. El lentivirus se produjo mediante la cotransfección de células HEK-293T con el plásmido de transferencia (NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen), los plásmidos de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando el reactivo de transfección NB (#NB02). El sobrenadante viral se recogió 48 y 72 horas después de la transfección. Para la infección, las células HeLa se resuspendieron en el stock de virus (5 × 105 células/mL) y se centrifugaron (1000 g, 45 min, 30 °C). Después de una segunda ronda de adición de virus y centrifugación, las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C, se lavaron dos veces para eliminar el polibreno y se devolvieron al cultivo. Después de aproximadamente dos períodos de duplicación, las células positivas para ZsGreen se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Eliminación de células CD8+ in vitro

Las células B16-OVA se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 7×104 células por pocillo durante la noche. Luego, las células se trataron con 500 μL de medio que contenía diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 horas de incubación, y con diferentes proporciones E:T de células T CD8 OT-1 activadas durante otras 24 horas de incubación. Después de la incubación, las células tumorales se recogieron y se analizaron utilizando el kit ANNEXIN V-FITC/PI (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). Se utilizó el software CompuSyn para calcular el índice de combinación (CI en ED50) en caso de que exista una sinergia entre las mBH3@NPs y las células T. El porcentaje de eficiencia de eliminación se calculó como 100 % - células normalizadas (Annexin V− PI−) %. Se recogieron los sobrenadantes celulares para evaluar el IFN-γ y la Granzima B utilizando el kit ELISA (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). Las células T CD8+ se recogieron para citometría de flujo con el fin de evaluar el IFN-γ, GrB, PD-1 y LAG-3.

Modelos tumorales

Para la administración de mBH3@NPs, se inyectaron por vía subcutánea ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con la línea celular B16-F10 o MC-38 (1×106 en 200 μL de PBS). Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs vacías, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón), según se muestra en la línea de tiempo de la Figura 6A. Para los ratones tratados con ABT-199, el compuesto se preparó en un vehículo que consistía en 10 % de etanol, 30 % de polietilenglicol-400 y 60 % de fosal 50 propilenglicol. Se administraron ABT-199 a las dosis y según los esquemas indicados en la Figura S10. Para la terapia combinada de mBH3@NPs y terapia ACT, se inyectaron por vía subcutánea ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con 2 × 106 células de melanoma B16-OVA o B16-F10. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2×106 en 100 μL de PBS) de ratones OT-1 o PMEL se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones con tumores, respectivamente. Se determinaron la longitud y el ancho de los tumores cada 2-3 días mediante medición con un calibrador digital, y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2. En todos los estudios, se sacrificaron los ratones una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 15 mm.

Para los modelos de xenoinjerto tumoral en ratones, se inyectaron por vía subcutánea ratones NSG hembra de 6 semanas de edad (Shanghai Model Organism Center, Inc) con 4×106 células HeLa-NY-ESO-1 resuspendidas en mezclas 50:50 de PBS frío y Matrix (Vazyme Biotech Co. Ltd., China). Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se asignaron aleatoriamente los ratones a cuatro grupos y se inyectaron intratumoralmente con mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, se inyectaron por vía intravenosa células T CD8+ transducidas con TCR NY-ESO-1 (2×106 en 100 μL de PBS). Se determinaron la longitud y el ancho de los tumores cada 2-3 días mediante medición con un calibrador digital, y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2.

Ensayo de migración de células T

Para el ensayo de migración in vitro de células T, se trataron ratones con tumores de aproximadamente 100 mm3 de células B16-OVA con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). En el segundo día, se recogieron los tumores y se trituraron directamente sobre un filtro de 45 μm y se complementaron con medio de cultivo DMEM completo (5×105 mL−1). Luego, las células se centrifugaron a 12.000×g durante 30 minutos para obtener el fluido intersticial tumoral. Se sembraron 2 × 105 células B16-OVA con 400 μL de fluido intersticial tumoral diluido en el pocillo inferior, y 5 × 105 células T OT-1 aisladas en 200 μL se tiñeron con CFDA, SE (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) durante 30 minutos y luego se colocaron en el pocillo superior (5 μm, Corning) para una cocultivo de 24 horas. Se recogieron las células de los pocillos inferiores y se añadieron cuentas de recuento (BioLegend) para analizar el porcentaje de migración de las células T OT-1. Para el ensayo de migración in vivo de células T, se implantaron ratones C57BL/6 con B16-OVA, y una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2×106) de ratones OT-1 se tiñeron con marcador celular (Solar Fluor 647, Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones con tumores. Después de 6 horas, se obtuvo una imagen de la fluorescencia de los ratones utilizando el sistema de imagen In Vivo (IVIS Spectrum, Caliper, EE. UU.).

Análisis por citometría de flujo

Se cortaron los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos en trozos. Para la digestión de los tejidos tumorales, se añadieron medios RPMI 1640 que contenían 10 % de FBS, colagenasa IV (1 mg mL−1), hialuronidasa (0,2 mg mL−1) y DNasa (0,1 mg mL−1) durante 20-30 minutos en baños de agua a 37 °C. Luego, la suspensión de tejido se pasó a través de una membrana de filtro de 45 μm para formar suspensiones de células individuales. Después de la eritrolisis con tampón 1×RBC, las células se bloquearon con el anticuerpo TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) durante 20 minutos a 4 °C y luego se tiñeron sobre hielo con anticuerpos conjugados con fluorescencia durante 30 minutos. Después del tinte, las células se resuspendieron en 200 μL de tampón FACS y finalmente se evaluaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.) y se analizaron utilizando FlowJo (v10.8.1). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en los Métodos STAR. La estrategia de selección para las principales células inmunitarias en este estudio se muestra en la Figura S13.

Tinción de inmunofluorescencia y H&E

Después del tratamiento tumoral, se sacrificaron los ratones. Se recogieron los tejidos tumorales y varios órganos (pulmón, corazón, hígado, riñón y bazo) y se fijaron con formaldehído al 4 % durante la noche. Todos los órganos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de espesor. Luego, se tiñeron con H&E para detectar posibles cambios patológicos. Para la tinción de inmunofluorescencia, las muestras se incubaron con diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia (TUNEL, Ki67, CD8, CRT, IFN-γ, PD-1, CD44, CCR7, CD69, DAPI) y las láminas se obtuvieron imágenes utilizando un escáner de corte digital (3D Histech).

Ensayo multicitoquínico

Brevemente, el tejido tumoral se homogeneizó y se recogió el sobrenadante celular de cada grupo de tratamiento para el ensayo de citoquinas utilizando el kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China). Las citoquinas seleccionadas incluyeron Granzima B, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-12. Para el ensayo multicitoquínico, se evaluaron los sobrenadantes del homogenado tumoral utilizando el kit de ensayo ABplex Mouse Cytokine 15-Plex Assay (ABclonal Biotechnology Co., Ltd.).

Pruebas de sangre y serológicas

Para garantizar la bioseguridad de esta terapia, se obtuvo suero mediante centrifugación a 3.000 rpm durante 20 minutos. Se determinaron las concentraciones de aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, bilirrubina total, creatinina y urea en suero. Se determinaron las citoquinas séricas relacionadas con el síndrome de liberación de citoquinas (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ) mediante el kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China).

Construcción de bibliotecas y secuenciación

Se extrajo el ARN total utilizando TRIzol (Thermo Fisher, 15596018) siguiendo el procedimiento del fabricante. Después de la extracción del ARN total, el ARNm se purificó a partir del ARN total utilizando Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, EE. UU.) con dos rondas de purificación. Después de la purificación, el ARNm se fragmentó en fragmentos cortos utilizando cationes divalentes a temperaturas elevadas (NEB, cat. e6150, EE. UU.). Los fragmentos de ARN escindidos se transcribieron luego a cDNA utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, cat. 1896649, EE. UU.), que luego se utilizó para sintetizar ADN de doble cadena marcado con U utilizando la ADN polimerasa I de E. coli (NEB, cat. m0209, EE. UU.), RNasa H (NEB, cat. m0297, EE. UU.) y solución de dUTP (Thermo Fisher, cat. R0133, EE. UU.). Se añadió una base A para la ligación a los adaptadores indexados. Cada adaptador contenía una sobreextensión de base T para ligar el adaptador al ADN fragmentado con cola A. Se ligaron adaptadores de doble índice a los fragmentos y se realizó la selección de tamaño con cuentas AMPureXP. Después del tratamiento con la enzima UDG lábil al calor (NEB, cat. m0280, EE. UU.), los productos ligados se amplificaron. El tamaño promedio de inserción para las bibliotecas de cDNA finales fue de 300 ± 50 pb. Finalmente, realizamos una secuenciación de apareamiento de 2 × 150 pb (PE150) en un Illumina Novaseq 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China). Las bibliotecas de cDNA construidas se secuenciaron luego en la plataforma de secuenciación Illumina Novaseq 6000. Utilizando el enfoque de secuenciación de ARN de apareamiento de Illumina, se secuenció el transcriptoma, generando un total de millones de lecturas de apareamiento de 2 × 150 pb. Las lecturas se filtraron aún más utilizando Cutadapt (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/). La calidad de la secuencia se verificó utilizando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9), incluido el Q20, el Q30 y el contenido de GC de los datos limpios.

Disociación de células individuales

Primero, se trataron ratones con tumores B16-F10 con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). Un día después, se inyectaron por vía intravenosa las células T CD8+ preactivadas (2×106 en 100 μL de PBS) de ratones PMEL en la vena caudal de los ratones con tumores. Se recogieron los tejidos tumorales seis días después. Luego, se realizó una secuenciación de scRNA en el laboratorio de Lc-Bio Technologies (Hangzhou) Co., Ltd. Los tejidos tumorales obtenidos se picaron en trozos de 0,5 mm2 y se digirieron en un disolvente de disociación (0,35 % de colagenasa IV, 2 mg mL−1 de papaína, 120 U mL−1 de DNasa I) durante 20 minutos. Después de la digestión, los especímenes se filtraron a través de tamices de células de 70 micrómetros para obtener suspensiones de células individuales. Luego, las suspensiones de células se trataron con tampón de lisis de eritrocitos (MACS 130-094-183, 10×) durante 10 minutos. Después de la lisis, las células se centrifugaron y el precipitado celular se resuspendió en tampón de citometría de flujo. Se añadieron 100 μL de microesferas de eliminación de células muertas (MACS130-090-101) para una incubación de 15 minutos. Al final de la incubación, se añadió tampón de unión a las columnas MS (130-042-201) para eliminar los reactivos. Se utilizaron APC Anti-ratón CD45 (BioLegend, número de catálogo 147708), PE Anti-ratón CD3 (BioLegend, número de catálogo 100206) para etiquetar la superficie celular. Las células se etiquetaron durante 30 minutos a 4 °C, protegidas de la luz. Posteriormente, las células CD45+/CD3+ se extrajeron y se analizaron de cada espécimen. La viabilidad celular se evaluó utilizando el método de tinción con azul de tripan, con una viabilidad requerida de >85 %. Se contó el número de células utilizando un contador de células automatizado Countess II y se ajustó la concentración celular a 700-1200 células μL−1.

Secuenciación de células individuales

Se añadió la suspensión de células individuales al chip 10× Chromium según las instrucciones del kit 10× Genomics Chromium Single-Cell 3′ (V3), con la expectativa de capturar 8.000 células. Las bibliotecas se ejecutaron en el HiSeq4000 para la secuenciación de Illumina. La amplificación de cDNA y la construcción de bibliotecas se realizaron según los protocolos estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en LC-Bio Technology (Hangzhou, China) en un sistema de secuenciación Illumina NovaSeq 6000 (secuenciación de doble extremo, 150 pb) con una profundidad mínima de 20.000 lecturas por célula.

Análisis estadístico de los datos de ARN de células individuales

Los resultados de la secuenciación de Illumina fuera de línea se convirtieron al formato FASTQ utilizando el software bcl2fastq (versión 5.0.1). Los datos de secuenciación de scRNA se compararon con el genoma de referencia utilizando el software CellRanger, y se identificaron y contaron las transcripciones de 3′ de células y células individuales en las muestras secuenciadas (Cell-ranger, versión 9.0.1). La matriz de expresión CellRanger resultante se cargó en Seurat (v3) para filtrar las células de baja calidad de los datos de secuenciación de scRNA, seguida de la reducción de escala y la agrupación. Las células de baja calidad se filtraron reteniendo solo las células con al menos 500 recuentos totales y más de 200 genes detectados. Los genes anotados como ribosomales (RPS, RPL), mitocondriales (MT-) o de la familia DnaJ/Hsp40 (DNAJ) se excluyeron del análisis posterior en función de sus símbolos de genes. Para fines de visualización, proyectamos la incrustación latente obtenida en un espacio bidimensional utilizando la función UMAP. Los DEG dentro de cada grupo de células se calcularon mediante la función scanpy.tl.rankgenesgroups (método = 't test'). Para evaluar la diversidad del repertorio de TCR, utilizamos el cálculo de la entropía de Shannon utilizando la función scirpy.tl.alpha_diversity.

Síntesis de ARNm

Para el mRNA de BH3, codifica los dominios de las proteínas proapoptóticas BH3, incluidas Bim, Puma, Bad y Noxa (Tabla S1). Los dominios BH3 se fusionaron con el andamio de cuadruple aptámero Stefin A para anclar y presentar la estructura del dominio BH3 y permitir o no su función fisiológica.^[40] Luego, los fragmentos objetivo completos se conectaron a vectores plantilla linealizados (Takara Biotech Co. Ltd., China) mediante una clonación perfecta para construir plásmidos para las reacciones de transcripción in vitro posteriores. El mRNA se sintetizó utilizando métodos estándar de transcripción in vitro. Los plásmidos que codificaban antígenos específicos se digirieron durante la noche utilizando HindIII para obtener una plantilla linealizada, seguida de la producción de mRNA utilizando el kit de cotranscripción EasyCap T7 (Vazyme Biotech Co. Ltd., China) según las instrucciones del fabricante. Y luego, el mRNA se purificó mediante el kit de purificación de ARN EasyPure (Transgen Biotech Co. Ltd., China). Todos los mRNA se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se almacenaron congelados a −80 °C.

Preparación y caracterización de mBH3@NPs

La formulación de mBH3@NPs se basó en la receta divulgada por Moderna.^[83] Específicamente, el lípido ionizable SM-102, el colesterol CHO-HP, el DSPC y el DMG-PEG2000 (AVT Co. Ltd., Shanghái, China) se mezclaron en una relación másica de 50:10:38,5:1,5 con etanol absoluto. Tres volúmenes de mRNA que codifican el antígeno [1:25 (p/p) mRNA a lípido, relación nitrógeno/fosfato (N/P) = 6] se suspendieron en un tampón de citrato de sodio (pH 4,5). Luego, las dos soluciones se mezclaron mediante una rápida pipeteo y se transfirieron a un dializador durante la noche a 4 °C en PBS. Las partículas en PBS se utilizaron para una mayor caracterización. La distribución del tamaño y el potencial zeta de mBH3@NPs se determinaron mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). La morfología se evaluó utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para verificar la estabilidad de la formulación de nanopartículas de mRNA, los diámetros se evaluaron después de la incubación tanto a temperatura ambiente como a 4 °C durante varias horas.

Evaluación de la citotoxicidad in vitro

Las células B16-F10, CT-26, HEK 293T y bEnd3 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104, respectivamente, y se cultivaron con un medio que contenía un 10 % de suero bovino fetal durante 24 h. Luego, se incubaron durante 24 h con mBH3@NPs a concentraciones de 0, 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ng/mL, respectivamente. Finalmente, se añadió 10 μL de solución del kit de conteo celular Cell-Counting-Kit-8 (APExBIO Tech, China) a cada pocillo y se detectó la viabilidad celular a 450 nm después de una incubación de 1 h.

Ensayo de apoptosis

Las células cancerosas se trataron con diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 h. Después del tratamiento, las células se recogieron, se tiñeron con anexina V conjugada con FITC y PI a 4 °C durante 10 min y se analizaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.). Los datos se analizaron con el software Flowjo v10.8.1.

Análisis de Western blot

Las células B16-F10 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo. Después de que las células alcanzaron una confluencia del 70-80 %, se trataron con nanopartículas, mRNA desnudo, mPuma@NPs y mBH3@NPs. Las muestras de proteína se extrajeron de las células lisadas con un tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con inhibidores de proteasas. Las muestras de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y luego se bloquearon con un 5 % de BSA. El anticuerpo primario diluido de la vía de la apoptosis, incluidos Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Caspase-3, Caspase-3 clivada, Caspase-9, Caspase-9 clivada, se incubó con las membranas durante la noche, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario durante 2 h a 37 °C. Después de lavar tres veces con TBST (20 mM Tris, 160 mM NaCl, 0,1 % de Tween 20), se utilizó el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad) para detectar las señales quimioluminiscentes. La beta-actina se utilizó como control de mantenimiento.

Ensayo de captación de glucosa

La captación de glucosa se evaluó mediante citometría de flujo utilizando el análogo de glucosa fluorescente 2-NBDG (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y el anticuerpo monoclonal Glut-1 (CST, 73015). Brevemente, las células OT-1 CD8+ preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Después del cocultivo, las células T se recogieron e incubaron para un análisis dual: las células se incubaron con 2-NBDG durante 1 h a 37 °C; las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal Glut-1 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Dylight488. El porcentaje de poblaciones de células T positivas para 2-NBDG y positivas para Glut-1 se determinó mediante citometría de flujo para cada grupo.

Medición del glutatión

Los niveles de glutatión y glutatión oxidado (GSSG) se determinaron utilizando el kit de ensayo GSH/GSSG de Solarbio. Brevemente, las células OT-1 CD8+ preactivadas se cocultivaron con células tumorales que habían sido pretratadas con mPuma@NPs, mBim@NPs o sin tratamiento. Para cada grupo, se lisaron 2 × 106 células T en 200 μL del tampón de lisis proporcionado. Después de la centrifugación a 12 000 × g durante 10 min a 4 °C, se recogió el sobrenadante para su análisis. Se preparó una curva estándar utilizando estándares. Se midió la absorbancia a 412 nm y se determinaron las concentraciones de glutatión total y GSSG en consecuencia, y luego se derivó la relación GSH/GSSG.

Detección de ROS, JC-1, ATP y HMGB1

Las células CT-26 y B16-F10 (2 × 105 por pocillo) se sembraron en una placa de 12 pocillos, se trataron con PBS, nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg/mL) durante 12 h. El nivel de ROS y el potencial de membrana mitocondrial en las células se detectaron utilizando el kit de ensayo de ROS y el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1 (Solarbio Science Technology Co., Ltd.), respectivamente. El medio de cultivo celular se recogió para el ensayo de ATP extracelular (Beyotime Biotechnology) y el análisis de HMGB1 (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). El lisado celular se recogió para el ensayo de ATP intracelular y el análisis de HMGB1.

Tinción inmunofluorescente de células

Las células B16-F10 y CT-26 se sembraron en portaobjetos en placas de 6 pocillos y se trataron con PBS, nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs (1 μg/mL) durante 12 h. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente. Luego, las células se permeabilizaron con PBS con 0,1 % de Triton X-100 (PBST) y se bloquearon con una solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron en el anticuerpo diluido CRT (1:200) durante la noche a 4 °C. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron en el anticuerpo secundario con dylight488 durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min y se obtuvieron imágenes utilizando CLSM (Leica FLUOVIEW FV3000 CLSM, Olympus, Japón).

Estimulación in vitro de células dendríticas

Las BMDC se aislaron de la médula ósea de ratones C57BL/6 hembra según lo descrito anteriormente.^[84] Brevemente, se prepararon suspensiones de células individuales, se pasaron a través de tamices celulares de 45 μm y se cultivaron en medio RPMI 1640 completo suplementado con 20 ng/mL de GM-CSF y 10 ng/mL de IL-4 (Peprotech) durante una semana. Las células B16-F10 se pretrataron con PBS (control), nanopartículas, mPuma@NPs y mBim@NPs durante 12 h. Posteriormente, se cocultivaron con BMDC durante 48 h. Los biomarcadores de maduración de las DC (CD80 y CD86) se evaluaron mediante citometría de flujo, con la selección en las células CD11c+.

Preparación y activación de células CD8+ PMEL y OT-1

El bazo de los ratones PMEL y OT-1 se esterilizó en la campana de bioseguridad y luego se molió mecánicamente a través de un tamiz celular de 45 μm para obtener una suspensión de células individuales. Después de la lisis con tampón de lisado de glóbulos rojos durante 3 min, las células se resuspendieron en DPBS. Se utilizó el kit de aislamiento de células T CD8+ (Selleck) para obtener una suspensión de células T CD8+ purificadas. Luego, se resuspendieron 1 × 106 células T nativas purificadas en una placa de 24 pocillos con medio RPMI suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, un 10 % de FBS inactivado térmicamente certificado, 50 μM de beta-mercaptoetanol, así como 30 UI/mL de IL-2 murino (Peprotech), hpg10025-33 (Genscript) u OVA257-264 (Solarbio) para la activación. Se añadieron 25 μL de cuentas magnéticas activadoras de células T murinas CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific Inc.) y se incubaron las células a 37 °C durante 72 h. Después de la estimulación, las células se juntaron en matraces para la expansión. La mitad del medio se reemplazó con medio fresco para mantener la densidad celular en aproximadamente 2 × 106 células/mL durante otros 72 h de incubación.

Aislamiento de células CD8+ humanas

Las células CD8+ humanas se aislaron de las PBMCs utilizando el kit de selección negativa de células CD8+ humanas (MedChemExpress, #HY-KO351). Las células enriquecidas se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 5 mM de HEPES, 2 mM de Glutamax, 50 μg/mL de Pen/Strep, 5 mM de NEAA, 5 mM de piruvato de sodio, un 10 % de FBS inactivado térmicamente certificado, 50 μM de beta-mercaptoetanol, así como 30 UI/mL de IL-2 humano (Proteintech). Las células se activaron en una placa de 48 pocillos a 2 × 106/mL con cuentas Dynabeads CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific, #11161D) (cuentas:células = 1:1), luego se transfirieron a matraces y se mantuvieron a 1 × 106 células/mL con cambios de medio cada 2-3 días.

Transducción lentiviral

El lentivirus específico de NY-ESO-1 se empaquetó en células HEK-293T utilizando los plásmidos de empaquetamiento de tercera generación psPAX2 y pMD2.G. El sobrenadante viral se recogió 48 y 72 h después de la transfección, se concentró y se tituló. Las placas no tratadas con tejido de 24 pocillos se recubrieron durante la noche a 4 °C con RetroNectin (25 μg/mL; Takara), se bloquearon con una solución de BSA al 2 % y se lavaron. Se añadieron partículas lentivirales y se centrifugaron en la placa (2000 g, 2 h, 32 °C). Después de retirar el sobrenadante y lavar, se añadieron 0,5 × 106 células CD8+ activadas por pocillo en medio que contenía 10 μg/mL de sulfato de protamina. Las placas se centrifugaron (500 g, 20 min) y se incubaron durante 72 h. Las células se recogieron, se tiñeron con el anticuerpo anti-HA (#901509, BioLegend) y se clasificaron mediante FACS para purificar las poblaciones positivas para TCR. Las células T clasificadas se mantuvieron en medio completo con 30 UI/mL de IL-2, se dividieron según fuera necesario para mantener una densidad de entre 1 × 106 células/mL.

Generación de células HeLa que expresan NY-ESO-1

Las células HeLa que expresan el antígeno NY-ESO-1 se generaron mediante transducción lentiviral. El lentivirus se produjo mediante la cotransfección de células HEK-293T con el plásmido de transferencia (NY-ESO-1-Ag-Luci-ZsGreen), los plásmidos de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando el reactivo de transfección NB (#NB02). El sobrenadante viral se recogió 48 y 72 h después de la transfección. Para la infección, las células HeLa se resuspendieron en el stock de virus (5 × 105 células/mL) y se centrifugaron (1000 g, 45 min, 30 °C). Después de una segunda ronda de adición de virus y centrifugación, las células se incubaron durante 1 h a 37 °C, se lavaron dos veces para eliminar el polibreno y se devolvieron al cultivo. Después de aproximadamente dos períodos de duplicación, las células positivas para ZsGreen se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Eliminación de células CD8+ in vitro

Las células B16-OVA se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 7 × 104 células por pocillo durante la noche. Luego, las células se trataron con 500 μL de medio que contenía diferentes dosis de mBH3@NPs durante 12 h de incubación y diferentes relaciones E:T de células CD8+ OT-1 activadas durante otras 24 h de incubación. Después de la incubación, las células tumorales se recogieron y se analizaron utilizando el kit ANNEXIN V-FITC/PI (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). El software CompuSyn se utilizó para calcular el índice de combinación (CI en ED50) si existe una sinergia de mBH3@NPs y células T. El porcentaje de eficiencia de eliminación se calculó como 100 % - Células normalizadas (Anexina V− PI− %). Se recogieron los sobrenadantes de las células para evaluar el IFN-γ y la granzima B utilizando el kit ELISA (Solarbio Science Technology Co., Ltd.). Las células CD8+ se recogieron para la citometría de flujo para evaluar el IFN-γ, la GrB, el PD-1 y el LAG-3.

Modelos tumorales

Para la administración de mBH3@NPs, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8 semanas de edad con la línea celular B16-F10 o MC-38 (1 × 106 células en 200 μL de PBS). Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs vacías, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón), según se muestra en la línea de tiempo de la Figura 6A. Para los ratones tratados con ABT-199, el compuesto se preparó en un vehículo que consistía en 10% de etanol, 30% de polietilenglicol-400 y 60% de fosal 50 propilenglicol. ABT-199 se administró en las dosis y los programas indicados en la Figura S10. Para la terapia combinada de mBH3@NPs y terapia ACT, se inyectaron por vía subcutánea ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8 semanas de edad con 2 × 106 células de melanoma B16-OVA o B16-F10. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, NPs, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2 × 106 en 100 μL de PBS) de ratones OT-1 o PMEL se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones con tumores, respectivamente. Se determinaron la longitud y el ancho de los tumores cada 2-3 días mediante medición con calibrador digital, y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2. En todos los estudios, los ratones se sacrificaron una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 15 mm.

Para los modelos de xenoinjerto tumoral en ratones, se inyectaron por vía subcutánea ratones NSG hembra de 6 semanas de edad (Shanghai Model Organism Center, Inc) con 4 × 106 células HeLa-NY-ESO-1 resuspendidas en mezclas 50:50 de PBS frío y Matrix (Vazyme Biotech Co. Ltd., China). Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos y se inyectaron intratumoralmente con mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, se inyectaron por vía intravenosa células T CD8+ transducidas con TCR NY-ESO-1 (2 × 106 en 100 μL de PBS). Se determinaron la longitud y el ancho de los tumores cada 2-3 días mediante medición con calibrador digital, y se calculó el volumen tumoral utilizando la siguiente fórmula: volumen tumoral = (longitud × ancho2)/2.

Ensayo de migración de células T

Para el ensayo de migración in vitro de células T, se trataron ratones con tumores de aproximadamente 100 mm3 de células B16-OVA con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). El segundo día, se recolectaron los tumores y se trituraron directamente sobre un tamiz de 45 μm y se suplementaron con medio de cultivo DMEM completo (5 × 105 mL−1). Luego, las células se centrifugaron a 12.000 × g durante 30 minutos para obtener el fluido intersticial tumoral. Se sembraron 2 × 105 células B16-OVA con 400 μL de fluido intersticial tumoral diluido en el fondo de la placa, y 5 × 105 células T OT-1 aisladas en 200 μL se tiñeron con CFDA, SE (Solarbio Science Technology Co., Ltd.) durante 30 minutos y luego se colocaron en el pozo superior (5 μm, Corning) para una cocultivo de 24 horas. Se recolectaron las células de los pozos inferiores y se añadieron cuentas de recuento (BioLegend) para analizar el porcentaje de migración de las células T OT-1. Para el ensayo de migración in vivo de células T, se implantaron ratones C57BL/6 con B16-OVA y, una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50-100 mm3, se inyectaron intratumoralmente con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs. Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2 × 106) de ratones OT-1 se tiñeron con marcador celular (Solar Fluor 647, Solarbio Science Technology Co., Ltd.) y se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones con tumores. Después de 6 horas, la fluorescencia de los ratones se visualizó utilizando el sistema de imagen In Vivo (IVIS Spectrum, Caliper, EE. UU.).

Análisis de citometría de flujo

Los tumores, los bazo y los ganglios linfáticos se cortaron en trozos. Para la digestión de los tejidos tumorales, se añadieron medios RPMI 1640 que contenían 10% de FBS, colagenasa IV (1 mg mL−1), hialuronidasa (0,2 mg mL−1) y DNasa (0,1 mg mL−1) durante 20-30 minutos en baños de agua a 37 °C. Luego, la suspensión de tejido se pasó a través de una membrana de filtro de 45 μm para formar suspensiones de células individuales. Después de la eritrolisis con tampón 1×RBC, las células se bloquearon con el anticuerpo TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) durante 20 minutos a 4 °C y luego se tiñeron sobre hielo con anticuerpos conjugados con fluorescencia durante 30 minutos. Después del teñido, las células se resuspendieron en 200 μL de tampón FACS y finalmente se evaluaron mediante citometría de flujo (CytoFLEX, Beckmancoulter, EE. UU.) y se analizaron utilizando FlowJo (v10.8.1). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en los Métodos STAR. La estrategia de selección para las principales células inmunitarias en este estudio se muestra en la Figura S13.

Tinción de inmunofluorescencia y H&E

Después del tratamiento tumoral, se sacrificaron los ratones. Se recolectaron los tejidos tumorales y varios órganos (pulmón, corazón, hígado, riñón y bazo) y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante la noche. Todos los órganos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de espesor. Luego, se tiñeron con H&E para detectar posibles cambios patológicos. Para la tinción de inmunofluorescencia, las muestras se incubaron con diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia (TUNEL, Ki67, CD8, CRT, IFN-γ, PD-1, CD44, CCR7, CD69, DAPI) y las láminas se visualizaron utilizando un escáner de corte digital (3D Histech).

Ensayo multicitoquínico

Brevemente, el tejido tumoral se homogeneizó y se recolectó el sobrenadante celular de cada grupo de tratamiento para el ensayo de citoquinas utilizando el kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China). Las citoquinas seleccionadas incluyeron Granzima B, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-12. Para el ensayo multicitoquínico, los sobrenadantes del homogenado tumoral se evaluaron utilizando el kit de ensayo ABplex Mouse Cytokine 15-Plex (ABclonal Biotechnology Co., Ltd.).

Pruebas de sangre y serológicas

Para garantizar la bioseguridad de esta terapia, se recuperó suero mediante centrifugación a 3.000 rpm durante 20 minutos. Se determinaron las concentraciones de aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, bilirrubina total, creatinina y urea en suero. Se determinaron las citoquinas séricas relacionadas con el síndrome de liberación de citoquinas (IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ) mediante el kit ELISA de Solarbio Life Sciences (China).

Construcción de bibliotecas y secuenciación

Se extrajo el ARN total utilizando TRIzol (Thermo Fisher, 15596018) siguiendo el procedimiento del fabricante. Después de la extracción del ARN total, el ARNm se purificó a partir del ARN total utilizando Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, EE. UU.) con dos rondas de purificación. Después de la purificación, el ARNm se fragmentó en fragmentos cortos utilizando cationes divalentes a temperaturas elevadas (NEB, cat. e6150, EE. UU.). Los fragmentos de ARN cortados se transcribieron luego a cDNA utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, cat. 1896649, EE. UU.), que luego se utilizó para sintetizar ADN de doble cadena marcado con U utilizando la ADN polimerasa I de E. coli (NEB, cat. m0209, EE. UU.), RNasa H (NEB, cat. m0297, EE. UU.) y solución de dUTP (Thermo Fisher, cat. R0133, EE. UU.). Se añadió una base A para la ligación a los adaptadores indexados. Cada adaptador contenía una sobreextensión de T para ligar el adaptador al ADN fragmentado con cola A. Se ligaron adaptadores de doble índice a los fragmentos y se realizó la selección de tamaño con cuentas AMPureXP. Después del tratamiento con la enzima UDG lábil al calor (NEB, cat. m0280, EE. UU.), los productos ligados se amplificaron. El tamaño promedio de inserción para las bibliotecas de cDNA finales fue de 300 ± 50 pb. Finalmente, realizamos una secuenciación de apareamiento de 2 × 150 pb (PE150) en un Illumina Novaseq 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China). Las bibliotecas de cDNA construidas se secuenciaron luego en la plataforma de secuenciación Illumina Novaseq 6000. Utilizando el enfoque de secuenciación de ARN de apareamiento de Illumina, se secuenció el transcriptoma, generando un total de millones de lecturas de apareamiento de 2 × 150 pb. Las lecturas se filtraron aún más utilizando Cutadapt (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/). La calidad de la secuencia se verificó utilizando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9), incluida la Q20, la Q30 y el contenido de GC de los datos limpios.

Disociación de células individuales

Los ratones portadores de B16-F10 se trataron primero con solución salina, mPuma@NPs y mBim@NPs (10 μg por ratón). Un día después, las células T CD8+ preactivadas (2 × 106 en 100 μL de PBS) de ratones PMEL se inyectaron por vía intravenosa en la vena caudal de los ratones con tumores. Los tejidos tumorales se recolectaron seis días después. Luego, se realizó una secuenciación de ARN de células individuales en el laboratorio de Lc-Bio Technologies (Hangzhou) Co., Ltd. Los tejidos tumorales obtenidos se picaron en trozos de 0,5 mm2 y se digirieron en un disolvente de disociación (0,35% de colagenasa IV, 2 mg mL−1 de papaína, 120 U mL−1 de DNasa I) durante 20 minutos. Después de la digestión, los especímenes se filtraron a través de tamices celulares de 70 micrómetros para obtener suspensiones de células individuales. Luego, las suspensiones celulares se trataron con tampón de lisis de eritrocitos (MACS 130-094-183, 10×) durante 10 minutos. Después de la lisis, las células se centrifugaron y el precipitado celular se resuspendió en tampón de citometría de flujo. Se añadieron 100 μL de microesferas de eliminación de células muertas (MACS130-090-101) para una incubación de 15 minutos. Al final de la incubación, se añadió tampón de unión a las columnas MS (130-042-201) para eliminar los reactivos. Se utilizaron APC Anti-ratón CD45 (BioLegend, catálogo n.º 147708), PE Anti-ratón CD3 (BioLegend, catálogo n.º 100206) para etiquetar la superficie celular. Las células se etiquetaron durante 30 minutos a 4 °C, protegidas de la luz. Posteriormente, las células CD45+/CD3+ se extrajeron y se analizaron de cada espécimen. La viabilidad celular se evaluó utilizando el método de tinción con azul de tripan, con una viabilidad requerida de >85%. Se contó el número de células utilizando un contador de células automatizado Countess II y se ajustó la concentración celular a 700-1200 células μL−1.

Secuenciación de células individuales

La suspensión de células individuales se añadió al chip 10× Chromium según las instrucciones del kit 10× Genomics Chromium Single-Cell 3′ (V3), con la expectativa de capturar 8.000 células. Las bibliotecas se ejecutaron en HiSeq4000 para la secuenciación de Illumina. La amplificación de cDNA y la construcción de bibliotecas se realizaron según los protocolos estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en LC-Bio Technology (Hangzhou, China) en un sistema de secuenciación Illumina NovaSeq 6000 (secuenciación de doble extremo, 150 pb) con una profundidad mínima de 20.000 lecturas por célula.

Análisis estadístico de los datos de ARN de células individuales

Los resultados de la secuenciación de Illumina fuera de línea se convirtieron al formato FASTQ utilizando el software bcl2fastq (versión 5.0.1). Los datos de secuenciación de ARN de células individuales se compararon con el genoma de referencia utilizando el software CellRanger, y se identificaron y contaron las transcripciones de 3′ de células y células individuales en las muestras secuenciadas (Cell-ranger, versión 9.0.1). La matriz de expresión CellRanger resultante se cargó en Seurat (v3) para filtrar las células de baja calidad de los datos de secuenciación de ARN de células individuales, seguida de la reducción de escala y la agrupación. Las células de baja calidad se filtraron reteniendo solo las células con al menos 500 recuentos totales y más de 200 genes detectados. Los genes anotados como ribosomales (RPS, RPL), mitocondriales (MT-) o de la familia DnaJ/Hsp40 (DNAJ) se excluyeron del análisis posterior en función de sus símbolos génicos. Para fines de visualización, proyectamos el espacio latente obtenido en un espacio bidimensional utilizando la función UMAP. Los DEG dentro de cada grupo de células se calcularon mediante la función scanpy.tl.rankgenesgroups (método = 't test'). Para evaluar la diversidad del repertorio de TCR, utilizamos el cálculo de la entropía de Shannon utilizando la función scirpy.tl.alpha_diversity.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los datos estadísticos se representaron gráficamente y se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., EE. UU.) e ImageJ. Los resultados cuantitativos se presentan como medias ± DE. Los tamaños de muestra para cada análisis estadístico se indican en las leyendas de las figuras. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student no pareada de dos colas. Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía con una prueba de comparación múltiple de Tukey. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01; ∗∗∗p < 0,001; NS, no significativo. Las barras de error en las representaciones gráficas corresponden a las medias ± DE.