La proteómica de las vesículas extracelulares plasmáticas identifica posibles biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento con 177Lu-PSMA-617 en pacientes con cáncer de próstata metastásico.

El 177Lu-PSMA-617 ha redefinido el panorama terapéutico del cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC), introduciendo una nueva clase de terapias dirigidas a proteínas, distintas de las terapias hormonales y quimioterapias tradicionales que han servido durante mucho tiempo como el estándar de atención para la enfermedad avanzada.^[1] Al unir un ligando PSMA-617 que se une al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) al isótopo de lutecio-177 emisor de beta, esta terapia administra radiación que daña el ADN a las células tumorales que expresan PSMA, al tiempo que generalmente preserva el tejido sano circundante.^[2] Los ensayos clínicos, incluidos VISION, PSMAfore y PSMAddition, han demostrado que el 177Lu-PSMA-617 mejora significativamente los resultados clínicos, estableciendo su papel en múltiples etapas de la enfermedad.^[3],^[4],^[5] A pesar de este avance, las respuestas terapéuticas al 177Lu-PSMA-617 siguen siendo heterogéneas, y un subconjunto de pacientes presenta resistencia primaria.^[6] Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de identificar biomarcadores que puedan predecir la eficacia terapéutica y guiar la selección de pacientes más allá del uso de los parámetros de imagen PSMA-PET (tomografía por emisión de positrones) por sí solos.^[7],^[8]

Si bien ciertas alteraciones genómicas se han relacionado con la resistencia a las terapias de radiación, incluido el 177Lu-PSMA-617, los factores que impulsan la enfermedad siguen siendo desconocidos.^[9],^[10] Esta laguna es crítica, dado el aumento de los agentes dirigidos a proteínas en el panorama terapéutico del cáncer de próstata, incluidos los tratamientos con radioligandos, los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) y los activadores de células T bispecíficos que explotan los marcadores de la superficie celular, como PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1.^[11],^[12],^[13],^[14] Sin embargo, la cuantificación de estas proteínas en la circulación ha sido muy difícil debido a la abundancia de proteínas plasmáticas circulantes, como la albúmina y las inmunoglobulinas, que dificultan la detección de marcadores derivados del tumor.^[15]

Los vesículos extracelulares plasmáticos (EV) representan un prometedor enfoque de biopsia líquida para superar las limitaciones de los biomarcadores basados en sangre actuales.^[16] Estas nanopartículas membranosas, secretadas por todas las células (incluidas las células tumorales), contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos que reflejan el estado molecular de su célula de origen.^[17],^[18] Los avances recientes en el aislamiento de EV, particularmente mediante ultracentrifugación diferencial, combinados con las mejoras en la sensibilidad de la espectrometría de masas, junto con la espectrometría de masas de adquisición independiente de datos (DIA-MS), han ganado terreno por su capacidad para cuantificar de manera integral las proteínas en un rango dinámico.^[19],^[20] A diferencia de los métodos de adquisición de datos convencionales, que fragmentan selectivamente los péptidos más abundantes, los métodos DIA fragmentan sistemáticamente todos los péptidos dentro de ventanas de masa definidas, capturando un perfil proteómico más completo e imparcial. Este enfoque mejora la sensibilidad para las proteínas de baja abundancia y mejora la reproducibilidad entre las muestras, lo que lo hace particularmente adecuado para fuentes complejas y de baja entrada, como los EV derivados del plasma.^[21],^[22]

Además, las células tumorales circulantes (CTC) representan una modalidad alternativa de biopsia líquida para la detección, la predicción del pronóstico y el seguimiento del tratamiento no invasivos de los pacientes con mCRPC.^[23],^[24],^[25],^[26] Los avances recientes, incluida la integración de la microfluídica inercial, la microscopía holográfica digital y la inmunofluorescencia, han permitido la detección de CTC de alto rendimiento y sin etiquetar con una mayor sensibilidad y especificidad.^[27]

Aquí, hipotetizamos que el análisis proteómico profundo de los EV plasmáticos utilizando una proteómica basada en DIA-MS imparcial podría descubrir biomarcadores de sensibilidad y resistencia en pacientes que reciben 177Lu-PSMA-617. Para probar esto, realizamos un estudio de biomarcadores prospectivo de 100 pacientes con mCRPC. Investigamos objetivos clave de la superficie celular, incluidos PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1; identificamos proteínas y vías enriquecidas en el tumor; enumeramos las subpoblaciones de CTC positivas para PSMA; y probamos la utilidad clínica de estos biomarcadores para predecir los resultados del tratamiento con 177Lu-PSMA-617.

Resultados

Cohorte de pacientes

Se inscribieron prospectivamente 100 pacientes con mCRPC antes del tratamiento con 177Lu-PSMA-617 (Figura 1). Las características basales de los pacientes se resumen en la Tabla 1. También inscribimos 20 controles masculinos sin cáncer con una edad media de 60 años (rango, 54–75). La edad media en el momento de la inscripción de los 100 pacientes con mCRPC fue de 74 años (rango, 44–94), y el nivel medio de PSA basal fue de 54,5 ng/mL (rango, 1,42–5000). Se observaron grupos de grado de Gleason 1-3 en el 16% de los pacientes, grado 4 en el 16% y grado 5 en el 47%, con un 21% de los pacientes que presentaban un grado de Gleason desconocido. La mayoría de los pacientes presentaban metástasis óseas (91%), el 63% presentaba afectación de los ganglios linfáticos y el 12% presentaba metástasis viscerales (hígado y pulmón). El volumen tumoral molecular (MTV) medio basal fue de 91,2 cm3 (rango, 2,00–983,06), con un valor medio de captación estándar (SUVmean) y un valor máximo de captación estándar (SUVmax) de 7,97 (rango, 1,52–61,78) y 33,4 (rango, 8,42–401,64), respectivamente, en la PET-TC con PSMA. El estado de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG) de 0-1 se observó en el 79% de los pacientes. La mayoría de los pacientes (72%) habían recibido tres o más terapias sistémicas que prolongan la vida, incluidos los inhibidores de la vía del receptor de andrógenos (abiraterona 67%, enzalutamida 62%, apalutamida 11%, darolutamida 15%) y los agentes de quimioterapia (docetaxel 85%, cabazitaxel 30%). En la cohorte de mCRPC tratada, la mediana de la supervivencia libre de progresión (PFS) fue de 212 días (rango, 32–648), mientras que la tasa de respuesta PSA50 fue del 44%. Los pacientes recibieron entre 1 y 6 dosis administradas, con un 13% que recibió 1 dosis, un 14% que recibió 2 dosis, un 12% que recibió 3 dosis, un 16% que recibió 4 dosis, un 7% de los pacientes que recibió 5 dosis y un 38% que recibió las 6 dosis.

Parámetros de imagen PSMA-PET y resultados

Investigamos los parámetros estándar de PSMA-PET que a veces se utilizan para ayudar en la toma de decisiones clínicas, lo que puede afectar los resultados.^[28],^[29] En nuestra cohorte, un SUVmean basal más alto no se asoció con una mayor PFS (razón de riesgos [HR] = 0,65, intervalo de confianza [IC] del 95%: 0,41–1,03, p = 0,066) o supervivencia general (OS) (HR = 0,78, IC del 95%: 0,45–1,36, p = 0,385) (Figura S2A), aunque se observaron tendencias sugestivas. Un SUVmax más alto se asoció con una mejor PFS (HR = 0,54, IC: 0,34–0,88, p = 0,013), pero no con la OS (HR = 0,72, IC del 95%: 0,41–1,26, p = 0,249) (Figura S2B). Luego, investigamos el impacto de la carga de MTV en los pacientes que recibieron 177Lu-PSMA-617. En nuestra cohorte, una alta carga de MTV se asoció con una peor PFS (HR = 1,61, IC del 95%: 1,02–2,54, p = 0,039) y predijo una OS significativamente peor (HR = 2,49, IC del 95%: 1,40–4,42, p = 0,002) (Figura S2C). Si bien la carga de MTV fue el mejor parámetro de imagen para predecir los resultados de la supervivencia, sigue siendo poco práctico para los pacientes con metástasis extensas debido a la necesidad de una segmentación manual laboriosa. Estas limitaciones resaltan la necesidad de biomarcadores mínimamente invasivos, como la proteómica de EV plasmáticos, para ayudar a mejorar la toma de decisiones clínicas.

Caracterización de las proteínas derivadas de EV

Evaluamos la solidez de la detección de EV en los 100 pacientes examinando la distribución del tamaño de los EV basales aislados del plasma, medidos mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). La mayoría de las partículas detectadas se encontraban entre 100 y 200 nm, lo que es consistente con el tamaño esperado de los EV pequeños aislados mediante ultracentrifugación diferencial (Figura 2A). A continuación, realizamos una interrogación proteómica profunda de estos EV plasmáticos utilizando una proteómica basada en DIA-MS imparcial. Se identificaron un total de 5137 proteínas derivadas de EV en la cohorte (Tabla S1), con una mediana de 3767 proteínas detectadas por paciente (rango, 2519–4555) (Figura 2B). Para evaluar la reproducibilidad del ensayo, realizamos inyecciones técnicas duplicadas en 20 muestras seleccionadas al azar. El análisis de componentes principales mostró que cada conjunto de réplicas técnicas se agrupó consistentemente entre sí (Figura 2C), mientras que el análisis de correlación por pares reveló correlaciones de >94%, lo que confirmó la reproducibilidad de nuestras ejecuciones. Luego, examinamos varios marcadores de EV canónicos y los agrupamos por clase funcional, incluidos las tetraspaninas, las proteínas de andamiaje, las proteínas asociadas a las balsas lipídicas y los reguladores del tráfico/secreción. Estos marcadores asociados a EV se detectaron en toda la cohorte, lo que respalda la consistencia de nuestro flujo de trabajo de purificación y proteómica de EV (Figura 2D). Para caracterizar aún más las proteínas de EV detectadas, consideramos sus localizaciones subcelulares anotadas. De las 5137 proteínas identificadas, el 18,8% se localizaba predominantemente en la membrana celular, el 19,5% en el núcleo, el 36,4% en el citoplasma, el 9,6% en las mitocondrias y el 15,7% en otros compartimentos, incluidos el retículo endoplásmico, los endosomas, el aparato de Golgi, los peroxisomas y los lisosomas (Figura 2E).

Para evaluar la importancia pronóstica de la detección de proteínas de la superficie celular que son relevantes en el cáncer de próstata, estratificamos a los pacientes en función de la presencia o ausencia de cuatro proteínas asociadas al CRPC clave que se están investigando actualmente en ensayos clínicos para pacientes con cáncer de próstata avanzado: PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1. Los pacientes se estratificaron en tres grupos: 0-1 proteínas detectadas, 2 proteínas detectadas y 3-4 proteínas detectadas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró un declive progresivo en la OS con un número creciente de proteínas detectadas (Figura 2F). Esto sugiere que los pacientes con la detección de 3-4 de estas proteínas de interés exhiben un perfil de proteínas de EV asociadas al tumor más amplio en comparación con los pacientes con la detección de 0-1 de estas proteínas. A continuación, evaluamos si un número mayor de proteínas de la superficie celular derivadas de EV detectables se asociaba con la carga tumoral de PSMA-PET. Utilizando los mismos grupos de estratificación, observamos un aumento significativo en la carga de MTV con un mayor número de proteínas detectadas (Figura 2G). Una vez más, estos hallazgos respaldan la noción de que la detección de estas cuatro proteínas asociadas al CRPC probablemente refleja la secreción de EV derivados del tumor.

Importancia pronóstica de proteínas específicas de EV

Para identificar biomarcadores pronósticos de sensibilidad o resistencia al 177Lu-PSMA-617, evaluamos la asociación entre las proteínas de la superficie de EV y los resultados clínicos. En nuestro ensayo de EV plasmáticos, PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 se detectaron en el 66%, 91%, 32% y 19% de los pacientes, respectivamente (Tabla S2). En la cohorte de controles sanos sin cáncer, no se detectó PSMA, B7-H3 ni STEAP1, mientras que el 10% de los pacientes presentaba niveles detectables de Trop-2 (Figura 1; Tabla S3). La detección de la proteína PSMA derivada de EV se asoció con una OS significativamente más corta (HR = 1,80, IC del 95%: 1,02–3,19, p = 0,043), pero no con la PFS (HR = 1,18, IC del 95%: 0,74–1,87, p = 0,494). La concentración de proteína PSMA también se correlacionó con la carga de MTV (r = 0,328, p = 0,002) (Figura 3A). STEAP1 se asoció con una OS significativamente más corta (HR = 2,99, IC del 95%: 1,70–5,25, p = 0,001), pero no con la PFS (HR = 1,59, IC del 95%: 0,94–2,69, p = 0,082). La concentración de STEAP1 también se correlacionó significativamente con la carga de MTV (r = 0,358, p = 0,0006) (Figura 3D). La proteína B7-H3 se asoció significativamente con una peor PFS (HR = 1,86, IC del 95%: 1,22–2,85, p = 0,004) y con la OS (HR = 2,51, IC del 95%: 1,50–4,21, p = 0,0004). También se observó una correlación positiva con la carga de MTV basal (r = 0,459, p < 0,0001) (Figura 3B). Finalmente, la detección de la proteína Trop-2 se asoció con una PFS más corta (HR = 1,59, IC del 95%: 1,37–3,34, p = 0,001) y con la OS (HR = 3,71, IC del 95%: 2,22–6,20, p < 0,0001) y también se correlacionó positivamente con la carga de MTV (r = 0,431, p < 0,0001) (Figura 3C).

A continuación, ampliamos nuestro análisis a un panel más amplio de proteínas de superficie conocidas, así como de proteínas de superficie derivadas de las vesículas extracelulares (VE). Los niveles elevados de TMPRSS2, HER2 (ERBB2) y STEAP1B se asociaron significativamente con un menor tiempo de supervivencia libre de progresión (SLP) y supervivencia global (SG), lo que sugiere su posible función como marcadores de una biología de la enfermedad agresiva. En contraste, una mayor expresión de CNTN1, CD46, CD151 y CXCR4 se asoció con una mejor SG (Figuras 3E y 3F) (Tabla S4). Estos hallazgos identifican un subconjunto de proteínas de las VE que podrían ser útiles para el futuro desarrollo de fármacos en pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC) o para servir como biomarcadores de estratificación en ensayos clínicos prospectivos.

Una alta carga de MTV y niveles más altos de VE predicen peores resultados de supervivencia

Para examinar si las asociaciones pronósticas de las proteínas individuales de las VE eran independientes de la carga de la enfermedad basal, realizamos análisis de supervivencia estratificados que combinaron la carga de MTV con la detección de proteínas de las VE asociadas al tumor (Figura S3). Una alta carga de MTV más una alta expresión de PSMA se asoció con una SG significativamente peor (razón de riesgos [RR] = 3,03, IC del 95%: 1,38–6,76, p = 0,006) en comparación con los pacientes con baja carga de MTV/baja expresión de PSMA. Una alta carga de MTV más una alta expresión de B7-H3 también se asoció con una peor SG (RR = 4,76, IC del 95%: 2,10–10,78, p = 0,0002). De manera similar, una alta carga de MTV más una alta expresión de Trop-2 mostró una peor SG significativamente (RR = 5,19, IC del 95%: 2,51–10,74, p < 0,0001), lo que destaca a Trop-2 como un marcador particularmente fuerte de un resultado adverso cuando se combina con una alta carga tumoral. Finalmente, una alta carga de MTV más una alta expresión de STEAP1 también se asoció con una peor SG (RR = 3,85, IC del 95%: 1,76–8,40, p = 0,001) (Figura S3).

Las proteínas de superficie de las VE se correlacionan con los biomarcadores séricos y la carga metastásica

A continuación, evaluamos la relación entre la expresión de las proteínas de superficie de las VE y los biomarcadores clínicos convencionales. En toda la cohorte, las concentraciones derivadas de las VE de PSMA (r = 0,414, p < 0,0001), B7-H3 (r = 0,552, p < 0,0001), Trop-2 (r = 0,494, p < 0,0001) y STEAP1 (r = 0,439, p < 0,0001) se correlacionaron positivamente con los niveles de PSA sérico (Figura S4). De manera similar, los niveles de VE de PSMA (r = 0,424, p < 0,0001), B7-H3 (r = 0,537, p < 0,0001), Trop-2 (r = 0,495, p < 0,0001) y STEAP1 (r = 0,379, p = 0,0001) se correlacionaron positivamente con los niveles de ALP sérico (Figura S5).

Para explorar aún más la relación entre la expresión de las proteínas de las VE y la carga tumoral molecular, estratificamos a los pacientes según el número de lesiones óseas detectadas en el PET-TC con PSMA (20 lesiones). La expresión de VE de B7-H3 (p < 0,001), Trop-2 (p < 0,0001) y STEAP1 (p < 0,01) fue significativamente mayor en los pacientes con >20 metástasis óseas (en comparación con aquellos con 0,05) (Tabla S7).

Las proteínas de las VE mejoran el rendimiento pronóstico más allá de los niveles basales de PSA y la carga de MTV

A continuación, evaluamos si las proteínas derivadas de las VE mejoraban el rendimiento pronóstico y predictivo más allá de los niveles basales de PSA, basándonos en el cálculo de los índices de concordancia (C-índices), en los que se considera que los valores de 0,71 a 0,80 son muy buenos para modelar los factores clínicos y genómicos derivados de otros biomarcadores líquidos.^[30],^[31],^[32],^[33] El PSA basal solo mostró una discriminación pronóstica modesta con un C-índice de 0,515 para el SLP y 0,618 para la SG. Al incorporar las proteínas de las VE en nuestro modelo multivariable, la adición de las VE de B7-H3 y Trop-2 mejoró el C-índice del SLP a 0,605 y 0,608 con una NRI del 69,6% y el 66,1%, respectivamente. Más allá de los marcadores tumorales canónicos, una firma multi-proteica que incluye SRSF1, PCDHGA10, SPINT1, PLK1, SGMS1, ROBO1, TNKS1BP1, EXOSC8 y MAP3K11 (modelo optimizado con 9 proteínas) mejoró aún más el rendimiento pronóstico cuando se combinó con el PSA, logrando un C-índice de 0,716 y una NRI del 81,1% (Tabla S8).

Para la predicción de la SG, el PSA solo demostró un rendimiento pronóstico modesto con un C-índice de 0,618. La adición de marcadores de VE individuales, incluido Trop-2, mostró una mejora en la discriminación del C-índice a 0,699 y una NRI del 56,1%. La firma multi-proteica optimizada que incluye SRSF1, SPINT1, Trop-2, MACROH2A2, RPA1, SGMS1, NCAM2, CDCA3 y NDUFB9 cuando se combinó con el PSA logró un C-índice mejorado de 0,773 y una NRI del 77,9% (Tabla S8).

Más allá de la carga de MTV sola (C-índice de 0,578 para el SLP), la adición de las VE de B7-H3 y Trop-2 mejoró el rendimiento del modelo, elevando el C-índice a 0,625 y 0,641, con una NRI del 71,8% y el 63,2%, respectivamente. La mayor mejora pronóstica se logró con una firma de VE multi-proteica optimizada que comprende PLK1, ROBO1, SRSF1, SGMS1, PCDHGA10, SPINT1, EXOSC8, GBP4 y SDCBP2, lo que resultó en un C-índice de 0,727 y una NRI del 69,9% (Tabla S8).

Para la predicción de la SG, la carga de MTV sola mostró un rendimiento pronóstico modesto con un C-índice de 0,613. La adición de las VE de B7-H3 y Trop-2 mejoró el rendimiento del modelo, elevando el C-índice a 0,674 y 0,695, con una NRI del 69,9% y el 53,3%, respectivamente. La mayor mejora se observó con una firma de VE multi-proteica optimizada que comprende SRSF1, MACROH2A2, CDCA3, SPINT1, Trop-2, RPA1, PLK1, NCBP1 y SGMS1, logrando un C-índice de 0,785 y una NRI del 90,6% (Tabla S8). Estos hallazgos destacan el potencial de las proteínas derivadas de las VE para refinar la estratificación del riesgo y la predicción de la respuesta, aunque es necesaria una validación externa adicional.

Los subgrupos de CTC proporcionan información pronóstica más allá del PSA y la carga de MTV

A continuación, evaluamos si las CTC mejoraban la precisión pronóstica más allá de las variables clínicas de rutina, incluido el PSA y la carga de MTV. Para el SLP, la adición de los recuentos totales de CTC más altos, independientemente de la expresión de PSMA o EpCAM, se asoció con un peor SLP (RR = 1,65, IC: 1,00–2,72, p = 0,048) y SG (RR = 3,16, IC: 1,64–6,09, p = 0,001) y se correlacionó positivamente con la carga de MTV basal (r = 0,345, p = 0,004) (Figura 5B). Los recuentos más altos de CTC PSMA+/EpCAM+ se asociaron con un peor SLP (RR = 2,03, IC: 1,21–3,39, p = 0,007) y SG (RR = 3,79, IC: 1,90–7,56, p = 0,0002) y también mostraron una correlación positiva con la carga de MTV (r = 0,29, p = 0,017) (Figura 5C). Las CTC PSMA+/EpCAM− se asociaron significativamente con una peor SG (RR = 1,87, IC: 1,01–3,47, p = 0,048) pero no con el SLP (RR = 1,57, IC: 0,95–2,59, p = 0,075). Las CTC PSMA+/EpCAM− también se correlacionaron significativamente con la carga de MTV (r = 0,366, p = 0,002) (Figura 5D). Finalmente, las CTC PSMA−/EpCAM+ se asociaron significativamente con un peor SLP (RR = 2,10, IC: 1,26–3,49, p = 0,004) y SG (RR = 2,34, IC: 1,24–4,41, p = 0,008), pero no con la carga de MTV (r = 0,235, p = 0,054) (Figura

Además, investigamos la utilidad pronóstica de los CTC más allá de la carga de MTV. De manera similar al PSA, la adición del recuento total de CTC aumentó el índice C de PFS a 0,621 (0,526–0,707) y la adición de CTC PSMA+/EpCAM+ aumentó el índice C a 0,620 (0,529–0,701). El grupo de CTC PSMA−/EpCAM+ mostró nuevamente el mayor aumento en el índice C, hasta 0,624 (0,529–0,713), mientras que el menor aumento se observó en el grupo de CTC PSMA+/EpCAM−. Se observaron tendencias similares para la OS en los 4 grupos de CTC. En conjunto, estos hallazgos muestran que los subgrupos de CTC proporcionan información pronóstica más allá del PSA y la carga de MTV (Tabla S9).

Los EVs PSMA+ y los CTC proporcionan una correlación mínima y un poder pronóstico aditivo limitado

Luego, evaluamos la correlación entre la expresión de EVs PSMA y los cuatro subgrupos de CTC. El análisis de correlación de Spearman demostró que no existe una correlación significativa entre los EVs PSMA y ninguno de los subconjuntos de CTC (p > 0,05) (Tabla S10).

A continuación, comparamos el rendimiento pronóstico de los EVs PSMA y los subconjuntos de CTC individualmente y en combinación. Para la PFS, las métricas basadas en CTC demostraron una mayor discriminación pronóstica (rango del índice C: 0,606–0,625) que los EVs PSMA solos (índice C: 0,514 [0,452–0,562]). La combinación de los EVs PSMA con cualquier subconjunto de CTC no mejoró la predicción de la PFS más allá de los modelos de CTC solos. Para la OS, la combinación de los EVs PSMA con los recuentos totales de CTC aumentó el índice C a 0,699 (0,607–0,789), y se observaron mejoras similares cuando los EVs PSMA se combinaron con subconjuntos individuales de CTC (Tabla S11).

La deconvolución de las redes de proteínas relacionadas con PSMA y B7-H3 identifica proteínas coexpresadas, así como vías biológicas divergentes

Para examinar las diferencias proteómicas globales en pacientes con alta expresión de EVs derivada de PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1, realizamos una correlación de Pearson de estas proteínas entre sí en todas las muestras. Esto indicó que la expresión de las proteínas PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 demostró correlaciones positivas entre sí (Figura 6A) y con otros objetivos de la superficie celular, como HER2, pero se correlacionó inversamente con las proteínas de la quinasa KIF2A e INPP4B, ambas de las cuales se han relacionado con otros cánceres.^[34],^[35] A través de la correlación de Spearman, también se observaron estos patrones de coexpresión positiva y negativa en todas las muestras (Figura 6B). Para realizar análisis más profundos a través de la interrogación de redes de proteínas, adaptamos la metodología del Algoritmo para la vinculación de redes de actividad (ALAN).^[36] ALAN comparó de manera efectiva los niveles de expresión de cada una de estas proteínas con todas las demás 5137 proteínas dentro de las 100 muestras de pacientes para descubrir asociaciones fuertes y débiles. ALAN también indicó que (en referencia a PSMA como referencia), las proteínas B7-H3, Trop-2, STEAP1 y HER2 exhibieron comportamientos similares, mientras que KIF2A e INPP4A exhibieron correlaciones inversas con las redes de proteínas PSMA (Figura 6C).

Para dilucidar aún más las diferencias entre las redes de proteínas PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 (objetivos terapéuticos separados en el desarrollo de fármacos para mCRPC), realizamos un análisis de expresión diferencial de proteínas entre los tumores que eran PSMA-altos/detectables y los grupos PSMA-bajos. Esto indicó que los EVs plasmáticos que eran PSMA-altos/detectables se asociaron con un aumento de las proteínas asociadas al cáncer de próstata, incluido AMACR (Figura 6D), que se ha utilizado previamente para diagnosticar el cáncer de próstata debido a su expresión patognomónica en el adenocarcinoma prostático.^[37] Se observaron hallazgos similares en los grupos Trop-2-detectados y B7-H3-altos. B7-H3-alto mostró SF3B1 expresado de manera diferente, un factor de empalme asociado con el cáncer de próstata agresivo, y DCPS, una enzima de eliminación de residuos que se ha relacionado previamente con la biología del cáncer colorrectal y el glioblastoma.^[38],^[39],^[40] En contraste, el grupo STEAP1-detectable demostró niveles aumentados de UPP1, una enzima de salvamento de pirimidinas que se ha relacionado con la preparación del nicho metastásico mediado por neutrófilos y los malos resultados en modelos preclínicos de cáncer de mama metastásico.^[41] La identificación de DCPS y UPP1 y su papel en el cáncer de próstata sigue siendo en gran medida inexplorada. Para descubrir las vías asociadas con PSMA y B7-H3, realizamos un GSEA preclasificado en estos perfiles de expresión de proteínas en función de las 50 vías de señalización Hallmark. Esto indicó que PSMA se asoció positivamente con las especies de oxígeno reactivo, mientras que se asoció negativamente con el huso mitótico (Figura 5E). En cambio, B7-H3 se asoció significativamente con la supresión de la señalización de IL2 e IL6 y la respuesta inflamatoria (Figura 5F). En general, nuestros resultados indican que la expresión de EVs derivada de PSMA y B7-H3 se correlaciona positivamente entre sí, así como con Trop-2, STEAP1 y HER2.

Cohorte de pacientes

Cien pacientes con mCRPC fueron incluidos prospectivamente antes del tratamiento con 177Lu-PSMA-617 (Figura 1). Las características basales de los pacientes se resumen en la Tabla 1. También incluimos 20 controles masculinos sin cáncer con una edad media de 60 años (rango, 54–75). La edad media en el momento de la inclusión de los 100 pacientes con mCRPC fue de 74 años (rango, 44–94), y el nivel medio basal de PSA fue de 54,5 ng/mL (rango, 1,42–5000). Se observaron grupos de grado de Gleason 1-3 en el 16% de los pacientes, grado 4 en el 16% y grado 5 en el 47%, con un 21% de los pacientes que tenían un grado de Gleason desconocido. La mayoría de los pacientes presentaban metástasis óseas (91%), el 63% presentaba afectación de los ganglios linfáticos y el 12% presentaba metástasis viscerales (hígado y pulmón). El volumen tumoral molecular (MTV) medio basal fue de 91,2 cm3 (rango, 2,00–983,06), con un valor medio de captación estándar (SUVmean) y un valor máximo de captación estándar (SUVmax) de 7,97 (rango, 1,52–61,78) y 33,4 (rango, 8,42–401,64), respectivamente, en la PET con PSMA. El estado de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG) de 0-1 se observó en el 79% de los pacientes. La mayoría de los pacientes (72%) habían recibido tres o más terapias sistémicas que prolongaban la vida, incluidos los inhibidores de la vía del receptor de andrógenos (abiraterona 67%, enzalutamida 62%, apalutamida 11%, darolutamida 15%) y los agentes de quimioterapia (docetaxel 85%, cabazitaxel 30%). Entre la cohorte de mCRPC tratados, la PFS media fue de 212 (rango, 32–648) días, mientras que la tasa de respuesta PSA50 fue del 44%. Los pacientes recibieron entre 1 y 6 dosis administradas, con un 13% que recibió 1 dosis, un 14% que recibió 2 dosis, un 12% que recibió 3 dosis, un 16% que recibió 4 dosis, un 7% de los pacientes que recibió 5 dosis y un 38% que recibió las 6 dosis.

Parámetros de imagen PET con PSMA y resultados

Investigamos los parámetros estándar de la PET con PSMA que a veces se utilizan para ayudar en la toma de decisiones clínicas, lo que puede afectar los resultados.^[28],^[29] En nuestra cohorte, un SUVmean basal más alto no se asoció con una mayor PFS (razón de riesgos [HR] = 0,65, intervalo de confianza [IC] del 95%: 0,41–1,03, p = 0,066) o supervivencia general (OS) (HR = 0,78, IC del 95%: 0,45–1,36, p = 0,385) (Figura S2A), aunque se observaron tendencias sugestivas. Un SUVmax más alto se asoció con una mejor PFS (HR = 0,54, IC: 0,34–0,88, p = 0,013), pero no con la OS (HR = 0,72, IC del 95%: 0,41–1,26, p = 0,249) (Figura S2B). Luego, investigamos el impacto de la carga de MTV en los pacientes que recibieron 177Lu-PSMA-617. En nuestra cohorte, una alta carga de MTV se asoció con una peor PFS (HR = 1,61, IC del 95%: 1,02–2,54, p = 0,039) y predijo una OS significativamente peor (HR = 2,49, IC del 95%: 1,40–4,42, p = 0,002) (Figura S2C). Si bien la carga de MTV fue el mejor parámetro de imagen para predecir los resultados de supervivencia, sigue siendo poco práctico para los pacientes con metástasis extensas debido a la necesidad de una segmentación manual que requiere mucho tiempo. Estas limitaciones resaltan la necesidad de biomarcadores mínimamente invasivos, como la proteómica de EVs plasmáticos, para ayudar a mejorar la toma de decisiones clínicas.

Caracterización de las proteínas derivadas de EVs

Evaluamos la solidez de la detección de EVs en los 100 pacientes examinando la distribución del tamaño de los EVs basales aislados del plasma, medidos mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). La mayoría de las partículas detectadas se encontraban entre 100 y 200 nm, lo que es consistente con el tamaño esperado de los EVs pequeños aislados mediante ultracentrifugación diferencial (Figura 2A). A continuación, realizamos una interrogación proteómica profunda de estos EVs plasmáticos utilizando una proteómica basada en DIA-MS no sesgada. Se identificaron un total de 5137 proteínas derivadas de EVs en la cohorte (Tabla S1), con una mediana de 3767 proteínas detectadas por paciente (rango, 2519–4555) (Figura 2B). Para evaluar la reproducibilidad del ensayo, realizamos inyecciones técnicas duplicadas en 20 muestras seleccionadas al azar. El análisis de componentes principales mostró que cada conjunto de réplicas técnicas se agrupó consistentemente entre sí (Figura 2C), mientras que el análisis de correlación por pares reveló correlaciones de >94%, lo que confirmó la reproducibilidad de nuestras ejecuciones. Luego, examinamos varios marcadores canónicos de EVs y los agrupamos por clase funcional, incluidos las tetraspaninas, las proteínas de andamiaje, las proteínas asociadas a las balsas lipídicas y los reguladores del tráfico/secreción. Estos marcadores asociados a EVs se detectaron en toda la cohorte, lo que respalda la consistencia de nuestro flujo de trabajo de purificación y proteómica de EVs (Figura 2D). Para caracterizar aún más las proteínas de EVs detectadas, consideramos sus localizaciones subcelulares anotadas. De las 5137 proteínas identificadas, el 18,8% se localizaba predominantemente en la membrana celular, el 19,5% en el núcleo, el 36,4% en el citoplasma, el 9,6% en las mitocondrias y el 15,7% en otros compartimentos, incluidos el retículo endoplásmico, los endosomas, el aparato de Golgi, los peroxisomas y los lisosomas (Figura 2E).

Para evaluar la importancia pronóstica de la detección de proteínas de la superficie celular que son relevantes en el cáncer de próstata, estratificamos a los pacientes en función de la presencia o ausencia de cuatro proteínas clave asociadas al CRPC que se están investigando actualmente en ensayos clínicos para pacientes con cáncer de próstata avanzado: PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1. Los pacientes se estratificaron en tres grupos: 0-1 proteínas detectadas, 2 proteínas detectadas y 3-4 proteínas detectadas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró una disminución progresiva de la OS con un número creciente de proteínas detectadas (Figura 2F). Esto sugiere que los pacientes con detección de 3-4 de estas proteínas de interés exhiben un perfil de proteínas de EVs asociado al tumor más amplio en comparación con los pacientes con detección de 0-1 de estas proteínas. A continuación, evaluamos si un número mayor de proteínas de la superficie celular derivadas de EVs detectables se asoció con la carga tumoral de la PET con PSMA. Utilizando los mismos grupos de estratificación, observamos un aumento significativo de la carga de MTV con un mayor número de proteínas detectadas (Figura 2G). Una vez más, estos hallazgos respaldan la noción de que la detección de estas cuatro proteínas asociadas al CRPC probablemente refleja la secreción de EVs derivados del tumor.

Importancia pronóstica de proteínas específicas de EVs

Para identificar biomarcadores pronósticos de sensibilidad o resistencia a 177Lu-PSMA-617, evaluamos la asociación entre las proteínas de superficie de las vesículas extracelulares (VE) y los resultados clínicos. En nuestro ensayo de VE plasmáticas, se detectaron PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 en el 66%, 91%, 32% y 19% de los pacientes, respectivamente (Tabla S2). En la cohorte de controles sanos sin cáncer, no se detectaron PSMA, B7-H3 y STEAP1, mientras que el 10% de los pacientes presentaba niveles detectables de Trop-2 (Figura 1; Tabla S3). La detección de la proteína PSMA derivada de las VE se asoció con una supervivencia global (SG) significativamente más corta (razón de riesgos [RR] = 1,80, IC del 95%: 1,02–3,19, p = 0,043), pero no con una supervivencia libre de progresión (SLP) (RR = 1,18, IC del 95%: 0,74–1,87, p = 0,494). La concentración de proteína PSMA también se correlacionó con la carga de metástasis (r = 0,328, p = 0,002) (Figura 3A). STEAP1 se asoció con una SG significativamente más corta (RR = 2,99, IC del 95%: 1,70–5,25, p = 0,001), pero no con la SLP (RR = 1,59, IC del 95%: 0,94–2,69, p = 0,082). La concentración de STEAP1 también se correlacionó significativamente con la carga de metástasis (r = 0,358, p = 0,0006) (Figura 3D). La proteína B7-H3 se asoció significativamente con una SLP peor (RR = 1,86, IC del 95%: 1,22–2,85, p = 0,004), así como con una SG peor (RR = 2,51, IC del 95%: 1,50–4,21, p = 0,0004). También se observó una correlación positiva con la carga de metástasis basal (r = 0,459, p < 0,0001) (Figura 3B). La proteína Trop-2 detectable se asoció con una SLP más corta (RR = 1,59, IC del 95%: 1,37–3,34, p = 0,001) y una SG más corta (RR = 3,71, IC del 95%: 2,22–6,20, p < 0,0001) y también se correlacionó positivamente con la carga de metástasis (r = 0,431, p < 0,0001) (Figura 3C).

A continuación, ampliamos nuestro análisis a un panel más amplio de proteínas de superficie conocidas, así como de proteínas de superficie derivadas de las VE. Los niveles elevados de TMPRSS2, HER2 (ERBB2) y STEAP1B se asociaron significativamente con una SLP y una SG más cortas, lo que sugiere su posible papel como marcadores de una biología de la enfermedad agresiva. En contraste, una mayor expresión de CNTN1, CD46, CD151 y CXCR4 se asoció con una SG mejorada (Figuras 3E y 3F) (Tabla S4). Estos hallazgos identifican un subconjunto de proteínas de las VE que pueden proporcionar información para el futuro desarrollo de fármacos en pacientes con mCRPC o servir como biomarcadores de estratificación en ensayos clínicos prospectivos.

Una alta carga de metástasis y niveles más altos de VE predicen peores resultados de supervivencia

Para examinar si las asociaciones pronósticas de las proteínas individuales de las VE eran independientes de la carga de la enfermedad basal, realizamos análisis de supervivencia estratificados que combinaron la carga de metástasis con la detección de proteínas de las VE asociadas con el tumor (Figura S3). Una alta carga de metástasis más una alta expresión de PSMA se asoció con una SG significativamente peor (RR = 3,03, IC del 95%: 1,38–6,76, p = 0,006) en comparación con los pacientes con baja carga de metástasis/baja expresión de PSMA. Una alta carga de metástasis más una alta expresión de B7-H3 también se asoció con una SG inferior (RR = 4,76, IC del 95%: 2,10–10,78, p = 0,0002). De manera similar, una alta carga de metástasis más una alta expresión de Trop-2 mostró una SG significativamente peor (RR = 5,19, IC del 95%: 2,51–10,74, p < 0,0001), lo que destaca a Trop-2 como un marcador particularmente fuerte de un resultado adverso cuando se combina con una alta carga tumoral. Finalmente, una alta carga de metástasis más una alta expresión de STEAP1 también se asoció con una peor SG (RR = 3,85, IC del 95%: 1,76–8,40, p = 0,001) (Figura S3).

Las proteínas de superficie de las VE se correlacionan con los biomarcadores séricos y la carga metastásica

A continuación, evaluamos la relación entre la expresión de las proteínas de superficie de las VE y los biomarcadores clínicos convencionales. En toda la cohorte, las concentraciones derivadas de las VE de PSMA (r = 0,414, p < 0,0001), B7-H3 (r = 0,552, p < 0,0001), Trop-2 (r = 0,494, p < 0,0001) y STEAP1 (r = 0,439, p < 0,0001) se correlacionaron positivamente con los niveles de PSA sérico (Figura S4). De manera similar, los niveles de VE de PSMA (r = 0,424, p < 0,0001), B7-H3 (r = 0,537, p < 0,0001), Trop-2 (r = 0,495, p < 0,0001) y STEAP1 (r = 0,379, p = 0,0001) se correlacionaron positivamente con los niveles de ALP sérico (Figura S5).

Para explorar aún más la relación entre la expresión de las proteínas de las VE y la carga tumoral molecular, estratificamos a los pacientes según el número de lesiones óseas detectadas en la exploración PET-PSMA (20 lesiones). La expresión de VE de B7-H3 (p < 0,001), Trop-2 (p < 0,0001) y STEAP1 (p < 0,01) fue significativamente mayor en los pacientes con >20 metástasis óseas (en comparación con aquellos con 0,05) (Tabla S10).

A continuación, comparamos el rendimiento pronóstico de los EV PSMA y los subconjuntos de CTC individualmente y en combinación. Para la PFS, las métricas basadas en CTC demostraron una mayor discriminación pronóstica (rango del índice C: 0,606–0,625) que los EV PSMA solos (índice C: 0,514 [0,452–0,562]). La combinación de los EV PSMA con cualquier subconjunto de CTC no mejoró la predicción de la PFS más allá de los modelos de CTC por sí solos. Para la OS, la combinación de los EV PSMA con los recuentos totales de CTC aumentó el índice C a 0,699 (0,607–0,789), y se observaron mejoras similares cuando los EV PSMA se combinaron con subconjuntos individuales de CTC (Tabla S11).

La deconvolución de las redes de proteínas relacionadas con PSMA y B7-H3 identifica proteínas coexpresadas, así como vías biológicas divergentes

Para examinar las diferencias proteómicas globales en pacientes con alta expresión de EV derivada de PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1, realizamos una correlación de Pearson de estas proteínas entre sí en todas las muestras. Esto indicó que la expresión de las proteínas PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 demostró correlaciones positivas entre sí (Figura 6A) y con otros objetivos de la superficie celular, como HER2, pero se correlacionó inversamente con las proteínas de la quinasa KIF2A e INPP4B, ambas de las cuales se han relacionado con otros cánceres.^[34],^[35] A través de la correlación de Spearman, también se observaron estos patrones de coexpresión positiva y negativa en todas las muestras (Figura 6B). Para realizar análisis más profundos a través de la interrogación de redes de proteínas, adaptamos la metodología del Algoritmo para la vinculación de redes de actividad (ALAN).^[36] ALAN comparó de manera efectiva los niveles de expresión de cada una de estas proteínas con todas las demás 5137 proteínas dentro de las 100 muestras de pacientes para descubrir asociaciones fuertes y débiles. ALAN también indicó que (en referencia a PSMA como referencia), las proteínas B7-H3, Trop-2, STEAP1 y HER2 exhibieron comportamientos similares, mientras que KIF2A e INPP4A exhibieron correlaciones inversas con las redes de proteínas PSMA (Figura 6C).

Para dilucidar aún más las diferencias entre las redes de proteínas PSMA, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 (objetivos terapéuticos separados en el desarrollo de fármacos para el CMPC metastásico), realizamos un análisis de expresión diferencial de proteínas entre los tumores que eran PSMA-altos/detectables y los grupos PSMA-bajos. Esto indicó que los EV plasmáticos que eran PSMA-altos/detectables se asociaron con un aumento de las proteínas asociadas con el cáncer de próstata, incluido AMACR (Figura 6D), que se ha utilizado previamente para diagnosticar el cáncer de próstata debido a su expresión patognomónica en el adenocarcinoma prostático.^[37] Se observaron hallazgos similares en los grupos Trop-2-detectados y B7-H3-altos. B7-H3-alto mostró SF3B1 expresado de manera diferente, un factor de empalme asociado con el cáncer de próstata agresivo, y DCPS, una enzima de desmantelamiento-eliminación que se ha relacionado previamente con la biología del cáncer colorrectal y el glioblastoma.^[38],^[39],^[40] En contraste, el grupo STEAP1-detectable demostró niveles elevados de UPP1, una enzima de salvamento de pirimidinas que se ha relacionado con la preparación del nicho metastásico mediado por neutrófilos y los malos resultados en modelos preclínicos de cáncer de mama metastásico.^[41] La identificación de DCPS y UPP1 y su papel en el cáncer de próstata sigue siendo en gran medida inexplorada. Para descubrir las vías asociadas con PSMA y B7-H3, realizamos un GSEA preclasificado en estos perfiles de expresión de proteínas en función de las 50 vías de señalización Hallmark. Esto indicó que PSMA se asoció positivamente con las especies de oxígeno reactivo, mientras que se asoció negativamente con el huso mitótico (Figura 5E). B7-H3 se asoció significativamente con la supresión de la señalización de IL2 e IL6 y la respuesta inflamatoria (Figura 5F). En general, nuestros resultados indican que la expresión de EV derivada de PSMA y B7-H3 se correlaciona positivamente entre sí, así como con Trop-2, STEAP1 y HER2.

Discusión

Nuestros hallazgos resaltan las posibles limitaciones de depender únicamente de las métricas de imagen PET de PSMA para la predicción pronóstica y respaldan la incorporación de biomarcadores proteómicos plasmáticos para ayudar en la toma de decisiones terapéuticas. Los parámetros PET de PSMA, como SUVmedio y SUVmáx, no predicen de manera confiable la PFS y la OS. Si bien un SUV basal alto puede predecir la respuesta del PSA, no equivale a una durabilidad del tratamiento, particularmente en pacientes con una alta carga metastásica. En contraste, la carga de MTV derivada de PET fue pronóstica, pero su cuantificación es laboriosa y está limitada por la variabilidad interpretativa, particularmente en pacientes con enfermedad extensa.^[42] Al capturar las proteínas derivadas de tumores de EV y los subgrupos de CTC de forma concurrente, nuestro ensayo se correlaciona con los biomarcadores basados en suero, como el PSA y la fosfatasa alcalina, y sirve como un sustituto de la carga tumoral y la biología de la enfermedad.

En particular, B7-H3, Trop-2 y STEAP1 se enriquecieron en pacientes con metástasis óseas extensas (>20 lesiones), lo que podría convertirlos en objetivos más adecuados para enfermedades metastásicas más extensas. Además, HER2 ha surgido como un marcador proteico significativo y clínicamente relevante en nuestro análisis. Su expresión elevada está notablemente relacionada con una peor OS. Esto se alinea con la investigación existente que sugiere un papel de HER2 en la progresión y la resistencia del cáncer de próstata, lo que abre la puerta a estrategias dirigidas a HER2 en el CMPC.^[43]

Curiosamente, nuestros resultados sugieren que la elevación de la señalización canónica de p53 puede conferir resistencia a las terapias que inducen roturas de ADN de cadena simple (SSB) a través de la emisión de partículas beta, que se reparan de manera eficiente mediante la reparación por escisión de bases (BER) en lugar de desencadenar la apoptosis.^[44],^[45] Activado por la señalización de las quinasas ATM/ATR, el p53 de tipo salvaje aumenta la expresión de genes como p21, promoviendo la detención del ciclo celular y mejorando las funciones de reparación del ADN.^[46] Al aumentar la BER, el p53 de tipo salvaje puede permitir que las células tumorales se recuperen de las SSB subletales, reduciendo la eficacia terapéutica de 177Lu-PSMA-617. Por otro lado, la alteración de la función de la vía canónica de p53 puede conducir a una mayor muerte de las células cancerosas debido a la incapacidad de reparar las SSB inducidas por la radioterapia de partículas beta, lo que se manifiesta clínicamente como una mayor sensibilidad a 177Lu-PSMA-617.

Por el contrario, la alta actividad de la vía E2F se asoció con mejores resultados en nuestro estudio, lo que sugiere una posible relación entre la proliferación tumoral y una mayor sensibilidad a 177Lu-PSMA-617. El programa transcripcional E2F, que normalmente se mantiene bajo control mediante RB1, promueve la progresión del ciclo celular y la entrada en la fase S y puede provocar estrés de replicación cuando se desregula.^[47] Aunque no se evaluó el estado genómico de RB1 en nuestra cohorte, se sabe que la pérdida funcional de RB1 altera la reparación de roturas de ADN de doble cadena y altera los puntos de control del ciclo celular, lo que lleva a la acumulación de daños en el ADN no reparados después de la radiación. La radiación es más eficaz contra las células que se dividen activamente, particularmente las que se encuentran en G2/M, donde el tiempo de reparación limitado antes de la mitosis aumenta la probabilidad de daño letal, mientras que las células quiescentes o de ciclo lento tienden a ser más resistentes.^[48],^[49] La actividad elevada de E2F acelera la entrada en la fase S, lo que aumenta la probabilidad de que las roturas de ADN de cadena simple (SSB) inducidas por la radiación se produzcan durante la síntesis de ADN, lo que podría superar la capacidad de BER y dar lugar a una catástrofe mitótica.^[50] En general, estos hallazgos sugieren que la actividad elevada de la señalización de E2F puede representar un estado biológicamente significativo de vulnerabilidad tumoral a la radioterapia dirigida a PSMA, en lugar de una característica de resistencia al tratamiento, lo que ayuda a explicar los mejores resultados observados en este subgrupo. Este hallazgo contrasta con otras terapias sistémicas utilizadas en el CMPC, incluidos los agentes hormonales o quimioterapéuticos, en los que la activación de la vía E2F se ha asociado con resultados inferiores.^[51]

El análisis de los subgrupos de CTC reveló que la presencia de un alto recuento de CTC PSMA+/EpCAM+ se asoció con una peor PFS y OS, lo que es consistente con estudios anteriores que relacionan un mayor recuento de CTC PSMA+ con resultados desfavorables.^[11] Una observación en el contexto de las terapias dirigidas a PSMA fue la detección de CTC PSMA−/EpCAM+, que también se asoció con una peor PFS y OS, lo que sugiere que estas células representan fenotipos desdiferenciados, como el cáncer de próstata con receptor de andrógenos (AR) negativo y neuroendocrino (NE) negativo (AR− NE−) o AR negativo y neuroendocrino positivo (AR− NE+). Estos hallazgos subrayan la presencia de CTC PSMA− junto con CTC PSMA+ en los mismos individuos, lo que destaca la heterogeneidad intra-paciente, una barrera crítica para una terapia sistémica eficaz. Esto apoya aún más la noción de que pueden ser necesarias estrategias de doble orientación, como las que combinan terapias dirigidas a PSMA y B7-H3, para abordar la heterogeneidad de la enfermedad.

En resumen, proporcionamos evidencia prospectiva de que el análisis proteómico de EV basado en sangre puede descubrir biomarcadores y vías de señalización clínicamente relevantes que pueden estar asociados con la respuesta y la resistencia al tratamiento con radioligando 177Lu-PSMA-617. Nuestros hallazgos sientan las bases para futuros ensayos que incorporen la proteómica basada en EV en los flujos de trabajo clínicos, lo que en última instancia permitirá una selección de pacientes más precisa y basada en la biología para las personas con cáncer de próstata avanzado.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio presenta varias limitaciones. Se llevó a cabo en una única institución, lo que puede limitar la generalización o reproducibilidad de nuestros hallazgos. La cohorte de estudio comprendió un 92% de pacientes blancos, lo que restringe la aplicabilidad de estos hallazgos a otros grupos de población. La ausencia de una cohorte de validación pone de manifiesto la necesidad de futuros estudios confirmatorios, que actualmente están siendo planificados por nuestro grupo y por otros. Es importante destacar que las firmas proteicas modeladas asociadas con la respuesta a PSA50, el SCP y la SO requieren una validación independiente en cohortes externas para establecer su utilidad predictiva y pronóstica. Las firmas de vesículas extracelulares (VE) multi-proteicas optimizadas identificadas mediante la selección de características basada en LASSO son exploratorias, derivadas de una única cohorte y varían en su composición entre los puntos finales (PSA50, SCP y SO) y los tratamientos de base (carga de PSA y MTV). La selección de características a nivel del proteoma es inherentemente propensa a identificar asociaciones específicas de cada punto final en una única cohorte, lo que genera incertidumbre sobre la estabilidad biológica y la reproducibilidad de estos paneles en cohortes independientes. Aunque se aplicó una corrección interna de optimismo mediante bootstrap, se requiere una validación externa en cohortes independientes de mCRPC tratadas con 177Lu-PSMA-617 para confirmar la estabilidad y la utilidad clínica de estas firmas. Dado que los análisis proteómicos son descriptivos y no confirmatorios, y dado que las asociaciones con el SCP y la SO fueron a veces consistentes, pero no uniformes en todos los marcadores, estos hallazgos deben interpretarse con cautela. Además, nuestro protocolo de aislamiento de VE no diferencia las VE derivadas del tumor de las vesículas derivadas de tejidos no tumorales. La ultracentrifugación aísla poblaciones heterogéneas de vesículas, puede dañar las vesículas, promover la agregación y producir una recuperación y un rendimiento variables entre las muestras, y estas deficiencias deben tenerse en cuenta al interpretar las señales asociadas a las VE. Si bien los replicados técnicos confirman la reproducibilidad a nivel de instrumento, la variabilidad preanalítica inherente al aislamiento de VE basado en ultracentrifugación, incluido las diferencias dependientes de la muestra en el rendimiento y la pureza, no se tuvo completamente en cuenta. Los replicados de flujo de trabajo independientes, procesados desde el plasma hasta la adquisición por espectrometría de masas, son fundamentales para establecer flujos de trabajo sólidos de descubrimiento de biomarcadores y representan una limitación de este estudio. Aunque las intensidades de cuantificación sin etiquetas (LFQ) se normalizaron utilizando el recuento total de partículas de VE derivadas de NTA, las mediciones de NTA realizadas después de la ultracentrifugación pueden incluir partículas no VE que se aíslan conjuntamente, como las lipoproteínas o los agregados de proteínas. Si bien este enfoque evita la confusión composicional asociada con la normalización basada en la abundancia de proteínas, el aislamiento conjunto de partículas no VE representa una limitación conocida del aislamiento de VE basado en ultracentrifugación y puede introducir variabilidad en el factor de normalización entre las muestras. Varias proteínas clave de las VE se modelaron utilizando la detección binaria en lugar de la abundancia continua, lo que puede introducir ambigüedad cerca del límite de detección. El uso de la clasificación de proteínas de VE basada en la detección/no detección y la dicotomización basada en la mediana es apropiado para el descubrimiento exploratorio en una única cohorte y reduce el ruido cerca del límite de detección, pero estos umbrales binarios son inherentemente específicos del ensayo, del flujo de trabajo y de la cohorte, lo que limita su aplicabilidad traslacional directa. Sin replicados de flujo de trabajo independientes y umbrales de detección analíticamente bloqueados, estas características binarias pueden reflejar parcialmente la variabilidad preanalítica y la carga tumoral en lugar de señales biológicas reproducibles, y el modelado basado en la abundancia continua con umbrales definidos prospectivamente es necesario para avanzar en estos hallazgos hacia la utilidad clínica. El estado de detección puede reflejar la variabilidad en la recuperación de VE, la sensibilidad de la espectrometría de masas, la abundancia de proteínas cerca del umbral de detección o la verdadera ausencia biológica. En la actualidad, no existen puntos de referencia establecidos que definan la sensibilidad analítica para la detección de proteínas de VE en plasma de pacientes con mCRPC, lo que representa una limitación técnica más amplia en el campo. Mejorar la sensibilidad y el rango dinámico del ensayo sigue siendo un objetivo clave para el desarrollo de un ensayo de proteómica de VE de grado clínico. Además, algunas proteínas de VE se detectaron solo en una minoría de pacientes y, aunque utilizamos un umbral de detección del 10% para la inclusión, dado el carácter exploratorio de este estudio, el valor pronóstico de las proteínas con baja prevalencia de detección sigue siendo limitado. También se desconoce si la baja detección refleja la verdadera ausencia de biología tumoral dentro de las VE o la insuficiencia de la sensibilidad del flujo de trabajo de espectrometría de masas, y esta incertidumbre puede influir en la interpretación de las asociaciones pronósticas. La observación de que aproximadamente 1600 proteínas son únicas de las muestras de cáncer en relación con los 20 controles de donantes sanos probablemente refleja una combinación de factores, incluidos el tamaño limitado de la muestra de control, las diferencias en la profundidad del proteoma y los patrones de datos faltantes, en lugar de una especificidad estricta de las VE derivadas del tumor, y esta proporción es difícil de conciliar con la pequeña fracción esperada de material de VE derivado del tumor en el plasma después del enriquecimiento basado en ultracentrifugación. Si bien varias de estas proteínas enriquecidas en cáncer, incluidas PSMA, B7-H3 y STEAP1, se detectan en líneas celulares de cáncer de próstata, lo que respalda su relevancia tumoral, la importancia funcional y biológica más amplia del conjunto completo de 1600 proteínas enriquecidas en cáncer no se ha caracterizado por completo y sigue siendo un área de investigación activa por parte de nuestro grupo y de otros.

Si bien la DIA-MS permite una cobertura proteómica profunda y un análisis de vías, su uso en la práctica clínica sigue siendo limitado. Los esfuerzos futuros podrían centrarse en el desarrollo de ensayos proteómicos de VE utilizando plataformas como Olink o ELISA, que ofrecen una mayor escalabilidad y son más compatibles con un flujo de trabajo clínico rápido. En cuanto a los análisis de vías GSEA, reconocemos que estos perfiles Hallmark se construyeron originalmente basándose en datos transcripómicos (no proteómicos); por lo tanto, las vías diferenciales clave requieren una validación adicional. Además, nuestra cohorte incluyó solo pacientes con enfermedad predominantemente PSMA, lo que limitó la detección de marcadores neuroendocrinos raros, como DLL3. Por el contrario, las proteínas predominantemente localizadas en el núcleo, como AR, FOXA1 y HOXB13, están poco representadas en las VE y su menor abundancia en las VE no refleja su concentración en las células tumorales. Además, sin una cohorte de validación, las interpretaciones a nivel de vía y las asociaciones pronósticas que vinculan las proteínas de VE con el análisis del SCP y la SO requieren una confirmación adicional. Finalmente, dado que los biomarcadores de biopsia líquida frecuentemente se correlacionan con la carga de la enfermedad, es inherentemente difícil distinguir los efectos de la carga de la enfermedad de la verdadera variación biológica en los estudios de VE, y esta complejidad debe tenerse en cuenta al interpretar nuestros resultados. Este trabajo requiere una validación prospectiva en otras cohortes de pacientes con mCRPC, preferiblemente aquellas que involucren 177Lu-PSMA-617 u otras terapias dirigidas a PSMA. En particular, el hallazgo provocativo de una posible mayor sensibilidad a 177Lu-PSMA-617 cuando la vía E2F está regulada al alza, o una posible menor sensibilidad cuando la vía p53 está regulada al alza, requiere una confirmación independiente.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio presenta varias limitaciones. Se llevó a cabo en una única institución, lo que puede limitar la generalización o reproducibilidad de nuestros hallazgos. La cohorte de estudio comprendió un 92% de pacientes blancos, lo que restringe la aplicabilidad de estos resultados a otros grupos de población. La ausencia de una cohorte de validación pone de manifiesto la necesidad de futuros estudios confirmatorios, que actualmente están siendo planificados por nuestro grupo y por otros. Es importante destacar que las firmas proteicas modeladas asociadas con la respuesta a PSA50, el SCP y la SO requieren una validación independiente en cohortes externas para establecer su utilidad predictiva y pronóstica. Las firmas de EV multi-proteicas optimizadas identificadas mediante la selección de características basada en LASSO son exploratorias, derivadas de una única cohorte y varían en su composición entre los puntos finales (PSA50, SCP y SO) y los tratamientos de base (carga de PSA y MTV). La selección de características a nivel del proteoma es inherentemente propensa a identificar asociaciones específicas de cada punto final en una única cohorte, lo que genera incertidumbre sobre la estabilidad biológica y la reproducibilidad de estos paneles en cohortes independientes. Aunque se aplicó una corrección interna de optimismo mediante bootstrap, se requiere una validación externa en cohortes independientes de mCRPC que reciban 177Lu-PSMA-617 para confirmar la estabilidad y la utilidad clínica de estas firmas. Dado que los análisis proteómicos son descriptivos y no confirmatorios, y dado que las asociaciones con el SCP y la SO fueron a veces consistentes pero no uniformes entre los marcadores, estos hallazgos deben interpretarse con cautela. Además, nuestro protocolo de aislamiento de EV no diferencia los EV derivados del tumor de las vesículas derivadas de tejidos no tumorales. La ultracentrifugación aísla poblaciones heterogéneas de vesículas, puede dañar las vesículas, promover la agregación y producir una recuperación y un rendimiento variables entre las muestras, y estas deficiencias deben tenerse en cuenta al interpretar las señales asociadas a los EV. Si bien los replicados técnicos confirman la reproducibilidad a nivel de instrumento, la variabilidad preanalítica inherente al aislamiento de EV basado en ultracentrifugación, incluido las diferencias dependientes de la muestra en el rendimiento y la pureza, no se tuvo completamente en cuenta. Los replicados independientes del flujo de trabajo, procesados desde el plasma hasta la adquisición de espectrometría de masas, son fundamentales para establecer flujos de trabajo sólidos de descubrimiento de biomarcadores y representan una limitación de este estudio. Aunque las intensidades de cuantificación sin etiquetas (LFQ) se normalizaron utilizando el recuento total de partículas de EV derivadas de NTA, las mediciones de NTA realizadas después de la ultracentrifugación pueden incluir partículas no EV que se aíslan conjuntamente, como las lipoproteínas o los agregados de proteínas. Si bien este enfoque evita la confusión composicional asociada con la normalización basada en la abundancia de proteínas, el aislamiento conjunto de partículas no EV representa una limitación conocida del aislamiento de EV basado en ultracentrifugación y puede introducir variabilidad en el factor de normalización entre las muestras. Varias proteínas clave de los EV se modelaron utilizando la detección binaria en lugar de la abundancia continua, lo que puede introducir ambigüedad cerca del límite de detección. El uso de la detección/no detección y la dicotomización basada en la mediana para la clasificación de proteínas de EV es apropiado para el descubrimiento exploratorio en una única cohorte y reduce el ruido cerca del límite de detección, pero estos umbrales binarios son inherentemente específicos del ensayo, del flujo de trabajo y de la cohorte, lo que limita su aplicabilidad traslacional directa. Sin replicados independientes del flujo de trabajo y umbrales de detección analíticamente bloqueados, estas características binarias pueden reflejar parcialmente la variabilidad preanalítica y la carga tumoral en lugar de señales biológicas reproducibles, y el modelado basado en la abundancia continua con umbrales definidos prospectivamente es necesario para avanzar en estos hallazgos hacia la utilidad clínica. El estado de detección puede reflejar la variabilidad en la recuperación de EV, la sensibilidad de la espectrometría de masas, la abundancia de proteínas cerca del umbral de detección o la verdadera ausencia biológica. En la actualidad, no existen puntos de referencia establecidos que definan la sensibilidad analítica para la detección de proteínas de EV en plasma de pacientes con mCRPC, lo que representa una limitación técnica más amplia en el campo. Mejorar la sensibilidad y el rango dinámico del ensayo sigue siendo un objetivo clave para el desarrollo de un ensayo de proteómica de EV de grado clínico. Además, algunas proteínas de EV se detectaron solo en una minoría de pacientes y, aunque utilizamos un umbral de detección del 10% para la inclusión, dado el carácter exploratorio de este estudio, el valor pronóstico de las proteínas con baja prevalencia de detección sigue siendo limitado. También se desconoce si una baja detección refleja la verdadera ausencia de biología tumoral dentro de los EV o la insuficiencia de la sensibilidad del flujo de trabajo de espectrometría de masas, y esta incertidumbre puede influir en la interpretación de las asociaciones pronósticas. La observación de que aproximadamente 1600 proteínas son únicas de las muestras de cáncer en relación con los 20 controles de donantes sanos probablemente refleja una combinación de factores, incluidos el tamaño limitado de la muestra de control, las diferencias en la profundidad del proteoma y los patrones de datos faltantes, en lugar de una especificidad estricta de los EV derivados del tumor, y esta proporción es difícil de conciliar con la pequeña fracción esperada de material de EV derivado del tumor en el plasma después del enriquecimiento basado en ultracentrifugación. Si bien varias de estas proteínas enriquecidas en cáncer, incluidas PSMA, B7-H3 y STEAP1, se detectan en líneas celulares de cáncer de próstata, lo que respalda su relevancia tumoral, la importancia funcional y biológica más amplia del conjunto completo de 1600 proteínas enriquecidas en cáncer no se ha caracterizado por completo y sigue siendo un área de investigación activa por parte de nuestro grupo y de otros.

Si bien la DIA-MS permite una cobertura proteómica profunda y un análisis de vías, su uso en la práctica clínica sigue siendo limitado. Los esfuerzos futuros podrían centrarse en el desarrollo de ensayos proteómicos de EV utilizando plataformas como Olink o ELISA, que ofrecen una mayor escalabilidad y son más compatibles con un flujo de trabajo clínico rápido. En cuanto a los análisis de vías GSEA, reconocemos que estos perfiles Hallmark se construyeron originalmente basándose en datos transcripómicos (no proteómicos); por lo tanto, las vías diferenciales clave requieren una validación adicional. Además, nuestra cohorte incluyó solo pacientes con enfermedad predominantemente PSMA, lo que limitó la detección de marcadores neuroendocrinos raros, como DLL3. Por el contrario, las proteínas predominantemente localizadas en el núcleo, como AR, FOXA1 y HOXB13, están poco representadas en los EV y su menor abundancia en los EV no refleja su concentración en las células tumorales. Además, sin una cohorte de validación, las interpretaciones a nivel de vía y las asociaciones pronósticas que vinculan las proteínas de EV con el análisis del SCP y la SO requieren una confirmación adicional. Finalmente, dado que los biomarcadores de la biopsia líquida frecuentemente se correlacionan con la carga de la enfermedad, es inherentemente difícil distinguir los efectos de la carga de la enfermedad de la verdadera variación biológica en los estudios de EV, y esta complejidad debe tenerse en cuenta al interpretar nuestros resultados. Este trabajo requiere una validación prospectiva en otras cohortes de pacientes con mCRPC, preferiblemente aquellas que involucren 177Lu-PSMA-617 u otras terapias dirigidas a PSMA. En particular, el hallazgo provocativo de una posible mayor sensibilidad a 177Lu-PSMA-617 cuando la vía E2F está regulada al alza, o una posible menor sensibilidad cuando la vía p53 está regulada al alza, requiere una confirmación independiente.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y realizar solicitudes, póngase en contacto con el contacto principal, el Dr. Emmanuel Antonarakis (anton401@umn.edu), quien se encargará de atenderlas.

Disponibilidad de materiales

No se generaron plásmidos, líneas celulares de ratón ni otros reactivos biológicos en este estudio. El protocolo de aislamiento de EV mediante ultracentrifugación diferencial descrito en este estudio está disponible en trabajos publicados anteriormente (DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16244261).

Disponibilidad de datos y código

•Los archivos Proteomic.Raw derivados de las muestras de EV del plasma se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través de PRIDE.
•Los archivos sin procesar se pueden descargar utilizando un cliente FTP a través de este enlace: https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task=0e236e1d0c15483a94c996ec937bd0b8. La intensidad de las proteínas de EV y los datos de enumeración de CTC para cada paciente se incluyeron como una tabla suplementaria.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible en el contacto principal a petición.

Contacto principal

Para obtener información adicional y realizar solicitudes, póngase en contacto con el contacto principal, el Dr. Emmanuel Antonarakis (anton401@umn.edu), quien se encargará de atenderlas.

Disponibilidad de materiales

No se generaron plásmidos, líneas celulares de ratón ni otros reactivos biológicos en este estudio. El protocolo de aislamiento de EV mediante ultracentrifugación diferencial descrito en este estudio está disponible en trabajos publicados anteriormente (DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16244261).

Disponibilidad de datos y código

•Los archivos Proteomic.Raw derivados de las muestras de EV del plasma se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través de PRIDE.
•Los archivos sin procesar se pueden descargar utilizando un cliente FTP a través de este enlace: https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task=0e236e1d0c15483a94c996ec937bd0b8. La intensidad de las proteínas de EV y los datos de enumeración de CTC para cada paciente se incluyeron como una tabla suplementaria.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible en el contacto principal a petición.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado parcialmente por una beca de estudio iniciada por el investigador (a E.S.A.) patrocinada por Novartis (CAAA617A1US11T). A.T.A. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral, PF-23-1153194-01-CDP, número de beca: (https://doi.org/10.53354/ACS.PF-23-1153194-01-CDP.pc.gr.175399). N.A.Z. contó con el apoyo de una Beca de Investigador Temprano del Departamento de Defensa 2022 (W81XWH-22-1-0242), una Beca de Investigación de Médicos del Departamento de Defensa 2025 (HT9425-25-1-0438), una Beca de Investigador Joven de la Fundación del Cáncer de Próstata 2022, el Fondo Filantrópico del Instituto de Cáncer de Próstata y Urológico de la Universidad de Minnesota y el Fondo Comunitario contra el Cáncer Randy Shaver (2023, 2024 y 2025). El apoyo a P.W.V. se proporcionó a través de R50CA211256. S.M.D. cuenta con el apoyo de las becas 10.13039/100000002NIH R01CA174777 y R01CA270539. J.H.H. cuenta con el apoyo de la 10.13039/100000048American Cancer Society (IRG-21-049-61-IRG) y NCI/NIH (R37 1R37CA288972-01). J.M.D. cuenta con el apoyo del Centro Oncológico Mágico y el Premio de Investigación Básica/Clínica del Departamento de Farmacología (BCPRA) en la 10.13039/100007249Universidad de Minnesota y por el NIH/NCI STTR R41CA268344-01. E.S.A. cuenta con el apoyo de las becas 10.13039/100000054NCI P30 CA077598 y 10.13039/100000005Departamento de Defensa W81XWH-22-2-0025. Los datos de espectrometría de masas se obtuvieron en el Recurso Compartido de Bioquímica Analítica del Centro Oncológico Mágico, que se financia en parte con la Beca de Apoyo al Centro Oncológico P30CA077598. Parte de los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el Recurso Compartido de Bioestadística del Centro Oncológico Mágico, con el apoyo del NCI Cancer Center Support Grant P30CA077598 y el National Center for Advancing Translational Sciences del NIH, número de premio UM1TR004405. El contenido es de exclusiva responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los 10.13039/100000002National Institutes of Health. Algunas partes de este trabajo se llevaron a cabo en el Centro Nano de Minnesota, que cuenta con el apoyo de la 10.13039/100000001National Science Foundation a través de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI) bajo el número de premio ECCS-2025124. El esquema de la figura se creó con https://biorender.com.

Contribuciones de los autores

Conceptualización, A.T.A., M.L.L., S.M.D., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; metodología, E.B., L.K., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; investigación, A.T.A., S.B., K.M.S., T.Y., G.J., I.O., C.J.R., N.A.Z., D.S., S.M.D., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; redacción – borrador original, A.T.A., E.B., L.K., Y.Z., P.W.V. y J.H.H.; redacción – revisión y edición, Y.Z., Z.C., D.S., C.J.R., N.A.Z., S.M.D., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; obtención de financiación, A.T.A., S.M.D., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; recursos, Y.Z., P.W.V., Z.C., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.; supervisión, Z.C., S.M.D., J.H.H., J.M.D. y E.S.A.

Declaración de intereses

E.B. trabaja como consultor para Astrin Biosciences, Tempus AI y EMRGNSE. J.H. trabaja como consultor para Tempus AI y Astrin Biosciences, y es cofundador de EMRGNSE LLC. J.M.D. es el director científico de Astrin Biosciences y tiene opciones sobre acciones. El interés relacionado con J.M.D. ha sido revisado y gestionado por la Universidad de Minnesota de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. N.A.Z. ha recibido honorarios por asesoramiento de Bayer (institucional) y Johnson and Johnson (institucional), y honorarios por consultoría de Slingshot Insights y Mosaic. E.S.A. declara haber recibido subvenciones y honorarios personales de Janssen, Johnson & Johnson, Sanofi, Bayer, Bristol Myers Squibb, Convergent Therapeutics, Curium, MacroGenics, Merck, Pfizer y AstraZeneca; honorarios personales de Aadi Bioscience, Abeona Therapeutics, Aikido Pharma, Astellas, Amgen, Blue Earth, Boundless Bio, Corcept Therapeutics, Duality Bio, Exact Sciences, Hookipa Pharma, Invitae, Eli Lilly, Foundation Medicine, Menarini-Silicon Biosystems, Tango Therapeutics, Tempus, Tolmar Scientific, VIR Biotechnology y Z-alpha; y subvenciones de Novartis, Celgene y Orion. E.S.A. también tiene una patente para una tecnología de biomarcador AR-V7 que ha sido licenciada a QIAGEN.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Participantes del estudio

Inscribimos prospectivamente a 100 adultos con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración en la Universidad de Minnesota entre marzo de 2023 y noviembre de 2024. El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional (IRB, número STUDY00013815), y todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. Dado que se requería adenocarcinoma de próstata para la inclusión en el estudio, todos los pacientes eran hombres.

La población del estudio consistió en pacientes adultos con cáncer de próstata avanzado que estaban en condiciones clínicas para recibir el tratamiento estándar con 177Lu-PSMA-617. La edad media en el momento de la inscripción en el estudio fue de 74 años, con un rango de 44 a 94 años. Se requería que los pacientes tuvieran adenocarcinoma de próstata confirmado histológicamente, enfermedad progresiva y al menos una lesión metastásica con alta captación de PSMA en la imagen PET-PSMA, así como una función renal adecuada. Se excluyeron los pacientes que presentaban otra neoplasia maligna activa concurrente, lesiones metastásicas predominantemente negativas para PSMA en la imagen PET-PSMA, metástasis hepáticas o cerebrales negativas para PSMA, evidencia histológica de cáncer de próstata neuroendocrino puro o de células pequeñas, o función renal inadecuada (creatinina sérica núcleo > citoplasma > mitocondria > otros (incluidos el retículo endoplásmico, el endosoma, el peroxisoma, el aparato de Golgi y el lisosoma).

Enumeración de CTC

La enumeración de CTC se realizó según lo descrito anteriormente.^[27] Brevemente, 20 ml de sangre total se sometieron a la eliminación de glóbulos rojos y leucocitos mediante un chip microfluídico, lo que produjo 6 ml de células enriquecidas. Las células se etiquetaron con anticuerpos fluorescentes dirigidos a PSMA y a la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), junto con la tinción nuclear de Hoechst. Las CTC se analizaron y se enumeraron utilizando un sistema de doble modalidad que combinaba la microscopía holográfica digital de alto rendimiento y la tinción por inmunofluorescencia. Las CTC se definieron como células positivas para Hoechst que superaban un umbral de morfología basado en el aprendizaje profundo y que expresaban PSMA con o sin expresión concurrente de EpCAM. Esta plataforma multimodal permitió la identificación en tiempo real asistida por etiquetas de las subpoblaciones de CTC tanto positivas como negativas para EpCAM con una baja tasa de falsos positivos (de mitocondria > otros (incluidos el retículo endoplásmico, el endosoma, el peroxisoma, el aparato de Golgi y el lisosoma).

Enumeración de CTC

La enumeración de CTC se realizó según lo descrito previamente.^[27] Brevemente, se procesaron 20 mL de sangre total para eliminar los glóbulos rojos y los leucocitos mediante un chip microfluídico, lo que dio como resultado 6 mL de células enriquecidas. Las células se etiquetaron con anticuerpos fluorescentes que se dirigían a PSMA y a la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), junto con la tinción nuclear de Hoechst. Las CTC se analizaron y se enumeraron utilizando un sistema de doble modalidad que combinaba la microscopía holográfica digital de alto rendimiento y la tinción por inmunofluorescencia. Las CTC se definieron como células Hoechst-positivas que superaban un umbral de morfología holográfica basado en el aprendizaje profundo y que expresaban PSMA con o sin expresión concurrente de EpCAM. Esta plataforma multimodal permitió la identificación en tiempo real asistida por etiquetas de las subpoblaciones de CTC EpCAM-positivas y EpCAM-negativas con una baja tasa de falsos positivos (de núcleo > citoplasma > mitocondria > otros (incluidos el retículo endoplásmico, el endosoma, el peroxisoma, el aparato de Golgi y el lisosoma).

Enumeración de CTC

La enumeración de CTC se realizó según lo descrito previamente.^[27] Brevemente, se procesaron 20 mL de sangre total para eliminar los glóbulos rojos y los leucocitos mediante un microchip, obteniendo 6 mL de células enriquecidas. Las células se marcaron con anticuerpos conjugados fluorescentemente dirigidos contra PSMA y la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), junto con el tinte nuclear de Hoechst. Las CTC se analizaron y se enumeraron utilizando un sistema de doble modalidad que combina la microscopía holográfica digital de alto rendimiento y la tinción por inmunofluorescencia. Las CTC se definieron como células Hoechst-positivas que superaban un umbral de morfología holográfica basado en aprendizaje profundo y que expresaban PSMA con o sin expresión concurrente de EpCAM. Esta plataforma multimodal permitió la identificación en tiempo real asistida por marcadores de las subpoblaciones de CTC tanto EpCAM-positivas como EpCAM-negativas, con una baja tasa de falsos positivos (de