La inducción microbiana de la expresión de MHC-II en las células de cáncer de colon supera la resistencia a la inmunoterapia y limita la metástasis.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad por cáncer, impulsado principalmente por la enfermedad metastásica que es refractaria a las terapias estándar ([Shiels et al., 2025]; [Siegel et al., 2026a]; [Siegel et al., 2026b]). Aunque el bloqueo de los puntos de control inmunitario ha producido beneficios duraderos en el CCR con deficiencia en la reparación del apareamiento (dMMR) y con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), la mayoría de los CCR son competentes en la reparación del apareamiento y estables en los microsatélites (MSS), y las etapas avanzadas de este subconjunto de la enfermedad obtienen pocos beneficios de las modalidades actuales de inmunoterapia basadas en PD-1 o CTLA-4 ([Le et al., 2015]; [Sharma et al., 2023]). Los esfuerzos clínicos para extender el bloqueo de los puntos de control al CCR metastásico MSS hasta ahora han mostrado una eficacia limitada, lo que subraya la necesidad de identificar mecanismos que conviertan los tumores con poca inflamación en lesiones capaces de sustentar una inmunidad antitumoral productiva ([Eng et al., 2019]; [Sharma et al., 2023]). Los estudios experimentales sugieren además que la resistencia en el CCR MSS no se explica simplemente por una ausencia completa de antígenos tumorales; más bien, estos tumores pueden albergar neoantígenos clonales, pero no logran sustentar una activación eficiente de las células T, lo que permite una evasión inmunitaria temprana ([Westcott et al., 2021]).

La microbiota intestinal ha surgido como un importante regulador de la inmunidad antitumoral y de la respuesta al bloqueo de los puntos de control inmunitario en entornos preclínicos y clínicos ([Baruch et al., 2021]; [Daillere et al., 2016]; [Davar et al., 2021]; [Gopalakrishnan et al., 2018]; [Lee et al., 2022]; [Matson et al., 2018]; [McCulloch et al., 2022]; [Routy et al., 2018]; [Sivan et al., 2015]; [Vetizou et al., 2015]). Se demostró que la colonización con Helicobacter hepaticus promueve la inmunidad antitumoral dependiente de las células T foliculares CD4+ y de las células B, junto con la formación de estructuras linfoides terciarias, lo que establece que los organismos comensales definidos pueden remodelar las respuestas inmunitarias locales en un modelo de cáncer de colon asociado a la colitis ([Overacre-Delgoffe et al., 2021]). Al mismo tiempo, los efectos de las especies de Helicobacter dependen del contexto. En otros entornos, la infección por Helicobacter se ha relacionado con la inflamación intestinal crónica, la mutagénesis y la tumorigénesis colorrectal, lo que subraya que las consecuencias de estas interacciones huésped-microbio dependen de la especie, el estado inmunitario del huésped y el contexto de la enfermedad ([Fox et al., 2011]; [Ge et al., 2019]). Sin embargo, la mayoría de los trabajos en esta área se han centrado en las células presentadoras de antígenos profesionales, la organización linfoide o los efectos dependientes de las citocinas en el compartimento inmunitario. Si las señales derivadas de la microbiota también actúan directamente sobre las células epiteliales malignas en el CCR establecido para alterar la presentación de antígenos, la progresión metastásica y la capacidad de respuesta terapéutica, aún no está claro.

Un posible vínculo entre las señales microbianas y la inmunogenicidad de las células cancerosas es el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II). Previamente demostramos que la expresión de MHC-II en las células epiteliales intestinales está regulada por un microbioma intestinal que contiene Helicobacter y que la pérdida de MHC-II epitelial promueve la tumorigénesis intestinal, lo que apoya un papel de la presentación de antígenos epiteliales en la vigilancia inmunitaria en las etapas tempranas de la enfermedad ([Beyaz et al., 2021]). En otros entornos tumorales, la expresión forzada de MHC-II impulsada por CIITA en las células cancerosas puede activar directamente las células T CD4+ ingenuas, y la expresión intrínseca de MHC-II en las células cancerosas se ha asociado con respuestas inmunitarias favorables y mejores resultados en múltiples cánceres, incluido el melanoma, el linfoma, el cáncer colorrectal, el cáncer de mama y, más recientemente, el cáncer endometrial humano ([Bou Nasser Eddine et al., 2017]; [Cho et al., 2021]; [Chung et al., 2026]; [Forero et al., 2016]; [Johnson et al., 2016]; [Riaz et al., 2017]; [Rodig et al., 2018]; [Roemer et al., 2018]). Al mismo tiempo, el MHC-II de las células tumorales no es uniformemente protector. En la metástasis en los ganglios linfáticos del cáncer de mama, el MHC-II de las células cancerosas promueve la expansión de las células T reguladoras y la progresión metastásica ([Lei et al., 2023]). Además, el MHC-II específico del tumor también puede sustentar la resistencia adaptativa a través de su función como ligando para el receptor co-inhibitorio de las células T LAG-3, lo que indica que el resultado de esta vía depende del contexto tisular y del estado inmunitario ([Johnson et al., 2018]). Por lo tanto, en el CCR, aún no se ha determinado si la regulación dependiente de la microbiota del MHC-II epitelial persiste después de la transformación maligna, si el MHC-II de las células cancerosas sustenta la inmunidad productiva o la tolerancia en los tumores establecidos, y si este eje influye en la diseminación metastásica y la respuesta al bloqueo de los puntos de control inmunitario.

Aquí, identificamos un mecanismo dependiente del microbioma que restaura la expresión de MHC-II en las células cancerosas de colon y convierte el CCR MSS refractario a la inmunidad en un estado inmunológicamente más receptivo. Utilizando modelos de CCR ortotópicos y genéticamente definidos y sistemas de cocultivo inmunitario de organoides derivados de pacientes humanos autólogos, demostramos que el microbioma que contiene Helicobacter induce la expresión de MHC-II en las células cancerosas, lo que promueve la inmunidad antitumoral contra el CCR MSS. El MHC-II intrínseco a las células cancerosas es necesario para los efectos antitumorales del microbioma y, cuando se refuerza, es suficiente para fenocopiar parcialmente la protección microbiana y sensibilizar los tumores MSS al bloqueo de los puntos de control inmunitario. Estos hallazgos definen un eje de presentación de antígenos microbio-cáncer como un determinante mecanísticamente accionable de la vigilancia inmunitaria y la respuesta a la inmunoterapia en el CCR MSS.

RESULTADOS

El microbioma intestinal que contiene especies de Helicobacter limita la progresión y la metástasis del CCR

Para probar si un microbioma intestinal que contiene Helicobacter modula la progresión del CCR, utilizamos un modelo de implantación ortotópica guiado por endoscopia que permite la evaluación longitudinal del crecimiento tumoral en la mucosa colónica. Utilizando la línea celular MC38, un modelo de CCR sinérgico hipermutado y similar a MSI-H en ratones C57BL/6, observamos una reducción significativa de la carga tumoral primaria en los ratones colonizados con Helicobacter (H+) en comparación con los controles negativos para Helicobacter (H−), según lo medido por colonoscopia y actividad de la luciferasa (Figura S1A-E). La incidencia de metástasis también se redujo en los ratones H+ (Figura S1F-G). Estos efectos antitumorales se reprodujeron en un entorno sinérgico independiente utilizando los tumores CT26 en ratones BALB/c (Figura S1H-K), lo que indica que los efectos antitumorales del microbioma H+ se generalizan en diferentes cepas de huésped y modelos tumorales.

Dado que las líneas celulares 2D trasplantadas no capturan completamente la genética, la histopatología y el comportamiento metastásico del CCR humano, particularmente la predominancia del subtipo MSS evasivo del sistema inmunitario, a continuación, evaluamos modelos de CCR ortotópicos basados en organoides genéticamente definidos ([Roper et al., 2017]). La implantación de organoides genéticamente modificados Apcnull, KrasG12D, Tp53null (AKP) en el colon conduce a la formación de tumores que modelan fielmente el CCR MSS ([Roper et al., 2017]; [Westcott et al., 2021]). La colonización con H+ atenuó el crecimiento tumoral de AKP y la metástasis (Figura 1A-D, S1L, M), lo que resultó en una prolongación de la supervivencia general en los ratones (Figura 1E).

A continuación, preguntamos si la colonización con Helicobacter podría restringir un modelo MSS más agresivo y evasivo del sistema inmunitario con una mayor competencia metastásica. Los ratones implantados ortotópicamente con organoides genéticamente modificados AKPS (ApcKnock-down, KrasG12D, Tp53null, Smad4null), desarrollan tumores MSS agresivos y evasivos del sistema inmunitario que eventualmente metastatizan al hígado y otros sitios con mayor frecuencia ([Roper et al., 2017]; [Westcott et al., 2021]). En este modelo, encontramos que la colonización con Helicobacter restringe el crecimiento tumoral primario (Figura 1F-G) y, sorprendentemente, previno la metástasis (Figura 1H-I), lo que condujo a una ventaja de supervivencia significativa en los ratones H+ (Figura 1J). En conjunto, estos datos identifican una flora asociada a Helicobacter que restringe tanto la progresión tumoral como la metástasis en cuatro modelos diferentes de CCR que abarcan distintos contextos genéticos e inmunológicos en dos cepas de ratones diferentes.

La colonización con especies individuales de Helicobacter restringe parcialmente la progresión y la metástasis del CCR

Previamente encontramos que la comunidad H+ contiene especies de Helicobacter H. typhlonius o H. mastomyrinus ([Beyaz et al., 2021]). Para determinar si las especies individuales de Helicobacter identificadas en la comunidad H+ son suficientes para restringir la progresión tumoral, inoculamos ratones H− con H. typhlonius o H. mastomyrinus, confirmamos la colonización exitosa (Figura S2A-G) y luego implantamos ortotópicamente organoides AKPS. La colonización con cualquiera de las dos especies redujo la carga tumoral primaria y la incidencia de metástasis (Figura S2H-J) y mejoró la supervivencia en relación con los controles H− (Figura S2K). Sin embargo, estos efectos fueron consistentemente menos pronunciados que los observados después de la transferencia de la flora completa. Estos hallazgos indican que las especies individuales de Helicobacter pueden conferir una protección parcial, mientras que pueden ser necesarios constituyentes microbianos adicionales o interacciones comunitarias cooperativas para los efectos protectores completos de la transferencia de la flora completa.

Para determinar si la actividad antimetastásica que observamos refleja una propiedad a nivel de género más amplia de Helicobacter, evaluamos especies adicionales de Helicobacter que no se detectaron en la flora H+. Inoculamos ratones H− con H. bilis, H. pullorum o H. hepaticus y evaluamos la diseminación metastásica después de la implantación ortotópica de tumores AKPS. En contraste con la flora H+, la colonización con estas especies no redujo la incidencia de metástasis (Figura S2L). En conjunto, estos datos indican que la supresión de la progresión metastásica no es una característica universal de la colonización por Helicobacter en ratones.

La colonización con Helicobacter mejora la infiltración de linfocitos intratumorales y los programas efectores

Los linfocitos infiltrantes tumorales están fuertemente asociados con resultados favorables en el CCR ([Galon et al., 2006]), y los comensales definidos pueden aumentar la infiltración inmunitaria intratumoral para promover la inmunidad antitumoral ([Sivan et al., 2015]; [Vetizou et al., 2015]). Coherente con la mejora de la supervivencia observada en los animales H+, la colonización con Helicobacter aumentó la infiltración de células T CD8+ intratumorales en el modelo AKPS, según lo evaluado por inmunofluorescencia (Figura 2A, B). Observamos un aumento similar en la acumulación de células T CD8+ en el modelo más inmunogénico MC38 (Figura S3A, B), lo que indica que el microbioma asociado a Helicobacter promueve la infiltración de células T en los modelos de CCR tanto de la enfermedad MSS como de la MSI-H.

Para definir cómo la colonización por Helicobacter remodela el microambiente tumoral-inmune con mayor resolución, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula en fracciones CD45+ y CD45− obtenidas mediante clasificación por FACS de tumores AKPS disociados enzimáticamente, recolectados 21 días después de la implantación ortotópica en ratones H+ y H−. Después del control de calidad, analizamos el compartimento CD45+ mediante agrupamiento no supervisado y anotamos las poblaciones inmunes utilizando marcadores de linaje canónicos (Figura S4A, B). La representación general de los principales linajes inmunes fue ampliamente similar entre los grupos. Sin embargo, los tumores H+ mostraron cambios en la composición, incluyendo un aumento de las poblaciones de macrófagos y monocitos, y un enriquecimiento de los estados del linaje B, principalmente células B plasmáticas (Figura 2C). Dentro del compartimento de células T, la colonización por Helicobacter se asoció con la inducción coordinada de programas de tráfico y efectores. Las células T CD8+ intratumorales de los tumores H+ mostraron firmas de quimiotaxis más altas y una mayor expresión de Ccl5 (Figura 2D, E), una quimiocina implicada en los programas de infiltración de células T en el tumor ([Topper et al., 2023]). Las células T CD8+ en los tumores H+ también exhibieron puntuaciones de efector más altas junto con una mayor expresión de Gzma (Figura 2F, G), lo que es consistente con una mayor diferenciación citotóxica. Las células T CD4+ demostraron de manera similar un aumento de las firmas de quimiotaxis y una mayor expresión de Cxcr6 (Figura 2H, I), un receptor de quimiocinas relacionado con la localización intratumoral y la persistencia de las células T ([Di Pilato et al., 2021]). Esto se acompañó de un aumento de las puntuaciones de efector de CD4 y una mayor expresión de transcritos inflamatorios y citotóxicos, incluyendo Il17a, Tnf y Gzma (Figura 2J, K).

A continuación, utilizamos el modelo MC38 como un sistema ortogonal para probar si los cambios en el estado inmune observados en los tumores AKPS se conservaban. La secuenciación de ARN de una sola célula de MC38 recapitula las características clave observadas en AKPS, con tumores H+ enriquecidos en plasmablastos (Figura S4C-E) y células T con una tendencia hacia la diferenciación efectora (Figura S5A-C). Específicamente, las células T CD8+ citotóxicas exhibieron puntuaciones de genes de citotoxicidad más altas con mayor expresión de Gzma/Gzmb y una reducción de la expresión asociada con el agotamiento, Pdcd1/Lag3 (Figura S5A-C). Las células T CD4+ mostraron niveles más altos de transcritos asociados con efectores (Il18r1, Jun, Slamf6) junto con una mayor expresión de Cxcr6 (Figura S5D). Estos hallazgos demuestran que la colonización por Helicobacter se asocia con una mejora conservada de la infiltración de células T intratumorales y los programas de efectores en los modelos de CCRC.

Las células T, las células B y las células Cxcr6+ son necesarias para el control tumoral mediado por el microbioma

Los análisis de secuenciación de ARN de una sola célula revelaron programas de quimiotaxis y efectores mejorados en las células T CD4+ y CD8+ de los tumores H+, acompañados de una expansión de las poblaciones de células B maduras, incluyendo las células B plasmáticas, en los modelos AKPS y MC38. Estas observaciones sugirieron la posibilidad de que las células inmunes adaptativas contribuyan directamente a la restricción de la progresión y la metástasis del tumor asociada al microbioma. Para determinar si las células linfocíticas adaptativas son necesarias para el control tumoral mediado por el microbioma, agotamos las células T (CD4+ y CD8+) o las células B (CD19+ y B220+) en ratones H+ que presentaban tumores AKPS. El agotamiento de las células T resultó en un aumento marcado de la incidencia de metástasis y una reducción significativa de la supervivencia en comparación con los controles H+ no agotados (Figura 3A, B). De manera similar, el agotamiento de las células B aumentó la carga metastásica y acortó la supervivencia en relación con los controles H+ (Figura 3A, B). En conjunto, estos resultados indican que tanto las células T como las células B contribuyen a la restricción de la progresión metastásica asociada al microbioma.

Para evaluar aún más el papel de la inmunidad adaptativa, evaluamos la progresión tumoral y la metástasis en modelos de ratón inmunodeficientes en condiciones H+, incluyendo NSG (sin células T, B y NK), Nude (sin células T) y Rag2 KO (sin células T y B). La pérdida de los componentes de la inmunidad adaptativa disminuyó el control de la metástasis y el beneficio para la supervivencia del microbioma H+ en estos modelos (Figura 3C-D). El efecto antimetastásico persistente en los ratones Rag2 KO probablemente refleja una vigilancia mediada por las células NK que se conserva contra la metástasis (Figura 3D).

En paralelo, nuestro análisis de secuenciación de ARN de una sola célula identificó una expresión consistentemente elevada de Cxcr6 en las células T CD4+ de los tumores H+ en ambos modelos, AKPS y MC38 (Figura 2I, Figura S5D). Dada la asociación establecida de Cxcr6 con el posicionamiento de las células T de memoria residentes en los tejidos dentro de los tumores ([Di Pilato et al., 2021]), probamos su relevancia funcional implantando los organoides AKPS en ratones deficientes en Cxcr6 en condiciones H+. La deficiencia de Cxcr6 resultó en un aumento de la incidencia de metástasis y una reducción de la supervivencia en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura 3E-F), lo que indica que las células Cxcr6+ contribuyen a la restricción de la progresión tumoral y la metástasis mediada por el microbioma. En conjunto, estos resultados demuestran que los efectos protectores del microbioma H+ requieren respuestas inmunes adaptativas coordinadas, incluyendo tanto las células T como las células B, y las células de memoria residentes en los tejidos asociadas a Cxcr6+.

La colonización por Helicobacter mejora la activación de las células T

Dado que la infiltración tumoral efectiva y la actividad citotóxica requieren una activación adecuada de las células T dentro de los ganglios linfáticos que drenan el tumor (dLN), a continuación, preguntamos si la colonización por Helicobacter mejora la activación de las células T específicas del tumor. Para evaluar directamente el potencial de activación de las células T CD8+, implantamos organoides AKPS que expresan bajos niveles del péptido ovalbúmina SIINFEKL (AKPS loSIIN ([Westcott et al., 2021])) en ratones H− y H+, con el establecimiento de la colonización microbiana 7 días antes de la implantación del tumor. Las respuestas de las células T se analizaron mediante citometría de flujo a los días 7 y 14 después de la implantación del tumor. En un momento temprano (día 7), los ratones H+ exhibieron una expansión pronunciada de las células T CD8+ en el dLN, acompañada de un aumento del número de células T CD4+, lo que es consistente con una activación mejorada en los órganos linfoides secundarios (Figura S6A-B). Esta expansión temprana precedió a un aumento significativo de la acumulación de células T CD8+ dentro de los tumores al día 14 (Figura S6C-D), lo que indica una progresión temporal desde la activación en los ganglios linfáticos hasta la acumulación de efectores intratumorales.

Dado que la magnitud de la activación de las células T efectoras se refleja en la expansión de las células T específicas del antígeno que expresan citocinas y moléculas citolíticas, incluyendo la granzima B (GzmB), IFNγ y TNFα, ([Westcott et al., 2021]), a continuación, evaluamos la diferenciación funcional de las células T en ratones con tumores AKPS. En el dLN, los ratones con tumores H+ mostraron un aumento del número de células T CD8+ específicas del antígeno que expresan Gzmb, IFNγ (Figura 4A-B) y TNFα (Figura S6E) en ambos momentos, días 7 y 14. De manera similar, las células T CD4+ que expresan GzmB, IFNγ (Figura 4C-D) y TNFα (Figura S6F) se enriquecieron en el dLN de los ratones con tumores H+. De acuerdo con este fenotipo de activación temprana, los ratones H+ exhibieron una mayor acumulación de células T CD8+ citotóxicas específicas del tumor dentro de los tumores. Coherente con los programas de efectores observados en los ganglios linfáticos que drenan el tumor, las células T CD8+ específicas del antígeno dentro de los tumores de los ratones H+ también exhibieron una mayor expresión de Gzmb, IFNγ (Figura 4E-F) y TNFα (Figura S6G) en los días 7 y 14. En particular, las células T CD4+ que expresan GzmB, IFNγ (Figura 4G-H) y TNFα (Figura S6H) también se enriquecieron significativamente en los tumores H+, lo que indica la inducción de un programa transcripcional citotóxico dentro del compartimento de las células T CD4+ en el contexto de la colonización por Helicobacter.

La expresión de MHC-II en el tumor es necesaria y suficiente para los efectos antitumorales mediados por el microbioma

A continuación, preguntamos si la presencia de especies de Helicobacter en el microbioma modula la expresión de MHC-II en las células cancerosas. Para abordar esto, revisamos nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula y examinamos los grupos no inmunes (CD45−) dentro de los tumores AKPS y MC38 (Figura S7A-D). Las células tumorales de los ratones H+ en ambos modelos exhibieron un aumento significativo de los genes asociados con el MHC (Figura 5A-B; Figura S7E-H), lo que se reflejó en niveles elevados de proteínas de MHC (Figura 5C-D; Figura S7I-J).

A continuación, probamos si el MHC-II intratumoral media la inmunidad antitumoral microbiana. Para abolir selectivamente el MHC-II tumoral preservando la regulación al alza del MHC-I, generamos un organoide AKPS deficiente en CIITA (CIITA KO). Como se esperaba, los organoides CIITA KO regularon al alza el MHC-I, pero no el MHC-II, en respuesta al IFNγ (Figura S8A-B). La implantación de tumores CIITA KO en ratones H+ resultó en un aumento del volumen tumoral (Figura 5E-G), un aumento de la metástasis (Figura 5H) y una reducción de la supervivencia (Figura 5I) en comparación con los tumores parentales. El análisis de inmunofluorescencia demostró una reducción de la infiltración de células T CD3+ en los tumores CIITA KO (Figura 5J-K), acompañada de una pérdida de la actividad de la vía del MHC-II en las células tumorales, lo que se refleja en una reducción de la tinción de CD74 (Figura 5L). En conjunto, estos hallazgos indican que el MHC-II intratumoral es necesario para la inmunidad antitumoral mediada por el microbioma.

Basándonos en la necesidad de MHC-II intrínseco a las células tumorales en el entorno H+, a continuación, preguntamos si el MHC-II tumoral por sí solo es suficiente para restringir la progresión y la metástasis del tumor, en ausencia de la colonización microbiana. Con este fin, generamos un organoide AKPS con una expresión elevada de CIITA (CIITA OE). Los organoides AKPS CIITA OE mostraron una expresión significativamente alta de MHC-II en ausencia de estímulos externos, como el IFNγ (Figura S8C-D). Utilizando los organoides CIITA OE y los organoides AKPS parentales, evaluamos si la expresión forzada del MHC-II intrínseco al tumor confiere actividad antitumoral en ratones H−. Nuestros resultados demostraron que la sobreexpresión de MHC-II redujo significativamente el volumen tumoral (Figura 6A-C) y la tasa de metástasis (Figura 6D). Sin embargo, estas reducciones no resultaron en una mejora significativa de la supervivencia general (Figura 6E), lo que indica que el MHC-II tumoral es suficiente para restringir parcialmente la progresión y la metástasis del tumor, pero no recapitula completamente el beneficio para la supervivencia asociado con la colonización por el microbioma H+. Los tumores derivados de los organoides CIITA OE contenían un mayor número de células T intratumorales mediante el análisis de inmunofluorescencia (Figura 6F-G) junto con una mayor expresión de MHC-II en las células tumorales, lo que se refleja en la tinción de CD74 (Figura 6H). En conjunto, estos datos demuestran que la expresión intrínseca de MHC-II en las células tumorales promueve la presencia de células T intratumorales y contribuye a la restricción del crecimiento tumoral y la metástasis, y que la expresión forzada de MHC-II en las células cancerosas es suficiente para conferir una actividad antitumoral parcial incluso en ausencia de la colonización por Helicobacter.

Los efectos antitumorales mediados por el MHC-II requieren el tráfico de células inmunes desde los ganglios linfáticos

Nuestros datos muestran que la regulación al alza del MHC-II tumoral inducida por el microbioma mejora la activación de las células T, aumenta las células inmunes infiltrantes en el tumor, reduce la carga tumoral y disminuye la incidencia de metástasis. Estos hallazgos sugieren que los efectos antitumorales del MHC-II en las células cancerosas dependen de una activación efectiva de las células inmunes dentro de los ganglios linfáticos que drenan el tumor y del tráfico posterior al microambiente tumoral. Para probar esto, implantamos organoides AKPS de tipo salvaje o sobreexpresores de CIITA (CIITA OE) y tratamos a los ratones con un vehículo o FTY720, un inhibidor de la salida de linfocitos de los ganglios linfáticos. La carga tumoral en los tumores CIITA OE tratados con FTY720 fue comparable a los controles CIITA WT, lo que indica que la expresión elevada de MHC-II en las células tumorales por sí sola no es suficiente para restringir el crecimiento tumoral cuando se inhibe el tráfico de las células inmunes desde los ganglios linfáticos (Figura S8E-H).

La colonización por Helicobacter después de la implantación del tumor restringe la metástasis

Inspirados en los efectos antitumores mediados por el microbioma observados en nuestros modelos preclínicos, evaluamos a continuación si la colonización por Helicobacter podría ejercer un beneficio terapéutico cuando se introduce después del establecimiento del tumor. Se implantaron organoides AKPS en ratones H− y, una vez confirmados los tumores en el día 7, la mitad de los ratones fueron posteriormente inoculados con flora H+. Si bien la colonización por H+ después de la implantación del tumor ralentizó el crecimiento tumoral en 3 semanas en comparación con los controles, no redujo la carga tumoral al final del estudio (Figura S9A-D), pero resultó en una reducción significativa en la incidencia de metástasis (Figura S9E) y mejoró la supervivencia libre de metástasis (Figura S9F), aunque la supervivencia general no se alteró significativamente (Figura S9G). Estos datos indican que la colonización por Helicobacter después del establecimiento del tumor puede restringir la metástasis.

Aumentar la expresión de MHC-II en el cáncer mejora la eficacia de la inmunoterapia en el CRC MSS

A continuación, investigamos si la modulación de la expresión de MHC-II intrínseca al tumor, inducida ya sea mediante la colonización por Helicobacter o la sobreexpresión de CIITA, podría mejorar la respuesta de los tumores MSS al bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB, anti-PD-1 + anti-CTLA-4; Figura 7A). Como se esperaba, el ICB solo no controló el crecimiento tumoral en ratones H−. En cambio, cuando el ICB se combinó con la inoculación de Helicobacter post-tumoral, el crecimiento tumoral se redujo significativamente al final del tratamiento (Figura 7B-D). De manera similar, el crecimiento de los tumores con sobreexpresión de CIITA se restringió en respuesta al ICB en comparación con los controles (Figura 7B-C), lo que indica que el aumento del MHC-II intrínseco al tumor aumenta la sensibilidad de los tumores MSS al ICB. El rechazo tumoral completo fue poco frecuente en los animales de control (10%, 1/10) en el grupo H−, mientras que la tasa de rechazo aumentó al 30% (3/10) en los ratones H+ y al 71% (5/7) en los ratones que presentaban tumores con sobreexpresión de CIITA (Figura 7D). En consonancia con esto, la colonización por Helicobacter o la sobreexpresión de CIITA redujeron significativamente la incidencia de metástasis en comparación con los controles (Figura 7E) y mejoraron la supervivencia (Figura 7F). En conjunto, estos hallazgos demuestran que elevar la expresión de MHC-II en el cáncer aumenta la respuesta a la inmunoterapia.

Aumentar la expresión de MHC-II en el cáncer mejora la inmunidad antitumoral en un sistema de co-cultivo inmunitario de PDO de CRC humano autólogo.

Finalmente, extendimos estos hallazgos al CRC MSS humano utilizando un sistema de co-cultivo de organoides derivados de pacientes (PDO) autólogos en 3 dimensiones (3D) con células inmunitarias. La sobreexpresión de CIITA en una línea de PDO de CRC MSS aumentó significativamente los niveles de expresión de MHC-II en comparación con la línea de PDO WT parental (Figura S10A). Durante un período de co-cultivo de 3 días, las PBMCs autólogas exhibieron una citotoxicidad mínima hacia los PDOs WT, pero eliminaron eficazmente los PDOs con sobreexpresión de CIITA y con niveles elevados de MHC-II. Para visualizar estas interacciones en tiempo real, establecimos un ensayo de imagen de células vivas por microscopía confocal utilizando PDOs humanos en co-cultivo con PBMCs autólogas o células T CD4+ autólogas (Figura 7G, Figura S10B). El aumento de la expresión de MHC-II en las células tumorales de los PDOs con sobreexpresión de CIITA mejoró la colocalización de las PBMCs con las células cancerosas (Figura 7H) y aumentó la apoptosis en los PDOs que interactuaban con las células inmunitarias (Figura 7I). La sobreexpresión de CIITA también aumentó las interacciones entre los PDOs y las células T CD4+ autólogas y promovió la apoptosis en las células cancerosas, aunque estos efectos fueron más modestos que los observados con las PBMCs (Figura 7J-K). En conjunto, estos hallazgos indican que el aumento de la expresión de MHC-II en las células cancerosas mejora la interacción inmune antitumoral en el CRC MSS humano.

Un microbioma intestinal que contiene especies de Helicobacter limita la progresión y la metástasis del CRC

Para probar si un microbioma intestinal que contiene Helicobacter modula la progresión del CRC, utilizamos un modelo de implantación ortotópica guiada por endoscopia que permite la evaluación longitudinal del crecimiento tumoral en la mucosa del colon. Utilizando la línea celular MC38, un modelo de CRC sinérgico similar a MSI-H y altamente mutado en ratones C57BL/6, observamos una reducción significativa en la carga tumoral primaria en ratones colonizados con Helicobacter (H+) en comparación con los controles negativos para Helicobacter (H−), según lo medido por colonoscopia y actividad de la luciferasa (Figura S1A-E). La incidencia de metástasis también se redujo en los ratones H+ (Figura S1F-G). Estos efectos antitumorales se reprodujeron en un entorno sinérgico independiente utilizando los tumores CT26 en ratones BALB/c (Figura S1H-K), lo que indica que los efectos antitumorales del microbioma H+ se generalizan en diferentes cepas de huésped y modelos tumorales.

Dado que las líneas celulares 2D trasplantadas no capturan completamente la genética, la histopatología y el comportamiento metastásico del CRC humano, particularmente la predominancia del subtipo MSS evasor inmunitario, evaluamos a continuación modelos de CRC ortotópicos basados en organoides definidos genéticamente ([Roper et al., 2017]). La implantación de organoides AKPS (Apcnull, KrasG12D, Tp53null) modificados genéticamente en el colon conduce a la formación de tumores que modelan fielmente el CRC MSS ([Roper et al., 2017]; [Westcott et al., 2021]). La colonización por H+ atenuó el crecimiento y la metástasis del tumor AKPS (Figura 1A-D, S1L, M), lo que resultó en una supervivencia general prolongada en los ratones (Figura 1E).

A continuación, investigamos si la colonización por Helicobacter podría restringir un modelo MSS más agresivo y evasor inmunitario con mayor capacidad metastásica. Los ratones implantados ortotópicamente con organoides AKPS (ApcKnock-down, KrasG12D, Tp53null, Smad4null), desarrollan tumores MSS agresivos y evasores inmunitarios que eventualmente metastatizan al hígado y otros sitios con mayor frecuencia ([Roper et al., 2017]; [Westcott et al., 2021]). En este modelo, encontramos que la colonización por Helicobacter restringe el crecimiento tumoral primario (Figura 1F-G) y, notablemente, previno la metástasis (Figura 1H-I), lo que condujo a una ventaja de supervivencia significativa en los ratones H+ (Figura 1J). En conjunto, estos datos identifican una flora del microbioma intestinal asociada a Helicobacter que restringe tanto la progresión tumoral como la metástasis en cuatro modelos diferentes de CRC que abarcan distintos contextos genéticos e inmunológicos en dos cepas de ratones diferentes.

La colonización con especies únicas de Helicobacter restringe parcialmente la progresión y la metástasis del CRC

Anteriormente, encontramos que la comunidad H+ contiene especies de Helicobacter como H. typhlonius o H. mastomyrinus ([Beyaz et al., 2021]). Para determinar si las especies individuales de Helicobacter identificadas en la comunidad H+ son suficientes para restringir la progresión tumoral, inoculamos ratones H− con H. typhlonius o H. mastomyrinus, confirmamos la colonización exitosa (Figura S2A-G) y luego implantamos ortotópicamente organoides AKPS. La colonización con cualquiera de las dos especies redujo la carga tumoral primaria y la incidencia de metástasis (Figura S2H-J) y mejoró la supervivencia en relación con los controles H− (Figura S2K). Sin embargo, estos efectos fueron consistentemente menos pronunciados que los observados después de la transferencia de toda la flora. Estos hallazgos indican que las especies únicas de Helicobacter pueden conferir una protección parcial, mientras que pueden ser necesarios constituyentes microbianos adicionales o interacciones comunitarias cooperativas para los efectos protectores completos de la transferencia de toda la flora.

Para determinar si la actividad antimetastásica que observamos refleja una propiedad a nivel de género más amplia de Helicobacter, evaluamos especies adicionales de Helicobacter que no se detectaron en la flora H+. Inoculamos ratones H− con H. bilis, H. pullorum o H. hepaticus y evaluamos la diseminación metastásica después de la implantación ortotópica de tumores AKPS. En contraste con la flora H+, la colonización con estas especies no redujo la incidencia de metástasis (Figura S2L). En conjunto, estos datos indican que la supresión de la progresión metastásica no es una característica universal de la colonización por Helicobacter en ratones.

La colonización por Helicobacter mejora la infiltración de linfocitos intratumorales y los programas efectores

Los linfocitos infiltrantes tumorales están fuertemente asociados con resultados favorables en el CRC ([Galon et al., 2006]), y los comensales definidos pueden aumentar la infiltración inmune intratumoral para promover la inmunidad antitumoral ([Sivan et al., 2015]; [Vetizou et al., 2015]). En consonancia con la mejora de la supervivencia observada en los animales H+, la colonización por Helicobacter aumentó la infiltración de células T CD8+ intratumorales en el modelo AKPS, según lo evaluado por inmunofluorescencia (Figura 2A, B). Observamos un aumento similar en la acumulación de células T CD8+ en el modelo más inmunogénico MC38 (Figura S3A, B), lo que indica que el microbioma asociado a Helicobacter promueve la infiltración de células T en los modelos de CRC tanto MSS como MSI-H.

Para definir cómo la colonización por Helicobacter remodela el microambiente tumoral inmunitario a mayor resolución, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula en fracciones CD45+ y CD45− clasificadas por FACS a partir de tumores AKPS disociados enzimáticamente recolectados 21 días después de la implantación ortotópica en ratones H+ y H−. Después del control de calidad, analizamos el compartimento CD45+ mediante agrupamiento no supervisado y anotamos las poblaciones inmunitarias utilizando marcadores de linaje canónicos (Figura S4A, B). La representación general de las principales líneas de células inmunitarias fue ampliamente similar entre los grupos. Sin embargo, los tumores H+ mostraron cambios en la composición, incluido el aumento de las poblaciones de macrófagos y monocitos y el enriquecimiento de los estados de la línea B, más notablemente las células B plasmáticas (Figura 2C). Dentro del compartimento de células T, la colonización por Helicobacter se asoció con la inducción coordinada de programas de tráfico y efectores. Las células T CD8+ intratumorales de los tumores H+ mostraron firmas de quimiotaxis más altas y una mayor expresión de Ccl5 (Figura 2D, E), una quimiocina implicada en los programas de infiltración de células T tumorales ([Topper et al., 2023]). Las células T CD8+ en los tumores H+ también exhibieron puntuaciones de efector más altas junto con una mayor expresión de Gzma (Figura 2F, G), lo que es consistente con una mayor diferenciación citotóxica. Las células T CD4+ demostraron de manera similar puntuaciones de quimiotaxis más altas y una mayor expresión de Cxcr6 (Figura 2H, I), un receptor de quimiocinas relacionado con la localización intratumoral y la persistencia de las células T ([Di Pilato et al., 2021]). Esto se acompañó de puntuaciones de efector CD4 más altas y una mayor expresión de transcritos inflamatorios y citotóxicos que incluyen Il17a, Tnf y Gzma (Figura 2J, K).

A continuación, utilizamos el modelo MC38 como un sistema ortogonal para probar si los cambios en el estado inmunitario observados en los tumores AKPS se conservaron. La secuenciación de ARN de una sola célula de MC38 recapitulo características clave observadas en AKPS, con tumores H+ enriquecidos con plasmablastos (Figura S4C-E) y células T sesgadas hacia la diferenciación efectora (Figura S5A-C). Específicamente, las células T CD8+ citotóxicas exhibieron puntuaciones de genes de citotoxicidad más altas con mayor expresión de Gzma/Gzmb y una menor expresión de Pdcd1/Lag3 asociado con el agotamiento (Figura S5A-C). Las células T CD4+ mostraron niveles más altos de transcritos asociados con efectores (Il18r1, Jun, Slamf6) junto con una mayor expresión de Cxcr6 (Figura S5D). Estos hallazgos demuestran que la colonización por Helicobacter se asocia con una mejora conservada de la infiltración de células T intratumorales y los programas efectores en los modelos de CRC.

Las células T, las células B y las células Cxcr6+ son necesarias para el control tumoral mediado por el microbioma.

Los análisis de secuenciación de ARN de célula única revelaron una mayor actividad quimiotáctica y programas efectores en las células T CD4+ y CD8+ de tumores H+, junto con una expansión de las poblaciones de células B maduras, incluidas las células B plasmáticas, tanto en los modelos AKPS como en MC38. Estas observaciones sugirieron la posibilidad de que las células inmunitarias adaptativas contribuyan directamente a la restricción del crecimiento y la metástasis tumoral asociada al microbioma. Para determinar si los linfocitos adaptativos son necesarios para el control tumoral mediado por el microbioma, se eliminaron las células T (CD4+ y CD8+) o las células B (CD19+ y B220+) en ratones H+ que presentaban tumores AKPS. La eliminación de las células T resultó en un aumento marcado de la incidencia de metástasis y una reducción significativa de la supervivencia en comparación con los controles H+ no eliminados (Figura 3A, B). De manera similar, la eliminación de las células B aumentó la carga metastásica y acortó la supervivencia en relación con los controles H+ (Figura 3A, B). En conjunto, estos resultados indican que tanto las células T como las células B contribuyen a la restricción de la progresión metastásica asociada al microbioma.

Para evaluar aún más el papel de la inmunidad adaptativa, evaluamos la progresión tumoral y la metástasis en modelos de ratón inmunodeficientes en condiciones H+, incluidos NSG (sin células T, B y NK), Nude (sin células T) y Rag2 KO (sin células T y B). La pérdida de los componentes de la inmunidad adaptativa disminuyó el control de la metástasis y el beneficio para la supervivencia de la flora H+ en estos modelos (Figura 3C-D). El efecto anti-metastásico persistente en los ratones Rag2 KO probablemente refleja una vigilancia mediada por las células NK contra la metástasis (Figura 3D).

En paralelo, nuestro análisis de secuenciación de ARN de célula única identificó una expresión consistentemente elevada de Cxcr6 en las células T CD4+ de tumores H+ en ambos modelos, AKPS y MC38 (Figura 2I, Figura S5D). Dado que se ha establecido la asociación de Cxcr6 con la ubicación de las células T de memoria residentes en los tejidos dentro de los tumores ([Di Pilato et al., 2021]), probamos su relevancia funcional implantando los organoides AKPS en ratones deficientes en Cxcr6 en condiciones H+. La deficiencia de Cxcr6 resultó en un aumento de la incidencia de metástasis y una reducción de la supervivencia en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura 3E-F), lo que indica que las células Cxcr6+ contribuyen a la restricción de la progresión tumoral y la metástasis mediada por el microbioma. En conjunto, estos resultados demuestran que los efectos protectores del microbioma H+ requieren respuestas inmunitarias adaptativas coordinadas, que incluyen tanto las células T como las células B, y las células Cxcr6+ de memoria residentes en los tejidos.

La colonización por Helicobacter mejora la activación de las células T

Dado que la infiltración tumoral efectiva y la actividad citotóxica requieren una activación adecuada de las células T dentro de los ganglios linfáticos que drenan el tumor (dLN), a continuación, investigamos si la colonización por Helicobacter mejora la activación de las células T específicas del tumor. Para evaluar directamente el potencial de activación de las células T CD8+, implantamos organoides AKPS que expresaban bajos niveles del péptido ovalbúmina SIINFEKL (AKPS loSIIN ([Westcott et al., 2021])) en ratones H− y H+, con el establecimiento de la colonización microbiana 7 días antes de la implantación del tumor. Las respuestas de las células T se analizaron mediante citometría de flujo en los días 7 y 14 después de la implantación del tumor. En un momento temprano (día 7), los ratones H+ exhibieron una expansión pronunciada de las células T CD8+ en el dLN, acompañada de un aumento en el número de células T CD4+, lo que es consistente con una mayor activación en los órganos linfoides secundarios (Figura S6A-B). Esta expansión temprana precedió a un aumento significativo de la acumulación de células T CD8+ dentro de los tumores en el día 14 (Figura S6C-D), lo que indica una progresión temporal desde la activación en los ganglios linfáticos hasta la acumulación efectora intratumoral.

Dado que la magnitud de la activación de las células T efectoras se refleja en la expansión de las células T específicas del antígeno que expresan citocinas y moléculas citolíticas, incluido el granzima B (GzmB), IFNγ y TNFα, ([Westcott et al., 2021]), a continuación, evaluamos la diferenciación funcional de las células T en ratones con tumores AKPS. En el dLN, los ratones con tumores H+ mostraron un aumento en el número de células T CD8+ específicas del antígeno que expresaban Gzmb, IFNγ (Figura 4A-B) y TNFα (Figura S6E) en ambos momentos, días 7 y 14. De manera similar, las células T CD4+ que expresaban GzmB, IFNγ (Figura 4C-D) y TNFα (Figura S6F) se enriquecieron en el dLN de los ratones con tumores H+. En concordancia con este fenotipo de activación temprana, los ratones H+ exhibieron una mayor acumulación de células T CD8+ específicas del tumor citotóxicas dentro de los tumores. Coherente con los programas efectores observados en los ganglios linfáticos que drenan el tumor, las células T CD8+ específicas del antígeno dentro de los tumores de los ratones H+ también exhibieron una mayor expresión de Gzmb, IFNγ (Figura 4E-F) y TNFα (Figura S6G) en los días 7 y 14. Cabe destacar que las células T CD4+ que expresaban GzmB, IFNγ (Figura 4G-H) y TNFα (Figura S6H) también se enriquecieron significativamente en los tumores H+, lo que indica la inducción de un programa transcripcional citotóxico dentro del compartimento de células T CD4+ en el contexto de la colonización por Helicobacter.

La expresión de MHC-II en el tumor es necesaria y suficiente para los efectos anti-tumorales mediados por el microbioma

A continuación, investigamos si la presencia de especies de Helicobacter en el microbioma modula la expresión de MHC-II en las células cancerosas. Para abordar esto, revisamos nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de célula única y examinamos los grupos no inmunitarios (CD45−) dentro de los tumores AKPS y MC38 (Figura S7A-D). Las células tumorales de los ratones H+ en ambos modelos exhibieron un aumento significativo en los genes asociados a MHC (Figura 5A-B; Figura S7E-H), lo que se reflejó en niveles elevados de proteínas MHC (Figura 5C-D; Figura S7I-J).

A continuación, probamos si el MHC-II intratumoral media la inmunidad anti-tumoral microbiana. Para abolir selectivamente el MHC-II tumoral preservando la regulación al alza de MHC-I, generamos un organoide AKPS deficiente en CIITA (CIITA KO). Como se esperaba, los organoides CIITA KO regularon al alza el MHC-I, pero no el MHC-II, en respuesta al IFNγ (Figura S8A-B). La implantación de tumores CIITA KO en ratones H+ resultó en un aumento del volumen tumoral (Figura 5E-G), un aumento de la metástasis (Figura 5H) y una reducción de la supervivencia (Figura 5I) en comparación con los tumores parentales. El análisis de inmunofluorescencia demostró una reducción de la infiltración de células T CD3+ en los tumores CIITA KO (Figura 5J-K), acompañada de la pérdida de la actividad de la vía de MHC-II en las células tumorales, lo que se refleja en la reducción de la tinción de CD74 (Figura 5L). En conjunto, estos hallazgos indican que el MHC-II intratumoral es necesario para la inmunidad anti-tumoral mediada por el microbioma.

Basándonos en la necesidad de MHC-II intratumoral en el entorno H+, a continuación, investigamos si el MHC-II tumoral por sí solo es suficiente para restringir la progresión tumoral y la metástasis, en ausencia de colonización microbiana. Con este fin, generamos un organoide AKPS con una expresión elevada de CIITA (CIITA OE). Los organoides AKPS CIITA OE mostraron una expresión significativamente alta de MHC-II en ausencia de estímulos externos, como el IFNγ (Figura S8C-D). Utilizando los organoides CIITA OE y los organoides AKPS parentales, evaluamos si la expresión intratumoral impuesta de MHC-II confiere actividad anti-tumoral en ratones H−. Nuestros resultados demostraron que la sobreexpresión de MHC-II redujo significativamente el volumen tumoral (Figura 6A-C) y la tasa de metástasis (Figura 6D). Sin embargo, estas reducciones no resultaron en una mejora significativa de la supervivencia general (Figura 6E), lo que indica que el MHC-II tumoral es suficiente para restringir parcialmente la progresión tumoral y la metástasis, pero no recapitula completamente el beneficio para la supervivencia asociado a la colonización por el microbioma H+. Los tumores derivados de los organoides CIITA OE contenían un mayor número de células T intratumorales mediante el análisis de inmunofluorescencia (Figura 6F-G), junto con una mayor expresión de MHC-II en las células tumorales, lo que se refleja en la tinción de CD74 (Figura 6H). En conjunto, estos datos demuestran que la expresión intratumoral de MHC-II promueve la presencia de células T intratumorales y contribuye a la restricción del crecimiento tumoral y la metástasis, y que la sobreexpresión impuesta de MHC-II en las células cancerosas es suficiente para conferir una actividad anti-tumoral parcial incluso en ausencia de colonización por Helicobacter.

Los efectos anti-tumorales mediados por MHC-II requieren el tráfico de células inmunitarias desde el ganglio linfático

Nuestros datos muestran que la regulación al alza del MHC-II tumoral inducida por el microbioma mejora la activación de las células T, aumenta las células T infiltrantes en el tumor, reduce la carga tumoral y disminuye la incidencia de metástasis. Estos hallazgos sugieren que los efectos anti-tumorales del MHC-II en las células cancerosas dependen de una activación efectiva de las células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos que drenan el tumor y del tráfico posterior al microambiente tumoral. Para probar esto, implantamos organoides AKPS de tipo salvaje o sobreexpresores de CIITA (CIITA OE) y tratamos a los ratones con un vehículo o FTY720, un inhibidor de la salida de linfocitos de los ganglios linfáticos. La carga tumoral en los tumores CIITA OE tratados con FTY720 fue comparable a los controles CIITA de tipo salvaje, lo que indica que el MHC-II tumoral elevado por sí solo no es suficiente para restringir el crecimiento tumoral cuando se inhibe el tráfico de células inmunitarias desde el ganglio linfático (Figura S8E-H).

La colonización por Helicobacter después de la implantación del tumor restringe la metástasis

Inspirados en los efectos anti-tumorales mediados por el microbioma observados en nuestros modelos preclínicos, a continuación, evaluamos si la colonización por Helicobacter podría ejercer un beneficio terapéutico cuando se introduce después del establecimiento del tumor. Se implantaron organoides AKPS en ratones H− y, una vez que se confirmaron los tumores en el día 7, la mitad de los ratones se inocularon posteriormente con la flora H+. Si bien la colonización H+ después de la implantación del tumor ralentizó el crecimiento tumoral en 3 semanas en comparación con los controles, no redujo la carga tumoral al final del estudio (Figura S9A-D), pero resultó en una reducción significativa de la incidencia de metástasis (Figura S9E) y mejoró la supervivencia libre de metástasis (Figura S9F), aunque la supervivencia general no se alteró significativamente (Figura S9G). Estos datos indican que la colonización por Helicobacter después del establecimiento del tumor puede restringir la metástasis.

Aumentar la expresión de MHC-II en las células cancerosas mejora la eficacia de la inmunoterapia en el CRC MSS

A continuación, investigamos si la modulación de la expresión de MHC-II intratumoral, inducida ya sea por la colonización por Helicobacter o la sobreexpresión de CIITA, podría mejorar la respuesta de los tumores MSS a la inhibición de los puntos de control inmunitario (ICB, anti-PD-1 + anti-CTLA-4; Figura 7A). Como se esperaba, la ICB por sí sola no controló el crecimiento tumoral en ratones H−. En cambio, cuando la ICB se combinó con la inoculación post-tumoral de Helicobacter, el crecimiento tumoral se redujo significativamente al final del tratamiento (Figura 7B-D). De manera similar, el crecimiento de los tumores sobreexpresores de CIITA se restringió en respuesta a la ICB en comparación con los controles (Figura 7B-C), lo que indica que el MHC-II intratumoral aumenta la sensibilidad de los tumores MSS a la ICB. El rechazo tumoral completo fue poco común en los animales de control (10%, 1/10) en el grupo H−, mientras que la tasa de rechazo aumentó al 30% (3/10) en los ratones H+ y al 71% (5/7) en los ratones que presentaban tumores sobreexpresores de CIITA (Figura 7D). En consonancia con esto, la colonización por Helicobacter o la sobreexpresión de CIITA redujeron significativamente la incidencia de metástasis en comparación con los controles (Figura 7E) y mejoraron la supervivencia (Figura 7F). En conjunto, estos hallazgos demuestran que aumentar la expresión de MHC-II en las células cancerosas aumenta la respuesta a la inmunoterapia.

Aumentar la expresión de MHC-II en las células cancerosas mejora la inmunidad anti-tumoral en un sistema de co-cultivo de PDO de CRC humano autólogo y células inmunitarias.

Finalmente, extendimos estos hallazgos al CRC humano MSS utilizando un sistema de co-cultivo de organoides derivados del paciente (PDO) autólogos en 3 dimensiones (3D) con células inmunitarias. La sobreexpresión de CIITA en una línea de PDO de CRC MSS aumentó significativamente los niveles de expresión de MHC-II en comparación con la línea de PDO WT parental (Figura S10A). Durante un período de co-cultivo de 3 días, las PBMCs autólogas mostraron una citotoxicidad mínima hacia los PDOs WT, pero eliminaron eficazmente los PDOs con sobreexpresión de CIITA y con niveles elevados de MHC-II. Para visualizar estas interacciones en tiempo real, establecimos un ensayo de imagen de células vivas por microscopía confocal utilizando PDOs humanos en co-cultivo con PBMCs autólogas o células T CD4+ autólogas (Figura 7G, Figura S10B). El aumento de la expresión de MHC-II en las células tumorales de los PDOs con sobreexpresión de CIITA mejoró la colocalización de las PBMCs con las células cancerosas (Figura 7H) y aumentó la apoptosis en los PDOs que interactuaban con las células inmunitarias (Figura 7I). La sobreexpresión de CIITA también aumentó las interacciones entre los PDOs y las células T CD4+ autólogas y promovió la apoptosis en las células cancerosas, aunque estos efectos fueron más modestos que los observados con las PBMCs (Figura 7J-K). En conjunto, estos hallazgos indican que el aumento de la expresión de MHC-II en las células cancerosas mejora el compromiso inmunitario antitumoral en el CRC humano MSS.

DISCUSIÓN

La mayoría de las muertes por CRC son el resultado de la progresión metastásica, y esta carga clínica recae predominantemente en pacientes con enfermedad MSS, un contexto en el que la inmunoterapia con bloqueo de puntos de control ha mostrado un beneficio limitado ([Canellas-Socias et al., 2024]; [Dekker et al., 2019]; [Eng et al., 2019]; [Le et al., 2015]). En paralelo, los estudios en CRC humano y modelos de ratón sugieren que los tumores MSS no son uniformemente invisibles para el sistema inmunitario, sino que, en cambio, muchos fallan en una etapa temprana de la activación productiva de las células T y el compromiso inmunitario local sostenido ([Galon et al., 2006]; [Mlecnik et al., 2016]; [Westcott et al., 2021]). Nuestro estudio sitúa un programa de presentación de antígenos epiteliales regulado por el microbioma dentro de este marco, al demostrar que un microbioma que contiene Helicobacter induce la expresión de MHC-II en las células cancerosas del colon, mejora la acumulación de células T intratumorales, restringe la progresión y metástasis del tumor y sensibiliza el CRC MSS a la inmunoterapia con bloqueo de puntos de control. Estos hallazgos amplían los modelos actuales de inmunidad antitumoral dependiente de la microbiota más allá de los efectos sobre las células T, las células presentadoras de antígenos profesionales, el entorno de citoquinas, la inmunidad sistémica antitumoral y las estructuras linfoides terciarias ([Baruch et al., 2021]; [Daillere et al., 2016]; [Davar et al., 2021]; [McCulloch et al., 2022]; [Overacre-Delgoffe et al., 2021]; [Routy et al., 2018]; [Sivan et al., 2015]; [Vetizou et al., 2015]). Nuestros resultados añaden una capa mecánica complementaria al demostrar que las señales microbianas pueden actuar directamente sobre el compartimento epitelial maligno, convirtiendo las células tumorales en posibles células presentadoras de antígenos con expresión de MHC-II.

Una implicación central de nuestro trabajo es que el MHC-II del cáncer no es simplemente un correlato pasivo de la exposición a citoquinas inflamatorias, sino un determinante causal de la inmunidad antitumoral en el CRC MSS ([Axelrod et al., 2019]; [Bou Nasser Eddine et al., 2017]; [Cho et al., 2021]; [Johnson et al., 2016]; [Rodig et al., 2018]). En múltiples tipos de tumores, incluido el melanoma, el linfoma, el cáncer de mama y el cáncer de endometrio, la expresión intrínseca de MHC-II en el tumor se ha asociado con estados inmunitarios favorables, mejores resultados clínicos o una mayor respuesta a la inmunoterapia ([Bou Nasser Eddine et al., 2017]; [Cho et al., 2021]; [Chung et al., 2026]; [Forero et al., 2016]; [Rodig et al., 2018]). Los estudios experimentales apoyan aún más la importancia funcional, mostrando que la expresión de MHC-II en las células tumorales promueve la inmunidad antitumoral, activa las células T CD4+ naive y que los neoantígenos restringidos por MHC-II pueden moldear la inmunidad tumoral y la respuesta a la inmunoterapia ([Alspach et al., 2019]; [Beyaz et al., 2021]; [Bou Nasser Eddine et al., 2017]; [Kalaora et al., 2021]; [Marty Pyke et al., 2018]). Coherente con estas observaciones, encontramos aquí que la deleción de CIITA en las células tumorales atenúa la mejora de la inmunidad antitumoral impulsada por los microbios, mientras que la sobreexpresión de CIITA aumenta la acumulación de células T intratumorales, reduce la metástasis y mejora la sensibilidad al bloqueo de puntos de control de la inmunoterapia, incluso en ausencia del estado protector del microbioma.

Al mismo tiempo, nuestros datos refuerzan la idea de que las consecuencias funcionales de la expresión de MHC-II en las células tumorales dependen del contexto en lugar de ser uniformemente beneficiosas en todos los tejidos y estados de la enfermedad ([Axelrod et al., 2019]). En la metástasis del cáncer de mama a los ganglios linfáticos, las células cancerosas que expresan MHC-II pueden promover la tolerancia inmunitaria y la expansión de las células T reguladoras, lo que indica que las consecuencias de la expresión intrínseca de MHC-II en el tumor dependen del ecosistema celular local, los estados de las células T CD4+ que responden y el equilibrio entre las señales estimulantes e inhibitorias ([Johnson et al., 2018]; [Lei et al., 2023]). Nuestros hallazgos postulan que, en el CRC MSS ortotópico bajo una condición de microbioma que apoya la activación inmunitaria, el efecto dominante de la expresión de MHC-II en las células cancerosas es inmunostimulante en lugar de tolerogénico.

Considerados en conjunto con el estudio complementario de Saad et al., nuestros hallazgos respaldan un modelo en el que el resultado de la metástasis en el CRC está determinado en una etapa temprana por la calidad del compromiso inmunitario local en lugar de surgir solo de un colapso inmunitario en etapas tardías ([Saad et al., 2026]; [Westcott et al., 2021]). Saad et al. identifican estados divergentes de las células T en las primeras etapas de la progresión del CRC ortotópico, mientras que nuestro estudio identifica un mecanismo epitelial dependiente del microbioma que puede sesgar esa ventana inmunitaria temprana hacia un control tumoral productivo. Como tal, estos dos estudios son complementarios a nivel mecanístico: uno define las trayectorias de las células T asociadas con la competencia metastásica, mientras que el otro identifica un eje de presentación de antígenos tumor-microbio que puede promover esas trayectorias hacia la vigilancia inmunitaria.

Una de las principales preguntas sin resolver es la identidad de los péptidos presentados por el MHC-II de las células tumorales en este contexto. Este tema se vuelve especialmente interesante a la luz de los trabajos que sugieren que las respuestas de las células T CD4+ antitumorales pueden intersectarse con los antígenos microbianos, la presentación de péptidos bacterianos y la biología de los neoantígenos de MHC-II ([Alspach et al., 2019]; [Kalaora et al., 2021]; [Saad et al., 2026]). No está claro si el MHC-II de las células cancerosas en el CRC presenta antígenos tumorales genuinos, antígenos miméticos con superposición estructural con los epítopos microbianos o un repertorio de ligandos mixtos que permite que la inmunidad tumoral se interconecte con el compartimento de células T CD4+ de la mucosa preexistente. Resolver esta pregunta requerirá inmunopeptidómica directa de MHC-II, reconstrucción de TCR emparejada y validación funcional de los ligandos candidatos en tumores primarios, ganglios linfáticos regionales y lesiones metastásicas.

Otra pregunta abierta es qué poblaciones de linfocitos son más importantes aguas abajo del eje microbioma-MHC-II. Nuestros experimentos de depleción y genética del huésped indican que tanto las células T como las células B contribuyen al fenotipo protector completo, y nuestros análisis de células individuales señalan programas quimiotácticos y efectores mejorados en los compartimentos CD4+ y CD8+ junto con estados de linaje B expandidos en condiciones protectoras del microbioma. Estas observaciones son consistentes con trabajos previos que muestran que las células T foliculares auxiliares específicas de la microbiota y las estructuras linfoides terciarias pueden respaldar la inmunidad antitumoral en el CRC, pero también plantean la posibilidad de que la expresión de MHC-II inducida por los microbios en las células tumorales pueda reforzar varios programas CD4+ distintos, incluidos los programas de ayuda tipo Th1, CD4+ citotóxicos y de apoyo a las células B ([Cui et al., 2021]; [Overacre-Delgoffe et al., 2021]; [Speiser et al., 2023]). Dado que Saad et al. encontraron que el control temprano eficaz se asocia con la diferenciación Th1/citotóxica, mientras que los tumores pro-metastásicos se inclinan hacia estados naive, tipo TfH, Th17 y reguladores ([Saad et al., 2026]; [Westcott et al., 2021]), será importante definir si el MHC-II de las células tumorales refuerza selectivamente los estados CD4+ protectores o aumenta más ampliamente la probabilidad de un compromiso local productivo.

Nuestro estudio también tiene implicaciones traslacionales. El MHC-II de las células tumorales puede representar tanto un biomarcador como un objetivo terapéutico en el CRC MSS. Esto es consistente con estudios previos que sugieren que el MHC-II intrínseco del tumor se asocia con una mayor inmunidad antitumoral ([Cho et al., 2021]; [Chung et al., 2026]; [Johnson et al., 2016]; [Rodig et al., 2018]; [Roemer et al., 2018]). Nuestros datos amplían este concepto al argumentar que la sobreexpresión del MHC-II en las células tumorales puede aumentar activamente la sensibilidad del CRC MSS al bloqueo de PD-1/CTLA-4. Esto plantea la posibilidad de que las estrategias que inducen o estabilizan el MHC-II de las células tumorales, ya sea a través de mecanismos microbianos, de citoquinas o epigenéticos, puedan utilizarse para convertir el CRC MSS resistente a la inmunoterapia en un estado inmunológicamente más receptivo.

El microbioma que contiene Helicobacter en nuestro estudio debe considerarse principalmente como un sistema modelo para el descubrimiento de mecanismos en lugar de como un objetivo terapéutico directo. En nuestros experimentos, los aislados únicos de Helicobacter reprodujeron parte del fenotipo de control tumoral, pero la supresión de la metástasis fue más fuerte con la comunidad transferida más amplia, lo que indica que los efectos cooperativos de la comunidad son importantes. Este punto es particularmente importante porque los miembros del género Helicobacter pueden tener efectos divergentes en los modelos de ratón, que van desde la estimulación de la inmunidad antitumoral en los modelos de CRC hasta la inflamación crónica y la actividad promotora del tumor en otros contextos ([Fox et al., 2011]; [Ge et al., 2019]; [Overacre-Delgoffe et al., 2021]). El trabajo futuro debe identificar los microbios humanos, los consorcios microbianos o los productos microbianos que reproducen de manera confiable el MHC-II del tumor e promueven la inmunidad antitumoral.

En resumen, nuestros hallazgos respaldan un modelo en el que la vigilancia inmunitaria del CRC MSS está determinada por si las células tumorales y el sistema inmunitario de la mucosa entran en un diálogo productivo que es facilitado por el microbioma. Al identificar la inducción dependiente del microbioma del MHC-II de las células tumorales como un determinante del compromiso inmunitario, el control de la metástasis y la respuesta al bloqueo de puntos de control de la inmunoterapia, este estudio proporciona un marco para las estrategias terapéuticas destinadas a restaurar la presentación de antígenos epiteliales en el CRC MSS resistente a la inmunoterapia.

MÉTODO

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DE LOS PARTICIPANTES DEL ESTUDIO

Modelos animales

Todos los estudios en ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Cold Spring Harbor Laboratory en una institución acreditada por AAALAC. Los ratones C57BL/6J (B6), los ratones Balb/c, los ratones B6.129P2-Cxcr6tm1Litt/J (ratones con deleción de Cxcr6), los ratones NSG, los ratones B6 Rag2 KO, los ratones Nude y los ratones β-act-EGFP (ratones tolerizados a GFP) se compraron en The Jackson Laboratory. Todos los experimentos se realizaron con ratones machos y hembras de 8 a 10 semanas de edad.

Líneas celulares

Las células MC38 (Kerafast; ENH204-FP) y MC38-luc-NIS se mantuvieron en DMEM (Corning) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 1X Glutamax (Gibco) y Primocin (Invivogen). Las células CT26 (ATCC; CRL-2638) se cultivaron en RPMI-1640 (Corning) suplementado con 10% de SFB, 1X Glutamax y Primocin. Todas las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora de CO2 humidificada al 5% y se pasaron cada 2-3 días. Todas las líneas celulares se probaron periódicamente para detectar la contaminación por micoplasma. Los identificadores de recursos de investigación (RRID) para las líneas celulares utilizadas en este estudio se enumeran en la tabla de recursos clave.

Cultivo de organoides

AKP (APCKO, KrasG12D, Tp53KO), AKPS (APCKD, KrasG12D, Tp53KO, Smad4KO [^[3]]) y los organoides derivados de AKPS (AKPS loSIIN, AKPS CIITA OE, AKPS CIITA KO) se incluyeron en Matrigel (Corning) y se cultivaron en un medio mínimo (Advanced DMEM (ADMEM) F-12 (Gibco) suplementado con 1X N2 Supplement (Gibco), 1X B27 Supplement (Gibco), 1X Glutamax y Primocin (100 μg/ml), según se describió anteriormente [^[4]]. Los organoides se pasaron cada 4-5 días utilizando la enzima TrypLE Express (Gibco). Los organoides AKP y AKPS se etiquetaron fluorescentemente, con AKP expresando GFP y AKPS expresando mScarlet, lo que permite el seguimiento tumoral y la imagenología fluorescente.### Derivación y cultivo de organoides humanos

Se obtuvieron muestras de tumores de colon humanos de pacientes con consentimiento informado que se sometieron a procedimientos de resección quirúrgica en el Hospital Huntington. Los protocolos del estudio fueron revisados y aprobados por el Northwell Health Biospecimen Repository (#1810). Las muestras de tejido se enjuagaron primero con PBS frío y se incubaron con una mezcla de antibióticos [Normocin (100 ug/ml), Gentamicina (50 μg/ml) y 1X Pen/Strep (100U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina) durante 20 minutos sobre hielo. A continuación, los fragmentos de tejido se lavaron nuevamente con PBS frío y se digirieron utilizando una mezcla de digestión que consistía en colagenasa (1 mg/ml) y clorhidrato de Y27632 (10 μM) en DMEM, seguida de incubación a 37 °C durante 45-60 minutos. Una vez completada la digestión, la mezcla se centrifugó a 300 g durante 5 minutos y los sedimentos se resuspendieron en la enzima TrypLE express para digerir aún más la muestra en células individuales durante 5-10 minutos a 37 °C. Luego, las células se volvieron a sedimentar y se resuspendieron con una mezcla de Matrigel:medio de cultivo 70:30 y se colocaron en placas de 6 pocillos. Las células se recubrieron con un medio de cultivo que consistía en ADMEM, 1X Glutamax, HEPES (10 mM), 50% de medio acondicionado L-WRN [^[1]]), 1X B27 Supplement, 1X N2 Supplement, Nicotinamida (10 mM), N-acetilcisteína (1 mM), Primocin (100 ug/ml), SB202190 (10 μM), Y-27632 (10 μM), Gastin I (10 nM), EGF (50 ng/ml) y A83-01 (500 nM). El medio de cultivo se renovó cada 4-5 días y los organoides derivados del paciente (PDO) se pasaron cada 7-10 días, normalmente en una proporción de 1:3.### Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

Junto con las muestras de tejido del paciente, se obtuvo sangre periférica de los mismos individuos. Primero, se diluyó la sangre total en una proporción de 1:1 con PBS que contenía 10% de FBS, y las PBMC se aislaron utilizando tubos SepMate-50 (STEMCELL Technologies) en combinación con Lymphoprep (STEMCELL Technologies). Brevemente, se añadió Lymphoprep al fondo de los tubos StepMate para establecer el gradiente de densidad, y la sangre diluida se colocó cuidadosamente encima. Los tubos se centrifugaron a 1200 x g durante 10 minutos con el freno desactivado, según las instrucciones del fabricante. La capa media (PBMC) se extrajo cuidadosamente utilizando una pipeta serológica, se centrifugó y se lavó con PBS. Las PBMC aisladas se crioconservaron en un medio de congelación comercial (Gibco). Para los ensayos de cocultivo, se descongeló el vial congelado y las PBMC se recuperaron y se cultivaron en un medio para células T humanas que consistía en ImmunoCult-XF T cell Expansion Medium (STEMCELL Technologies) suplementado con hIL-2 (2 ng/ml), hIL-7 (20 ng/ml) y Primocin (100 μg/ml) hasta su uso.### Cultivo y expansión de células T humanas

Las PBMC aisladas del paciente se expandieron utilizando el anticuerpo CD3/CD28 según el protocolo del fabricante (STEMCELL Technologies) antes del aislamiento de células T CD4+ y los ensayos de cocultivo. Brevemente, se añadieron 25 μl de anticuerpo CD3/CD28 a 1 x 10^6 PBMC en 1 ml de medio para células T y se cultivaron durante 3 días. Luego, las células se lavaron y se cultivaron con medio para células T para la expansión durante 7 días adicionales. Posteriormente, las células T CD4+ se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células T CD4+ EasySep Human (STEMCELL Technologies). Las células inmunitarias expandidas, incluidas las células T CD4+, se utilizaron luego para los ensayos de cocultivo posteriores.### Cocultivo de organoides de células inmunitarias autólogas humanas y CRC

Los organoides de CRC estables se dividieron según lo descrito anteriormente y se les permitió recuperarse y crecer durante 2-3 días. Los organoides se etiquetaron con CellTracker Red (1 μM) y las células inmunitarias autólogas se etiquetaron con CellTracker Green (1 μM) durante 30 minutos, seguido de dos lavados en sus respectivos medios. Las células inmunitarias (2 x 10^5) se mezclaron con 50-100 organoides en un medio que consistía en 45% de medio de organoides, 45% de medio para células T humanas y 10% de Matrigel suplementado con tinte Caspase-3/7 (500 nM). Los cocultivos se colocaron en placas de 96 pocillos para imagenología (Agilent). Las placas se centrifugaron brevemente (100 x g, 1 minuto) para llevar las células a un solo plano focal. Los cocultivos se visualizaron al día siguiente, a menos que se indique lo contrario, para evaluar las interacciones entre las células tumorales e inmunitarias y la apoptosis de los organoides, según se describe a continuación.### Imagenología y análisis de células vivas

Toda la imagenología se realizó utilizando un sistema PerkinElmer UltraVIEW VoX, con tiempos de adquisición indicados en las figuras y leyendas de las figuras correspondientes. El sistema está equipado con un microscopio confocal láser de disco giratorio de alta velocidad (Yokogawa® CSU-X1) optimizado para la imagenología de células vivas, una unidad de fotocinética (para FRAP y fotoactivación), seis líneas láser (405, 440, 488, 514, 561 y 640 nm), una cámara CCD de alta gama y un escenario totalmente automatizado que permite el mosaico de imágenes. El análisis de imágenes se realizó utilizando Volocity versión 6.3. Las imágenes de pila Z se procesaron primero como proyecciones de intensidad máxima (MIP) para el análisis posterior. Para cada fluoróforo, se establecieron umbrales para detectar la señal positiva de los objetivos correspondientes (por ejemplo, organoides derivados del paciente (PDO), células inmunitarias y caspasa-3/7) mediante la comparación con imágenes de campo brillante emparejadas. Los valores del coeficiente de colocalización [^[5]] (definido como la relación de un fluoróforo colocalizado sobre la señal total de ese fluoróforo) se calcularon para cada punto de tiempo y se exportaron a Microsoft Excel para un análisis adicional. Para cuantificar las interacciones entre las células cancerosas y las células inmunitarias, calculamos el coeficiente de colocalización de las células inmunitarias (Inmuneco-loc / Inmunetotal) en cada punto de tiempo y normalizamos estos valores con el coeficiente en el punto de tiempo inicial (t = 0), cuando los PDO y las células inmunitarias se distribuyeron uniformemente en los pocillos. Esta normalización minimizó los valores falsos positivos de las células que no interactúan (es decir, cuando los PDO y las células inmunitarias simplemente se colocaron uno encima del otro). Los valores normalizados se trazaron a lo largo del curso del tiempo del cocultivo. Para los análisis de caspasa-3/7, calculamos el coeficiente de colocalización de los PDO con la caspasa-3/7 (Organoidco-loc / Organoidtotal) y primero normalizamos estos valores con el grupo de control correspondiente sin células inmunitarias, para tener en cuenta la actividad de la caspasa-3/7 no mediada por las células inmunitarias (por ejemplo, la apoptosis inducida por la privación). La relación entre la apoptosis completa e incompleta se multiplicó luego por estos valores de coeficiente normalizados para cuantificar la magnitud de la apoptosis de los organoides mediada por el sistema inmunitario en el punto de tiempo final.### DETALLES DEL MÉTODO

Transferencia de especies de Helicobacter

El trasplante de microbiota fecal se realizó como se describió anteriormente [^[6]]. Brevemente, se resuspendieron dos pellets fecales (~50 mg en total) de ratones donantes positivos para Helicobacter en 1 ml de PBS estéril, se homogeneizaron a fondo y se pasaron a través de un tamiz celular de 70 μm. Los ratones receptores recibieron 200 μl del filtrado resultante por gavage oral cada dos días, para un total de tres dosis. Para las transferencias de especies únicas de Helicobacter (H. hepaticus, H. pullorum y H. bilis), se procesaron los contenidos cecales de ratones libres de gérmenes monocolonizados con la especie respectiva y se administraron como se describió anteriormente. Para las transferencias con H. typhlonius o H. mastomyrinus, se administraron 100 μl de cultivo de Helicobacter (OD = 1,5) por gavage oral cada dos días, para tres dosis. Los contenidos cecales fueron amablemente proporcionados por el Dr. Tim W. Hand, y los cultivos de Helicobacter individuales fueron proporcionados por el Dr. James G. Fox. Se confirmó la colonización exitosa y la identidad de la especie mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando cebadores de ARNr 16S específicos de la especie (tabla suplementaria 1), como se indica en la tabla de recursos clave.### Confirmación de la colonización por Helicobacter mediante qPCR del contenido fecal

El ADN microbiano fecal se extrajo utilizando el kit ZymoBIOMICS DNA Kit (Zymo Research) según el protocolo del fabricante. El ADN extraído de ratones positivos para Helicobacter (flora completa y/o inoculados con especies únicas) y negativos para Helicobacter se utilizó para detectar especies individuales de Helicobacter. Brevemente, se utilizaron 10 ng de ADN extraído por reacción para un ensayo de qPCR basado en SYBR-green (Applied Biosystems) con 300 nM de concentraciones finales de cebadores específicos de la especie, como se describió anteriormente [^[7], ^[8]]. Los valores del ciclo umbral (Ct) se utilizaron para calcular la abundancia relativa de cada especie de Helicobacter normalizada con respecto a las eubacterias totales [^[8]]. Todas las secuencias de cebadores se enumeran en la tabla de recursos clave.### Imagenología de bioluminiscencia (BLI)

La imagenología de bioluminiscencia se realizó utilizando un escáner IVIS Spectrum (Revvity). Primero, se anestesiaron los ratones portadores de tumores con isoflurano (~2% por inhalación) en una cámara de inducción. Se administró una solución estéril de D-Luciferina (15 mg/ml en PBS) por inyección intraperitoneal (IP) a una dosis de 10 μl por gramo de peso corporal (por ejemplo, 200 μl para un ratón de 20 g). Después de la inyección, se colocaron los ratones boca abajo en el escáner IVIS Spectrum y se mantuvo la anestesia con isoflurano durante la adquisición de la imagen. Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron utilizando el software Living Image (Revvity). Para garantizar una absorción óptima del sustrato y la emisión máxima de fotones, la imagenología se inició 14 minutos después de la inyección IP. Los escaneos iniciales se adquirieron utilizando un tiempo de exposición de 1 minuto, gran binning y apertura f/1 en el campo de visión C. En los puntos de tiempo posteriores, se redujo el tiempo de exposición y el binning según fuera necesario para evitar la saturación de píxeles. El tiempo total de anestesia no superó los 30 minutos por sesión. Se visualizaron los ratones cada dos semanas para controlar el crecimiento del tumor. La intensidad de la señal se cuantificó como radiancia (fotones/segundo/cm2/estereorradián) definiendo una región de interés (ROI) utilizando el software Living Image.### Tratamiento de organoides con citocinas

Los organoides AKPS estables o los PDO humanos de CRC se dividieron en el día 4-5 del cultivo. Inmediatamente después del pasaje, los organoides se trataron con Interferón gamma de ratón (mIFNγ 2 ng/ml; PeproTech) o Interferón gamma humano (hIFNγ 2 ng/ml; PeproTech) y se mantuvieron bajo estimulación con citocinas durante 48 horas. Posteriormente, los organoides se recolectaron para el ensayo de citometría de flujo.### Citometría de flujo

Después del tratamiento con citocinas de 48 horas, los organoides (AKPS o CRC humanos) se digirieron en suspensiones de células individuales utilizando la enzima TrypLE Express. Las células se tiñeron con un cóctel de anticuerpos que contenía MHC-I FITC de ratón y MHC-II APC/Cy7 de ratón o MHC-I FITC humano y MHC-II PE humano, cada uno a una dilución de 1:200. Las células muertas se excluyeron utilizando el tinte de viabilidad SYTOX blue (Life Technologies) del análisis.### Modelo de inyección ortotópica guiada por colonoscopia

Se realizó la implantación ortotópica de células u organoides en el colon, según se describió previamente [^[4], ^[9]]. En resumen, los organoides incrustados en Matrigel se disolvieron con solución de recuperación celular (Corning) a 4 °C durante 30 a 60 minutos y se lavaron con PBS. Se digirió una pequeña porción de cada organoide con la enzima TripLE Express para estimar el número de células. Las suspensiones de organoides lavadas se ajustaron a 1x10^7 células equivalentes/mL para los organoides AKP y a 5x10^6 células equivalentes/mL para los organoides AKPS en un 10% de Matrigel para la inyección. Los organoides intactos se implantaron en la submucosa del colon utilizando una jeringa Hamilton (modelo 7656-1) equipada con una aguja personalizada de 33G (Hamilton; fabricada a medida, similar a 7803-05, 16” pt4’ Deg12). Cada ratón recibió aproximadamente 100 μl de la suspensión celular ajustada (1x10^6 células equivalentes para AKP y 5x10^5 células equivalentes para los organoides AKPS por inyección). Se confirmó el éxito de las inyecciones mediante la aparición de una burbuja mucosa visible en el colon. Las inyecciones ortotópicas de líneas celulares 2D (MC38, MC38-luc-NIS y CT26) se realizaron de manera similar, utilizando 1x10^7 células/mL para MC38 y MC38-luc-NIS y 2,5x10^6 células/mL para CT26. El crecimiento tumoral se controló mediante colonoscopia óptica utilizando el sistema de cámara Karl Storz Image 1 HD (Image 1 HUB CCU, fuente de luz de xenón de 175 vatios) equipado con un telescopio integrado Richard Wolf de 1,9 mm/9,5 Fr (Richard Wolf, modelo 8626.431). Los ratones se sacrificaron en los puntos temporales especificados o al alcanzar los criterios de eutanasia humanitaria (ya sea una pérdida del 20% del peso corporal o al presentar un mal estado físico, es decir, postura encorvada). Se examinaron los sitios metastásicos (hígado, pulmón, omento y, en raras ocasiones, ganglios linfáticos) en busca de fluorescencia mScarlet utilizando una linterna de excitación fluorescente (Electron Microscopy Sciences; Xite-GR) y se confirmó mediante análisis histológico. Los ratones con inyecciones fallidas, definidas como la ausencia de formación tumoral al día 7 o tumores aislados confinados al espacio intraperitoneal, se excluyeron del análisis.### Índice tumoral y medición del tamaño

Las imágenes de colonoscopia se registraron y analizaron fuera de línea. El índice tumoral se calculó según se describió previamente [^[10]]. En resumen, el tamaño del tumor se midió a partir de las imágenes de colonoscopia y se normalizó al diámetro del lumen, donde la ausencia de tumor detectable corresponde a un índice tumoral de 0 y la obstrucción luminal completa por el tumor corresponde a un índice tumoral de 1. Para el índice tumoral normalizado, los valores del índice tumoral obtenidos después de los regímenes de tratamiento (por ejemplo, la inoculación de Helicobacter o la inmunoterapia) se normalizaron a los valores correspondientes del índice tumoral medidos antes del inicio del régimen de tratamiento.

Para la medición del tamaño bruto del tumor, los tumores se recolectaron al día 21 mediante la disección de la región del colon distal que contenía el tumor. Los tumores recolectados se lateralizaron y se recortaron para excluir el tejido adyacente que no expresaba mScarlet. Se adquirieron imágenes con una regla colocada junto a cada muestra para medir la longitud y el ancho del tumor, mientras que la altura se midió por separado con una regla. El volumen tumoral se calculó multiplicando la longitud x el ancho x la altura medida para cada muestra.### Tratamiento in vivo con FTY720

Para la administración in vivo de FTY720 (fingolimod; Selleckchem; S5002), se disolvió en DMSO y se diluyó hasta una concentración de trabajo de 5 μg/ml. Los ratones recibieron FTY720 (1 mg/kg) mediante gavaje oral diario, comenzando un día antes de la implantación del tumor y continuando durante 14 días. Los tumores se recolectaron el día 15.### Inmunoterapia de ratones con tumores

Los organoides AKPS (5x10^6 células equivalentes) se implantaron ortotópicamente en el colon de los ratones receptores, como se describió anteriormente, y se confirmó el establecimiento exitoso del tumor mediante colonoscopia al día 7 después de la implantación. A partir del día 21 después de la implantación, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de anticuerpo anti-PD1 (200 μg por dosis; BioXcell) y anticuerpo anti-CTLA4 (200 μg para la dosis inicial, seguida de 100 μg para las dosis posteriores; BioXcell). Los anticuerpos se administraron cada dos días durante dos semanas, para un total de seis dosis. La progresión tumoral se controló cada dos semanas mediante colonoscopia durante todo el curso del tratamiento.### Preparación de portaobjetos de tejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE)

Para el análisis histológico, los tejidos (colon, hígado y pulmones) se recolectaron de los ratones en los puntos temporales experimentales indicados. Para los tumores de colon, el colon se abrió longitudinalmente antes del proceso de inclusión. Los tejidos se fijaron en formalina al 10% durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente y luego se transfirieron a etanol al 70% para su almacenamiento antes del procesamiento. Los tejidos fijados se incluyeron en parafina y los bloques de tejido se cortaron en secciones de 10 μm de espesor. Las secciones se enviaron a CSHL Animal and Tissue Imaging Shared Resources para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E).### Tinción de inmunofluorescencia

Las secciones de tumores FFPE se desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de una serie de etanol graduado. Se realizó la recuperación del antígeno en tampón de citrato (Millipore Sigma) utilizando un microondas. Las secciones se bloquearon con SuperBlock durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CD3 (Abcam; 1:100), CD8a (1:200; Cell Signaling Technology), E-Cadherina (1:100; R&D System). Después de tres lavados en PBS-T al 0,05%, las portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados para cada especie [Goat IgG (1:200; Invitrogen), Rabbit IgG (1:200; Invitrogen) y Rat IgG (1:200; Invitrogen;)] durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron dos veces con PBS, se contrateñeron con DAPI (0,5 μg/ml; Invitrogen) durante 5 minutos y se montaron. Las portaobjetos se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia Keyence BZ-X (Keyence) y se procesaron en FIJI (ImageJ2, versión 2.3.0). La cuantificación se realizó manualmente, como se describe a continuación.### Cuantificación de imágenes

Las células inmunitarias CD8+ en contacto con las células cancerosas se cuantificaron utilizando Imaris. En resumen, el canal Epcam se utilizó para generar una superficie que contenía todas las estructuras tumorales glandulares dentro de cada campo de visión. Esta superficie se utilizó luego como máscara espacial para restringir el análisis en los canales restantes a las regiones inmediatamente adyacentes a las estructuras tumorales EpCAM+. La colocalización de las señales de CD3 y CD8 se utilizó para identificar y cuantificar las células T CD8+ en contacto con las células cancerosas utilizando el módulo de detección de "puntos" de Imaris. Para la cuantificación de CD74, se dibujaron manualmente regiones de interés (ROI) dentro de las áreas tumorales y se calculó la intensidad de fluorescencia media para cada ROI.### Transducción lentiviral de organoides

Para generar líneas de sobreexpresión de CIITA (CIITA OE), los organoides AKPS y los organoides de cáncer colorrectal humano (CRC) se digirieron en células individuales utilizando la enzima TripLE express, se lavaron y se resuspendieron en un medio de cultivo de organoides completo. Se incubaron 1x10^6 células con 10 μl de partículas lentivirales que codifican ya sea CIITA de ratón (pLV[Exp]-Puro-EF1A>mCiita) o CIITA humano (pLV[Exp]-Puro-EF1A>hCiita), ambos de Vector Builder, en presencia de polibreno (20 μg/ml; Sigma). Las células se colocaron en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos y se centrifugaron a 300 x g durante 1 hora a temperatura ambiente (espín-infección), seguida de una incubación a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 3 horas adicionales. Luego, las células se centrifugaron, se resuspendieron en una mezcla de 30% de medio y 70% de Matrigel y se colocaron en una placa de 6 pocillos. Después de 4 a 5 días, los organoides se pasaron y se sometieron a la selección con puromicina (7 μg/ml; Gibco). Los organoides supervivientes se expandieron y luego se analizaron mediante citometría de flujo para confirmar la sobreexpresión exitosa de CIITA.### Electroporación de organoides CRISPR/Cas9 RNP

Para generar líneas de organoides de knockout de CIITA (CIITA KO), los organoides AKPS del día 4 se disociaron en células individuales, como se describió anteriormente, y se resuspendieron en 100 μl de OPTI-MEM (Gibco). Los complejos ribonucleoproteicos (RNP) se ensamblaron mezclando 1,64 μl (0,1 nmol) de nucleasa Alt-R Cas9 (Integrated DNA Technologies) con 3 μl (0,3 nmol) de sgRNA sintético (Synthego) e incubando durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, se agregaron las células a la mezcla de RNP, se transfirieron a una cubeta de electroporación con una separación de 2 mm (Bulldog Bio) y se electroporaron utilizando un electroporador NEPA21 (Bulldog Bio) con los siguientes ajustes: parámetros de pulso de poración: 175 V, 5 ms de duración del pulso, 50 ms de intervalo, 2 pulsos, 10% de tasa de decaimiento, + polaridad; y parámetros de pulso de transferencia: 20 V, 50 ms de duración, 50 ms de intervalo, 5 pulsos, 40% de tasa de decaimiento, ± polaridad. Después de la electroporación, los organoides se resuspendieron suavemente en un medio mínimo precalentado y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de su inclusión en Matrigel. Se permitió que los organoides electroporados se recuperaran y luego se pasaran. Los organoides recién divididos se trataron con IFN-γ de ratón (2 ng/ml) para inducir la expresión de MHC II, seguido de la clasificación en un clasificador de células Sony SH800S para aislar las células CIITA KO negativas para MHC-II.### Activación inmunitaria de células

Preparación de tejidos

Para distinguir las células T infiltrantes de las células T circulantes, se inyectaron por vía intravenosa a los ratones anticuerpos APC-eFluor 780 CD45 (eBiosciences) poco antes del sacrificio. Se recolectaron los ganglios linfáticos que drenan el colon (caudal e ilíaco) y se disociaron mecánicamente en RPMI-1640 (Corning) suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivado térmicamente (HI-FBS) (Corning). Los tumores se identificaron utilizando una linterna de doble fluorescencia (Nightsea), se extirparon y se transfirieron a un tampón de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (500 U/ml; Worthington) y DNasa I (20 μg/ml; Sigma-Aldrich). Los tumores se picaron finamente con tijeras quirúrgicas y se digirieron a 37 °C durante 40 minutos con agitación suave. Después de la digestión enzimática, los tumores se disociaron aún más utilizando un disociador gentilMACS Octo (Miltenyi Biotec) con el programa tumor_imp1.1 y se pasaron a través de un tamiz de células de 100 μm para generar suspensiones de células individuales.

Las células linfocíticas de la suspensión celular se aislaron mediante aislamiento por gradiente utilizando Percoll (Cytivia). En resumen, los tejidos digeridos se mezclaron con 5 ml de Percoll al 44% en DMEM y luego se colocaron 3 ml de Percoll al 67% en PBS debajo mediante una pipeta de vidrio. Sin perturbar la interfaz, las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 minutos sin frenado a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo cónico de 15 ml, se rellenó con medio RPMI 1640 y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las células linfocíticas de los ganglios linfáticos que drenan el colon (dLN) y el tumor se dividieron para la tinción citométrica de flujo inmediata o la estimulación ex vivo con péptidos.### Tinción y análisis por citometría de flujo

La discriminación de células vivas/muertas se realizó utilizando Ghost Dye Red 780 (1:500; Cytek Bioscience) diluido en PBS. La tinción de superficie se realizó en un tampón de FACS que consistía en 1 mM de EDTA, 25 mM de HEPES, 0,5% de HI-FBS en PBS. Las células se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando concentrado de fijación/permeabilización (eBioscience) diluido 1:3 en diluyente de fijación/permeabilización (eBioscience) y se lavaron en un tampón de permeabilización (eBioscience). La tinción intracelular se realizó en un tampón de permeabilización durante la noche a 4 °C. Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en un tampón de FACS para la adquisición en un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software BD FACSDiva v8.0. Los datos se analizaron utilizando FlowJo v10.4.2 (FlowJo). Las células individuales se identificaron mediante la separación de FSC-A frente a SSC-A seguida de la separación de FSC-A frente a FSC-H para excluir los dobletes. Las células T CD8+ vivas se definieron como células CD8α+ Ghost Dye−. La expresión de marcadores adicionales se evaluó específicamente dentro de esta población de células T CD8+ específicas del antígeno para todos los experimentos de citometría de flujo relacionados con las células T en este estudio. Para las células T CD4+, se separaron las células CD4+ vivas Ghost Dye− y luego se evaluó la expresión de marcadores posteriores dentro de esta población.### Estimulación con péptidos para la tinción de citocinas

Se prepararon suspensiones de células simples a partir de los tumores y los ganglios linfáticos regionales, según se describe anteriormente. A continuación, se estimularon las células inmunitarias en un medio para células T de ratón que consistía en RPMI-1640 suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) HI, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 50 μM de β-mercaptoetanol, 1× de aminoácidos no esenciales y 0,5X (50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina). Las células se incubaron con GolgiPlug (1:1000; BD Bioscience), solución de monensina (2 μM; BioLegend) y péptido SIINFEKL (Anaspec; 1 μM; AS-60193-1) durante 3 horas a 37 °C. Tras la estimulación, las células se lavaron y se tiñeron para detectar marcadores de superficie e intracelulares, según se describe anteriormente.### Secuenciación de ARN de células simples

Los tumores se picaron y se digirieron en un medio de digestión que consistía en RPMI1640 (Corning) suplementado con un 10 % de SFB, colagenasa D (2,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), Liberase DL (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) y DNasa I (0,2 mg/ml; Sigma-Aldrich). La digestión se llevó a cabo a 37 °C con rotación a baja velocidad (25 rpm) durante 30 a 60 minutos. Las muestras digeridas se filtraron a través de tamices celulares de 100 μm y los fragmentos de tejido restantes se rompieron mecánicamente utilizando el émbolo de una jeringa. Las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 minutos, se lavaron una vez con RPMI1640 y se tiñeron con anticuerpos anti-CD45-APC/Cy7 (células inmunitarias) o anti-EpCAM-APC (células epiteliales) (1:200, BioLegend). Las células CD45+ EpCAM− y las células CD45− EpCAM+ se clasificaron utilizando el clasificador celular Sony SH800S y se combinaron en una proporción de 80:20, seguido de la preparación de la biblioteca de células simples.

Las bibliotecas de células simples se generaron utilizando un controlador de cromo (10X Genomics) con el kit de expresión génica de células simples 3’ de cromo Next GEM (10X Genomics), según las instrucciones del fabricante en el recurso compartido de biología de células simples CSHL. Las suspensiones celulares se cargaron para obtener 8000 células por muestra. El ADNc y las bibliotecas se evaluaron utilizando el bioanalizador Agilent 2100, se cuantificaron mediante qPCR de KAPA y se secuenciaron en un NextSeq500 o Novaseq2000 (Illumina) hasta una profundidad de aproximadamente 20 000 lecturas por célula. Los archivos FASTQ se alinearon con el genoma de referencia del ratón (gex-mm10-2020-A) y se generaron matrices de recuento de genes-células digitales utilizando los parámetros predeterminados.### Análisis de datos de secuenciación de ARN de células simples

MC38

Se evaluó la calidad de los datos según las pautas publicadas [^[11], ^[12]]. Se excluyeron las células con >10 % de transcritos mitocondriales, 2500 genes detectados, >10 000 recuentos de ARN o 10 % de transcritos mitocondriales, 5000 genes detectados, >25 000 recuentos de ARN o mCiita) o CIITA humano (pLV[Exp]-Puro-EF1A>hCiita), ambos de Vector Builder, en presencia de polibreno (20 μg/ml; Sigma). Las células se colocaron en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos y se centrifugaron a 300 x g durante 1 hora a temperatura ambiente (espín-infección), seguido de una incubación a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 3 horas adicionales. Luego, las células se centrifugaron, se resuspendieron en una mezcla de 30% de medio y 70% de Matrigel y se colocaron en una placa de 6 pocillos. Después de 4-5 días, los organoides se pasaron y se sometieron a una selección con puromicina (7 μg/ml; Gibco). Los organoides supervivientes se expandieron y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo para confirmar la sobreexpresión exitosa de CIITA.

Electroporación de organoides CRISPR/Cas9 RNP

Para generar líneas de organoides AKPS con knockout de CIITA (CIITA KO), los organoides AKPS del día 4 se disociaron en células individuales según lo descrito anteriormente y se resuspendieron en 100 μl de OPTI-MEM (Gibco). Los complejos de ribonucleoproteína (RNP) se ensamblaron mezclando 1,64 μl (0,1 nmol) de nucleasa Alt-R Cas9 (Integrated DNA Technologies) con 3 μl (0,3 nmol) de sgRNA sintético (Synthego) e incubando durante 10-20 minutos a temperatura ambiente. Luego, se añadieron las células a la mezcla de RNP, se transfirieron a una cubeta de electroporación con una separación de 2 mm (Bulldog Bio) y se sometieron a electroporación utilizando un electroporador NEPA21 (Bulldog Bio) con los siguientes parámetros: parámetros del pulso de poración: 175 V, 5 ms de duración del pulso, 50 ms de intervalo, 2 pulsos, 10% de tasa de decaimiento, + polaridad; y parámetros del pulso de transferencia: 20 V, 50 ms de duración, 50 ms de intervalo, 5 pulsos, 40% de tasa de decaimiento, ± polaridad. Después de la electroporación, los organoides se resuspendieron suavemente en un medio mínimo precalentado y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de su inclusión en Matrigel. Se permitió que los organoides electroporados se recuperaran y posteriormente se pasaran. Los organoides recién divididos se trataron con IFN-γ de ratón (2 ng/ml) para inducir la expresión de MHC II, seguido de la clasificación en un clasificador de células Sony SH800S para aislar las células CIITA KO negativas para MHC-II.

Activación de células inmunitarias

Preparación de tejidos

Para distinguir las células T infiltrantes de los tejidos de las células T circulantes, se inyectó por vía intravenosa a los ratones con el anticuerpo APC-eFluor 780 CD45 (eBiosciences) poco antes de la eutanasia. Se recolectaron los ganglios linfáticos que drenan el colon (caudales e ilíacos) y se disociaron mecánicamente en RPMI-1640 (Corning) suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivado térmicamente (HI-FBS) (Corning). Los tumores se identificaron utilizando una linterna de doble proteína fluorescente (Nightsea), se extirparon y se transfirieron a un tampón de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (500 Uml-1; Worthington) y DNasa I (20 μg/ml; Sigma-Aldrich). Los tumores se picaron finamente con tijeras quirúrgicas y se digirieron a 37 °C durante 40 minutos con agitación suave. Después de la digestión enzimática, los tumores se disociaron aún más utilizando un disociador gentilMACS Octo (Miltenyi Biotec) con el programa tumor_imp1.1 y se pasaron a través de un tamiz de células de 100 μm para generar suspensiones de células individuales.

Las células linfocíticas de la suspensión celular se aislaron mediante aislamiento por gradiente utilizando Percoll (Cytivia). Brevemente, los tejidos digeridos se mezclaron con 5 ml de Percoll al 44% en DMEM y luego se colocaron 3 ml de Percoll al 67% en PBS debajo mediante una pipeta de vidrio Pasteur. Sin perturbar la interfaz, las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 minutos sin freno a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, el sedimento se transfirió a un tubo cónico de 15 ml, se completó con medio RPMI 1640 y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las células linfocíticas de los ganglios linfáticos que drenan el colon (dLN) y el tumor se dividieron para la tinción citométrica de flujo inmediata o la estimulación ex vivo con péptidos.

Tinción y análisis por citometría de flujo

La discriminación de células vivas/muertas se realizó utilizando Ghost Dye Red 780 (1:500; Cytek Bioscience) diluido en PBS. La tinción de superficie se realizó en un tampón FACS que consistía en 1 mM de EDTA, 25 mM de HEPES, 0,5% de HI-FBS en PBS. Las células se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando Concentrado de fijación/permeabilización (eBioscience) diluido 1:3 en diluyente de fijación/permeabilización (eBioscience) y se lavaron en tampón de permeabilización (eBioscience). La tinción intracelular se realizó en tampón de permeabilización durante la noche a 4 °C. Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS para la adquisición en un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software BD FACSDiva v8.0. Los datos se analizaron utilizando FlowJo v10.4.2 (FlowJo). Las células linfocíticas individuales se identificaron mediante la separación FSC-A frente a SSC-A seguida de la separación FSC-A frente a FSC-H para excluir los dobletes. Las células T CD8+ vivas se definieron como células CD8α+ Ghost Dye−. La expresión de marcadores adicionales se evaluó específicamente dentro de esta población de células T CD8+ específicas para el antígeno para todos los experimentos de citometría de flujo relacionados con las células T en este estudio. Para las células T CD4+, se separaron las células CD4+ Ghost Dye− vivas y luego se evaluó la expresión de marcadores posteriores dentro de esta población.

Estimulación con péptidos para la tinción de citocinas

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de tumores y ganglios linfáticos que drenan el tumor como se describió anteriormente. Luego, las células inmunitarias se estimularon en un medio de células T de ratón que consistía en RPMI-1640 suplementado con 10% de HI-FBS, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 50 μM de β-mercaptoetanol, 1× de aminoácidos no esenciales y 0,5X (50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina). Las células se incubaron con GolgiPlug (1:1000; BD Bioscience), solución de monensina (2 μM; BioLegend) y péptido SIINFEKL (Anaspec; 1 μM; AS-60193-1) durante 3 horas a 37 °C. Después de la estimulación, las células se lavaron y se tiñeron para los marcadores de superficie e intracelulares como se describió anteriormente.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Los tumores se picaron y se digirieron en un medio de digestión que consistía en RPMI1640 (Corning) suplementado con 10% de FBS, colagenasa D (2,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), Liberase DL (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) y DNasa I (0,2 mg/ml; Sigma-Aldrich). La digestión se llevó a cabo a 37 °C con rotación a baja velocidad (25 rpm) durante 30-60 minutos. Las muestras digeridas se filtraron a través de tamices de células de 100 μm y los fragmentos de tejido restantes se interrumpieron mecánicamente utilizando el émbolo de una jeringa. Las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 minutos, se lavaron una vez con RPMI1640 y se tiñeron con anticuerpos CD45-APC/Cy7 (células inmunitarias) o EpCAM-APC (células epiteliales) (1:200, BioLegend). Las células CD45+ EpCAM− y las células CD45− EpCAM+ se clasificaron utilizando un clasificador de células Sony SH800S y se combinaron en una proporción de 80:20, seguido de la preparación de la biblioteca de una sola célula.

Las bibliotecas de una sola célula se generaron utilizando un controlador de cromo (10X Genomics) utilizando el kit de expresión génica de una sola célula 3’ Chromium Next GEM (10X Genomics), según las instrucciones del fabricante en el recurso compartido de biología de células únicas CSHL. Las suspensiones celulares se cargaron para obtener 8000 células por muestra. El cDNA y las bibliotecas se evaluaron utilizando un bioanalizador Agilent 2100, se cuantificaron mediante qPCR KAPA y se secuenciaron en una NextSeq500 o Novaseq2000 (Illumina) a una profundidad de aproximadamente 20.000 lecturas por célula. Los archivos FASTQ se alinearon al genoma de referencia del ratón (gex-mm10-2020-A) y se generaron matrices de conteo de genes-células digitales utilizando los parámetros predeterminados.

Análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula

MC38

La calidad de los datos se evaluó según las pautas publicadas [^[11], ^[12]]. Se excluyeron las células con >10% de transcritos mitocondriales, 2500 genes detectados, >10.000 recuentos de ARN o 10% de transcritos mitocondriales, 5.000 genes detectados, >25.000 recuentos de ARN o mCiita) o CIITA humano (pLV[Exp]-Puro-EF1A>hCiita), ambos de Vector Builder, en presencia de polibreno (20 μg/ml; Sigma). Las células se colocaron en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos y se centrifugaron a 300 x g durante 1 hora a temperatura ambiente (espín-infección), seguida de una incubación a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 3 horas adicionales. A continuación, las células se centrifugaron, se resuspendieron en una mezcla de 30% de medio y 70% de Matrigel y se colocaron en una placa de 6 pocillos. Después de 4 a 5 días, los organoides se pasaron y se sometieron a una selección con puromicina (7 μg/ml; Gibco). Los organoides supervivientes se expandieron y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo para confirmar la sobreexpresión exitosa de CIITA.

Electroporación de RNP CRISPR/Cas9 en organoides

Para generar líneas de organoides AKPS con deleción de CIITA (CIITA KO), los organoides AKPS del día 4 se disociaron en células individuales según lo descrito anteriormente y se resuspendieron en 100 μl de OPTI-MEM (Gibco). Los complejos de ribonucleoproteína (RNP) se ensamblaron mezclando 1,64 μl (0,1 nmol) de nucleasa Alt-R Cas9 (Integrated DNA Technologies) con 3 μl (0,3 nmol) de sgRNA sintético (Synthego) e incubando durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron las células a la mezcla de RNP, se transfirieron a una cubeta de electroporación con una separación de 2 mm (Bulldog Bio) y se sometieron a electroporación utilizando un electroporador NEPA21 (Bulldog Bio) con los siguientes parámetros: parámetros de pulso de poración: 175 V, 5 ms de duración del pulso, 50 ms de intervalo, 2 pulsos, 10% de tasa de decaimiento, + polaridad; y parámetros de pulso de transferencia: 20 V, 50 ms de duración, 50 ms de intervalo, 5 pulsos, 40% de tasa de decaimiento, ± polaridad. Después de la electroporación, los organoides se resuspendieron suavemente en un medio mínimo precalentado y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de su inclusión en Matrigel. Se permitió que los organoides electroporados se recuperaran y posteriormente se pasaron. Los organoides recién divididos se trataron con IFN-γ de ratón (2 ng/ml) para inducir la expresión de MHC II, seguido de la clasificación en un clasificador de células Sony SH800S para aislar las células CIITA KO negativas para MHC-II.

Activación de células inmunitarias

Preparación de tejidos

Para distinguir las células T infiltrantes de los tejidos de las células T circulantes, se inyectó por vía intravenosa a los ratones con el anticuerpo APC-eFluor 780 CD45 (eBiosciences) poco antes de la eutanasia. Se recolectaron los ganglios linfáticos que drenan el colon (caudal e ilíaco) y se disociaron mecánicamente en RPMI-1640 (Corning) suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivado térmicamente (HI-FBS) (Corning). Los tumores se identificaron utilizando una linterna de doble proteína fluorescente (Nightsea), se extirparon y se transfirieron a un tampón de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (500 U/ml; Worthington) y DNasa I (20 μg/ml; Sigma-Aldrich). Los tumores se picaron finamente con tijeras quirúrgicas y se digirieron a 37 °C durante 40 minutos con agitación suave. Tras la digestión enzimática, los tumores se disociaron aún más utilizando un disociador gentilMACS Octo (Miltenyi Biotec) con el programa tumor_imp1.1 y se pasaron a través de un tamiz de células de 100 μm para generar suspensiones de células individuales.

Los linfocitos de la suspensión celular se aislaron mediante aislamiento por gradiente utilizando Percoll (Cytivia). Brevemente, los tejidos digeridos se mezclaron con 5 ml de Percoll al 44% en DMEM y, a continuación, se colocó 3 ml de Percoll al 67% en PBS debajo mediante una pipeta de vidrio. Sin perturbar la interfaz, las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 minutos sin frenado a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, el sedimento se transfirió a un tubo cónico de 15 ml, se rellenó con medio RPMI 1640 y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Los linfocitos de los ganglios linfáticos que drenan el colon (dLN) y el tumor se dividieron para la tinción citométrica de flujo inmediata o la estimulación ex vivo con péptidos.

Tinción y análisis por citometría de flujo

La discriminación de células vivas y muertas se realizó utilizando Ghost Dye Red 780 (1:500; Cytek Bioscience) diluido en PBS. La tinción de superficie se llevó a cabo en tampón FACS que consistía en 1 mM de EDTA, 25 mM de HEPES, 0,5% de HI-FBS en PBS. Las células se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando concentrado de fijación/permeabilización (eBioscience) diluido 1:3 en diluyente de fijación/permeabilización (eBioscience) y se lavaron en tampón de permeabilización (eBioscience). La tinción intracelular se realizó en tampón de permeabilización durante la noche a 4 °C. Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS para la adquisición en un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software BD FACSDiva v8.0. Los datos se analizaron utilizando FlowJo v10.4.2 (FlowJo). Los linfocitos individuales se identificaron mediante la separación por FSC-A frente a SSC-A seguida de FSC-A frente a FSC-H para excluir los dobletes. Las células T CD8+ vivas se definieron como células CD8α+ Ghost Dye−. La expresión de marcadores adicionales se evaluó específicamente dentro de esta población de células T CD8+ específicas para el antígeno para todos los experimentos de citometría de flujo relacionados con las células T en este estudio. Para las células T CD4+, se separaron las células CD4+ Ghost Dye− vivas y, a continuación, se evaluó la expresión de marcadores dentro de esta población.

Estimulación con péptidos para la tinción de citocinas

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de tumores y ganglios linfáticos que drenan el tumor según lo descrito anteriormente. A continuación, las células inmunitarias se estimularon en un medio para células T de ratón que consistía en RPMI-1640 suplementado con 10% de HI-FBS, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 50 μM de β-mercaptoetanol, 1× de aminoácidos no esenciales y 0,5X (50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina). Las células se incubaron con GolgiPlug (1:1000; BD Bioscience), solución de monensina (2 μM; BioLegend) y péptido SIINFEKL (Anaspec; 1 μM; AS-60193-1) durante 3 horas a 37 °C. Tras la estimulación, las células se lavaron y se tiñeron para los marcadores de superficie e intracelulares según lo descrito anteriormente.

Preparación de tejidos

Para distinguir las células T infiltrantes de los tejidos de las células T circulantes, se inyectó por vía intravenosa a los ratones con el anticuerpo APC-eFluor 780 CD45 (eBiosciences) poco antes de la eutanasia. Se recolectaron los ganglios linfáticos que drenan el colon (caudal e ilíaco) y se disociaron mecánicamente en RPMI-1640 (Corning) suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivado térmicamente (HI-FBS) (Corning). Los tumores se identificaron utilizando una linterna de doble proteína fluorescente (Nightsea), se extirparon y se transfirieron a un tampón de digestión que contenía colagenasa tipo 1 (500 U/ml; Worthington) y DNasa I (20 μg/ml; Sigma-Aldrich). Los tumores se picaron finamente con tijeras quirúrgicas y se digirieron a 37 °C durante 40 minutos con agitación suave. Tras la digestión enzimática, los tumores se disociaron aún más utilizando un disociador gentilMACS Octo (Miltenyi Biotec) con el programa tumor_imp1.1 y se pasaron a través de un tamiz de células de 100 μm para generar suspensiones de células individuales.

Los linfocitos de la suspensión celular se aislaron mediante aislamiento por gradiente utilizando Percoll (Cytivia). Brevemente, los tejidos digeridos se mezclaron con 5 ml de Percoll al 44% en DMEM y, a continuación, se colocó 3 ml de Percoll al 67% en PBS debajo mediante una pipeta de vidrio. Sin perturbar la interfaz, las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 minutos sin frenado a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, el sedimento se transfirió a un tubo cónico de 15 ml, se rellenó con medio RPMI 1640 y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Los linfocitos de los ganglios linfáticos que drenan el colon (dLN) y el tumor se dividieron para la tinción citométrica de flujo inmediata o la estimulación ex vivo con péptidos.

Tinción y análisis por citometría de flujo

La discriminación de células vivas y muertas se realizó utilizando Ghost Dye Red 780 (1:500; Cytek Bioscience) diluido en PBS. La tinción de superficie se llevó a cabo en tampón FACS que consistía en 1 mM de EDTA, 25 mM de HEPES, 0,5% de HI-FBS en PBS. Las células se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando concentrado de fijación/permeabilización (eBioscience) diluido 1:3 en diluyente de fijación/permeabilización (eBioscience) y se lavaron en tampón de permeabilización (eBioscience). La tinción intracelular se realizó en tampón de permeabilización durante la noche a 4 °C. Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS para la adquisición en un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software BD FACSDiva v8.0. Los datos se analizaron utilizando FlowJo v10.4.2 (FlowJo). Los linfocitos individuales se identificaron mediante la separación por FSC-A frente a SSC-A seguida de FSC-A frente a FSC-H para excluir los dobletes. Las células T CD8+ vivas se definieron como células CD8α+ Ghost Dye−. La expresión de marcadores adicionales se evaluó específicamente dentro de esta población de células T CD8+ específicas para el antígeno para todos los experimentos de citometría de flujo relacionados con las células T en este estudio. Para las células T CD4+, se separaron las células CD4+ Ghost Dye− vivas y, a continuación, se evaluó la expresión de marcadores dentro de esta población.

Estimulación con péptidos para la tinción de citocinas

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de tumores y ganglios linfáticos que drenan el tumor según lo descrito anteriormente. A continuación, las células inmunitarias se estimularon en un medio para células T de ratón que consistía en RPMI-1640 suplementado con 10% de HI-FBS, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 50 μM de β-mercaptoetanol, 1× de aminoácidos no esenciales y 0,5X (50 U/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina). Las células se incubaron con GolgiPlug (1:1000; BD Bioscience), solución de monensina (2 μM; BioLegend) y péptido SIINFEKL (Anaspec; 1 μM; AS-60193-1) durante 3 horas a 37 °C. Tras la estimulación, las células se lavaron y se tiñeron para los marcadores de superficie e intracelulares según lo descrito anteriormente.

Secuenciación de ARN de célula única

Los tumores se picaron y se digirieron en un medio de digestión que consistía en RPMI1640 (Corning) suplementado con 10% de FBS, colagenasa D (2,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), Liberase DL (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) y DNasa I (0,2 mg/ml; Sigma-Aldrich). La digestión se llevó a cabo a 37 °C con rotación a baja velocidad (25 rpm) durante 30 a 60 minutos. Las muestras digeridas se filtraron a través de tamices de células de 100 μm y los fragmentos de tejido restantes se rompieron mecánicamente utilizando el émbolo de una jeringa. Las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 minutos, se lavaron una vez con RPMI1640 y se tiñeron con anticuerpos CD45-APC/Cy7 (células inmunitarias) o EpCAM-APC (células epiteliales) (1:200, BioLegend). Las células CD45+ EpCAM− y las células CD45− EpCAM+ se clasificaron utilizando un clasificador de células Sony SH800S y se combinaron en una proporción de 80:20, seguida de la preparación de la biblioteca de células únicas.

Se generaron bibliotecas de células individuales utilizando un controlador Chromium (10X Genomics) con el kit de expresión génica de células individuales 3’ Chromium Next GEM (10X Genomics), según las instrucciones del fabricante en el recurso compartido de biología de células individuales CSHL. Las suspensiones celulares se cargaron para alcanzar un objetivo de 8000 células por muestra. El ADNc y las bibliotecas se evaluaron utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer, se cuantificaron mediante KAPA qPCR y se secuenciaron en un NextSeq500 o Novaseq2000 (Illumina) hasta una profundidad de aproximadamente 20.000 lecturas por célula. Los archivos FASTQ se alinearon al genoma de referencia del ratón (gex-mm10-2020-A) y se generaron matrices de recuento de genes-células digitales utilizando los parámetros predeterminados.

Análisis de datos de secuenciación de ARN de células individuales

MC38

La calidad de los datos se evaluó según las pautas publicadas [^[11], ^[12]]. Se excluyeron las células con >10% de transcritos mitocondriales, 2500 genes detectados, >10.000 recuentos de ARN o 10% de transcritos mitocondriales, 25.000 recuentos de ARN o 10% de transcritos mitocondriales, 2500 genes detectados, >10.000 recuentos de ARN o 10% de transcritos mitocondriales, 25.000 recuentos de ARN o