Un virus oncolítico modificado genéticamente, que incorpora un anticuerpo simple (scFv) anti-PCSK9, potencia la inmunidad a largo plazo de las células T CD8+ mediante la modulación de la presentación del antígeno MHC-I.

Los virus oncolíticos (VO) lisan selectivamente las células cancerosas e inician una respuesta inmunitaria antitumoral, lo que los convierte en prometedores agentes terapéuticos contra el cáncer. No obstante, las consecuencias inmunológicas de la terapia con VO siguen sin estar claras.^[1] Clínicamente, los VO se ven limitados por la activación inadecuada de la inmunidad antitumoral del huésped y la difusión intratumoral restringida.^[2],^[3],^[4] Para potenciar los resultados terapéuticos, se han diseñado VO para que expresen moduladores inmunitarios que amplifiquen o reactiven la inmunidad antitumoral.^[5],^[6],^[7] Por lo tanto, dilucidar el impacto de los VO en la inmunidad antitumoral es esencial para desarrollar VO de nueva generación.

En los últimos años, se han logrado avances significativos en el estudio de los inhibidores de la convertasa proproteína subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) en el campo de la terapia contra el cáncer.^[8],^[9],^[10] Las pruebas emergentes sugieren que la PCSK9 no solo desempeña un papel en el metabolismo de los lípidos, sino que también puede servir como un posible objetivo terapéutico en el cáncer al modular la regulación inmunitaria dentro del microambiente tumoral (MET).^[11],^[12] Por ejemplo, se ha demostrado que los inhibidores de la PCSK9 mejoran la actividad antitumoral de las células T CD8+ al promover el reciclaje y la señalización del receptor de las células T (TCR) mediado por el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR).^[13] Además, la inhibición de la PCSK9 puede aumentar la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) en la superficie de las células tumorales, lo que activa las células T CD8+ infiltrantes y ejerce efectos antitumorales. Este mecanismo también puede potenciar la eficacia de los inhibidores del punto de control inmunitario PD-1.^[14] Sin embargo, aún se desconoce en gran medida si la PCSK9 influye en la oncolisis o la inmunomodulación mediada por los VO.

Aquí, investigamos el impacto de la infección por VO en la función de las células T y descubrimos que esta reduce el reconocimiento TCR-MHC-I mediante la regulación al alza de la PCSK9 en las células tumorales. La focalización de la PCSK9 con un inhibidor anti-PCSK9 o VO recombinantes que codifican fragmentos de anticuerpos variables de cadena única anti-PCSK9 (scFv) mejoró la eficacia antitumoral de los VO y estableció una inmunidad celular T duradera. Los VO diseñados que contienen scFv anti-PCSK9 mostraron una mejor cinética de replicación viral y mejoraron la eficacia de la terapia anti-PD-1. En conjunto, nuestros datos demuestran que el bloqueo de la PCSK9 potencia la terapia con VO y ofrece una estrategia de tratamiento para el cáncer colorrectal (CCR).

Resultados

La infección por VO altera la respuesta de las células T CD8+ al inducir la degradación del MHC-I

Aunque los VO pueden lisar directamente las células tumorales e iniciar respuestas inmunitarias antitumorales, sus consecuencias inmunológicas más amplias siguen estando incompletamente caracterizadas. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) se introdujo como un potente candidato oncolítico y se diseñó mediante la eliminación de la metionina en el residuo 51 de la proteína de la matriz (VSVΔ51) para reducir el potencial de neurotoxicidad.^[15] Para perfilar sistemáticamente las consecuencias inmunológicas inducidas por la infección con VSVΔ51, reanalizamos nuestros datos de secuenciación unicelular (scRNA-seq) publicados sobre tumores MC38 tratados con PBS e inyectados con VSVΔ51 en un momento posterior al tratamiento (Figura 1A).^[16] Inesperadamente, el análisis de enriquecimiento del cúmulo de células T reveló una regulación a la baja significativa de las vías de procesamiento y presentación de antígenos, junto con la señalización del TCR, en el grupo infectado con VSVΔ51 en comparación con el grupo de control (Figuras 1B, 1C y S1A). Estos hallazgos sugieren que el VSVΔ51 puede atenuar la citotoxicidad de las células T al alterar el reconocimiento TCR-MHC-I entre las células T CD8+ y las células tumorales.

Para validar funcionalmente estos hallazgos, establecimos un modelo de cocultivo de células T CD8+ de ratones OT1 y células tumorales CT26 que expresan el péptido ovalbúmina (CT26-OVA) en el medio acondicionado (CM) de las células cancerosas. El CM derivado de las células cancerosas infectadas con VSVΔ51 se recogió y posteriormente se expuso a la luz UV para inactivar el virus (CM-VSVΔ51-UV). El CM-VSVΔ51-UV alteró significativamente la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 contra las células CT26-OVA (Figura 1D). A continuación, utilizamos una cepa pseudotipada VSVΔ51ΔG que contiene una deleción de genes que codifican su glicoproteína para el ensayo de cocultivo, lo que limita la propagación viral y la oncolisis directa del VSVΔ51. El CM derivado de VSVΔ51ΔG (CM-VSVΔ51ΔG) también disminuyó la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 (Figura 1E).

Dado que el VSVΔ51 infecta y se replica preferentemente en las células tumorales, investigamos más a fondo el impacto de la infección por VSVΔ51 en la expresión de MHC-I en la superficie de las células tumorales. El análisis de citometría de flujo reveló una disminución de la expresión de MHC-I en la superficie de las células CT26-OVA tras el tratamiento con CM-VSVΔ51-UV o CM-VSVΔ51ΔG (Figuras 1F y 1G). Además, el CM inactivado por calor no redujo la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 ni la expresión de MHC-I en la membrana (Figuras S1B y S1C). Los resultados anteriores indican que la infección por VSVΔ51 reduce significativamente el MHC-I en la superficie de las células vecinas mediante un mecanismo paracrino.

A continuación, determinamos si este fenómeno observado podía generalizarse a otras células cancerosas o cepas de virus. Descubrimos que el VSVΔ51 también redujo el MHC-I en la superficie de las líneas celulares de CCR humanas DLD1 y HCT116 (Figura 1H). Las células infectadas con el virus de la viruela (VV) y las células infectadas con el virus del herpes simple (HSV) degradaron constantemente el MHC-I en la membrana (Figura S1D) y los niveles totales de proteína de MHC-I (Figura S1E). Estos hallazgos sugieren que la infección por VO puede inducir la pérdida de MHC-I en las células vecinas no infectadas, lo que disminuye la citotoxicidad de las células T CD8+ y promueve la evasión inmunitaria.

La infección por VO induce el eje SREBP2-PCSK9 para degradar el MHC-I a través de la vía lisosomal

Para investigar cómo la infección por VO reduce la expresión de MHC-I, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) de las células DLD1 de control e infectadas con VSVΔ51. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) confirmó que la infección por VSVΔ51 aumenta la expresión de la vía de "regulación del proceso metabólico del colesterol" (Figura 2A). Evaluamos los niveles intracelulares de colesterol y descubrimos una reducción significativa del contenido total y libre de colesterol en las células DLD1 y HCT116 tras la infección por VSVΔ51 (Figuras S2A y S2B). Estudios anteriores han demostrado que el regulador del metabolismo del colesterol PCSK9 desempeña un papel en la degradación lisosomal del MHC-I,^[14],^[17],^[18], lo que nos llevó a explorar el papel de la PCSK9 en la pérdida de MHC-I regulada por la infección por VSVΔ51. Descubrimos que la infección por VSVΔ51 aumentó los niveles transcripcionales de PCSK9 y su factor de transcripción aguas arriba SREBP2 (Figura 2B). El análisis de inmunoblotaje confirmó que los niveles de SREBP2 y PCSK9 aumentaron notablemente, mientras que los niveles de MHC-I disminuyeron significativamente tras la infección por VSVΔ51 (Figura 2C). Además, la secreción de PCSK9 se estimuló mediante la infección viral con diferentes cepas de virus, incluidos VSVΔ51, VV y HSV (Figuras 2D y S2C).

A continuación, investigamos si el eje SREBP2-PCSK9 media en la regulación a la baja del MHC-I. La inhibición farmacológica de SREBP2 con fatostatina abolió la regulación al alza de PCSK9 tras la infección por VSVΔ51 (Figuras S2D y S2E), mientras que el tratamiento exógeno con IFNa2b no influyó en la expresión de PCSK9 (Figuras S2F y S2G), lo que demuestra que la infección por VSVΔ51 activa la expresión de PCSK9 a través de la activación de SREBP2. A continuación, descubrimos que el anticuerpo neutralizante de PCSK9 aprobado, alirocumab, rescató la regulación a la baja del MHC-I inducida por VSVΔ51, como se demostró mediante el análisis de inmunoblotaje (Figuras 2E y S2I) y la citometría de flujo (Figuras 2F y S2H). Generamos células HCT-116 con deleción de PCSK9 utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y descubrimos que la infección por VSVΔ51 no redujo la expresión de MHC-I en las células con deleción de PCSK9 (Figuras 2G y 2H). En consecuencia, tanto la inhibición farmacológica de SREBP2 mediante fatostatina (Figuras 2I y S2J) como el silenciamiento genómico de SREBP2 utilizando ARN de interferencia corto (Figuras 2J y 2K) invirtieron la regulación a la baja del MHC-I inducida por la infección por VSVΔ51. El análisis GSEA también reveló la regulación al alza de la "procesamiento y presentación de antígenos mediante el MHC de clase I" tras la infección por VSVΔ51 (Figura 2L). El análisis cuantitativo de PCR demostró un aumento de los niveles transcripcionales de HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, TAPBP y TAP1 (Figuras 2M y S2K). El aumento transcripcional de la vía del MHC-I sugiere que la regulación a la baja del MHC-I mediada por VSVΔ51 se produce a nivel postranscripcional. En los experimentos de persecución con cicloheximida (CHX), el VSVΔ51 mejoró significativamente la velocidad de degradación del MHC-I (Figura 2N). Para examinar el mecanismo detallado de la degradación del MHC-I, se utilizaron el inhibidor del proteasoma MG132 y el inhibidor del lisosoma bafilomicina A1 (Baf-A1) para bloquear las vías de degradación de proteínas. Los resultados mostraron que Baf-A1, pero no MG132, rescató la regulación a la baja del MHC-I inducida por VSVΔ51 (Figuras 2O y S2L). En conjunto, estos datos demuestran que la infección por VSVΔ51 activa el eje SREBP2-PCSK9 para inducir la degradación lisosomal del MHC-I.

La inhibición de la PCSK9 y el tratamiento con VSVΔ51 se combinan para suprimir múltiples modelos tumorales y remodelar el microambiente tumoral

Para determinar si la inhibición de la PCSK9 podría mejorar el potencial terapéutico de los VO, evaluamos el efecto del anticuerpo anti-PCSK9 sobre la replicación viral y la oncolisis in vitro. Sin embargo, el tratamiento con alirocumab no influyó en la propagación viral (Figura S3A) ni en la replicación viral (Figuras S3B y S3C). El tratamiento con alirocumab tampoco amplificó la oncolisis directa del VSVΔ51 (Figura S3D). A continuación, evaluamos el efecto combinado del anticuerpo anti-PCSK9 y el VSVΔ51 in vivo. Se trató a ratones con tumores MC38 subcutáneos (inestabilidad de microsatélites [MSI]) con (1) VSVΔ51 intravenoso, (2) alirocumab intraperitoneal o (3) una combinación de VSVΔ51 y alirocumab (Figura 3A). La combinación de VSVΔ51/alirocumab redujo significativamente el volumen tumoral y el peso tumoral en comparación con cualquiera de las dos terapias individuales (Figuras 3B–3D).

Los pacientes con cáncer colorrectal estable en microsatélites (MSS) o con reparación de desajustes deficiente, que representan aproximadamente el 95% de todos los casos de CCR, presentan bajas tasas de respuesta a la inmunoterapia.^[19] Por lo tanto, se utilizaron modelos tumorales sinogénicos CT26 y Colon26 (MSS) para evaluar los efectos del potencial combinado del tratamiento con VSVΔ51/alirocumab. De forma consistente, el tratamiento con alirocumab también sinergizó con el VSVΔ51 para controlar el crecimiento tumoral y reducir la carga tumoral en los modelos tumorales subcutáneos de Colon26 (Figuras 3F–3H) y CT26 (Figuras 3J–3L). Las curvas de crecimiento tumoral mostraron que la combinación de VSVΔ51/alirocumab indujo la regresión tumoral en algunos ratones (20%), mientras que ningún animal del grupo de monoterapia presentó una remisión completa en el modelo CT26 (Figura S3E).

Para delinear sistemáticamente las alteraciones inmunitarias provocadas por la combinación de VSVΔ51/PCSK9i, realizamos una secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) en células CD45+ aisladas de tumores CT26. Clasificamos estos cúmulos en 11 tipos de células mediante marcadores específicos de tipo celular canónicos (Figura 3M). Al cuantificar la composición celular de las muestras, descubrimos que el tratamiento con VSVΔ51 aumentó la frecuencia de macrófagos; inesperadamente, la frecuencia de células T no difería significativamente entre los cuatro grupos (Figura 3N).

Centrándonos en el cúmulo de células T, el análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) reveló que la vía de señalización del TCR se reguló al alza en el grupo de combinación en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 3O), lo que indica que la inhibición de la PCSK9 alivia la supresión de la capacidad citotóxica de las células T inducida por el VO. A continuación, reanalizamos los cúmulos de células T y obtuvimos 6 subcúmulos funcionales (Figuras 3P y 3Q). En particular, el subconjunto de células T CD8+ asociadas a la citotoxicidad era abundante en el grupo de combinación (Figura 3R). La proporción de células T CD4+ auxiliares en el grupo de combinación disminuyó en comparación con el grupo de monoterapia con VSVΔ51 (Figura 3R). Estos resultados indican que las células T CD8+ mediaron principalmente la actividad antitumoral. Además, el análisis de pseudotiempo de los cúmulos de células T reveló que las células T del grupo de combinación ocuparon preferentemente estados de diferenciación más tempranos en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 3S).

Para profundizar en el estudio, analizamos las células asesinas naturales (NK) y los compartimentos de monocitos/macrófagos para obtener una visión completa de la remodelación del microambiente tumoral (TME) inducida por la terapia combinada. El análisis de aproximación y proyección de múltiples (UMAP) de las células NK mostró 7 subconjuntos distintos de células NK (Figura S4A). El tumor tratado con la combinación de PCSK9i/VSVΔ51 mostró una mayor población citotóxica (Gzma+) y una mayor población de quimiocinas (Ccl5+) en comparación con el tumor tratado con VSVΔ51 (Figura S4B). Reagrupamos la población de monocitos/macrófagos e identificamos 9 subconjuntos distintos (Figura S4C). Las células de monocitos/macrófagos del grupo de combinación contenían una mayor proporción de subconjuntos que reclutan neutrófilos (Cxcl2+) y una menor proporción de poblaciones que activan el complemento (C1qa+) en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura S4D). También observamos que el tratamiento combinado redujo la puntuación M2^[20] de la polarización de los macrófagos en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura S4E). Por lo tanto, la terapia combinada reprograma los principales infiltrados inmunitarios, transformando un estado inducido por VSVΔ51 en un microambiente más activado y citotóxico.### La combinación de VSVΔ51 e inhibición de PCSK9 favorece las células T CD8+ de tipo "stem" y establece la memoria antitumoral.

Investigamos más a fondo qué células inmunitarias median la actividad antitumoral de la combinación de VSVΔ51/alirocumab mediante experimentos de depleción in vivo utilizando anticuerpos contra las células T CD4+ y CD8+. Los anticuerpos de depleción eliminaron eficazmente las células T CD4+ y CD8+ (Figura 4A). Nuestros datos demostraron que la depleción de las células T CD8+ abolió en gran medida el efecto inhibidor de la combinación de VSVΔ51/alirocumab sobre el crecimiento tumoral, pero no la de las células T CD4+ (Figura 4B). Estas observaciones nos llevaron a centrarnos en la inmunidad de las células T CD8+ tras la combinación de VSVΔ51/alirocumab y analizamos sistemáticamente las células T que infiltran los tumores mediante citometría de flujo en los modelos CT26 y MC38 (Figura S5A). La combinación de VSVΔ51/alirocumab aumentó significativamente el porcentaje de células T CD8+ infiltrantes tumorales y la expresión de interferón (IFN)-γ o granzima B en las células T CD8+ en comparación con el tratamiento único o el grupo de control (Figuras 4C, 4D, S5B y S5C). En resumen, estos datos indican que el anticuerpo anti-PCSK9 podría potenciar el efecto terapéutico in vivo de los virus oncolíticos (VO) al mejorar la inmunidad de las células T CD8+.

Para determinar la durabilidad del efecto terapéutico de la combinación de VSVΔ51/PCSK9i, establecimos un modelo de retoterapia tumoral. A los ratones libres de tumores del tratamiento combinado de VSVΔ51/alirocumab se les volvió a inocular con una dosis 2 veces mayor de células CT26 autólogas o células 4T1 heterólogas en el lado bilateral, 50 días después de la primera inoculación tumoral. A los ratones sanos de la misma edad se les inyectó el mismo número de células CT26 o 4T1 como grupo de control (Figura 4E). Cabe destacar que todos los ratones libres de tumores rechazaron los tumores CT26 reintroducidos, pero no los tumores 4T1 (Figuras 4F y 4G). También se observó una regresión parcial de los tumores 4T1 en los ratones libres de tumores; sin embargo, todos los ratones sanos desarrollaron tumores CT26 y 4T1 después de la inoculación (Figuras 4F y 4G). Estos hallazgos indican que la combinación de VSVΔ51/alirocumab podría establecer una inmunidad tumoral específica duradera. También se analizó el perfil inmunitario de los órganos linfoides periféricos el día 50 en los ratones libres de tumores. Los ratones libres de tumores inducidos por el tratamiento combinado mostraron porcentajes más altos de células T centrales de memoria CD4+ y CD8+ (TCM), mientras que las proporciones de células T efectoras de memoria (TEM) permanecieron sin cambios en el bazo y los ganglios linfáticos drenantes (Figuras 4H y S5D).

Además, se aislaron células T CD3+ del bazo de los ratones mencionados y se cocultivaron con células CT26 o 4T1 in vitro. Los ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) confirmaron que las células T del bazo derivadas de los ratones libres de tumores demostraron una mayor actividad citotóxica contra las células CT26 autólogas que las de los ratones sanos, mientras que no se observó tal efecto contra las células 4T1 heterólogas (Figura 4I). Tras la estimulación con células CT26, las células T del bazo de los ratones libres de tumores también mostraron proporciones significativamente mayores de células T CD8+ CD107a+, células T CD8+ Ki67+ y células T CD4+ Ki67+ en relación con los otros grupos (Figura 4J). En conjunto, estos datos demuestran que la combinación de VSVΔ51/PCSK9i induce respuestas robustas de células T de memoria y una inmunidad tumoral específica duradera.### El VSV modificado que contiene scFv anti-PCSK9 exhibió una mayor replicación viral y tropismo tumoral.

Para aumentar la administración intratumoral del anticuerpo anti-PCSK9, generamos un VSV oncolítico recombinante para expresar un fragmento de anticuerpo de cadena variable única (scFv) anti-PCSK9 derivado de alirocumab y evolocumab, designado rVSV-Ali y rVSV-Evo, respectivamente (Figura 5A; Tabla S1). Analizamos la eficiencia de expresión de scFv en las células DLD1 después de la infección y descubrimos que tanto rVSV-Ali como rVSV-Evo podían expresar eficientemente el scFv en las células tumorales infectadas (Figuras 5B y 5C). rVSV-Ali o rVSV-Evo revirtieron la regulación a la baja de MHC-I inducida por la infección con VSVΔ51 (Figura 5D). Además, el CM de las células infectadas con rVSV-Ali o rVSV-Evo mejoró significativamente el MHC-I de la superficie en las células tumorales (Figura 5E), lo que indica la liberación de scFv.

A continuación, evaluamos la capacidad de replicación y la eficacia oncolítica de rVSV-Ali y rVSV-Evo. El ensayo de placa reveló que rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron títulos virales más altos que VSVΔ51, especialmente en las células DLD1 y HCT116 (Figura 5F). Además, rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron una mayor actividad oncolítica in vitro a una baja concentración de infección (MOI) que el VSVΔ51 parental (Figura 5G).

Nuestros datos demostraron que la adición extracelular del anticuerpo PCSK9 no influyó en la replicación viral (Figuras S3A-S3C). Sin embargo, rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron una cinética de replicación viral más alta que el VSVΔ51 parental (Figura 5F). Estudios previos han sugerido que el PCSK9 intracelular puede modular las vías del IFN de tipo I.^[21],^[22] Por lo tanto, medimos la expresión de IFNB1 y los genes estimulados por el IFN (ISG) tras la infección viral. rVSV-Ali y rVSV-Evo restringieron significativamente la transcripción de IFNB1, ISG15 y CXCL10, en comparación con VSVΔ51 (Figura S6A). La eliminación de PCSK9 también suprimió el aumento de la transcripción de IFNB1, ISG15 y CXCL10 inducido por la infección con VSVΔ51 (Figura S6B). De manera consistente, la eliminación de PCSK9 mejoró la replicación viral de VSVΔ51 (Figuras S6C y S6D), lo que se revirtió con el tratamiento con IFNa2b exógeno (Figuras S6C y S6D). Estos hallazgos sugieren que rVSV-Ali y rVSV-Evo inhiben la vía del IFN al neutralizar el PCSK9 intracelular, lo que promueve la cinética de replicación viral.

Analizamos más a fondo la replicación viral y el tropismo tumoral de rVSV-Ali/Evo in vivo. Establecimos un modelo de tumor subcutáneo de CT26 e inyectamos por vía intravenosa VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo, respectivamente. La detección de ARN viral reveló un aumento de la expresión de la proteína G del virus del estomatitis vesicular (VSV-G) en los tejidos tumorales de los grupos de rVSV-Ali y rVSV-Evo en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 5H). Sin embargo, no hubo cambios significativos en los tejidos normales, incluidos el riñón, el hígado, el pulmón, el corazón y el bazo (Figura 5H). El análisis de inmunotransferencia de los tejidos tumorales reveló que el tratamiento con VSVΔ51 indujo la regulación al alza de PCSK9 y SREBP2 y redujo la expresión de MHC-I y LDLR, mientras que rVSV-Ali/Evo restauró la expresión de MHC-I y mejoró la proteína viral VSV-G (Figura 5I). No se observaron cambios significativos en la expresión de SREBP2, PCSK9 o LDLR en los tejidos hepáticos (Figura 5J). Además, el tratamiento con rVSV-Ali elevó significativamente el nivel de colesterol específicamente en los tejidos tumorales, pero no afectó el colesterol hepático o sérico (Figura 5K). En contraste, el tratamiento combinado con VSVΔ51/alirocumab ejerció un efecto sistémico sobre la homeostasis del colesterol, reduciendo los niveles de colesterol sérico y aumentando los niveles de colesterol hepático (Figura 5K). No se observó ninguna diferencia significativa en el control tumoral entre rVSV-Ali y la terapia combinada con VSVΔ51/alirocumab en el modelo de tumor CT26 (Figuras S6E-S6H). Estos resultados indican que rVSV-Ali/Evo podría revertir la pérdida de MHC-I inducida por VSVΔ51, lo que permite la administración local del scFv anti-PCSK9 en el microambiente tumoral (TME) y evita la posible hepatotoxicidad.### El VSV modificado con scFv anti-PCSK9 mejoró las células T de memoria de tipo "stem".

A continuación, evaluamos si rVSV-Ali/Evo exhibió una eficacia terapéutica superior en comparación con el VSVΔ51 parental in vivo. En los modelos subcutáneos de tumor MC38 y CT26, los ratones tratados con rVSV-Ali o rVSV-Evo mostraron un control tumoral significativamente mejorado, lo que se evidenció por volúmenes tumorales y pesos tumorales marcadamente reducidos en comparación con el grupo de control o VSVΔ51 (Figuras 6A-6H). Un estudio reciente verificó que las células de CPDA con alta expresión de PCSK9 colonizan preferentemente los tejidos pulmonares.^[23] Para determinar si rVSV-Ali y rVSV-Evo exhiben una eficacia terapéutica superior en el modelo de metástasis pulmonar, establecimos un modelo de metástasis pulmonar de CT26-luc (Figura 6I). Los resultados experimentales demostraron que los ratones tratados con rVSV-Ali o rVSV-Evo tenían una carga tumoral significativamente reducida (Figuras 6J y 6L) y exhibieron una probabilidad de supervivencia sustancialmente mayor (Figura 6K) en comparación con el grupo de tratamiento con VSVΔ51.

Para dilucidar aún más los efectos de rVSV-Ali y rVSV-Evo sobre el microambiente inmunitario tumoral, analizamos los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) en el modelo de tumor subcutáneo de CT26 (Figura S7A). El tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo aumentó significativamente el porcentaje de células T CD8+ infiltrantes tumorales y la expresión de IFN-γ y granzima B en las células T CD8+ (Figura 6M). La proporción de Tregs dentro de las células T CD4+ aumentó modestamente después del tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo; sin embargo, la relación Teff/Treg se mantuvo significativamente elevada en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 6M). Estos datos indican que rVSV-Ali y rVSV-Evo podrían potenciar el efecto terapéutico in vivo al mejorar la inmunidad de las células T CD8+. Además, tanto rVSV-Ali como rVSV-Evo indujeron una mayor proporción de células precursoras de memoria CD127hi que el tratamiento con VSVΔ51 (Figura S8A). De manera consistente, TCF7, un factor de transcripción crítico para la formación de células T CD8+ centrales de memoria, también se reguló al alza en los grupos de rVSV-Ali y rVSV-Evo (Figura S8B). Observamos que las TCM eran casi indetectables en los TIL, mientras que las células TEM CD4+ o CD8+ aumentaron significativamente tras el tratamiento con VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo (Figuras S8C y S8D).

Para abordar aún más si rVSV-Ali y rVSV-Evo podrían activar el desarrollo de la memoria inmunitaria a largo plazo, analizamos a continuación los linfocitos esplénicos. Coherente con el perfil inmunológico observado en los TIL, el tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo aumentó significativamente la expresión de granzima B en las células T CD8+ y mejoró la proporción de células precursoras de memoria CD127hi o TCF7hi (Figuras 6N, S8E y S8F). La proporción de células TEM dentro de los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ se elevó simultáneamente en todos los tratamientos (Figuras 6O y S8G). Interesantemente, el tratamiento con VSVΔ51 redujo la fracción de TCM dentro de las células T CD4+ y CD8+, mientras que rVSV-Ali y rVSV-Evo restauraron marcadamente la población de TCM (Figuras 6O y S8G). Los hallazgos anteriores indicaron que rVSV-Ali/Evo no solo activó una robusta inmunidad antitumoral, sino que también promovió el desarrollo de la memoria inmunológica a largo plazo.### El VSV modificado con scFv anti-PCSK9 mejoró la eficacia de la terapia anti-PD-1.

El bloqueo de puntos de control inmunitario basado en inhibidores de PD-1 ha demostrado avances prometedores en el manejo clínico del CCRC; sin embargo, su efecto terapéutico se limita a la mayoría de los pacientes con CCRC MSS.^[24],^[25],^[26] Para determinar si el VSV recombinante podría mejorar la eficacia terapéutica de la terapia anti-PD-1 en el modelo de CCRC MSS, tratamos ratones portadores de CT26 con VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo, combinados con anticuerpo anti-PD-1, y comparamos los resultados terapéuticos (Figura 7A). Nuestros resultados demostraron que rVSV-Ali o rVSV-Evo en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 (rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1) conferían una eficacia terapéutica superior en comparación con otros grupos en el modelo tumoral CT26 (Figuras 7B y 7C). Este régimen de tratamiento condujo a una reducción significativa de la masa tumoral y logró una tasa de respuesta completa del 50% (4 de 8 ratones; Figuras 7B y 7C).

Simultáneamente, analizamos la reprogramación inmune tanto en el tumor como en el bazo tras la terapia combinada con rVSV-Ali/Evo modificado + anti-PD-1. En el análisis de las células infiltrantes linfocíticas tumorales (TIL) del modelo subcutáneo de CT26, el tratamiento con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 no indujo un aumento significativo en la infiltración y la actividad funcional de las células T CD8+, en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura S9A). Se observó una mejora en la proporción de células T CD8+ precursoras de memoria CD127hi y TCF7hi en los grupos rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura S9B). Sin embargo, no hubo cambios significativos en las fracciones TEM CD4+ y CD8+ dentro de las TIL (Figura S9C). Estos resultados demuestran que rVSV-Ali/Evo presenta un mayor potencial para activar la memoria inmunitaria a largo plazo que VSVΔ51 en combinación con la terapia anti-PD-1.

En el análisis de los linfocitos esplénicos, el tratamiento con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 no mejoró significativamente la población o la función de las células T CD8+ (Figura S9D), pero aumentó notablemente las células precursoras de memoria CD127hi y TCF7hi en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura 7D). Además, los tratamientos con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 también atenuaron la reducción de las células TCM inducida por el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1, pero no indujeron cambios significativos en las células TEM en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura 7E). Además, los experimentos de reexposición tumoral (Figura S9E) revelaron que los ratones curados con el tratamiento combinado con VSV modificado con scFv anti-PCSK9 y anticuerpo anti-PD-1 rechazaron por completo los tumores CT26 reexponidos, pero no los tumores 4T1 (Figuras S9F–S9K). Se observó una regresión parcial de los tumores 4T1 en los ratones libres de tumores, mientras que todos los ratones no tratados desarrollaron tumores CT26 y 4T1 tras la inoculación (Figuras S9F–S9K).

Para explorar aún más el potencial clínico de rVSV-Ali como terapia combinada para el tratamiento anti-PD-1, establecimos un modelo de ratón humanizado injertado con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante la inyección intravenosa de 1 × 107 PBMC en ratones NOD-IL2Rγnull (NSG); 1 semana después, se inyectaron 5 × 106 células HCT116 por vía subcutánea (Figura 7F). Tres semanas después de la infusión de PBMC, la citometría de flujo de la sangre periférica del ratón mostró un aumento marcado de las células CD45+ humanas, lo que confirmó el injerto exitoso (Figura S10A). Luego, los ratones portadores de tumores fueron sometidos a los tratamientos indicados. En particular, la combinación de rVSV-Ali y anticuerpo anti-PD-1 logró la eficacia terapéutica más potente, lo que condujo a una regresión tumoral marcada y a una tasa de respuesta completa del 80% (4 de 5 ratones; Figuras 7G y 7H). En conjunto, estos hallazgos destacan el prometedor potencial traslacional de rVSV-Ali en combinación con el bloqueo del punto de control PD-1.

La infección por OV altera la respuesta de las células T CD8+ al inducir la degradación de MHC-I

Aunque los virus oncolíticos (OV) pueden lisar directamente las células tumorales e iniciar respuestas inmunitarias antitumorales, sus consecuencias inmunológicas más amplias siguen estando incompletamente caracterizadas. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) se introdujo como un potente candidato oncolítico y se modificó genéticamente mediante la eliminación de la metionina en el residuo 51 de la proteína de matriz (VSVΔ51) para reducir el potencial de neurotoxicidad.^[15] Para perfilar sistemáticamente las consecuencias inmunitarias inducidas por la infección por VSVΔ51, reanalizamos nuestros datos de secuenciación unicelular (scRNA-seq) publicados sobre tumores MC38 tratados con PBS e inyectados con VSVΔ51 en un momento posterior al tratamiento (Figura 1A).^[16] Inesperadamente, el análisis de enriquecimiento del cúmulo de células T reveló una regulación a la baja significativa de las vías de procesamiento y presentación de antígenos, junto con la señalización del TCR, en el grupo infectado con VSVΔ51 en comparación con el grupo de control (Figuras 1B, 1C y S1A). Estos hallazgos sugieren que VSVΔ51 puede atenuar la citotoxicidad de las células T al alterar el reconocimiento TCR-MHC-I entre las células T CD8+ y las células tumorales.

Para validar funcionalmente estos hallazgos, establecimos un modelo de cocultivo de células T CD8+ de ratones OT1 y células tumorales CT26 que expresan el péptido ovalbúmina (CT26-OVA) en el medio acondicionado (CM) de las células cancerosas. El CM derivado de las células cancerosas infectadas con VSVΔ51 se recogió y posteriormente se expuso a la luz UV para inactivar el virus (CM-VSVΔ51-UV). El CM-VSVΔ51-UV alteró significativamente la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 contra las células CT26-OVA (Figura 1D). A continuación, utilizamos una cepa pseudotipada VSVΔ51ΔG que contiene una deleción de genes que codifican su glicoproteína para el ensayo de cocultivo, lo que limita la propagación viral y la lisis oncolítica directa de VSVΔ51. El CM derivado de VSVΔ51ΔG (CM-VSVΔ51ΔG) también disminuyó la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 (Figura 1E).

Dado que VSVΔ51 infecta y se replica preferentemente en las células tumorales, investigamos más a fondo el impacto de la infección por VSVΔ51 en la expresión de MHC-I en la superficie de las células tumorales. El análisis de citometría de flujo reveló una disminución de la expresión de MHC-I en la superficie de las células CT26-OVA tras el tratamiento con CM-VSVΔ51-UV o CM-VSVΔ51ΔG (Figuras 1F y 1G). Además, el CM inactivado por calor no redujo la citotoxicidad de las células T CD8+ OT1 ni la expresión de MHC-I en la membrana (Figuras S1B y S1C). Los resultados anteriores indican que la infección por VSVΔ51 reduce significativamente el MHC-I en la superficie de las células diana de forma paracrina.

A continuación, determinamos si este fenómeno observado podría generalizarse a otras células cancerosas o cepas de virus. Descubrimos que VSVΔ51 también redujo el MHC-I en la superficie de las líneas celulares de CCRC humanas DLD1 y HCT116 (Figura 1H). Las células infectadas con el virus de la viruela (VV) y las células infectadas con el virus del herpes simple (HSV) degradaron constantemente el MHC-I en la membrana (Figura S1D) y los niveles totales de proteína MHC-I (Figura S1E). Estos hallazgos sugieren que la infección por OV puede inducir la pérdida de MHC-I en las células diana no infectadas, lo que disminuye la citotoxicidad de las células T CD8+ y promueve la evasión inmunitaria.

La infección por OV induce el eje SREBP2-PCSK9 para degradar el MHC-I a través de la vía lisosomal

Para investigar cómo la infección por OV reduce la regulación de MHC-I, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) de las células DLD1 de control e infectadas con VSVΔ51. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) confirmó que la infección por VSVΔ51 aumenta la expresión de la vía de "regulación del proceso metabólico del colesterol" (Figura 2A). Evaluamos los niveles intracelulares de colesterol y encontramos una reducción significativa del contenido total y libre de colesterol en las células DLD1 y HCT116 tras la infección por VSVΔ51 (Figuras S2A y S2B). Estudios anteriores han demostrado que el regulador del metabolismo del colesterol PCSK9 desempeña un papel en la degradación lisosomal de MHC-I,^[14],^[17],^[18], lo que nos llevó a explorar el papel de PCSK9 en la pérdida de MHC-I regulada por la infección por VSVΔ51. Descubrimos que la infección por VSVΔ51 aumentó los niveles transcripcionales de PCSK9 y su factor de transcripción aguas arriba SREBP2 (Figura 2B). El análisis de inmunoblotaje confirmó que los niveles de SREBP2 y PCSK9 aumentaron notablemente, mientras que los niveles de MHC-I disminuyeron significativamente tras la infección por VSVΔ51 (Figura 2C). Además, la secreción de PCSK9 se estimuló mediante la infección viral con diferentes cepas de virus, incluidos VSVΔ51, VV y HSV (Figuras 2D y S2C).

A continuación, investigamos si el eje SREBP2-PCSK9 media en la regulación a la baja de MHC-I. La inhibición farmacológica de SREBP2 con fatostatina abolió la regulación al alza de PCSK9 tras la infección por VSVΔ51 (Figuras S2D y S2E), mientras que el tratamiento exógeno con IFNa2b no influyó en la expresión de PCSK9 (Figuras S2F y S2G), lo que establece que la infección por VSVΔ51 desencadena la expresión de PCSK9 a través de la activación de SREBP2. Luego, encontramos que el anticuerpo neutralizante de PCSK9 aprobado, alirocumab, rescató la regulación a la baja de MHC-I inducida por VSVΔ51, como se demostró mediante el análisis de inmunoblotaje (Figuras 2E y S2I) y la citometría de flujo (Figuras 2F y S2H). Generamos células HCT-116 con deleción de PCSK9 utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y descubrimos que la infección por VSVΔ51 no redujo la expresión de MHC-I en las células con deleción de PCSK9 (Figuras 2G y 2H). En consecuencia, tanto la inhibición farmacológica de SREBP2 mediante fatostatina (Figuras 2I y S2J) como el silenciamiento genómico de SREBP2 utilizando ARN de interferencia corto (Figuras 2J y 2K) invirtieron la regulación a la baja de MHC-I inducida por la infección por VSVΔ51. El análisis GSEA también reveló la regulación al alza de la "presentación y procesamiento de antígenos mediante MHC de clase I" tras la infección por VSVΔ51 (Figura 2L). El análisis cuantitativo de PCR demostró un aumento de los niveles transcripcionales de HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, TAPBP y TAP1 (Figuras 2M y S2K). El aumento transcripcional de la vía MHC-I sugiere que la regulación a la baja de MHC-I mediada por VSVΔ51 se produce en la fase postranscripcional. En los experimentos de persecución con cicloheximida (CHX), VSVΔ51 mejoró significativamente la velocidad de degradación de MHC-I (Figura 2N). Para examinar el mecanismo detallado de la degradación de MHC-I, se utilizaron el inhibidor del proteasoma MG132 y el inhibidor del lisosoma bafilomicina A1 (Baf-A1) para bloquear las vías de degradación de proteínas. Los resultados mostraron que Baf-A1, pero no MG132, rescató la regulación a la baja de MHC-I inducida por VSVΔ51 (Figuras 2O y S2L). En conjunto, estos datos demuestran que la infección por VSVΔ51 activa el eje SREBP2-PCSK9 para inducir la degradación lisosomal de MHC-I.

La inhibición de PCSK9 y el tratamiento con VSVΔ51 se combinan para suprimir múltiples modelos tumorales y remodelar el microambiente tumoral

Para determinar si la inhibición de PCSK9 podría mejorar el potencial terapéutico de los OV, evaluamos el efecto del anticuerpo anti-PCSK9 sobre la replicación y la oncolisis viral in vitro. Sin embargo, el tratamiento con alirocumab no influyó en la propagación viral (Figura S3A) ni en la replicación viral (Figuras S3B y S3C). El tratamiento con alirocumab tampoco amplificó la lisis oncolítica directa de VSVΔ51 (Figura S3D). A continuación, evaluamos el efecto combinado del anticuerpo anti-PCSK9 y VSVΔ51 in vivo. Los ratones portadores de tumores MC38 subcutáneos (inestabilidad de microsatélites [MSI]) fueron tratados con (1) VSVΔ51 intravenoso, (2) alirocumab intraperitoneal o (3) una combinación de VSVΔ51 y alirocumab (Figura 3A). La combinación de VSVΔ51/alirocumab redujo significativamente el volumen y el peso tumoral en comparación con cualquiera de las monoterapia (Figuras 3B–3D).

Los pacientes con CCRC estable en microsatélites (MSS) o con reparación deficiente del desajuste, que representan aproximadamente el 95% de todos los casos de CCRC, presentan bajas tasas de respuesta a la inmunoterapia.^[19] Por lo tanto, se utilizaron modelos tumorales sinérgicos de CT26 y Colon26 (MSS) para evaluar los efectos del potencial combinado del tratamiento con VSVΔ51/alirocumab. De manera consistente, el tratamiento con alirocumab también se sinergizó con VSVΔ51 para controlar el crecimiento tumoral y reducir la carga tumoral en los modelos tumorales subcutáneos de Colon26 (Figuras 3F–3H) y CT26 (Figuras 3J–3L). Las curvas de crecimiento tumoral mostraron que la combinación de VSVΔ51/alirocumab indujo la regresión tumoral en algunos ratones (20%), mientras que ningún animal del grupo de monoterapia presentó una remisión completa en el modelo de CT26 (Figura S3E).

Para caracterizar sistemáticamente las alteraciones inmunitarias inducidas por la combinación de VSVΔ51/PCSK9i, realizamos secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) en células CD45+ aisladas de tumores CT26. Clasificamos estos grupos en 11 tipos de células mediante marcadores específicos de tipo celular canónicos (Figura 3M). Al cuantificar la composición celular de las muestras, observamos que el tratamiento con VSVΔ51 aumentó la frecuencia de macrófagos; inesperadamente, la frecuencia de células T no difería significativamente entre los cuatro grupos (Figura 3N).

Centrándonos en el grupo de células T, el análisis de enriquecimiento de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) reveló que la vía de señalización del receptor de células T (TCR) se reguló al alza en el grupo de combinación en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 3O), lo que indica que la inhibición de PCSK9 alivia la supresión de la capacidad citotóxica de las células T inducida por el OV. Luego, reanalizamos los grupos de células T y obtuvimos 6 subgrupos funcionales (Figuras 3P y 3Q). En particular, el subconjunto CD8_Teff asociado con la citotoxicidad era abundante en el grupo de combinación (Figura 3R). La proporción de células T helper CD4 en el grupo de combinación disminuyó en comparación con el grupo de monoterapia con VSVΔ51 (Figura 3R). Estos resultados indican que las células T CD8+ mediaron principalmente la actividad antitumoral. Además, el análisis de pseudotiempo de los grupos de células T reveló que las células T del grupo de combinación ocupaban preferentemente estados de diferenciación más tempranos, en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura 3S).

Analizamos más a fondo las células asesinas naturales (NK) y los compartimentos de monocitos/macrófagos para obtener una visión completa de la remodelación del microambiente tumoral (TME) impulsada por la terapia de combinación. El análisis de aproximación y proyección de múltiples (UMAP) de las células NK mostró 7 subconjuntos distintos de células NK (Figura S4A). El tumor tratado con la combinación de PCSK9i/VSVΔ51 mostró una mayor población citotóxica (Gzma+) y una población de quimiocinas (Ccl5+) en comparación con el tumor tratado con VSVΔ51 (Figura S4B). Reagrupamos la población de monocitos/macrófagos e identificamos 9 subconjuntos distintos (Figura S4C). Las células de monocitos/macrófagos en el grupo de combinación contenían una mayor proporción de subconjuntos que reclutan neutrófilos (Cxcl2+) y una menor proporción de poblaciones que activan el complemento (C1qa) que el grupo de VSVΔ51 (Figura S4D). También observamos que el tratamiento de combinación redujo la puntuación M2^[20] de la polarización de los macrófagos en comparación con el grupo de VSVΔ51 (Figura S4E). Por lo tanto, la terapia de combinación reprograma los principales infiltrados inmunitarios desde un estado inducido por VSVΔ51 hacia un microambiente más activado y citotóxico.

La combinación de VSVΔ51 e inhibición de PCSK9 favorece las células T CD8+ de tipo "stem" y establece la memoria antitumoral.

Investigamos más a fondo qué células inmunitarias mediaron la actividad antitumoral de la combinación de VSVΔ51/alirocumab mediante experimentos de depleción in vivo utilizando anticuerpos contra las células T CD4+ y CD8+. Los anticuerpos de depleción eliminaron eficazmente las células T CD4+ y CD8+ (Figura 4A). Nuestros datos demostraron que la depleción de las células T CD8+ abolió en gran medida el efecto inhibidor de la combinación de VSVΔ51/alirocumab sobre el crecimiento tumoral, pero no las células T CD4+ (Figura 4B**). Estas observaciones nos llevaron a centrarnos en la inmunidad de las células T CD8+ tras la combinación de VSVΔ51/alirocumab y analizamos sistemáticamente las células T que infiltran los tumores utilizando citometría de flujo en los modelos CT26 y MC38 (Figura S5A). La combinación de VSVΔ51/alirocumab aumentó significativamente el porcentaje de células T CD8+ que infiltran el tumor y la expresión de interferón (IFN)-γ o granzima B en las células T CD8+ en comparación con el tratamiento único o el grupo de control (Figuras 4C, 4D, S5B y S5C). En resumen, estos datos indican que el anticuerpo anti-PCSK9 podría potenciar el efecto terapéutico in vivo de los OVs al mejorar la inmunidad de las células T CD8+.

Para determinar la durabilidad del efecto terapéutico de la combinación de VSVΔ51/PCSK9i, establecimos un modelo de retoterapia tumoral. A los ratones libres de tumores de la terapia de combinación VSVΔ51/alirocumab se les volvió a inocular con una dosis 2 veces mayor de células CT26 autólogas o células 4T1 heterólogas en el lado bilateral el día 50 después de la primera inoculación tumoral. A los ratones sanos de la misma edad se les inyectó el mismo número de células CT26 o 4T1 como grupo de control (Figura 4E**). En particular, todos los ratones libres de tumores rechazaron los tumores CT26 reintroducidos, pero no los tumores 4T1 (Figuras 4F y 4G). También se observó una regresión parcial de los tumores 4T1 en los ratones libres de tumores; sin embargo, todos los ratones sanos desarrollaron tumores CT26 y 4T1 después de la inoculación (Figuras 4F y 4G). Estos hallazgos indican que la combinación de VSVΔ51/alirocumab podría establecer una inmunidad tumoral específica duradera. También se analizó el perfil inmunitario de los órganos linfoides periféricos el día 50 en los ratones libres de tumores. Los ratones libres de tumores inducidos por el tratamiento de combinación mostraron porcentajes más altos de células T de memoria central CD4+ y CD8+ (TCM), mientras que las proporciones de células T de memoria efectora (TEM) permanecieron sin cambios en el bazo y los ganglios linfáticos drenantes (Figuras 4H y S5D).

Además, se aislaron células T CD3+ del bazo de los ratones mencionados anteriormente y se cocultivaron con células CT26 o 4T1 in vitro. Los ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) confirmaron que las células T del bazo derivadas de los ratones libres de tumores demostraron una mayor actividad citotóxica contra las células CT26 autólogas que las de los ratones sanos, mientras que no se observó tal efecto contra las células 4T1 heterólogas (Figura 4I). Tras la estimulación con células CT26, las células T del bazo de los ratones libres de tumores también mostraron proporciones significativamente mayores de células T CD8+ CD107a+, células T CD8+ Ki67+ y células T CD4+ Ki67+ en relación con los otros grupos (Figura 4J**). En conjunto, estos datos demuestran que la combinación de VSVΔ51/PCSK9i induce respuestas robustas de células T de memoria y una inmunidad tumoral específica duradera.

El VSV modificado que contiene scFv anti-PCSK9 exhibió una mayor replicación viral y tropismo tumoral.

Para aumentar la administración intratumoral del anticuerpo anti-PCSK9, generamos un VSV oncolítico recombinante para expresar un fragmento de anticuerpo de cadena variable única (scFv) anti-PCSK9 derivado de alirocumab y evolocumab, designado rVSV-Ali y rVSV-Evo, respectivamente (Figura 5A; Tabla S1). Analizamos la eficiencia de expresión de scFv en las células DLD1 después de la infección y descubrimos que tanto rVSV-Ali como rVSV-Evo podían expresar eficientemente el scFv en las células tumorales infectadas (Figuras 5B y 5C). rVSV-Ali o rVSV-Evo invirtieron la regulación a la baja de MHC-I inducida por la infección con VSVΔ51 (Figura 5D). Además, el CM de las células infectadas con rVSV-Ali o rVSV-Evo mejoró significativamente el MHC-I de la superficie en las células tumorales (Figura 5E), lo que indica la liberación de scFv.

Luego, evaluamos la capacidad de replicación y la eficacia oncolítica de rVSV-Ali y rVSV-Evo. El ensayo de placa reveló que rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron títulos virales más altos que VSVΔ51, especialmente en las células DLD1 y HCT116 (Figura 5F). Además, rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron una mayor actividad oncolítica in vitro a una baja concentración de infección (MOI) que el VSVΔ51 parental (Figura 5G).

Nuestros datos demostraron que la adición extracelular del anticuerpo PCSK9 no influyó en la replicación viral (Figuras S3A-S3C). Sin embargo, rVSV-Ali y rVSV-Evo exhibieron una cinética de replicación viral más alta que el VSVΔ51 parental (Figura 5F**). Estudios previos han sugerido que el PCSK9 intracelular puede modular las vías de IFN de tipo I.^[21],^[22] Por lo tanto, medimos la expresión de IFNB1 y los genes estimulados por IFN (ISG) después de la infección viral. rVSV-Ali y rVSV-Evo restringieron significativamente la transcripción de IFNB1, ISG15 y CXCL10, en comparación con VSVΔ51 (Figura S6A). La eliminación de PCSK9 también suprimió la mejora de la transcripción de IFNB1, ISG15 y CXCL10 inducida por la infección con VSVΔ51 (Figura S6B). En consecuencia, la eliminación de PCSK9 mejoró la replicación viral de VSVΔ51 (Figuras S6C y S6D), lo que se revirtió con el tratamiento con IFNa2b exógeno (Figuras S6C y S6D). Estos hallazgos sugieren que rVSV-Ali y rVSV-Evo inhiben la vía de IFN al neutralizar el PCSK9 intracelular, lo que promueve la cinética de replicación viral.

Analizamos más a fondo la replicación viral y el tropismo tumoral de rVSV-Ali/Evo in vivo. Establecimos un modelo de tumor subcutáneo CT26 e inyectamos por vía intravenosa VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo, respectivamente. La detección de ARN viral reveló un aumento de la expresión de la proteína G del virus del estomatitis vesicular (VSV-G) en los tejidos tumorales de los grupos rVSV-Ali y rVSV-Evo en comparación con el grupo VSVΔ51 (Figura 5H). Sin embargo, no hubo cambios significativos en los tejidos normales, incluidos el riñón, el hígado, el pulmón, el corazón y el bazo (Figura 5H). El análisis de inmunoblotting de los tejidos tumorales reveló que el tratamiento con VSVΔ51 indujo la regulación al alza de PCSK9 y SREBP2 y redujo la expresión de MHC-I y LDLR, mientras que rVSV-Ali/Evo restauró la expresión de MHC-I y mejoró la proteína viral VSV-G (Figura 5I). No se observaron cambios significativos en la expresión de SREBP2, PCSK9 o LDLR en los tejidos hepáticos (Figura 5J**). Además, el tratamiento con rVSV-Ali elevó significativamente el nivel de colesterol específicamente en los tejidos tumorales, pero no afectó el colesterol hepático o sérico (Figura 5K). En contraste, el tratamiento de combinación VSVΔ51/alirocumab ejerció un efecto sistémico sobre la homeostasis del colesterol, reduciendo los niveles de colesterol sérico y aumentando los niveles de colesterol hepático (Figura 5K). No se observó ninguna diferencia significativa en el control tumoral entre el tratamiento con rVSV-Ali y la combinación de VSVΔ51/alirocumab en el modelo de tumor CT26 (Figuras S6E-S6H). Estos resultados indican que rVSV-Ali/Evo podría revertir la pérdida de MHC-I inducida por VSVΔ51, lo que permite la administración local del scFv anti-PCSK9 en el TME y evita la posible hepatotoxicidad.

El VSV modificado con scFv anti-PCSK9 potencia las células T CD8+ de tipo "stem" de memoria.

A continuación, evaluamos si rVSV-Ali/Evo exhibió una eficacia terapéutica superior en comparación con el VSVΔ51 parental in vivo. En los modelos subcutáneos de tumor MC38 y CT26, los ratones tratados con rVSV-Ali o rVSV-Evo mostraron un control tumoral significativamente mejorado, lo que se evidenció por volúmenes tumorales y pesos tumorales marcadamente reducidos en comparación con el grupo de control o VSVΔ51 (Figuras 6A-6H). Un estudio reciente verificó que las células de CPDA con alta expresión de PCSK9 colonizan preferentemente los tejidos pulmonares.^[23] Para determinar si rVSV-Ali y rVSV-Evo exhiben una eficacia terapéutica superior en el modelo de metástasis pulmonar, establecimos un modelo de metástasis pulmonar CT26-luc (Figura 6I). Los resultados experimentales demostraron que los ratones tratados con rVSV-Ali o rVSV-Evo tenían una carga tumoral significativamente reducida (Figuras 6J y 6L) y exhibieron una probabilidad de supervivencia sustancialmente mayor (Figura 6K**) en comparación con el grupo de tratamiento con VSVΔ51.

Para dilucidar aún más los efectos de rVSV-Ali y rVSV-Evo sobre el microambiente inmunitario tumoral, analizamos los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) en el modelo de tumor subcutáneo CT26 (Figura S7A). El tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo aumentó significativamente el porcentaje de células T CD8+ que infiltran el tumor y la expresión de IFN-γ y granzima B en las células T CD8+ (Figura 6M). La proporción de Tregs dentro de las células T CD4+ aumentó modestamente después del tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo; sin embargo, la relación Teff/Treg se mantuvo significativamente elevada en comparación con el grupo VSVΔ51 (Figura 6M). Estos datos indican que rVSV-Ali y rVSV-Evo podrían potenciar el efecto terapéutico in vivo al mejorar la inmunidad de las células T CD8+. Además, tanto rVSV-Ali como rVSV-Evo indujeron una proporción más alta de células precursoras de memoria CD127hi que el tratamiento con VSVΔ51 (Figura S8A). En consecuencia, TCF7, un factor de transcripción crítico para la formación de células T CD8+ de memoria central, también se reguló al alza en los grupos rVSV-Ali y rVSV-Evo (Figura S8B). Observamos que la TCM era casi indetectable en los TIL, mientras que las células TEM CD4+ o CD8+ aumentaron significativamente después del tratamiento con VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo (Figuras S8C y S8D).

Para abordar aún más si rVSV-Ali y rVSV-Evo podrían activar el desarrollo de la memoria inmunitaria a largo plazo, analizamos a continuación los linfocitos esplénicos. Coherente con el perfil inmunológico observado en las células TIL, el tratamiento con rVSV-Ali o rVSV-Evo aumentó significativamente la expresión de Granzima B en las células T CD8+ y mejoró la proporción de células precursoras de memoria CD127hi o TCF7hi (Figuras 6N, S8E y S8F). La proporción de células TEM dentro de los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ se elevó concomitantemente en todos los tratamientos (Figuras 6O y S8G). Curiosamente, el tratamiento con VSVΔ51 redujo la fracción de células TCM dentro de las células T CD4+ y CD8+, mientras que rVSV-Ali y rVSV-Evo restauraron notablemente la población de células TCM (Figuras 6O y S8G). Los hallazgos mencionados anteriormente indicaron que rVSV-Ali/Evo no solo activó una robusta inmunidad antitumoral, sino que también promovió el desarrollo de la memoria inmunológica a largo plazo.

VSV modificado con scFv anti-PCSK9 mejoró la eficacia de la terapia anti-PD-1

El bloqueo de puntos de control inmunitario basado en inhibidores de PD-1 ha demostrado avances prometedores en el manejo clínico del CRC; sin embargo, su efecto terapéutico se limita a la mayoría de los pacientes con CRC MSS.^[24],^[25],^[26] Para determinar si el VSV recombinante podría mejorar la eficacia terapéutica de la terapia anti-PD-1 en el modelo de CRC MSS, tratamos ratones portadores de CT26 con VSVΔ51, rVSV-Ali o rVSV-Evo, en combinación con un anticuerpo anti-PD-1, y comparamos los resultados terapéuticos (Figura 7A). Nuestros resultados demostraron que rVSV-Ali o rVSV-Evo en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 (rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1) conferían una eficacia terapéutica superior en comparación con otros grupos en el modelo tumoral CT26 (Figuras 7B y 7C). Este régimen de tratamiento condujo a una reducción significativa de la masa tumoral y logró una tasa de respuesta completa del 50% (4 de 8 ratones; Figuras 7B y 7C).

Perfilamos simultáneamente la reprogramación inmunitaria tanto en el tumor como en el bazo después de la terapia de combinación con rVSV-Ali/Evo modificado. En el análisis de las células TIL del modelo subcutáneo de CT26, el tratamiento con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 no indujo un aumento significativo en la infiltración y la actividad funcional de las células T CD8+, en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura S9A). Se observó una mejora en la proporción de células precursoras de memoria CD8+ CD127hi y TCF7hi en los grupos rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura S9B). Sin embargo, no hubo cambios significativos en las fracciones de células TEM CD4+ y CD8+ dentro de las células TIL (Figura S9C). Estos resultados demuestran que rVSV-Ali/Evo muestran un mayor potencial en la activación de la memoria inmunitaria a largo plazo que VSVΔ51 en combinación con la terapia anti-PD-1.

En el análisis de los linfocitos esplénicos, el tratamiento con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 no mejoró significativamente la población o función de las células T CD8+ (Figura S9D), pero aumentó notablemente las células precursoras de memoria CD127hi y TCF7hi en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura 7D). Además, los tratamientos con rVSV-Ali + anti-PD-1 o rVSV-Evo + anti-PD-1 también atenuaron la reducción de TCM inducida por el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1, pero no indujeron cambios significativos en las células TEM en comparación con el grupo VSVΔ51 + anti-PD-1 (Figura 7E). Además, los experimentos de re-inoculación tumoral (Figura S9E) revelaron que los ratones curados por el tratamiento combinado con VSV modificado con scFv anti-PCSK9 y un anticuerpo anti-PD-1 rechazaron por completo los tumores CT26 re-inoculados, pero no los tumores 4T1 (Figuras S9F–S9K). Se observó una regresión parcial de los tumores 4T1 en los ratones libres de tumores, mientras que todos los ratones no tratados desarrollaron tumores CT26 y 4T1 después de la inoculación (Figuras S9F–S9K).

Para explorar aún más el potencial clínico de rVSV-Ali como terapia de combinación para el tratamiento anti-PD-1, establecimos un modelo de ratón humanizado injertado con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) inyectando 1 × 107 PBMC por vía intravenosa en ratones NOD-IL2Rγnull (NSG); 1 semana después, se inyectaron 5 × 106 células HCT116 por vía subcutánea (Figura 7F). Tres semanas después de la infusión de PBMC, la citometría de flujo de la sangre periférica del ratón mostró un aumento marcado en las células CD45+ humanas, lo que confirmó un injerto exitoso (Figura S10A). Luego, los ratones portadores de tumores se sometieron a los tratamientos indicados. En particular, la combinación de rVSV-Ali y un anticuerpo anti-PD-1 logró la eficacia terapéutica más potente, lo que condujo a una regresión tumoral marcada y una tasa de respuesta completa del 80% (4 de 5 ratones; Figuras 7G y 7H). En conjunto, estos hallazgos destacan el prometedor potencial de traslación de rVSV-Ali en combinación con el bloqueo del punto de control PD-1.

Discusión

Los virus oncolíticos (VO) pueden mediar la lisis tumoral directa y remodelar el microambiente tumoral frío (TME) al mejorar la inmunidad antitumoral y disminuir la inmunosupresión. Sin embargo, las respuestas inmunitarias antitumorales a los VO no son sostenidas. Las consecuencias inmunitarias de la terapia oncolítica siguen siendo insuficientemente comprendidas.^[1] Aquí, identificamos la inducción de PCSK9 después de la infección viral como un regulador negativo de la inmunidad de las células T a través de la degradación del MHC-I en las células tumorales. Nuestros resultados demuestran que la focalización de PCSK9 puede potenciar la viroterapia oncolítica al promover el desarrollo de células T CD8+ efectoras y de memoria.

La presentación de MHC es el mecanismo principal por el cual el sistema inmunitario adaptativo supervisa las infecciones virales. En consecuencia, muchos virus han evolucionado estrategias sofisticadas de evasión inmunitaria que se dirigen específicamente a las vías de MHC. Estudios previos han demostrado que ciertos virus, como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)^[27] y el virus herpes asociado al sarcoma de Kaposi^[28],^[29], pueden reducir la expresión de MHC-I en las células huésped. Inversamente, se ha informado que el HSV oncolítico reprograma el TME y aumenta la expresión de MHC-II en las células tumorales in vivo, lo que contribuye potencialmente a las células T CD4+ polifuncionales para el control tumoral y las respuestas de recuerdo.^[30] En este estudio, demostramos que la infección por VO disminuye el reconocimiento TCR-MHC-I, lo que permite la evasión inmunitaria de las células tumorales.

En nuestro estudio, la infección por VO desencadena la secreción de PCSK9, lo que conduce a la degradación lisosomal de MHC-I. Coherente con informes previos, la sobreexpresión de PCSK9 promueve la degradación lisosomal de MHC-I.^[14] Una ventaja clave de la focalización de PCSK9 es la disponibilidad del anticuerpo neutralizante de PCSK9 aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos, alirocumab. Análisis cinéticos previos revelaron que evolocumab se une a PCSK9 murino con una Kd de 17 nmol/L, aproximadamente 1000 veces menor afinidad que para PCSK9 humano (Kd = 16 pmol/L). Alirocumab conserva una reactividad cruzada modesta, exhibiendo una reducción de 4,5 veces en la afinidad por PCSK9 murino (Kd = 2,61 nmol/L) en comparación con PCSK9 humano (Kd = 0,58 nmol/L).^[13] En consecuencia, se eligió alirocumab como el agente preferido para los estudios in vivo en ratones. Tanto en los tumores inestables en microsatélites (MC38) como en los tumores MSS (CT26 y Colon26), alirocumab potenció notablemente la eficacia de VSVΔ51 in vivo al provocar respuestas de células T CD8+ antitumorales. Esta inmunidad antitumoral específica persistió a largo plazo en los ratones libres de tumores. Curiosamente, la terapia de combinación demostró una eficacia superior en los tumores MSS (CT26 y Colon26) en comparación con los tumores MSI-alto (MC38), un efecto posiblemente atribuible a los diferentes niveles basales de expresión de PCSK9 en estos tipos de tumores. En conjunto, estos datos indican que la inhibición de PCSK9 combinada con VSVΔ51 constituye una estrategia eficaz para los tumores resistentes a la inmunoterapia convencional.

Tanto rVSV-Ali como rVSV-Evo exhibieron una eficacia antitumoral notablemente superior en comparación con VSVΔ51. Curiosamente, rVSV-Ali exhibió una eficacia terapéutica superior a rVSV-Evo en múltiples modelos de ratones portadores de tumores. Esto puede atribuirse a la mayor afinidad de alirocumab por PCSK9 murino que la de evolocumab.^[13] Inesperadamente, rVSV-Ali y rVSV-Evo demostraron una mayor cinética de replicación viral que VSVΔ51. Esta diferencia probablemente se deba a la supresión de PCSK9 endógeno por el VSV recombinante. Coherente con nuestros hallazgos, estudios recientes han demostrado que PCSK9 intracelular puede promover las respuestas de interferón de tipo I en las células tumorales.^[21],^[22]

La ingeniería de VO para expresar scFv anti-PCSK9 ofrece varias ventajas clave: (1) mejora la durabilidad de la inmunidad de las células T CD8+ antitumorales al contrarrestar la reducción mediada por VO y restaurar la presentación del antígeno MHC-I, (2) promueve la cinética de replicación viral y la persistencia dentro de las células tumorales al mitigar la respuesta de interferón de tipo I, (3) permite la administración intratumoral eficiente del agente anti-PCSK9 al tiempo que reduce la exposición sistémica y la posible hepatotoxicidad asociada con la terapia con anticuerpos convencionales, y (4) supera directamente la degradación de MHC-I, un mecanismo importante de escape inmunitario desencadenado por la infección de VO de las células tumorales.

En resumen, demostramos que los VO ejercen un efecto regulador negativo sobre la inmunidad de las células T. La focalización de PCSK9 mejora notablemente la eficacia terapéutica de los VO contra el CRC, un efecto atribuible a la reprogramación de la inmunidad de las células T mediada por el anticuerpo anti-PCSK9. En conjunto, este estudio destaca el potencial de las estrategias dirigidas a PCSK9 para potenciar la terapia con VO y ofrece un enfoque para el tratamiento del CRC.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio actual presenta algunas limitaciones. Primero, la ingeniería de VO en este estudio utilizó la plataforma VSV. Sin embargo, los VO aprobados clínicamente son predominantemente virus de ADN. Es imperativo expresar el scFv dirigido a PCSK9 en virus oncolíticos de ADN y evaluar la eficacia terapéutica y la virulencia viral. Segundo, la administración intravenosa de VO sigue siendo el método predeterminado para acceder a las metástasis, pero la neutralización sistémica limita la eficacia.^[31] Las estrategias de nanocamuflaje previas han superado esta limitación.^[32],^[33] Si bien el estudio anterior utilizó virus desnudos para establecer la prueba de concepto, las iteraciones futuras integrarán dichas plataformas de administración para preservar la biodisponibilidad sistémica sin sacrificar la seguridad. Tercero, no podemos descartar por completo la posibilidad de que la inhibición de PCSK9 aumente la inmunidad antitumoral remodelando el metabolismo del colesterol. El impacto específico de la remodelación del colesterol en la función de las células inmunitarias se investigará más a fondo.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio actual presenta algunas limitaciones. Primero, la ingeniería de VO en este estudio utilizó la plataforma VSV. Sin embargo, los VO aprobados clínicamente son predominantemente virus de ADN. Es imperativo expresar el scFv dirigido a PCSK9 en virus oncolíticos de ADN y evaluar la eficacia terapéutica y la virulencia viral. Segundo, la administración intravenosa de VO sigue siendo el método predeterminado para acceder a las metástasis, pero la neutralización sistémica limita la eficacia.^[31] Las estrategias de nanocamuflaje previas han superado esta limitación.^[32],^[33] Si bien el estudio anterior utilizó virus desnudos para establecer la prueba de concepto, las iteraciones futuras integrarán dichas plataformas de administración para preservar la biodisponibilidad sistémica sin sacrificar la seguridad. Tercero, no podemos descartar por completo la posibilidad de que la inhibición de PCSK9 aumente la inmunidad antitumoral remodelando el metabolismo del colesterol. El impacto específico de la remodelación del colesterol en la función de las células inmunitarias se investigará más a fondo.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Las solicitudes de información y recursos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Fan Xing (xingfan@gdph.org.cn), y serán atendidas por este.

Disponibilidad de materiales

Los plásmidos y el VSV modificado generados en este estudio están disponibles a través del contacto principal con un acuerdo de transferencia de materiales completado.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación sin procesar informados en este artículo se han depositado en el NCBI Sequence Read Archive (SRA) bajo el BioProject: PRJNA1392047 y estarán disponibles públicamente a partir de la fecha de publicación.
•No se generó código original para este estudio. Todo el software y los algoritmos utilizados en este estudio se han divulgado y citado en la sección de Métodos STAR.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este artículo está disponible a través del contacto principal a pedido.

Contacto principal

Las solicitudes de información y recursos adicionales deben dirigirse al investigador principal, Fan Xing (xingfan@gdph.org.cn), quien se encargará de atenderlas.

Disponibilidad de materiales

Los plásmidos y los VSV modificados genéticamente generados en este estudio están disponibles a través del investigador principal, previa presentación de un acuerdo de transferencia de materiales.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación sin procesar que se presentan en este artículo se han depositado en el NCBI Sequence Read Archive (SRA) bajo el identificador BioProject: PRJNA1392047 y estarán disponibles públicamente a partir de la fecha de publicación.•No se generó ningún código original para este estudio. Todo el software y los algoritmos utilizados en este estudio se han divulgado y citado en la sección de Métodos STAR.•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se presentan en este artículo está disponible a través del investigador principal, previa solicitud.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la 10.13039/100014718 National Natural Science Foundation of China (82173829 a F.X. y 32370836 a Y. Li), 10.13039/501100013111 Guangdong Special Support Program for Young Top Talents (2023TQ07Y333 a F.X.), 10.13039/501100021171 Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2024A1515012829 a Y. Li), Research Project establecido por 10.13039/501100004433 Chinese Pharmaceutical Association hospital pharmacy department (CPA-Z05-ZC-2025002 a X.X.), y Youth Talent Development Grand de 10.13039/501100010096 Southern Medical University (G623281132 a F.X.).

Contribuciones de los autores

F.X., Y. Li y H.F. diseñaron este estudio; Y.Z., Z.H., H.F. y M.C. realizaron los experimentos; J. Zhou, Y. Liu, W.H. y H.F. llevaron a cabo el análisis de secuenciación de ARN de células individuales y de grupos celulares; Y.Z., X.X., X.G. y D.W. analizaron e interpretaron los datos; Y.Z., J. Zheng y Z.L. redactaron el manuscrito; F.X., Y. Li y H.F. editaron el manuscrito; F.X. y Y. Li supervisaron el estudio; y F.X. es el garante del estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. H.F., Y.Z., Z.H., J. Zhou y Y. Liu contribuyeron por igual a este trabajo.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Animales

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J, BALB/c y BALB/c nude (de 4 a 8 semanas de edad) de GDMLAC y Rise mice, y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) (25 °C–27 °C, 50 % de humedad, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas). Los ratones se aclimataron durante al menos 5 días antes de la experimentación. El cuidado de los animales y los experimentos se realizaron estrictamente de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" y los "Principios para la utilización y el cuidado de animales vertebrados" y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong (KY-N-2022-129-02).

Líneas celulares

Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de ATCC, Procell y Meisen, incluidas una variedad de líneas celulares de CCRC, como DLD1 y HCT116, así como las líneas celulares de CCRC murinas CT26, Colon26 y MC38, y la línea celular de carcinoma mamario murino 4T1. Cada línea celular se mantuvo en condiciones de cultivo estándar, que implicaron la incubación en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 a una temperatura de 37 °C. Se cultivaron en medio DMEM o RPMI 1640, ambos de Procell, suplementados con 10 % de suero bovino fetal (FBS, de Vazyme) y un cóctel de antibióticos que comprende 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las líneas celulares se autenticaron mediante el método de repetición en tándem (STR) y se comprobó que eran negativas para las contaminaciones por micoplasma.

Detalles del método

Generación de linfocitos T citotóxicos a partir de ratones OT-1

Se recolectaron y procesaron esplenocitos de ratones OT-1 utilizando métodos asépticos. Se utilizó el tampón de lisis de glóbulos rojos para lisar los glóbulos rojos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, los esplenocitos se centrifugaron, se resuspendieron a una concentración de 1 × 106 células/mL en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de FBS, 1 % de antibióticos, 2-mercaptoetanol, junto con 10 nmol/L de péptido OVA y 10 ng/mL de IL-2 humana recombinante, y se incubaron durante 3 días. Después de esto, las células se cultivaron posteriormente en medio fresco con 10 ng/mL de IL-2 durante 2 días adicionales en preparación para experimentos posteriores.

VSV inactivados con UV

Se colocaron 500 μL del medio acondicionado después de la infección con VSVΔ51 en una placa de 12 pocillos sobre hielo y se expusieron a luz UV-C de 254 nm (CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP) a 1 J cm-2 (≈10 min a 10 mW cm-2) con una agitación suave cada 2 min para garantizar una exposición uniforme. Después de la irradiación, se añadieron inmediatamente 10 μL a una monocapa de células BHK-21 en una placa de 12 pocillos y se incubaron durante 48 h; la ausencia de efecto citopático bajo el microscopio confirmó la pérdida completa de partículas infecciosas.

Transferencia de genes y construcción de líneas celulares estables

Se transfectaron células HEK293T con el vector principal, psPAX2 y pMD2.G (relación 4:3:1) utilizando 10 mg/mL de polietilenimina, y el medio se renovó 8 horas después. Después de 48 horas, se recolectaron los sobrenadantes lentivirales, se centrifugaron (2000 rpm, 10 min) y se filtraron (0,45 μm). Las células DLD1 y HCT116 se expusieron al virus durante 8 horas y luego se seleccionaron con puromicina (DLD1: 2 μg/mL; HCT116: 1,5 μg/mL) durante 7 a 10 días para formar líneas estables.

Construcción de VSV recombinantes

Para construir rVSV-Ali y rVSV-Evo, las secuencias de codificación de scFv anti-PCSK9 (Tabla S1) se insertaron en el genoma de VSV entre la glicoproteína de VSV (proteína G) y la proteína polimerasa (proteína L) utilizando los sitios de enzimas de restricción NheI (Thermo Fisher, ER0972) y XhoI (Thermo Fisher, ER0691). El genoma de VSV alberga una sustitución M51R en el gen de la matriz (M), lo que atenúa la virulencia neural de la cepa original.

Luego, rVSV-Ali y rVSV-Evo se rescataron del plásmido de ADN complementario pXN2 utilizando el sistema de genética inversa establecido en células BHK. En resumen, las células BHK se infectaron con virus de la vacuna recombinante que produce la ARN polimerasa T7 (rVV-T7) a una MOI de 1. Las células se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. Después de 2 horas, las células se transfectaron con el plásmido genómico de VSV pVSV-XN2, pBluescript (pBS) que codifica VSV-N, pBS que codifica VSV-P y pBS que codifica las proteínas VSV L utilizando el reactivo de lipofectamina 2000. Las células se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 48 horas. Después de 48 horas, se recolectó el sobrenadante y se clarificó pasándolo a través de un filtro de 0,2 μm. Luego, rVSV-Ali y rVSV-Evo se expandieron y titularon en células Vero, y luego se determinó el título del virus recombinante utilizando un ensayo de placa.

Modelos animales

Se obtuvo la aprobación del Comité de Ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong. Se inyectaron células CT26 (2 × 106 en 100 μL de PBS) por vía subcutánea en los flancos traseros de ratones hembra BALB/c de 6 semanas de edad. En el día 6, los ratones se dividieron en cuatro grupos y se les administró alirocumab (10 mg/kg, 5 dosis) por vía i. p. con o sin VSVΔ51 (3 × 107 unidades formadoras de placa/ratón) por vía i. v. Para Colon26 (2 × 106 en 100 μL de PBS) o MC38 (8 × 105 en 100 μL de PBS), se repitió el procedimiento en ratones hembra BALB/c o C57BL/6 de 6 semanas de edad. Se midieron las dimensiones del tumor, y el volumen se calculó como (longitud × ancho2)/2.

Se establecieron ratones PBMC humanizados mediante la inyección intravenosa de 1 × 107 células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) recién aisladas en ratones NSG (NOD-scid IL2Rγnull) de 6 a 8 semanas de edad. El injerto se confirmó mediante la detección por citometría de flujo de células CD45+ humanas en sangre periférica en la semana 3 posterior a la trasplantación.

Imagen de bioluminiscencia en ratones

Se implantaron ratones con CT26 que expresaban luciferasa. Se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con una solución de luciferina (15 mg/mL en DPBS, dosis de 150 mg/kg). Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron utilizando el sistema IVIS Lumina y se analizaron con el software Living Image.

Secuenciación de ARN y análisis de datos de transcriptómica

Se extrajo el ARN total de las células DLD1 utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies). Las muestras se enviaron a Shanghai Biotechnology Corporation para el análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq). Se realizó un análisis funcional de los genes expresados diferencialmente mediante el análisis de enriquecimiento genómico (GO) y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA).

Análisis de secuenciación de ARN de células individuales

Los datos brutos de secuenciación de ARN de células individuales se analizaron en R utilizando Seurat (v4.2). Para cada muestra, se crearon objetos Seurat a partir de matrices de recuento de genes y células, y se filtraron para eliminar las células/dopletes de baja calidad utilizando criterios de control de calidad consistentes (nFeatureRNA 200–6000, nCountRNA 500–50000, percent.mt < 10 %; se eliminaron los genes expresados en