Los vesículos de CAR-NK derivados de iPSC programables remodelan el microambiente inmunitario y erradican los tumores.

Las terapias con receptores quiméricos de antígenos (CAR) han demostrado un éxito notable en las neoplasias hematológicas, pero su aplicación en tumores sólidos se ve limitada por el síndrome de liberación de citoquinas, la neurotoxicidad y el microambiente tumoral inmunosupresor (TME).^[1],^[2],^[3] Las células asesinas naturales (NK) ofrecen una alternativa prometedora debido a su citotoxicidad independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y al bajo riesgo de enfermedad de injerto contra huésped.^[4],^[5],^[6],^[7] También secretan quimiocinas como XCL1 y CCL5 para reclutar cDC1 y favorecer un TME proinflamatorio.^[8],^[9],^[10] Sin embargo, los enfoques convencionales de CAR-NK que utilizan NK92 o células NK de sangre periférica sufren de una escasa persistencia tumoral, una penetración limitada y una expansión ineficiente.^[11],^[12] Las células NK derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (iNK) proporcionan una fuente citotóxica renovable y estandarizada, adecuada para la producción de grado clínico^[11],^[13],^[14] y, por lo tanto, se seleccionaron como la plataforma para un mayor desarrollo.

A pesar de estas ventajas, persisten desafíos clave, como el rechazo inmunitario, la penetración limitada en el estroma y la expansión in vitro ineficiente, que dificultan la traslación de las terapias CAR-NK.^[15],^[16],^[17] Para abordar estos desafíos, proponemos una estrategia terapéutica innovadora basada en vesículas extracelulares CAR-iNK (EV) (CAR-iNEV). En este estudio, seleccionamos las iNK como la fuente parental de CAR-iNEV, debido a su potencial de expansión ilimitado, la consistencia entre lotes y la compatibilidad con la ingeniería genética. Su tamaño a nanoescala permite que las CAR-iNEV penetren eficientemente en la densa barrera del estroma de los tumores sólidos y ejerzan efectos antitumorales en lo profundo del núcleo tumoral.^[18],^[19] Además de las dimensiones favorables para la difusión pasiva, las EV pueden remodelar activamente el TME. Las CAR-iNEV expresan proteínas moduladoras de la MEC, como MMP1, MMP14 y CD147, que promueven la degradación del colágeno y el aflojamiento del estroma, y pueden modular la actividad de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) para reducir la deposición de MEC y la rigidez de la matriz.^[20] Estas propiedades facilitan una mayor infiltración en el tejido tumoral.^[21],^[22] En conjunto, estos mecanismos respaldan la selección de EV sobre plataformas basadas en células para superar las barreras del estroma en los tumores sólidos.

CD133 es un marcador de células madre cancerosas (CSC) bien establecido que se expresa en gran medida en múltiples neoplasias, incluido el glioblastoma,^[23] el cáncer colorrectal,^[24] el cáncer de próstata,^[25] el carcinoma hepatocelular (HCC),^[26] y el cáncer de páncreas.^[27],^[28],^[29] La regulación al alza de la expresión de CD133 está estrechamente asociada con la agresividad tumoral, la resistencia a la quimioterapia y la recurrencia.^[30] Para mejorar la focalización tumoral, diseñamos un nanobody (Nb) de alta afinidad para CD133 y lo utilizamos para reemplazar el fragmento de cadena variable de un solo dominio (scFv) convencional en los constructos CAR. En comparación con los scFv, los Nb exhiben una estabilidad estructural superior y una menor inmunogenicidad.^[18],^[31]

En este estudio, desarrollamos CAR-iNEV modificadas con CD133 (CARCD133-iNEV) que eliminan selectivamente las células tumorales y reprograman el microambiente inmunitario al promover la infiltración y activación de macrófagos y neutrófilos. En ratones humanizados, las CARCD133-iNEV suprimieron la progresión tumoral y prolongaron significativamente la supervivencia. Cuando se combinaron con la terapia anti-CD47, mejoraron aún más la regresión tumoral e indujeron memoria inmunitaria, lo que resultó en un control tumoral duradero. Estos resultados establecen las CARCD133-iNEV como una inmunoterapia CAR sin células capaz de superar las limitaciones clave de las terapias CAR-T y CAR-NK basadas en células, lo que destaca su potencial de traslación para el tratamiento de tumores sólidos.

Resultados

Selección y validación funcional de un nanobody CD133 de alta afinidad

Para desarrollar un Nb de focalización de CD133 optimizado, establecimos un sistema de expresión procarionte para las proteínas humanas y murinas recombinantes de CD133 y realizamos un cribado de visualización de fagos combinado con ELISA para identificar candidatos de Nb de alta afinidad (Figuras 1A y 1B). Los 10 clones candidatos principales identificados en el paso de selección inicial se expresaron y purificaron en un sistema de expresión procarionte, y su expresión se validó utilizando etiquetas de hemaglutinina (HA) y anticuerpos específicos para VHH (Figura 1C; Tabla S1). El análisis de ELISA confirmó que Nb63 exhibió la mayor afinidad de unión tanto a las proteínas humanas como a las murinas de CD133 (Figura 1D). Se realizó un análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) para determinar la cinética de unión de Nb-CD133 (Nb63). Las constantes de disociación (Kd) para la unión de Nb63 a CD133 humano y murino fueron de 1,97 nM y 2,51 nM, respectivamente (Figura 1E).

Diseño y optimización de células CAR-NK derivadas de iPSC

La optimización del diseño de CAR es fundamental para mejorar la función terapéutica de las células CAR-iNK contra los tumores sólidos. En este estudio, diseñamos un constructo CAR mejorado al incorporar un Nb de alta afinidad, Nb-CD133 (Nb63), en lugar del scFv convencional. Además, para optimizar la señalización CAR, diseñamos siete arquitecturas CAR específicas de NK distintas, cada una de las cuales contenía un dominio transmembrana, uno o dos dominios costimuladores asociados a NK y una cadena de señalización CD3ζ (Figura 1F). Los constructos CAR se subclonaron e insertaron en el vector lentiviral pCD513B-CopGFP, y las células iNK que expresaban Nb-CD133 se clasificaron mediante citometría de flujo para la posterior evaluación funcional (Figura 1G). En particular, el constructo CAR de tercera generación, que incluía los dominios costimuladores CD3ζ y NKG2D-2B4-DAP10, exhibió el mayor potencial citotóxico al tiempo que mantenía la integridad funcional de las células NK, como lo refleja la expresión sostenida de moléculas efectoras (FasL, TRAIL, perforina, granzima B) y receptores activadores (CD16, NKp46; Figuras 1H y S1A). Para evaluar aún más la influencia de los diferentes dominios costimuladores en la citotoxicidad de las células CAR-iNK, establecimos células tumorales Colon26 con deleción de CD133 (CD133-KO). Los ensayos de citotoxicidad in vitro revelaron que, independientemente del estado de expresión de CD133, las células CAR-iNK que expresaban el CAR NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ presentaron la mayor actividad de eliminación tumoral (Figuras S1B y S1C). Tras el cribado funcional, seleccionamos el constructo NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ como el mejor andamio CAR debido a su superior citotoxicidad y fenotipo de célula NK conservado. Para caracterizar aún más su actividad funcional, medimos la expresión de CD107a y la producción intracelular de interferón (IFN)-γ en las células CAR-iNK mediante citometría de flujo. En ausencia del antígeno diana CD133, las células CAR-iNK exhibieron un nivel de activación basal; sin embargo, al interactuar con las células tumorales CD133+, tanto los niveles de CD107a como los de IFN-γ se elevaron notablemente. Este patrón de activación dependiente del antígeno se observó de forma constante en múltiples líneas celulares tumorales, incluidas las variantes de tipo salvaje y CD133-KO de H22, Panc02 y Colon26 (Figura S1D). Estos resultados demuestran que las células CAR-iNK que expresan el constructo NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ exhiben una actividad antitumoral significativamente mayor y una mayor capacidad para atacar selectivamente las células tumorales CD133+.

Preparación y caracterización de CAR-iNEV

El tamaño uniforme de las partículas es fundamental para lograr el efecto de mejora de la permeabilidad y la retención. Por lo tanto, empleamos la filtración tangencial (TFF) para aislar las CAR-iNEV, que, en comparación con la ultracentrifugación, ofrece un mejor control sobre la distribución del tamaño, el rendimiento y la pureza, mejorando así la acumulación tumoral y la eficacia in vivo.^[32],^[33] Para mejorar la especificidad de focalización de las CAR-iNEV, se incorporó un Nb CD133 en el constructo CAR (CARCD133-iNEV), mientras que las CAR-iNEV modificadas con una secuencia de Nb de control no focalizada (CARCtrl-iNEV) y las iNEV no modificadas sin CAR (Blank-iNEV) sirvieron como controles (Figura 2A). El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) reveló que los diámetros medios de las partículas de CARCD133-iNEV y CARCtrl-iNEV fueron de 113 ± 16 nm y 116 ± 22 nm, respectivamente, con potenciales zeta de −14,2 ± 1,5 mV y −13,73 ± 0,49 mV, respectivamente (Figuras 2B y 2C). El análisis de Western blot confirmó la purificación exitosa de las CAR-iNEV, como lo indica la presencia de los marcadores de EV CD9, CD81, CD63 y Alix, mientras que el marcador del retículo endoplásmico, la calnexina, estaba ausente (Figura 2D). La microscopía electrónica de transmisión (MET) validó aún más la morfología de las CAR-iNEV, revelando estructuras de vesículas esféricas o elípticas con diámetros que oscilan entre 50 y 120 nm, lo que es consistente con las mediciones de NTA. Además, el etiquetado con oro combinado con el enriquecimiento con cuentas magnéticas HA confirmó la presencia de Nb CD133 con etiqueta HA en las superficies de las CAR-iNEV (Figura 2E). El análisis de citometría de flujo respaldó aún más estos hallazgos: en comparación con las iNEV no modificadas, las CAR-iNEV presentaron una señal de fluorescencia de isotiocianato de fluoresceína (FITC) significativamente más fuerte tras la tinción con anticuerpos anti-HA-FITC, lo que confirmó la presentación eficaz de la estructura CAR en la superficie (Figura 2F). La cuantificación basada en ELISA reveló que cada CAR-iNEV contenía aproximadamente 86 moléculas de Nb (Figura S2A). Las pruebas de estabilidad mostraron que las CAR-iNEV mantuvieron una distribución del tamaño y una concentración de partículas consistentes durante un máximo de 60 días a 4 °C (Figura S2B). En paralelo, evaluamos los marcadores de EV, las proteínas funcionales (perforina y granzima B), los receptores de células NK (NKG2D y NKp46) y la actividad citotóxica, todos los cuales permanecieron sin cambios en relación con el día 0 (Figuras S2C y S2D). En conjunto, estos resultados demuestran que la CAR-iNEV conserva tanto la integridad estructural como la funcional durante el almacenamiento refrigerado, lo que subraya su estabilidad. Además, el análisis de Western blot mostró que las células NK diseñadas con CAR y sus EV derivadas de iNK, PB-NK y NK-92 expresaban niveles comparables de proteínas citotóxicas y receptores activadores (Figura S2E). Dada la superior capacidad de expansión, estabilidad y consistencia de la producción de las iNK, las seleccionamos como la fuente óptima para las CAR-iNEV. Estudios previos han demostrado que las EV derivadas de células NK conservan muchas de las moléculas efectoras de sus células parentales. Para validar esto en nuestro sistema, realizamos un análisis comparativo exhaustivo de los componentes funcionales clave en las CARCD133-iNEV y las CARCtrl-iNEV. Los ensayos cuantitativos revelaron que tanto las CARCD133-iNEV como las CARCtrl-iNEV contienen altos niveles de proteínas citotóxicas (perforina y granzima B) y factores proinflamatorios (factor de necrosis tumoral [TNF]-α e IFN-γ; Figuras S2F y S2G).

Para evaluar visualmente la capacidad de focalización tumoral de las CAR-iNEV, etiquetamos las vesículas con el colorante fluorescente PKH67 y las incubamos con células tumorales fijadas. La imagen de microscopía confocal reveló que las CARCD133-iNEV se enriquecieron en gran medida en las membranas de las células tumorales que expresaban CD133, mientras que casi no se observó unión de las CARCtrl-iNEV (Figura 2G). A continuación, investigamos el proceso mediante el cual las células vivas internalizan las CAR-iNEV. Las células tumorales se co-incubaron con CAR-iNEV etiquetadas con PKH67, y se monitoreó la captación celular de las CAR-iNEV. En comparación con el grupo CARCtrl-iNEV, el grupo CARCD133-iNEV mostró una rápida internalización de las CAR-iNEV etiquetadas en 12 horas, como lo indica la mayor intensidad de fluorescencia de las células en ese grupo. Además, el aumento de la intensidad de fluorescencia observado en el grupo CARCD133-iNEV se abolió tras la deleción de CD133 (Figura 2H). Para evaluar la relación entre la captación de CAR-iNEV y la citotoxicidad, realizamos ensayos de curso de tiempo en los que las CAR-iNEV se co-cultivaron con células tumorales durante diferentes puntos temporales. La muerte de las células tumorales aumentó con el tiempo de co-cultivo y se estabilizó en aproximadamente 12 horas. El bloqueo de la internalización de EV con el inhibidor de la dinamina, Dynasore, redujo notablemente la eliminación mediada por CAR-iNEV (Figuras S2H y S2I). En conjunto, estos resultados respaldan un modelo mecanístico en el que las CAR-iNEV primero deben ser captadas de manera eficiente por las células tumorales diana, lo que permite la liberación de su carga efectora citotóxica dentro de las células para desencadenar la muerte de las células tumorales.

Para verificar aún más la especificidad de CD133 de los CAR-iNEV, realizamos ELISA y ELISA basado en células. Los resultados del ELISA confirmaron que los CARCD133-iNEV se unían fuertemente tanto a las proteínas recombinantes humanas como murinas de CD133 (Figura 2I). Además, un ELISA basado en células demostró que los CARCD133-iNEV reconocen y se unen eficazmente al CD133 endógeno en la superficie de las células de cáncer gástrico, hepático y pancreático (Figura 2J). En particular, la unión de los CARCD133-iNEV fue casi inexistente en las células CD133-KO (Figura 2K). Finalmente, evaluamos la actividad citotóxica de los CAR-iNEV in vitro, utilizando CARCtrl-iNEV y Blank-iNEV como controles. Aunque los CARCtrl-iNEV y Blank-iNEV mostraron efectos citotóxicos basales, los CARCD133-iNEV indujeron un aumento significativo de la lisis de las células tumorales en las tres líneas celulares tumorales, mientras que este efecto no se observó en las células CD133-KO (Figura 2L). El aumento de la actividad antitumoral de los CARCD133-iNEV puede atribuirse a su superior afinidad de direccionamiento y eficiencia de internalización. En conjunto, estos resultados muestran que hemos diseñado y purificado con éxito los CARCD133-iNEV, que exhibieron una excepcional especificidad de CD133, una robusta unión a las células tumorales y una potente actividad citotóxica.

Seguridad in vivo y direccionamiento tumoral de los CAR-iNEV

La seguridad sigue siendo una consideración crítica en la aplicación clínica de la terapia con células CAR-T/CAR-NK. En este estudio, evaluamos sistemáticamente el perfil de bioseguridad de los CAR-iNEV y comparamos su eficacia terapéutica y toxicidad con las de las células CAR-iNK. Para evaluar rigurosamente la posible toxicidad, se administraron inyecciones de células CAR-iNK y CAR-iNEV a ratones. Según informes anteriores, la dosis circulante eficaz de las células CAR-NK es de aproximadamente 1 × 107 células, lo que influyó en el diseño de nuestro régimen de dosificación.^[11],^[34],^[35] En el modelo de ratón con HCC inducido por H22, se administraron CAR-iNEV a altas dosis (1 × 1012 partículas) o bajas dosis (1 × 1011 partículas) o células CAR-iNK (1 × 107 células) a los ratones (Figura 3A). Se controlaron de cerca las condiciones fisiológicas de los ratones y se realizó una eutanasia humanitaria si la pérdida de peso corporal de los animales superaba el 15% o si se observaba una angustia grave. Los resultados revelaron que no se observó mortalidad en ninguno de los grupos tratados con CAR-iNEV, independientemente de la dosis administrada (Figura 3B). Para evaluar aún más la toxicidad sistémica, realizamos análisis hematológicos y bioquímicos de los ratones tratados. Los ratones tratados con células CARCD133-iNK mostraron efectos adversos graves, que incluyeron pérdida de peso, convulsiones y mortalidad, acompañados de recuentos anormales de células sanguíneas. En contraste, los grupos tratados con CARCD133-iNEV no mostraron reacciones tóxicas evidentes, lo que indica que la terapia con CAR-iNEV tiene una ventana terapéutica más amplia y un menor riesgo de toxicidad en comparación con la terapia con CAR-iNK (Figuras 3C y S3A). Además, la tinción con H&E de los órganos principales de los ratones tratados con altas o bajas dosis de CARCD133-iNEV no reveló signos de daño tisular, lo que apoya aún más la excelente biocompatibilidad y el perfil de seguridad de los CARCD133-iNEV (Figura S3B). A cualquier dosis, el tratamiento con CARCD133-iNEV redujo significativamente el volumen y el peso del tumor, mientras que el grupo CARCtrl-iNEV no mostró una supresión notable del tumor (Figura 3D). De las condiciones probadas, el tratamiento con CARCD133-iNEV a altas dosis produjo la inhibición tumoral más potente, sin toxicidad observable, y se utilizó la dosis alta en los experimentos posteriores. Estos resultados establecen el CARCD133-iNEV como un candidato inmunoterapéutico bien tolerado y eficaz, y proporcionan un sólido respaldo para su traslación clínica.

Para evaluar la capacidad de direccionamiento tumoral de los CARCD133-iNEV y rastrear su biodistribución in vivo, utilizamos un sistema de imagen in vivo (IVIS) para la imagen de animales vivos. Cuando los volúmenes tumorales de los animales alcanzaron aproximadamente 150 mm3, se inyectaron a los animales CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV, y se registraron las señales de fluorescencia a las 4, 8 y 24 horas posteriores a la inyección. En comparación con el grupo CARCtrl-iNEV, el grupo CARCD133-iNEV presentó señales de fluorescencia significativamente mayores en el sitio del tumor, y estas señales persistieron durante al menos 24 horas, lo que indica una acumulación sostenida de los CARCD133-iNEV en el sitio del tumor (Figuras 3E, 3F y S3C). La imagen ex vivo confirmó aún más el enriquecimiento preferencial de los CARCD133-iNEV dentro de los tejidos tumorales. El análisis de fluorescencia de las secciones tumorales reveló una intensa acumulación de señal en el grupo CARCD133-iNEV, con una acumulación mínima de señal en los órganos principales distintos del hígado (Figuras 3G y 3H). La tinción inmunohistoquímica confirmó aún más que los CARCD133-iNEV se acumularon selectivamente en los tumores, donde produjeron señales Nb significativamente mayores que las del grupo CARCtrl-iNEV. Es importante destacar que no se detectó una acumulación de señal sustancial en otros órganos, lo que confirma la especificidad tumoral de los CARCD133-iNEV (Figura 3I). Para cuantificar aún más su capacidad de direccionamiento tumoral, incorporamos análisis adicionales de citometría de flujo in vivo e imagen de radiotrazador de circonio-89 (89Zr). Estos datos demostraron que los CARCD133-iNEV se acumularon preferentemente en los tejidos tumorales CD133+, con niveles de circulación mínimos y una baja captación en los órganos normales principales (Figuras 3J–3L y S3D). Esta biodistribución enriquecida en el tumor sustenta su favorable perfil de seguridad al limitar la exposición fuera del objetivo.

Los CARCD133-iNEV inducen la muerte directa de las células tumorales y reprograman el microambiente inmunitario tumoral

Para validar aún más la eficacia terapéutica de los CAR-iNEV, establecimos modelos de xenoinjerto tumoral para HCC (H22), cáncer de páncreas (Panc02) y cáncer colorrectal (Colon26) en ratones. Los ratones del modelo recibieron inyecciones intravenosas de CARCD133-iNEV a una dosis alta (1 × 1012 partículas) tres veces por semana, y se controlaron regularmente el volumen tumoral y el peso corporal (Figura 4A). Los resultados revelaron que el tratamiento con CARCD133-iNEV inhibió significativamente el crecimiento tumoral en todos los modelos de xenoinjerto tumoral (Figura 4B). No se observaron cambios significativos en el peso corporal ni anomalías hematológicas durante el período de tratamiento, lo que indica que los CARCD133-iNEV tienen un excelente perfil de seguridad, incluso a dosis altas (Figuras S4A y S4B). Para imitar aún más el TME nativo, establecimos un modelo ortotópico de HCC utilizando células Hep53.4 marcadas con luciferasa. La imagen de animales vivos IVIS demostró que el tratamiento con CARCD133-iNEV suprimió eficazmente el crecimiento tumoral y prolongó significativamente la supervivencia en los ratones con tumor (Figuras 4C–4E y S4C). A continuación, evaluamos la relevancia clínica de la terapia con CARCD133-iNEV utilizando ratones con sistema inmunitario humanizado (HIS) (huHSC-NCG-M) injertados con xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) de cáncer de hígado (n = 4), cáncer de páncreas (n = 3) y cáncer colorrectal (n = 3). Los CAR-iNEV (humanos) se generaron a partir de células NK derivadas de iPSC humanas y se validó la carga de CAR mediante Western blot, citometría de flujo, microscopía electrónica y NTA (Figuras S5A–S5D). En particular, el tratamiento con CARCD133-iNEV (humanos) suprimió significativamente la progresión tumoral en 7 de 10 modelos de PDX CD133+ (Figuras 4F–4H). Además, no se observó una pérdida de peso significativa ni efectos adversos relacionados con el tratamiento en los ratones HIS, lo que apoya aún más el favorable perfil de seguridad y el potencial de traslación de la terapia con CARCD133-iNEV (Figuras 4I y 4J).

La activación de macrófagos y neutrófilos impulsada por CARCD133-iNEV remodela el microambiente inmunitario tumoral

Para determinar si los CARCD133-iNEV pueden modular el TME, realizamos un secuenciamiento de ARN de una sola célula en las células inmunitarias CD45+ aisladas de los tejidos tumorales (Panc02) recogidos 2 semanas después del tratamiento. El análisis preliminar reveló alteraciones significativas en la composición de los subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes tumorales en el grupo tratado con CARCD133-iNEV, lo que sugiere que el tratamiento tuvo un profundo efecto de reprogramación en las células inmunitarias (Figuras S6A–S6C). Los macrófagos que se encontraron en los tejidos se clasificaron en 11 grupos distintos; se observó un aumento sustancial en la proporción de macrófagos proinflamatorios y una marcada reducción en la proporción de macrófagos promotores del tumor C1q+ después del tratamiento con CARCD133-iNEV (Figuras 5A, 5B, S7A y S7B). El análisis de enriquecimiento de genes reveló que los genes clave regulados al alza en los macrófagos del grupo tratado estaban asociados con las respuestas proinflamatorias (Figura S8A). Además, el análisis de la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) identificó siete subconjuntos de neutrófilos (grupos 0-7) dentro de los tejidos tumorales (Figura S9A). El tratamiento con CARCD133-iNEV aumentó notablemente la abundancia de neutrófilos y enriqueció los subconjuntos (grupos 0, 1, 3, 6 y 7) asociados con el quimiotaxis, la activación inflamatoria y las respuestas inmunitarias innatas, lo que es consistente con la polarización antitumoral N1. En contraste, los grupos 5 y 6 fueron más prevalentes en el grupo de control y se relacionaron con vías implicadas en el desarrollo y la regulación del crecimiento de los tejidos (Figuras S9B y S9C). Los neutrófilos tratados con CAR-iNEV también mostraron una mayor expresión de CCL3 y CCL4, características distintivas de la polarización N1, lo que apoya aún más su papel en la promoción de un fenotipo de neutrófilos antitumoral dentro del TME (Figura S9D).

Dado el pronunciado remodelado funcional de los macrófagos tras el tratamiento con CARCD133-iNEV, realizamos además un análisis de trayectoria de pseudotiempo utilizando Monocle2. Las células del grupo 3 se identificaron como monocitos clásicos, y el estado 2, que implicaba principalmente al grupo 3, se designó como el punto de partida de la trayectoria (Figura 5C). A medida que avanzaba el pseudotiempo, los macrófagos divergieron en el punto de ramificación 2, diferenciándose en dos linajes distintos. Una rama, que estaba compuesta predominantemente por las células de los grupos 1 y 2 del grupo CARCD133-iNEV, exhibió un fenotipo proinflamatorio, mientras que la otra rama, que estaba compuesta principalmente por las células del grupo 0 del grupo de control, conservó una firma inmunosupresora (Figura 5D). El análisis de la expresión génica de los macrófagos reveló que Ifitm2, Nos2 y Cxcl2 se expresaban en gran medida a lo largo de la primera rama, y sus niveles de expresión aumentaron a medida que avanzaba el pseudotiempo. En contraste, la segunda rama mostró una alta expresión de marcadores de macrófagos inmunosupresores, incluidos C1qa, C1qb y C1qc (Figura S10A). Además, el análisis de expresión génica dependiente de la rama basado en el algoritmo BEAM identificó cuatro grupos de genes distintos asociados con el punto de ramificación 2. Antes del punto de ramificación 2, los grupos de macrófagos (grupos 2 y 4) presentaron firmas asociadas con la fosforilación oxidativa y el procesamiento del ARNm. Sin embargo, los macrófagos que se diferenciaron hacia el estado enriquecido en el grupo CARCD133-iNEV (grupo 3) se enriquecieron en gran medida en las vías de señalización mediadas por citocinas y en las vías de activación de la respuesta inmunitaria, lo que indica un aumento de las funciones efectoras inmunitarias. Por el contrario, los macrófagos que se diferenciaron hacia el estado del grupo PBS se enriquecieron en procesos de remodelación de la cromatina y regulación del ciclo celular, lo que resultó en una reducción significativa de la activación inmunitaria en comparación con el punto de ramificación 2 (Figuras 5E y S10B). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con CARCD133-iNEV estimula eficazmente la activación inmunitaria de los macrófagos, desplazando el TME hacia un estado más inmunostimulante y proinflamatorio.

Estudios previos han demostrado que el aumento de la actividad glucolítica en macrófagos y neutrófilos se asocia típicamente con un alto estado de activación; esto desempeña un papel clave en la inflamación, las respuestas inmunitarias y el microambiente tumoral (TME).^[36],^[37],^[38] Para investigar el estado metabólico de estas células inmunitarias en el contexto del tratamiento con CARCD133-iNEV, aislamos macrófagos y neutrófilos de tejidos tumorales mediante clasificación basada en citometría de flujo. El análisis metabolómico reveló un aumento significativo de la glucólisis aeróbica en ambas poblaciones celulares. Estos hallazgos se validaron aún más mediante ELISA y mediante la medición de la tasa de acidificación extracelular (ECAR), lo que confirmó un cambio metabólico hacia la glucólisis en los macrófagos y neutrófilos activados por CARCD133-iNEV (Figuras 5F, 5G y S11A–S11C). Los experimentos de cocultivo revelaron que la exposición directa de macrófagos o neutrófilos a CARCD133-iNEV tuvo efectos fenotípicos mínimos, mientras que el medio acondicionado de células tumorales tratadas con CAR-iNEV aumentó notablemente los marcadores de macrófagos M1 (CD86 y MHC II) e indujo un fenotipo de neutrófilos similar a N1 con niveles elevados de TNF-α e interleucina-12 (Figuras S11D y S11E). Estos hallazgos indican que la activación de macrófagos y neutrófilos mediada por CAR-iNEV se produce indirectamente a través de la modulación de las células tumorales y es insuficiente para causar una activación excesiva de los neutrófilos.

Para determinar si la supresión tumoral mediada por CARCD133-iNEV depende de los macrófagos o los neutrófilos, eliminamos selectivamente estas células inmunitarias in vivo utilizando anticuerpos contra Ly6G (para la depleción de neutrófilos) o liposomas de clodronato (para la depleción de macrófagos). Los resultados demostraron que la depleción de neutrófilos o macrófagos afectó significativamente la eficacia terapéutica de los CAR-iNEV (Figura 5H). En particular, la depleción de macrófagos abolió casi por completo los efectos antitumorales de los CARCD133-iNEV, lo que sugiere que la supresión tumoral por CARCD133-iNEV depende principalmente de la activación de los macrófagos. Para evaluar el papel de las células T en la eliminación tumoral mediada por CAR-iNEV, evaluamos su eficacia en ratones Rag1-KO (deficientes en células T) y en ratones desnudos. Sorprendentemente, los CARCD133-iNEV siguieron siendo eficaces en ambos modelos, lo que demuestra que su capacidad de eliminar tumores es independiente de la participación de las células T (Figuras S11F–S11H).

La producción de especies reactivas de oxígeno es un mecanismo bien establecido por el cual los macrófagos eliminan patógenos y células tumorales. Dado que los macrófagos en los tumores tratados con CARCD133-iNEV presentaban niveles elevados de óxido nítrico sintasa inducible (NOS2), generamos ratones con deleción condicional específica de macrófagos de NOS2 (F4/80-Cre; NOS2flox/flox) para una mayor investigación. Los resultados revelaron que la supresión tumoral mediada por CARCD133-iNEV se redujo significativamente en los ratones NOS2cKO (Figura 5I). Estos hallazgos sugieren que CARCD133-iNEV ejerce sus efectos antitumorales a través de la activación de macrófagos y neutrófilos, principalmente mediante la inducción de la regulación al alza de NOS2 en los macrófagos.

Inhibición sinérgica del cáncer metastásico e inducción de la memoria inmunológica mediante terapia combinada

Dado el profundo papel de los CAR-iNEV en la remodelación del TME, exploramos aún más su potencial en terapias combinadas. Los inhibidores del punto de control inmunitario (ICIs), como los anticuerpos contra PD-1, CTLA-4 y CD47, son estrategias esenciales en la inmunoterapia contra el cáncer. A continuación, exploramos la sinergia terapéutica entre CARCD133-iNEV e ICIs. Nuestros resultados mostraron que la monoterapia con CARCD133-iNEV o con anticuerpos anti-PD-1/CTLA-4/CD47 suprimió parcialmente el crecimiento tumoral, mientras que el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con un anticuerpo anti-CD47 bloqueó por completo la progresión tumoral (Figuras 6A y 6B).

Para evaluar la eficacia de los CARCD133-iNEV y los anticuerpos anti-CD47 en modelos metastásicos clínicamente relevantes, establecimos modelos de metástasis peritoneal y pulmonar en ratones. Se inyectaron células Hep53.4 marcadas con luciferasa por vía intraperitoneal o intravenosa en ratones, y la imagen de bioluminiscencia se utilizó para controlar la progresión tumoral. En el modelo de metástasis pulmonar, la monoterapia con CARCD133-iNEV o con un anticuerpo anti-CD47 retrasó solo modestamente la progresión tumoral, y los ratones finalmente sucumbieron a la carga tumoral. En contraste, la terapia combinada suprimió significativamente las lesiones metastásicas y prolongó la supervivencia, y el 80 % (4/5) de los ratones lograron una eliminación completa del tumor. De manera similar, en el modelo de metástasis peritoneal, la terapia combinada con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 condujo a la regresión completa del tumor en el 60 % de los ratones, prolongando significativamente su supervivencia (Figuras 6C, 6D y S11I). Estos datos sugieren que el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con el bloqueo de CD47 erradica eficazmente los tumores metastásicos y mejora notablemente los resultados de supervivencia.

Para evaluar el potencial terapéutico de los CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 en tumores resistentes a PD-1, establecimos modelos HIS-PDX. Los tumores se derivaron de cinco pacientes con cáncer de páncreas en los que la terapia neoadyuvante con PD-1 había fracasado, y los tejidos tumorales se implantaron en ratones HIS. Los resultados revelaron que el bloqueo de CD47 por sí solo no logró suprimir significativamente la progresión tumoral, mientras que la monoterapia con CARCD133-iNEV retrasó parcialmente el crecimiento tumoral, pero fue insuficiente para lograr una remisión completa. Sin embargo, el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con la terapia anti-CD47 suprimió significativamente el crecimiento tumoral y condujo a una eliminación casi completa del tumor (Figura 6E). También incluimos cinco muestras de PDX de pacientes con cáncer de colon que habían fracasado con quimioterapia o radioterapia. La terapia combinada con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 demostró una eficacia comparable en estos PDX e inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Figura 6F).

Dada la eficacia superior de los CARCD133-iNEV junto con el bloqueo de CD47 en la eliminación de tumores metastásicos, a continuación, examinamos si esta terapia podría inducir una memoria inmunológica duradera. A los 120 días posteriores a la eliminación del tumor, se volvió a inocular a los ratones libres de tumores con las mismas células tumorales (células Panc02-Luc). No se observó recurrencia tumoral en el grupo de terapia combinada, mientras que los tumores se desarrollaron rápidamente en los ratones de control de la misma edad (Figura 6G). El análisis de citometría de flujo de los subconjuntos de células T esplénicas presentes en los ratones reveló un aumento significativo de la proporción de células T de memoria efectoras (CD62L−CD44+) dentro de las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ después de la inoculación subcutánea con células Panc02 (Figura 6H). Además, demostramos que este aumento no se debió a la activación residual de las células T, ya que las células T de memoria efectoras se mantuvieron en niveles basales en los ratones sin reinoculación (Figura 6I). Estos resultados sugieren que el tratamiento combinado con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 no solo logra la erradicación tumoral a largo plazo, sino que también induce una robusta memoria inmunológica mediada por células T, proporcionando una protección a largo plazo contra la recurrencia tumoral.

Selección y validación funcional de un nanobody CD133 de alta afinidad

Para desarrollar un Nb de orientación a CD133 optimizado, establecimos un sistema de expresión procarionte para las proteínas humanas y murinas recombinantes de CD133 y realizamos una selección por pantalla de fagos combinada con ELISA para identificar candidatos de Nb de alta afinidad (Figuras 1A y 1B). Los 10 clones candidatos principales identificados en el paso de selección inicial se expresaron y purificaron en un sistema de expresión procarionte, y su expresión se validó utilizando una etiqueta de hemaglutinina (HA) y anticuerpos específicos de VHH (Figura 1C; Tabla S1). El análisis de ELISA confirmó que Nb63 exhibió la mayor afinidad de unión tanto a las proteínas humanas como a las murinas de CD133 (Figura 1D). Se realizó un análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) para determinar la cinética de unión de Nb-CD133 (Nb63). Las constantes de disociación (Kd) para la unión de Nb63 a CD133 humano y murino fueron de 1,97 nM y 2,51 nM, respectivamente (Figura 1E).

Diseño y optimización de células CAR-NK derivadas de iPSC

La optimización del diseño de CAR es fundamental para mejorar la función terapéutica de las células CAR-iNK contra los tumores sólidos. En este estudio, diseñamos una construcción CAR mejorada incorporando un Nb de alta afinidad, Nb-CD133 (Nb63), en lugar del scFv convencional. Además, para optimizar la señalización de CAR, diseñamos siete arquitecturas CAR específicas de NK distintas, cada una de las cuales contenía un dominio transmembrana, uno o dos dominios costimuladores asociados a NK y una cadena de señalización CD3ζ (Figura 1F). Las construcciones CAR se subclonaron e insertaron en el vector lentiviral pCD513B-CopGFP, y las células iNK que expresaban Nb-CD133 se clasificaron mediante citometría de flujo para la posterior evaluación funcional (Figura 1G). En particular, la construcción CAR de tercera generación, que incluía los dominios costimuladores CD3ζ y NKG2D-2B4-DAP10, exhibió el mayor potencial citotóxico al tiempo que mantenía la integridad funcional de las células NK, lo que se reflejó en la expresión sostenida de moléculas efectoras (FasL, TRAIL, perforina, granzima B) y receptores activadores (CD16, NKp46; Figuras 1H y S1A). Para evaluar aún más la influencia de los diferentes dominios costimuladores en la citotoxicidad de las células CAR-iNK, establecimos células tumorales Colon26 con deleción de CD133 (CD133-KO). Los ensayos de citotoxicidad in vitro revelaron que, independientemente del estado de expresión de CD133, las células CAR-iNK que expresaban el CAR NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ presentaron la mayor actividad de eliminación de tumores (Figuras S1B y S1C). Tras la selección funcional, seleccionamos la construcción NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ como el mejor andamio CAR debido a su superior citotoxicidad y fenotipo de célula NK conservado. Para caracterizar aún más su actividad funcional, medimos la expresión de CD107a y la producción intracelular de interferón (IFN)-γ en las células CAR-iNK mediante citometría de flujo. En ausencia del antígeno CD133, las células CAR-iNK exhibieron un nivel de activación basal; sin embargo, al interactuar con las células tumorales CD133+, tanto los niveles de CD107a como los de IFN-γ se elevaron notablemente. Este patrón de activación dependiente del antígeno se observó de manera consistente en múltiples líneas celulares tumorales, incluidas las variantes de tipo salvaje y CD133-KO de H22, Panc02 y Colon26 (Figura S1D). Estos resultados demuestran que las células CAR-iNK que expresan la construcción NKG2D-2B4-DAP10-CD3ζ exhiben una actividad antitumoral significativamente aumentada y una mayor capacidad para atacar selectivamente las células tumorales CD133+.

Preparación y caracterización de CAR-iNEV

Un tamaño de partícula uniforme es fundamental para lograr el efecto de permeabilidad y retención mejoradas. Por lo tanto, empleamos la filtración tangencial (TFF) para aislar los CAR-iNEV, que, en comparación con la ultracentrifugación, ofrece un control superior sobre la distribución del tamaño, el rendimiento y la pureza, mejorando así la acumulación tumoral y la eficacia in vivo. ^[32], ^[33] Para mejorar la especificidad de direccionamiento de los CAR-iNEV, se incorporó un Nb CD133 en el constructo CAR (CARCD133-iNEV), mientras que los CAR-iNEV modificados con una secuencia de control Nb no dirigida (CARCtrl-iNEV) y los iNEV no modificados sin CAR (Blank-iNEV) sirvieron como controles (Figura 2A). El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) reveló que los diámetros medios de partícula de los CARCD133-iNEV y los CARCtrl-iNEV fueron de 113 ± 16 nm y 116 ± 22 nm, respectivamente, con potenciales zeta de −14,2 ± 1,5 mV y −13,73 ± 0,49 mV, respectivamente (Figuras 2B y 2C). El análisis de Western blot confirmó la purificación exitosa de los CAR-iNEV, como lo indica la presencia de los marcadores de EV CD9, CD81, CD63 y Alix, mientras que el marcador del retículo endoplásmico, la calnexina, estaba ausente (Figura 2D). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) validó aún más la morfología de los CAR-iNEV, revelando estructuras de vesículas esféricas o elípticas con diámetros que oscilan entre 50 y 120 nm, lo que es consistente con las mediciones de NTA. Además, el etiquetado con inmunogold combinado con el enriquecimiento con cuentas magnéticas de HA confirmó la presencia de Nb CD133 marcados con HA en las superficies de los CAR-iNEV (Figura 2E). El análisis de citometría de flujo respaldó aún más estos hallazgos: en comparación con los iNEV no modificados, los CAR-iNEV presentaron una señal de fluorescencia de isotiocianato de fluoresceína (FITC) significativamente más fuerte tras la tinción con anticuerpo anti-HA-FITC, lo que confirmó la presentación eficaz de la estructura CAR en la superficie (Figura 2F). La cuantificación basada en ELISA reveló que cada CAR-iNEV contenía aproximadamente 86 moléculas de Nb (Figura S2A). Las pruebas de estabilidad mostraron que los CAR-iNEV mantuvieron una distribución de tamaño y una concentración de partículas consistentes durante un máximo de 60 días a 4 °C (Figura S2B). En paralelo, evaluamos los marcadores de EV, las proteínas funcionales (perforina y granzima B), los receptores de la superficie de las células NK (NKG2D y NKp46) y la actividad citotóxica, todos los cuales permanecieron sin cambios en relación con el día 0 (Figuras S2C y S2D). En conjunto, estos resultados demuestran que el CAR-iNEV conserva tanto la integridad estructural como la funcional durante el almacenamiento refrigerado, lo que subraya su estabilidad. Además, el análisis de Western blot mostró que las células NK modificadas con CAR y sus EV derivadas de iNK, PB-NK y NK-92 expresaban niveles comparables de proteínas citotóxicas y receptores activadores (Figura S2E). Dada la capacidad de expansión, la estabilidad y la consistencia de la producción superiores de las iNK, las seleccionamos como la fuente óptima para los CAR-iNEV. Estudios previos han demostrado que los EV derivados de células NK conservan muchas de las moléculas efectoras de sus células progenitoras. Para validar esto en nuestro sistema, realizamos un análisis comparativo exhaustivo de los componentes funcionales clave en los CARCD133-iNEV y los CARCtrl-iNEV. Los ensayos cuantitativos revelaron que tanto los CARCD133-iNEV como los CARCtrl-iNEV contienen altos niveles de proteínas citotóxicas (perforina y granzima B) y factores proinflamatorios (factor de necrosis tumoral [TNF]-α e IFN-γ; Figuras S2F y S2G).

Para evaluar visualmente la capacidad de direccionamiento tumoral de los CAR-iNEV, etiquetamos las vesículas con el colorante fluorescente PKH67 y las incubamos con células tumorales fijadas. La imagen de microscopía confocal reveló que los CARCD133-iNEV se enriquecieron en gran medida en las membranas de las células tumorales que expresaban CD133, mientras que casi no se observó unión de los CARCtrl-iNEV (Figura 2G). A continuación, investigamos el proceso mediante el cual las células vivas internalizan los CAR-iNEV. Las células tumorales se co-incubaron con CAR-iNEV marcados con PKH67 y se monitoreó la captación celular de los CAR-iNEV. En comparación con el grupo CARCtrl-iNEV, el grupo CARCD133-iNEV mostró una internalización rápida de los CAR-iNEV marcados en 12 horas, como lo indica la intensidad de fluorescencia significativamente mayor de las células en ese grupo. Además, el aumento de la intensidad de fluorescencia observado en el grupo CARCD133-iNEV se abolió tras la eliminación de CD133 (Figura 2H). Para evaluar la relación entre la captación de CAR-iNEV y la citotoxicidad, realizamos ensayos de curso de tiempo en los que los CAR-iNEV se co-cultivaron con células tumorales durante diferentes puntos temporales. La muerte de las células tumorales aumentó con el tiempo de co-cultivo y se estabilizó en aproximadamente 12 horas. El bloqueo de la internalización de EV con el inhibidor de la dinamina, Dynasore, redujo significativamente la muerte mediada por CAR-iNEV (Figuras S2H y S2I). En conjunto, estos resultados respaldan un modelo mecanístico en el que los CAR-iNEV primero deben ser captados de manera eficiente por las células tumorales diana, lo que permite la liberación de su carga efectora citotóxica dentro de las células para desencadenar la muerte de las células tumorales.

Para verificar aún más la especificidad de CD133 de los CAR-iNEV, realizamos ELISA y ELISA basado en células. Los resultados del ELISA confirmaron que los CARCD133-iNEV se unieron fuertemente tanto a las proteínas recombinantes humanas como murinas de CD133 (Figura 2I). Además, un ELISA basado en células demostró que los CARCD133-iNEV reconocen y se unen eficazmente a CD133 endógeno en las superficies de las células de cáncer gástrico, hepático y pancreático (Figura 2J). En particular, la unión de los CARCD133-iNEV fue casi inexistente en las células CD133-KO (Figura 2K). Finalmente, evaluamos la actividad citotóxica de los CAR-iNEV in vitro, y los CARCtrl-iNEV y los Blank-iNEV sirvieron como controles. Aunque los CARCtrl-iNEV y los Blank-iNEV exhibieron efectos citotóxicos de referencia, los CARCD133-iNEV indujeron un aumento significativo de la lisis de las células tumorales en las tres líneas celulares tumorales, mientras que este efecto no se observó en las células CD133-KO (Figura 2L). El aumento de la actividad antitumoral de los CARCD133-iNEV se puede atribuir a su afinidad de direccionamiento y eficiencia de internalización superiores. En conjunto, estos resultados muestran que diseñamos y purificamos con éxito los CARCD133-iNEV que exhibieron una especificidad de CD133 excepcional, una unión robusta a las células tumorales y una potente actividad citotóxica.

Seguridad in vivo y direccionamiento tumoral de los CAR-iNEV

La seguridad sigue siendo una consideración fundamental en la aplicación clínica de la terapia con células CAR-T/CAR-NK. En este estudio, evaluamos sistemáticamente el perfil de bioseguridad de los CAR-iNEV y comparamos su eficacia terapéutica y toxicidad con las de las células CAR-iNK. Para evaluar rigurosamente la posible toxicidad, se administraron inyecciones de células CAR-iNK y CAR-iNEV a ratones. Según informes anteriores, la dosis circulante eficaz de las células CAR-NK es de aproximadamente 1 × 107 células, lo que influyó en el diseño de nuestro régimen de dosificación. ^[11], ^[34], ^[35] En el modelo de ratón de HCC inducido por H22, se administraron CAR-iNEV a los ratones en dosis altas (1 × 1012 partículas) o dosis bajas (1 × 1011 partículas) o células CAR-iNK (1 × 107 células) (Figura 3A). Las condiciones fisiológicas de los ratones se monitorearon de cerca y se realizó la eutanasia humanitaria si la pérdida de peso de los animales excedió el 15% o si se observó una angustia grave. Los resultados revelaron que no se observó mortalidad en ninguno de los grupos tratados con CAR-iNEV, independientemente de la dosis administrada (Figura 3B). Para evaluar aún más la toxicidad sistémica, realizamos análisis hematológicos y bioquímicos de los ratones tratados. Los ratones tratados con células CARCD133-iNK exhibieron efectos adversos graves, que incluyeron pérdida de peso, convulsiones y mortalidad, acompañados de recuentos anormales de células sanguíneas. En contraste, los grupos tratados con CARCD133-iNEV no mostraron reacciones tóxicas evidentes, lo que indica que la terapia con CAR-iNEV tiene una ventana terapéutica más amplia y un riesgo de toxicidad reducido en comparación con la terapia con CAR-iNK (Figuras 3C y S3A). Además, la tinción con H&E de los órganos principales de los ratones tratados con CARCD133-iNEV en dosis altas o bajas no reveló signos de daño tisular, lo que apoya aún más la excelente biocompatibilidad y el perfil de seguridad de los CARCD133-iNEV (Figura S3B). En cualquier dosis, el tratamiento con CARCD133-iNEV redujo significativamente el volumen y el peso del tumor, mientras que el grupo CARCtrl-iNEV no exhibió una supresión notable del tumor (Figura 3D). De las condiciones probadas, el tratamiento con CARCD133-iNEV en dosis altas produjo la inhibición tumoral más potente, sin toxicidad observable, y se utilizó la dosis alta en los experimentos posteriores. Estos resultados establecen el CARCD133-iNEV como un candidato inmunoterapéutico bien tolerado y eficaz y brindan un sólido respaldo para su traslación clínica.

Para evaluar la capacidad de direccionamiento tumoral de los CARCD133-iNEV y rastrear su biodistribución in vivo, empleamos un sistema de imagen in vivo (IVIS) para la imagen de animales vivos. Cuando los volúmenes tumorales de los animales alcanzaron aproximadamente 150 mm3, se inyectaron a los animales CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV y se registraron las señales de fluorescencia a las 4, 8 y 24 horas posteriores a la inyección. En comparación con el grupo CARCtrl-iNEV, el grupo CARCD133-iNEV presentó señales de fluorescencia significativamente mayores en el sitio del tumor, y estas señales persistieron durante al menos 24 horas, lo que indica una acumulación sostenida de los CARCD133-iNEV en el sitio del tumor (Figuras 3E, 3F y S3C). La imagen ex vivo confirmó aún más el enriquecimiento preferencial de los CARCD133-iNEV dentro de los tejidos tumorales. El análisis de fluorescencia de las secciones tumorales reveló una intensa acumulación de señal en el grupo CARCD133-iNEV, con una acumulación de señal mínima en los órganos principales distintos del hígado (Figuras 3G y 3H). La tinción inmunohistoquímica confirmó aún más que los CARCD133-iNEV se acumularon selectivamente en los tumores, donde produjeron señales de Nb significativamente mayores que las del grupo CARCtrl-iNEV. Lo más importante es que no se detectó una acumulación de señal sustancial en otros órganos, lo que confirmó la especificidad tumoral de los CARCD133-iNEV (Figura 3I). Para cuantificar aún más su capacidad de direccionamiento tumoral, incorporamos análisis adicionales de citometría de flujo in vivo e imagen de radiotrazador de circonio-89 (89Zr). Estos datos demostraron que los CARCD133-iNEV se acumularon preferentemente en los tejidos tumorales CD133+, con niveles de circulación mínimos y una captación baja en los órganos normales principales (Figuras 3J–3L y S3D). Esta biodistribución enriquecida en tumores sustenta su perfil de seguridad favorable al limitar la exposición fuera del objetivo.

Los CARCD133-iNEV inducen la muerte directa de las células tumorales y reprograman el microambiente inmunitario tumoral.

Para validar aún más la eficacia terapéutica de los CAR-iNEV, establecimos modelos de xenoinjerto tumoral para el CCH (H22), el cáncer de páncreas (Panc02) y el cáncer colorrectal (Colon26) en ratones. Los ratones del modelo recibieron por vía intravenosa CARCD133-iNEV en una dosis alta (1 × 1012 partículas) tres veces por semana, y se monitorizó regularmente el volumen tumoral y el peso corporal (Figura 4A). Los resultados revelaron que el tratamiento con CARCD133-iNEV inhibió significativamente el crecimiento tumoral en todos los modelos de xenoinjerto tumoral (Figura 4B). No se observaron cambios significativos en el peso corporal ni anomalías hematológicas durante el período de tratamiento, lo que indica que los CARCD133-iNEV tienen un excelente perfil de seguridad, incluso a dosis altas (Figuras S4A y S4B). Para imitar aún más el microambiente tumoral (TME) nativo, establecimos un modelo ortotópico de CCH utilizando células Hep53.4 marcadas con luciferasa. La imagen in vivo de animales vivos demostró que el tratamiento con CARCD133-iNEV suprimió eficazmente el crecimiento tumoral y prolongó significativamente la supervivencia en ratones con tumores (Figuras 4C–4E y S4C). A continuación, evaluamos la relevancia clínica de la terapia con CARCD133-iNEV utilizando ratones con un sistema inmunitario humanizado (HIS) (huHSC-NCG-M) a los que se les injertaron xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) de hígado (n = 4), páncreas (n = 3) y cáncer colorrectal (n = 3). Los CAR-iNEV (humanos) se generaron a partir de células NK derivadas de iPSC humanas y se validó la carga de CAR mediante Western blot, citometría de flujo, microscopía electrónica y NTA (Figuras S5A–S5D). En particular, el tratamiento con CARCD133-iNEV (humano) suprimió significativamente la progresión tumoral en 7 de 10 modelos de PDX CD133+ (Figuras 4F–4H). Además, no se observó una pérdida de peso significativa ni efectos adversos relacionados con el tratamiento en los ratones HIS, lo que apoya aún más el favorable perfil de seguridad y el potencial traslacional de la terapia con CARCD133-iNEV (Figuras 4I y 4J).

La activación de macrófagos y neutrófilos impulsada por CARCD133-iNEV remodela el microambiente inmunitario tumoral

Para determinar si los CARCD133-iNEV pueden modular el TME, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula en células inmunitarias CD45+ aisladas de tejidos tumorales (Panc02) recogidos 2 semanas después del tratamiento. El análisis preliminar reveló alteraciones significativas en la composición de los subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes tumorales en el grupo tratado con CARCD133-iNEV, lo que sugiere que el tratamiento tuvo un profundo efecto de reprogramación en las células inmunitarias (Figuras S6A–S6C). Los macrófagos que se encontraron en los tejidos se clasificaron en 11 grupos distintos; se observó un aumento sustancial en la proporción de macrófagos proinflamatorios y una marcada reducción en la proporción de macrófagos promotores del tumor C1q+ después del tratamiento con CARCD133-iNEV (Figuras 5A, 5B, S7A y S7B). El análisis de enriquecimiento de genes reveló que los genes clave regulados al alza en los macrófagos del grupo tratado estaban asociados con respuestas proinflamatorias (Figura S8A). Además, el análisis de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) identificó siete subconjuntos de neutrófilos (grupos 0-7) dentro de los tejidos tumorales (Figura S9A). El tratamiento con CARCD133-iNEV aumentó notablemente la abundancia de neutrófilos y enriqueció los subconjuntos (grupos 0, 1, 3, 6 y 7) asociados con la quimiotaxis, la activación inflamatoria y las respuestas inmunitarias innatas, lo que es consistente con la polarización antitumoral tipo N1. Por el contrario, los grupos 5 y 6 fueron más prevalentes en el grupo de control y se relacionaron con vías implicadas en el desarrollo de los tejidos y la regulación del crecimiento (Figuras S9B y S9C). Los neutrófilos tratados con CAR-iNEV también mostraron una expresión elevada de CCL3 y CCL4, características distintivas de la polarización N1, lo que apoya aún más su papel en la promoción de un fenotipo de neutrófilos antitumoral dentro del TME (Figura S9D).

Dado el pronunciado remodelado funcional de los macrófagos tras el tratamiento con CARCD133-iNEV, realizamos además un análisis de trayectoria de pseudotiempo utilizando Monocle2. Se identificaron las células del grupo 3 como monocitos clásicos, y el estado 2, que implicaba principalmente al grupo 3, se designó como el punto de partida de la trayectoria (Figura 5C). A medida que avanzaba el pseudotiempo, los macrófagos divergieron en el punto de ramificación 2, diferenciándose en dos linajes distintos. Una rama, que estaba compuesta predominantemente por las células de los grupos 1 y 2 del grupo CARCD133-iNEV, exhibió un fenotipo proinflamatorio, mientras que la otra rama, que estaba compuesta principalmente por las células del grupo 0 del grupo de control, conservó una firma inmunosupresora (Figura 5D). El análisis de la expresión génica de los macrófagos reveló que Ifitm2, Nos2 y Cxcl2 se expresaban en gran medida a lo largo de la primera rama, y sus niveles de expresión aumentaban a medida que avanzaba el pseudotiempo. Por el contrario, la segunda rama mostró una alta expresión de marcadores de macrófagos inmunosupresores, incluidos C1qa, C1qb y C1qc (Figura S10A). Además, el análisis de expresión génica dependiente de la rama basado en el algoritmo BEAM identificó cuatro grupos de genes distintos asociados con el punto de ramificación 2. Antes del punto de ramificación 2, los grupos de macrófagos (grupos 2 y 4) presentaron firmas asociadas con la fosforilación oxidativa y el procesamiento del ARN. Sin embargo, los macrófagos que se diferenciaban hacia el estado enriquecido en el grupo CARCD133-iNEV (grupo 3) se enriquecieron en las vías de señalización mediadas por citocinas y en las vías de activación de la respuesta inmunitaria, lo que indica un aumento de las funciones efectoras inmunitarias. Por el contrario, los macrófagos que se diferenciaron hacia el estado del grupo PBS (grupo 1) se enriquecieron en procesos de remodelación de la cromatina y regulación del ciclo celular, lo que resultó en una reducción significativa de la activación inmunitaria en comparación con el punto de ramificación 2 (Figuras 5E y S10B). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con CARCD133-iNEV estimula eficazmente la activación inmunitaria de los macrófagos, desplazando el TME hacia un estado más inmunostimulante y proinflamatorio.

Estudios previos han demostrado que el aumento de la actividad glucolítica en los macrófagos y los neutrófilos suele estar asociado con un alto estado de activación; esto desempeña un papel clave en la inflamación, las respuestas inmunitarias y el TME.^[36],^[37],^[38] Para investigar el estado metabólico de estas células inmunitarias en el contexto del tratamiento con CARCD133-iNEV, aislamos macrófagos y neutrófilos de tejidos tumorales mediante clasificación basada en citometría de flujo. El análisis metabolómico reveló un aumento significativo de la glucólisis aeróbica en ambas poblaciones celulares. Estos hallazgos se validaron aún más mediante ELISA y mediante la medición de la tasa de acidificación extracelular (ECAR), lo que confirmó un cambio metabólico hacia la glucólisis en los macrófagos y neutrófilos activados por CARCD133-iNEV (Figuras 5F, 5G y S11A–S11C). Los experimentos de cocultivo revelaron que la exposición directa de macrófagos o neutrófilos a CARCD133-iNEV tuvo efectos fenotípicos mínimos, mientras que el medio acondicionado de células tumorales tratadas con CAR-iNEV aumentó notablemente los marcadores de macrófagos M1 (CD86 y MHC II) e indujo un fenotipo de neutrófilos tipo N1 con TNF-α e interleucina-12 elevados (Figuras S11D y S11E). Estos hallazgos indican que la activación de macrófagos y neutrófilos mediada por CAR-iNEV se produce indirectamente a través de la modulación de las células tumorales y no es suficiente para causar una activación excesiva de los neutrófilos.

Para determinar si la supresión tumoral mediada por CARCD133-iNEV depende de los macrófagos o de los neutrófilos, los deplejamos selectivamente in vivo utilizando anticuerpos contra Ly6G (para la depleción de neutrófilos) o liposomas de clodronato (para la depleción de macrófagos). Los resultados demostraron que la depleción de neutrófilos o macrófagos perjudicó significativamente la eficacia terapéutica de los CAR-iNEV (Figura 5H). En particular, la depleción de macrófagos abolió casi por completo los efectos antitumorales de los CARCD133-iNEV, lo que sugiere que la supresión tumoral por los CARCD133-iNEV depende principalmente de la activación de los macrófagos. Para evaluar el papel de las células T en el ataque tumoral mediado por CAR-iNEV, evaluamos su eficacia en ratones Rag1-KO (deficientes en células T) y en ratones desnudos. Sorprendentemente, los CARCD133-iNEV siguieron siendo eficaces en ambos modelos, lo que demuestra que su capacidad de matar tumores es independiente de la participación de las células T (Figuras S11F–S11H).

La producción de especies reactivas del oxígeno es un mecanismo bien establecido por el cual los macrófagos eliminan patógenos y células tumorales. Dado que los macrófagos en los tumores tratados con CARCD133-iNEV presentaban niveles elevados de óxido nítrico sintasa inducible (NOS2), generamos ratones con KO condicional específico de macrófagos de NOS2 (F4/80-Cre; NOS2flox/flox) para una mayor investigación. Los resultados revelaron que la supresión tumoral mediada por CARCD133-iNEV se redujo significativamente en los ratones NOS2cKO (Figura 5I). Estos hallazgos sugieren que los CARCD133-iNEV ejercen sus efectos antitumorales mediante la activación de macrófagos y neutrófilos, principalmente mediante la inducción de la regulación al alza de NOS2 en los macrófagos.

Inhibición sinérgica del cáncer metastásico e inducción de la memoria inmunológica mediante la terapia combinada

Dado el profundo papel de los CAR-iNEV en la remodelación del TME, exploramos aún más su potencial en las terapias combinadas. Los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICIs), como los anticuerpos contra PD-1, CTLA-4 y CD47, son estrategias esenciales en la inmunoterapia contra el cáncer. A continuación, exploramos la sinergia terapéutica entre los CARCD133-iNEV y los ICIs. Nuestros resultados mostraron que la monoterapia con CARCD133-iNEV o con anticuerpos anti-PD-1/CTLA-4/CD47 suprimió parcialmente el crecimiento tumoral, mientras que el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con un anticuerpo anti-CD47 bloqueó por completo la progresión tumoral (Figuras 6A y 6B).

Para evaluar la eficacia de los CARCD133-iNEV y los anticuerpos anti-CD47 en modelos metastásicos clínicamente relevantes, establecimos modelos de metástasis peritoneal y pulmonar en ratones. Se inyectaron células Hep53.4 marcadas con luciferasa por vía intraperitoneal o intravenosa en ratones, y se utilizó la imagen de bioluminiscencia para monitorizar la progresión tumoral. En el modelo de metástasis pulmonar, la monoterapia con CARCD133-iNEV o con un anticuerpo anti-CD47 retrasó solo modestamente la progresión tumoral, y los ratones finalmente sucumbieron a la carga tumoral. Por el contrario, la terapia combinada suprimió significativamente las lesiones metastásicas y prolongó la supervivencia, y el 80 % (4/5) de los ratones lograron una eliminación completa del tumor. De manera similar, en el modelo de metástasis peritoneal, la terapia combinada con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 condujo a la regresión completa del tumor en el 60 % de los ratones, lo que prolongó significativamente su supervivencia (Figuras 6C, 6D y S11I). Estos datos sugieren que el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con el bloqueo de CD47 erradica eficazmente los tumores metastásicos y mejora notablemente los resultados de supervivencia.

Para evaluar el potencial terapéutico de los CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 en tumores resistentes a PD-1, establecimos modelos HIS-PDX. Los tumores se derivaron de cinco pacientes con cáncer de páncreas en los que la terapia neoadyuvante con PD-1 había fracasado, y los tejidos tumorales se implantaron en ratones HIS. Los resultados revelaron que el bloqueo de CD47 por sí solo no suprimió significativamente la progresión tumoral, mientras que la monoterapia con CARCD133-iNEV retrasó parcialmente el crecimiento tumoral, pero fue insuficiente para lograr una remisión completa. Sin embargo, el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con la terapia anti-CD47 suprimió significativamente el crecimiento tumoral y condujo a una eliminación casi completa del tumor (Figura 6E). También incluimos cinco muestras de PDX de pacientes con cáncer de colon que habían fracasado en la quimioterapia o la radioterapia. La terapia combinada con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 demostró una eficacia comparable en estos PDX e inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Figura 6F).

Dado la eficacia superior de los CARCD133-iNEV, junto con el bloqueo de CD47, en la eliminación de tumores metastásicos, examinamos a continuación si esta terapia podría inducir una memoria inmunológica duradera. A los 120 días posteriores a la eliminación del tumor, los ratones libres de tumor fueron sometidos a un nuevo desafío con las mismas células tumorales (células Panc02-Luc). No se observó recurrencia tumoral en el grupo de terapia combinada, mientras que los tumores se desarrollaron rápidamente en los ratones de control de la misma edad (Figura 6G). El análisis por citometría de flujo de los subconjuntos de células T esplénicas presentes en los ratones reveló un aumento significativo en la proporción de células T de memoria efectoras (CD62L−CD44+) dentro de las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ después de la inoculación subcutánea con células Panc02 (Figura 6H). Además, demostramos que este aumento no se debió a la activación residual de las células T, ya que las células T de memoria efectoras se mantuvieron en niveles basales en los ratones que no fueron sometidos a un nuevo desafío (Figura 6I). Estos resultados sugieren que el tratamiento combinado con CARCD133-iNEV y el bloqueo de CD47 no solo logra la erradicación tumoral a largo plazo, sino que también induce una robusta memoria inmunológica mediada por células T, proporcionando una protección a largo plazo contra la recurrencia tumoral.

Discusión

Como terapia vesicular sin células, la terapia con CARCD133-iNEV ofrece ventajas distintas sobre las terapias convencionales con células CAR-T y CAR-NK en el microambiente tumoral (TME) altamente inmunosupresor. Estos nanovesículos diseñados pueden penetrar de manera más efectiva en las densas barreras del estroma tumoral que las células utilizadas en las otras terapias y son intrínsecamente menos susceptibles a las señales inmunosupresoras derivadas del TME. A diferencia de las células CARCD133-iNK, que conservan la citotoxicidad innata a través de los receptores activadores naturales, los CAR-iNEV dependen casi exclusivamente del reconocimiento de antígenos mediado por CAR para la actividad citotóxica. Esta dependencia confiere una mayor selectividad de diana y puede reducir los efectos fuera de la diana en las aplicaciones clínicas. La capacidad de penetración tumoral mejorada de los CAR-iNEV no se debe únicamente a su tamaño a nanoescala. Además de las dimensiones favorables para la difusión pasiva, los EVs pueden remodelar activamente el TME. Los CAR-iNEV expresan proteínas moduladoras de la matriz extracelular (ECM), como MMP1, MMP14 y CD147, que promueven la degradación del colágeno y el aflojamiento del estroma, y pueden modular la actividad de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) para reducir la deposición de ECM y la rigidez de la matriz.^[20] Estas propiedades facilitan una infiltración más profunda en el tejido tumoral, lo que coincide con observaciones previas de que los EVs derivados de las células NK penetran de manera más efectiva en los esferoides tumorales que sus células NK parentales.^[21] En conjunto, estos mecanismos respaldan la selección de EVs sobre las plataformas basadas en células para superar las barreras del estroma en los tumores sólidos.

Los estudios han demostrado que los vesículos derivados de CAR-T pueden entregar ARN estimulantes que activan la señalización del IFN de tipo I, mejorando así la activación de las células T CD8+ y promoviendo la eliminación del tumor.^[39] De manera similar, los EVs liberados por las células inmunitarias innatas contienen naturalmente proteínas citotóxicas y citocinas inmunomoduladoras, facilitando la comunicación cruzada con otras células inmunitarias dentro del TME.^[40],^[41],^[42] En particular, el tratamiento con CARCD133-iNEV condujo a un marcado aumento de los macrófagos similares a M1 y los neutrófilos similares a N1, y este cambio proinflamatorio estuvo fuertemente asociado con la reducción del volumen tumoral. Estas acciones no solo se dirigen directamente a las células tumorales, sino que también remodelan el TME al amplificar las señales inflamatorias y suprimir los componentes inmunosupresores, estableciendo un ciclo de auto-reforzamiento de la inmunidad antitumoral. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que los CAR-iNEV promueven la regresión tumoral a través de un mecanismo dual: la eliminación directa de las células tumorales y la reprogramación del TME a través de la activación de los subconjuntos proinflamatorios M1 y N1, lo que resulta en una mayor eficacia terapéutica.

Además de sus propiedades inmunoterapéuticas, los CARCD133-iNEV se pueden combinar sinérgicamente con los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) para maximizar la eficacia terapéutica. En este estudio, el tratamiento con CARCD133-iNEV combinado con el bloqueo del punto de control inmunitario CD47 aumentó significativamente la eliminación del tumor e indujo una memoria inmunológica a largo plazo en los ratones supervivientes. Este efecto sinérgico subraya la capacidad de los CARCD133-iNEV para integrarse con inmunoterapias complementarias, involucrando eficazmente tanto las respuestas inmunitarias innatas como las adaptativas para lograr una mayor y más duradera eficacia antitumoral de lo que se puede lograr mediante el uso de la monoterapia.

En resumen, el CARCD133-iNEV representa no solo una modalidad terapéutica independiente segura y potente, sino también una plataforma versátil para la integración en inmunoterapias combinadas, lo que permite un tratamiento personalizado y de precisión de los tumores sólidos. Para abordar los requisitos de cantidad y calidad para la producción de CARCD133-iNEV a escala clínica, proponemos TFF como una plataforma central, dado su rendimiento, pureza y consistencia entre lotes superiores.^[32] Estudios recientes que utilizan biorreactores de fibra hueca combinados con TFF y cromatografía han logrado aproximadamente 1013 partículas de EV por lote con actividad citotóxica conservada y hasta 100 veces menos nivel de proteína contaminante,^[43],^[44], lo que proporciona una hoja de ruta factible para la fabricación de CARCD133-iNEV a gran escala y de alta calidad. Los estudios futuros deben centrarse en validar la eficacia y la seguridad de su uso en ensayos preclínicos y clínicos avanzados.

Limitaciones del estudio

A pesar de sus numerosas ventajas, los CARCD133-iNEV aún enfrentan varios desafíos que deben abordarse para facilitar su traslación clínica. En primer lugar, la producción, purificación y caracterización a gran escala de los CARCD133-iNEV siguen sin estar estandarizadas. Dada la posible heterogeneidad de las preparaciones de EV, son esenciales medidas estrictas de control de calidad y protocolos de fabricación para garantizar la consistencia, la reproducibilidad y la eficacia terapéutica. En segundo lugar, la eficacia y la seguridad terapéuticas de los CARCD133-iNEV se han evaluado principalmente en modelos tumorales murinos. Para aumentar su potencial de traslación, son necesarios estudios adicionales realizados en modelos animales grandes para validar aún más su eficacia a largo plazo, optimizar los regímenes de dosificación y evaluar las posibles toxicidades.

Limitaciones del estudio

A pesar de sus numerosas ventajas, los CARCD133-iNEV aún enfrentan varios desafíos que deben abordarse para facilitar su traslación clínica. En primer lugar, la producción, purificación y caracterización a gran escala de los CARCD133-iNEV siguen sin estar estandarizadas. Dada la posible heterogeneidad de las preparaciones de EV, son esenciales medidas estrictas de control de calidad y protocolos de fabricación para garantizar la consistencia, la reproducibilidad y la eficacia terapéutica. En segundo lugar, la eficacia y la seguridad terapéuticas de los CARCD133-iNEV se han evaluado principalmente en modelos tumorales murinos. Para aumentar su potencial de traslación, son necesarios estudios adicionales realizados en modelos animales grandes para validar aún más su eficacia a largo plazo, optimizar los regímenes de dosificación y evaluar las posibles toxicidades.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Las solicitudes de información, recursos y reactivos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Peng Xia (pengxia@uchicago.edu), y serán atendidas por este.

Disponibilidad de materiales

Todos los reactivos únicos/estables generados en este estudio están disponibles a través del contacto principal con un acuerdo de transferencia de materiales completado.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de alto rendimiento están disponibles a través de la base de datos GEO con el número de acceso GSE293929.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible a través del contacto principal a pedido.

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Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la 10.13039/501100001809 Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82403916), el Programa de Becas de Chicago, la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico (P30 CA014599), 10.13039/501100007129 Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2024QH227) y 10.13039/501100005047 Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Liaoning (2025JH2/101800397). Agradecemos al Centro de Investigación de la Información de la Universidad de Chicago por el uso del clúster de computación de alto rendimiento Gardner.

Contribuciones de los autores

Conceptualización, H.Z., B.J. y P.X.; metodología, H.Z., S.L., C.L., Y.J., X.N., Y.G. y P.X.; visualización, C.L., X.G., C.-W.J., W.J. y X.Z.; validación, S.L., H.L., Y.J. y X.N.; adquisición de fondos, P.X. y H.Z.; curación de datos, P.X.; software, C.L., H.L. y W.J.; administración del proyecto, B.J. y P.X.; supervisión, X.Z., B.J. y P.X.; redacción del borrador original, H.Z., S.L., H.L. y Y.J.; revisión y edición de la redacción, C.L., Y.G. y P.X.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Ratones

Se adquirieron ratones macho C57BL/6 (Cat. 027) y ratones macho BALB/c (Cat. 028), de 8 semanas de edad, comercialmente (Charles River Laboratories, IL, EE. UU.). Los ratones con deleción específica de macrófagos de NOS2 se generaron cruzando ratones Nos2-flox (C57BL/6Smoc-Nos2em1(flox)Smoc) (Shanghai Model Organisms Center, Inc., Shanghai, China, Cat. NM-CKO-226494) con ratones F4/80-Cre (The Jackson Laboratory). La descendencia resultante se genotipó y se utilizaron ratones macho con deleción condicional de Nos2 (8 semanas de edad) para los experimentos. Se compraron ratones huHSC-NCG-M macho (8 semanas de edad; Cat. T057533) a Gempharma Technology Company (Cat. T057533). Todos los ratones se alojaron en condiciones estándar del laboratorio, y los tamaños de los grupos se especifican en las leyendas de las figuras. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de las muestras. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Chicago (71829-11) y el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong (KYLL-2023-412).

Líneas celulares y cultivo celular

Las líneas celulares K562 (Cat. CCL-243), HEK 293T/17 (Cat. CRL-11268), Panc02 (Cat. CRL-2553) y células iPSC humanas (Cat. ACS-1027) se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). La línea celular de ratón iPSC se compró a Alstem (Cat. iPS02M). La línea celular H22 (Cat. YC-C053) se compró a Ubigene Biosciences (Ubigene Biosciences Co., Ltd., Guangzhou, China). La línea celular Colon26 se compró a Creative biogene (Shirley, NY, EE. UU., Cat. CSC-RR0461). La línea celular Hep53.4 se compró a CLS-Cell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemania, Cat. 400200). Todas las líneas celulares fueron autenticadas por los proveedores mediante el perfilado STR (líneas humanas) o la validación genética (líneas murinas). Todas las líneas celulares se probaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma cada 4 semanas utilizando un kit de detección basado en PCR (Beyotime, C0301S) y fueron consistentemente negativas antes de los experimentos.

Las líneas celulares Panc02, H22 y Hep 53.4 se transfectaron con un lentivirus que codifica el gen de la luciferasa (Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canadá, Cat. LVP010079) para construir las líneas celulares Panc02-Luc, H22-Luc y Hep 53.4-Luc, con el fin de permitir la obtención de imágenes de tumores en animales vivos. Las condiciones de cultivo celular fueron las siguientes: las células H22 se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SFB) y 2 mM de L-glutamina. Las células Panc02 y Colon26 se cultivaron en medio Dulbecco modificado con alta concentración de glucosa (DMEM; Gibco, EE. UU.) con los mismos suplementos. Las iPSC se cultivaron en el medio iPSC (Oricell, Cyagen Biosciences, Cat. HUIPS-90011). Los cultivos de iPSC se disociaron utilizando Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., AT104). Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

Muestras humanas

Las muestras de tumores humanos utilizadas en este estudio se obtuvieron de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong, con la aprobación del comité de ética institucional (KYLL-2023-413). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Se incluyeron un total de diez muestras de tumores, que comprendían hHCC (n = 4), cáncer colorrectal (n = 3) y cáncer de páncreas (n = 3). Cada muestra de tumor se cortó en pequeños fragmentos y se implantó de forma subcutánea para establecer modelos PDX. Tras el enraizamiento exitoso, los ratones portadores de PDX se asignaron al grupo experimental o al grupo de control, según recibieran o no el tratamiento CARCtrl-iNEV o el tratamiento CARCD133-iNEV. No se proporcionó información clínica, como el sexo, la raza, la ascendencia y la etnia, por parte del hospital y, por lo tanto, no se pudo incorporar en los análisis posteriores, lo que se reconoce como una limitación.

Detalles del método

Cribado de la biblioteca de nanobodies CD133

Se identificaron nanobodies dirigidos a CD133 a partir de una biblioteca de fagos VHH (Shenzhen Kangtai Biotechnology) que contenía aproximadamente 4 × 109 clones únicos, según protocolos establecidos previamente.^[46] Para la selección, se utilizaron inmunotubos recubiertos con proteína CD133 para realizar tres rondas de selección. Se seleccionaron y analizaron un total de 731 clones individuales mediante ELISA de fagos utilizando un anticuerpo secundario anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). La reacción se desarrolló con solución de sustrato TMB y se midió la absorbancia a 450 nm en un plazo de 30 minutos tras la adición de la solución de parada. Los clones que dieron positivo en las tres rondas de ELISA de fagos se sometieron a secuenciación para una mayor caracterización.

Construcción de plásmidos y producción de lentivirus

Se diseñaron varios constructos CAR para que contuvieran los siguientes dominios en secuencia: la señal peptídica CD8, VHH (dominio pesado de cadena variable de anticuerpos de cadena única), la región de unión CD8α, ya sea el dominio extracelular NKp46 o NKG2D, el dominio de señalización intracelular 2B4 o DAP10 y el dominio de activación CD3ζ. Además, el vector contenía un gen de resistencia a la puromicina y una etiqueta HA. Estas secuencias CAR se optimizaron para la expresión humana y se sintetizaron de novo por System Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.). Los constructos CAR se clonaron en el vector principal lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro bajo el control del promotor EF1α. Se diseñó un casete bicistrónico para coexpresar el CAR y el reportero de transducción CopGFP, separados por un péptido de autoescisión T2A para garantizar la expresión equimolar de ambas proteínas. Para la producción del vector lentiviral, se sembraron células HEK293T/17 (ATCC, Cat. CRL-11268) en placas de cultivo de 10 cm a una confluencia de aproximadamente el 70% un día antes de la transfección. Se realizó una transfección transitoria utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Cat. L3000015). En resumen, el ADN plasmídico que codifica el constructo CAR (15 μg), el plásmido de empaquetamiento psPAX2 (10 μg; Addgene, Cat. 12260) y el plásmido de envoltura pMD2.G (5 μg; Addgene, Cat. 12259) se mezclaron en Opti-MEM (Gibco, Cat. 31985070) y se incubaron con el reactivo de transfección para formar complejos de ADN. Estos complejos se añadieron por goteo a las células HEK293T/17 en un medio libre de suero. Después de 8 h, se reemplazó el medio por medio DMEM fresco. Los sobrenadantes virales se recogieron a las 48 y 72 horas posteriores a la transfección, se recogieron en tubos estériles y se centrifugaron a 500×g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. El medio que contenía virus clarificado se concentró utilizando el concentrador Lenti-X (Takara, EE. UU., Cat. 631231). El sobrenadante viral se mezcló con el concentrador Lenti-X en una proporción de 3:1 y se incubó durante la noche a 4 °C, seguido de una centrifugación a 1500×g durante 45 minutos a 4 °C. El pellet viral se resuspendió en PBS estéril y se dividió en alícuotas para su almacenamiento a −80 °C.

Generación de células CAR-iPSC

Para la transducción lentiviral, las iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas lentivirales concentradas que codificaban los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada del virus. Las células se agitaron suavemente cada 15 minutos durante el período de transducción de 6 h a 37 °C. Tras la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó por medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/ml para enriquecer selectivamente las células que expresaban CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenían puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con un 2% de suero bovino fetal y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluorocromo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza superior al 95%. Tras la clasificación, las iPSC que expresaban CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.

Diferenciación de las iPSC-CAR en células NK

Para la diferenciación de células NK, las iPSC se disociaron utilizando EDTA-tripsina al 0,25% y se resuspendieron a una densidad de 2 × 103 células/ml en medio Iscove modificado con Dulbecco (IMDM) suplementado con un 15% de SFB, un 1% de metilcelulosa (Methocult, Cat. M3434) y 2 mM de glutamina. Se añadieron factor de células madre de ratón recombinante (SCF, PeproTech, 50 ng/ml), interleucina-3 (IL-3, PeproTech, 30 ng/ml) e interleucina-6 humana (IL-6, PeproTech, 30 ng/ml) para promover la inducción de progenitores hematopoyéticos. Las células se sembraron en placas de fondo bajo de 35 mm y se cultivaron a 37 °C en un 5% de CO2 durante 8 días para permitir la formación de cuerpos embrionarios (EB). El día 8, los EB se recogieron, se lavaron y se disociaron en suspensiones de células individuales utilizando EDTA-tripsina al 0,25%. Para la inducción de células NK, las HPC se resuspendieron a una densidad de 2 × 104 células por pocillo en α-MEM suplementado con un 10% de SFB, 1000 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (PeproTech) y 5 ng/ml de interleucina-15 de ratón (PeproTech). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C, con cambios de medio cada 3-4 días. Las células NK se recogieron después de 10-14 días.

La diferenciación de las iPSC humanas se indujo según un protocolo publicado.^[47] Primero, se sembraron 5000 iPSC adaptadas a TrypLE por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se cultivaron en medio APEL suplementado con 40 ng/ml de factor de células madre humano (Gibco, Cat. PHC2111), 20 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y 20 ng/ml de proteína morfogenética ósea humana recombinante (BMP-4). El día 11 de la diferenciación, los EB resultantes se transfirieron directamente a placas de 24 pocillos no recubiertas y se permitió que continuaran diferenciándose en condiciones de cultivo de células NK. Los cultivos se mantuvieron durante 28-32 días adicionales en medio de diferenciación de células NK que contenía 10 ng/ml (IL-15, 20 ng/ml de IL-7, 20 ng/ml de SCF y 10 ng/ml de ligando FLT3. En particular, se incluyó IL-3 a 5 ng/ml solo durante la primera semana de este período para apoyar la diferenciación temprana. Cuando las células NK maduraron, se recogieron y se cocultivaron con células artificiales de presentación de antígenos K562-mbIL-21-4-1BB irradiadas para estimular la expansión. El cultivo de expansión se realizó en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de SFB y 50 U/ml de interleucina-2 humana.

Filtración tangencial (TFF) y aislamiento de vesículas extracelulares

Los medios acondicionados de las células se aclararon y se concentraron utilizando una cápsula de filtración tangencial Minimate (Pall Corporation) equipada con una membrana Omega para eliminar las células desprendidas, los restos grandes y los contaminantes particulados. La filtración se realizó utilizando una bomba peristáltica MASTERFLEX Console Analog L/S (Modelo 77521-47), con caudales ajustados para mantener las siguientes presiones: presión de alimentación (P Feed): 30 psi; presión de retentado (P Retentate): 25 psi; y presión de filtrado (P Filtrate): 0 psi. Los medios acondicionados de las células se introdujeron en el depósito y se concentraron a los caudales indicados hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Después de la concentración, se realizó un intercambio de tampón y una filtración de diálisis utilizando una cantidad de PBS equivalente al volumen original del medio. Se añadió PBS al depósito y se recirculó durante 10 minutos para eliminar las impurezas residuales y las vesículas extracelulares atrapadas en el filtro. A continuación, la muestra se concentró a un volumen de 10 ml y se repitió el paso de recirculación/diálisis tres veces. La muestra final de 10 ml se sometió a una recirculación adicional de 10 minutos, seguida de la recogida del depósito. Para garantizar la eliminación completa de los contaminantes residuales, se añadieron 10 ml de PBS y la mezcla se recirculó durante 10 minutos y se recogió. Este paso de recirculación de PBS se repitió tres veces en total. A continuación, se realizó una mayor concentración del volumen final de 30 ml utilizando un filtro centrífugo Centricon Plus-70 (membrana Ultracel-PL, 100 kDa) con centrifugación a 3000 × g a 4 °C en una centrífuga Allegra X-15R. El concentrado se recuperó mediante centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 minutos a 4 °C. Para maximizar el rendimiento, se añadieron 1 ml de PBS al filtro Centricon Plus-70 y la muestra se reconcentró mediante centrifugación a 3000 × g durante 2 minutos a 4 °C, seguida de centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 minutos.

Purificación de proteínas

Para la expresión y purificación de la proteína diana, los plásmidos recombinantes pET-14B-CD133 (humano y de ratón) se transformaron en células BL21(DE3). Las culturas bacterianas se cultivaron a 37 °C y 225 rpm hasta alcanzar una OD600 de 0,6, y luego se indujo con 0,2 mM de IPTG a 16 °C durante la noche. Las células se recogieron por centrifugación a 8000 × g durante 15 min a 4 °C y se resuspendieron en tampón de lisis (300 mM de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, 10 mM de imidazol, pH 8,0, 1 mM de PMSF). Se realizó una homogeneización a alta presión a baja temperatura durante tres ciclos, seguida de una centrifugación a 12 000 × g durante 45 min para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se cargó en una columna de gravedad que contenía 1 mL de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Alemania). Las proteínas unidas se lavaron secuencialmente con 50 mL de tampón de lavado I (20 mM de imidazol, pH 8,0) y 50 mL de tampón de lavado II (40 mM de imidazol, pH 8,0), y luego se eluyeron con 25 mL de tampón de elución (250 mM de imidazol, pH 8,0). El eluido se purificó aún más mediante cromatografía de gel Superdex-150 utilizando un sistema AKTA Pure (GE Healthcare Life Sciences, EE. UU.) en 1× PBS. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C. La purificación de los nanobodies siguió el mismo protocolo de cromatografía de afinidad Ni-NTA. Los nanobodies purificados se caracterizaron mediante western blot utilizando la etiqueta 6×His, la etiqueta HA y los anticuerpos anti-VHH.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Se recogieron y homogeneizaron tejidos de hígado de ratón. Los niveles de citocinas y quimiocinas inflamatorias en los homogenados de hígado se cuantificaron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente, según los protocolos de los fabricantes. Se emplearon los siguientes kits de JONLNBIO: Kit ELISA para ratón Ccl3 (Cat. JL20414), Ratón Ccl5 (Cat. JL17335), Ratón Cxcl1 (Cat. JL20150), Ratón Cxcl5 (Cat. JL28925), Ratón IL-1α (Cat. JL13044), Ratón IL-1β (Cat. JL18442), Ratón IL-6 (Cat. JL20268), Ratón TNF-α (Cat. JL10484) y Kit ELISA para ratón Csf3 (Cat. JL10697). Además, los niveles de Cxcl2 de ratón se midieron utilizando el kit ELISA de Abnova (Cat. KA1505). Todos los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante correspondiente, y se midió la absorbancia para determinar la concentración de cada mediador inflamatorio en las muestras de tejido. Las muestras de tejido para el análisis ELISA se prepararon como homogenados utilizando el siguiente procedimiento: los tejidos diana se colocaron sobre hielo y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4) previamente enfriada para eliminar la sangre residual, luego se pesaron y se reservaron. La homogeneización del tejido se realizó sobre hielo utilizando un tampón de lisis compuesto por 50 mM de Tris, 0,9% de NaCl y 0,1% de SDS a pH 7,3, con un volumen de tampón de lisis añadido proporcional al peso del tejido, normalmente 9 mL por 1 g de fragmentos de tejido, complementado con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como inhibidor de proteasas. Los homogenados se procesaron aún más mediante la ruptura ultrasónica bajo enfriamiento con hielo para evitar el sobrecalentamiento. Los homogenados preparados se centrifugaron luego a 5000 × g durante 5 min a 4 °C, y los sobrenadantes se recogieron para el ELISA. Antes del análisis, se cuantificaron las concentraciones totales de proteínas de los homogenados de tejido utilizando el ensayo de ácido bicinquinónico (BCA), y las muestras se ajustaron a una concentración final de proteína de 2 mg/mL para la detección del ELISA.

Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Los experimentos de SPR se realizaron en un instrumento Biacore S200 para caracterizar la cinética de unión de los nanobodies (Nbs) con CD133 humano y de ratón. Antes de la inmovilización, el chip sensor S-CM5 (Cytiva) se acondicionó previamente mediante inyecciones secuenciales de 10 mM de glicina-HCl (pH 1,5) y tampón de funcionamiento para estabilizar la superficie. Las proteínas CD133 humanas y de ratón se inmovilizaron en celdas de flujo separadas del chip mediante la química de acoplamiento de aminas estándar. Brevemente, la superficie del chip se activó inyectando una mezcla recién preparada de 0,05 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 0,2 M de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) durante 7 min a una velocidad de flujo de 10 μL/min. Las proteínas CD133, diluidas a 30 μg/mL en un tampón de acetato de sodio de 10 mM (pH 5,0), se inyectaron sobre la superficie activada hasta que los niveles de inmovilización alcanzaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (RU). Una celda de flujo de referencia se sometió al mismo procedimiento de activación y bloqueo sin acoplamiento de proteínas para controlar la unión inespecífica y los cambios en el índice de refracción masivo. Todos los ensayos de unión se realizaron a 25 °C utilizando un tampón de funcionamiento compuesto por 10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0,05% (v/v) de Tween 20, que se filtró y se desgasificó antes de su uso. Se inyectaron diluciones seriadas de 2 veces de cada nanobody sobre la superficie del sensor a una velocidad de flujo de 30 μL/min durante una fase de asociación de 120 s, seguida de una fase de disociación de 180 s con el flujo del tampón de funcionamiento. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se logró inyectando 10 mM de glicina-HCl (pH 2,0) durante 120 s, lo que garantiza la disociación completa de los Nbs unidos y preserva la integridad del CD133 inmovilizado. Los sensorgramas se doble-referenciaron restando las señales de la celda de referencia y las inyecciones de tampón en blanco para corregir la unión inespecífica y la deriva instrumental. Los parámetros cinéticos de unión, incluido el coeficiente de velocidad de asociación, el coeficiente de velocidad de disociación y el coeficiente de disociación de equilibrio, se obtuvieron ajustando los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore S200. La calidad del ajuste se evaluó en función de los residuos y los valores de chi-cuadrado.

Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa

La actividad citotóxica se evaluó utilizando un ensayo basado en luciferasa. Las líneas celulares tumorales Panc02, Colon26 y H22 que expresaban de forma estable la luciferasa de luciérnaga se utilizaron como células diana. Las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos y se co-incubaron con células CAR-iNK que contenían diferentes constructos CAR a las proporciones efector-diana (E/T) indicadas. Después de 2 h de incubación a 37 °C, la lisis celular se cuantificó midiendo la actividad residual de la luciferasa utilizando un sistema de ensayo de luciferasa estándar (Promega) según las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se detectó con un lector de microplacas, y la citotoxicidad se calculó como el porcentaje de reducción de la luminiscencia en relación con los pocillos de control no tratados.

Para la Figura S1C, las células diana se incubaron con CAR-iNK durante 4 h antes de la medición.

Para la Figura S3D, las células diana se incubaron con CARCD133-iNEV o CARCtrl-iNEV durante 2 h antes de la medición.

Modelo de cáncer ortotópico hepático in vivo

Las células tumorales Hep53.4 que expresaban luciferasa (Hep53.4-Luc) se recogieron al 70-80% de confluencia utilizando 0,05% de tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a una concentración de 2 × 107 células/200 μL en PBS frío inmediatamente antes de la implantación. Los ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (peso de 18 a 22 g) se anestesiaron con isoflurano (inducción al 3-4%, mantenimiento al 1,5-2%). Tras la preparación aséptica del área abdominal, se realizó una pequeña incisión subcostal para exponer el lóbulo hepático lateral izquierdo. Una suspensión que contenía 1 × 106 células Hep53.4-Luc en 10 μL de PBS se mezcló suavemente con 20 μL de Matrigel en una proporción de 1:2 (v/v) inmediatamente antes de la inyección. La mezcla de 30 μL se inyectó cuidadosamente debajo de la cápsula hepática para establecer un tumor hepático ortotópico. La carga tumoral se monitorizó longitudinalmente mediante el sistema IVIS Spectrum (PerkinElmer). En cada punto de tiempo de imagen, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina (3 mg en 100 μL de PBS estéril). Cuatro minutos después de la inyección, los animales se anestesiaron con isoflurano y se adquirieron las imágenes. La cuantificación de las señales se realizó utilizando el software Living Image versión 4.5, definiendo regiones de interés (ROI) sobre el área del hígado y calculando el flujo fotónico total (fotones/seg/cm2) como medida de la carga tumoral. Los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. La aleatorización se realizó utilizando números aleatorios generados por ordenador para garantizar una asignación imparcial. Los regímenes de tratamiento se iniciaron según el diseño del estudio, según se detalla en el diagrama de flujo, y los investigadores desconocían la asignación de los grupos para minimizar el sesgo. A lo largo del estudio, se monitorizaron los ratones diariamente para detectar signos de angustia o efectos adversos, y se observaron estrictamente los puntos finales humanitarios.

Modelo de metástasis pulmonar in vivo

Para la generación del modelo de metástasis pulmonar, las células Panc02-Luc se prepararon como se describió anteriormente y se resuspendieron en PBS estéril a 1 × 107 células/mL. Los ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad se inmovilizaron y se calentaron para dilatar la vena de la cola, y luego se inyectaron con 1 × 106 células Panc02-Luc en 100 μL de PBS a través de la vena de la cola lateral. Se confirmó la administración intravenosa exitosa mediante la ausencia de hinchazón o fugas en el sitio de inyección. Se monitorizaron de cerca los ratones para detectar signos de dificultad respiratoria y estado general de salud durante el estudio. El crecimiento tumoral y la metástasis se cuantificaron mediante BLI tras la inyección intraperitoneal de D-luciferina. Las señales BLI de referencia se utilizaron para aleatorizar los ratones en grupos de tratamiento, de acuerdo con el protocolo del modelo ortotópico.

Modelo subcutáneo in vivo

Las líneas celulares tumorales Hep53.4, Panc02, H22 y Colon26 se cultivaron y se recogieron utilizando 0,05% de tripsina-EDTA al 70-80% de confluencia. Las células se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a 1 × 107 células/mL. Para la implantación tumoral subcutánea, se inyectaron 1 × 106 células Hep53.4 y Panc02 en el flanco derecho de ratones hembra C57BL/6 sinérgicos, mientras que se inyectaron 1 × 106 células H22 y Colon26 por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c sinérgicos, respectivamente. El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días mediante mediciones con calibre. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (longitud × anchura × anchura)/2. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos cuando el volumen tumoral alcanzó los 150 mm3. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó los 1500 mm3 o cuando se observaron los puntos finales humanitarios predefinidos.

Modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) in vivo

Las muestras clínicas de los pacientes se obtuvieron con autorización y aprobación del Comité de Ética de la Investigación del Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong (KYLL-2023-413). Se obtuvieron los formularios de consentimiento informado de los pacientes y sus familias. Los tejidos tumorales frescos se transportaron sobre hielo en RPMI-1640 estéril suplementado con un 1% de solución antibiótico-antimicótica. En un plazo de 2 h tras la resección, los tumores se picaron en fragmentos de aproximadamente 3 × 3 × 3 mm3 utilizando bisturíes estériles en condiciones asépticas. Los fragmentos se implantaron por vía subcutánea en el flanco derecho posterior de ratones huHSC-NCG-M bajo anestesia con isoflurano. Los ratones recibieron analgésicos en el postoperatorio según los protocolos institucionales. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante mediciones con calibre, calculando el volumen tumoral utilizando la fórmula: (longitud × anchura × anchura)/2. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente los 150 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. Se evaluó la eficacia antitumoral y la supervivencia. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores superaron los 1500 mm3 o si presentaban signos de angustia, siguiendo los puntos finales humanitarios.

Análisis de citometría de flujo in vivo

Se administraron CAR-iNEV a ratones a una dosis de 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena caudal. 24 horas después de la inyección, se sacrificaron los animales bajo anestesia con isoflurano y se perfundieron a través de la aurícula izquierda con 10 mL de PBS frío para eliminar las vesículas circulantes. Se extirparon los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón), así como los tumores recolectados, se colocaron en HBSS frío y se procesaron inmediatamente para obtener suspensiones de células individuales. El tejido hepático se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 minutos a 37 °C con agitación suave, luego se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm, seguido de lisis de glóbulos rojos (tampón ACK, 2-3 minutos a temperatura ambiente) y se lavó dos veces con tampón FACS (PBS con 2% de FBS y 2 mM de EDTA). El tejido pulmonar se digirió de manera similar utilizando colagenasa D (1,0 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 minutos a 37 °C, se pasó a través de un tamiz de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y se lavó en tampón FACS. Los bazo se disociaron suavemente mediante interrupción mecánica a través de un tamiz de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y luego se lavaron en tampón FACS. Los tejidos renales y cardíacos se picaron y se digirieron en HBSS que contenía colagenasa II (1,0 mg/mL) más DNasa I (50 U/mL) durante 30 minutos a 37 °C, se filtraron a través de un tamiz de 70 μm y se lavaron en tampón FACS. El tejido tumoral se extirpó, se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 minutos a 37 °C, se filtró, se lisaron los glóbulos rojos y se lavó. Para identificar las células tumorales frente a los fibroblastos asociados al tumor (FAT), se realizó una tinción adicional con marcadores de linaje (EpCAM para las células tumorales, PDGFRα/αSMA para los fibroblastos). Después de la disociación, se evaluó la viabilidad de las células mediante la exclusión de azul de tripan y se contaron las células viables. Aproximadamente 1 × 106 células viables por muestra se transfirieron a 100 μL de tampón FACS para la tinción. La tinción de superficie se realizó agregando marcadores de superficie conjugados con fluorocromo para los subconjuntos celulares (CD45, EpCAM, PDGFRα, αSMA) a diluciones preoptimizadas e incubando durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.

Para la citometría de flujo en experimentos de captación celular, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se fijaron con 100 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la fijación, las células se lavaron una vez en tampón FACS y luego se permeabilizaron agregando 200 μL de tampón de permeabilización (PBS que contiene 0,1% de saponina y 2% de FBS) e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sin lavado adicional, se realizó la tinción intracelular agregando anti-HA conjugado con fluorocromo (1:100) e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en el tampón de permeabilización. Luego, las células se lavaron dos veces en tampón FACS y se resuspendieron en 100 μL de tampón FACS. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo con ajustes de voltaje idénticos en todos los órganos y muestras.

Para el etiquetado de CAR-iNEV con 89Zr-DFO, se utilizó un enfoque de quelación en dos pasos para permitir el radiomarcado de superficie de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV con 89Zr. Inicialmente, los exosomas se funcionalizaron con el quelante desferrioxamina (DFO). Brevemente, p-NCS-Bn-DFO (Future Chem, Seúl, Corea), disuelto en DMSO a una concentración de 5-20 mg/mL, se agregó a la suspensión de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV a una relación de peso DFO a proteína exosómica de 1:10. Después de la incubación, los exosomas etiquetados con DFO se purificaron utilizando una columna de desalanización de dextrano (punto de corte molecular (MWCO) 5000, Pierce, WI, EE. UU.), con 10 mM de PBS como eluyente. Posteriormente, los CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV modificados con DFO se etiquetaron con 89Zr. El 89Zr4+, suministrado en ácido oxálico 1,0 M, se neutralizó primero a un pH entre 6,8 y 7,5 utilizando 1,0 M de Na2CO3. La solución de 89Zr neutralizada se combinó luego con los conjugados de exosomas DFO y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora bajo agitación suave (550 rpm). Los exosomas etiquetados se purificaron posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna de desalanización de dextrano (MWCO 50 000), y se utilizó 10 mM de PBS (pH 7,4, sin Ca2+ y Mg2+) como tampón de elución para garantizar la eliminación del radionúclido no unido. La preparación final de exosomas radiomarcados se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Para la biodistribución ex vivo, se utilizaron un total de 40 ratones BALB/c machos para el análisis de biodistribución ex vivo. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (2%, 1 L/min) y se inyectaron por vía intravenosa con 89Zr-CARCtrl-iNEV o 89Zr-CARCD133-iNEV a una dosis fija de 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena caudal. En puntos de tiempo predeterminados (1, 4, 8, 12 y 24 horas) después de una sola administración, se sacrificaron cuatro ratones por grupo bajo anestesia profunda. Se recolectaron los órganos principales (sangre, colon, estómago, riñones, pulmones, bazo, hígado, corazón y tumor), se enjuagaron con PBS, se secaron y se pesaron. La radiactividad en cada muestra se midió utilizando un sistema de contador gamma (1480 Wizard, PerkinElmer, MA, EE. UU.) con una ventana de energía centrada en el pico de 909 keV de 89Zr. Se preparó en paralelo un estándar que contenía una fracción conocida de la dosis inyectada y se contó en condiciones idénticas para permitir la calibración de la actividad. Todas las mediciones se corrigieron para el fondo y la desintegración física al momento de la inyección. El porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) se calculó como: %ID/g = (actividad del órgano/actividad inyectada) × 100/peso del órgano.

Para los tratamientos in vivo, se establecieron modelos de tumor subcutáneo utilizando células H22 para evaluar la eficacia terapéutica de las células CARCD133-iNK y los CARCD133-iNEV. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 150 mm3, los ratones portadores de tumores (BALB/c, n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a siete grupos de tratamiento: (1) control de PBS (200 μL), (2) dosis alta de CARCD133-iNK (1 × 107 células por inyección), (3) dosis baja de CARCD133-iNK (1 × 106 células por inyección), (4) dosis alta de CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (5) dosis baja de CARCtrl-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección), (6) dosis alta de CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) y (7) dosis baja de CARCD133-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena caudal en un volumen total de 200 μL cada dos días. Los volúmenes tumorales se midieron cada dos días utilizando calibradores y se calcularon.

Para evaluar la actividad antitumoral de los CARCD133-iNEV en múltiples modelos de tumores, se utilizaron modelos subcutáneos que utilizaban células H22, Panc02 y Colon26. Los ratones portadores de tumores (n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a tres grupos y se trataron por vía intravenosa con: (1) PBS Ctrl (200 μL), (2) CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Los tratamientos se administraron tres veces por semana, cada inyección se administró en un volumen de 200 μL. Los tamaños de los tumores se midieron cada dos días como se describió anteriormente.

Para los estudios de inmunoterapia combinada en modelos PDX, se utilizaron ratones que presentaban tumores establecidos (∼150 mm3) y se asignaron aleatoriamente de la siguiente manera: en el experimento que se muestra en la Figura 6E, cuatro grupos (n = 5 por grupo) recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). En el experimento que se muestra en la Figura 6F, los ratones portadores de PDX se asignaron aleatoriamente a dos grupos (n = 5 por grupo) y se trataron con PBS (200 μL) o CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) combinado con anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales superaron los 1500 mm3 o después de cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias. Se monitoreó la supervivencia hasta 60 días. De manera similar, los ratones portadores de CDX se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) CARCD133-iNEV combinado con anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los tratamientos se administraron por inyección en la vena caudal una vez por semana durante tres dosis (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 1500 mm3 o al final del experimento (32 días).

Para los modelos de metástasis, se utilizaron ratones que presentaban metástasis pulmonares o peritoneales de Panc02-Luc y se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) y se trataron por vía intravenosa con (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Todos los tratamientos se administraron tres veces por semana por inyección en la vena caudal (200 μL por inyección). Se monitoreó la carga tumoral cada cinco días utilizando BLI. Se monitoreó la supervivencia de los ratones y se sacrificaron cuando cumplieron con los criterios de sacrificio por razones humanitarias o por muerte natural. El punto final del experimento se fijó en 40 días después del inicio del tratamiento.

Para evaluar la longevidad de la memoria inmunitaria antitumoral, se realizaron experimentos de retoterapia aproximadamente 120 días después del último tratamiento con CARCD133-iNEV + anticuerpos anti-CD47. Este intervalo se consideró adecuado para la eliminación de los agentes terapéuticos residuales y la resolución de las respuestas inmunitarias agudas. Cinco ratones, seleccionados aleatoriamente de los siete ratones que previamente fueron curados con terapia combinada (tres del modelo de metástasis pulmonar y dos del modelo de metástasis peritoneal), se retaron por vía subcutánea con células Panc02-Luc (como se describió anteriormente para el establecimiento de los modelos de metástasis pulmonar y peritoneal). Se utilizaron ratones de la misma edad como controles. Se monitoreó el crecimiento tumoral y la supervivencia para evaluar la persistencia de la inmunidad antitumoral en los supervivientes a largo plazo.

Para investigar los papeles de los macrófagos y los neutrófilos en la progresión tumoral, los ratones portadores de tumores de Colon26 se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos. Como se muestra en la Figura 5H, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron: (1) PBS (200 μL), (2) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) CARCD133-iNEV más clodronato (200 μg por inyección) o (4) CARCD133-iNEV más anticuerpos anti-Ly6G (0,5 mg por inyección; clon 1A8, Bio X Cell). En la Figura 5I, los ratones portadores de tumores de Colon26 de tipo salvaje (WT) y los ratones con deleción específica de macrófagos de Nos2 (Nos2-KO) (n = 5 por grupo) se trataron con (1) WT + PBS (200 μL), (2) WT + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) Nos2-KO + PBS (200 μL) o (4) Nos2-KO + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena caudal tres veces por semana (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron los 1500 mm3 o al cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias.

Para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), se recolectaron los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y colon) de los ratones portadores de tumores después del tratamiento. Los tejidos se enjuagaron brevemente en PBS frío para eliminar la sangre residual y se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C durante 24 horas. Los tejidos fijados se deshidrataron en etanol graduado (70%, 80%, 90%, 95% y 100%), se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor utilizando un micrótomo rotatorio y se montaron en portaobjetos de vidrio con carga positiva. Las secciones se desparafinaron en xileno (2 × 10 minutos), se rehidrataron a través de concentraciones decrecientes de etanol hasta agua destilada y se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron en agua corriente durante 10 minutos, se diferenciaron en alcohol ácido al 1% durante 30 segundos, se tiñeron con azul en agua de amoníaco al 0,1% durante 1 minuto, se contratiñeron con eosina durante 2 minutos y se deshidrataron a través de una serie ascendente de etanol. Después de la aclaración en xileno, los portaobjetos se montaron con resina neutra. Las imágenes se capturaron bajo iluminación de campo claro.

Para la inmunohistoquímica (IHQ) para la detección de CAR-iNEV marcados con HA en tejidos de ratón.

Para evaluar la biodistribución de CAR-iNEV in vivo, se realizó una tinción por inmunohistoquímica (IHQ) en corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tejidos tumorales obtenidos de ratones tratados. Los tejidos se fijaron en PFA al 4% durante la noche a 4 °C, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinización y rehidratación, la actividad peroxidasa endógena se inhibió con 3% de H2O2 durante 10 minutos a temperatura ambiente. La recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6.0) a 95 °C durante 20 minutos. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-HA (Abmart, Cat#M20003; dilución 1:200) diluido en el tampón de bloqueo. Después del lavado con PBS (3 × 5 minutos), las láminas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo del color se logró utilizando el sustrato 3,3'-diaminobencidina (DAB), y las secciones se contrateñieron con hematoxilina durante 30 segundos, se deshidrataron, se aclararon y se montaron con resina neutra.

Tinción por IHQ para la detección de CD133 en muestras de tumores humanos

Se obtuvieron especímenes de carcinoma hepatocelular humano (n = 4), cáncer colorrectal (n = 3) y cáncer de páncreas (n = 3) de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong. Los tejidos se fijaron en PFA al 4% durante 24 horas, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinización y rehidratación como se describió anteriormente, la actividad peroxidasa endógena se bloqueó utilizando 3% de H2O2 durante 10 minutos, y la recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6.0) a 95 °C durante 20 minutos. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-CD133 (CST, Cat#64326; dilución 1:200) diluido en PBS que contenía 1% de BSA. Las láminas se lavaron e incubaron con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente. La tinción se desarrolló utilizando el sustrato DAB, se contrateñó con hematoxilina, se deshidrató, se aclaró y se montó.

Cuantificación y análisis estadístico

A menos que se especifique lo contrario, los datos se presentan como Media ± Desviación Estándar (DE). Los análisis estadísticos se realizaron de la siguiente manera: se utilizó la prueba t de Student de dos colas no pareada para comparaciones de dos grupos, mientras que se aplicó ANOVA de una vía para comparaciones de múltiples grupos, incluidos los pesos tumorales y los parámetros toxicológicos. Se empleó ANOVA de dos vías para los análisis de series temporales de la viabilidad celular in vitro y las curvas de crecimiento tumoral. El análisis de supervivencia se realizó utilizando la prueba de rango logarítmico. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo, y los niveles de significación se indican de la siguiente manera: ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Graphpad Prism v10 (GraphPad Software, http://www.graphpad.com) y SPSS v20 (paquete estadístico para Windows SPSS Inc., https://www.ibm.com/it-it/products/spss-statistics) se utilizaron para la gestión de datos, el análisis estadístico y la generación de gráficos.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Ratones

Se adquirieron comercialmente ratones macho C57BL/6 (Cat. 027) y ratones macho BALB/c (Cat. 028) inmunocompetentes, de 8 semanas de edad (Charles River Laboratories, IL, EE. UU.). Los ratones con deleción génica específica de macrófagos de NOS2 se generaron mediante el cruce de ratones Nos2-flox (C57BL/6Smoc-Nos2em1(flox)Smoc) (Shanghai Model Organisms Center, Inc., Shanghái, China, Cat. NM-CKO-226494) con ratones F4/80-Cre (The Jackson Laboratory). La descendencia resultante se genotipó y se utilizaron ratones macho con deleción condicional de Nos2 (de 8 semanas de edad) para los experimentos. Se compraron ratones macho huHSC-NCG-M (de 8 semanas de edad; Cat. T057533) a Gempharma Technology Company (Cat. T057533). Todos los ratones se alojaron en condiciones institucionales estándar, y los tamaños de los grupos se especifican en las leyendas de las figuras. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Chicago (71829-11) y el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong (KYLL-2023-412).

Líneas celulares y cultivo celular

Las líneas celulares K562 (Cat. CCL-243), HEK 293T/17 (Cat. CRL-11268), Panc02 (Cat. CRL-2553) y iPSC humanas (Cat. ACS-1027) se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). La línea celular iPSC de ratón se compró a Alstem (Cat. iPS02M). La línea celular H22 (Cat. YC-C053) se compró a Ubigene Biosciences (Ubigene Biosciences Co., Ltd., Guangzhou, China). La línea celular Colon26 se compró a Creative biogene (Shirley, NY, EE. UU., Cat. CSC-RR0461). La línea celular Hep53.4 se compró a CLS-Cell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemania, Cat. 400200). Todas las líneas celulares fueron autenticadas por los proveedores mediante el perfilado STR (líneas humanas) o la validación genética (líneas murinas). Todas las líneas celulares se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma cada 4 semanas utilizando un kit de detección basado en PCR (Beyotime, C0301S) y consistentemente dieron negativo antes de los experimentos.

Las líneas celulares Panc02, H22 y Hep 53.4 se transfectaron con un lentivirus que codifica el gen de la luciferasa (Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canadá, Cat. LVP010079) para construir las líneas celulares Panc02-Luc, H22-Luc y Hep 53.4-Luc para permitir la imagen tumoral in vivo. Las condiciones de cultivo celular fueron las siguientes: las células H22 se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 2 mM de L-glutamina. Las células Panc02 y Colon26 se cultivaron en medio DMEM (Gibco, EE. UU.) con alta concentración de glucosa con los mismos suplementos. Las iPSC se cultivaron en el medio iPSC (Oricell, Cyagen Biosciences, Cat. HUIPS-90011). Las culturas de iPSC se disociaron utilizando Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., AT104). Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Muestras humanas

Las muestras de tumores humanos utilizadas en este estudio se obtuvieron de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong con la aprobación del comité de ética institucional (KYLL-2023-413). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Se incluyeron un total de diez muestras de tumores, que comprendían hHCC (n = 4), cáncer colorrectal (n = 3) y cáncer de páncreas (n = 3). Cada muestra de tumor se cortó en pequeños trozos y se implantó subcutáneamente para establecer modelos PDX. Después del injerto exitoso, los ratones portadores de PDX se asignaron al grupo experimental o al grupo de control según si recibieron tratamiento con CARCtrl-iNEV o tratamiento con CARCD133-iNEV. La información clínica, incluido el sexo, la raza, el origen étnico y la ascendencia, no fue proporcionada por el hospital y, por lo tanto, no pudo incorporarse en los análisis posteriores, lo que se reconoce como una limitación.

Detalles del método

Selección de la biblioteca de nanobodies CD133

Se identificaron nanobodies que se unen a CD133 a partir de una biblioteca de fagos VHH (Shenzhen Kangtai Biotechnology) que contiene aproximadamente 4 × 109 clones únicos, según protocolos establecidos previamente.^[46] Para la selección, se utilizaron tubos de inmunoselección recubiertos con proteína CD133 durante tres rondas de selección. Se seleccionaron un total de 731 clones individuales y se analizaron mediante ELISA de fagos utilizando un anticuerpo secundario anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). La reacción se desarrolló con solución de sustrato TMB, y la absorbancia a 450 nm se midió dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada. Los clones que dieron positivo en las tres rondas de ELISA de fagos se sometieron a secuenciación para una mayor caracterización.

Construcción de plásmidos y producción de lentivirus

Se diseñaron varios constructos CAR para que contuvieran los siguientes dominios en secuencia: la señal peptídica CD8, VHH (dominio pesado variable del anticuerpo de cadena pesada única), la región de unión CD8α, ya sea el dominio extracelular NKp46 o NKG2D, el dominio de señalización intracelular 2B4 o DAP10, y el dominio de activación CD3ζ. Además, el vector contenía un gen de resistencia a la puromicina y una etiqueta HA. Estas secuencias CAR se optimizaron para la expresión humana y se sintetizaron de novo por System Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.). Los constructos CAR se clonaron en el vector retroviral pCDH-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro bajo el control del promotor EF1α. Se diseñó un casete bicistrónico para coexpresar el CAR y el reportero de transducción CopGFP, separados por un péptido T2A de autolimpieza para garantizar la expresión equimolar de ambas proteínas. Para la producción del vector retroviral, se sembraron células HEK293T/17 (ATCC, Cat. CRL-11268) en placas de cultivo de 10 cm a una confluencia de aproximadamente el 70% un día antes de la transfección. Se realizó una transfección transitoria utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Cat. L3000015). Brevemente, el ADN plasmídico que codifica el constructo CAR (15 μg), el plásmido de empaquetamiento psPAX2 (10 μg; Addgene, Cat. 12260) y el plásmido de envoltura pMD2.G (5 μg; Addgene, Cat. 12259) se mezclaron en Opti-MEM (Gibco, Cat. 31985070) y se incubaron con el reactivo de transfección para formar complejos de ADN. Estos complejos se añadieron por goteo a las células HEK293T/17 en un medio libre de suero. Después de 8 h, el medio se reemplazó con medio DMEM fresco. Los sobrenadantes virales se recogieron a las 48 y 72 h después de la transfección, se recogieron en tubos estériles y se centrifugaron a 500×g durante 10 min a 4°C para eliminar los restos celulares. El medio viral clarificado se concentró utilizando el concentrador Lenti-X (Takara, EE. UU., Cat. 631231). El sobrenadante viral se mezcló con el concentrador Lenti-X en una proporción de 3:1 y se incubó durante la noche a 4°C, seguido de una centrifugación a 1500×g durante 45 min a 4°C. El pellet viral se resuspendió en PBS estéril y se dividió en alícuotas para su almacenamiento a −80°C.### Generación de células CAR-iPSC

Para la transducción retroviral, las células iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas retrovirales concentradas que codifican los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada del virus. Las células se agitaron suavemente cada 15 min durante el período de transducción de 6 h a 37°C. Después de la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó con medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/mL para enriquecer selectivamente las células que expresan CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenía puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las células iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con 2% de suero fetal bovino y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 min con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluoróforo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza superior al 95%. Después de la clasificación, las células iPSC que expresan CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.### Diferenciación de las células CAR-iPSC en células NK

Para la diferenciación de células NK, las células iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas retrovirales concentradas que codifican los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada del virus. Las células se agitaron suavemente cada 15 min durante el período de transducción de 6 h a 37°C. Después de la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó con medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/mL para enriquecer selectivamente las células que expresan CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenía puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las células iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con 2% de suero fetal bovino y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 min con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluoróforo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza superior al 95%. Después de la clasificación, las células iPSC que expresan CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.### Diferenciación de las células CAR-iPSC en células NK

Para la diferenciación de células NK, las células iPSC de ratón se disociaron utilizando 0,25% de tripsina-EDTA y se resuspendieron a una densidad de 2 × 103 células/ml en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) suplementado con 15% de FBS, 1% de metilcelulosa (Methocult, Cat. M3434) y 2 mM de glutamina. Se añadieron factor de células madre de ratón recombinante (SCF, PeproTech, 50 ng/mL), interleucina-3 (IL-3, PeproTech, 30 ng/mL) e interleucina-6 humana (IL-6, PeproTech, 30 ng/mL) para promover la inducción de progenitores hematopoyéticos. Las células se sembraron en placas de 35 mm de baja adherencia y se cultivaron a 37°C en 5% de CO2 durante 8 días para permitir la formación de cuerpos embrionarios (EB). El día 8, los EB se recogieron, se lavaron y se disociaron en suspensiones de células individuales utilizando 0,25% de tripsina-EDTA. Para la inducción de células NK, las células HPC se resuspendieron a una densidad de 2 × 104 células por pocillo en α-MEM suplementado con 10% de FBS, 1000 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (PeproTech) y 5 ng/mL de interleucina-15 de ratón (PeproTech). Los cultivos se mantuvieron a 37°C, con cambios de medio cada 3-4 días. Las células NK se recogieron después de 10-14 días.

La diferenciación de las células iPSC humanas se indujo según un protocolo publicado.^[47] Primero, se sembraron 5000 células iPSC adaptadas a TrypLE por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las células se cultivaron en medio APEL suplementado con 40 ng/mL de factor de células madre humano (Gibco, Cat. PHC2111), 20 ng/mL de factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y 20 ng/mL de proteína morfogenética ósea humana recombinante 4 (BMP-4). El día 11 de la diferenciación, los EB resultantes se transfirieron directamente a placas de 24 pocillos no recubiertas y se permitió que continuaran diferenciándose en condiciones de cultivo de células NK. Los cultivos se mantuvieron durante 28-32 días adicionales en medio de diferenciación de células NK que contenía 10 ng/mL (IL-15, 20 ng/mL de IL-7, 20 ng/mL de SCF y 10 ng/mL de ligando FLT3. Cabe destacar que IL-3 a 5 ng/mL solo se incluyó durante la primera semana de este período para apoyar la diferenciación temprana. Cuando las células NK maduraron, se recogieron y se cocultivaron con células presentadoras de antígeno artificiales K562-mbIL-21-4-1BB irradiadas (aAPC) para estimular la expansión. El cultivo de expansión se realizó en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 50 U/ml de interleucina-2 humana.### Filtración tangencial (TFF) y aislamiento de vesículas extracelulares

Los medios acondicionados de las células se clarificaron y se concentraron utilizando una cápsula de filtración tangencial Minimate (Pall Corporation) equipada con una membrana Omega para eliminar las células desprendidas, los restos grandes y los contaminantes particulados. La filtración se realizó utilizando una bomba peristáltica MASTERFLEX Console Analog L/S (Modelo 77521-47), con caudales ajustados para mantener las siguientes presiones: presión de alimentación (P Feed): 30 psi; presión de retentado (P Retentate): 25 psi; y presión de filtrado (P Filtrate): 0 psi. Los medios acondicionados de las células se introdujeron en el depósito y se concentraron a los caudales indicados hasta alcanzar un volumen final de 10 mL. Después de la concentración, se realizó un intercambio de búfer y una filtración de diálisis utilizando una cantidad de PBS equivalente al volumen original del medio. Se añadió PBS al depósito y se recirculó durante 10 min para eliminar las impurezas residuales y las vesículas extracelulares atrapadas en la membrana del filtro. A continuación, la muestra se concentró a un volumen de 10 mL y se repitió el paso de recirculación/diálisis tres veces. El pellet final de 10 mL se sometió a una recirculación adicional de 10 min, seguida de la recogida del depósito. Para garantizar la eliminación completa de los contaminantes residuales, se añadió PBS (10 mL) y la mezcla se recirculó durante 10 min y se recogió. Este paso de recirculación de PBS se repitió tres veces en total. La concentración adicional del volumen final de 30 mL se realizó utilizando un filtro centrífugo Centricon Plus-70 (membrana Ultracel-PL, 100 kDa) con centrifugación a 3000 × g a 4°C en una centrífuga Allegra X-15R. El concentrado se recuperó mediante centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 min a 4°C. Para maximizar el rendimiento, se añadió 1 mL de PBS al filtro Centricon Plus-70 y la muestra se reconcentró mediante centrifugación a 3000 × g durante 2 min a 4°C, seguida de centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 min.### Purificación de proteínas

Para la expresión y purificación de proteínas diana, los plásmidos recombinantes pET-14B-CD133 (humano y de ratón) se transformaron en células BL21(DE3). Las culturas bacterianas se cultivaron a 37°C y 225 rpm hasta alcanzar una OD600 de 0,6, y luego se indujeron con 0,2 mM de IPTG a 16°C durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación a 8000 × g durante 15 min a 4°C y se resuspendieron en tampón de lisis (300 mM de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, 10 mM de imidazol, pH 8,0, 1 mM de PMSF). Se realizó una homogeneización a alta presión a baja temperatura durante tres ciclos, seguida de una centrifugación a 12 000 × g durante 45 min para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se cargó en una columna de gravedad que contenía 1 mL de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Alemania). Las proteínas unidas se lavaron secuencialmente con 50 mL de tampón de lavado I (20 mM de imidazol, pH 8,0) y 50 mL de tampón de lavado II (40 mM de imidazol, pH 8,0), y luego se eluyeron con 25 mL de tampón de elución (250 mM de imidazol, pH 8,0). El eluido se purificó aún más mediante cromatografía de gel Superdex-150 utilizando un sistema AKTA Pure (GE Healthcare Life Sciences, EE. UU.) en 1× PBS. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80°C. La purificación de nanobodies siguió el mismo protocolo de cromatografía de afinidad Ni-NTA. Los nanobodies purificados se caracterizaron mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-VHH, anti-HA y anti-6×His.### Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Se recogieron y homogeneizaron tejidos de hígado de ratón. Los niveles de citocinas y quimiocinas inflamatorias en los homogenados de hígado se cuantificaron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente según los protocolos de los fabricantes. Se utilizaron los siguientes kits de JONLNBIO: Kit ELISA de ratón Ccl3 (Cat. JL20414), ratón Ccl5 (Cat. JL17335), ratón Cxcl1 (Cat. JL20150), ratón Cxcl5 (Cat. JL28925), ratón IL-1α (Cat. JL13044), ratón IL-1β (Cat. JL18442), ratón IL-6 (Cat. JL20268), ratón TNF-α (Cat. JL10484) y Kit ELISA de ratón Csf3 (Cat. JL10697). Además, los niveles de Cxcl2 de ratón se midieron utilizando el kit ELISA de Abnova (Cat. KA1505). Todos los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones respectivas del fabricante, y se midió la absorbancia para determinar la concentración de cada mediador inflamatorio en las muestras de hígado. Las muestras de tejido para el análisis ELISA se prepararon como homogenados utilizando el siguiente procedimiento: los tejidos diana se colocaron sobre hielo y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4) enfriada para eliminar los restos de sangre, y luego se pesaron y se reservaron. La homogeneización de los tejidos se realizó sobre hielo utilizando un tampón de lisis compuesto por 50 mM de Tris, 0,9% de NaCl y 0,1% de SDS a pH 7,3, con un volumen de tampón de lisis añadido proporcional al peso del tejido, normalmente 9 mL por 1 g de fragmentos de tejido, suplementado con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como inhibidor de proteasas. Los homogenados se procesaron aún más mediante la interrupción ultrasónica bajo enfriamiento con hielo para evitar el sobrecalentamiento. Los homogenados preparados se centrifugaron a 5000 × g durante 5 min a 4°C, y los sobrenadantes se recogieron para el ELISA. Antes del análisis, se cuantificaron las concentraciones totales de proteínas de los homogenados de tejido utilizando el ensayo de ácido bicinquinónico (BCA), y las muestras se ajustaron a una concentración de proteína final de 2 mg/mL para la detección del ELISA.### Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Se realizaron experimentos SPR en un instrumento Biacore S200 para caracterizar la cinética de unión de los nanobodies (Nb) con CD133 humano y de ratón. Antes de la inmovilización, el chip sensor S-CM5 (Cytiva) se preacondicionó mediante inyecciones secuenciales de 10 mM de glicina-HCl (pH 1,5) y tampón de lavado para estabilizar la superficie. Las proteínas CD133 humanas y de ratón se inmovilizaron en celdas de flujo separadas del chip mediante la química estándar de acoplamiento de aminas. Brevemente, la superficie del chip se activó mediante la inyección de una mezcla recién preparada de 0,05 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 0,2 M de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) durante 7 min a una velocidad de flujo de 10 μL/min. Las proteínas CD133, diluidas a 30 μg/mL en un tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 5,0), se inyectaron sobre la superficie activada hasta que los niveles de inmovilización alcanzaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR). Una celda de flujo de referencia se sometió al mismo procedimiento de activación y bloqueo sin acoplamiento de proteínas para controlar la unión inespecífica y los cambios en el índice de refracción. Todos los ensayos de unión se llevaron a cabo a 25 °C utilizando un tampón de lavado compuesto por 10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0,05% (v/v) de Tween 20, que se filtró y desgasificó antes de su uso. Se inyectaron diluciones seriadas de 2 pliegues de cada nanobody sobre la superficie del sensor a una velocidad de flujo de 30 μL/min durante una fase de asociación de 120 s, seguida de una fase de disociación de 180 s con el flujo del tampón de lavado. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se logró mediante la inyección de 10 mM de glicina-HCl (pH 2,0) durante 120 s, lo que aseguró la disociación completa de los Nb unidos, al tiempo que se preservó la integridad del CD133 inmovilizado. Los sensorgramas se doblemente referenciaron mediante la sustracción de las señales de la celda de referencia y las inyecciones de tampón en blanco para corregir la unión inespecífica y la desviación instrumental. Los parámetros cinéticos de unión, incluido el coeficiente de velocidad de asociación, el coeficiente de velocidad de disociación y la constante de disociación de equilibrio, se obtuvieron ajustando los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore S200. La calidad del ajuste se evaluó en función de los residuos y los valores de chi-cuadrado.

Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa

La actividad citotóxica se evaluó utilizando un ensayo basado en luciferasa. Las líneas celulares tumorales Panc02, Colon26 y H22, que expresan de forma estable la luciferasa, se utilizaron como células diana. Las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos y se co-incubaron con células CAR-iNK que portaban diferentes constructos CAR a las proporciones efector-diana (E/T) indicadas. Después de 2 h de incubación a 37 °C, la lisis celular se cuantificó midiendo la actividad residual de la luciferasa utilizando un sistema de ensayo estándar de luciferasa (Promega) según las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se detectó con un lector de microplacas y la citotoxicidad se calculó como el porcentaje de reducción de la luminiscencia en relación con los pocillos de control no tratados.

Para la Figura S1C, las células diana se incubaron con CAR-iNK durante 4 h antes de la medición.

Para la Figura S3D, las células diana se incubaron con CARCD133-iNEV o CARCtrl-iNEV durante 2 h antes de la medición.

Modelo de cáncer ortotópico hepático in vivo

Las células tumorales Hep53.4 que expresan luciferasa (Hep53.4-Luc) se recolectaron al 70-80% de confluencia utilizando 0,05% de tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a una concentración de 2 × 107 células/200 μL en PBS frío inmediatamente antes de la implantación. Se anestesiaron ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (peso de 18 a 22 g) utilizando isoflurano (inducción al 3-4%, mantenimiento al 1,5-2%). Tras la preparación aséptica del área abdominal, se realizó una pequeña incisión subcostal para exponer el lóbulo hepático lateral izquierdo. Una suspensión que contenía 1 × 106 células Hep53.4-Luc en 10 μL de PBS se mezcló suavemente con 20 μL de Matrigel en una proporción de 1:2 (v/v) inmediatamente antes de la inyección. La mezcla de 30 μL se inyectó cuidadosamente debajo de la cápsula hepática para establecer un tumor hepático ortotópico. La carga tumoral se monitorizó longitudinalmente mediante el sistema IVIS Spectrum (PerkinElmer). En cada punto de tiempo de imagen, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina (3 mg en 100 μL de PBS estéril). Cuatro minutos después de la inyección, se anestesiaron los animales con isoflurano y se adquirieron las imágenes. La cuantificación de las señales se realizó utilizando el software Living Image versión 4.5, definiendo regiones de interés (ROI) sobre el área hepática y calculando el flujo fotónico total (fotones/seg/cm2) como medida de la carga tumoral. Los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. La aleatorización se realizó utilizando números aleatorios generados por ordenador para garantizar una asignación imparcial. Los regímenes de tratamiento se iniciaron según el diseño del estudio, según se detalla en el diagrama de flujo, y los investigadores desconocían la asignación de los grupos para minimizar el sesgo. A lo largo del estudio, se monitorizaron los ratones diariamente para detectar signos de angustia o efectos adversos, y se observaron estrictamente los puntos finales humanitarios.

Modelo de metástasis pulmonar in vivo

Para la generación del modelo de metástasis pulmonar, las células Panc02-Luc se prepararon como se describió anteriormente y se resuspendieron en PBS estéril a 1 × 107 células/mL. Se inmovilizaron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad y se calentaron para dilatar la vena de la cola, y luego se inyectaron con 1 × 106 células Panc02-Luc en 100 μL de PBS a través de la vena de la cola lateral. Se confirmó la administración intravenosa exitosa mediante la ausencia de hinchazón o fugas en el sitio de inyección. Se monitorizaron de cerca los ratones para detectar signos de dificultad respiratoria y estado general de salud a lo largo del estudio. El crecimiento tumoral y la metástasis se cuantificaron mediante BLI tras la inyección intraperitoneal de D-luciferina. Las señales BLI de referencia se utilizaron para aleatorizar los ratones en grupos de tratamiento, de acuerdo con el protocolo del modelo ortotópico.

Modelo subcutáneo in vivo

Las líneas celulares tumorales Hep53.4, Panc02, H22 y Colon26 se cultivaron y recolectaron utilizando 0,05% de tripsina-EDTA al 70-80% de confluencia. Las células se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a 1 × 107 células/mL. Para la implantación tumoral subcutánea, se inyectaron 1 × 106 células Hep53.4 y Panc02 en el flanco derecho de ratones hembra C57BL/6 sinérgicos, mientras que se inyectaron 1 × 106 células H22 y Colon26 subcutáneamente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c sinérgicos, respectivamente. El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días mediante mediciones con calibre. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (longitud × ancho × ancho)/2. Los ratones se agruparon aleatoriamente cuando el volumen tumoral alcanzó los 150 mm3. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó los 1500 mm3 o cuando se observaron los puntos finales humanitarios predefinidos.

Modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) in vivo

Las muestras clínicas del paciente se obtuvieron con autorización y aprobación del Comité de Ética de la Investigación del Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong (KYLL-2023-413). Se obtuvieron los formularios de consentimiento informado de los pacientes y sus familias. Los tejidos tumorales frescos se transportaron sobre hielo en RPMI-1640 estéril suplementado con un 1% de solución antibiótico-antimicótica. En un plazo de 2 h tras la resección, los tumores se picaron en fragmentos de aproximadamente 3 × 3 × 3 mm3 utilizando bisturíes estériles en condiciones asépticas. Los fragmentos se implantaron subcutáneamente en el flanco posterior derecho de ratones huHSC-NCG-M bajo anestesia con isoflurano. Los ratones recibieron analgésicos en el postoperatorio según los protocolos institucionales. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante mediciones con calibre, calculando el volumen tumoral utilizando la fórmula: (longitud × ancho × ancho)/2. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente los 150 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. Se evaluó la eficacia antitumoral y la supervivencia. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores superaron los 1500 mm3 o si presentaban signos de angustia, siguiendo los puntos finales humanitarios.

Citometría de flujo in vivo

Se administraron CAR-iNEV a los ratones a 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena de la cola. 24 h después de la inyección, se anestesiaron los animales con isoflurano y se perfundieron a través de la arteria carótida con 10 mL de PBS helado para eliminar los vesículos circulantes. Se extirparon los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) y los tumores recolectados, se colocaron en HBSS helado y se procesaron inmediatamente para obtener suspensiones de células individuales. El tejido hepático se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C con una agitación suave, luego se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm, seguido de la lisis de los glóbulos rojos (tampón ACK, 2-3 min a temperatura ambiente) y se lavó dos veces con tampón FACS (PBS con 2% de FBS y 2 mM de EDTA). El tejido pulmonar se digirió de forma similar utilizando colagenasa D (1,0 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se pasó a través de un tamiz celular de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y se lavaron en tampón FACS. Los bazo se disociaron suavemente mediante la interrupción mecánica a través de un tamiz celular de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y luego se lavaron en tampón FACS. El tejido renal y el tejido cardíaco se picaron y se digirieron en HBSS que contenía colagenasa II (1,0 mg/mL) más DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y se lavaron en tampón FACS. El tejido tumoral se extirpó, se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se filtró, se lisaron los glóbulos rojos y se lavó. Para identificar las células tumorales frente a los fibroblastos asociados al tumor (FAT), se realizó un tinte adicional para los marcadores de linaje (EpCAM para las células tumorales, PDGFRα/αSMA para los fibroblastos). Después de la disociación, se evaluó la viabilidad de las células mediante la exclusión de azul de tripan y se contaron las células viables. Aproximadamente 1 × 106 células viables por muestra se transfirieron a 100 μL de tampón FACS para el tinte. El tinte de superficie se realizó añadiendo marcadores de superficie conjugados con fluorocromo para los subconjuntos celulares (CD45, EpCAM, PDGFRα, αSMA) a diluciones preoptimizadas y se incubó durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.

Para la citometría de flujo de los experimentos de captación celular, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se fijaron con 100 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la fijación, las células se lavaron una vez en tampón FACS y luego se permeabilizaron añadiendo 200 μL de tampón de permeabilización (PBS que contiene 0,1% de saponina y 2% de FBS) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Sin un lavado adicional, se realizó el tinte intracelular añadiendo anti-HA conjugado con fluorocromo (1:100) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en el tampón de permeabilización. Las células se lavaron dos veces en tampón FACS y se resuspendieron en 100 μL de tampón FACS. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo con ajustes de voltaje idénticos en todos los órganos y muestras.

Etiquetado de CAR-iNEV con 89Zr-DFO

Para permitir el etiquetado de superficie de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV con 89Zr, se utilizó un enfoque de quelación en dos pasos. Inicialmente, los exosomas se funcionalizaron con el quelante desferrioxamina (DFO). Brevemente, p-NCS-Bn-DFO (Future Chem, Seúl, Corea), disuelto en DMSO a una concentración de 5-20 mg/mL, se añadió a la suspensión de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV a una relación de peso DFO a proteína exosómica de 1:10. Después de la incubación, los exosomas etiquetados con DFO se purificaron utilizando una columna de desalanización de dextrano (punto de corte molecular (MWCO) de 5000, Pierce, WI, EE. UU.), con 10 mM de PBS como eluyente. Posteriormente, los CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV modificados con DFO se etiquetaron con 89Zr. El 89Zr4+, suministrado en ácido oxálico 1,0 M, se neutralizó primero a un pH entre 6,8 y 7,5 utilizando 1,0 M de Na2CO3. La solución de 89Zr neutralizada se combinó con los conjugados de exosomas DFO y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h bajo una agitación suave (550 rpm). Los exosomas etiquetados se purificaron posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna de desalanización de dextrano (MWCO de 50 000), y se utilizó 10 mM de PBS (pH 7,4, sin Ca2+ y Mg2+) como tampón de elución para garantizar la eliminación del radionúclido no unido. La preparación final de exosomas radiomarcados se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Biodistribución ex vivo

Se utilizaron un total de 40 ratones BALB/c machos para el análisis de biodistribución ex vivo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (2%, 1 L/min) e inyectados por vía intravenosa con 89Zr-CARCtrl-iNEV o 89Zr-CARCD133-iNEV a una dosis fija de 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena de la cola. En puntos temporales predeterminados (1, 4, 8, 12 y 24 h) después de una única administración, se sacrificaron cuatro ratones por grupo bajo anestesia profunda. Se recolectaron los órganos principales (sangre, colon, estómago, riñones, pulmones, bazo, hígado, corazón y tumor), se enjuagaron con PBS, se secaron y se pesaron. La radiactividad en cada muestra se midió utilizando un sistema de contador gamma (1480 Wizard, PerkinElmer, MA, EE. UU.) con una ventana de energía centrada en el pico de 909 keV de 89Zr. Se preparó en paralelo un estándar que contenía una fracción conocida de la dosis inyectada y se contó en condiciones idénticas para permitir la calibración de la actividad. Todas las mediciones se corrigieron para el ruido de fondo y la desintegración física al momento de la inyección. El porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) se calculó como: %ID/g = (actividad del órgano/actividad inyectada) × 100/peso del órgano.

Tratamientos in vivo

Para evaluar la eficacia terapéutica de las células CARCD133-iNK y CARCD133-iNEV, se establecieron modelos de tumor subcutáneo utilizando células H22. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 150 mm3, los ratones portadores de tumores (BALB/c, n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a siete grupos de tratamiento: (1) control con PBS (200 μL), (2) dosis alta de CARCD133-iNK (1 × 107 células por inyección), (3) dosis baja de CARCD133-iNK (1 × 106 células por inyección), (4) dosis alta de CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (5) dosis baja de CARCtrl-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección), (6) dosis alta de CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) y (7) dosis baja de CARCD133-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola en un volumen total de 200 μL cada dos días. Los volúmenes tumorales se midieron cada dos días utilizando un calibrador y se calcularon.

Para evaluar la actividad antitumoral de CARCD133-iNEV en múltiples modelos de tumor, se utilizaron modelos subcutáneos con células H22, Panc02 y Colon26. Los ratones portadores de tumores (n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a tres grupos y se trataron por vía intravenosa con: (1) PBS control (200 μL), (2) CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Los tratamientos se administraron tres veces por semana, cada inyección se realizó en un volumen de 200 μL. Los tamaños de los tumores se midieron cada dos días como se describió anteriormente.

Para los estudios de inmunoterapia combinada en modelos PDX, los ratones portadores de tumores establecidos (∼150 mm3) se asignaron aleatoriamente de la siguiente manera: en el experimento que se muestra en la Figura 6E, cuatro grupos (n = 5 por grupo) recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). En el experimento que se muestra en la Figura 6F, los ratones portadores de PDX se asignaron aleatoriamente a dos grupos (n = 5 por grupo) y se trataron con PBS (200 μL) o CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) combinado con anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales superaron los 1500 mm3 o después de cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias. Se monitoreó la supervivencia hasta por 60 días. De manera similar, los ratones portadores de CDX se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) CARCD133-iNEV combinado con anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola una vez por semana durante tres dosis (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 1500 mm3 o al final del experimento (32 días).

Para los modelos de metástasis, los ratones portadores de metástasis pulmonares o peritoneales de Panc02-Luc se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) y se trataron por vía intravenosa con (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Todos los tratamientos se administraron tres veces por semana por inyección en la vena de la cola (200 μL por inyección). La carga tumoral se monitoreó cada cinco días utilizando BLI. Se monitoreó la supervivencia de los ratones y se sacrificaron cuando cumplieron con los criterios de sacrificio por razones humanitarias o por muerte natural. El punto final del experimento se fijó en 40 días después del inicio del tratamiento.

Para evaluar la longevidad de la memoria inmunitaria antitumoral, se realizaron experimentos de reexposición tumoral aproximadamente 120 días después del último tratamiento con CARCD133-iNEV + anticuerpo anti-CD47. Se consideró que este intervalo era adecuado para la eliminación de los agentes terapéuticos residuales y la resolución de las respuestas inmunitarias agudas. Cinco ratones, seleccionados aleatoriamente de los siete ratones que previamente fueron curados con terapia combinada (tres del modelo de metástasis pulmonar y dos del modelo de metástasis peritoneal), fueron reexuestos por vía subcutánea con células Panc02-Luc (como se describió anteriormente para el establecimiento de los modelos de metástasis pulmonar y peritoneal). Se utilizaron ratones de la misma edad como controles. Se monitoreó el crecimiento tumoral y la supervivencia para evaluar la persistencia de la inmunidad antitumoral en los supervivientes a largo plazo.

Para investigar los papeles de los macrófagos y los neutrófilos en la progresión tumoral, los ratones portadores de tumores de Colon26 se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos. Como se muestra en la Figura 5H, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron: (1) PBS (200 μL), (2) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) CARCD133-iNEV más clodronato (200 μg por inyección) o (4) CARCD133-iNEV más anticuerpos anti-Ly6G (0,5 mg por inyección; clon 1A8, Bio X Cell). En la Figura 5I, los ratones portadores de tumores de Colon26 de tipo salvaje (WT) y los ratones con deleción específica de macrófagos de Nos2 (Nos2-KO) (n = 5 por grupo) fueron tratados con (1) WT + PBS (200 μL), (2) WT + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) Nos2-KO + PBS (200 μL) o (4) Nos2-KO + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola tres veces por semana (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron los 1500 mm3 o al cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

Para la evaluación histopatológica, se recolectaron los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y colon) de los ratones portadores de tumores después del tratamiento. Los tejidos se enjuagaron brevemente en PBS frío para eliminar la sangre residual y se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) a 4 °C durante 24 h. Los tejidos fijados se deshidrataron a través de una serie de etanol graduado (70%, 80%, 90%, 95% y 100%), se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor utilizando un micrótomo rotatorio y se montaron en portaobjetos de vidrio con carga positiva. Las secciones se desparafinaron en xileno (2 × 10 min), se rehidrataron a través de concentraciones descendentes de etanol hasta agua destilada y se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 5 min. Los portaobjetos se enjuagaron en agua corriente durante 10 min, se diferenciaron en alcohol ácido al 1% durante 30 s, se tiñeron con azul en agua de amoníaco al 0,1% durante 1 min, se contratiñeron con eosina durante 2 min y se deshidrataron a través de una serie ascendente de etanol. Después de la aclaración en xileno, los portaobjetos se montaron con resina neutra. Las imágenes se capturaron bajo iluminación de campo claro.

Inmunohistoquímica (IHC) para la detección de CAR-iNEV con etiqueta HA en tejidos de ratón

Para evaluar la biodistribución de CAR-iNEV in vivo, se realizó la tinción IHC en los tejidos de corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tumor recolectados de los ratones tratados. Los tejidos se fijaron en 4% de PFA durante la noche a 4 °C, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinación y rehidratación, la actividad de la peroxidasa endógena se eliminó con 3% de H2O2 durante 10 min a temperatura ambiente. La recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) a 95 °C durante 20 min. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-HA (Abmart, Cat#M20003; dilución 1:200) diluido en tampón de bloqueo. Después del lavado con PBS (3 × 5 min), las secciones se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 30 min a temperatura ambiente. El desarrollo del color se logró utilizando el sustrato 3,3'-diaminobencidina (DAB), y las secciones se contratiñeron con hematoxilina durante 30 s, se deshidrataron, se aclararon y se montaron con resina neutra.

Tinción IHC para la detección de CD133 en muestras de tumores humanos

Se obtuvieron especímenes de carcinoma hepatocelular humano (n = 4), cáncer colorrectal (n = 3) y cáncer de páncreas (n = 3) de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong. Los tejidos se fijaron en 4% de PFA durante 24 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinación y rehidratación como se describió anteriormente, la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó utilizando 3% de H2O2 durante 10 min, y la recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) a 95 °C durante 20 min. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-CD133 (CST, Cat#64326; dilución 1:200) diluido en PBS que contenía 1% de BSA. Los portaobjetos se lavaron e incubaron con anticuerpo secundario ligado a HRP durante 30 min a temperatura ambiente. La tinción se desarrolló utilizando el sustrato DAB, se contratiñó con hematoxilina, se deshidrató, se aclaró y se montó.

Cribado de la biblioteca de nanobodies CD133

Se identificaron nanobodies que se unen a CD133 a partir de una biblioteca de visualización de fagos VHH (Shenzhen Kangtai Biotechnology) que contiene aproximadamente 4 × 109 clones únicos, de acuerdo con protocolos establecidos previamente.^[46] Para la selección, se utilizaron inmunotubos recubiertos con proteína CD133 para tres rondas de selección. Se seleccionaron un total de 731 clones individuales y se analizaron mediante ELISA de fagos utilizando un anticuerpo secundario anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). La reacción se desarrolló con solución de sustrato TMB, y la absorbancia a 450 nm se midió dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada. Los clones que dieron positivo en las tres rondas de ELISA de fagos se sometieron a secuenciación para una mayor caracterización.

Construcción de plásmidos y producción de lentivirus

Se diseñaron varios constructos CAR para que contuvieran los siguientes dominios en secuencia: la señal peptídica CD8, VHH (dominio de cadena pesada variable del anticuerpo de cadena pesada única), la región de unión CD8α, ya sea el dominio extracelular NKp46 o NKG2D, el dominio de señalización intracelular 2B4 o DAP10, y el dominio de activación CD3ζ. Además, el vector contenía un gen de resistencia a la puromicina y una etiqueta HA. Estas secuencias CAR se optimizaron para la expresión humana y se sintetizaron de novo por System Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.). Los constructos CAR se clonaron en el vector principal lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro bajo el control del promotor EF1α. Se diseñó un casete bicistrónico para coexpresar el CAR y el reportero de transducción CopGFP, separados por un péptido T2A de autolimpieza para garantizar la expresión equimolar de ambas proteínas. Para la producción del vector lentiviral, se sembraron células HEK293T/17 (ATCC, Cat. CRL-11268) en placas de cultivo de 10 cm a una confluencia de aproximadamente el 70% un día antes de la transfección. Se realizó una transfección transitoria utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Cat. L3000015). Brevemente, el ADN plasmídico que codifica el constructo CAR (15 μg), el plásmido de empaquetamiento psPAX2 (10 μg; Addgene, Cat. 12260) y el plásmido de envoltura pMD2.G (5 μg; Addgene, Cat. 12259) se mezclaron en Opti-MEM (Gibco, Cat. 31985070) y se incubaron con el reactivo de transfección para formar complejos de ADN. Estos complejos se añadieron por goteo a las células HEK293T/17 en un medio libre de suero. Después de 8 h, el medio se reemplazó con medio DMEM fresco. Los sobrenadantes virales se recogieron a las 48 y 72 h después de la transfección, se recogieron en tubos estériles y se centrifugaron a 500×g durante 10 min a 4°C para eliminar los restos celulares. El medio viral clarificado se concentró utilizando el concentrador Lenti-X (Takara, EE. UU., Cat. 631231). El sobrenadante viral se mezcló con el concentrador Lenti-X en una proporción de 3:1 y se incubó durante la noche a 4°C, seguido de una centrifugación a 1500×g durante 45 min a 4°C. El pellet viral se resuspendió en PBS estéril y se dividió en alícuotas para su almacenamiento a −80°C.

Generación de células CAR-iPSC

Para la transducción lentiviral, las células iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas lentivirales concentradas que codifican los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada viral. Las células se agitaron suavemente cada 15 min durante el período de transducción de 6 h a 37°C. Después de la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó con medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/mL para enriquecer selectivamente las células que expresan CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenía puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las células iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con 2% de suero fetal bovino y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 min con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluoróforo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza establecido por encima del 95%. Después de la clasificación, las células iPSC que expresan CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.

Diferenciación de las células CAR-iPSC en células NK

Para la transducción lentiviral, las células iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas lentivirales concentradas que codifican los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada viral. Las células se agitaron suavemente cada 15 min durante el período de transducción de 6 h a 37°C. Después de la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó con medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/mL para enriquecer selectivamente las células que expresan CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenía puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las células iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con 2% de suero fetal bovino y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 min con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluoróforo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza establecido por encima del 95%. Después de la clasificación, las células iPSC que expresan CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.

Para la transducción lentiviral, las células iPSC con una confluencia de aproximadamente el 60-70% se incubaron con partículas lentivirales concentradas que codifican los constructos CAR en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Cat. TR-1003) para mejorar la entrada viral. Las células se agitaron suavemente cada 15 min durante el período de transducción de 6 h a 37°C. Después de la transducción, el sobrenadante viral se reemplazó con medio fresco y se permitió que las células se recuperaran durante 48 h. Posteriormente, se añadió puromicina (Gibco, Cat. A1113803) a una concentración final de 2,5 μg/mL para enriquecer selectivamente las células que expresan CAR. La selección continuó durante 10 días con cambios diarios de medio que contenía puromicina para eliminar las células no transducidas. Para verificar la expresión superficial del CAR, las células iPSC resistentes a los antibióticos se recogieron utilizando Accutase (Gibco, Cat. A1110501) y se lavaron dos veces con tampón de tinción frío (PBS suplementado con 2% de suero fetal bovino y 2 mM de EDTA). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 min con anticuerpos primarios anti-VHH conjugados con fluoróforo. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción y se filtraron a través de un filtro celular de 40 μm para eliminar los agregados. Se realizó un análisis citométrico de flujo y una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador celular Sony SH800ZBP. Las células vivas individuales se clasificaron en función de los perfiles de dispersión directa y lateral, y las células CAR-positivas con la etiqueta HA se clasificaron con un umbral de pureza establecido por encima del 95%. Después de la clasificación, las células iPSC que expresan CAR se sembraron en placas frescas recubiertas con Matrigel y se cultivaron continuamente sin puromicina. Se realizó una validación periódica de la expresión del CAR mediante citometría de flujo para garantizar una expresión estable del transgen.

Para la diferenciación de las células NK, las células iPSC de ratón se disociaron utilizando 0,25% de tripsina-EDTA y se resuspendieron a una densidad de 2 × 103 células/ml en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) suplementado con 15% de FBS, 1% de metilcelulosa (Methocult, Cat. M3434) y 2 mM de glutamina. Se añadieron factor de células madre de ratón recombinante (SCF, PeproTech, 50 ng/ml), interleucina-3 (IL-3, PeproTech, 30 ng/ml) e interleucina-6 humana (IL-6, PeproTech, 30 ng/ml) para promover la inducción de progenitores hematopoyéticos. Las células se sembraron en placas de cultivo de 35 mm de baja adherencia y se cultivaron a 37°C en 5% de CO2 durante 8 días para permitir la formación de cuerpos embrionarios (EB). El día 8, los EB se recogieron, se lavaron y se disociaron en suspensiones de células individuales utilizando 0,25% de tripsina-EDTA. Para la inducción de células NK, las células HPC se resuspendieron a una densidad de 2 × 104 células por pocillo en α-MEM suplementado con 10% de FBS, 1000 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (PeproTech) y 5 ng/ml de interleucina-15 de ratón (PeproTech). Los cultivos se mantuvieron a 37°C, con cambios de medio cada 3-4 días. Las células NK se recogieron después de 10-14 días.

La diferenciación de las células iPSC humanas se indujo según un protocolo publicado.^[47] Primero, se sembraron 5000 células iPSC adaptadas a TrypLE por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las células se cultivaron en medio APEL suplementado con 40 ng/ml de factor de células madre humano (Gibco, Cat. PHC2111), 20 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y 20 ng/ml de proteína morfogenética ósea humana recombinante 4 (BMP-4). El día 11 de la diferenciación, los EB resultantes se transfirieron directamente a placas de 24 pocillos no recubiertas y se les permitió continuar diferenciándose en condiciones de cultivo de células NK. Los cultivos se mantuvieron durante 28-32 días adicionales en medio de diferenciación de células NK que contenía 10 ng/ml (IL-15, 20 ng/ml de IL-7, 20 ng/ml de SCF y 10 ng/ml de ligando FLT3. Cabe destacar que la IL-3 a 5 ng/ml solo se incluyó durante la primera semana de este período para apoyar la diferenciación temprana. Cuando las células NK maduraron, se recogieron y se cocultivaron con células presentadoras de antígeno artificiales K562-mbIL-21-4-1BB irradiadas (aAPC) para estimular la expansión. El cultivo de expansión se realizó en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 50 U/ml de interleucina-2 humana.

Filtración tangencial (TFF) y aislamiento de vesículas extracelulares

Los medios acondicionados de las células se clarificaron y se concentraron utilizando una cápsula de filtración tangencial Minimate (Pall Corporation) equipada con una membrana Omega para eliminar las células desprendidas, los restos grandes y los contaminantes particulados. La filtración se realizó utilizando una bomba peristáltica MASTERFLEX Console Analog L/S (Modelo 77521-47), con caudales ajustados para mantener las siguientes presiones: presión de alimentación (P Feed): 30 psi; presión de retentado (P Retentate): 25 psi; y presión de filtrado (P Filtrate): 0 psi. Los medios acondicionados de las células se introdujeron en el depósito y se concentraron a los caudales indicados hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Después de la concentración, se realizó un intercambio de búfer y una filtración de diálisis utilizando una cantidad de PBS equivalente al volumen original del medio. Se añadió PBS al depósito y se recirculó durante 10 min para eliminar las impurezas residuales y las vesículas extracelulares atrapadas en la membrana del filtro. A continuación, la muestra se concentró a un volumen de 10 ml y se repitió el paso de recirculación/diálisis tres veces. La muestra final de 10 ml se sometió a una recirculación adicional de 10 min, seguida de la recogida del depósito. Para garantizar la eliminación completa de los contaminantes residuales, se añadió PBS (10 ml) y la mezcla se recirculó durante 10 min y se recogió. Este paso de recirculación de PBS se repitió tres veces en total. La concentración adicional del volumen final de 30 ml se realizó utilizando un filtro centrífugo Centricon Plus-70 (membrana Ultracel-PL, 100 kDa) con centrifugación a 3000 × g durante 4°C en una centrífuga Allegra X-15R. El concentrado se recuperó mediante centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 min a 4°C. Para maximizar el rendimiento, se añadió 1 ml de PBS al filtro Centricon Plus-70 y la muestra se reconcentró mediante centrifugación a 3000 × g durante 2 min a 4°C, seguida de centrifugación inversa a 1000 × g durante 2 min.

Purificación de proteínas

Para la expresión y purificación de proteínas diana, los plásmidos recombinantes pET-14B-CD133 (humanos y de ratón) se transformaron en células BL21(DE3). Las culturas bacterianas se cultivaron a 37°C y 225 rpm hasta alcanzar una OD600 de 0,6, y luego se indujeron con 0,2 mM de IPTG a 16°C durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación a 8000 × g durante 15 min a 4°C y se resuspendieron en tampón de lisis (300 mM de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, 10 mM de imidazol, pH 8,0, 1 mM de PMSF). Se realizó una homogeneización a alta presión a baja temperatura durante tres ciclos, seguida de una centrifugación a 12 000 × g durante 45 min para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se cargó en una columna de gravedad que contenía 1 ml de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Alemania). Las proteínas unidas se lavaron secuencialmente con 50 ml de tampón de lavado I (20 mM de imidazol, pH 8,0) y 50 ml de tampón de lavado II (40 mM de imidazol, pH 8,0), y luego se eluyeron con 25 ml de tampón de elución (250 mM de imidazol, pH 8,0). El eluido se purificó aún más mediante cromatografía de gel Superdex-150 utilizando un sistema AKTA Pure (GE Healthcare Life Sciences, EE. UU.) en 1× PBS. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80°C. La purificación de nanobodies siguió el mismo protocolo de cromatografía de afinidad Ni-NTA. Los nanobodies purificados se caracterizaron mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-VHH, anti-HA y anti-6×His.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Se recogieron y homogeneizaron tejidos hepáticos de ratón. Los niveles de citocinas y quimiocinas inflamatorias en los homogenados hepáticos se cuantificaron utilizando kits ELISA comerciales según los protocolos de los fabricantes. Se utilizaron los siguientes kits de JONLNBIO: Kit ELISA de Ccl3 de ratón (Cat. JL20414), Ccl5 de ratón (Cat. JL17335), Cxcl1 de ratón (Cat. JL20150), Cxcl5 de ratón (Cat. JL28925), IL-1α de ratón (Cat. JL13044), IL-1β de ratón (Cat. JL18442), IL-6 de ratón (Cat. JL20268), TNF-α de ratón (Cat. JL10484) y Kit ELISA de Csf3 de ratón (Cat. JL10697). Además, los niveles de Cxcl2 de ratón se midieron utilizando el kit ELISA de Abnova (Cat. KA1505). Todos los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante correspondiente, y se midió la absorbancia para determinar la concentración de cada mediador inflamatorio en las muestras de hígado. Las muestras de tejido para el análisis ELISA se prepararon como homogenados utilizando el siguiente procedimiento: los tejidos diana se colocaron sobre hielo y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4) enfriada para eliminar la sangre residual, y luego se pesaron y se reservaron. La homogeneización del tejido se realizó sobre hielo utilizando un tampón de lisis compuesto por 50 mM de Tris, 0,9% de NaCl y 0,1% de SDS a pH 7,3, con un volumen de tampón de lisis añadido proporcional al peso del tejido, normalmente 9 ml por 1 g de fragmentos de tejido, suplementado con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como inhibidor de proteasas. Los homogenados se procesaron aún más mediante la interrupción ultrasónica bajo enfriamiento con hielo para evitar el sobrecalentamiento. Los homogenados preparados se centrifugaron a 5000 × g durante 5 min a 4°C, y los sobrenadantes se recogieron para el ELISA. Antes del análisis, se cuantificaron las concentraciones totales de proteínas de los homogenados de tejido utilizando el ensayo de ácido bicinquinónico (BCA), y las muestras se ajustaron a una concentración de proteína final de 2 mg/ml para la detección del ELISA.

Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Se realizaron experimentos SPR en un instrumento Biacore S200 para caracterizar la cinética de unión de los nanobodies (Nb) con CD133 humano y de ratón. Antes de la inmovilización, el chip sensor S-CM5 (Cytiva) se preacondicionó mediante inyecciones secuenciales de 10 mM de glicina-HCl (pH 1,5) y tampón de lavado para estabilizar la superficie. Las proteínas CD133 humanas y de ratón se inmovilizaron en celdas de flujo separadas del chip mediante la química estándar de acoplamiento de aminas. Brevemente, la superficie del chip se activó mediante la inyección de una mezcla recién preparada de 0,05 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 0,2 M de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) durante 7 min a una velocidad de flujo de 10 μL/min. Las proteínas CD133, diluidas a 30 μg/mL en un tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 5,0), se inyectaron sobre la superficie activada hasta que los niveles de inmovilización alcanzaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR). Una celda de flujo de referencia se sometió al mismo procedimiento de activación y bloqueo sin acoplamiento de proteínas para controlar la unión inespecífica y los cambios en el índice de refracción. Todos los ensayos de unión se llevaron a cabo a 25 °C utilizando un tampón de lavado compuesto por 10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0,05% (v/v) de Tween 20, que se filtró y desgasificó antes de su uso. Se inyectaron diluciones seriadas de 2 pliegues de cada nanobody sobre la superficie del sensor a una velocidad de flujo de 30 μL/min durante una fase de asociación de 120 s, seguida de una fase de disociación de 180 s con el flujo del tampón de lavado. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se logró mediante la inyección de 10 mM de glicina-HCl (pH 2,0) durante 120 s, lo que aseguró la disociación completa de los Nb unidos, al tiempo que se preservó la integridad del CD133 inmovilizado. Los sensorgramas se doblemente referenciaron mediante la sustracción de las señales de la celda de referencia y las inyecciones de tampón en blanco para corregir la unión inespecífica y la desviación instrumental. Los parámetros cinéticos de unión, incluido el coeficiente de velocidad de asociación, el coeficiente de velocidad de disociación y el coeficiente de disociación de equilibrio, se obtuvieron ajustando los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore S200. La calidad del ajuste se evaluó en función de los residuos y los valores de chi-cuadrado.

Ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa

La actividad citotóxica se evaluó utilizando un ensayo basado en luciferasa. Las líneas celulares tumorales Panc02, Colon26 y H22, que expresan de forma estable la luciferasa, se utilizaron como células diana. Las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos y se co-incubaron con células CAR-iNK que portaban diferentes constructos CAR a las proporciones efector-diana (E/T) indicadas. Después de 2 h de incubación a 37 °C, la lisis celular se cuantificó midiendo la actividad residual de la luciferasa utilizando un sistema de ensayo estándar de luciferasa (Promega) según las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se detectó con un lector de microplacas y la citotoxicidad se calculó como el porcentaje de reducción de la luminiscencia en relación con los pocillos de control no tratados.

Para la Figura S1C, las células diana se incubaron con CAR-iNK durante 4 h antes de la medición.

Para la Figura S3D, las células diana se incubaron con CARCD133-iNEV o CARCtrl-iNEV durante 2 h antes de la medición.

Modelo de cáncer ortotópico hepático in vivo

Las células tumorales Hep53.4 que expresan luciferasa (Hep53.4-Luc) se recolectaron al 70-80% de confluencia utilizando 0,05% de tripsina-EDTA, se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a una concentración de 2 × 107 células/200 μL en PBS frío inmediatamente antes de la implantación. Se anestesiaron ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (peso de 18 a 22 g) utilizando isoflurano (inducción al 3-4%, mantenimiento al 1,5-2%). Tras la preparación aséptica del área abdominal, se realizó una pequeña incisión subcostal para exponer el lóbulo hepático lateral izquierdo. Una suspensión que contenía 1 × 106 células Hep53.4-Luc en 10 μL de PBS se mezcló suavemente con 20 μL de Matrigel en una proporción de 1:2 (v/v) inmediatamente antes de la inyección. La mezcla de 30 μL se inyectó cuidadosamente debajo de la cápsula hepática para establecer un tumor hepático ortotópico. La carga tumoral se monitorizó longitudinalmente mediante el sistema IVIS Spectrum (PerkinElmer). En cada punto de tiempo de imagen, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina (3 mg en 100 μL de PBS estéril). Cuatro minutos después de la inyección, se anestesiaron los animales con isoflurano y se adquirieron las imágenes. La cuantificación de las señales se realizó utilizando el software Living Image versión 4.5, definiendo regiones de interés (ROI) sobre el área hepática y calculando el flujo fotónico total (fotones/seg/cm2) como medida de la carga tumoral. Los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. La aleatorización se realizó utilizando números aleatorios generados por ordenador para garantizar una asignación imparcial. Los regímenes de tratamiento se iniciaron según el diseño del estudio, según se detalla en el diagrama de flujo, y los investigadores desconocían la asignación de los grupos para minimizar el sesgo. A lo largo del estudio, se monitorizaron los ratones diariamente para detectar signos de angustia o efectos adversos, y se observaron estrictamente los puntos finales humanitarios.

Modelo de metástasis pulmonar in vivo

Para la generación del modelo de metástasis pulmonar, las células Panc02-Luc se prepararon como se describió anteriormente y se resuspendieron en PBS estéril a 1 × 107 células/mL. Se inmovilizaron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad y se calentaron para dilatar la vena de la cola, y luego se inyectaron con 1 × 106 células Panc02-Luc en 100 μL de PBS a través de la vena de la cola lateral. Se confirmó la administración intravenosa exitosa mediante la ausencia de hinchazón o fugas en el sitio de inyección. Se monitorizaron de cerca los ratones para detectar signos de dificultad respiratoria y estado general de salud durante el estudio. El crecimiento tumoral y la metástasis se cuantificaron mediante BLI tras la inyección intraperitoneal de D-luciferina. Las señales BLI de referencia se utilizaron para aleatorizar los ratones en grupos de tratamiento, de acuerdo con el protocolo del modelo ortotópico.

Modelo subcutáneo in vivo

Las líneas celulares tumorales Hep53.4, Panc02, H22 y Colon26 se cultivaron y recolectaron utilizando 0,05% de tripsina-EDTA al 70-80% de confluencia. Las células se lavaron dos veces con PBS estéril y se resuspendieron a 1 × 107 células/mL. Para la implantación tumoral subcutánea, se inyectaron 1 × 106 células Hep53.4 y Panc02 en el flanco derecho de ratones hembra C57BL/6 sinérgicos, mientras que se inyectaron 1 × 106 células H22 y Colon26 subcutáneamente en el flanco derecho de ratones hembra BALB/c sinérgicos, respectivamente. El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días mediante mediciones con calibre. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (longitud × ancho × ancho)/2. Los ratones se agruparon aleatoriamente cuando el volumen tumoral alcanzó los 150 mm3. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó los 1500 mm3 o cuando se observaron los puntos finales humanitarios predefinidos.

Modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) in vivo

Las muestras clínicas del paciente se obtuvieron con autorización y aprobación del Comité de Ética de la Investigación del Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong (KYLL-2023-413). Se obtuvieron los formularios de consentimiento informado de los pacientes y sus familias. Los tejidos tumorales frescos se transportaron sobre hielo en RPMI-1640 estéril suplementado con un 1% de solución antibiótico-antimicótica. En las 2 h posteriores a la resección, los tumores se picaron en fragmentos de aproximadamente 3 × 3 × 3 mm3 utilizando bisturíes estériles en condiciones asépticas. Los fragmentos se implantaron subcutáneamente en el flanco posterior derecho de ratones huHSC-NCG-M bajo anestesia con isoflurano. Los ratones recibieron analgésicos en el período postoperatorio según los protocolos institucionales. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante mediciones con calibre, calculando el volumen tumoral utilizando la fórmula: (longitud × ancho × ancho)/2. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente los 150 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. Se evaluó la eficacia antitumoral y la supervivencia. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores superaron los 1500 mm3 o si presentaban signos de angustia, siguiendo los puntos finales humanitarios.

Citometría de flujo in vivo

Se administraron CAR-iNEV a los ratones a 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena de la cola. 24 h después de la inyección, los animales se anestesiaron con isoflurano y se perfundieron a través del ventrículo izquierdo con 10 mL de PBS helado para eliminar las vesículas circulantes. Se extirparon los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) y los tumores recolectados, se colocaron en HBSS helado y se procesaron inmediatamente para obtener suspensiones de células individuales. El tejido hepático se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C con una suave agitación, y luego se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm, seguido de la lisis de los glóbulos rojos (tampón ACK, 2-3 min a temperatura ambiente) y se lavó dos veces con tampón FACS (PBS con 2% de FBS y 2 mM de EDTA). El tejido pulmonar se digirió de forma similar utilizando colagenasa D (1,0 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se pasó a través de un tamiz de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y se lavaron en tampón FACS. Los bazo se disociaron suavemente mediante la interrupción mecánica a través de un tamiz celular de 70 μm, se lisaron los glóbulos rojos y luego se lavaron en tampón FACS. Los tejidos renales y cardíacos se picaron y se digirieron en HBSS que contenía colagenasa II (1,0 mg/mL) más DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y se lavaron en tampón FACS. El tejido tumoral se extirpó, se picó y se digirió en HBSS que contenía colagenasa IV (0,5 mg/mL) y DNasa I (50 U/mL) durante 30 min a 37 °C, se filtró, se lisaron los glóbulos rojos y se lavó. Para identificar las células tumorales frente a los fibroblastos asociados al tumor (FAT), se realizó un tinte adicional para los marcadores de linaje (EpCAM para las células tumorales, PDGFRα/αSMA para los fibroblastos). Después de la disociación, se evaluó la viabilidad de las células mediante la exclusión de azul de tripan y se contaron las células viables. Aproximadamente 1 × 106 células viables por muestra se transfirieron a 100 μL de tampón FACS para el tinte. El tinte de superficie se realizó añadiendo marcadores de superficie conjugados con fluorocromo para los subconjuntos celulares (CD45, EpCAM, PDGFRα, αSMA) a diluciones preoptimizadas y se incubó durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.

Para los experimentos de citometría de flujo de captación celular, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y luego se fijaron con 100 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la fijación, las células se lavaron una vez en tampón FACS y luego se permeabilizaron añadiendo 200 μL de tampón de permeabilización (PBS que contiene 0,1% de saponina y 2% de FBS) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Sin un lavado adicional, se realizó el tinte intracelular añadiendo anti-HA conjugado con fluorocromo (1:100) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en el tampón de permeabilización. Las células se lavaron dos veces en tampón FACS y se resuspendieron en 100 μL de tampón FACS. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo con ajustes de voltaje idénticos en todos los órganos y muestras.

Etiquetado de CAR-iNEV con 89Zr-DFO

Para permitir el etiquetado de superficie de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV con 89Zr, se utilizó un enfoque de quelación de dos pasos. Inicialmente, los exosomas se funcionalizaron con el quelante desferrioxamina (DFO). Brevemente, p-NCS-Bn-DFO (Future Chem, Seúl, Corea), disuelto en DMSO a una concentración de 5-20 mg/mL, se añadió a la suspensión de CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV a una relación de peso DFO a proteína exosómica de 1:10. Después de la incubación, los exosomas etiquetados con DFO se purificaron utilizando una columna de desalanización de dextrano (punto de corte molecular (MWCO) de 5000, Pierce, WI, EE. UU.), con 10 mM de PBS como eluyente. Posteriormente, los CARCtrl-iNEV o CARCD133-iNEV modificados con DFO se etiquetaron con 89Zr. El 89Zr4+, suministrado en ácido oxálico 1,0 M, se neutralizó primero a un pH entre 6,8 y 7,5 utilizando 1,0 M de Na2CO3. La solución de 89Zr neutralizada se mezcló con los conjugados de exosomas DFO y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h bajo una suave agitación (550 rpm). Los exosomas etiquetados se purificaron posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna de desalanización de dextrano (MWCO de 50 000) y se utilizó 10 mM de PBS (pH 7,4, sin Ca2+ y Mg2+) como tampón de elución para garantizar la eliminación del radionúclido no unido. La preparación final de exosomas radiomarcados se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Biodistribución ex vivo

Se utilizaron un total de 40 ratones BALB/c machos para el análisis de biodistribución ex vivo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (2%, 1 L/min) e inyectados por vía intravenosa con 89Zr-CARCtrl-iNEV o 89Zr-CARCD133-iNEV a una dosis fija de 1 × 1012 partículas por animal a través de la vena de la cola. En puntos temporales predeterminados (1, 4, 8, 12 y 24 h) después de una única administración, se sacrificaron cuatro ratones por grupo bajo anestesia profunda. Se recolectaron los principales órganos (sangre, colon, estómago, riñones, pulmones, bazo, hígado, corazón y tumor), se enjuagaron con PBS, se secaron y se pesaron. La radiactividad en cada muestra se midió utilizando un sistema de contador gamma (1480 Wizard, PerkinElmer, MA, EE. UU.) con una ventana de energía centrada en el pico de 909 keV de 89Zr. Se preparó en paralelo un estándar que contenía una fracción conocida de la dosis inyectada y se contó en condiciones idénticas para permitir la calibración de la actividad. Todas las mediciones se corrigieron para el fondo y la desintegración física al momento de la inyección. El porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) se calculó como: %ID/g = (actividad del órgano/actividad inyectada) × 100/peso del órgano.

Tratamientos in vivo

Para evaluar la eficacia terapéutica de las células CARCD133-iNK y CARCD133-iNEV, se establecieron modelos de tumor subcutáneo utilizando células H22. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 150 mm3, los ratones portadores de tumores (BALB/c, n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a siete grupos de tratamiento: (1) control con PBS (200 μL), (2) dosis alta de CARCD133-iNK (1 × 107 células por inyección), (3) dosis baja de CARCD133-iNK (1 × 106 células por inyección), (4) dosis alta de CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (5) dosis baja de CARCtrl-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección), (6) dosis alta de CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) y (7) dosis baja de CARCD133-iNEV (1 × 1011 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola en un volumen total de 200 μL cada dos días. Los volúmenes tumorales se midieron cada dos días utilizando calibradores y se calcularon.

Para evaluar la actividad antitumoral de CARCD133-iNEV en múltiples modelos de tumor, se utilizaron modelos subcutáneos con células H22, Panc02 y Colon26. Los ratones portadores de tumores (n = 5 por grupo) se asignaron aleatoriamente a tres grupos y se trataron por vía intravenosa con: (1) PBS control (200 μL), (2) CARCtrl-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Los tratamientos se administraron tres veces por semana, cada inyección se realizó en un volumen de 200 μL. Los tamaños de los tumores se midieron cada dos días como se describió anteriormente.

Para los estudios de inmunoterapia combinada en modelos PDX, los ratones portadores de tumores establecidos (∼150 mm3) se asignaron aleatoriamente de la siguiente manera: en el experimento que se muestra en la Figura 6E, cuatro grupos (n = 5 por grupo) recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). En el experimento que se muestra en la Figura 6F, los ratones portadores de PDX se asignaron aleatoriamente a dos grupos (n = 5 por grupo) y se trataron con PBS (200 μL) o CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) combinado con anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales superaron los 1500 mm3 o después de cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias. La supervivencia se controló hasta por 60 días. De manera similar, los ratones portadores de CDX se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) CARCD133-iNEV combinado con anticuerpos anti-PD-1 (12,5 mg/kg) o anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola una vez por semana durante tres dosis (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 1500 mm3 o al final del experimento (32 días).

Para los modelos de metástasis, los ratones portadores de metástasis pulmonares o peritoneales de Panc02-Luc se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) y se trataron por vía intravenosa con (1) PBS (200 μL), (2) anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg), (3) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) o (4) terapia combinada con CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección) más anticuerpos anti-CD47 (10 mg/kg). Todos los tratamientos se administraron tres veces por semana por inyección en la vena de la cola (200 μL por inyección). La carga tumoral se controló cada cinco días utilizando BLI. Se controló la supervivencia de los ratones y se sacrificaron cuando cumplieron con los criterios de sacrificio por razones humanitarias o por muerte natural. El punto final del experimento se fijó en 40 días después del inicio del tratamiento.

Para evaluar la longevidad de la memoria inmunitaria antitumoral, se realizaron experimentos de reexposición tumoral aproximadamente 120 días después del último tratamiento con CARCD133-iNEV + anticuerpos anti-CD47. Se consideró que este intervalo era adecuado para la eliminación de los agentes terapéuticos residuales y la resolución de las respuestas inmunitarias agudas. Cinco ratones, seleccionados aleatoriamente de los siete ratones previamente curados con terapia combinada (tres del modelo de metástasis pulmonar y dos del modelo de metástasis peritoneal), fueron reexuestos por vía subcutánea con células Panc02-Luc (como se describió anteriormente para el establecimiento de los modelos de metástasis pulmonar y peritoneal). Se utilizaron ratones de la misma edad como controles. Se controló el crecimiento tumoral y la supervivencia para evaluar la persistencia de la inmunidad antitumoral en los supervivientes a largo plazo.

Para investigar los papeles de los macrófagos y los neutrófilos en la progresión tumoral, los ratones portadores de tumores de Colon26 se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos. Como se muestra en la Figura 5H, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 5 por grupo) que recibieron: (1) PBS (200 μL), (2) CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) CARCD133-iNEV más clodronato (200 μg por inyección) o (4) CARCD133-iNEV más anticuerpos anti-Ly6G (0,5 mg por inyección; clon 1A8, Bio X Cell). En la Figura 5I, los ratones portadores de tumores de Colon26 de tipo salvaje (WT) y los ratones con deleción específica de macrófagos de Nos2 (Nos2-KO) (n = 5 por grupo) se trataron con (1) WT + PBS (200 μL), (2) WT + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección), (3) Nos2-KO + PBS (200 μL) o (4) Nos2-KO + CARCD133-iNEV (1 × 1012 partículas por inyección). Todos los tratamientos se administraron por inyección en la vena de la cola tres veces por semana (200 μL por inyección). Los ratones se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron los 1500 mm3 o al cumplir con los criterios de sacrificio por razones humanitarias.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

Para la evaluación histopatológica, se recolectaron los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y colon) de los ratones portadores de tumores después del tratamiento. Los tejidos se enjuagaron brevemente en PBS frío para eliminar los restos de sangre y se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) a 4 °C durante 24 h. Los tejidos fijados se deshidrataron en etanol graduado (70%, 80%, 90%, 95% y 100%), se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor utilizando un micrótomo rotatorio y se montaron en portaobjetos de vidrio con carga positiva. Las secciones se desparafinaron en xileno (2 × 10 min), se rehidrataron en concentraciones descendentes de etanol hasta agua destilada y se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 5 min. Los portaobjetos se enjuagaron en agua corriente durante 10 min, se diferenciaron en alcohol ácido al 1% durante 30 s, se avivaron en agua amoniacal al 0,1% durante 1 min, se contratiñeron con eosina durante 2 min y se deshidrataron en una serie ascendente de etanol. Después de la aclaración en xileno, los portaobjetos se montaron con resina neutra. Las imágenes se capturaron bajo iluminación de campo claro.

Inmunohistoquímica (IHC) para la detección de CAR-iNEV marcada con HA en tejidos de ratón

Para evaluar la biodistribución de CAR-iNEV in vivo, se realizó la tinción IHC en los tejidos de corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tumor recolectados de los ratones tratados. Los tejidos se fijaron en 4% de PFA durante la noche a 4 °C, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinación y rehidratación, la actividad peroxidasa endógena se eliminó con 3% de H2O2 durante 10 min a temperatura ambiente. La recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) a 95 °C durante 20 min. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-HA (Abmart, Cat#M20003; 1:200 dilución) diluido en tampón de bloqueo. Después del lavado con PBS (3 × 5 min), los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 30 min a temperatura ambiente. El desarrollo del color se logró utilizando el sustrato 3,3'-diaminobencidina (DAB), y las secciones se contratiñeron con hematoxilina durante 30 s, se deshidrataron, se aclararon y se montaron con resina neutra.

Tinción IHC para la detección de CD133 en muestras de tumores humanos

Se obtuvieron muestras de carcinoma hepatocelular humano (n = 4), cáncer colorrectal (n = 3) y cáncer de páncreas (n = 3) de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo Hospital Qilu de la Universidad de Shandong. Los tejidos se fijaron en 4% de PFA durante 24 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Después de la desparafinación y rehidratación como se describió anteriormente, la actividad peroxidasa endógena se bloqueó utilizando 3% de H2O2 durante 10 min, y la recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato de sodio de 10 mM (pH 6,0) a 95 °C durante 20 min. La unión inespecífica se bloqueó con 5% de suero de burro normal durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-CD133 (CST, Cat#64326; 1:200 dilución) diluido en PBS que contenía 1% de BSA. Los portaobjetos se lavaron e incubaron con anticuerpo secundario ligado a HRP durante 30 min a temperatura ambiente. La tinción se desarrolló utilizando el sustrato DAB, se contratiñó con hematoxilina, se deshidrató, se aclaró y se montó.

Cuantificación y análisis estadístico

A menos que se especifique lo contrario, los datos se presentan como Media ± Desviación Estándar (DE). Los análisis estadísticos se realizaron de la siguiente manera: se utilizó la prueba t de Student de dos colas no pareada para las comparaciones de dos grupos, mientras que se aplicó ANOVA de una vía para las comparaciones de múltiples grupos, incluidos los pesos tumorales y los parámetros toxicológicos. Se utilizó ANOVA de dos vías para los análisis de series temporales de la viabilidad celular in vitro y las curvas de crecimiento tumoral. El análisis de supervivencia se realizó utilizando la prueba de rango logarítmico. Se consideró que un valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo, y los niveles de significación se indican de la siguiente manera: ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Graphpad Prism v10 (GraphPad Software, http://www.graphpad.com) y SPSS v20 (paquete estadístico para Windows SPSS Inc., https://www.ibm.com/it-it/products/spss-statistics) se utilizaron para la gestión de datos, el análisis estadístico y la generación de gráficos.