HE4 induce la expresión de PD-L1 en las células mieloides a través de la señalización IFN-γR-JAK-STAT3, lo que favorece la evasión inmunitaria tumoral.

El microambiente tumoral (MET), compuesto por células malignas, inmunitarias y estromales, así como por la matriz extracelular, determina de forma crítica la progresión tumoral y la respuesta terapéutica.^[1] Las células inmunitarias, incluidas las células T citotóxicas y las células asesinas naturales, restringen el crecimiento tumoral al eliminar las células malignas, mientras que los tumores evaden la vigilancia inmunitaria al activar los puntos de control inmunitario, siendo el más notable el eje de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1)/ligando de muerte programada 1 (PD-L1).^[2],^[3] Los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs) dirigidos a PD-1/PD-L1 han logrado éxito clínico y ahora son terapias de primera línea para múltiples neoplasias.^[4],^[5] Sin embargo, su eficacia se ve limitada por las bajas tasas de respuesta, la resistencia específica del tipo de tumor y los eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario.^[6],^[7],^[8],^[9],^[10] Aunque la expresión de PD-L1 es un determinante clave de la respuesta terapéutica, los mecanismos que regulan la expresión de PD-L1 dentro del MET aún no se comprenden completamente.

La expresión de PD-L1 se regula a nivel transcripcional y postraduccional en el MET.^[5],^[11],^[12],^[13] A nivel transcripcional, PD-L1 se induce mediante citocinas como el IFN-γ a través de la señalización JAK-STAT3 y PI3K-AKT en células cancerosas y mieloides^[11],^[14],^[15] y por el tipo I de IFN en células supresoras derivadas de la médula ósea.^[16],^[17] La hipoxia también mejora la transcripción de PD-L1 a través de la estabilización de HIF-1α y la unión al promotor.^[18] A nivel postraduccional, la estabilidad de PD-L1 se regula mediante la glicosilación N-unida, lo que limita la degradación por ubiquitina-proteasoma,^[19],^[20],^[21] y mediante la protección mediada por CMTM6 contra la degradación lisosomal,^[22],^[23], con modificaciones adicionales como la fosforilación que modulan aún más la función de PD-L1.^[24],^[25] PD-L1 se expresa ampliamente en el MET, particularmente en las células presentadoras de antígenos mieloides, donde suprime predominantemente la inmunidad de las células T antitumorales; en consecuencia, PD-L1 hospedador/mieloide e intrínseco a las células dendríticas (DC) determinan de forma crítica las respuestas al bloqueo de PD-(L)1.^[26],^[27] Sin embargo, los ligandos extracelulares, los receptores y las vías de señalización específicas de cada tipo de célula que impulsan la inducción de PD-L1 en los compartimentos no tumorales siguen estando poco definidos, lo que limita las estrategias basadas en mecanismos más allá del direccionamiento directo de PD-(L)1.^[26],^[27],^[28],^[29] Dado que la señalización de PD-1/PD-L1 también mantiene la tolerancia inmunitaria periférica, la definición de los reguladores específicos del cáncer de PD-L1 puede permitir intervenciones inmunoterapéuticas más seguras con una reducción de los eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE).

HE4 (proteína epididimaria humana 4) es una glicoproteína secretada que se identificó originalmente en el epidídimo humano^[30] y se cree que contribuye a la homeostasis tisular al regular la actividad de las proteasas y la adhesión celular.^[31],^[32] En entornos patológicos, la expresión de HE4 está desregulada, particularmente en condiciones fibróticas e inflamatorias, lo que implica su participación en la reparación tisular aberrante y la progresión de la fibrosis.^[33],^[34] Es importante destacar que HE4 ha surgido como un biomarcador clave del cáncer, particularmente en el cáncer de ovario, donde los niveles elevados en suero se correlacionan con la progresión tumoral, el mal pronóstico y la resistencia a la quimioterapia.^[30] Más allá de su uso clínico como biomarcador, se ha implicado a HE4 (WFDC2) en la regulación dependiente del contexto de los procesos relacionados con las proteasas, lo que sugiere funciones extracelulares más amplias.^[35] Se ha relacionado la elevación de la expresión de HE4 con el aumento de la proliferación, la migración y la invasión de las células cancerosas en varios tipos de cáncer, como el carcinoma de ovario.^[36] HE4 promueve la evasión inmunitaria al remodelar los perfiles de citocinas y limitar la infiltración de células inmunitarias, fomentando así un MET inmunosupresor.^[36],^[37] Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la inmunosupresión mediada por HE4 han seguido siendo poco claros. Aquí, identificamos HE4 como un regulador clave de la expresión de PD-L1 en el MET. HE4 se une a los receptores de IFN-γ en las células mieloides para activar la señalización JAK-STAT3 e impulsar la transcripción de PD-L1. La neutralización de HE4 murino o humano redujo la expresión de PD-L1 en las células mieloides, mejoró la activación de las células T CD8+ y suprimió el crecimiento tumoral en múltiples modelos, al tiempo que inducía menos irAE que el bloqueo de PD-1. Clínicamente, la elevación de HE4 se asocia con un mal pronóstico, pero predice una mejor respuesta a los inhibidores de PD-1 en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), lo que destaca su doble papel como objetivo terapéutico y biomarcador predictivo.

Resultados

HE4 extracelular promueve la evasión inmunitaria tumoral al suprimir la citotoxicidad mediada por las células T CD8+

Para identificar posibles objetivos de inmunoterapia en el MET, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en tejidos tumorales y paratumorales emparejados de pacientes con adenocarcinoma de pulmón (LUAD) que no habían recibido tratamiento. El análisis de aproximación y proyección de múltiples variedades (UMAP) identificó 23 grupos de células (Figura 1A), lo que reveló una expresión significativamente mayor de WFDC2 (HE4) en las células epiteliales/malignas (EPCAM+KRT8+KRT18+KRT19+) de los tumores que en los tejidos paratumorales (Figuras 1B y 1C). Además, las células epiteliales (grupos 7, 10, 14, 17 y 20) se estratificaron en poblaciones malignas y no malignas mediante el análisis de inferCNV, y WFDC2 se expresó a niveles significativamente más altos en las células epiteliales malignas que en sus contrapartes no malignas (Figuras S1A y S1B). De manera consistente, el análisis de conjuntos de datos de scRNA-seq de CPNM de TISCH2 confirmó la expresión predominante de WFDC2 en las poblaciones malignas (Figura S1C), y el análisis de GEPIA validó niveles más altos de ARNm de WFDC2 en los tumores de LUAD que en los tejidos normales (Figura 1D). Dado que WFDC2 es un biomarcador conocido en el cáncer de ovario,^[30], también se confirmó su expresión elevada en los tumores de ovario (Figura S1D).

Con base en estas observaciones, examinamos la expresión de HE4 en líneas celulares tumorales de ratón (Figura S1E) y generamos líneas celulares de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y ID8 con sobreexpresión o eliminación de HE4 (Figuras S1F y S1G). Mediante el uso de un modelo tumoral subcutáneo de LLC, evaluamos el papel de HE4 en la progresión tumoral in vivo. La eficiencia de la sobreexpresión y la eliminación de HE4 se validó de forma independiente mediante la medición de los niveles de HE4 en suero, como se muestra en la Figura S1H. En comparación con las células de control, la sobreexpresión ectópica de HE4 potenció notablemente el crecimiento tumoral (Figuras 1E y S1I). Por el contrario, la eliminación de HE4 atenuó significativamente el crecimiento tumoral in vivo (Figuras 1F y S1J). En un modelo de cáncer de ovario intraperitoneal de ID8, la sobreexpresión de HE4 redujo significativamente la supervivencia (Figura 1G), mientras que la eliminación de HE4, validada por los niveles de HE4 en el líquido ascítico (Figura S1K), casi eliminó la formación de líquido ascítico (Figura 1H) y los depósitos tumorales peritoneales (Figura S1L).

Dado que HE4 es una glicoproteína secretada por el tumor, hipotetizamos que su actividad protumorogénica está mediada, al menos en parte, por su forma extracelular. Para probar esto, purificamos el mHE4-Fc (HE4 murino recombinante unido a Fc) (Figura 1I) y lo administramos por vía intraperitoneal a ratones con tumores subcutáneos de MC38 (Figura S1M), que expresan bajos niveles de HE4 endógeno (Figura S1E). La administración de mHE4-Fc aceleró significativamente el crecimiento tumoral in vivo (Figuras 1J y S1N). En particular, la administración de la proteína mHE4-Fc también revirtió eficazmente la supresión del crecimiento de los tumores de LLC con eliminación de HE4 (Figuras 1K, S1O y S1P), lo que indica que HE4 extracelular promueve la progresión tumoral in vivo. Aunque se ha implicado a HE4 en la proliferación y la invasión de las células tumorales, mHE4-Fc no logró restaurar el crecimiento tumoral en ratones deficientes en Rag1 que carecen de células T y B maduras (Figuras 1L, S1Q y S1R) y no afectó la proliferación de las células LLC o ID8 in vitro (Figuras 1M y S1S). Estos resultados indican que HE4 extracelular ejerce sus efectos protumorogénicos principalmente a través de mecanismos microambientales dependientes de la inmunidad adaptativa en lugar de la proliferación intrínseca de las células tumorales.

Dado que el IFN-γ y la granzima B son moléculas efectoras clave de las células T CD8+^[38],^[39] y se elevaron en los ratones con tumores con eliminación de HE4 (Figuras S1T y S1U), examinamos si HE4 suprime la inmunidad antitumoral en el MET. El análisis citométrico de flujo reveló un aumento de las frecuencias de células T CD8+ IFN-γ+ en los tumores de ID8 y LLC con eliminación de HE4 (Figuras S2A–S2C), mientras que la sobreexpresión de HE4 redujo las células T CD8+ IFN-γ+ (Figura S2D). De manera consistente, la administración de mHE4-Fc suprimió la función efectora de las células T CD8+, lo que se reflejó en la reducción de las células T CD8+ IFN-γ+ y granzima B+ en los tumores de LLC con eliminación de HE4 (Figuras 1N y S2E). Finalmente, el agotamiento de las células T CD8+ mediante el uso de un anticuerpo anti-CD8α revirtió sustancialmente el efecto supresor tumoral de la eliminación de HE4 (Figuras S2F–S2H) y redujo los niveles de IFN-γ y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el MET (Figuras S2I y S2J), lo que demuestra que HE4 promueve la evasión inmunitaria tumoral principalmente al alterar la función de las células T CD8+.

HE4 extracelular promueve la evasión inmunitaria tumoral a través de PD-L1 mieloide en el MET

PD-L1 es un punto de control inmunitario clave que suprime la función de las células T citotóxicas. Se ha informado que HE4 estabiliza la proteína PD-L1 mediante mecanismos postraduccionales,^[40] el análisis de suspensiones de células únicas derivadas de pacientes con LUAD cultivadas ex vivo reveló una correlación positiva significativa entre los niveles de HE4 extracelular y la expresión de PD-L1 en las células inmunitarias CD45+ (Figura S3A). De manera consistente, el análisis de conjuntos de datos de scRNA-seq públicos (GSA: CRA001160; GEO: GSE155446, GSE146771) mostró correlaciones positivas entre la expresión de WFDC2 en las células tumorales y la expresión de CD274 en los macrófagos en el adenocarcinoma pancreático, el meduloblastoma y el cáncer colorrectal (Figuras S3B–S3D), lo que respalda un vínculo funcional entre HE4 derivado del tumor y la regulación de la PD-L1 inmunitaria. En los modelos de tumor murino de LLC y MC38, el mHE4-Fc recombinante aumentó selectivamente la expresión de PD-L1 en las células inmunitarias CD45+, pero no en las células tumorales CD45- (Figuras S3E–S3G). Además, mHE4 no promovió el crecimiento tumoral en ratones deficientes en Cd274 (Figuras S3H y 1P–1R), lo que indica que la promoción tumoral impulsada por HE4 depende de la PD-L1 inmunitaria.

Más allá de las células tumorales, la expresión de PD-L1 en las poblaciones mieloides regula de forma crítica la progresión tumoral in vivo.^[29],^[41],^[42] Analizamos la expresión de PD-L1 en los diferentes subconjuntos de mieloides en los tumores de LLC, incluidos los macrófagos (Figura S4A), los monocitos (Figura S4B), las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) (Figura S4C) y las células dendríticas (DC) (Figura S4D). La eliminación de HE4 redujo significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos, las DC y las MDSC (Figuras 1O y S4E), mientras que la administración intraperitoneal de mHE4-Fc restauró la expresión de PD-L1 en estas poblaciones (Figuras 1O y S4E). Por el contrario, la expresión de PD-L1 en los monocitos no se vio significativamente afectada por la eliminación de HE4 o el tratamiento con mHE4-Fc (Figuras S4E y S4F).

El análisis citométrico de flujo de los subconjuntos de macrófagos reveló que HE4 reguló preferentemente la expresión de PD-L1 en los macrófagos tipo M0 y M2, con un efecto más débil en los macrófagos tipo M1 (Figuras S4G y S4H). Por el contrario, mHE4-Fc aumentó la proporción de células PD-L1+ principalmente en los macrófagos tipo M0 y M2, mientras que la respuesta en los macrófagos tipo M1 se atenuó (Figura S4I), lo que posiblemente refleja la inducción de PD-L1 casi saturada impulsada por la señalización JAK-STAT1 fuerte en las células M1 polarizadas.

HE4 regula al alza la expresión de PD-L1 a nivel transcripcional a través de la vía IFN-γR-JAK-STAT3

A continuación, examinamos los efectos de HE4 sobre la expresión de PD-L1 in vitro en los diferentes tipos de células mieloides. El HE4 recombinante aumentó de forma robusta la expresión de PD-L1 en los macrófagos (Figura 2A) y las DC (Figura S5A). En los ensayos de polarización, HE4 aumentó significativamente PD-L1 en las células Raw264.7 indiferenciadas y polarizadas hacia M2, mientras que este efecto se atenuó en los macrófagos polarizados hacia M1 (Figura S5B). En particular, el tratamiento con HE4 no afectó la capacidad fagocítica de las células Raw264.7 (Figura S5C), lo que indica un efecto selectivo sobre la regulación de PD-L1.

Aunque se ha informado que HE4 estabiliza la proteína PD-L1 mediante mecanismos postraduccionales al inhibir la degradación mediada por MMP9/13,^[40] el bloqueo de la síntesis de proteínas con cicloheximida abolió por completo la regulación al alza de PD-L1 inducida por HE4 (Figuras 2A y 2B). Además, el HE4 recombinante aumentó significativamente los niveles de ARNm de Cd274 en las células Raw264.7 (Figura 2C), lo que respalda un mecanismo transcripcional subyacente a la inducción de PD-L1 impulsada por HE4.

Múltiples vías de señalización, incluyendo IFN-γ/JAK/STAT, HIF-1α, factor nuclear κB (NF-κB) y MAPK/ERK, han sido implicadas en la regulación transcripcional de PD-L1.^[12] Para definir el mecanismo subyacente a la expresión de PD-L1 inducida por HE4, realizamos un cribado de inhibidores farmacológicos. La regulación al alza de PD-L1 mediada por HE4 se bloqueó selectivamente mediante inhibidores de JAK1/2 y STAT3 (Figura 2D), pero no mediante inhibidores de p38, JNK, NF-κB, HIF-1α, EGFR o STAT1 (Figuras S6A y S6B), lo que indica un papel primario de la transcripción dependiente de JAK-STAT3. De manera consistente, HE4 recombinante se unió directamente a los macrófagos (Figura 2E) y activó la señalización JAK-STAT3 (Figura 2F), lo que sugiere la activación de un receptor de superficie aguas arriba de esta vía.

Dado que los receptores de IFN pueden activar la señalización JAK-STAT3,^[43],^[44], a continuación investigamos su participación. La inhibición de Ifnar1 no afectó a la regulación al alza de Cd274 a nivel de ARNm inducida por HE4 (Figuras S6C–S6E), mientras que la inhibición de Ifngr1 atenuó notablemente la expresión de PD-L1 a nivel de ARNm y proteína inducida por HE4, así como la fosforilación de STAT3 (Figuras 2G–2I). La interacción directa entre HE4 e IFN-γR1/2 se confirmó mediante inmunoprecipitación de proteínas recombinantes (Figuras 2J–2L). El modelado estructural de AlphaFold 3 identificó residuos clave en HE4 maduro que median la unión a IFN-γR1/2 (Figura 2M); la sustitución de alanina de estos residuos abolió la interacción con el receptor (Figura 2N) y redujo significativamente la inducción de PD-L1 tanto a nivel de ARNm como de proteína (Figuras 2O–2Q). En conjunto, estos datos demuestran que HE4 impulsa la transcripción de PD-L1 a través de la activación directa de IFN-γR y la activación del eje de señalización JAK-STAT3.

El análisis integrado de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) de muestras de LUAD reveló una amplia expresión de IFN-γR1 e IFN-γR2 en todos los tipos de células, con enriquecimiento en poblaciones mieloides, particularmente en macrófagos (Figuras S6F y S6G). En estas células, la señalización de IFN-γ-IFN-γR promueve las funciones antimicrobianas, la presentación de antígenos y la producción de citocinas inflamatorias.^[45],^[46] Para comparar los programas transcripcionales inducidos por HE4 e IFN-γ, realizamos secuenciación de ARN en células Raw264.7. HE4 e IFN-γ indujeron conjuntos de genes superpuestos pero distintos (Figuras 3A y 3B), con 74 genes regulados al alza compartidos, incluyendo Cd274 (Figura 3C; Tabla S1). El análisis KEGG mostró convergencia en vías como la interacción citocina-receptor de citocina y la señalización JAK-STAT (Figuras S7A y S7B), mientras que HE4 enriqueció de forma única vías que incluyen la señalización de la interleucina-17 (IL-17) y programas relacionados con los lípidos/aterosclerosis (Figura S7A). Coherente con estas diferencias, IFN-γ desencadenó una fosforilación de STAT3 rápida pero transitoria, mientras que HE4 indujo una activación de STAT3 retardada pero sostenida (Figuras S7C y S7D), lo que indica una cinética de señalización y regulación por retroalimentación distintas.

Además, utilizando AlphaFold 3, identificamos tres sitios idénticos en IFN-γR1/2 que se unen tanto a HE4 como a IFN-γ: Ser51/Lys105 de IFN-γR1 y Tyr47 de IFN-γR2 (Figura 3D). Esta mímica molecular tripartita posiciona a HE4 como un posible antagonista de la vigilancia inmune mediada por IFN-γ. Por lo tanto, realizamos un ensayo de "pull-down" para probar si HE4 e IFN-γ compiten por la unión a IFNγ-R1/2. IFN-γ pudo competir por la unión de HE4 e IFNγ-R1/2, ya que IFN-γ atenuó significativamente la unión de HE4 a IFNγ-R1/2 a concentraciones comparables (Figura 3E). Inesperadamente, HE4 no pudo competir por la unión de IFN-γ e IFN-γR1/2, ya que la cantidad de IFN-γ unida a IFNγ-R1/2 no disminuyó incluso cuando la concentración de HE4 fue 2 veces mayor (Figura S7F), lo que podría deberse a las diferentes afinidades entre HE4 e IFNγ-R1/2 y entre IFN-γ e IFNγ-R1/2. El análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) reveló que la afinidad de unión entre HE4-Fc e IFNGR1-His (KD ≈ 20,8 nM; Figura 3F) fue aproximadamente 10 veces menor que la afinidad entre IFN-γ-Fc e IFNGR1-His (KD ≈ 1,83 nM; Figura 3G). Cabe destacar que la concentración de HE4 en el microambiente tumoral (TME) de ascitis ID8 o tumores LLC fue aproximadamente 14,6 o 16,2 veces mayor que la de IFN-γ, respectivamente (Figuras 3H y 3I). Mecánicamente, una disparidad de concentración tan pronunciada podría compensar la afinidad relativamente débil del receptor de HE4, lo que en última instancia potencia su capacidad de unión competitiva contra IFN-γ. De hecho, un exceso de 15 veces de HE4 atenuó significativamente la unión de IFN-γ a IFNγR1/2 (Figura 3J). En conjunto, nuestros hallazgos respaldan un mecanismo competitivo dependiente de la concentración, por el cual los niveles elevados de HE4 en el TME pueden competir eficazmente con IFN-γ por la unión al receptor, lo que podría modular las vías de señalización mediadas por IFN-γ en el microambiente tumoral.

Dado que la estimulación de células Raw264.7 con HE4 o IFN-γ no produjo programas transcripcionales o enriquecimientos KEGG completamente superpuestos, a continuación analizamos los macrófagos bajo competencia mHE4/mIFN-γ (1:1) mediante secuenciación de ARN. El análisis de componentes principales (PCA) reveló una clara separación de los estados transcripcionales en los diferentes tratamientos (Figura 3K). Como se esperaba, los macrófagos tratados con mHE4-Fc o mIFN-γ solos formaron grupos distintos a lo largo de PC1 y PC2, lo que indica que cada estímulo impulsa una firma de expresión génica única. Cabe destacar que el co-tratamiento con mHE4-Fc e IFN-γ no se agrupó con ninguno de los grupos de estímulo único; en cambio, estas muestras ocuparon una posición intermedia pero claramente discreta en el espacio PCA. En conjunto, estos resultados sugieren que la exposición concurrente a HE4 e IFN-γ induce un estado transcripcional distinto, en lugar de una simple respuesta aditiva o el dominio de cualquiera de los programas impulsados por HE4 o IFN-γ.

Como se esperaba, el perfilamiento transcripcional mostró que IFN-γ indujo de forma robusta los genes diana canónicos de STAT1, incluidos Irf1, Stat1, Cxcl10 y Socs1, lo que es consistente con la fuerte activación del eje IFN-γ-STAT1. Cabe destacar que el co-tratamiento con HE4 atenuó notablemente la inducción de estos transcritos dependientes de STAT1, lo que indica que HE4 suprime la señalización de STAT1 impulsada por IFN-γ a nivel transcripcional (Figuras 3L y S7G). En contraste, los genes asociados a STAT3, como Il10, Vegfa, Ccl2 y Arg2, permanecieron expresados a niveles similares a los de HE4 bajo la co-estimulación con HE4-IFN-γ, lo que sugiere una preservación relativa de un programa sesgado hacia STAT3 (Figuras 3L y S7G). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que HE4 antagoniza preferentemente la activación de STAT1 mediada por IFN-γ, reprogramando así los macrófagos hacia un estado con un potencial inflamatorio y antitumoral reducido. El análisis de enriquecimiento KEGG reveló además que, en relación con IFN-γ solo, la co-estimulación con HE4 e IFN-γ aumentó las vías relacionadas con la fosforilación oxidativa, la enfermedad hepática grasa no alcohólica y la interacción citocina-receptor de citocina, al tiempo que redujo la transducción olfativa (Figura S7H). Además, en comparación con HE4 solo, la co-estimulación con HE4-IFN-γ enriqueció múltiples vías de respuesta antiviral/de detección de patógenos, incluyendo la infección por HSV-1, la infección por el virus de Epstein-Barr (EBV) y COVID-19, así como la señalización de Hippo y varias vías relacionadas con el cáncer (Figura S7H). A continuación, evaluamos los resultados relacionados con la presentación de antígenos en macrófagos en condiciones en las que HE4 puede interferir con la señalización de IFN-γ. El análisis citométrico de flujo mostró que la estimulación con IFN-γ aumentó notablemente la expresión de MHC-II en los macrófagos RAW264.7, mientras que HE4 solo no indujo la regulación al alza de MHC-II. Es importante destacar que el co-tratamiento con HE4 no atenuó notablemente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II inducida por IFN-γ (Figura S7I). Estos datos sugieren que la inmunosupresión mediada por HE4 se ejerce a través de mecanismos más selectivos.

El bloqueo de HE4 con un anticuerpo monoclonal tiene un efecto terapéutico en múltiples tumores de ratón

Dado que HE4 promovió la regulación transcripcional al alza de PD-L1 (Figura 1O), un punto de control inmunitario clave en el TME, exploramos si el bloqueo de HE4 con un anticuerpo monoclonal tenía algún efecto terapéutico sobre la progresión tumoral. Examinamos múltiples anticuerpos monoclonales anti-mHE4 de rata (mAbs) e identificamos un clon, #117 (isotipo IgG2a), que bloqueó significativamente la regulación al alza de PD-L1 inducida por HE4 tanto a nivel de ARNm (Figura S8A) como de proteína (Figura S8B) en las células Raw264.7. Cabe destacar que el clon #117 no afectó a la proliferación de las células tumorales in vitro (Figuras S8C–S8E). Además, evaluamos la especificidad y la actividad funcional del clon #117. Utilizando AlphaFold 3, predijimos los residuos clave en HE4 que median las interacciones con las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) variables del clon #117. La sustitución de alanina de estos residuos (Glu48, Lys53-Cys55, Asp57-Arg59 y Lys72) abolió la unión del anticuerpo a mHE4, lo que respalda la precisión del modelo estructural y la especificidad de la interacción (Figura S8F). Además, para determinar si el clon #117 reconoce HE4 nativo, correctamente plegado y glicosilado, establecimos un ELISA de sándwich utilizando un anticuerpo anti-HE4 comercial para la captura y el clon #117 para la detección. El medio acondicionado de las células LLC de tipo salvaje produjo una señal robusta, mientras que el medio de las células HE4-knockout fue casi indetectable (Figura S8G). De manera consistente, HE4 se detectó fácilmente en el medio acondicionado de los tumores LLC de tipo salvaje, en comparación con los controles de knockout correspondientes (Figura S8H), lo que confirma que el clon #117 detecta eficazmente HE4 tumoral nativo. La resonancia plasmónica de superficie (SPR) demostró además una unión de alta afinidad del clon #117 a HE4 (KD = 0,0462 nM; Figura S8I), con una unión insignificante a la etiqueta Fc (Figura S8J), lo que respalda aún más la especificidad del anticuerpo. Finalmente, un ELISA competitivo mostró que el clon #117 bloqueó de forma potente la unión de HE4-IFNGR1, con una CI50 de 3,79 nM (Figura S8K). En conjunto, estos datos establecen el clon #117 del anticuerpo monoclonal anti-HE4 como un anticuerpo altamente específico, de alta afinidad y funcionalmente bloqueador, adecuado para detectar y atacar terapéuticamente HE4 tumoral.

A continuación, probamos la eficacia terapéutica del clon #117 en múltiples modelos de tumores murinos, utilizando el clon de anticuerpo monoclonal anti-mHE4 #1 como control, ya que este no logra bloquear la sobreexpresión de PD-L1 inducida por HE4 (Figuras S8A y S8B). Descubrimos que el clon #117 inhibió significativamente el crecimiento de tumores LLC subcutáneos en ratones hembra, mientras que el clon #1 no tuvo ningún efecto terapéutico (Figuras 4A–4C). Para descartar el sexo como factor, repetimos este experimento en ratones macho y observamos el mismo efecto terapéutico del clon #117 (Figuras S9A–S9D). Utilizando un modelo de cáncer de pulmón espontáneo inducido por uretano (Figura 4D), demostramos que el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 atenuó significativamente la tumorigénesis en comparación con el control, como lo demuestra la reducción de la formación de nódulos tumorales pulmonares (Figura 4E). De manera consistente, el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 también tuvo un efecto terapéutico significativo en el modelo peritoneal ID8, que se manifestó como una disminución significativa del volumen de ascitis (Figuras 4F y 4G). La línea celular HGS-1 representa otro modelo bien establecido de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) que recapitula las características biomecánicas, celulares y moleculares clave del HGSOC humano, incluyendo una fuerte concordancia en los perfiles de expresión de ARNm, las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, la rigidez del tejido y la composición del matrizoma.^[47] Tras la implantación ortotópica de células HGS-1 en el ovario del ratón, se evaluó la eficacia terapéutica del tratamiento con anticuerpos anti-HE4 (Figura 4H). Como se muestra en la Figura 4I, la administración del anticuerpo anti-HE4 redujo significativamente tanto el tamaño del tumor primario como la carga tumoral general en comparación con el grupo de control isotípico. Curiosamente, el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 no tuvo un efecto terapéutico significativo en los tumores MC38 (Figuras S9E y S9F), lo que puede deberse al bajo nivel de expresión de HE4 en las células MC38 (Figura S1E). Curiosamente, aunque las células 4T1 presentaban niveles de expresión de HE4 más altos que las células LLC (Figura S1E), el efecto inhibidor de la neutralización de HE4 en los tumores 4T1 fue más débil que el observado en los tumores LLC, a pesar de seguir siendo estadísticamente significativo (Figuras S9G–S9I). En particular, los niveles de HE4 libre disminuyeron significativamente (Figura 4J), lo que indica que el clon #117 actúa bloqueando las interacciones HE4-receptor, en lugar de acelerar la degradación de HE4 in vivo.

Coherente con los hallazgos in vitro (Figuras S8A y S8B), el bloqueo de HE4 con el clon de anticuerpo monoclonal #117 disminuyó significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos del microambiente tumoral (TME) de LLC subcutáneo (s.c.) (Figura 4K), ID8 intraperitoneal (i.p.) (Figura 4L) y 4T1 in situ (Figura S9J). De manera similar, la administración del clon #117 también disminuyó la expresión de PD-L1 en las células dendríticas (DCs) y las células mieloides supresoras (MDSCs) del TME de los tumores LLC (Figura S9K). Además, en el microambiente de los tumores LLC, la expresión de PD-L1 se redujo en todos los subconjuntos de macrófagos, incluidos los de tipo M1, M2 y no M1/M2, tras la administración del clon #117 (Figura S9K).

A continuación, exploramos si el efecto antitumoral terapéutico del bloqueo de HE4 dependía completamente de la disminución de PD-L1. Utilizando un modelo peritoneal ID8 y un modelo subcutáneo LLC, descubrimos que el bloqueo simultáneo de HE4 y PD-L1 no produjo mejores efectos antitumorales que la terapia con un solo agente, lo que indica que la actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 depende completamente de su regulación de la expresión de PD-L1 (Figuras S9L–S9O). De manera consistente, el efecto antitumoral del clon #117 también se abolió cuando los tumores se inocularon subcutáneamente en ratones deficientes en Cd274, lo que confirma aún más que HE4 regula al alza la expresión de PD-L1 principalmente en las células inmunitarias CD45+, incluidos los macrófagos, pero no en las células cancerosas (Figuras 4M y 4N). En resumen, estos datos indican que HE4 es un regulador crítico de PD-L1 y puede incluso ser un regulador importante en el TME de ciertos tumores.

Estos hallazgos indican que la actividad pro-tumorigénica de HE4 extracelular se media predominantemente a través del eje PD-1/PD-L1 y es independiente a nivel mecanístico de la señalización de CTLA-4. Dado que CTLA-4 y PD-1/PD-L1 representan vías de control inmunitario distintas pero complementarias y que el bloqueo dual de estos ejes ha sido aprobado clínicamente con una eficacia antitumoral mejorada en múltiples tipos de cáncer, a continuación examinamos el beneficio terapéutico de combinar anti-HE4 con anti-CTLA-4 in vivo (Figura S9P). De hecho, la coadministración de anticuerpos anti-mHE4 y anti-mCTLA-4 suprimió de manera más efectiva el crecimiento tumoral de LLC que la monoterapia (Figuras 4O y S9P). Además, en comparación con el tratamiento con un solo agente, el bloqueo de HE4 también se sinergizó con el agente quimioterapéutico paclitaxel, lo que produjo una mayor actividad antitumoral tanto en el modelo LLC (Figuras 4P y S9Q) como en el modelo ID8 (Figuras S9R y S9S). En conjunto, estos resultados respaldan el uso de anti-HE4 como un socio de combinación racional para la inmunoterapia dirigida a CTLA-4 o la quimioterapia, lo que es consistente con la experiencia clínica de que los regímenes de combinación que integran el bloqueo de PD-1/PD-L1 con anti-CTLA-4 o quimioterapia superan a la monoterapia.

Los eventos adversos relacionados con la inmunoterapia (irAEs) representan un desafío importante en el uso clínico de los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs). Para evaluar los posibles riesgos inflamatorios del bloqueo de HE4, seguimos un protocolo descrito previamente.^[48] En particular, el tratamiento con anti-PD1 elevó significativamente los niveles séricos de IFN-γ, IL-6, troponina I cardíaca (cTnI), proteína C reactiva (CRP) y ALT, mientras que el tratamiento con anti-HE4 no alteró significativamente estos parámetros (Figura 4Q). El análisis histológico reveló además una incidencia y gravedad marcadamente menores de la inflamación en el corazón, el hígado, los pulmones y el colon tras el tratamiento con anti-HE4 en comparación con el tratamiento con anti-PD1 (Figuras 4R y 4S). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con anti-HE4 se asocia con un menor riesgo de irAEs, lo que subraya su perfil de seguridad superior como estrategia inmunoterapéutica.

A continuación, examinamos los cambios generales en el microambiente inmunitario tras el bloqueo de HE4 mediante secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq). Mediante el análisis de reducción de dimensionalidad, se identificaron 26 grupos de células en el TME de los tumores LLC (Figura 5A), y las proporciones de varios grupos de células tumorales fueron significativamente menores en el grupo tratado con anticuerpo monoclonal anti-HE4 que en el grupo tratado con control isotípico (Figuras 5B y 5C), lo que fue consistente con el fenotipo de supresión del crecimiento tumoral observado. La expresión de PD-L1 se redujo significativamente en los seis grupos de macrófagos (Figuras 5D y 5E). Además de la reducción de la proporción de subconjuntos de macrófagos PD-L1+, el análisis citométrico de flujo reveló una disminución de la proporción de macrófagos M2/M1 (Figura S9T), aunque los datos de scRNA-seq no mostraron una diferencia significativa en las proporciones de macrófagos M1 y M2 (Figura 5C). Además, los tumores tratados con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 presentaron un mayor porcentaje de células T CD8+ efectoras que los tumores de control, aunque la diferencia no alcanzó significación estadística, posiblemente debido al pequeño tamaño de la muestra (Figura 5F). Coherente con los resultados de scRNA-seq, los porcentajes de células T CD8+ efectoras (CD69+ o IFN-γ+) fueron significativamente mayores en el TME de los tumores LLC o en la ascitis ID8 después del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-HE4 que en el del tratamiento de control, como se muestra en el análisis citométrico de flujo (Figuras 5G y 5H). De manera consistente, el efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-HE4 no se demostró cuando los tumores se inocularon en ratones deficientes en Rag1 (Figuras 5I–5K). Además, el agotamiento de las células T CD8+ con un anticuerpo monoclonal anti-CD8α abolió por completo el efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-HE4, lo que demuestra que el control tumoral mediado por el bloqueo de HE4 depende estrictamente de las células T CD8+ (Figuras 5L–5O). En particular, el agotamiento de macrófagos mediante el anticuerpo monoclonal anti-CSF1R también abolió el efecto antitumoral del bloqueo de HE4, pero exhibió una actividad antitumoral comparable a la del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-HE4 (Figuras 5P–5S). En conjunto, estos datos indican que la neutralización de HE4 atenúa significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos para remodelar el microambiente inmunitario tumoral e inhibir el crecimiento tumoral.

A continuación, examinamos si HE4 tenía algún efecto sobre la expresión de PD-L1 en los macrófagos humanos. La proteína de HE4 humana recombinante aumentó significativamente tanto los niveles de ARNm como los niveles de proteína de PD-L1 en los macrófagos THP-1 diferenciados con PMA (Figuras 6A–6C) y se unió fuertemente a estas células (Figura 6D). Coherente con nuestros datos anteriores (Figuras 2D, S5A y S5B), el tratamiento con inhibidores de JAK y STAT3, pero no con inhibidores de STAT1, atenuó significativamente la sobreexpresión de PD-L1 inducida por hHE4 en las células THP-1 diferenciadas con PMA (Figuras 6E y 6F). Estos datos indican que HE4 desempeña un papel altamente conservado en la regulación de la expresión de PD-L1 en los macrófagos.

Aunque HE4 humano y HE4 murino exhiben una conservación funcional, su homología de secuencia es relativamente baja (aproximadamente 44,3%), y un anticuerpo monoclonal elevado contra HE4 murino (clon #117) no reconoce HE4 humano (Figura S10A). A continuación, examinamos anticuerpos monoclonales anti-HE4 humanos en ratones y descubrimos que un clon de los anticuerpos monoclonales anti-hHE4 (clon #10, IgG2b) inhibió significativamente la expresión de ARNm y proteína de PD-L1 inducida por hHE4 en las células THP-1 inducidas con PMA (Figuras 6G y 6H). Este anticuerpo también redujo en gran medida la unión de la proteína hHE4 a las células THP-1 (Figura 6I). Además, evaluamos la especificidad del clon #10. Utilizando AlphaFold 3, predijimos los residuos clave en HE4 que median las interacciones con las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) del clon #10. La sustitución de alanina de estos residuos (Asp57, Asn58, Lys76, Gln96, Ser101-Cys103 y Gln106) abolió la unión del anticuerpo a hHE4, lo que respalda la especificidad de la interacción (Figura 6J). Para caracterizar aún más las propiedades de este anticuerpo monoclonal anti-hHE4, evaluamos su comportamiento farmacocinético in vivo administrando por vía intravenosa el clon #10 a ratones C57BL/6 como modelo sustituto de un anticuerpo anti-hHE4 totalmente humanizado. Tras una sola dosis intravenosa (10 mg/kg), el perfil de concentración-tiempo en suero mostró una fase de distribución rápida seguida de una fase de eliminación prolongada (Figura 6K). El anticuerpo alcanzó una concentración máxima en suero (Cmax) de 36,15 μg/mL poco después de la administración y exhibió una vida media terminal prolongada (t1/2) de aproximadamente 137 h. El tiempo medio de residencia (MRT) fue de 197,3 h, lo que indica una exposición sistémica sostenida. En conjunto, estos parámetros farmacocinéticos demuestran una retención in vivo prolongada y una eliminación lenta del anticuerpo anti-HE4.

Es importante destacar que, en comparación con el control isotípico, el tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 disminuyó significativamente la expresión de PD-L1 en las células CD45+ y aumentó las concentraciones de IFN-γ y granzima B en suspensiones de células individuales de LUAD humano (Figuras 6L–6O). Por el contrario, en comparación con el control, la proteína hHE4 recombinante inhibió significativamente la producción de IFN-γ (Figura 6P). Dado que el anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 no reacciona de forma cruzada con HE4 murino (Figura S10B), para evaluar aún más la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 en un entorno preclínico, utilizamos modelos de xenoinjerto de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanizadas en ratones C-NKG, que carecen de células T, B y células asesinas naturales (NK) (Figura 6Q). La administración del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 atenuó significativamente la tumorigénesis en la línea de ovario humano OVCAR3 (Figuras 6R y 6S) y en la línea de cáncer de pulmón de células no pequeñas NCI-H358 (Figura 6T), lo que sugiere que el bloqueo de HE4 con anticuerpos monoclonales específicos promete aplicaciones clínicas.

La expresión elevada de HE4 en el TME predice una mejor respuesta a los inhibidores de puntos de control inmunitario.

Además, el análisis de los conjuntos de datos TCGA y GTEx reveló una expresión diferencial del ARNm de HE4 en otros tumores sólidos, más allá del adenocarcinoma pulmonar (LUAD) y el cáncer de ovario. Específicamente, además del LUAD (Figura 1D) y los cánceres de ovario (Figura S1D), la expresión de HE4 también se incrementó significativamente en el carcinoma de células escamosas del cuello uterino y el adenocarcinoma endocervical (CESC), el colangiocarcinoma (CHOL), el adenocarcinoma pancreático (PAAD), el carcinoma endometrial del cuerpo uterino (UCEC) y el carcinosarcoma uterino (UCS), mientras que se redujo en el adenocarcinoma de colon (COAD), el carcinoma de células claras del riñón (KIRC) y el sarcoma (SARC) (Figura 7A). De manera consistente, el análisis inmunohistoquímico confirmó una mayor expresión de la proteína HE4 en el PAAD (Figura S11A), una expresión reducida en el COAD (Figura S11B) y niveles inalterados en el cáncer de vejiga en comparación con los tejidos adyacentes no tumorales correspondientes (Figura S11C). En conjunto, estos datos indican que la expresión de HE4 es alta en ciertos tipos de cáncer humano.

Mediante el uso de Western blot y tinción inmunohistoquímica, observamos niveles significativamente más altos de la proteína HE4 en las muestras de LUAD que en los tejidos paracancerosos correspondientes (Figuras 7B–7D), lo que coincide con hallazgos anteriores (Figura 1D). Habiendo establecido que HE4 regula la expresión de PD-L1 en las células mieloides del microambiente tumoral (TME), a continuación, examinamos su potencial como biomarcador para predecir la eficacia terapéutica de la inmunoterapia anti-PD-1. Recopilamos una cohorte de muestras de cáncer de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 más quimioterapia e informamos que la expresión de HE4 fue significativamente mayor en las muestras de pacientes que respondieron a la inmunoterapia anti-PD-1 que en las de pacientes que no respondieron al tratamiento anti-PD-1 (Figura 7E). En particular, HE4 superó a la expresión de PD-L1 como biomarcador predictivo de la inmunoterapia, como lo demuestra su mayor AUC (0,7309 frente a 0,6133; Figura 7F). El análisis de otras cohortes de CPNM que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 más (o no) quimioterapia arrojó resultados similares (Figura 7G). De manera consistente, los análisis de bases de datos mostraron además que una mayor expresión de HE4 se asoció con una mayor tasa de respuesta a la inmunoterapia anti-PD-1, lo que indica que HE4 puede ser un biomarcador adecuado para predecir la eficacia de la inmunoterapia anti-PD-1 (Figura 7H). En conjunto, estos datos indican que HE4 se expresa en gran medida en ciertos tipos de cáncer humano y puede servir como biomarcador predictivo para la inmunoterapia anti-PD-1 actual.

HE4 extracelular promueve la evasión inmune tumoral al suprimir la citotoxicidad mediada por células T CD8+

Para identificar posibles dianas de inmunoterapia en el TME, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en pares de tejidos tumorales y paratumorales de pacientes con adenocarcinoma pulmonar (LUAD) que no habían recibido tratamiento. El análisis de aproximación y proyección uniforme del espacio múltiple (UMAP) identificó 23 grupos de células (Figura 1A), lo que reveló una expresión significativamente mayor de WFDC2 (HE4) en las células epiteliales/malignas (EPCAM+KRT8+KRT18+KRT19+) de los tumores que en los tejidos paratumorales (Figuras 1B y 1C). Además, las células epiteliales (grupos 7, 10, 14, 17 y 20) se estratificaron en poblaciones malignas y no malignas mediante el análisis de inferCNV, y WFDC2 se expresó a niveles significativamente más altos en las células epiteliales malignas que en sus contrapartes no malignas (Figuras S1A y S1B). De manera consistente, el análisis de conjuntos de datos de scRNA-seq de CPNM de TISCH2 confirmó la expresión predominante de WFDC2 en las poblaciones malignas (Figura S1C), y el análisis de GEPIA validó niveles más altos de ARNm de WFDC2 en los tumores de LUAD que en los tejidos normales (Figura 1D). Dado que WFDC2 es un biomarcador conocido en el cáncer de ovario,^[30], también se confirmó su mayor expresión en los tumores de ovario (Figura S1D).

Con base en estas observaciones, examinamos la expresión de HE4 en líneas celulares de tumores de ratón (Figura S1E) y generamos células de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) y ID8 con sobreexpresión o eliminación de HE4 (Figuras S1F y S1G). Mediante el uso de un modelo tumoral subcutáneo de LLC, evaluamos el papel de HE4 en la progresión tumoral in vivo. La eficacia de la sobreexpresión y la eliminación de HE4 se validó de forma independiente mediante la medición de los niveles de HE4 en suero, como se muestra en la Figura S1H. En comparación con las células de control, la sobreexpresión ectópica de HE4 potenció notablemente el crecimiento tumoral (Figuras 1E y S1I). Por el contrario, la eliminación de HE4 atenuó significativamente el crecimiento tumoral in vivo (Figuras 1F y S1J). En un modelo de cáncer de ovario intraperitoneal de ID8, la sobreexpresión de HE4 redujo significativamente la supervivencia (Figura 1G), mientras que la eliminación de HE4, validada por los niveles de HE4 en el líquido ascítico (Figura S1K), casi abolió la formación de líquido ascítico (Figura 1H) y los depósitos tumorales peritoneales (Figura S1L).

Dado que HE4 es una glicoproteína secretada por el tumor, hipotetizamos que su actividad protumorogénica está mediada, al menos en parte, por su forma extracelular. Para probar esto, purificamos el mHE4-Fc recombinante etiquetado con Fc (Figura 1I) y lo administramos por vía intraperitoneal a ratones con tumores subcutáneos de MC38 (Figura S1M), que expresan bajos niveles de HE4 endógeno (Figura S1E). La administración de mHE4-Fc aceleró significativamente el crecimiento tumoral in vivo (Figuras 1J y S1N). En particular, la administración de la proteína mHE4-Fc también revirtió eficazmente la supresión del crecimiento de los tumores de LLC con eliminación de HE4 (Figuras 1K, S1O y S1P), lo que indica que HE4 extracelular promueve la progresión tumoral in vivo. Aunque se ha implicado a HE4 en la proliferación y la invasión de las células tumorales, el mHE4-Fc no logró restaurar el crecimiento tumoral en ratones deficientes en Rag1 que carecen de células T y B maduras (Figuras 1L, S1Q y S1R) y no afectó la proliferación de las células LLC o ID8 in vitro (Figuras 1M y S1S). Estos resultados indican que HE4 extracelular ejerce sus efectos protumorogénicos principalmente a través de mecanismos microambientales dependientes de la inmunidad adaptativa en lugar de la proliferación intrínseca directa de las células tumorales.

Dado que el IFN-γ y la granzima B son moléculas efectoras clave de las células T CD8+ [38, 39] y se elevaron en ratones con tumores con eliminación de HE4 (Figuras S1T y S1U), examinamos si HE4 suprime la inmunidad antitumoral en el TME. El análisis citométrico reveló un aumento de las frecuencias de células T CD8+ IFN-γ+ en los tumores de ID8 y LLC con eliminación de HE4 (Figuras S2A–S2C), mientras que la sobreexpresión de HE4 redujo las células T CD8+ IFN-γ+ (Figura S2D). De manera consistente, la administración de mHE4-Fc suprimió la función efectora de las células T CD8+, lo que se reflejó en la reducción de las células T CD8+ IFN-γ+ y granzima B+ en los tumores de LLC con eliminación de HE4 (Figuras 1N y S2E). Finalmente, el agotamiento de las células T CD8+ mediante el uso de un anticuerpo anti-CD8α revirtió sustancialmente el efecto supresor tumoral de la eliminación de HE4 (Figuras S2F–S2H) y redujo los niveles de IFN-γ y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el TME (Figuras S2I y S2J), lo que demuestra que HE4 promueve la evasión inmune tumoral principalmente al alterar la función de las células T CD8+.

HE4 extracelular promueve la evasión inmune tumoral a través de PD-L1 en las células mieloides del TME

PD-L1 es un punto de control inmunitario clave que suprime la función de las células T citotóxicas. Se ha informado que HE4 estabiliza la proteína PD-L1 mediante mecanismos postraduccionales,^[40] el análisis de suspensiones de células individuales derivadas de pacientes con LUAD cultivadas ex vivo reveló una correlación positiva significativa entre los niveles de HE4 extracelular y la expresión de PD-L1 en las células inmunitarias CD45+ (Figura S3A). De manera consistente, el análisis de conjuntos de datos de scRNA-seq públicos (GSA: CRA001160; GEO: GSE155446, GSE146771) mostró correlaciones positivas entre la expresión de WFDC2 en las células tumorales y la expresión de CD274 en los macrófagos en el adenocarcinoma pancreático, el meduloblastoma y el cáncer colorrectal (Figuras S3B–S3D), lo que respalda un vínculo funcional entre HE4 derivado del tumor y la regulación de PD-L1 inmune. En los modelos de tumor de ratón LLC y MC38, el mHE4-Fc recombinante aumentó selectivamente la expresión de PD-L1 en las células inmunitarias CD45+ pero no en las células tumorales CD45− (Figuras S3E–S3G). Además, el mHE4 no promovió el crecimiento tumoral en ratones deficientes en Cd274 (Figuras S3H y 1P–1R), lo que indica que la promoción tumoral impulsada por HE4 depende de PD-L1 inmune.

Además de las células tumorales, la expresión de PD-L1 en las poblaciones mieloides regula críticamente la progresión tumoral in vivo.[29, 41, 42] Analizamos la expresión de PD-L1 en los diferentes subconjuntos de mieloides en los tumores de LLC, incluidos los macrófagos (Figura S4A), los monocitos (Figura S4B), las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) (Figura S4C) y las células dendríticas (DC) (Figura S4D). La eliminación de HE4 redujo significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos, las DC y las MDSC (Figuras 1O y S4E), mientras que la administración intraperitoneal de mHE4-Fc restauró la expresión de PD-L1 en estas poblaciones (Figuras 1O y S4E). Por el contrario, la expresión de PD-L1 en los monocitos no se vio significativamente afectada por la eliminación de HE4 o el tratamiento con mHE4-Fc (Figuras S4E y S4F).

El análisis citométrico de los subconjuntos de macrófagos reveló que HE4 reguló preferentemente la expresión de PD-L1 en los macrófagos tipo M0 y M2, con un efecto más débil en los macrófagos tipo M1 (Figuras S4G y S4H). Por el contrario, el mHE4-Fc aumentó la proporción de células PD-L1+ principalmente en los macrófagos tipo M0 y M2, mientras que la respuesta en los macrófagos tipo M1 se atenuó (Figura S4I), lo que posiblemente refleja una inducción de PD-L1 casi saturada impulsada por una fuerte señalización de IFN-γ-IFNGR-STAT1 en las células M1 polarizadas.

HE4 regula al alza la expresión de PD-L1 a nivel transcripcional a través de la vía IFN-γR-JAK-STAT3

A continuación, examinamos los efectos de HE4 sobre la expresión de PD-L1 in vitro en los diferentes tipos de células mieloides. El HE4 recombinante aumentó de manera notable la expresión de PD-L1 en los macrófagos (Figura 2A) y las DC (Figura S5A). En los ensayos de polarización, HE4 aumentó significativamente PD-L1 en las células Raw264.7 indiferenciadas y polarizadas hacia M2, mientras que este efecto se atenuó en los macrófagos polarizados hacia M1 (Figura S5B). En particular, el tratamiento con HE4 no afectó la capacidad fagocítica de las células Raw264.7 (Figura S5C), lo que indica un efecto selectivo sobre la regulación de PD-L1.

Aunque se ha informado que HE4 estabiliza PD-L1 postraduccionalmente al inhibir la degradación mediada por MMP9/13,^[40] el bloqueo de la síntesis de proteínas con cicloheximida abolió por completo la regulación al alza de PD-L1 inducida por HE4 (Figuras 2A y 2B). Además, el HE4 recombinante aumentó significativamente los niveles de ARNm de Cd274 en las células Raw264.7 (Figura 2C), lo que respalda un mecanismo transcripcional subyacente a la inducción de PD-L1 impulsada por HE4.

Se ha implicado a múltiples vías de señalización, incluido IFN-γ/JAK/STAT, HIF-1α, factor nuclear κB (NF-κB) y MAPK/ERK, en la regulación transcripcional de PD-L1.^[12] Para definir el mecanismo subyacente a la expresión de PD-L1 inducida por HE4, realizamos un cribado de inhibidores farmacológicos. La regulación al alza de PD-L1 mediada por HE4 se bloqueó selectivamente mediante inhibidores de JAK1/2 y STAT3 (Figura 2D) pero no mediante inhibidores de p38, JNK, NF-κB, HIF-1α, EGFR o STAT1 (Figuras S6A y S6B), lo que indica un papel principal de la transcripción dependiente de JAK-STAT3. De manera consistente, el HE4 recombinante se unió directamente a los macrófagos (Figura 2E) y activó la señalización de JAK-STAT3 (Figura 2F), lo que sugiere la participación de un receptor de superficie aguas arriba de esta vía.

Dado que los receptores de IFN pueden activar la señalización de JAK-STAT3,[43, 44] a continuación, investigamos su participación. La eliminación de Ifnar1 no alteró la regulación al alza del ARNm de Cd274 inducida por HE4 (Figuras S6C–S6E), mientras que la eliminación de Ifngr1 atenuó significativamente la expresión de ARNm y proteína de PD-L1, así como la fosforilación de STAT3 (Figuras 2G–2I). La interacción directa entre HE4 y IFN-γR1/2 se confirmó mediante la inmunoprecipitación de proteínas recombinantes (Figuras 2J–2L). El modelado estructural de AlphaFold 3 identificó residuos clave en HE4 maduro que median la unión a IFN-γR1/2 (Figura 2M); la sustitución de alanina de estos residuos abolió la interacción del receptor (Figura 2N) y redujo significativamente la inducción de PD-L1 a nivel de ARNm y proteína (Figuras 2O–2Q). En conjunto, estos datos demuestran que HE4 impulsa la transcripción de PD-L1 mediante la unión directa a IFN-γR y la activación del eje de señalización JAK-STAT3.

El análisis integrado de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) de muestras de CALP reveló una amplia expresión de IFN-γR1 e IFN-γR2 en todos los tipos de células, con un enriquecimiento en poblaciones mieloides, particularmente en macrófagos (Figuras S6F y S6G). En estas células, la señalización de IFN-γ-IFN-γR promueve funciones antimicrobianas, la presentación de antígenos y la producción de citocinas inflamatorias.^[45],^[46] Para comparar los programas transcripcionales inducidos por HE4 e IFN-γ, realizamos secuenciación de ARN en células Raw264.7. Tanto HE4 como IFN-γ indujeron conjuntos de genes superpuestos pero distintos (Figuras 3A y 3B), con 74 genes regulados al alza compartidos, incluido Cd274 (Figura 3C; Tabla S1). El análisis KEGG mostró convergencia en vías como la interacción citocina-receptor de citocina y la señalización JAK-STAT (Figuras S7A y S7B), mientras que HE4 enriqueció de forma única vías que incluyen la señalización de la interleucina-17 (IL-17) y programas relacionados con los lípidos/aterosclerosis (Figura S7A). En consonancia con estas diferencias, IFN-γ desencadenó una fosforilación de STAT3 rápida pero transitoria, mientras que HE4 indujo una activación de STAT3 retardada pero sostenida (Figuras S7C y S7D), lo que indica una cinética de señalización y una regulación por retroalimentación distintas.

Además, utilizando AlphaFold 3, identificamos tres sitios idénticos en IFN-γR1/2 que se unen tanto a HE4 como a IFN-γ: Ser51/Lys105 de IFN-γR1 y Tyr47 de IFN-γR2 (Figura 3D). Esta mimetización molecular tripartita posiciona a HE4 como un posible antagonista de la vigilancia inmune mediada por IFN-γ. Por lo tanto, realizamos un ensayo de "pull-down" para probar si HE4 e IFN-γ compiten por la unión a IFNγ-R1/2. IFN-γ pudo competir por la unión de HE4 e IFNγ-R1/2, ya que IFN-γ atenuó significativamente la unión de HE4 a IFNγ-R1/2 a concentraciones comparables (Figura 3E). Inesperadamente, HE4 no pudo competir por la unión de IFN-γ e IFN-γR1/2, ya que la cantidad de IFN-γ unido a IFNγ-R1/2 no disminuyó, incluso cuando la concentración de HE4 fue 2 veces mayor (Figura S7F), lo que podría deberse a las diferentes afinidades entre HE4 e IFNγ-R1/2 y entre IFN-γ e IFNγ-R1/2. El análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) reveló que la afinidad de unión entre HE4-Fc e IFNGR1-His (KD ≈ 20,8 nM; Figura 3F) fue aproximadamente 10 veces menor que la afinidad entre IFN-γ-Fc e IFNGR1-His (KD ≈ 1,83 nM; Figura 3G). Cabe destacar que la concentración de HE4 en el microambiente tumoral (TME) de ascitis ID8 o tumores LLC fue aproximadamente 14,6 o 16,2 veces mayor que la de IFN-γ, respectivamente (Figuras 3H y 3I). Mecánicamente, una disparidad de concentración tan pronunciada podría compensar la afinidad relativamente débil del receptor de HE4, lo que en última instancia potenciaría su capacidad de unión competitiva contra IFN-γ. De hecho, un exceso de 15 veces de HE4 atenuó significativamente la unión de IFN-γ a IFNγR1/2 (Figura 3J). En conjunto, nuestros hallazgos respaldan un mecanismo competitivo dependiente de la concentración, por el cual los niveles elevados de HE4 en el TME pueden competir eficazmente con IFN-γ por la unión al receptor, lo que podría modular las vías de señalización mediadas por IFN-γ en el microambiente tumoral.

Dado que la estimulación de células Raw264.7 con HE4 frente a IFN-γ no provocó programas transcripcionales o enriquecimientos KEGG completamente superpuestos, a continuación, analizamos los macrófagos bajo competencia mHE4/mIFN-γ (1:1) mediante secuenciación de ARN. El análisis de componentes principales (PCA) reveló una clara separación de los estados transcripcómicos en los diferentes tratamientos (Figura 3K). Como se esperaba, los macrófagos tratados con mHE4-Fc o mIFN-γ solos formaron grupos distintos a lo largo de PC1 y PC2, lo que indica que cada estímulo impulsa una firma de expresión génica única. Cabe destacar que el co-tratamiento con mHE4-Fc e IFN-γ no se agrupó con ninguno de los grupos de estímulo único; en cambio, estas muestras ocuparon una posición intermedia pero claramente discreta en el espacio PCA. En conjunto, estos resultados sugieren que la exposición concurrente a HE4 e IFN-γ induce un estado transcripcional distinto, en lugar de una simple respuesta aditiva o el dominio del programa impulsado por HE4 o IFN-γ.

Como se esperaba, el análisis del perfil transcripcional mostró que IFN-γ indujo de forma robusta los genes diana canónicos de STAT1, incluidos Irf1, Stat1, Cxcl10 y Socs1, lo que es consistente con una fuerte activación del eje IFN-γ-STAT1. Cabe destacar que el co-tratamiento con HE4 atenuó notablemente la inducción de estos transcritos dependientes de STAT1, lo que indica que HE4 suprime la señalización de STAT1 impulsada por IFN-γ a nivel transcripcional (Figuras 3L y S7G). En contraste, los genes asociados a STAT3, como Il10, Vegfa, Ccl2 y Arg2, siguieron expresándose a niveles similares a los de HE4 bajo la co-estimulación con HE4-IFN-γ, lo que sugiere una preservación relativa de un programa sesgado hacia STAT3 (Figuras 3L y S7G). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que HE4 antagoniza preferentemente la activación de STAT1 mediada por IFN-γ, reprogramando así los macrófagos hacia un estado con un potencial inflamatorio y antitumoral reducido. El análisis de enriquecimiento KEGG reveló además que, en relación con IFN-γ solo, la co-estimulación con HE4 e IFN-γ aumentó las vías relacionadas con la fosforilación oxidativa, la enfermedad hepática grasa no alcohólica y la interacción citocina-receptor de citocina, al tiempo que redujo la transducción olfativa (Figura S7H). Además, en comparación con HE4 solo, la co-estimulación con HE4-IFN-γ enriqueció múltiples vías de respuesta antiviral/de detección de patógenos, que incluyen la infección por HSV-1, la infección por el virus de Epstein-Barr (EBV), COVID-19 y la detección de ADN citosólico, mientras que la señalización de Hippo, la enfermedad inflamatoria intestinal y varias vías relacionadas con el cáncer se redujeron (Figura S7H). A continuación, evaluamos los resultados relacionados con la presentación de antígenos en los macrófagos en condiciones en las que HE4 puede interferir con la señalización de IFN-γ. El análisis citométrico de flujo mostró que la estimulación con IFN-γ aumentó notablemente la expresión de MHC-II en los macrófagos RAW264.7, mientras que HE4 solo no indujo la regulación al alza de MHC-II. Es importante destacar que el co-tratamiento con HE4 no atenuó notablemente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II inducida por IFN-γ (Figura S7I). Estos datos sugieren que la inmunosupresión mediada por HE4 se ejerce a través de mecanismos más selectivos.

El bloqueo de HE4 con un anticuerpo monoclonal tiene un efecto terapéutico en múltiples tumores de ratón

Dado que HE4 promovió la regulación al alza transcripcional de PD-L1 (Figura 1O), un punto de control inmunitario clave en el TME, exploramos si el bloqueo de HE4 con un anticuerpo monoclonal tenía algún efecto terapéutico sobre la progresión tumoral. Examinamos múltiples anticuerpos monoclonales anti-mHE4 de rata (mAbs) e identificamos un clon, #117 (isotipo IgG2a), que bloqueó significativamente la regulación al alza de PD-L1 inducida por HE4 tanto a nivel de ARNm (Figura S8A) como a nivel de proteína (Figura S8B) en las células Raw264.7. Cabe destacar que el clon #117 no afectó a la proliferación de las células tumorales in vitro (Figuras S8C-S8E). Además, evaluamos la especificidad y la actividad funcional del clon #117. Utilizando AlphaFold 3, predijimos los residuos clave en HE4 que median las interacciones con las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) variables del clon #117. La sustitución de alanina de estos residuos (Glu48, Lys53-Cys55, Asp57-Arg59 y Lys72) abolió la unión del anticuerpo a mHE4, lo que respalda la precisión del modelo estructural y la especificidad de la interacción (Figura S8F). Además, para determinar si el clon #117 reconoce HE4 nativo, correctamente plegado y glicosilado, establecimos un ELISA de "sándwich" utilizando un anticuerpo anti-HE4 comercial para la captura y el clon #117 para la detección. El medio acondicionado de las células LLC de tipo salvaje produjo una señal robusta, mientras que el medio de las células HE4-knockout fue casi indetectable (Figura S8G). De manera consistente, HE4 se detectó fácilmente en el medio acondicionado de los tumores LLC de tipo salvaje, en comparación con los controles de knockout correspondientes (Figura S8H), lo que confirma que el clon #117 detecta eficazmente HE4 tumoral nativo. La resonancia plasmónica de superficie (SPR) demostró además una unión de alta afinidad del clon #117 a HE4 (KD = 0,0462 nM; Figura S8I), con una unión insignificante a la etiqueta Fc (Figura S8J), lo que respalda aún más la especificidad del anticuerpo. Por último, un ELISA competitivo mostró que el clon #117 bloqueó de forma potente la unión de HE4-IFNGR1, con una CI50 de 3,79 nM (Figura S8K). En conjunto, estos datos establecen el clon #117 del anticuerpo monoclonal anti-HE4 como un anticuerpo altamente específico, de alta afinidad y funcionalmente bloqueador, adecuado para detectar y atacar terapéuticamente HE4 tumoral.

A continuación, probamos la eficacia terapéutica del clon #117 en múltiples modelos de tumores de ratón, utilizando el clon #1 del anticuerpo anti-mHE4 como control, ya que no bloquea la regulación al alza de PD-L1 inducida por HE4 (Figuras S8A y S8B). Descubrimos que el clon #117 inhibió significativamente el crecimiento de tumores LLC subcutáneos en ratones hembra, mientras que el clon #1 no tuvo ningún efecto terapéutico (Figuras 4A-4C). Para excluir el sexo, repetimos este experimento en ratones macho y observamos el mismo efecto terapéutico del clon #117 (Figuras S9A-S9D). Utilizando un modelo de cáncer de pulmón espontáneo inducido por uretano (Figura 4D), demostramos que el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 atenuó significativamente la tumorigénesis en comparación con el control, como lo demuestra la reducción de la formación de nódulos tumorales pulmonares (Figura 4E). De manera consistente, el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 también tuvo un efecto terapéutico significativo en el modelo peritoneal ID8, que se manifestó como una disminución significativa del volumen de ascitis (Figuras 4F y 4G). La línea celular HGS-1 representa otro modelo bien establecido de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) que recapitula las características biomecánicas, celulares y moleculares clave del HGSOC humano, incluida una fuerte concordancia en los perfiles de expresión de ARNm, las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, la rigidez de los tejidos y la composición del matrizoma.^[47] Tras la implantación ortotópica de células HGS-1 en el ovario del ratón, se evaluó la eficacia terapéutica del tratamiento con anticuerpos anti-HE4 (Figura 4H). Como se muestra en la Figura 4I, la administración del anticuerpo anti-HE4 redujo significativamente tanto el tamaño del tumor primario como la carga tumoral general en comparación con el grupo de control de isotipo. Es interesante destacar que el anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117 no tuvo un efecto terapéutico significativo en los tumores MC38 (Figuras S9E y S9F), lo que puede deberse al bajo nivel de expresión de HE4 en las células MC38 (Figura S1E). Es interesante destacar que, aunque las células 4T1 presentaban niveles de expresión de HE4 más altos que las células LLC (Figura S1E), el efecto inhibidor de la neutralización de HE4 en los tumores 4T1 fue más débil que el observado en los tumores LLC, a pesar de seguir siendo estadísticamente significativo (Figuras S9G-S9I). Cabe destacar que los niveles de HE4 libre disminuyeron significativamente (Figura 4J), lo que indica que el clon #117 actúa bloqueando las interacciones HE4-receptor, en lugar de acelerar la degradación de HE4 in vivo.

En consonancia con los hallazgos in vitro (Figuras S8A y S8B), el bloqueo de HE4 con el mAb clon #117 disminuyó significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos en el TME de LLC subcutáneo (s.c.) (Figura 4K), ID8 intraperitoneal (i.p.) (Figura 4L) y 4T1 in situ (Figura S9J). De manera similar, la administración del clon #117 también disminuyó la expresión de PD-L1 en las células dendríticas (DC) y las células mieloides supresoras (MDSC) en el TME de los tumores LLC (Figura S9K). Además, en el microambiente de los tumores LLC, la expresión de PD-L1 se redujo en todos los subconjuntos de macrófagos, incluidos las poblaciones de tipo M1, de tipo M2 y no M1/M2, tras la administración del clon #117 (Figura S9K).

A continuación, exploramos si el efecto antitumoral terapéutico del bloqueo de HE4 dependía completamente de la disminución de PD-L1. Utilizando un modelo peritoneal ID8 y un modelo subcutáneo LLC, descubrimos que el bloqueo simultáneo de HE4 y PD-L1 no produjo mejores efectos antitumorales que la terapia con un solo agente, lo que indica que la actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 depende completamente de su regulación de la expresión de PD-L1 (Figuras S9L-S9O). De manera consistente, el efecto antitumoral del clon #117 también se abolió cuando los tumores se inocularon subcutáneamente en ratones deficientes en Cd274, lo que confirma aún más que HE4 regula la expresión de PD-L1 principalmente en las células inmunitarias CD45+, incluidas los macrófagos, pero no en las células cancerosas (Figuras 4M y 4N). En resumen, estos datos indican que HE4 es un regulador crítico de PD-L1 y puede incluso ser un regulador importante en el TME de ciertos tumores.

Estos hallazgos indican que la actividad pro-tumorigénica de la HE4 extracelular se media predominantemente a través del eje PD-1/PD-L1 y es, a nivel mecanístico, independiente de la señalización de CTLA-4. Dado que CTLA-4 y PD-1/PD-L1 representan vías de control inmunitario distintas pero complementarias, y que el bloqueo dual de estos ejes ha sido aprobado clínicamente con una eficacia antitumoral mejorada en múltiples tipos de cáncer, examinamos a continuación el beneficio terapéutico de combinar anti-HE4 con anti-CTLA-4 in vivo (Figura S9P). De hecho, la coadministración de anticuerpos anti-mHE4 y anti-mCTLA-4 suprimió de manera más efectiva el crecimiento tumoral de LLC que cualquier monoterapia (Figuras 4O y S9P). Además, en comparación con el tratamiento con un solo agente, el bloqueo de HE4 también mostró una sinergia con el agente quimioterapéutico paclitaxel, lo que resultó en una mayor actividad antitumoral tanto en el modelo de LLC (Figuras 4P y S9Q) como en el modelo ID8 (Figuras S9R y S9S). En conjunto, estos resultados respaldan el uso de anti-HE4 como un componente racional en combinación con inmunoterapia dirigida a CTLA-4 o quimioterapia, lo que coincide con la experiencia clínica que indica que los regímenes de combinación que integran el bloqueo de PD-1/PD-L1 con anti-CTLA-4 o quimioterapia superan a la monoterapia.

Las reacciones adversas relacionadas con la inmunoterapia (irAE) representan un desafío importante en el uso clínico de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs). Para evaluar los posibles riesgos inflamatorios del bloqueo de HE4, seguimos un protocolo descrito previamente.^[48] Cabe destacar que el tratamiento con anti-PD1 elevó significativamente los niveles séricos de IFN-γ, IL-6, troponina I cardíaca (cTnI), proteína C reactiva (CRP) y ALT, mientras que el tratamiento con anti-HE4 no alteró significativamente estos parámetros (Figura 4Q). El análisis histológico reveló además una incidencia y gravedad marcadamente menores de la inflamación en el corazón, el hígado, los pulmones y el colon después del tratamiento con anti-HE4 en comparación con el tratamiento con anti-PD1 (Figuras 4R y 4S). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con anti-HE4 se asocia con un riesgo reducido de irAE, lo que subraya su perfil de seguridad superior como estrategia inmunoterapéutica.

El bloqueo de HE4 regula el entorno inmunitario en el microambiente tumoral (TME)

A continuación, examinamos los cambios generales en el microambiente inmunitario después del bloqueo de HE4 mediante secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq). Mediante análisis de reducción de dimensionalidad, se identificaron 26 grupos de células en el TME de los tumores de LLC (Figura 5A), y las proporciones de varios grupos de células tumorales fueron significativamente menores en el grupo tratado con anticuerpo monoclonal anti-HE4 que en el grupo tratado con control isotípico (Figuras 5B y 5C), lo que fue consistente con el fenotipo de supresión del crecimiento tumoral observado. La expresión de PD-L1 se redujo significativamente en los seis grupos de macrófagos (Figuras 5D y 5E). Además de la reducción de la proporción de subconjuntos de macrófagos PD-L1+, el análisis citométrico reveló una disminución de la proporción de macrófagos M2/M1 (Figura S9T), aunque los datos de scRNA-seq no mostraron una diferencia significativa en las proporciones de macrófagos M1 y M2 (Figura 5C). Además, los tumores tratados con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 presentaron un mayor porcentaje de células T CD8+ efectoras que los tumores de control, aunque la diferencia no alcanzó significancia estadística, posiblemente debido al pequeño tamaño de la muestra (Figura 5F). Coherente con los resultados de scRNA-seq, los porcentajes de células T CD8+ efectoras (CD69+ o IFN-γ+) fueron significativamente mayores en el TME de los tumores de LLC o en el ascitis de ID8 después del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 que en el del tratamiento de control, como se muestra en el análisis citométrico (Figuras 5G y 5H). De manera consistente, el efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-HE4 no se demostró cuando los tumores se injertaron en ratones deficientes en Rag1 (Figuras 5I–5K). Además, el agotamiento de las células T CD8+ con un anticuerpo monoclonal anti-CD8α abolió por completo el efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-HE4, lo que demuestra que el control tumoral mediado por el bloqueo de HE4 depende estrictamente de las células T CD8+ (Figuras 5L–5O). Cabe destacar que el agotamiento de macrófagos mediante el anticuerpo monoclonal anti-CSF1R también abolió el efecto antitumoral del bloqueo de HE4, pero exhibió una actividad antitumoral comparable a la del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 (Figuras 5P–5S). En conjunto, estos datos indican que la neutralización de HE4 atenúa significativamente la expresión de PD-L1 en los macrófagos para remodelar el microambiente inmunitario tumoral e inhibir el crecimiento tumoral.

La neutralización de HE4 tiene efectos terapéuticos en los cánceres humanos

A continuación, examinamos si HE4 tenía algún efecto sobre la expresión de PD-L1 en los macrófagos humanos. La proteína de HE4 humana recombinante aumentó significativamente tanto los niveles de ARNm como los niveles de proteína de PD-L1 en los macrófagos THP-1 diferenciados con PMA (Figuras 6A–6C) y se unió fuertemente a estas células (Figura 6D). Coherente con nuestros datos anteriores (Figuras 2D, S5A y S5B), el tratamiento con inhibidores de JAK y STAT3, pero no con inhibidores de STAT1, atenuó significativamente la sobreexpresión de PD-L1 inducida por hHE4 en las células THP-1 diferenciadas con PMA (Figuras 6E y 6F). Estos datos indican que HE4 desempeña un papel altamente conservado en la regulación de la expresión de PD-L1 en los macrófagos.

Aunque la HE4 humana y la HE4 del ratón exhiben una conservación funcional, su homología de secuencia es relativamente baja (aproximadamente 44,3%), y un anticuerpo monoclonal elevado contra la HE4 del ratón (clon #117) no reconoce la HE4 humana (Figura S10A). A continuación, examinamos anticuerpos monoclonales anti-HE4 del ratón y encontramos que un clon de los anticuerpos monoclonales anti-hHE4 (clon #10, IgG2b) inhibió significativamente la expresión de ARNm y proteína de PD-L1 inducida por hHE4 en las células THP-1 inducidas con PMA (Figuras 6G y 6H). Este anticuerpo monoclonal también redujo en gran medida la unión de la proteína hHE4 a las células THP-1 (Figura 6I). Además, evaluamos la especificidad del clon #10. Utilizando AlphaFold 3, predijimos los residuos clave en HE4 que median las interacciones con las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) del clon #10. La sustitución de alanina de estos residuos (Asp57, Asn58, Lys76, Gln96, Ser101-Cys103 y Gln106) abolió la unión del anticuerpo a hHE4, lo que respalda la especificidad de la interacción (Figura 6J). Para caracterizar aún más las propiedades de este anticuerpo monoclonal anti-hHE4, evaluamos su comportamiento farmacocinético in vivo administrando por vía intravenosa el clon #10 a ratones C57BL/6 como modelo sustituto de un anticuerpo anti-hHE4 totalmente humanizado. Tras una sola dosis intravenosa (10 mg/kg), el perfil de concentración-tiempo en suero mostró una fase de distribución rápida seguida de una fase de eliminación prolongada (Figura 6K). El anticuerpo alcanzó una concentración máxima en suero (Cmax) de 36,15 μg/mL poco después de la administración y exhibió una vida media terminal prolongada (t1/2) de aproximadamente 137 h. El tiempo medio de residencia (MRT) fue de 197,3 h, lo que indica una exposición sistémica sostenida. En conjunto, estos parámetros farmacocinéticos demuestran una retención in vivo prolongada y una eliminación lenta del anticuerpo anti-HE4.

Es importante destacar que, en comparación con el control isotípico, el tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 disminuyó significativamente la expresión de PD-L1 en las células CD45+ y aumentó las concentraciones de IFN-γ y granzima B en suspensiones de células individuales de LUAD humano (Figuras 6L–6O). Por el contrario, en comparación con el control, la proteína hHE4 recombinante inhibió significativamente la producción de IFN-γ (Figura 6P). Dado que el anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 no reacciona cruzadamente con la HE4 del ratón (Figura S10B), para evaluar aún más la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 en un entorno preclínico, utilizamos modelos de xenoinjerto de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanizadas en ratones C-NKG, que carecen de células T, B y células asesinas naturales (NK) (Figura 6Q). La administración del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 clon #10 atenuó significativamente la tumorigénesis en la línea de ovario humano OVCAR3 (Figuras 6R y 6S) y en la línea de NSCLC NCI-H358 (Figura 6T), lo que sugiere que el bloqueo de HE4 con anticuerpos monoclonales específicos promete una aplicación clínica.

La alta expresión de HE4 en el TME predijo una mejor respuesta a los inhibidores de los puntos de control inmunitario

Además, el análisis de los conjuntos de datos TCGA y GTEx reveló una expresión diferencial del ARNm de HE4 en otros tumores sólidos además del adenocarcinoma de pulmón y el cáncer de ovario. Específicamente, además del adenocarcinoma de pulmón (Figura 1D) y los cánceres de ovario (Figura S1D), la expresión de HE4 también se reguló al alza significativamente en el carcinoma de células escamosas del cuello uterino y el adenocarcinoma endocervical (CESC), el colangiocarcinoma (CHOL), el adenocarcinoma de páncreas (PAAD), el carcinoma endometrial del cuerpo uterino (UCEC) y el carcinosarcoma uterino (UCS), mientras que se reguló a la baja en el adenocarcinoma de colon (COAD), el carcinoma de células claras del riñón (KIRC) y el sarcoma (SARC) (Figura 7A). De manera consistente, el análisis inmunohistoquímico confirmó una mayor expresión de la proteína HE4 en PAAD (Figura S11A), una expresión reducida en COAD (Figura S11B) y niveles sin cambios en el cáncer de vejiga en relación con los tejidos adyacentes no tumorales correspondientes (Figura S11C). En conjunto, estos datos indican que la expresión de HE4 es alta en ciertos tipos de cáncer humano.

Mediante el uso de Western blot y tinción inmunohistoquímica, observamos niveles significativamente más altos de proteína HE4 en las muestras de adenocarcinoma de pulmón que en los tejidos paracancerosos correspondientes (Figuras 7B–7D), lo que es consistente con los hallazgos anteriores (Figura 1D). Habiendo establecido que HE4 regula la expresión de PD-L1 en los mieloides en el TME, examinamos a continuación su potencial como biomarcador para predecir la eficacia terapéutica de la inmunoterapia anti-PD-1. Recopilamos una cohorte de muestras de cáncer de pacientes con NSCLC que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 más quimioterapia e informamos que la expresión de HE4 fue significativamente mayor en las muestras de pacientes que fueron sensibles a la inmunoterapia anti-PD-1 que en las de pacientes que fueron resistentes al tratamiento con anti-PD-1 (Figura 7E). Cabe destacar que HE4 superó a la expresión de PD-L1 como biomarcador predictivo de la inmunoterapia, como lo demuestra su mayor AUC (0,7309 frente a 0,6133; Figura 7F). El análisis de otras cohortes de NSCLC que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 más (o no) quimioterapia arrojó resultados similares (Figura 7G). De manera consistente, los análisis de bases de datos mostraron además que una mayor expresión de HE4 se asoció con una mayor tasa de respuesta a la inmunoterapia anti-PD-1, lo que indica que HE4 puede ser un biomarcador apropiado para predecir la eficacia de la inmunoterapia anti-PD-1 (Figura 7H). En conjunto, estos datos indican que HE4 se expresa en gran medida en ciertos tipos de cáncer humano y puede servir como un biomarcador predictivo para la inmunoterapia anti-PD-1 actual.

Discusión

Los inhibidores de los puntos de control inmunitario dirigidos al eje PD-1/PD-L1 han mejorado la terapia contra el cáncer, pero siguen siendo limitados por respuestas incompletas y irAE. Aquí, identificamos la HE4 secretada por el tumor como un impulsor de la transcripción de PD-L1 en los mieloides a través de la señalización de IFN-γR-JAK-STAT3. La neutralización de HE4 suprime PD-L1 y provoca una robusta actividad antitumoral en múltiples modelos (Figura 7I), al tiempo que induce sustancialmente menos irAE que el bloqueo de PD-1 (Figuras 4Q–4S). En conjunto, estos hallazgos establecen a HE4 como un mediador clave de la interacción tumor-inmune y un prometedor objetivo de inmunoterapia. Clínicamente, la HE4 elevada puede identificar tumores con una mayor dependencia de la evasión inmune mediada por PD-1/PD-L1, aunque esta asociación también puede reflejar la presión inmune adaptativa y requiere una validación adicional que integre las firmas de células T inflamadas e IFN-γ con PD-L1 de las células inmunitarias.

Los ICIs actuales, en particular los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1, han transformado la terapia contra el cáncer, pero a menudo interrumpen la tolerancia periférica y causan irAE, incluidos dermatitis, colitis, hepatitis y neumonitis, lo que limita su uso clínico más amplio.^[2],^[4],^[49],^[50],^[51],^[52] En contraste, HE4 muestra una expresión mínima en los tejidos normales, pero se regula al alza selectivamente en múltiples malignidades, incluidos los cánceres de ovario, pulmón, estómago y mama.^[30],^[53],^[54],^[55] En consecuencia, el bloqueo de HE4 puede dirigirse preferentemente a los compartimentos inmunitarios asociados al tumor al tiempo que limita la activación inmune sistémica. Coherente con esta noción, la neutralización de HE4 indujo poca inflamación multiórgano en comparación con la terapia anti-PD-1 (Figuras 4Q–4S), lo que respalda un perfil de seguridad potencialmente mejorado que merece una validación adicional en modelos propensos a la autoinmunidad y modelos humanizados.

Rowswell-Turner et al. establecieron por primera vez la relación entre la HE4 extracelular y la sobreexpresión de PD-L1 en células mieloides a través de un mecanismo postraduccional propuesto que implica una reducción de la proteólisis de PD-L1 mediada por MMP.^[40] En contraste, nuestros datos respaldan un modelo distinto en el que la HE4 regula principalmente la PD-L1 a nivel transcripcional, como lo indican la sensibilidad a la cicloheximida y la robusta inducción del ARNm de Cd274. Además, identificamos el IFN-γR (IFNGR1/2) como el receptor funcional para la HE4 extracelular y definimos una vía descendente JAK-STAT3 necesaria para la inducción de PD-L1 en células mieloides. Este mecanismo definido por el receptor permite una estrategia terapéutica: neutralizar la HE4 para bloquear la interacción HE4-IFNGR1, lo que suprime el crecimiento tumoral in vivo y puede ofrecer una ventana terapéutica mejorada en comparación con el bloqueo directo de PD-1/PD-L1. La aparente discrepancia con trabajos anteriores puede reflejar una regulación dependiente del contexto de PD-L1 por la HE4, con mecanismos postraduccionales o transcripcionales predominantes en diferentes entornos biológicos.

En consonancia con informes previos que identifican el IFN-γ como el principal impulsor de la expresión de PD-L1 en tumores y células mieloides,^[14],^[56], nuestros datos muestran que la HE4 puede funcionar como un inductor alternativo e, en algunos contextos, dominante de PD-L1. El bloqueo de la HE4 redujo significativamente la PD-L1 en los macrófagos y restauró la actividad de las células T CD8+ incluso en presencia de IFN-γ, lo que indica un eje regulador no redundante (Figuras 4K-4L, 5G-5H y S9J-S9K). Los análisis bioquímicos y estructurales demuestran además que la HE4 compite con el IFN-γ por la unión al IFN-γR (Figura 3J), lo que sugiere que en los microambientes tumorales (MAT) enriquecidos con HE4, esta puede contribuir sustancialmente a la inducción de PD-L1 dependiente de IFN-γR. En conjunto, estos hallazgos sugieren que, más allá de la señalización IFN-γ-STAT, los factores derivados del tumor, como la HE4, pueden dominar la regulación de PD-L1 y la evasión inmune en MAT específicos.^[14],^[56]

Una cuestión importante se refiere a la contribución relativa de la PD-L1 expresada por las células mieloides frente a las células tumorales. Estudios previos indican que la PD-L1 en los macrófagos, monocitos y células dendríticas (CD) asociadas al tumor, en lugar de en las células tumorales, suprime predominantemente la inmunidad antitumoral en el MAT.^[29],^[57],^[58],^[59],^[60],^[61] En consonancia con esto, nuestros análisis in vivo muestran que la HE4 regula la PD-L1 principalmente dentro del compartimento CD45+: la HE4 aumenta significativamente la PD-L1 en los macrófagos (Figura 1O) y también en las CD y las células mieloides supresoras (CMDS) (Figuras S4E-S4F), al tiempo que ejerce efectos mínimos sobre los monocitos o las células tumorales CD45- (Figuras S3F-S3G). Por lo tanto, la HE4 programa selectivamente los subconjuntos mieloides hacia un estado inmunosupresor con alta expresión de PD-L1 (PD-L1hi), lo que explica el papel dominante de la PD-L1 en las células mieloides en la evasión inmune. En consecuencia, el bloqueo de la HE4 reduce la PD-L1 en las células mieloides y logra una eficacia antitumoral comparable al bloqueo de PD-L1, lo que sugiere un objetivo upstream, enriquecido en el tumor, con el potencial de limitar la toxicidad fuera del tumor. La base de esta selectividad mieloide no está clara y puede reflejar umbrales de señalización de IFN-γR específicos del tipo celular o contextos de correceptores.

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, nuestras evaluaciones de eficacia y seguridad in vivo se basaron principalmente en modelos de ratón sinérgicos y entornos de tratamiento a corto plazo, lo que puede no capturar completamente la complejidad y los efectos inmunitarios crónicos presentes en los cánceres humanos. En segundo lugar, si bien nuestros datos respaldan la PD-L1 en las células mieloides como el principal mediador de la evasión inmune impulsada por la HE4, no se exploraron exhaustivamente las posibles funciones de la HE4 en el MAT independientes de PD-L1 o no inmunitarias. Finalmente, las asociaciones clínicas entre la expresión de HE4 y la respuesta al bloqueo de PD-1 son retrospectivas y requieren una validación prospectiva en cohortes más amplias e independientes.

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, nuestras evaluaciones de eficacia y seguridad in vivo se basaron principalmente en modelos de ratón sinérgicos y entornos de tratamiento a corto plazo, lo que puede no capturar completamente la complejidad y los efectos inmunitarios crónicos presentes en los cánceres humanos. En segundo lugar, si bien nuestros datos respaldan la PD-L1 en las células mieloides como el principal mediador de la evasión inmune impulsada por la HE4, no se exploraron exhaustivamente las posibles funciones de la HE4 en el MAT independientes de PD-L1 o no inmunitarias. Finalmente, las asociaciones clínicas entre la expresión de HE4 y la respuesta al bloqueo de PD-1 son retrospectivas y requieren una validación prospectiva en cohortes más amplias e independientes.

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Las solicitudes de información, recursos y reactivos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Chenhui Wang (wangch@uestc.edu.cn), quien las atenderá.

Disponibilidad de materiales

Los materiales y reactivos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave. Los reactivos generados en nuestro laboratorio en este estudio están disponibles a pedido.

Disponibilidad de datos y código

•El conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de adenocarcinoma de pulmón humano (LUAD) se ha depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GEO: GSE298300. El conjunto de datos de scRNA-seq del tumor de ratón LLC está disponible con el número de acceso GEO: GSE304155. Los datos de secuenciación de ARN masiva generados a partir de células RAW264.7 se han depositado con los números de acceso GEO: GSE298587 y GSE313133. Todos los conjuntos de datos son de acceso público a través de la base de datos NCBI GEO.

•Este artículo no presenta código original.

•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este trabajo está disponible a través del contacto principal a pedido.

Contacto principal

Las solicitudes de información, recursos y reactivos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Chenhui Wang (wangch@uestc.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Los materiales y reactivos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave. Los reactivos generados en nuestro laboratorio en este estudio están disponibles a pedido.

Disponibilidad de datos y código

•El conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de adenocarcinoma de pulmón humano (LUAD) se ha depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GEO: GSE298300. El conjunto de datos de scRNA-seq del tumor de ratón LLC está disponible con el número de acceso GEO: GSE304155. Los datos de secuenciación de ARN masiva generados a partir de células RAW264.7 se han depositado con los números de acceso GEO: GSE298587 y GSE313133. Todos los conjuntos de datos son de acceso público a través de la base de datos NCBI GEO.

•Este artículo no presenta código original.

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Agradecimientos

Agradecemos al profesor Zhou Shengtao (Segundo Hospital Universitario de Sichuan) por su ayuda en el establecimiento de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la 10.13039/501100014219 National Science Fund for Distinguished Young Scholars, China (82225029, a C.W.); The Special Project of Natural Science Foundation of China (82441031, a C.W.); el Key Project of the 10.13039/501100001809 National Natural Science Foundation of China (82430076, a C.W.); el Sichuan Science and Technology Program (2026NSFSC1929, a B.Z.; 2026NSFSC0699, a Y.W.); el General Program of 10.13039/501100001809 National Natural Science Foundation of China (grant no. 82572023, a R.H.); el Youth Fund of the 10.13039/501100001809 National Natural Science Foundation of China (82301987, a B.Z.; 82302628, a Y.D.; 82301989, a R.H.; y 82402704, a Y.L.); el 10.13039/501100012166 National Key Research and Development Program of China (2020YFA0710700, a C.W.); el Postdoctoral Foundation of China (2024M750363, a B.Z.); el Sichuan Postdoctoral Innovation Plan (BX202202, a Y.D.); el Postdoctoral Foundation of Sichuan Provincial People’s Hospital (2022BH018, a L.F.; 2022BH07, a M.Y.); y el Postdoctoral Foundation of Sichuan Province (TB2022086, a R.H.; TB2023092, a L.F.).

Contribuciones de los autores

B.Z. y Y.Z. realizaron los experimentos con la ayuda de P.S., T.P., Y.L., M.Y., R.H., L.F., Z.C., H.W., G.H., Y.D. y X.L. C.C. y S.Z. ayudaron a establecer el modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario. X.X., F.L. y Q.C. ayudaron a obtener las muestras de cáncer humano y evaluaron los cortes de tumor. B.Z. y C.W. diseñaron los experimentos y analizaron los datos; C.W. redactó el manuscrito y supervisó el proyecto con B.Z., Y.W. y X.X.

Declaración de intereses

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

STAR★Métodos

Tabla de recursos clave

Modelo experimental y detalles del estudio

Recolección de muestras humanas

El protocolo para la recolección de muestras humanas de LUAD fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Provincial del Pueblo de Sichuan (número de aprobación: 2022-383), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Se recolectaron prospectivamente muestras frescas de tumor y tejidos adyacentes normales emparejados de pacientes que no habían recibido radioterapia/quimioterapia o terapia neoadyuvante en los 6 meses anteriores. La recolección de muestras se realizó inmediatamente después de la resección quirúrgica sin interferir con los procedimientos quirúrgicos estándar. Se disociaron dos pares de tumores y tejidos adyacentes normales en suspensiones de células individuales para la secuenciación de ARN de una sola célula. Además, se recolectaron retrospectivamente muestras de tumor fijadas en parafina de 44 pacientes con CPNM, incluidos 21 casos de adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y 23 casos de carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC), que fueron clasificados como sensibles al tratamiento con inmunoterapia (n = 27) o resistentes (n = 17). Todos los pacientes recibieron tratamiento combinado con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia basada en platino. Los inhibidores de PD-1 administrados incluyeron camrelizumab (n = 20), pembrolizumab (n = 1), serplulimab (n = 1), tislelizumab (n = 9) y sintilimab (n = 12). La etapa clínica al inicio del tratamiento fue la siguiente: etapa IIa (n = 8), etapa IIb (n = 10), etapa IIIa (n = 22), etapa IIIb (n = 3) y etapa IIIc (n = 1). Para los pacientes postoperatorios (n = 29), la sensibilidad al tratamiento se definió como la ausencia de progresión o recurrencia de la enfermedad durante más de 2 años cuando la inmunoterapia se inició en la etapa clínica II, o durante más de 1 año cuando se inició en la etapa III; la resistencia al tratamiento se definió como la progresión o recurrencia de la enfermedad dentro de los 6 meses posteriores a la cirugía. Para los pacientes preoperatorios (n = 55), la sensibilidad al tratamiento se definió como la obtención de una respuesta parcial o completa, mientras que la resistencia se clasificó como enfermedad estable (EE) o enfermedad progresiva (EP), según los criterios RECIST v1.1.

Además, se proporcionó retrospectivamente un microarreglo de CPNM de pacientes que eran sensibles o resistentes al anticuerpo anti-PD1 más (o no) quimioterapia por el Dr. Qian Chu, del Hospital Tongji. En estas cohortes, se incluyeron un total de 57 pacientes con CPNM, incluidos 43 casos de LUAD y 14 casos de LUSC. Entre estos pacientes, 52 recibieron terapia de combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia basada en platino, 4 recibieron monoterapia con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y 1 paciente recibió terapia de combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 y quimioterapia basada en platino. Las muestras se obtuvieron de pacientes tratados en el entorno preoperatorio. La sensibilidad al tratamiento se definió como la obtención de una respuesta parcial o completa (RP; n = 37), mientras que la resistencia al tratamiento se definió como enfermedad progresiva (EP; n = 20), según los criterios RECIST v1.1.^[62]

Animales

Los ratones Cd274−/− y sus hermanos de camada de tipo salvaje (WT) utilizados en este estudio fueron producidos internamente mediante el cruce de progenitores heterocigotos (de la 5ª a la 9ª generación). Se realizó la genotipificación utilizando tanto conjuntos de cebadores específicos para el tipo salvaje (WT) como específicos para el gen desactivado (KO), diseñados por GemPharmatech. Todos los ratones utilizados en este estudio tenían entre 6 y 8 semanas de edad y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China. Los ratones se mantuvieron a 24 ± 2 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, con acceso libre a alimentos y agua. El alojamiento de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética para la Experimentación con Animales del Hospital del Pueblo Provincial de Sichuan (número de aprobación: 2022-404).

Líneas celulares y cultivo celular

Las células HEK293T, LLC, ID8 y Raw264.7 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células THP-1, 4T1, MC38, OVCAR3 y NCI-H358 se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Los macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) se diferenciaron como se describió previamente.^[63] Las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) se prepararon cultivando células de médula ósea con GM-CSF (20 ng/mL) e IL-4 (10 ng/mL), como se describió previamente.^[64] Todas las células se mantuvieron y se amplificaron en una incubadora de CO2 a 37 °C con 5% de CO2. Las células se pasaron cada 2 días. Las células 293 F se mantuvieron en medio FreeStyle 293 sin suero y se amplificaron en una incubadora con agitación (130 rpm) bajo 5% de CO2 a 37 °C. La autenticación de la línea celular se realizó mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio están libres de contaminación por micoplasma.

Detalles del método

Preparación de proteínas recombinantes murinas y humanas

Los plásmidos que contienen el ADN complementario de la secuencia completa de HE4 murino y humano, pcDNA3.1-mHE4-Flag y pcDNA3.1-hHE4-Flag, se compraron a Youbio BioTech Co. (Changsha, China). Los plásmidos se amplificaron en E. coli DH5α, se purificaron mediante un kit de medio plasmídico libre de endo y se transfectaron en células 293 F mediante el reactivo de transfección FectoPRO, según el protocolo del fabricante. Después de 7 a 10 días de cultivo, las proteínas recombinantes marcadas con Flag, mHE4-Flag o hHE4-Flag, se purificaron por afinidad a partir del sobrenadante mediante agarosa conjugada con anti-Flag (#2058ES08, Yeasen BioTech, Shanghái, China). Para la producción de proteínas marcadas con Fc, los fragmentos de ADN que codifican hHE4 (aa 31-123) o mHE4 (aa 26-174) se amplificaron mediante PCR, se subclonaron e insertaron posteriormente en el vector modificado pINFUSE-hIgG-Fc con una señal peptídica IL-2. Tras la transfección en células 293 F como se describió anteriormente, la proteína HE4 marcada con Fc (HE4-Fc) se purificó por afinidad con resina de proteína G según el protocolo del fabricante (L10029, GenScript BioTech, Naning, China). Además, los fragmentos extracelulares de IFN-γR1 o IFN-γR2 murinos se insertaron en el vector pcDNA3.1+C-His (pcDNA3.1-Ifngr1-His y pcDNA3.1-Ifngr2-His, respectivamente). Los plásmidos se transfectaron posteriormente en células 293 F. Las proteínas His-marcadas IFN-γR1 o IFN-γR2 se purificaron por afinidad con resina Ni-TED según el protocolo del fabricante (L00885, GenScript BioTech, Nankín, China). Los productos eluidos se sometieron a cuatro rondas de intercambio de tampón con PBS frío mediante ultrafiltración y se concentraron a la concentración adecuada. La pureza de las proteínas recombinantes se analizó mediante Western blot o SDS‒PAGE con tinción azul de Coomassie. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Estimulación celular

Para determinar si HE4 desencadena la regulación al alza de PD-L1, las células Raw264.7 o BMDM se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 5 × 105/pocillo. A continuación, las células se trataron con la concentración indicada de proteína recombinante HE4 en Opti-MEM durante 3 h (para Western blot y qPCR en tiempo real) o 12 h (para citometría de flujo e inmunoblot). Para evaluar el efecto de HE4 sobre la expresión de PD-L1 en diferentes subconjuntos de macrófagos, las células Raw264.7 se diferenciaron en macrófagos tipo M1 con 300 ng/mL de LPS más 20 ng/mL de IFN-γ durante 24 h, o se diferenciaron en macrófagos tipo M2 con 50 ng/mL de IL-4 durante 48 h, seguido de la estimulación con proteína recombinante HE4 durante 12 h. Las células mononucleares humanas THP-1 se estimularon con 100 ng/mL de PMA durante 48 h para permitir su diferenciación en macrófagos antes del tratamiento. El pretratamiento con los inhibidores se realizó durante 1 h antes de la estimulación con HE4.

Producción y purificación de anticuerpos anti-HE4

Los anticuerpos monoclonales anti-HE4 murinos y anti-HE4 humanos de rata se generaron en AtaGenix Laboratories Co., Ltd. (Wuhan, China). Brevemente, las ratas (o ratones) se inmunizaron con mHE4-Fc (aa26-174) o hHE4-Fc (aa31-123) cuatro veces. Las suspensiones de células individuales de los esplenocitos inmunizados se fusionaron posteriormente con células de mieloma murino sp2/0 mediante polietilenglicol (p7181, Sigma‒Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los hibridomas se seleccionaron en un medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), seguido de dos rondas de clonación por dilución limitante para establecer líneas celulares monoclonales. El hibridoma monoclonal se mantuvo en un medio RPMI-1640 sin suero durante 5 días, y los sobrenadantes se recogieron y se analizaron mediante ELISA para determinar la especificidad del antígeno (Tabla S2). Los hibridomas específicos para HE4 se mantuvieron en un medio específico sin suero (NC0301, YoCon, Pekín, China) y se amplificaron en una incubadora con agitación para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades. Tras el cultivo masivo durante 7 a 10 días, el medio de cultivo se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. Los anticuerpos se aislaron del sobrenadante mediante resina de proteína G y luego se eluyeron con un tampón de glicina-HCl 0,1 M (pH = 2,7). Los eluidos se ultrafiltraron cuatro veces con PBS 1× frío y se concentraron a la concentración adecuada. Se realizaron SDS‒PAGE y tinción azul de Coomassie para evaluar la pureza de los productos eluidos. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Para evaluar si la administración del anticuerpo monoclonal anti-HE4 causaba eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario, se inyectaron ratones A/J machos de tipo salvaje de 10 semanas con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 (200 μg/ratón, n = 10) por vía intraperitoneal cada tres días durante 21 días. Además, como controles, los ratones recibieron una inyección de un anticuerpo monoclonal isotípico ratón IgG2a (n = 10) o un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 (n = 9). Durante el período de tratamiento, se recogió suero de cada ratón para la cuantificación mediante ELISA de los niveles de IL-6, IFN-γ y las enzimas hepáticas ALT y AST. Se recogieron tejidos, incluidos el corazón, los pulmones, el hígado y el colon, para su evaluación histológica.

Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Los experimentos de resonancia plasmónica de superficie (SPR) se llevaron a cabo utilizando un sistema WeSPR 100 equipado con chips de oro carboxilados (G10031), siguiendo las instrucciones del fabricante (XLement, Shanghái, China), para evaluar cuantitativamente las afinidades de unión de las interacciones antígeno-anticuerpo y receptor-ligando. Brevemente, los chips sensores se activaron utilizando NHS (0,1 M) y EDC (0,4 M) recién preparados en un tampón MES (pH = 6,0) a 37 °C durante 30 min, seguido de un lavado exhaustivo con agua ultrapura y un breve secado. Para los análisis de interacción receptor-ligando, la IFNGR1-His recombinante se diluyó a 30 μg/mL en un tampón MES (pH 4,5) y se inmovilizó en la superficie del chip activado (6 μL por pocillo) mediante incubación durante la noche a 4 °C. Para los análisis de interacción antígeno-anticuerpo, las proteínas recombinantes HE4-Fc o proteínas de control Fc se diluyeron de manera similar y se inmovilizaron. Al día siguiente, se eliminó la solución residual mediante un ligero golpeteo y la superficie del chip se bloqueó con 150 μL de tampón de bloqueo proporcionado con el kit a 37 °C durante 1 h. Después de dos lavados con tampón de dilución, se realizaron los análisis de unión utilizando el módulo de análisis de afinidad según el flujo de trabajo estándar de adquisición y ajuste. La cinética de unión se analizó utilizando el software de análisis WeSPR.

Transducción lentiviral para la desactivación o sobreexpresión de genes

El ADN complementario de la secuencia completa de HE4 murino (NM_026323.2) se insertó en el vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro (pCDH-HE4) o pLVX-CMV-puro (pLVX-HE4) para generar un lentivirus para la sobreexpresión ectópica. Para la producción de lentivirus, el plásmido recombinante pCDH-HE4 o pLVX-HE4 (6 μg), el plásmido de empaquetamiento pAX2 (3 μg) y el plásmido de envoltura VSV-G (3 μg) se preincubaron con polietilenimina (30 μg) en Opti-MEM durante 15 min y luego se añadieron a células HEK293T (80% de densidad en platos de 6 cm). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 48 h después de la transfección, se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm y se suplementaron con 8 μg/mL de polibreno antes de usarse para infectar las células LLC y ID8. Los plásmidos vacíos pCDH-puro o pLVX-puro se utilizaron como controles. Después de 72 h de incubación, las células no infectadas se eliminaron con puromicina (5 μg/mL) durante 7 días. Las poblaciones supervivientes se expandieron para validar la expresión de HE4 mediante qPCR en tiempo real y Western blotting.

Para la desactivación de genes, los ARN guía (gARN) de los genes diana se diseñaron utilizando el servidor en línea CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Los oligonucleótidos de sentido y antisentido se unieron mediante un termociclador, se fosforilaron con quinasa de polinucleótido T4 y se ligaron en un vector pLenti-CRISPRv2-GFP digerido con BsmBI mediante ligasa de ADN T4. La producción de lentivirus se realizó según el protocolo descrito anteriormente. Las partículas virales se enriquecieron mediante ultrafiltración, se suspendieron en medio completo fresco que contenía 8 μg/mL de polibreno y se añadieron a las células diana. Después de una incubación de 24 h, el medio se reemplazó con medio completo fresco y luego se incubó durante 48 h. Las células positivas para GFP se clasificaron individualmente mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en placas de 96 pocillos (es decir, una célula por pocillo). Las poblaciones clonales se expandieron y la eficiencia de desactivación de cada gen se verificó mediante Western blotting.

Modelos tumorales sin génicos murinos

Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices éticas pertinentes y fueron aprobados por el Departamento del Comité de Ética del Hospital Provincial de Sichuan, Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China. Las células cancerosas se recolectaron en la fase de crecimiento logarítmico, se lavaron con PBS 1× preenfriado y se resuspendieron en solución salina a una densidad celular adecuada. Se establecieron modelos de tumores subcutáneos mediante la inoculación de MC38 (1 × 106/150 μL) o LLC (2 × 106/150 μL) en el flanco derecho de ratones C57BL/6. Las células 4T1 (2 × 106/100 μL) se implantaron en las almohadillas de grasa mamaria de ratones BALB/c para establecer un modelo de cáncer de mama ortotópico. Las células HGS-1 (1 × 106 células en 10 μL por ovario) se implantaron bilateralmente de forma ortotópica en los ovarios de ratones C57BL/6 para establecer un modelo de cáncer de ovario. El diámetro mayor (L, mm) y el diámetro menor (W, mm) de los tejidos tumorales se midieron con calibradores Vernier cada dos días, y el volumen tumoral se calculó mediante la siguiente fórmula: (L∗W∗W)/2 (mm3). Al final de los experimentos, los ratones fueron sometidos a una eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado de la siguiente manera: los ratones se colocaron en una cámara de eutanasia designada, y se realizó la eutanasia con CO2 introduciendo gradualmente dióxido de carbono en la cámara durante 10 minutos para garantizar una transición pacífica. Después de la eutanasia con CO2, cada ratón se sometió a una dislocación cervical para confirmar la pérdida irreversible de la conciencia y la muerte, de acuerdo con las directrices veterinarias aceptadas. Los tejidos tumorales se resecaron y se pesaron. El volumen y el peso del tumor sirvieron como las principales métricas de los modelos de tumor subcutáneo y ortotópico. Las células ID8 (2 × 106/200 μL) se inyectaron intraperitonealmente en ratones C57BL/6 para establecer un modelo de metástasis peritoneal del cáncer de ovario. En el punto final del experimento (aproximadamente 40 días), se recolectó y cuantificó el líquido ascítico. El volumen del líquido ascítico sirvió como la principal métrica del modelo de metástasis peritoneal ID8. De acuerdo con las directrices éticas, los ratones fueron sacrificados una vez que el volumen del tumor alcanzó los 2 cm3 o si se produjeron úlceras.

Para evaluar los efectos de la expresión de HE4 en el crecimiento tumoral in vivo, las células LLC e ID8 con eliminación o sobreexpresión de HE4 se inocularon de forma subcutánea e intraperitoneal en ratones C57BL/6, respectivamente. En paralelo, las mismas cantidades de células LLC e ID8 infectadas con lentivirus cargado con un vector vacío se incubaron con ratones de control.

Para simular el papel de los fragmentos extracelulares de HE4 en el crecimiento tumoral, las células MC38 (1 × 106/150 μL) o las células LLC con eliminación de HE4 (2 × 106/150 μL) se inocularon en el flanco derecho de ratones C57BL/6. La proteína recombinante HE4-Fc o la proteína Fc (2,5 mg/kg de peso corporal) se administraron intraperitonealmente cada dos días hasta el punto final del experimento. Cabe destacar que las proteínas HE4-Fc y Fc se administraron un día antes de la incubación de las células tumorales en el modelo LLC o 3 días después de la inoculación en el modelo MC38. El tamaño de los tumores se registró diariamente. En el punto final del experimento, se extirparon los tumores intactos, se pesaron y se digirieron enzimáticamente hasta obtener suspensiones de células individuales para experimentos posteriores.

A los ratones con tumores se les administraron anticuerpos monoclonales contra HE4 (anti-HE4 mAbs) para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 in vivo. La administración de anticuerpos se inició a partir del día 4 después de la inoculación (células ID8 o HGS-1), o cuando el volumen de los tumores subcutáneos (LLC o MC38) u ortotópicos (4T1) alcanzó los 50–100 mm3. Los anti-HE4 mAbs o el control de IgG isotípica (10 mg/kg de peso corporal) se administraron mediante inyección intraperitoneal cada dos días, seis veces en total. En el punto final del experimento, se recolectaron el líquido ascítico o los tejidos tumorales para experimentos posteriores.

Para evaluar los efectos antitumorales coordinados de los anticuerpos anti-HE4 y anti-CTLA-4, a los ratones con tumores LLC se les administró tratamiento una vez que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente los 50–100 mm3. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de anti-mHE4 mAb (10 mg/kg) y anti-CTLA-4 mAb (5 mg/kg), administradas ya sea de forma individual o en combinación.

Se evaluaron los efectos antitumorales sinérgicos de la neutralización de HE4 combinada con la quimioterapia. Específicamente, cuando los tumores LLC subcutáneos alcanzaron volúmenes que oscilaban entre 50 y 100 mm3, se administraron anti-HE4 mAbs (5 mg/kg) por vía intraperitoneal cada dos días, para un total de 6 dosis. Al mismo tiempo, se administró paclitaxel (10 mg/kg) por vía intraperitoneal cada 4 días hasta el punto final del experimento. Para el modelo peritoneal ID8, se administraron anti-HE4 mAbs el día 4 después de la inoculación de células ID8, seis veces en total. La administración de paclitaxel se inició el día 7, tres veces a intervalos semanales. Se utilizaron IgG de tipo coincidente y vehículo como controles para la administración de anti-mHE4 mAbs y paclitaxel, respectivamente. Se controlaron los resultados de supervivencia de cada ratón durante todo el período del estudio, y se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para analizar la eficacia del tratamiento.

Depleción de células T CD8+ y macrófagos in vivo

Para la depleción de células T CD8+ in vivo, se administraron anticuerpos anti-CD8α (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal a partir del día de la inoculación de LLC (día 0) y se administraron cada dos días hasta que se sacrificaron los animales. Se recolectaron los bazo y se disociaron en suspensiones de células individuales, y la frecuencia de células T CD8+ se cuantificó mediante análisis citométrico de flujo (CD3+/CD8α+). Para la depleción de macrófagos in vivo, se administraron anticuerpos anti-CSF1R (20 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal antes de la inoculación de LLC durante una semana, con administración continua cada 3 días durante todo el estudio. Se extirparon los tejidos tumorales, se digirieron enzimáticamente hasta obtener suspensiones de células individuales y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de macrófagos (CD45+/CD11b+/F4/80+).

Modelos de cáncer de pulmón inducidos por uretano

Se indujo cáncer de pulmón primario de células no pequeñas en ratones FVB mediante inyecciones intraperitoneales semanales de uretano (1 mg/g de peso corporal, disuelto en solución salina estéril). Después de seis semanas de tratamiento con uretano, los ratones se sometieron a administración intraperitoneal de anti-HE4 mAbs o control de IgG de tipo coincidente (10 mg/kg de peso corporal, cada dos días) 6 veces. La administración de anticuerpos se realizó nuevamente desde las semanas 12 a 14. En el punto final del experimento (semana 18), los ratones se sometieron a una eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado, y los tejidos pulmonares se extirparon quirúrgicamente. El lóbulo pulmonar más grande se procesó para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), y se cuantificó el número de nódulos tumorales visibles.

Tinción inmunohistoquímica y puntuación

Se evaluó la expresión de HE4 en los tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica. En resumen, las secciones de tumores incluidos en parafina se desparafinaron, se rehidrataron y se sumergieron en solución tampón de citrato-citrato (10 mM, pH = 6,0) a 95 °C durante 30 minutos. Antes de la incubación con el anticuerpo primario, las secciones de tejido se trataron secuencialmente con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS 1× durante 20 minutos y se bloquearon con PBS que contiene 5% de suero de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 hora. Luego, las láminas se incubaron con los anticuerpos indicados a 4 °C durante la noche, seguidas de la incubación con el anticuerpo secundario recombinante polimérico HRP-cabra anti-ratón/conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales positivas de los objetivos se visualizaron con sustratos DAB, y los núcleos se contrateñeron con hematoxilina. En paralelo, se evaluó la especificidad del anticuerpo primario preincubando las muestras con 50 μg de proteína recombinante HE4-Fc a 4 °C durante 1 hora antes de agregarlas a las secciones. Se utilizó un sistema de puntuación semicuantitativo para evaluar el nivel de expresión de HE4, como se describió anteriormente.^[65] En resumen, las imágenes teñidas se puntuaron por intensidad (1: débil; 2, moderada; 3, fuerte) y porcentaje de células positivas (1: 0–25%; 2: 26–50%; 3: 51–75%; 4: 76–100%) mediante un protocolo doble ciego. La puntuación final de la inmunohistoquímica de cada sección se calculó como el producto de la intensidad y el porcentaje.

Western blot

Para el Western blot, las células cultivadas y los tejidos se lisaron en tampón de carga SDS‒PAGE que contiene 100 μM de ditiotreitol (DTT), y los lisados celulares resultantes se sonicaron para reducir la viscosidad. Las proteínas solubles en los sobrenadantes del cultivo se precipitaron con metanol y cloroformo, como se describió anteriormente.^[66] Los pellets resultantes se disolvieron en tampón de carga SDS‒PAGE que contiene DTT. Todas las muestras se hirvieron durante 5 minutos, y cantidades iguales de proteína se separaron electroforéticamente y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con 5% de leche descremada en PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 hora. Después de la incubación con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante la noche, las membranas se lavaron con PBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron mediante un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (BG0001, BioGround, Chongqing, China). Las imágenes se capturaron mediante un sistema de imágenes de quimioluminiscencia (Clinx, Shanghai, China) para un análisis posterior.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real

Después de los tratamientos indicados, las células se lavaron dos veces con PBS helado y se extrajo el ARN total mediante un kit E.Z.N.A. Total RNA Kit I (D6915-04, Omega Biotek, Norcross, Georgia, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Se utilizaron cantidades iguales de ARN para la transcripción inversa en ADNc mediante la transcriptasa inversa Hiscript III (R302-01, Vazyme, Naning, China). El ADNc resultante se sometió a PCR en tiempo real utilizando la mezcla maestra SYBR Green qPCR (Q311, Vazyme). El β-actina de ratón y el GAPDH humano se utilizaron como controles internos, y los niveles de expresión relativa de los genes se calcularon mediante el método 2−ΔΔCT.^[67]

Ensayo de unión proteína-célula

Las células RAW264.7 y las células THP-1 diferenciadas con PMA (1 × 105) se incubaron con 5 μg de proteína HE4-Flag o HE4-Fc a 37 °C durante 2 horas, y cantidades iguales de péptidos 3 × Flag o Fc sirvieron como controles negativos. Luego, las células se fijaron con 2% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguidas de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor-488 anti-Flag o PE-conjugados anti-Fc durante 30 minutos sobre hielo. Las células teñidas se lavaron una vez con tampón FACS (5% de BSA en PBS) y luego se sometieron a análisis de citometría de flujo.

Ensayo de unión proteína-proteína in vitro

Para investigar si HE4 interactúa directamente con IFN-γR1 e IFN-γR2, se diluyeron 2 μg de proteínas recombinantes HE4-Flag, IFN-γR1-His o IFN-γR2-His en tampón de unión (20 mM de fosfato, pH 7,4; 200 mM de NaCl; 2 mM de EDTA; 5% de glicerol; 0,2% de NP-40 y cóctel de inhibidores de proteasas) y se incubaron a 4 °C durante 4 horas, seguidas de una incubación adicional con 30 μL de Ni-TED o agarosa conjugada con anti-Flag durante 2 horas. Las cuentas se lavaron tres veces con tampón de alta sal y luego se resuspendieron en tampón de carga SDS‒PAGE para análisis de inmunoblotting.

Para determinar si HE4 compite con IFN-γ por la unión a IFN-γR1 e IFN-γR2, se incubaron 2 μg de IFN-γR1-His y IFN-γR2-His purificados con 30 μL de resina Ni-TED a 4 °C durante 2 horas. La mezcla resultante se lavó tres veces con tampón de alta sal y luego se incubó con las cantidades indicadas de proteínas recombinantes HE4-Flag e IFN-γ durante 2 horas adicionales. Después de tres lavados, la resina resultante se resuspendió en tampón de carga SDS‒PAGE para análisis de inmunoblotting.

Para determinar la concentración inhibitoria media (IC50) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117, realizamos un ELISA competitivo para evaluar su capacidad para bloquear la interacción entre mHE4-Fc y el receptor IFNGR1. Brevemente, la proteína recombinante mIFNGR1-His (0,2 μg en 100 μL por pocillo) se recubrió en placas de 96 pocillos de alta unión e incubó durante la noche a 4 °C. mHE4-Fc (0,3 μg en 100 μL por pocillo) se preincubó con concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 #117 a 4 °C durante 1 h antes de agregarlo a las placas, que se habían bloqueado con 5 % de ASB. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 h, se añadió un anticuerpo anti-Fc conjugado con HRP e incubó durante 1 h adicional. Luego, las placas se lavaron cuatro veces con PBST, seguido de la adición del sustrato TMB. La reacción se detuvo con la solución de parada y se midió la absorbancia en consecuencia.

Citometría de flujo

Se analizaron las abundancias de células T, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y células que expresan PD-L1 dentro del microambiente tumoral mediante citometría de flujo. Para tumores subcutáneos u ortotópicos, los tejidos tumorales se disociaron mecánicamente y se digirieron en un tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 min. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales y luego se lavaron con PBS frío. Para el modelo peritoneal ID8, el ascitis se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y los sedimentos se lavaron con PBS frío y luego se incubaron con un tampón de lisis de glóbulos rojos sobre hielo durante 5 min. Las células se lavaron con PBS frío dos veces y se resuspendieron en un tampón FACS para experimentos posteriores. Las células vivas y muertas se distinguieron mediante un kit de viabilidad fijable Zombie Violet según el protocolo del fabricante. Las células se preincubaron con TruStain FcX a 4 °C durante 15 min para bloquear los receptores Fc, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo a 4 °C durante 30 min. Luego, las células se fijaron con 2 % de paraformaldehído (PFA) a temperatura ambiente durante 15 min y se resuspendieron en un tampón FACS para el análisis. Para la tinción intracelular, las células se incubaron con un cóctel de estimulación celular (1:1000) durante 3 h a 37 °C, seguido de bloqueo con TruStain FcX y tinción superficial. Luego, las células fijadas con PFA se permeabilizaron con un tampón de tinción de Foxp3/factor de transcripción (#00-5523-00, eBioscience) y se incubaron con los anticuerpos apropiados sobre hielo durante 30 min, seguido de análisis por citometría de flujo.

Para evaluar si HE4 aumenta la expresión de PD-L1, las células RAW264.7 o THP-1 diferenciadas con PMA se trataron con proteína recombinante HE4 según lo indicado. Luego, las células se recogieron y lavaron con 1 × PBS frío, seguido de la tinción para distinguir las células vivas/muertas. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con fluorocromo sobre hielo durante 30 min y se fijaron con 2 % de PFA para citometría de flujo. Los datos se adquirieron mediante un sistema de citometría de flujo NovoCyte Quanteon (Agilent) y se analizaron con el software FlowJo V10 (BD Biosciences).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Se recogieron tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes emparejados de dos pacientes con LUAD inmediatamente después de la resección quirúrgica. Los tejidos se enjuagaron con PBS frío tres veces para eliminar los coágulos de sangre y luego se picaron sobre hielo. El bloque de tejido se incubó con una solución de digestión compuesta por 0,25 % de tripsina y 10 μg/mL de DNasa I a 37 °C con agitación a 50 rpm durante 30 min. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y luego a través de un tamiz de 40 μm nuevamente, y el filtrado se recogió en un nuevo tubo de centrífuga. El sedimento celular se resuspendió en 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 min. Luego, se agregaron 10 mL de PBS preenfriado y la mezcla se centrifugó a 250 × g durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en PBS que contenía 0,5 % de FBS. Las células se tiñeron con 0,4 % de AO/PI para evaluar la viabilidad celular. La captura de células individuales de 10 × Genomics, la construcción de bibliotecas de Illumina, el preprocesamiento de datos de secuenciación de ARN de una sola célula, la integración, la reducción de dimensionalidad y la agrupación se realizaron por Capital Biotech (Pekín, China). En resumen, el software CellRanger se utilizó para alinear y anotar las lecturas de secuenciación con el ensamblaje del genoma de referencia humano GRCh38.p13, con anotaciones de genes derivadas de GENCODE v34, para generar matrices de recuento de genes-células. Después de la alineación, la información del código de barras, incluida la identificación de células y los identificadores moleculares únicos (UMI), se procesó y analizó en R (versión 3.6.0) utilizando el paquete R Seurat (versión 4.0.0).^[68] Las células cuyo número de genes era menor de 200, o cuyo número de genes se encontraba en el 1 % superior, o cuya proporción de genes mitocondriales era superior al 25 %, se consideraron anormales y se eliminaron. Después del filtrado, se retuvieron las células de alta calidad para un análisis posterior. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad y se realizó la visualización de datos utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) y la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP).

Los grupos se anotaron para diferentes tipos de células en función de la expresión de marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/)^[69] y la expresión diferencial de genes (DEG), como se describió anteriormente.^[70] Los datos de ARN de una sola célula se visualizaron mediante Loupe Browser (v8.1.2) y se analizaron los perfiles de expresión de los genes de interés en diferentes grupos de células. Se realizó un análisis de InferCNV para estratificar las células epiteliales (EPCAM+) en subconjuntos epiteliales malignos y no malignos, con células T CD3+ utilizadas como la población normal de referencia, para analizar aún más la expresión diferencial de genes entre las células epiteliales malignas y normales. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298300.

También se realizó una secuenciación de ARN de una sola célula para evaluar los impactos de la neutralización de HE4 en el microambiente inmunitario tumoral. Los tumores subcutáneos de LLC se recogieron el día después de la última administración de los anticuerpos monoclonales. Los tejidos se picaron sobre hielo y luego se digirieron a 37 °C con una velocidad de agitación de 50 rpm durante 30 min. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y luego a través de un tamiz de 40 μm nuevamente, y el filtrado se recogió en un nuevo tubo de centrífuga. El sedimento celular se resuspendió en 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 min. El sedimento celular se lavó y se resuspendió en PBS que contenía 0,5 % de FBS, seguido de la evaluación de la viabilidad celular. Luego, las muestras se enviaron a Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghái, China), para una secuenciación y un análisis bioinformático adicionales. En resumen, la construcción de la biblioteca se realizó según el protocolo del fabricante (DNBelab C TaiM4 V3.0) y se cuantificó mediante un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2100 y un ensayo de ADN de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China). Las lecturas de la plataforma MGI DNBSEQ-T7 se procesaron mediante la canalización dnbc4tools v2.1.2 con parámetros predeterminados y recomendados. Los archivos FASTQ generados a partir de la salida de secuenciación DNBSEQ se alinearon con el ensamblaje del genoma Mus musculus GRCm38.p6, versión M_25, utilizando el algoritmo STAR. A continuación, se generaron matrices de código de barras de genes para cada muestra individual contando los UMI y filtrando los códigos de barras no asociados a las células. Finalmente, generamos una matriz de código de barras de genes que contiene las células con código de barras y los recuentos de expresión génica. Esta salida se importó luego al kit de herramientas R Seurat v4.1.1 para el control de calidad y el análisis posterior. En particular, los genes expresados en menos de tres células, las células con menos de cincuenta genes detectados y las células con porcentajes mitocondriales superiores al 5 % se excluyeron del análisis posterior. Después del filtrado, se retuvieron las células de alta calidad para un análisis posterior. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad y se realizó la visualización de datos utilizando t-SNE y UMAP.

Los grupos se anotaron para diferentes tipos de células en función de la expresión de marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/)^[69]. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE304155.

Secuenciación de ARN masiva y análisis

Se realizó un análisis transcriptómico masivo para comparar la transcripción de genes en macrófagos después de la estimulación con HE4 e IFN-γ. En resumen, las células Raw264.7 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y luego se estimularon con HE4-Fc (20 μg/mL) o IFN-γ (100 ng/mL) durante 3 h. Después de lavar dos veces con PBS frío, se extrajo el ARN total y se transcribió a ADNc. La construcción de la biblioteca y la secuenciación se realizaron mediante la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China) en Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghái, China). Los datos de secuenciación se analizaron mediante una plataforma en línea (https://cloud.majorbio.com/). Los genes regulados al alza por HE4-Fc (en comparación con la estimulación con Fc) o IFN-γ (en comparación con el vehículo) se enumeran. Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG para comparar sistemáticamente las vías de señalización moduladas por HE4 e IFN-γ. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298587.

Ensayo de proliferación celular

Para investigar si la proteína HE4 extracelular promueve la proliferación celular, las células ID8 o LLC, con o sin desactivación de HE4, se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo. La proteína HE4 recombinante o los anticuerpos monoclonales anti-HE4 se agregaron al medio de cultivo a las concentraciones indicadas. A las 0, 24, 48 y 72 h después del tratamiento, se añadió el reactivo CCK-8 a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm después de una incubación de 1 h a 37 °C. La tasa de proliferación relativa de las células se calculó normalizando los valores de absorbancia en cada punto de tiempo a los valores de referencia.

Detección de citocinas

En el punto final del experimento, se recogió sangre de cada ratón y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min para separar el suero. Los tejidos tumorales de las células LLC, MC38 y 4T1 se pesaron, se picaron y luego se cultivaron en placas de 24 pocillos con 1 mL de medio RPMI-1640 sin suero suplementado con 1 % de penicilina-estreptomicina durante 24 h. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de la centrifugación a 5000 rpm durante 5 min y se almacenaron inmediatamente a -80 °C. Las concentraciones medidas de cada citocina en los sobrenadantes de cultivo tumoral se normalizaron al peso del tejido tumoral (pg/g de tumor). Para el modelo peritoneal ID8, el ascitis se cuantificó y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes. Los niveles de IFN-γ, IL-6, TNF-α y HE4 en el suero, el sobrenadante de cultivo y el ascitis se midieron mediante kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante. Para la medición de citocinas humanas, después de que una suspensión de células individuales de LUAD se incubara con HE4-Flag o anticuerpos monoclonales anti-HE4 durante 48 h, se recogió el sobrenadante de cultivo y se diluyó 5 veces para ELISA. Los kits ELISA de ratón IFN-γ (#430804), ratón humano IFN-γ (#430104) y ratón TNF-α (#430904) se compraron a BioLegend. Los kits ELISA de ratón HE4 (CSB-EL026092MO), humano HE4 (CSB-E12923h) y granzima B humana (CSB-E08718h) se compraron a Cusabio (Wuhan, China). El kit ELISA de ratón CTnI (SEKM-0153) se compró a Solarbio. El kit ELISA de ratón granzima B (E-EL-M0594) y el kit ELISA de ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS (FLT3L) (E-EL-M0030) se compraron a Elabscience (Wuhan, China). El kit ELISA de ratón CRP (PC186) y el ensayo de amplex rojo de creatinina (S0291S) se compraron a Beyotime. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT/GPT) y aspartato aminotransferasa (AST/GOT) en suero se midieron con kits de ensayo de actividad (E-BC-K235-S, E-BC-K236-M) según los protocolos estándar (Elabscience).

Predicción de interacciones proteína-proteína mediante AlphaFold 3

La predicción de la estructura de las proteínas se realizó mediante el servidor web AlphaFold 3 (https://alphafoldserver.com/). Brevemente, para investigar el modo de unión y las interfaces de interacción específicas entre HE4 y los receptores IFNGR1 e IFNGR2, se utilizó la proteína HE4 madura de ratón (aa26-174) y los dominios extracelulares de IFNGR1 (aa26-254) e IFNGR2 (aa20-262) para iniciar la predicción. Además, para examinar más a fondo la especificidad del anticuerpo monoclonal anti-HE4, se secuenciaron las regiones pesadas variables (VH) y las regiones ligeras variables (VL) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 (clon #117) y del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 (clon #10), y la proteína HE4 de longitud completa, junto con las secuencias VH y VL, se sometieron a la predicción de la estructura utilizando AlphaFold3. Una puntuación de modelado de plantilla predicha (pTM) superior a 0,5 indicó una alta confianza en el modelo estructural general, mientras que una puntuación de PTM de interfaz (ipTM) superior a 0,6 sugirió una alta fiabilidad de la interfaz de interacción proteica predicha. Los resultados de la predicción se descargaron y se sometieron a un análisis más exhaustivo mediante el software PyMOL.

En PyMOL, se cargó el archivo "model_0.cif" y se analizaron los sitios de interacción proteína-proteína mediante una serie de comandos. El análisis implicó tres pasos principales: etiquetar diferentes cadenas de proteínas, identificar las posibles regiones de interacción entre proteínas y seleccionar los residuos dentro de una distancia de interacción de 4 Å para la visualización.

Preparación de suspensiones de muestras de cáncer humano y tratamiento

Los tejidos tumorales frescos de pacientes con LUAD se picaron y se digirieron en un tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 minutos. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm y luego se resuspendieron en un medio RPMI-1640 al 10% para experimentos posteriores. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de proteína HE4 recombinante (hHE4-Flag) o anticuerpos monoclonales anti-hHE4 a 37 °C durante 48 horas. A continuación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con un fluorocromo para el análisis de citometría de flujo, y se detectaron la IFN-γ y la granzima B en los sobrenadantes de la cultura mediante un kit ELISA.

Análisis farmacocinético del anticuerpo monoclonal anti-hHE4

Para modelar el comportamiento farmacocinético del anticuerpo anti-hHE4 totalmente humanizado in vivo, se administró una dosis única de anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #10 por inyección en la vena de la cola a ratones C57BL/6 (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. Se recogieron muestras de sangre en los puntos temporales indicados después de la inyección (0, 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168 h, 336 h y 504 h) mediante punción retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. Se dejó que las muestras de sangre coagularan a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 × g durante 10 minutos para obtener suero, que se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de suero del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 se cuantificaron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Brevemente, se recubrieron placas de pocillos de 96 pocillos de alta unión durante la noche a 4 °C con proteína hHE4-Fc recombinante (0,2 μg por pocillo). Después de bloquear con PBS al 5% de BSA, se añadieron muestras de suero diluidas (1:10000) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP, seguido del desarrollo del sustrato TMB y la medición de la absorbancia a 450 nm. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon en función de una curva estándar generada utilizando anticuerpo monoclonal anti-hHE4 purificado del clon #10.

Los parámetros farmacocinéticos, incluido la concentración máxima en suero (Cmax), la vida media de eliminación (t1/2) y el tiempo medio de residencia (MRT), se estimaron utilizando un análisis no compartimental con el software GraphPad Prism o Phoenix WinNonlin.

Modelos de tumores de ratones humanizados del sistema inmunitario

Los modelos de xenoinjerto de ratones humanizados con PBMC se establecieron como se describió anteriormente para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 en estudios preclínicos.^[71] En resumen, después de una semana de adaptación al entorno, se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho ratones c-NKG (hembras, de 8 semanas de edad) con una suspensión de células tumorales y PBMC que contenía 5 × 106 células NCI-H358 (o OVCAR3) y 3,0 × 105 PBMC. A partir del día 3 después de la inoculación, se administró por vía peritoneal a los ratones c-NKG portadores de tumores 10 mg/kg/ratón de anticuerpos monoclonales anti-hHE4 o el control de isotipo IgG2a cada dos días, un total de cuatro veces. Al día siguiente de la última administración, se sometieron los ratones a una eutanasia humanitaria mediante un procedimiento estandarizado, y se resecó, pesó y procesó el tejido tumoral para el análisis de citometría de flujo.

Análisis bioinformático

Aquí, utilizamos Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA), un servidor interactivo en línea que integra datos de perfilado de expresión génica del Cancer Genome Atlas (TCGA) y los proyectos Genotype-Tissue Expression (GTEx), para analizar y verificar la expresión génica de HE4 en LUAD, cáncer de ovario, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de páncreas y cáncer de vejiga (http://gepia2.cancer-pku.cn/index.html).^[72] La respuesta clínica de los pacientes con LUAD con alta o baja expresión de HE4 a los inhibidores de los puntos de control inmunitario se predijo mediante la puntuación de disfunción y exclusión inmune tumoral (TIDE), un marco computacional desarrollado para evaluar el potencial de escape inmunitario tumoral a partir de los perfiles de expresión génica de las muestras de cáncer (http://tide.dfci.harvard.edu/query/).^[73]

Cuantificación y análisis estadístico

Los experimentos in vitro se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Los experimentos con animales se repitieron al menos dos veces de forma independiente. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) y se analizaron con GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). La significación estadística de las comparaciones múltiples se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la corrección post hoc de Bonferroni, y se utilizó una prueba t de Student de dos colas para las comparaciones de dos grupos. Cuando se compararon múltiples grupos con una segunda variable, por ejemplo, a lo largo del tiempo, se realizó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Sidak. Las curvas de supervivencia se compararon mediante la prueba de rango logarítmico (prueba de Mantel-Cox). Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Recogida de muestras humanas

El protocolo para la recogida de muestras humanas de LUAD fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital del Pueblo Provincial de Sichuan (número de aprobación: 2022-383), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Se recogieron prospectivamente tejidos tumorales frescos y tejidos normales adyacentes emparejados de pacientes que no habían sido sometidos a radio-/quimioterapia o terapia neoadyuvante en los 6 meses anteriores. La recogida de muestras se realizó inmediatamente después de la resección quirúrgica sin interferir con los procedimientos quirúrgicos estándar. Se disociaron dos pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes en suspensiones de células individuales para la secuenciación de ARN de células individuales. Además, se utilizaron 16 tumores y tejidos paratumorales emparejados para evaluar la expresión de HE4. Además, se recogieron retrospectivamente muestras tumorales fijadas en parafina de 44 pacientes con NSCLC, incluidos 21 casos de adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y 23 casos de carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC), que se clasificaron como sensibles a la inmunoterapia o resistentes a ella. Todos los pacientes recibieron un tratamiento combinado con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia basada en platino. Los inhibidores de PD-1 administrados incluyeron camrelizumab (n = 20), pembrolizumab (n = 1), serplulimab (n = 1), tislelizumab (n = 9) y sintilimab (n = 12). El estadio clínico al inicio del tratamiento fue el siguiente: estadio IIa (n = 8), estadio IIb (n = 10), estadio IIIa (n = 22), estadio IIIb (n = 3) y estadio IIIc (n = 1). Para los pacientes postoperatorios (n = 29), la sensibilidad al tratamiento se definió como la ausencia de progresión o recurrencia de la enfermedad durante más de 2 años cuando la inmunoterapia se inició en el estadio clínico II, o durante más de 1 año cuando se inició en el estadio III; la resistencia al tratamiento se definió como la progresión o recurrencia de la enfermedad en un plazo de 6 meses después de la cirugía. Para los pacientes preoperatorios (n = 55), la sensibilidad al tratamiento se definió como la consecución de una respuesta parcial o completa, mientras que la resistencia se clasificó como enfermedad estable (EE) o enfermedad progresiva (EP) según los criterios RECIST v1.1.

Además, se proporcionó retrospectivamente un microarreglo de NSCLC de pacientes que eran sensibles o resistentes al anticuerpo anti-PD1 más (o no) quimioterapia por el Dr. Qian Chu, del Hospital Tongji. En estas cohortes, se incluyeron un total de 57 pacientes con NSCLC, incluidos 43 casos de LUAD y 14 casos de LUSC. Entre estos pacientes, 52 recibieron una terapia combinada con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia basada en platino, 4 recibieron una terapia con un único anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y 1 paciente recibió una terapia combinada con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 y quimioterapia basada en platino. Las muestras se obtuvieron de pacientes tratados en el entorno preoperatorio. La sensibilidad al tratamiento se definió como la consecución de una respuesta parcial o completa (RP; n = 37), mientras que la resistencia al tratamiento se definió como enfermedad progresiva (EP; n = 20), según los criterios RECIST v1.1.^[62]

Animales

Los ratones Cd274−/− y WT utilizados en este estudio se produjeron internamente mediante el cruce de progenitores heterocigotos (de la 5ª a la 9ª generación). Se realizó la genotipificación utilizando conjuntos de cebadores específicos del tipo salvaje (WT) y específicos del gen desactivado (KO) diseñados por GemPharmatech. Todos los ratones utilizados en este estudio tenían entre 6 y 8 semanas de edad y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en el centro de animales del Colegio de Medicina de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China. Los ratones se mantuvieron a 24 ± 2 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas con acceso libre a alimentos y agua. El alojamiento de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de los animales, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal del Hospital del Pueblo Provincial de Sichuan (número de aprobación: 2022-404).

Líneas celulares y cultivo celular

Las células HEK293T, LLC, ID8 y Raw264.7 se mantuvieron en DMEM suplementado con un 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células THP-1, 4T1, MC38, OVCAR3 y NCI-H358 se mantuvieron en un medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se diferenciaron según lo descrito anteriormente.^[63] Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) se prepararon cultivando células de la médula ósea con GM-CSF (20 ng/mL) e IL-4 (10 ng/mL), según lo descrito anteriormente.^[64] Todas las células se mantuvieron y se amplificaron en una incubadora de CO2 a 37 °C con un 5% de CO2. Las células se pasaron cada 2 días; las células 293 F se mantuvieron en un medio FreeStyle 293 sin suero y se amplificaron en una incubadora de agitación (130 rpm) bajo un 5% de CO2 a 37 °C. Se realizó la autenticación de la línea celular mediante el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio están libres de contaminación por micoplasma.

El protocolo para la recolección de muestras humanas de CALU (carcinoma de adenocarcinoma de pulmón) fue aprobado por el Comité de Revisión de Ética del Hospital Provincial del Pueblo de Sichuan (número de aprobación: 2022-383), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Se recolectaron prospectivamente muestras frescas de tumor y tejidos normales adyacentes de pacientes que no se habían sometido a radio-/quimioterapia o terapia neoadyuvante en los 6 meses anteriores. La recolección de muestras se realizó inmediatamente después de la resección quirúrgica, sin interferir con los procedimientos quirúrgicos estándar. Se disociaron dos pares de muestras de tumor y tejido normal adyacente en suspensiones de células individuales para la secuenciación de ARN de una sola célula. Se utilizaron 16 tumores adicionales y tejidos paratumorales para evaluar la expresión de HE4. Además, se recolectaron retrospectivamente muestras de tumor incluidas en parafina de 44 pacientes con CPNP (cáncer de pulmón no microcítico), incluidos 21 casos de adenocarcinoma de pulmón (CALU) y 23 casos de carcinoma de células escamosas de pulmón (CCEP), que se clasificaron como sensibles a la inmunoterapia (n = 27) o resistentes (n = 17). Todos los pacientes recibieron tratamiento combinado con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia a base de platino. Los inhibidores de PD-1 administrados incluyeron camrelizumab (n = 20), pembrolizumab (n = 1), serplulimab (n = 1), tislelizumab (n = 9) y sintilimab (n = 12). El estadio clínico al inicio del tratamiento fue el siguiente: Estadio IIa (n = 8), Estadio IIb (n = 10), Estadio IIIa (n = 22), Estadio IIIb (n = 3) y Estadio IIIc (n = 1). Para los pacientes postoperatorios (n = 29), la sensibilidad al tratamiento se definió como la ausencia de progresión o recurrencia de la enfermedad durante más de 2 años cuando la inmunoterapia se inició en el estadio clínico II, o durante más de 1 año cuando se inició en el estadio III; la resistencia al tratamiento se definió como la progresión o recurrencia de la enfermedad dentro de los 6 meses posteriores a la cirugía. Para los pacientes preoperatorios (n = 55), la sensibilidad al tratamiento se definió como la consecución de una respuesta parcial o completa, mientras que la resistencia se clasificó como enfermedad estable (EE) o enfermedad progresiva (EP), según los criterios RECIST v1.1.

Además, se proporcionó retrospectivamente un microarreglo de CPNP de pacientes que eran sensibles o resistentes al anticuerpo anti-PD1 más (o no) quimioterapia por el Dr. Qian Chu, del Hospital Tongji. En estas cohortes, se incluyeron un total de 57 pacientes con CPNP, incluidos 43 casos de CALU y 14 casos de CCEP. De estos pacientes, 52 recibieron terapia de combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y quimioterapia a base de platino, 4 recibieron monoterapia con anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y 1 paciente recibió terapia de combinación con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 y quimioterapia a base de platino. Las muestras se obtuvieron de pacientes tratados en el entorno preoperatorio. La sensibilidad al tratamiento se definió como la consecución de una respuesta parcial o completa (RP; n = 37), mientras que la resistencia al tratamiento se definió como enfermedad progresiva (EP; n = 20), según los criterios RECIST v1.1.^[62]

Animales

Los ratones Cd274−/− y WT utilizados en este estudio se produjeron internamente mediante el cruce de progenitores heterocigotos (5–9ª generación). Se realizó la genotipificación utilizando conjuntos de cebadores específicos para el tipo salvaje (WT) y específicos para el gen desactivado (KO) diseñados por GemPharmatech. Todos los ratones utilizados en este estudio tenían entre 6 y 8 semanas de edad y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en el centro de animales del Departamento de Medicina de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China. Los ratones se mantuvieron a 24 ± 2 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas con acceso libre a alimentos y agua. El alojamiento de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal del Hospital Provincial del Pueblo de Sichuan (número de aprobación: 2022-404).

Líneas celulares y cultivo celular

Las células HEK293T, LLC, ID8 y Raw264.7 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células THP-1, 4T1, MC38, OVCAR3 y NCI-H358 se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Los macrófagos derivados de la médula ósea (MDMO) se diferenciaron según lo descrito anteriormente.^[63] Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (CDMO) se prepararon cultivando células de la médula ósea con GM-CSF (20 ng/mL) e IL-4 (10 ng/mL), según lo descrito anteriormente.^[64] Todas las células se mantuvieron y se amplificaron en una incubadora de CO2 a 37 °C con 5% de CO2. Las células se pasaron cada 2 días; las células 293 F se mantuvieron en un medio de expresión FreeStyle 293 sin suero y se amplificaron en una incubadora agitada (130 rpm) bajo 5% de CO2 a 37 °C. La autenticación de la línea celular se realizó mediante el perfilado de repeticiones en tándem cortas (STR). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio están libres de contaminación por micoplasma.

Detalles del método

Preparación de proteínas recombinantes murinas y humanas

Los plásmidos que contienen el ADN complementario de longitud completa de HE4 murino y humano, pcDNA3.1-mHE4-Flag y pcDNA3.1-hHE4-Flag, se compraron a Youbio BioTech Co. (Changsha, China). Los plásmidos se amplificaron en E. coli DH5α, se purificaron mediante un kit de medio de plásmidos libre de endo y se transfectaron en células 293 F mediante el reactivo de transfección FectoPRO según el protocolo del fabricante. Después de 7 a 10 días de cultivo, las proteínas recombinantes marcadas con Flag, mHE4-Flag o hHE4-Flag, se purificaron por afinidad a partir del sobrenadante mediante agarosa conjugada con anti-Flag (#2058ES08, Yeasen BioTech, Shanghái, China). Para la producción de proteínas marcadas con Fc, los fragmentos de ADN que codifican hHE4 (aa 31–123) o mHE4 (aa 26–174) se amplificaron mediante PCR, se subclonaron e insertaron posteriormente en el vector modificado pINFUSE-hIgG-Fc con una señal peptídica IL-2. Tras la transfección en células 293 F como se describe anteriormente, la proteína HE4 marcada con Fc (HE4-Fc) se purificó por afinidad con resina de proteína G según el protocolo del fabricante (L10029, GenScript BioTech, Naning, China). Además, los fragmentos extracelulares de IFN-γR1 o IFN-γR2 murinos se insertaron en el vector pcDNA3.1+C-His (pcDNA3.1-Ifngr1-His y pcDNA3.1-Ifngr2-His, respectivamente). Los plásmidos se transfectaron posteriormente en células 293 F. Las proteínas His-marcadas de IFN-γR1 o IFN-γR2 se purificaron por afinidad con resina Ni-TED según el protocolo del fabricante (L00885, GenScript BioTech, Nankín, China). Los productos eluidos se sometieron a cuatro rondas de intercambio de tampón con PBS frío mediante ultrafiltración y se concentraron a la concentración adecuada. La pureza de las proteínas recombinantes se analizó mediante Western blot o SDS‒PAGE con tinción azul de Coomassie. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Para determinar si HE4 desencadena la regulación ascendente de PD-L1, las células Raw264.7 o MDMO se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 5 × 105/pocillo. A continuación, las células se trataron con la concentración indicada de proteína recombinante de HE4 en Opti-MEM durante 3 h (para Western blot y qPCR en tiempo real) o 12 h (para citometría de flujo e inmunoblot). Para evaluar el efecto de HE4 sobre la expresión de PD-L1 en diferentes subconjuntos de macrófagos, las células Raw264.7 se diferenciaron en macrófagos similares a M1 con 300 ng/mL de LPS más 20 ng/mL de IFN-γ durante 24 h, o se diferenciaron en macrófagos similares a M2 con 50 ng/mL de IL-4 durante 48 h, seguido de la estimulación con proteína recombinante de HE4 durante 12 h. Las células mononucleares humanas THP-1 se estimularon con 100 ng/mL de PMA durante 48 h para permitir su diferenciación en macrófagos antes del tratamiento. El pretratamiento con los inhibidores se realizó durante 1 h antes de la estimulación con HE4.

Producción y purificación de anticuerpos anti-HE4

Los anticuerpos monoclonales anti-HE4 murinos y anti-HE4 humanos se generaron mediante AtaGenix Laboratories Co., Ltd. (Wuhan, China). Brevemente, las ratas (o los ratones) se inmunizaron con mHE4-Fc (aa26–174) o hHE4-Fc (aa31–123) cuatro veces. Las suspensiones de células individuales de los esplenocitos inmunizados se fusionaron posteriormente con células de mieloma murino sp2/0 mediante polietilenglicol (p7181, Sigma‒Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los hibridomas se seleccionaron en un medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), seguido de dos rondas de clonación por dilución limitante para establecer líneas celulares monoclonales. El hibridoma monoclonal se mantuvo en un medio específico sin suero (NC0301, YoCon, Pekín, China) y se amplificó en una incubadora agitada para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades. Tras el cultivo masivo durante 7 a 10 días, los medios de cultivo se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min para eliminar los restos celulares. Los anticuerpos se aislaron del sobrenadante mediante resina de proteína G y luego se eluyeron con un tampón de glicina-HCl 0,1 M (pH = 2,7). Los eluidos se ultrafiltraron cuatro veces con PBS 1× frío y se concentraron a la concentración adecuada. Se realizó una tinción azul de Coomassie en SDS‒PAGE para evaluar la pureza de los productos eluidos. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Para evaluar si la administración del anticuerpo monoclonal anti-HE4 provocaba eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario, se inyectaron 10 ratones A/J machos de 10 semanas de edad con el anticuerpo monoclonal anti-HE4 (200 μg/ratón, n = 10) por vía intraperitoneal cada tres días durante 21 días. Además, como controles, se inyectaron a los ratones con un anticuerpo monoclonal rat IgG2a (n = 10) o un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 (n = 9). Durante el período de tratamiento, se recogió suero de cada ratón para la cuantificación mediante ELISA de los niveles de IL-6, IFN-γ y las enzimas hepáticas ALT y AST. Se recogieron tejidos, incluidos el corazón, los pulmones, el hígado y el colon, para su evaluación histológica.

Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Los experimentos de resonancia plasmónica de superficie (SPR) se llevaron a cabo utilizando un sistema WeSPR 100 equipado con chips de oro carboxilados (G10031), siguiendo las instrucciones del fabricante (XLement, Shanghái, China), para evaluar cuantitativamente las afinidades de unión de las interacciones antígeno-anticuerpo y receptor-ligando. Brevemente, los chips sensores se activaron utilizando NHS (0,1 M) y EDC (0,4 M) recién preparados en un tampón MES (pH = 6,0) a 37 °C durante 30 min, seguido de un lavado exhaustivo con agua ultrapura y un breve secado. Para los análisis de interacción receptor-ligando, la proteína recombinante IFNGR1-His se diluyó a 30 μg/mL en un tampón MES (pH 4,5) y se inmovilizó en la superficie del chip activado (6 μL por pocillo) durante la noche a 4 °C. Para los análisis de interacción antígeno-anticuerpo, las proteínas recombinantes HE4-Fc o proteínas de control Fc se diluyeron de forma similar y se inmovilizaron. Al día siguiente, se eliminó la solución residual mediante un ligero golpeteo y la superficie del chip se bloqueó con 150 μL de tampón de bloqueo proporcionado con el kit a 37 °C durante 1 h. Después de dos lavados con tampón de dilución, se realizaron los análisis de unión utilizando el módulo de análisis de afinidad según el flujo de trabajo estándar de adquisición y ajuste. La cinética de unión se analizó utilizando el software de análisis WeSPR.

Transducción lentiviral para la desactivación o sobreexpresión de genes

El ADN complementario de longitud completa de HE4 murino (NM_026323.2) se insertó en el vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro (pCDH-HE4) o pLVX-CMV-puro (pLVX-HE4) para generar un lentivirus para la expresión ectópica. Para la producción de lentivirus, el plásmido recombinante pCDH-HE4 o pLVX-HE4 (6 μg), el plásmido de empaquetamiento pAX2 (3 μg) y el plásmido de envoltura VSV-G (3 μg) se preincubaron con polietilenimina (30 μg) en Opti-MEM durante 15 min y luego se añadieron a células HEK293T (80% de densidad en platos de 6 cm). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 48 h después de la transfección, se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm y se suplementaron con 8 μg/mL de polibreno antes de usarse para infectar las células LLC y ID8. Los plásmidos pCDH-puro o pLVX-puro vacíos se utilizaron como controles. Después de 72 h de incubación, las células no infectadas se eliminaron con puromicina (5 μg/mL) durante 7 días. Las poblaciones supervivientes se expandieron para validar la expresión de HE4 mediante qPCR en tiempo real y Western blotting.

Para la inactivación génica, los ARN guía (gARN) de los genes diana se diseñaron mediante el servidor en línea CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Los oligonucleótidos de sentido y antisentido se unieron mediante un termociclador, se fosforilaron con la kinasa de polinucleótidos T4 y se ligaron en un vector pLenti-CRISPRv2-GFP digerido con BsmBI mediante la ligasa de ADN T4. La producción de lentivirus se realizó según el protocolo mencionado anteriormente. Las partículas virales se enriquecieron mediante ultrafiltración, se suspendieron en medio completo fresco que contenía 8 μg/mL de polibreno y se añadieron a las células diana. Después de la incubación durante 24 h, el medio se reemplazó con medio completo fresco y luego se incubó durante 48 h. Las células GFP-positivas se clasificaron individualmente mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en placas de 96 pocillos (es decir, una célula por pocillo). Las poblaciones clonales se expandieron y la eficiencia de la inactivación de cada gen se verificó mediante Western blot.

Modelos de tumores sinérgicos murinos

Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices éticas pertinentes y fueron aprobados por el Departamento del Comité de Ética del Hospital del Pueblo Provincial de Sichuan, Universidad de Ciencias y Tecnología Electrónica de China. Las células cancerosas se recolectaron en la fase de crecimiento logarítmico, se lavaron con PBS 1× preenfriado y se resuspendieron en solución salina a una densidad celular adecuada. Los modelos de tumores subcutáneos se establecieron inoculando MC38 (1 × 106/150 μL) o LLC (2 × 106/150 μL) en el flanco derecho de ratones C57BL/6. Las células 4T1 (2 × 106/100 μL) se implantaron en los cojinetes de grasa mamaria de ratones BALB/c para establecer un modelo de cáncer de mama ortotópico. Las células HGS-1 (1 × 106 células en 10 μL por ovario) se implantaron bilateralmente en los ovarios de ratones C57BL/6 para establecer un modelo de cáncer de ovario. El diámetro largo (L, mm) y el diámetro corto (W, mm) de los tejidos tumorales se midieron con calibradores cada dos días, y el volumen tumoral se calculó mediante la siguiente fórmula: (L∗W∗W)/2 (mm3). Al final de los experimentos, los ratones se sometieron a una eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado de la siguiente manera: los ratones se colocaron en una cámara de eutanasia designada y se realizó la eutanasia con CO2 introduciendo gradualmente dióxido de carbono en la cámara durante 10 minutos para garantizar una transición pacífica. Después de la eutanasia con CO2, cada ratón se sometió a una dislocación cervical para confirmar la pérdida irreversible de la conciencia y la muerte, de acuerdo con las directrices veterinarias aceptadas. Los tejidos tumorales se resecaron y se pesaron. El volumen y el peso del tumor sirvieron como las métricas primarias de los modelos de tumor subcutáneo y ortotópico. Las células ID8 (2 × 106/200 μL) se inyectaron intraperitonealmente en ratones C57BL/6 para establecer un modelo de metástasis peritoneal del cáncer de ovario. En el punto final del experimento (aproximadamente 40 días), se recolectó el líquido ascítico y se cuantificó. El volumen del líquido ascítico sirvió como la métrica primaria del modelo de metástasis peritoneal ID8. De acuerdo con las directrices éticas, los ratones se sacrificaron una vez que el volumen del tumor alcanzó los 2 cm3 o si se produjeron úlceras.

Para evaluar los efectos de la expresión de HE4 en el crecimiento tumoral in vivo, las células LLC e ID8 con la inactivación o sobreexpresión de HE4 se inocularon subcutáneamente e intraperitonealmente en ratones C57BL/6, respectivamente. En paralelo, la misma cantidad de células LLC e ID8 infectadas con lentivirus cargado con un vector vacío se incubaron con ratones de control.

Para imitar el papel de los fragmentos extracelulares de HE4 en el crecimiento tumoral, las células MC38 (1 × 106/150 μL) o las células LLC con la inactivación de HE4 (2 × 106/150 μL) se inocularon en el flanco derecho de ratones C57BL/6. La proteína recombinante HE4-Fc o la proteína Fc (2,5 mg/kg de peso corporal) se administraron intraperitonealmente cada dos días hasta el punto final del experimento. Cabe destacar que las proteínas HE4-Fc y Fc se administraron un día antes de la incubación de las células tumorales en el modelo LLC o 3 días después de la inoculación en el modelo MC38. El tamaño de los tumores se registró diariamente. En el punto final del experimento, se extirparon los tumores intactos, se pesaron y se digirieron enzimáticamente en suspensiones de células individuales para experimentos posteriores.

A los ratones con tumores se les administraron anticuerpos monoclonales contra HE4 (anti-HE4 mAbs) para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 in vivo. La administración de anticuerpos se inició a partir del día 4 después de la inoculación (células ID8 o HGS-1), o cuando el volumen de los tumores subcutáneos (LLC o MC38) u ortotópicos (4T1) alcanzó los 50–100 mm3. Los anti-HE4 mAbs o el control de IgG isotípica (10 mg/kg de peso corporal) se administraron mediante inyección intraperitoneal cada dos días, seis veces en total. En el punto final del experimento, se recolectó el líquido ascítico o los tejidos tumorales para experimentos posteriores.

Para evaluar los efectos antitumorales coordinados de los anticuerpos anti-HE4 y anti-CTLA-4, a los ratones con tumores LLC se les administró tratamiento una vez que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente los 50–100 mm3. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de anti-mHE4 mAb (10 mg/kg) y anti-CTLA-4 mAb (5 mg/kg), administradas ya sea solas o en combinación.

Se evaluaron los efectos antitumorales sinérgicos de la neutralización de HE4 combinada con la quimioterapia. Específicamente, cuando los tumores LLC subcutáneos alcanzaron volúmenes que oscilaban entre 50 y 100 mm3, se administraron anti-HE4 mAbs (5 mg/kg) por vía intraperitoneal cada dos días durante un total de 6 dosis. Al mismo tiempo, se administró paclitaxel (10 mg/kg) por vía intraperitoneal cada 4 días hasta el punto final del experimento. Para el modelo peritoneal ID8, se administraron anti-HE4 mAbs el día 4 después de la inoculación de células ID8, seis veces en total. La administración de paclitaxel se inició el día 7, tres veces a intervalos semanales. Se utilizaron IgG de tipo coincidente y vehículo como controles para la administración de anti-mHE4 mAbs y paclitaxel, respectivamente. Se controlaron los resultados de supervivencia de cada ratón durante todo el período de estudio, y se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para analizar la eficacia del tratamiento.

Depleción de células T CD8+ y macrófagos in vivo

Para la depleción de células T CD8+ in vivo, se administraron anticuerpos anti-CD8α (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal a partir del día de la inoculación de LLC (día 0) y se administraron cada dos días hasta que se sacrificaron los animales. Se recolectaron los bazo y se disociaron en suspensiones de células individuales, y la frecuencia de células T CD8+ se cuantificó mediante análisis citométrico de flujo (CD3+/CD8α+). Para agotar los macrófagos in vivo, se administraron anticuerpos anti-CSF1R (20 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal antes de la inoculación de LLC durante una semana, con administración continua cada 3 días durante todo el estudio. Se extirparon los tejidos tumorales, se digirieron enzimáticamente en suspensiones de células individuales y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de macrófagos (CD45+/CD11b+/F4/80+).

Modelos de cáncer de pulmón inducido por uretano

Se indujo cáncer de pulmón primario de células no pequeñas en ratones FVB mediante inyecciones intraperitoneales semanales de uretano (1 mg/g de peso corporal, disuelto en solución salina estéril). Después de seis semanas de tratamiento con uretano, los ratones se sometieron a una administración intraperitoneal de anti-HE4 mAbs o control de IgG de tipo coincidente (10 mg/kg de peso corporal, cada dos días) 6 veces. La administración de anticuerpos se realizó nuevamente de las semanas 12 a 14. En el punto final del experimento (semana 18), los ratones se sometieron a una eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado, y los tejidos pulmonares se extirparon quirúrgicamente. El lóbulo pulmonar más grande se procesó para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), y se cuantificó el número de nódulos tumorales visibles.

Tinción inmunohistoquímica y puntuación

La expresión de HE4 en los tejidos tumorales se evaluó mediante inmunohistoquímica. En resumen, las secciones de tumores incluidos en parafina se desparafinaron, se rehidrataron y se sumergieron en solución tampón de citrato-citrato (10 mM, pH = 6,0) a 95 °C durante 30 minutos. Antes de la incubación con el anticuerpo primario, las secciones de tejido se trataron secuencialmente con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS 1× durante 20 minutos y se bloquearon con PBS que contenía 5% de suero de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 hora. Luego, las láminas se incubaron con los anticuerpos indicados a 4 °C durante la noche, seguidas de la incubación con el anticuerpo secundario recombinante polimérico HRP-cabra anti-ratón/conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales positivas de los objetivos se visualizaron con sustratos DAB, y los núcleos se contrateñeron con hematoxilina. En paralelo, la especificidad del anticuerpo primario se evaluó preincubando las muestras con 50 μg de proteína recombinante HE4-Fc a 4 °C durante 1 hora antes de que se añadieran a las secciones. Se utilizó un sistema de puntuación semicuantitativo para evaluar el nivel de expresión de HE4, como se describió anteriormente.^[65] En resumen, las imágenes teñidas se puntuaron por intensidad (1: débil; 2, moderada; 3, fuerte) y porcentaje de células positivas (1: 0–25%; 2: 26–50%; 3: 51–75%; 4: 76–100%) mediante un protocolo doble ciego. La puntuación de inmunohistoquímica final de cada sección se calculó como el producto de la intensidad y el porcentaje.

Western blot

Para Western blot, las células cultivadas y los tejidos se lisaron en tampón de carga SDS‒PAGE que contenía 100 μM de ditiotreitol (DTT), y los lisados celulares resultantes se sonicaron para reducir la viscosidad. Las proteínas solubles en los sobrenadantes del cultivo se precipitaron con metanol y cloroformo, como se describió anteriormente.^[66] Los pellets resultantes se disolvieron en tampón de carga SDS‒PAGE que contenía DTT. Todas las muestras se hirvieron durante 5 minutos y cantidades iguales de proteína se separaron electroforéticamente y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 hora. Después de la incubación con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante la noche, las membranas se lavaron con PBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron mediante un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (BG0001, BioGround, Chongqing, China). Las imágenes se capturaron mediante un sistema de imagen de quimioluminiscencia (Clinx, Shanghai, China) para un análisis posterior.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real

Después de los tratamientos indicados, las células se lavaron dos veces con PBS helado y se extrajo el ARN total mediante un kit E.Z.N.A. Total RNA Kit I (D6915-04, Omega Biotek, Norcross, Georgia, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizaron cantidades iguales de ARN para la transcripción inversa en ADNc mediante la transcriptasa inversa Hiscript III (R302-01, Vazyme, Naning, China). El ADNc resultante se sometió a PCR en tiempo real utilizando la mezcla maestra SYBR Green qPCR (Q311, Vazyme). El β-actina de ratón y el GAPDH humano se utilizaron como controles internos, y los niveles de expresión relativa de los genes se calcularon mediante el método 2−ΔΔCT.^[67]

Ensayo de unión proteína-célula

Las células RAW264.7 y las células THP-1 diferenciadas con PMA (1 × 105) se incubaron con 5 μg de proteína HE4-Flag o HE4-Fc a 37 °C durante 2 h, y cantidades iguales de péptidos 3 × Flag o Fc sirvieron como controles negativos. Luego, las células se fijaron con un 2% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios Alexa Fluor-488-conjugados anti-Flag o PE-conjugados anti-Fc durante 30 minutos sobre hielo. Las células teñidas se lavaron una vez con tampón FACS (5% de BSA en PBS) y luego se sometieron a análisis de citometría de flujo.

Ensayo de unión proteína-proteína in vitro

Para investigar si HE4 interactúa directamente con IFN-γR1 e IFN-γR2, se diluyeron 2 μg de proteína recombinante HE4-Flag, IFN-γR1-His o IFN-γR2-His en tampón de unión (20 mM de fosfato, pH 7,4; 200 mM de NaCl; 2 mM de EDTA; 5% de glicerol; 0,2% de NP-40 y cóctel de inhibidores de proteasas) y se incubaron a 4 °C durante 4 h, seguido de una incubación adicional con 30 μL de Ni-TED o anti-Flag-agarosa conjugado durante 2 h. Las cuentas se lavaron tres veces con tampón de alta sal y luego se resuspendieron en tampón de carga SDS‒PAGE para análisis de Western blot.

Para determinar si HE4 compite con IFN-γ por la unión a IFN-γR1 e IFN-γR2, se incubaron 2 μg de IFN-γR1-His purificado e IFN-γR2-His con 30 μL de resina Ni-TED a 4 °C durante 2 h. La mezcla resultante se lavó tres veces con un tampón de alta concentración salina y luego se incubó con las cantidades indicadas de HE4-Flag recombinante y proteínas IFN-γ durante 2 h adicionales. Después de tres lavados, la resina resultante se resuspendió en un tampón de carga para SDS-PAGE para el análisis de inmunoblotting.

Para determinar la concentración inhibidora media (IC50) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117, realizamos un ELISA competitivo para evaluar su capacidad para bloquear la interacción entre mHE4-Fc y el receptor IFNGR1. Brevemente, la proteína recombinante mIFNGR1-His (0,2 μg en 100 μL por pocillo) se recubrió en placas de 96 pocillos de alta unión e incubó durante la noche a 4 °C. mHE4-Fc (0,3 μg en 100 μL por pocillo) se preincubó con concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 #117 a 4 °C durante 1 h antes de agregarlo a las placas, que se habían bloqueado con 5% de BSA. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 h, se agregó un anticuerpo anti-Fc conjugado con HRP e incubó durante 1 h adicional. Luego, las placas se lavaron cuatro veces con PBST, seguido de la adición del sustrato TMB. La reacción se detuvo con la solución de parada y se midió la absorbancia.

Citometría de flujo

Se analizaron las abundancias de células T, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y células que expresan PD-L1 dentro del microambiente tumoral mediante citometría de flujo. Para tumores subcutáneos u ortotópicos, los tejidos tumorales se disociaron mecánicamente y se digirieron en un tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 min. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales y luego se lavaron con PBS frío. Para el modelo peritoneal ID8, el ascitis se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y los sedimentos se lavaron con PBS frío y luego se incubaron con un tampón de lisis de glóbulos rojos sobre hielo durante 5 min. Las células se lavaron con PBS frío dos veces y se resuspendieron en un tampón FACS para experimentos posteriores. Las células vivas y muertas se distinguieron mediante un kit de viabilidad fijable Zombie Violet según el protocolo del fabricante. Las células se preincubaron con TruStain FcX a 4 °C durante 15 min para bloquear los receptores Fc, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo a 4 °C durante 30 min. Luego, las células se fijaron con 2% de paraformaldehído (PFA) a temperatura ambiente durante 15 min y se resuspendieron en un tampón FACS para el análisis. Para la tinción intracelular, las células se incubaron con un cóctel de estimulación celular (1:1000) durante 3 h a 37 °C, seguido de bloqueo con TruStain FcX y tinción superficial. Luego, las células fijadas con PFA se permeabilizaron con un tampón de tinción de Foxp3/factor de transcripción (#00-5523-00, eBioscience) y se incubaron con los anticuerpos apropiados sobre hielo durante 30 min, seguido de un análisis por citometría de flujo.

Para evaluar si HE4 aumenta la expresión de PD-L1, las células RAW264.7 o THP-1 diferenciadas con PMA se trataron con proteína HE4 recombinante según lo indicado. Luego, las células se recolectaron y lavaron con 1×PBS frío, seguido de la tinción para distinguir las células vivas/muertas. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con fluorocromo sobre hielo durante 30 min y se fijaron con 2% de PFA para la citometría de flujo. Los datos se adquirieron mediante un sistema de citometría de flujo NovoCyte Quanteon (Agilent) y se analizaron con el software FlowJo V10 (BD Biosciences).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Se recolectaron tejidos tumorales frescos y tejidos normales adyacentes emparejados de dos pacientes con LUAD inmediatamente después de la resección quirúrgica. Los tejidos se enjuagaron con PBS frío tres veces para eliminar los coágulos de sangre y luego se picaron sobre hielo. El bloque de tejido se incubó con una solución de digestión compuesta por 0,25% de tripsina y 10 μg/mL de DNasa I a 37 °C con agitación a 50 rpm durante 30 min. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y luego a través de un tamiz de 40 μm nuevamente, y el filtrado se recolectó en un nuevo tubo de centrífuga. El sedimento celular se resuspendió en 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 min. Luego, se agregaron 10 mL de PBS preenfriado y la mezcla se centrifugó a 250 × g durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en PBS que contenía 0,5% de FBS. Las células se tiñeron con 0,4% de AO/PI para evaluar la viabilidad celular. La captura de células individuales de 10 × Genomics, la construcción de bibliotecas de Illumina, el preprocesamiento de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula, la integración, la reducción de dimensionalidad y la agrupación se realizaron por Capital Biotech (Pekín, China). En resumen, el software CellRanger (https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj) se utilizó para alinear y anotar las lecturas de secuenciación con el ensamblaje del genoma de referencia humano GRCh38.p13, con anotaciones de genes derivadas de GENCODE v34, para generar matrices de conteo de genes-células. Después de la alineación, la información del código de barras, incluida la información del código de barras que identifica las células y los identificadores moleculares únicos (UMI), se procesó y analizó en R (versión 3.6.0) utilizando el paquete R Seurat (versión 4.0.0).^[68] Las células cuyo número de genes era inferior a 200, o cuyo número de genes se encontraba en el 1% superior, o cuya proporción de genes mitocondriales era superior al 25%, se consideraron anormales y se eliminaron. Después del filtrado, se retuvieron las células de alta calidad para un análisis posterior. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad y se realizó la visualización de datos utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) y la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP).

Los grupos se anotaron para diferentes tipos de células basándose en la expresión de marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/)^[69] y la expresión diferencial de genes (DEG), como se describió anteriormente.^[70] Los datos de ARN de una sola célula se visualizaron mediante Loupe Browser (v8.1.2) y se analizaron los perfiles de expresión de los genes de interés en diferentes grupos de células. Se realizó un análisis de InferCNV para estratificar las células epiteliales (EPCAM+) en subconjuntos epiteliales malignos y no malignos, utilizando las células T CD3+ como población normal de referencia, para analizar aún más la expresión diferencial de genes entre las células epiteliales malignas y normales. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298300.

También se realizó una secuenciación de ARN de una sola célula para evaluar los efectos de la neutralización de HE4 en el microambiente inmunitario tumoral. Los tumores subcutáneos de LLC se recolectaron el día después de la última administración de los anticuerpos monoclonales. Los tejidos se picaron sobre hielo y luego se digirieron a 37 °C con una velocidad de agitación de 50 rpm o 30 min. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y el sedimento celular se resuspendió en una solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 min. El sedimento celular se lavó y se resuspendió en PBS que contenía 0,5% de FBS, seguido de la evaluación de la viabilidad celular. Luego, las muestras se enviaron a Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghái, China), para una secuenciación y un análisis bioinformático adicionales. En resumen, la construcción de la biblioteca se realizó según el protocolo del fabricante (DNBelab C TaiM4 V3.0) y se cuantificó mediante un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2100 y un ensayo de ADN de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China). Las lecturas de la plataforma MGI DNBSEQ-T7 se procesaron mediante la canalización dnbc4tools v2.1.2 con parámetros predeterminados y recomendados. Los archivos FASTQ generados a partir de la salida de la secuenciación DNBSEQ se alinearon con el ensamblaje del genoma Mus musculus GRCm38.p6, versión M_25, utilizando el algoritmo STAR. A continuación, se generaron matrices de código de barras de genes para cada muestra individual contando los UMI y filtrando los códigos de barras no asociados a las células. Finalmente, generamos una matriz de código de barras de genes que contenía las células con código de barras y los conteos de expresión génica. Esta salida se importó luego al kit de herramientas R Seurat v4.1.1 para el control de calidad y el análisis posterior. En particular, los genes expresados en menos de tres células, las células con menos de cincuenta genes detectados y las células con porcentajes mitocondriales superiores al 5% se excluyeron del análisis posterior. Después del filtrado, se retuvieron las células de alta calidad para un análisis posterior. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad y se realizó la visualización de datos utilizando t-SNE y UMAP.

Los grupos se anotaron para diferentes tipos de células basándose en la expresión de marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/)^[69]. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE304155.

Secuenciación de ARN a granel y análisis

Se realizó un análisis transcriptómico a granel para comparar la transcripción de genes en macrófagos después de la estimulación con HE4 e IFN-γ. En resumen, las células Raw264.7 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y luego se estimularon con HE4-Fc (20 μg/mL) o IFN-γ (100 ng/mL) durante 3 h. Después de lavar dos veces con PBS frío, se extrajo el ARN total y se transcribió a ADNc. La construcción de la biblioteca y la secuenciación se realizaron mediante la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China) en Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghái, China). Los datos de secuenciación se analizaron mediante una plataforma en línea (https://cloud.majorbio.com/). Los genes regulados al alza por HE4-Fc (en comparación con la estimulación con Fc) o IFN-γ (en comparación con el vehículo) se enumeran. Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG para comparar sistemáticamente las vías de señalización moduladas por HE4 e IFN-γ. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298587.

Ensayo de proliferación celular

Para investigar si la proteína HE4 extracelular promueve la proliferación celular, las células ID8 o LLC, con o sin eliminación de HE4, se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo. La proteína HE4 recombinante o los anticuerpos monoclonales anti-HE4 se agregaron al medio de cultivo a las concentraciones indicadas. A las 0, 24, 48 y 72 h después del tratamiento, se agregó el reactivo CCK-8 a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm después de una incubación de 1 h a 37 °C. La tasa de proliferación relativa de las células se calculó normalizando los valores de absorbancia en cada punto de tiempo con los valores de referencia.

Detección de citocinas

En el punto final experimental, se recolectó sangre de cada ratón y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para separar el suero. Los tejidos tumorales de las células LLC, MC38 y 4T1 se pesaron, se picaron y luego se cultivaron en placas de 24 pocillos con 1 mL de medio RPMI-1640 libre de suero suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina durante 24 horas. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron después de la centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron inmediatamente a −80 °C. Las concentraciones medidas de cada citocina en los sobrenadantes del cultivo tumoral se normalizaron al peso del tejido tumoral (pg/g de tumor). Para el modelo peritoneal ID8, se cuantificó el líquido ascítico y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se recolectaron los sobrenadantes. Los niveles de IFN-γ, IL-6, TNF-α y HE4 en el suero, el sobrenadante del cultivo y el líquido ascítico se midieron mediante kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante. Para la medición de citocinas humanas, después de incubar una suspensión de células individuales de LUAD con HE4-Flag o anticuerpos monoclonales anti-HE4 durante 48 horas, se recolectó el sobrenadante del cultivo y se diluyó 5 veces para el ELISA. Los kits ELISA para ratón IFN-γ (#430804), humano IFN-γ (#430104) y ratón TNF-α (#430904) se adquirieron de BioLegend. Los kits ELISA para ratón HE4 (CSB-EL026092MO), humano HE4 (CSB-E12923h) y humano granzima B (CSB-E08718h) se adquirieron de Cusabio (Wuhan, China). El kit ELISA para ratón CTnI (SEKM-0153) se adquirió de Solarbio. El kit ELISA para ratón granzima B (E-EL-M0594) y el kit ELISA para ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS (FLT3L) (E-EL-M0030) se adquirieron de Elabscience (Wuhan, China). El kit ELISA para ratón CRP (PC186) y el kit de ensayo de creatinina Amplex Red (S0291S) se adquirieron de Beyotime. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT/GPT) y aspartato aminotransferasa (AST/GOT) en el suero se midieron con kits de ensayo de actividad (E-BC-K235-S, E-BC-K236-M) según los protocolos estándar (Elabscience).

Predicción de las interacciones proteína-proteína mediante AlphaFold 3

La predicción de la estructura de la proteína se realizó mediante el servidor web AlphaFold 3 (https://alphafoldserver.com/). Brevemente, para investigar el modo de unión y las interfaces de interacción específicas entre HE4 y los receptores IFNGR1 e IFNGR2, se utilizó la proteína HE4 madura de ratón (aa26-174) y los dominios extracelulares de IFNGR1 (aa26-254) e IFNGR2 (aa20-262) para iniciar la predicción. Además, para examinar más a fondo la especificidad del anticuerpo monoclonal anti-HE4, se secuenciaron las regiones variables pesadas (VH) y las regiones variables ligeras (VL) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 (clon #117) y del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 (clon #10), y la proteína HE4 de longitud completa junto con las secuencias VH y VL se sometieron a la predicción de la estructura utilizando AlphaFold3. Una puntuación de modelado de plantilla predicha (pTM) mayor que 0,5 indicó una alta confianza en el modelo estructural general, mientras que una puntuación de PTM de interfaz (ipTM) mayor que 0,6 sugirió una alta fiabilidad de la interfaz de interacción proteica predicha. Los resultados de la predicción se descargaron y se sometieron a un análisis adicional mediante el software PyMOL.

En PyMOL, se cargó el archivo "model_0.cif" y se analizaron los sitios de interacción proteína-proteína mediante una serie de comandos. El análisis implicó tres pasos principales: etiquetar diferentes cadenas de proteínas, identificar las posibles regiones de interacción entre las proteínas y seleccionar los residuos dentro de una distancia de interacción de 4 Å para la visualización.

Preparación de suspensiones de muestras de cáncer humano y tratamiento

Los tejidos tumorales frescos de pacientes con LUAD se picaron y se digirieron en tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 minutos. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm y luego se resuspendieron en un medio RPMI-1640 al 10% para experimentos posteriores. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de proteína HE4 recombinante (hHE4-Flag) o anticuerpos monoclonales anti-hHE4 a 37 °C durante 48 horas. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con un fluorocromo para el análisis de citometría de flujo, y se detectaron IFN-γ y granzima B en los sobrenadantes del cultivo con un kit ELISA.

Análisis farmacocinético del anticuerpo monoclonal anti-hHE4

Para modelar el comportamiento farmacocinético del anticuerpo anti-hHE4 totalmente humanizado in vivo, se administró una sola dosis de anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #10 por inyección en la vena de la cola a ratones C57BL/6 (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. Se recolectaron muestras de sangre en los puntos de tiempo indicados después de la inyección (0, 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168 h, 336 h y 504 h) mediante punción retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. Se permitió que las muestras de sangre coagularan a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 3000 × g durante 10 minutos para obtener suero, que se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de suero del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 se cuantificaron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Brevemente, se recubrieron placas de pocillos de 96 pocillos de alta unión durante la noche a 4 °C con proteína hHE4-Fc recombinante (0,2 μg por pocillo). Después de bloquear con 5% de BSA en PBS, se agregaron muestras de suero diluidas (1:10000) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP, seguido del desarrollo del sustrato TMB y la medición de la absorbancia a 450 nm. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon en función de una curva estándar generada utilizando anticuerpo monoclonal anti-hHE4 purificado del clon #10.

Los parámetros farmacocinéticos, incluida la concentración máxima en suero (Cmax), la vida media de eliminación (t1/2) y el tiempo de residencia medio (MRT), se estimaron utilizando un análisis no compartimental con el software GraphPad Prism o Phoenix WinNonlin.

Modelos de tumores de ratón con sistema inmunitario humanizado

Los modelos de xenoinjerto de ratón PBMC-humanizados se establecieron como se describió anteriormente para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 en la fase preclínica.^[71] Brevemente, después de una semana de adaptación al entorno, se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho ratones c-NKG (hembras, de 8 semanas de edad) con una suspensión de células tumorales-PBMC que contenía 5 × 106 células NCI-H358 (o OVCAR3) y 3,0 × 105 PBMC. A partir del día 3 después de la inoculación, se administró por vía peritoneal a los ratones c-NKG portadores de tumores 10 mg/kg/ratón de anticuerpos monoclonales anti-hHE4 o el control de isotipo IgG2a cada dos días, un total de cuatro veces. Al día siguiente de la última administración, se sometieron los ratones a una eutanasia humanitaria mediante un procedimiento estandarizado, y se resecaron los tejidos tumorales, se pesaron y se procesaron para el análisis de citometría de flujo.

Análisis bioinformático

Aquí, utilizamos Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA), un servidor interactivo en línea que integra datos de perfilamiento de expresión génica del Cancer Genome Atlas (TCGA) y los proyectos Genotype-Tissue Expression (GTEx), para analizar y verificar la expresión génica de HE4 en LUAD, cáncer de ovario, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de páncreas y cáncer de vejiga (http://gepia2.cancer-pku.cn/index.html).^[72] La respuesta clínica de los pacientes con LUAD con alta o baja expresión de HE4 a los inhibidores del punto de control inmunitario se predijo mediante la puntuación de disfunción y exclusión tumoral (TIDE), un marco computacional desarrollado para evaluar el potencial de escape inmunitario tumoral a partir de los perfiles de expresión génica de las muestras de cáncer (http://tide.dfci.harvard.edu/query/).^[73]

Preparación de proteínas recombinantes murinas y humanas

Se adquirieron plásmidos que contenían el ADN complementario de longitud completa de HE4 de ratón y humano, pcDNA3.1-mHE4-Flag y pcDNA3.1-hHE4-Flag, de Youbio BioTech Co. (Changsha, China). Los plásmidos se amplificaron en E. coli DH5α, se purificaron mediante un kit de medio de plásmidos libre de endo y se transfectaron en células 293 F mediante el reactivo de transfección FectoPRO según el protocolo del fabricante. Después de 7 a 10 días de cultivo, las proteínas recombinantes marcadas con Flag, mHE4-Flag o hHE4-Flag, se purificaron por afinidad a partir del sobrenadante mediante agarosa conjugada con anti-Flag (#2058ES08, Yeasen BioTech, Shanghái, China). Para la producción de proteínas marcadas con Fc, se amplificaron fragmentos de ADN que codifican hHE4 (aa 31-123) o mHE4 (aa 26-174) mediante PCR, se subclonaron posteriormente y se insertaron en el vector modificado pINFUSE-hIgG-Fc con un péptido de señal IL-2. Después de la transfección en células 293 F como se describió anteriormente, la proteína HE4 marcada con Fc (HE4-Fc) se purificó por afinidad con resina de proteína G según el protocolo del fabricante (L10029, GenScript BioTech, Naning, China). Además, los fragmentos extracelulares de IFN-γR1 o IFN-γR2 de ratón se insertaron en el vector pcDNA3.1+C-His (pcDNA3.1-Ifngr1-His y pcDNA3.1-Ifngr2-His, respectivamente). Los plásmidos se transfectaron posteriormente en células 293 F. Las proteínas IFN-γR1 o IFN-γR2 marcadas con His se purificaron por afinidad con resina Ni-TED según el protocolo del fabricante (L00885, GenScript BioTech, Nankín, China). Los productos eluidos se sometieron a cuatro rondas de intercambio de tampón con PBS frío mediante ultrafiltración y se concentraron a la concentración adecuada. Las purezas de las proteínas recombinantes se analizaron mediante Western blot o SDS-PAGE con tinción azul de Coomassie. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Estimulación celular

Para determinar si HE4 desencadena la regulación al alza de PD-L1, se sembraron células Raw264.7 o BMDM en placas de 12 pocillos a una densidad de 5 × 105/pocillo. Luego, las células se trataron con la concentración indicada de proteína recombinante HE4 en Opti-MEM durante 3 horas (para Western blot y qPCR en tiempo real) o 12 horas (para citometría de flujo e inmunoblot). Para evaluar el efecto de HE4 sobre la expresión de PD-L1 en diferentes subconjuntos de macrófagos, las células Raw264.7 se diferenciaron en macrófagos similares a M1 con 300 ng/mL de LPS más 20 ng/mL de IFN-γ durante 24 horas, o se diferenciaron en macrófagos similares a M2 con 50 ng/mL de IL-4 durante 48 horas, seguido de la estimulación con proteína recombinante HE4 durante 12 horas. Las células mononucleares humanas THP-1 se estimularon con 100 ng/mL de PMA durante 48 horas para permitir que se diferenciaran en macrófagos antes del tratamiento. El pretratamiento con los inhibidores se realizó durante 1 hora antes de la estimulación con HE4.

Producción y purificación de anticuerpos anti-HE4

Los anticuerpos monoclonales anti-HE4 de ratón y anti-HE4 de ratón se generaron mediante AtaGenix Laboratories Co., Ltd. (Wuhan, China). Brevemente, se inmunizaron ratones (o ratones) con mHE4-Fc (aa26-174) o hHE4-Fc (aa31-123) cuatro veces. Las suspensiones de células individuales de esplenocitos inmunizados se fusionaron posteriormente con células de mieloma de ratón sp2/0 mediante glicol de polietileno (p7181, Sigma‒Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los hibridomas se seleccionaron en un medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), seguido de dos rondas de clonación por dilución limitante para establecer líneas celulares monoclonales. El hibridoma monoclonal se mantuvo en un medio RPMI-1640 libre de suero durante 5 días, y los sobrenadantes se recolectaron y se probaron mediante ELISA para la especificidad del antígeno (Tabla S2). Los hibridomas específicos de HE4 se mantuvieron en un medio específico libre de suero (NC0301, YoCon, Beijing, China) y se amplificaron en un incubador de agitación de CO2 para producir anticuerpos monoclonales en grandes cantidades. Después de la cultivación masiva durante 7 a 10 días, los medios de cultivo se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. Los anticuerpos se aislaron del sobrenadante mediante resina de proteína G y luego se eluyeron con un tampón de glicina-HCl 0,1 M (pH = 2,7). Los eluídos se ultrafiltraron cuatro veces con PBS frío y se concentraron a la concentración adecuada. Se realizó tinción azul de Coomassie en SDS-PAGE para evaluar la pureza de los productos eluidos. Se almacenaron alícuotas a −20 °C para experimentos posteriores.

Para evaluar si la administración del anticuerpo monoclonal anti-HE4 causaba eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario, se inyectó el anticuerpo monoclonal anti-HE4 (200 μg/ratón, n = 10) por vía intraperitoneal cada tres días durante 21 días en ratones A/J machos de tipo salvaje de 10 semanas de edad. Además, como controles, se inyectó en los ratones un anticuerpo monoclonal isotipo IgG2a de rata (n = 10) o un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 (n = 9). Durante el período de tratamiento, se recogió suero de cada ratón para la cuantificación por ELISA de los niveles de IL-6, IFN-γ y las enzimas hepáticas ALT y AST. Se recolectaron tejidos, incluidos el corazón, los pulmones, el hígado y el colon, para su evaluación histológica.

Análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Se realizaron experimentos de resonancia plasmónica de superficie (SPR) utilizando un sistema WeSPR 100 equipado con chips sensores de oro carboxilados (G10031), siguiendo las instrucciones del fabricante (XLement, Shanghái, China), para evaluar cuantitativamente las afinidades de unión de las interacciones antígeno-anticuerpo y receptor-ligando. En resumen, los chips sensores se activaron utilizando NHS (0,1 M) y EDC (0,4 M) recién preparados en tampón MES (pH = 6,0) a 37 °C durante 30 minutos, seguido de un lavado exhaustivo con agua ultrapura y un breve secado. Para los análisis de interacción receptor-ligando, se diluyó IFNGR1-His recombinante a 30 μg/mL en tampón MES (pH 4,5) y se inmovilizó en la superficie del chip activado (6 μL por pocillo) mediante incubación durante la noche a 4 °C. Para los análisis de interacción antígeno-anticuerpo, se diluyeron y se inmovilizaron de manera similar las proteínas HE4-Fc o proteínas de control Fc. Al día siguiente, se eliminó la solución residual mediante toques suaves y se bloqueó la superficie del chip con 150 μL de tampón de bloqueo proporcionado con el kit a 37 °C durante 1 hora. Después de dos lavados con tampón de dilución, se realizaron los análisis de unión utilizando el módulo de análisis de afinidad según el flujo de trabajo estándar de adquisición y ajuste. La cinética de unión se analizó utilizando el software de análisis WeSPR.

Transducción con lentivirus para la inactivación o sobreexpresión de genes

El ADN complementario completo de HE4 de ratón (NM_026323.2) se insertó en el vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro (pCDH-HE4) o pLVX-CMV-puro (pLVX-HE4) para generar un lentivirus para la expresión ectópica. Para la producción de lentivirus, el plásmido recombinante pCDH-HE4 o pLVX-HE4 (6 μg), el plásmido de empaquetamiento pAX2 (3 μg) y el plásmido de envoltura VSV-G (3 μg) se preincubaron con polietilenimina (30 μg) en Opti-MEM durante 15 minutos y luego se añadieron a células HEK293T (80% de densidad en placas de 6 cm). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 48 horas después de la transfección, se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm y se suplementaron con 8 μg/mL de polibreno antes de usarse para infectar las células LLC e ID8. Los plásmidos pCDH-puro o pLVX-puro vacíos se utilizaron como controles. Después de 72 horas de incubación, se eliminaron las células no infectadas con puromicina (5 μg/mL) durante 7 días. Las poblaciones supervivientes se expandieron para validar la expresión de HE4 mediante qPCR en tiempo real y Western blot.

Para la inactivación de genes, los ARN guía (gARN) de los genes diana se diseñaron mediante el servidor en línea CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Los oligonucleótidos de sentido y antisentido se unieron mediante un termociclador, se fosforilaron con quinasa de polinucleótido T4 y se ligaron en un vector pLenti-CRISPRv2-GFP digerido con BsmBI mediante ligasa de ADN T4. La producción de lentivirus se realizó según el protocolo mencionado anteriormente. Las partículas virales se enriquecieron mediante ultrafiltración, se suspendieron en medio completo fresco que contenía 8 μg/mL de polibreno y se añadieron a las células diana. Después de una incubación de 24 horas, el medio se reemplazó con medio completo fresco y luego se incubó durante 48 horas. Las células GFP-positivas se clasificaron individualmente mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) en placas de 96 pocillos (es decir, una célula por pocillo). Las poblaciones clonales se expandieron y la eficiencia de inactivación de cada gen se verificó mediante Western blot.

Modelos de tumores sinérgicos murinos

Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices éticas pertinentes y fueron aprobados por el Departamento del Comité de Ética del Hospital del Pueblo Provincial de Sichuan, Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China. Las células cancerosas se recogieron en la fase de crecimiento logarítmico, se lavaron con PBS preenfriado 1 × y se resuspendieron en solución salina a una densidad celular adecuada. Se establecieron modelos de tumores subcutáneos inoculando MC38 (1 × 106/150 μL) o LLC (2 × 106/150 μL) en el flanco derecho de ratones C57BL/6. Las células 4T1 (2 × 106/100 μL) se implantaron en los cojinetes de grasa mamaria de ratones BALB/c para establecer un modelo de cáncer de mama ortotópico. Las células HGS-1 (1 × 106 células en 10 μL por ovario) se implantaron bilateralmente en los ovarios de ratones C57BL/6 para establecer un modelo de cáncer de ovario. El diámetro largo (L, mm) y el diámetro corto (W, mm) de los tejidos tumorales se midieron con calibradores cada dos días, y el volumen tumoral se calculó mediante la siguiente fórmula: (L∗W∗W)/2 (mm3). Al final de los experimentos, los ratones se sometieron a una eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado de la siguiente manera: los ratones se colocaron en una cámara de eutanasia designada y se realizó la eutanasia con CO2 introduciendo gradualmente dióxido de carbono en la cámara durante 10 minutos para garantizar una transición pacífica. Después de la eutanasia con CO2, cada ratón se sometió a una dislocación cervical para confirmar la pérdida irreversible de la conciencia y la muerte, de acuerdo con las directrices veterinarias aceptadas. Los tejidos tumorales se resecaron y se pesaron. El volumen y el peso del tumor sirvieron como las métricas primarias de los modelos de tumor subcutáneo y ortotópico. Las células ID8 (2 × 106/200 μL) se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones C57BL/6 para establecer un modelo de metástasis peritoneal del cáncer de ovario. En el punto final del experimento (aproximadamente 40 días), se recogió el líquido ascítico y se cuantificó. El volumen del líquido ascítico sirvió como la métrica primaria del modelo de metástasis peritoneal ID8. De acuerdo con las directrices éticas, los ratones se sacrificaron una vez que el volumen del tumor alcanzó los 2 cm3 o si se produjeron úlceras.

Para evaluar los efectos de la expresión de HE4 en el crecimiento tumoral in vivo, las células LLC e ID8 con inactivación o sobreexpresión de HE4 se inocularon por vía subcutánea e intraperitoneal en ratones C57BL/6, respectivamente. En paralelo, la misma cantidad de células LLC e ID8 infectadas con lentivirus que contenía un vector vacío se incubaron con ratones de control.

Para imitar el papel de los fragmentos de HE4 extracelular en el crecimiento tumoral, se inocularon MC38 (1 × 106/150 μL) o células LLC con inactivación de HE4 (2 × 106/150 μL) en el flanco derecho de ratones C57BL/6. La proteína recombinante HE4-Fc o la proteína Fc (2,5 mg/kg de peso corporal) se administraron por vía intraperitoneal cada dos días hasta el punto final del experimento. Cabe destacar que las proteínas HE4-Fc y Fc se administraron un día antes de la inoculación de células tumorales en el modelo LLC o 3 días después de la inoculación en el modelo MC38. Se registraron los tamaños de los tumores diariamente. En el punto final del experimento, se extirparon los tumores intactos, se pesaron y se digirieron enzimáticamente en suspensiones de células individuales para experimentos posteriores.

Se administraron anticuerpos monoclonales contra HE4 (anticuerpos anti-HE4) a ratones con tumores para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 in vivo. La administración de anticuerpos se inició a partir del día 4 después de la inoculación (células ID8 o HGS-1), o cuando el volumen de los tumores subcutáneos (LLC o MC38) u ortotópicos (4T1) alcanzó los 50–100 mm3. Los anticuerpos anti-HE4 o el control de IgG isotípico (10 mg/kg de peso corporal) se administraron por inyección intraperitoneal cada dos días, seis veces en total. En el punto final del experimento, se recogieron el líquido ascítico o los tejidos tumorales para experimentos posteriores.

Para evaluar los efectos antitumorales coordinados de los anticuerpos anti-HE4 y anti-CTLA-4, se trató a ratones con tumores LLC una vez que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente los 50–100 mm3. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de anticuerpo monoclonal anti-mHE4 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (5 mg/kg), administrados solos o en combinación.

Se evaluaron los efectos antitumorales sinérgicos de la neutralización de HE4 combinada con la quimioterapia. Específicamente, cuando los volúmenes de los tumores LLC subcutáneos alcanzaron los 50 a 100 mm3, se administraron anticuerpos anti-HE4 (5 mg/kg) por vía intraperitoneal cada dos días durante un total de 6 dosis. Al mismo tiempo, se administró paclitaxel (10 mg/kg) por vía intraperitoneal cada 4 días hasta el punto final del experimento. Para el modelo peritoneal ID8, se administraron anticuerpos anti-HE4 el día 4 después de la inoculación de células ID8, seis veces en total. La administración de paclitaxel se inició el día 7, tres veces a intervalos semanales. Se utilizaron IgG unidas a isótopos y vehículo como controles para la administración de anticuerpos anti-mHE4 y paclitaxel, respectivamente. Se controlaron los resultados de supervivencia de cada ratón durante el período de estudio y se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para analizar la eficacia del tratamiento.

Depleción de células T CD8+ y macrófagos in vivo

Para la depleción de células T CD8+ in vivo, se administraron anticuerpos anti-CD8α (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal a partir del día de la inoculación de LLC (día 0) y se administraron cada dos días hasta que se sacrificaron los animales. Se recogieron los bazo y se disociaron en suspensiones de células individuales, y la frecuencia de las células T CD8+ se cuantificó mediante análisis citométrico de flujo (CD3+/CD8α+). Para la depleción de macrófagos in vivo, se administraron anticuerpos anti-CSF1R (20 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal antes de la inoculación de LLC durante una semana, con dosis continuas cada 3 días durante el estudio. Se extirparon los tejidos tumorales, se digirieron enzimáticamente en suspensiones de células individuales y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de macrófagos (CD45+/CD11b+/F4/80+).

Modelos de cáncer de pulmón inducido por uretano

Se indujo cáncer de pulmón primario de células no pequeñas en ratones FVB mediante inyecciones intraperitoneales semanales de uretano (1 mg/g de peso corporal, disuelto en solución salina estéril). Después de seis semanas de tratamiento con uretano, se administraron por vía intraperitoneal a los ratones anticuerpos anti-HE4 o control de IgG unidas a isótopos (10 mg/kg de peso corporal, cada dos días) 6 veces. La administración de anticuerpos se realizó nuevamente de las semanas 12 a 14. En el punto final del experimento (semana 18), se sometieron a eutanasia humana mediante un procedimiento estandarizado y se extirparon los tejidos pulmonares. El lóbulo pulmonar más grande se procesó para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y se cuantificó el número de nódulos tumorales visibles.

Tinción inmunohistoquímica y puntuación

Se evaluó la expresión de HE4 en los tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica. En resumen, las secciones de tumores incluidos en parafina se desparafinaron, se rehidrataron y se sumergieron en solución de tampón de citrato de sodio (10 mM, pH = 6,0) a 95 °C durante 30 minutos. Antes de la incubación con el anticuerpo primario, las secciones de tejido se trataron secuencialmente con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS 1 × durante 20 minutos y se bloquearon con PBS que contenía 5% de suero de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 hora. Luego, las láminas se incubaron con los anticuerpos indicados a 4 °C durante la noche, seguidos de la incubación con el anticuerpo secundario recombinante de polímero HRP de cabra anti-ratón/conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales positivas de los objetivos se visualizaron con sustratos DAB y los núcleos se contrateñeron con hematoxilina. En paralelo, se evaluó la especificidad del anticuerpo primario incubando las muestras con 50 μg de proteína recombinante HE4-Fc a 4 °C durante 1 hora antes de agregarlas a las secciones. Se utilizó un sistema de puntuación semicuantitativo para evaluar el nivel de expresión de HE4, como se describió anteriormente.^[65] En resumen, las imágenes teñidas se puntuaron por intensidad (1: débil; 2, moderada; 3, fuerte) y porcentaje de células positivas (1: 0–25%; 2: 26–50%; 3: 51–75%; 4: 76–100%) mediante un protocolo doble ciego. La puntuación de inmunohistoquímica final de cada sección se calculó como el producto de la intensidad y el porcentaje.

Western blot

Para el Western blot, las células cultivadas y los tejidos se lisaron en un tampón de carga para SDS-PAGE que contenía 100 μM de ditiotreitol (DTT), y los lisados celulares resultantes se sometieron a sonicación para reducir la viscosidad. Las proteínas solubles en los sobrenadantes del cultivo se precipitaron con metanol y cloroformo, según se describió previamente.^[66] Los pellets resultantes se disolvieron en un tampón de carga para SDS-PAGE que contenía DTT. Todas las muestras se hirvieron durante 5 minutos, y cantidades iguales de proteína se separaron electroforéticamente y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada en PBS que contenía un 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 hora. Después de incubarlas con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante la noche, las membranas se lavaron con PBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron mediante un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (BG0001, BioGround, Chongqing, China). Las imágenes se capturaron mediante un sistema de imagen de quimioluminiscencia (Clinx, Shanghái, China) para su posterior análisis.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real

Tras los tratamientos indicados, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se extrajo el ARN total mediante un kit E.Z.N.A. Total RNA Kit I (D6915-04, Omega Biotek, Norcross, Georgia, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Cantidades iguales de ARN se transcribieron inversamente a ADNc mediante la transcriptasa inversa Hiscript III (R302-01, Vazyme, Naning, China). El ADNc resultante se sometió a PCR en tiempo real utilizando la mezcla maestra SYBR Green qPCR (Q311, Vazyme). Se utilizaron el β-actina de ratón y el GAPDH humano como controles internos, y los niveles de expresión relativa de los genes se calcularon mediante el método 2−ΔΔCT.^[67]

Ensayo de unión proteína-célula

Las células RAW264.7 y las células THP-1 diferenciadas con PMA (1 × 105) se incubaron con 5 μg de proteína HE4-Flag o HE4-Fc a 37 °C durante 2 horas, y cantidades iguales de péptidos 3 × Flag o Fc sirvieron como controles negativos. A continuación, las células se fijaron con un 2% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios anti-Flag o anti-Fc conjugados con Alexa Fluor-488 o PE durante 30 minutos sobre hielo. Las células teñidas se lavaron una vez con tampón FACS (5% de BSA en PBS) y luego se sometieron a análisis de citometría de flujo.

Ensayo de unión proteína-proteína in vitro

Para investigar si HE4 interactúa directamente con IFN-γR1 e IFN-γR2, se diluyeron 2 μg de proteínas recombinantes de HE4-Flag, IFN-γR1-His o IFN-γR2-His en un tampón de unión (20 mM de fosfato, pH 7,4; 200 mM de NaCl; 2 mM de EDTA; 5% de glicerol; 0,2% de NP-40 y cóctel de inhibidores de proteasas) y se incubaron a 4 °C durante 4 horas, seguido de una incubación adicional con 30 μL de Ni-TED o agarosa conjugada con anti-Flag durante 2 horas. Las cuentas se lavaron tres veces con un tampón de alta sal y luego se resuspendieron en un tampón de carga para SDS-PAGE para el análisis de inmunoblotting.

Para determinar si HE4 compite con IFN-γ por la unión a IFN-γR1 e IFN-γR2, se incubaron 2 μg de IFN-γR1-His e IFN-γR2-His con 30 μL de resina Ni-TED a 4 °C durante 2 horas. La mezcla resultante se lavó tres veces con un tampón de alta sal y luego se incubó con las cantidades indicadas de proteínas recombinantes de HE4-Flag e IFN-γ durante 2 horas adicionales. Después de tres lavados, la resina resultante se resuspendió en un tampón de carga para SDS-PAGE para el análisis de inmunoblotting.

Para determinar la concentración inhibidora media (IC50) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #117, realizamos un ELISA competitivo para evaluar su capacidad para bloquear la interacción entre mHE4-Fc y el receptor IFNGR1. Brevemente, la proteína recombinante mIFNGR1-His (0,2 μg en 100 μL por pocillo) se recubrió en placas de 96 pocillos de alta unión y se incubó durante la noche a 4 °C. mHE4-Fc (0,3 μg en 100 μL por pocillo) se preincubó con concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 #117 a 4 °C durante 1 hora antes de agregarlo a las placas, que se habían bloqueado con un 5% de BSA. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, se agregó un anticuerpo anti-Fc conjugado con HRP y se incubó durante 1 hora adicional. Luego, las placas se lavaron cuatro veces con PBST, seguido de la adición del sustrato TMB. La reacción se detuvo con la solución de detención y se midió la absorbancia en consecuencia.

Citometría de flujo

Se analizaron las abundancias de células T, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y células que expresan PD-L1 dentro del microambiente tumoral mediante citometría de flujo. Para los tumores subcutáneos u ortotópicos, los tejidos tumorales se disociaron mecánicamente y se digirieron en un tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 minutos. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales y luego se lavaron con PBS frío. Para el modelo peritoneal ID8, el ascitis se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos y los pellets se lavaron con PBS frío y luego se incubaron con un tampón de lisis de glóbulos rojos sobre hielo durante 5 minutos. Las células se lavaron con PBS frío dos veces y se resuspendieron en un tampón FACS para experimentos posteriores. Las células vivas y muertas se distinguieron mediante un kit de viabilidad fijable Zombie Violet según el protocolo del fabricante. Las células se preincubaron con TruStain FcX a 4 °C durante 15 minutos para bloquear los receptores Fc, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos a 4 °C durante 30 minutos. Luego, las células se fijaron con un 2% de paraformaldehído (PFA) a temperatura ambiente durante 15 minutos y se resuspendieron en un tampón FACS para el análisis. Para la tinción intracelular, las células se incubaron con un cóctel de estimulación celular (1:1000) durante 3 horas a 37 °C, seguido del bloqueo con TruStain FcX y la tinción superficial. Luego, las células fijadas con PFA se permeabilizaron con un tampón de tinción de Foxp3/factor de transcripción (#00-5523-00, eBioscience) y se incubaron con los anticuerpos apropiados sobre hielo durante 30 minutos, seguido del análisis por citometría de flujo.

Para evaluar si HE4 aumenta la expresión de PD-L1, las células RAW264.7 o las células THP-1 diferenciadas con PMA se trataron con proteína recombinante de HE4 según lo indicado. Luego, las células se recolectaron y se lavaron con PBS 1× frío, seguido de la tinción para distinguir las células vivas/muertas. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con fluorocromo sobre hielo durante 30 minutos y se fijaron con un 2% de PFA para la citometría de flujo. Los datos se adquirieron mediante un sistema de citometría de flujo NovoCyte Quanteon (Agilent) y se analizaron con el software FlowJo V10 (BD Biosciences).

Secuenciación de ARN de una sola célula

Se recolectaron tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes pareados de dos pacientes con LUAD inmediatamente después de la resección quirúrgica. Los tejidos se enjuagaron tres veces con PBS frío para eliminar los coágulos de sangre y luego se picaron sobre hielo. El bloque de tejido se incubó con una solución de digestión compuesta por un 0,25% de tripsina y 10 μg/mL de DNasa I a 37 °C con agitación a 50 rpm durante 30 minutos. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y luego a través de un tamiz de 40 μm nuevamente, y el filtrado se recolectó en un nuevo tubo de centrífuga. El pellet celular se resuspendió en 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. Luego, se agregaron 10 mL de PBS preenfriado y la mezcla se centrifugó a 250 × g durante 5 minutos. El pellet celular se resuspendió en PBS que contenía un 0,5% de FBS. Las células se tiñeron con un 0,4% de AO/PI para evaluar la viabilidad celular. Se realizó la captura de células individuales de 10x Genomics, la construcción de bibliotecas de Illumina, el preprocesamiento de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula, la integración, la reducción de dimensionalidad y la agrupación por Capital Biotech (Pekín, China). En resumen, el software CellRanger se utilizó para alinear y anotar las lecturas de secuenciación con el ensamblaje del genoma de referencia humano GRCh38.p13, con anotaciones de genes derivadas de GENCODE v34, para generar matrices de conteo de genes-células. Después de la alineación, la información del código de barras, incluida la información del código de barras que identifica las células y los identificadores moleculares únicos (UMI), se procesó y analizó en R (versión 3.6.0) utilizando el paquete R Seurat (versión 4.0.0).^[68] Las células cuyo número de genes era inferior a 200, o cuyo número de genes se clasificó en el 1% superior, o cuya proporción de genes mitocondriales fue superior al 25%, se consideraron anormales y se eliminaron. Después del filtrado, se retuvieron las células de alta calidad para su posterior análisis. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad y se realizó la visualización de datos utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) y la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP).

Los grupos se anotaron para diferentes tipos de células en función de la expresión de los marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/)^[69] y la expresión génica diferencial (DEG), según se describió previamente.^[70] Los datos de ARN de una sola célula se visualizaron mediante Loupe Browser (v8.1.2) y se analizaron los perfiles de expresión de los genes de interés en diferentes grupos de células. Se realizó un análisis de InferCNV para estratificar las células epiteliales (EPCAM+) en subconjuntos epiteliales malignos y no malignos, con las células CD3+ T utilizadas como población normal de referencia, para analizar aún más la expresión diferencial de los genes entre las células epiteliales malignas y normales. Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298300.

También se realizó la secuenciación de ARN de una sola célula para evaluar los impactos de la neutralización de HE4 en el microambiente inmunitario tumoral. Los tumores subcutáneos de LLC se recolectaron el día después de la última administración de los anticuerpos monoclonales. Los tejidos se picaron sobre hielo y luego se digirieron a 37 °C con una velocidad de agitación de 50 rpm o 30 minutos. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y luego a través de un tamiz de 40 μm nuevamente, y el filtrado se recolectó en un nuevo tubo de centrífuga. El pellet celular se resuspendió en solución de lisis de glóbulos rojos y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. El pellet celular se lavó y se resuspendió en PBS que contenía un 0,5% de FBS, seguido de la evaluación de la viabilidad celular. Luego, las muestras se enviaron a Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghái, China), para una secuenciación y un análisis bioinformático adicionales. En resumen, la construcción de la biblioteca se realizó según el protocolo del fabricante (DNBelab C TaiM4 V3.0) y se cuantificó mediante un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2100 y un ensayo de ADN de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China). Las lecturas de la plataforma MGI DNBSEQ-T7 se procesaron mediante la canalización dnbc4tools v2.1.2 con parámetros predeterminados y recomendados. Los archivos FASTQ generados a partir de la salida de la secuenciación DNBSEQ se alinearon con el ensamblaje del genoma Mus musculus GRCm38.p6, versión M_25, utilizando el algoritmo STAR. A continuación, se generaron matrices de código de barras de genes para cada muestra individual contando los UMI y filtrando los códigos de barras no asociados a las células. Finalmente, generamos una matriz de código de barras de genes que contiene las células con código de barras y los conteos de expresión génica. Esta salida se importó luego al kit de herramientas R Seurat v4.1.1 para el control de calidad y el análisis posterior. En particular, los genes expresados en menos de tres células, las células con menos de cincuenta genes detectados y las células con porcentajes de genes mitocondriales superiores al 5% se excluyeron del análisis posterior. Anotamos los grupos para diferentes tipos de células en función de la expresión de los marcadores celulares canónicos (http://117.50.127.228/CellMarker/).^[69] Los datos sin procesar se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE304155.

Secuenciación de ARN masiva y análisis

Se realizó un análisis transcriptómico exhaustivo para comparar la transcripción génica en macrófagos después de la estimulación con HE4 e IFN-γ. En resumen, las células Raw264.7 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y luego se estimularon con HE4-Fc (20 μg/mL) o IFN-γ (100 ng/mL) durante 3 h. Después de lavar dos veces con PBS frío, se extrajo el ARN total y se transcribió a cDNA. La construcción de la biblioteca y la secuenciación se llevaron a cabo mediante la plataforma MGI DNBSEQ-T7 (MGI-Tech, Shenzhen, China) en Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). Los datos de secuenciación se analizaron mediante una plataforma en línea (https://cloud.majorbio.com/). Se enumeran los genes regulados al alza por HE4-Fc (en comparación con la estimulación con Fc) o IFN-γ (en comparación con el vehículo). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG para comparar sistemáticamente las vías de señalización moduladas por HE4 e IFN-γ. Los datos brutos se enviaron a la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE298587.

Ensayo de proliferación celular

Para investigar si la proteína extracelular HE4 promueve la proliferación celular, las células ID8 o LLC, con o sin la eliminación de HE4, se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células por pocillo. Se añadió proteína HE4 recombinante o anticuerpos monoclonales anti-HE4 al medio de cultivo a las concentraciones indicadas. A las 0, 24, 48 y 72 h después del tratamiento, se añadió el reactivo CCK-8 a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm después de una incubación de 1 h a 37 °C. La tasa de proliferación relativa de las células se calculó normalizando los valores de absorbancia en cada punto temporal a los valores de referencia.

Detección de citocinas

En el punto final del experimento, se recogió sangre de cada ratón y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para separar el suero. Los tejidos tumorales de las células LLC, MC38 y 4T1 se pesaron, se picaron y luego se cultivaron en placas de 24 pocillos con 1 mL de medio RPMI-1640 sin suero suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina durante 24 h. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de la centrifugación a 5000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron inmediatamente a -80 °C. Las concentraciones medidas de cada citocina en los sobrenadantes de cultivo tumoral se normalizaron al peso del tejido tumoral (pg/g de tumor). Para el modelo peritoneal ID8, se cuantificó el líquido ascítico y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes. Los niveles de IFN-γ, IL-6, TNF-α y HE4 en el suero, el sobrenadante de cultivo y el líquido ascítico se midieron mediante kits ELISA comerciales según las instrucciones del fabricante. Para la medición de citocinas humanas, después de incubar una suspensión de una sola célula de LUAD con HE4-Flag o anticuerpos monoclonales anti-HE4 durante 48 h, se recogió el sobrenadante de cultivo y se diluyó 5 veces para el ELISA. Los kits ELISA para el ratón IFN-γ (#430804), el humano IFN-γ (#430104) y el ratón TNF-α (#430904) se compraron a BioLegend. Los kits ELISA para el ratón HE4 (CSB-EL026092MO), el humano HE4 (CSB-E12923h) y la granzima B humana (CSB-E08718h) se compraron a Cusabio (Wuhan, China). El kit ELISA para la cTnI del ratón (SEKM-0153) se compró a Solarbio. El kit ELISA para la granzima B del ratón (E-EL-M0594) y el kit ELISA para el ligando de la tirosina quinasa 3 similar a FMS (FLT3L) (E-EL-M0030) se compraron a Elabscience (Wuhan, China). El kit ELISA para la proteína C reactiva (CRP) del ratón (PC186) y el kit de ensayo de creatinina Amplex Red (S0291S) se compraron a Beyotime. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT/GPT) y aspartato aminotransferasa (AST/GOT) en suero se midieron con kits de ensayo de actividad (E-BC-K235-S, E-BC-K236-M) según los protocolos estándar (Elabscience).

Predicción de las interacciones proteína-proteína mediante AlphaFold 3

La predicción de la estructura de la proteína se realizó mediante el servidor web AlphaFold 3 (https://alphafoldserver.com/). Brevemente, para investigar el modo de unión y las interfaces de interacción específicas entre HE4 y los receptores IFNGR1 e IFNGR2, se utilizó la proteína HE4 madura del ratón (aa26-174) y los dominios extracelulares de IFNGR1 (aa26-254) e IFNGR2 (aa20-262) para iniciar la predicción. Además, para examinar más a fondo la especificidad del anticuerpo monoclonal anti-HE4, se secuenciaron las regiones pesadas variables (VH) y las regiones ligeras variables (VL) del anticuerpo monoclonal anti-mHE4 (clon #117) y del anticuerpo monoclonal anti-hHE4 (clon #10), y la proteína HE4 de longitud completa junto con las secuencias VH y VL se sometieron a la predicción de la estructura utilizando AlphaFold3. Una puntuación de modelado de plantilla predicha (pTM) superior a 0,5 indicó una alta confianza en el modelo estructural general, mientras que una puntuación de PTM de interfaz (ipTM) superior a 0,6 sugirió una alta fiabilidad de la interfaz de interacción proteica predicha. Los resultados de la predicción se descargaron y se sometieron a un análisis adicional mediante el software PyMOL.

En PyMOL, se cargó el archivo "model_0.cif" y se analizaron los sitios de interacción proteína-proteína mediante una serie de comandos. El análisis implicó tres pasos principales: etiquetar diferentes cadenas de proteínas, identificar las posibles regiones de interacción entre las proteínas y seleccionar los residuos dentro de una distancia de interacción de 4 Å para la visualización.

Preparación de suspensiones de muestras de cáncer humano y tratamiento

Se picaron los tejidos tumorales frescos de pacientes con LUAD y se digirieron en tampón FACS que contenía 2 mg/mL de colagenasa IV y 0,2 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 40 minutos. Las células digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm y luego se resuspendieron en un medio RPMI-1640 al 10% para experimentos posteriores. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de proteína HE4 recombinante (hHE4-Flag) o anticuerpos monoclonales anti-hHE4 a 37 °C durante 48 h. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado con fluorocromo para el análisis de citometría de flujo, y se detectaron la IFN-γ y la granzima B en los sobrenadantes de cultivo con un kit ELISA.

Análisis farmacocinético del anticuerpo monoclonal anti-hHE4

Para modelar el comportamiento farmacocinético del anticuerpo anti-hHE4 totalmente humanizado in vivo, se administró una sola dosis de anticuerpo monoclonal anti-mHE4 del clon #10 por inyección en la vena de la cola a ratones C57BL/6 (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. Se recogieron muestras de sangre en los puntos temporales indicados después de la inyección (0, 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168 h, 336 h y 504 h) mediante sangrado retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. Se dejó que las muestras de sangre coagularan a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 3000 × g durante 10 minutos para obtener suero, que se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-hHE4 en suero se cuantificaron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Brevemente, se recubrieron placas de pocillos de 96 pocillos de alta unión durante la noche a 4 °C con proteína recombinante hHE4-Fc (0,2 μg por pocillo). Después de bloquear con BSA al 5% en PBS, se añadieron muestras de suero diluidas (1:10000) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG del ratón conjugado con HRP, seguido del desarrollo del sustrato TMB y la medición de la absorbancia a 450 nm. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon basándose en una curva estándar generada utilizando anticuerpo monoclonal anti-hHE4 purificado del clon #10.

Los parámetros farmacocinéticos, incluidos la concentración máxima en suero (Cmax), la vida media de eliminación (t1/2) y el tiempo de residencia medio (MRT), se estimaron utilizando un análisis no compartimental con el software GraphPad Prism o Phoenix WinNonlin.

Modelos de ratón humanizado del sistema inmunitario con tumores

Los modelos de xenoinjerto de ratón PBMC humanizados se establecieron como se describió anteriormente para evaluar la eficacia antitumoral de la neutralización de HE4 en un entorno preclínico.^[71] Brevemente, después de una semana de adaptación al entorno, se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho ratones c-NKG (hembras, de 8 semanas de edad) con una suspensión de células tumorales-PBMC que contenía 5 × 106 células NCI-H358 (o OVCAR3) y 3,0 × 105 PBMC. A partir del día 3 después de la inoculación, se administró por vía peritoneal a los ratones c-NKG portadores de tumores 10 mg/kg/ratón de anticuerpos monoclonales anti-hHE4 o el control de isotipo IgG2a cada dos días, un total de cuatro veces. Al día siguiente de la última administración, se sometieron los ratones a una eutanasia humanitaria mediante un procedimiento estandarizado, y se resecaron los tejidos tumorales, se pesaron y se procesaron para el análisis de citometría de flujo.

Análisis bioinformático

Aquí, utilizamos Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA), un servidor interactivo en línea que integra datos de perfilado de expresión génica del Cancer Genome Atlas (TCGA) y los proyectos Genotype-Tissue Expression (GTEx), para analizar y verificar la expresión génica de HE4 en LUAD, cáncer de ovario, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de páncreas y cáncer de vejiga (http://gepia2.cancer-pku.cn/index.html).^[72] Se predijo la respuesta clínica de los pacientes con LUAD con alta o baja expresión de HE4 a los inhibidores del punto de control inmunitario mediante la puntuación de disfunción y exclusión tumoral (TIDE), un marco computacional desarrollado para evaluar el potencial de escape inmunitario tumoral a partir de los perfiles de expresión génica de las muestras de cáncer (http://tide.dfci.harvard.edu/query/).^[73]

Cuantificación y análisis estadístico

Los experimentos in vitro se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Los experimentos con animales se repitieron al menos dos veces de forma independiente. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) y se analizaron con GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). La significación estadística de las comparaciones múltiples se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la corrección post hoc de Bonferroni, y se utilizó una prueba t de Student de dos colas para las comparaciones de dos grupos. Cuando se compararon múltiples grupos con una segunda variable, por ejemplo, a lo largo del tiempo, se realizó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Sidak. Las curvas de supervivencia se compararon mediante la prueba de rango logarítmico (prueba de Mantel-Cox). Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.