Los cánceres colorrectales con distinto potencial metastásico desencadenan respuestas tempranas divergentes de las células T.

La mucosa intestinal alberga el mayor compartimento inmunitario del cuerpo de los mamíferos, donde las células inmunitarias residentes y reclutadas deben mantener la tolerancia a los antígenos comensales y dietéticos, al tiempo que conservan su capacidad para montar respuestas eficaces contra patógenos y transformación maligna^[1],^[2]. La proliferación epitelial descontrolada conduce al cáncer colorrectal (CCR), la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo^[3]-^[5]. Más del 85% de los casos de CCR humanos surgen de la acumulación de mutaciones esporádicas o hereditarias en los genes supresores de tumores Apc, Tp53, Smad4 y el oncogén Kras^[3],^[6],^[7]. Aunque el bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICB) ha transformado el tratamiento de ciertos tumores sólidos, la mayoría de los CCR, en particular aquellos con un sistema de reparación de errores de emparejamiento (pMMR) eficiente, siguen siendo refractarios a la inmunoterapia y son propensos a la metástasis^[8]-^[10]. En contraste, los tumores con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR) albergan una alta carga mutacional que promueve la inmunogenicidad y la respuesta a las terapias mediadas por células T^[9],^[10]. Esta dicotomía subraya el papel fundamental, aunque no del todo comprendido, de las respuestas de las células T locales en la configuración de la progresión del CCR y su propensión metastásica^[11].

Aunque la inmunidad adaptativa puede eliminar las células tumorales nascentes, también puede volverse funcionalmente silenciada o ser cooptada en un microambiente tumoral (TME) en evolución^[12]-^[14]. En el tejido intestinal, este desafío se ve agravado por la necesidad constante de restringir la activación inmunitaria perjudicial hacia los abundantes antígenos luminales, creando un entorno en el que las respuestas específicas del tumor deben surgir en medio de mecanismos de tolerancia preexistentes^[15]-^[18]. Sin embargo, cómo las células T integran estas señales conflictivas, especialmente durante las primeras etapas del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica, sigue sin estar claro^[11]. Los estudios previos se han centrado en gran medida en modelos de CCR dMMR altamente inmunogénicos o en xenoinjertos subcutáneos no fisiológicos, lo que proporciona información limitada sobre las respuestas de las células T residentes en el intestino o asociadas a la metástasis^[19],^[20]. Además, las respuestas policlonales de las células T en el CCR no metastásico frente al CCR pro-metastásico, distintas de las respuestas inmunitarias "de fondo" en el intestino, siguen sin explorarse.

Para abordar estas lagunas, combinamos modelos de CCR ortotópicos con distintos potenciales metastásicos y una estrategia de mapeo temporal del destino de las células T que permitió la discriminación entre las células T intestinales preexistentes y los posibles clones antitumorales reclutados. Este enfoque nos permitió comparar el reclutamiento, la activación y la clonalidad de las células T en tumores no metastásicos y pro-metastásicos dentro de sus microambientes nativos. Descubrimos que estos tipos de tumores inducen respuestas de activación de las células T tempranas fundamentalmente distintas, que van desde una robusta diferenciación efectora y expansión clonal hasta estados similares a los de células T ingenuas o hipoactivadas, lo que destaca una divergencia previamente no reconocida en el compromiso inmunitario local que precede a la progresión metastásica.

Resultados

Perfil inmunitario de modelos de CCR ortotópicos con distinto potencial metastásico

Para investigar la infiltración de linfocitos T en los tumores colorrectales y el epitelio del colon sano adyacente, implementamos modelos ortotópicos de CCR guiados por colonoscopio^[21],^[22]. Inyectamos las siguientes líneas de organoides tumorales de ratón en las paredes del colon de ratones inmunocompetentes B6: 1) AKP, que alberga mutaciones Apc−/−, KrasG12D y Tp53−/−^[21],^[23],^[24], y 2) línea pro-metastásica (pro-Met) que se generó mediante múltiples pasajes in vivo de la línea AKP (Figuras 1A, S1A y B). Para cada una de estas líneas de organoides tumorales trasplantadas, evaluamos el crecimiento tumoral del colon, la metástasis hepática y el fenotipo de las células T en una etapa temprana (dos semanas después de la inyección del tumor) y en una etapa tardía (6-7 semanas después de la inyección del tumor) del desarrollo del CCR. Este análisis temporal nos permitió determinar cuándo surgen las diferencias en la agresividad tumoral y la infiltración inmunitaria y cómo evolucionan con el tiempo. Si bien el diámetro promedio del tumor del colon fue comparable entre ambos modelos de organoides tumorales en la etapa temprana del CCR, los tumores pro-Met fueron más grandes en la etapa tardía del CCR (Figura 1B). Se observaron macrometástasis hepáticas solo en el modelo pro-Met en la etapa tardía del CCR (Figuras 1C y S1C). Estas observaciones establecen AKP y pro-Met como modelos de CCR primarios emparejados que divergen marcadamente en el comportamiento metastásico, proporcionando un marco para una mayor investigación de su TME primario.

Para determinar cómo difieren la morfología tumoral y la infiltración inmunitaria entre los modelos y los puntos temporales, realizamos un análisis histopatológico de los colones de ratones que presentaban tumores AKP y pro-Met en las etapas temprana y tardía. Realizamos tinción con hematoxilina y eosina (H&E) combinada con inmunohistoquímica (IHC) para tdTomato (para delimitar las células tumorales) y CD4 y CD8 para evaluar la infiltración de células T en las lesiones del colon (Figura 1D). Ambos tipos de tumores fueron consistentes con adenocarcinoma en la mayoría de los tumores analizados, con invasión que se extendía hasta la muscularis en una etapa temprana (Figura 1D). En la etapa tardía, ambos modelos se clasificaron uniformemente como adenocarcinomas y exhibieron extensión transmural desde la mucosa hasta la serosa (Figuras 1D y S1D). Para cuantificar la progresión tumoral, utilizamos una puntuación de gravedad tumoral integrando los grados de necrosis, fibroplasia y displasia epitelial. Utilizando esta métrica, los tumores AKP exhibieron un aumento en la gravedad a medida que progresaban de la etapa temprana a la tardía, lo que refleja un empeoramiento histopatológico progresivo con el tiempo. En contraste, los tumores pro-Met no mostraron un cambio significativo dependiente de la etapa, lo que es consistente con la presencia de un estado histopatológico más avanzado en una etapa temprana. Los tumores pro-Met en etapa temprana obtuvieron una puntuación intermedia, que no fue significativamente diferente de los tumores AKP en etapa temprana o los tumores pro-Met en etapa tardía, mientras que los tumores AKP en etapa tardía y los tumores pro-Met en etapa tardía fueron indistinguibles (Figura 1E). La evaluación por IHC indicó que ambos tumores estaban altamente infiltrados con células T CD4+ y, en menor medida, con células T CD8+ en la etapa temprana. Sin embargo, en la etapa tardía, las células T CD4+ y CD8+ se detectaron principalmente en la periferia del tumor, con menos infiltración dentro del lecho tumoral (Figura 1D). Para evaluar cuantitativamente estas diferencias inmunitarias, realizamos citometría de flujo en los tejidos tumorales del colon para medir la acumulación de células T en los modelos y los puntos temporales. Observamos una mayor acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ en los tumores AKP en etapa temprana que en los tumores pro-Met en las etapas temprana y tardía (Figura 1F). Además de los tumores del colon, examinamos el epitelio no tumoral adyacente (para los linfocitos intraepiteliales, denominados IEL) para servir como línea de base de referencia y para evaluar si los tumores alteran las regiones no tumorales adyacentes. Se utilizaron los IEL del colon de ratones inyectados con placebo como controles para tener en cuenta el daño potencial causado por la inyección con colonoscopio. El epitelio no tumoral de los ratones inyectados con AKP y pro-Met mostró una acumulación de IEL CD4+ y CD8αβ+ comparable a la de los controles inyectados con placebo (Figura 1G). Estos datos sugieren que el modelo AKP establece un microambiente tumoral más inflamado que el modelo pro-Met en las etapas tempranas del desarrollo del CCR.

Para complementar los modelos de organoides e incluir un modelo de CCR dMMR ampliamente utilizado, inyectamos ortotópicamente la línea de adenocarcinoma de colon de ratón MC38 y su derivado (MC38 LVM2), que se pasó dos veces en el hígado del ratón (Figura 1A). En la etapa temprana, los ratones trasplantados con células MC38 o MC38 LVM2 desarrollaron tumores del colon comparables en tamaño a los tumores pro-Met en etapa tardía y significativamente más grandes que los tumores AKP en etapa temprana (p = 0,0352 para MC38 frente a AKP; p = 0,0052 para MC38 LVM2 frente a AKP) (Figura S1E). A pesar de esto, no se detectaron metástasis hepáticas en las líneas celulares MC38. Debido a que los ratones que presentaban tumores MC38 exhibieron morbilidad más allá del punto temporal temprano, todos los análisis posteriores de este modelo se llevaron a cabo exclusivamente 2 semanas después de la inyección. El análisis de citometría de flujo reveló que los tumores MC38 y MC38 LVM2 albergaron frecuencias comparables de células T CD4+ y CD8αβ+. Aunque MC38 representa un modelo de CCR dMMR, la acumulación de células T CD4+ en los tumores MC38 fue menor que la observada en los tumores AKP en etapa temprana (p = 0,0042 para MC38; p = 0,0057 para MC38 LVM2) (Figura S1F). En el epitelio no tumoral, las frecuencias de IEL CD4+ y CD8αβ+ en los ratones inyectados con MC38 fueron similares a las de los controles inyectados con MC38 LVM2 y placebo (Figura S1G). Estos resultados sugieren que, aunque los tumores MC38 y MC38 LVM2 crecen más agresivamente que los modelos de organoides probados, proporcionan un sistema de CCR ortotópico dMMR adecuado para analizar las respuestas de las células T en el sitio del tumor. En conjunto, estos datos indican distintas respuestas de las células T en los modelos de CCR ortotópicos con patrones de crecimiento divergentes, estabilidad de microsatélites y potencial metastásico.

Los tumores AKP no metastásicos inducen potentes respuestas tempranas de las células T

La divergencia en etapa temprana en la acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ entre los tumores AKP y pro-Met sugiere que estos modelos establecen distintos microambientes inmunitarios en el inicio del tumor. Esto nos llevó a realizar dos enfoques complementarios para investigar más a fondo estas diferencias. Primero, evaluamos el potencial de las células T para interactuar directamente con las células tumorales AKP y pro-Met en la etapa temprana del CCR, dado que la IHC confirmó su estrecha proximidad a ambos tipos de tumores en este momento (Figura 1D). Para lograr esto, adaptamos primero el sistema LIPSTIC universal (uLIPSTIC) a nuestros modelos de CCR^[25],^[26]. Las líneas de organoides AKP y pro-Met que expresan Sortasa A (SrtA) se inyectaron ortotópicamente en las paredes del colon de ratones G5 que expresan Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC (Figuras 2A y S1H). El tratamiento de estos ratones con tamoxifeno indujo la expresión de SrtA en las células de las células caliciformes y las células epiteliales tímicas, evitando así el rechazo de los tumores que expresan SrtA (Figura 2A)^[27]. Dos semanas después de la inyección del tumor, los ratones fueron inyectados con el sustrato biotina-LPETG y los tumores se cosecharon para el análisis de citometría de flujo. Los tumores AKP y pro-Met expresaron SrtA, la etiqueta FLAG y biotina en su superficie, lo que confirmó su capacidad para transferir el sustrato biotina-LPETG a las células T que expresan G5 mediante la interacción intercelular (Figura 2B). Si bien los tumores pro-Met mostraron interacciones mínimas con las células CD8αβ+ y ninguna interacción detectable con las células CD4+, una fracción sustancial de las células CD4+ y CD8αβ+ interactuó con los tumores AKP (Figura 2C). En comparación con las células T que no interactúan (biotina−), una proporción mayor de células T biotina+ expresó los marcadores de activación PD-1, Tbet y CD44, lo que sugiere que las interacciones entre las células T y los tumores AKP son biológicamente funcionales (Figura 2D). Las células caliciformes del colon no etiquetaron ninguna célula inmune dentro de los IEL del colon, la lámina propia (LP) o los ganglios linfáticos mesentéricos (mLN), lo que apoya aún más que cualquier etiquetado observado en el tumor se origina a partir de interacciones con las células tumorales que expresan SrtA (Figuras S1I y J). Para determinar si las células T αβ son los principales interactores inmunitarios en este modelo, analizamos todas las poblaciones CD45+ infiltrantes tumorales, incluidas las células B y varias líneas celulares mieloides. Descubrimos que las células T αβ constituyen la gran mayoría (~70%) de la fracción interactuante de biotina+, mientras que las poblaciones innatas como los eosinófilos, los neutrófilos y los macrófagos mostraron un etiquetado de biotina mínimo (Figura S1K). Esto revela que, a pesar de que las células T representan una minoría del infiltrado CD45+ total, son la población inmunitaria más interactiva con las células tumorales. Estos hallazgos revelan que los tumores AKP en etapa temprana respaldan el compromiso de las células T productivo, mientras que los tumores pro-Met evaden en gran medida tales interacciones, estableciendo trayectorias inmunitarias divergentes entre los dos tipos de tumores.

Para determinar si las interacciones físicas detectadas por uLIPSTIC identifican una población funcionalmente relevante, primero se separaron las células T CD4+ infiltrantes tumorales biotin+ y biotin− de ratones portadores de AKP y se realizó la secuenciación de TCR de una sola célula (scTCR-seq) (Figura 2E). Se estimó la diversidad clonal con el índice de diversidad 50 (D50) de TCRβ, con valores que oscilan entre 0 (menos diverso) y 0,5 (más diverso)^[28]. También se utilizó el índice de Morisita-Horn (MHI) para determinar la superposición clonal entre los compartimentos biotin+ y biotin−, siendo 1 indicativo de una superposición clonal del 100%. Las células T CD4+ biotin+ exhibieron un D50 significativamente menor en comparación con la fracción biotin−, lo que demuestra que la interacción física con el tumor está asociada con la expansión clonal (y S1L). Además, se observó una superposición clonal mínima entre los compartimentos biotin+ y biotin−, como lo indica el bajo MHI (Figura 2E). En segundo lugar, para evaluar la potencia funcional del repertorio interactuante, se cocultivaron células T αβ biotin+ y biotin− con organoides pro-Met (Figura 2F). Tanto las células T αβ biotin+ como las biotin− exhibieron capacidad citotóxica, y la fracción biotin+ redujo significativamente la supervivencia de los organoides en comparación con la fracción biotin− (Figura 2G y S1M). Esta actividad citotóxica se acompañó de un fenotipo CD44hi PD-1+ activado (Figura 2H). Tanto las fracciones de células T biotin+ como biotin− indujeron una producción robusta de citocinas en relación con los organoides cultivados solos, como lo demuestran los niveles elevados de IFN-γ y TNF-α en los sobrenadantes del cocultivo. Aunque la secreción de citocinas no fue significativamente diferente entre las condiciones biotin+ y biotin− (Figuras 2I y J), las células T biotin+ indujeron una mayor regulación al alza de la expresión de la clase I del MHC (MHCI) en los organoides tumorales pro-Met (Figura 2K). La expresión de la clase II del MHC (MHCII) también se elevó de manera similar en ambas condiciones que contenían células T en comparación con los organoides solos, sin que se observara una diferencia significativa entre las fracciones biotin+ y biotin− (Figura 2L). Dado que la expresión de MHCI suele ser más sensible a la exposición a bajos niveles de citocinas y a las señales dependientes del contacto que MHCII^[29], la mayor regulación al alza de MHCI por la fracción biotin+ puede indicar una interacción efectora más fuerte con las células tumorales. Estos hallazgos indican que las células T que interactúan físicamente con los tumores AKP in vivo constituyen una población clonalmente expandida, activada y funcionalmente citotóxica con una mayor capacidad de modulación tumoral.

Un sistema de mapeo de destino para identificar las células T inducidas por el tumor en el CRC ortotópico

El sistema de CRC ortotópico-uLIPSTIC es una herramienta poderosa para capturar las interacciones celulares directas durante el corto período de administración del sustrato. Sin embargo, un obstáculo importante en la caracterización de las respuestas inmunitarias adaptativas a los tumores en sistemas policlonales es la incapacidad de distinguir las células T reclutadas recientemente que responden a los tumores (o a las alteraciones relacionadas con el tumor) de las células T residentes en los tejidos que ocupan el sitio de trasplante antes de la introducción del tumor. Esta distinción es particularmente desafiante en el entorno intestinal, dado el gran número de linfocitos residentes que participan en las respuestas inmunitarias en curso contra los antígenos luminales^[30],^[31]. Para abordar este desafío y complementar el sistema uLIPSTIC, combinamos los modelos de CRC ortotópicos con un enfoque de mapeo de destino para rastrear el reclutamiento y la activación de las células T periféricas en el colon^[21],^[22],^[32],^[33]. El tratamiento con tamoxifeno de ratones SellCreERT2 X Rosa26CAG-LSL-tdTomato (iSellTomato) etiqueta permanentemente las células T naïves que expresan L-selectina (Sell, CD62L+) como Tomato+. Esta estrategia permitió enriquecer las células T "ex-naïves" (CD62L− Tomato+) y seguir el destino de las células T inducidas por el tumor^[32],^[33].

Para validar la eficiencia del etiquetado de células T en ratones iSellTomato en condiciones homeostáticas, se recolectaron el mLN, el epitelio del colon y la LP poco después de la administración de tamoxifeno para el análisis de citometría de flujo (Figuras S2A y B). En todos los compartimentos, más de la mitad de las células CD62L+ eran Tomato+. Como se esperaba, la mayoría de las células T CD4+ y CD8αβ+ en el mLN expresaban CD62L. En contraste, aproximadamente el 20-40% de las células T CD4+ y CD8αβ+ en el epitelio del colon y la LP eran CD62L+, principalmente debido al etiquetado de las células T naïves presentes de forma natural en los folículos linfoides aislados y los parches colónicos^[34]. El tinte de inmunofluorescencia (IF) y la imagen confocal confirmaron la presencia de células Tomato+ que se co-localizan con las estructuras de agregados linfoides en el colon (Figura S2B). Para validar aún más que el sistema iSellTomato también se puede utilizar para etiquetar y rastrear las células T durante el crecimiento tumoral establecido, los ratones fueron tratados con tamoxifeno cuatro semanas después del trasplante de tumores AKP o pro-Met y se analizaron un día después (Figura S2C). El tinte de IF confirmó la presencia de células T CD3+ Tomato+ dentro de los colones con tumores, y estas células se localizaron predominantemente en los agregados linfoides (Figura S2D). Estos hallazgos demuestran que el etiquetado iSellTomato sigue siendo efectivo en etapas posteriores de la progresión tumoral y se puede utilizar para rastrear las células T reclutadas recientemente en el colon con tumores. A lo largo de este estudio, el término "mapeo de destino" se refiere específicamente a estas células T CD62L− Tomato+. Dado que la disminución de CD62L puede ocurrir después de la activación de las células T en múltiples ubicaciones anatómicas, esta población probablemente incluye células que se activan en los ganglios linfáticos que drenan el tumor, en las estructuras linfoides del colon o dentro del microambiente tumoral (TME). Por lo tanto, el sistema iSellTomato no tiene la intención de identificar exclusivamente las células T específicas del tumor, sino más bien de enriquecer la ola de células T policlonales que se reclutan y activan durante el período definido de establecimiento tumoral, lo que permite distinguirlas de los linfocitos residentes en los tejidos preexistentes.

Para investigar la dinámica del reclutamiento y la activación de las células T en los modelos de CRC ortotópicos, inyectamos los organoides tumorales y las líneas celulares previamente descritas en las paredes del colon de ratones iSellTomato y administramos tamoxifeno antes o cuatro semanas después de la inyección del tumor. Dos semanas después de la administración de tamoxifeno, recolectamos tumores y epitelio del colon de ratones inyectados con tumor y con control (sham) para el análisis de citometría de flujo (Figura 3A). En la etapa temprana, observamos una mayor acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ recién reclutadas y mapeadas por destino CD62L− Tomato+ en el AKP no metastásico en comparación con los tumores de colon pro-Met (Figuras 3B y C). En la etapa tardía, el reclutamiento de células T CD4+ y CD8αβ+ a los tumores AKP no metastásicos disminuyó a niveles comparables a los observados en ambas etapas del modelo pro-Met (Figuras 3B y C). Tanto los tumores MC38 como los MC38 LVM2 mostraron tasas de reclutamiento de células T comparables a las de los tumores AKP no metastásicos en etapa temprana (Figura 3D). El modelo AKP en etapa temprana resultó en una mayor acumulación de células T CD4+ recién reclutadas en el epitelio del colon adyacente, mientras que otros modelos mostraron patrones de reclutamiento comparables al control (sham) (Figura 3E). En contraste, ni los modelos de organoides ni los de líneas celulares afectaron la acumulación de células T CD8αβ+ recién reclutadas en el epitelio del colon adyacente (Figuras 3F y G). Estos datos indican aún más que los tumores AKP no metastásicos desencadenan una nueva acumulación de células T y fomentan un microambiente más inflamado, en contraste con los tumores pro-Met, que parecen evadir tales nuevas respuestas desde la etapa temprana, lo que provoca una respuesta de células T similar a la que se observa en la etapa tardía del CRC.

La alteración de la respuesta temprana de las células T no es suficiente para impulsar la metástasis de los tumores AKP

Las diferencias fenotípicas tempranas de las células T entre los modelos AKP y pro-Met nos llevaron a investigar si el entorno de células T más inflamado en los tumores AKP podría afectar su progresión metastásica. Primero, determinamos si la ausencia de metástasis después del trasplante de tumores AKP refleja una incapacidad intrínseca de las células AKP para colonizar el hígado. Tras la inyección intrasplénica^[35],^[36], tanto las líneas celulares tumorales AKP como las pro-Met fueron igualmente capaces de formar metástasis hepáticas, lo que indica que los tumores AKP son competentes para crecer en el hígado cuando se les da acceso directo, y que su resultado no metastásico en el modelo ortotópico se debe probablemente a una diseminación alterada en lugar de a la incapacidad de colonizar el hígado (Figura S2E).

Luego, investigamos directamente el papel de las células T en la configuración del tumor primario de AKP y los resultados metastásicos. Inyectamos ortotópicamente tumores AKP y pro-Met en ratones inmunodeficientes Rag1−/− (RKO), que carecen de células T y B funcionales. A las seis semanas posteriores a la inyección, los tumores de colon AKP y pro-Met en los ratones RKO alcanzaron tamaños comparables a los observados en los huéspedes inmunocompetentes. Coherente con sus fenotipos en ratones inmunocompetentes, los tumores pro-Met formaron metástasis hepáticas, mientras que los tumores AKP permanecieron no metastásicos (Figura S2F). Para probar específicamente el impacto de las células T en el fenotipo observado de AKP, realizamos el agotamiento de anticuerpos de las células T CD4+ o CD8+ en ratones C57BL/6 trasplantados con organoides tumorales AKP (Figura S2G). El agotamiento eficiente de las células T CD4+ o CD8+ se confirmó mediante citometría de flujo (Figura S2H). En el punto de tiempo temprano, los tamaños de los tumores AKP fueron comparables entre los grupos. Sin embargo, en la etapa tardía, los ratones con células T CD8+ agotadas desarrollaron tumores significativamente más grandes, mientras que los ratones con células T CD4+ agotadas mostraron tamaños de tumores intermedios entre el control de isotipo y las condiciones de células T CD8+ agotadas (Figura S2I). Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD4+ alteró la activación de las células T CD8+, lo que redujo su producción de IFN-γ y su expresión de PD-1, mientras que el agotamiento de las células T CD8+ tuvo efectos mínimos en la activación de las células T CD4+ (Figuras S2J y K). No obstante, no se detectaron metástasis hepáticas en ninguno de los grupos experimentales, lo que sugiere que los programas transcripcionales intrínsecos en los tumores AKP y pro-Met probablemente desempeñan un papel dominante en la determinación de su destino metastásico. Aunque ni la focalización de las células T CD4+ ni la de las células T CD8+ fueron suficientes para impulsar la progresión metastásica en los tumores AKP, nuestros datos refuerzan el papel de las células T en la configuración del microambiente tumoral primario (TME). Esto nos llevó a investigar cómo las células T CD4+ y CD8αβ+ se adaptan funcionalmente a los distintos TME de AKP y pro-Met, independientemente de su capacidad para determinar los resultados metastásicos.

Perfil transcripcional de las células T reclutadas recientemente en la etapa temprana de CRC no metastásico y pro-metastásico

Para determinar cómo divergen los programas de adaptación temprana de las células T en los modelos de CRC AKP frente a pro-Met, nos centramos en el enfoque de mapeo de destino iSellTomato, que permite el seguimiento de las células T policlonales “ex-naïve” marcadas en el momento del trasplante tumoral y durante las primeras etapas del desarrollo tumoral. Este enfoque nos permitió evaluar cómo se adaptan las células T recién reclutadas al microambiente tumoral (TME). Se trasplantaron ratones iSellTomato con organoides AKP o pro-Met, o se sometieron a un procedimiento simulado (ver Figura 3A). Dos semanas después, se clasificaron las células T CD62L− Tomato+ aisladas de los tumores de colon y del epitelio no tumoral, y se realizó un secuenciamiento de ARN de célula única y del receptor de células T (TCR) (scRNA/TCR-seq) utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium para definir los programas transcripcionales inducidos por cada tipo de tumor. La visualización UMAP y la agrupación no supervisada de las células T CD4+ mapeadas por destino las clasificaron en ocho grupos distintos a nivel transcripcional en los tumores y en las células IEL del colon (Figura 4A). Los grupos 0 y 5 correspondieron a las células citotóxicas/Th1 de las células IEL y del tumor, respectivamente, y se caracterizaron por la alta expresión de genes como Nkg7, Ccl5, Cxcr3, Tbx21, Ifng, Cd44, Cd226 y Bhlhe40. En contraste, el grupo 1 se caracterizó por la expresión de Sell, S1pr1, Igfbp4, Il7r y Ccr7, que son marcadores clásicos de las células T naïve. El grupo 3 también expresó marcadores asociados con la capacidad de auto-renovación, como Tcf7 y Slamf6. Los grupos 1 y 3 mostraron una disminución de los marcadores de activación, como Cd44, Il2ra y Pdcd1 (Figuras 4A-C). Los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) CD4+ de AKP y las células IEL adyacentes se enriquecieron en los grupos citotóxicos/Th1, mientras que los TIL CD4+ de pro-Met se representaron predominantemente en los grupos similares a las células naïve 1 y 3 (Figuras 4A-D). Cabe destacar que, aunque nuestra clasificación se enriqueció con células T CD62L− Tomato+ ex-naïve, las células de los grupos 1 y 3 conservaron un perfil similar a las células naïve a nivel transcripcional.

Las células IEL y TIL CD4+ de pro-Met también se enriquecieron en el grupo 2, que mostró una firma de células T foliculares auxiliares (Tfh) caracterizada por la expresión de Cxcr5, Bcl6, Il21 y Tox2. La firma de células T helper 17 (Th17) se asignó al grupo 4, caracterizado por Rorc, Il17a y Il17re, y estuvo dominado por los TIL CD4+ de pro-Met. El grupo 7 incluyó las células T reguladoras (Tregs) definidas por la expresión de Foxp3, Il10 y Gzmb. Los TIL CD4+ de pro-Met se enriquecieron ligeramente más en este grupo que los TIL CD4+ de AKP (Figuras 4A-D).

Como lo indican las distribuciones de los grupos y los genes expresados diferencialmente seleccionados, los tumores AKP y las células IEL adyacentes se enriquecieron con células citotóxicas y Th1 activadas, mientras que las células T CD4+ tumorales y las células IEL de pro-Met expresaron genes de firma similares a las células naïve, Tfh y Th17 (Figuras 4D, E y S3A). El análisis de enriquecimiento de Procesos Biológicos de la Ontología Genética (GOBP) apoyó aún más esta dicotomía, mostrando la regulación al alza de las vías de migración de linfocitos, activación y respuesta inmune mediada por citocinas en las células T CD4+ de AKP, en contraste con la regulación al alza de la traducción citoplasmática y la curación de heridas mediada por la angiogénesis en las células T CD4+ de pro-Met (Figura 4F). Estos análisis sugieren que los tumores AKP inducen una activación robusta de las células T CD4+ y programas de diferenciación citotóxica que los tumores pro-Met no logran inducir.

Las células T CD8αβ+ mapeadas por destino se clasificaron en cuatro grupos principales. De manera similar a las células T CD4+ de pro-Met, las células T CD8αβ+ de pro-Met mostraron un fenotipo similar a las células naïve/células madre. Un total del 78% de las células T CD8αβ+ de pro-Met (en comparación con el 54% de sus contrapartes AKP) se localizaron en el grupo 1, caracterizado por la alta expresión de Ccr7, Sell, Lef1, S1pr1, Tcf7 y Il7r (Figuras S3B y C). En contraste, el 23% de las células T CD8αβ+ de AKP (en comparación con el 9% de sus contrapartes pro-Met) se localizaron en un grupo efector citotóxico 2, caracterizado por la expresión de marcadores de activación y estimulación del TCR, como Ccl5, Nkg7, Nr4a1, Dusp5, Icos, Ctla4, Tigit, Il2rb y Pdcd1 (Figuras S3B y C), lo que refleja nuevamente un estado más activado en los tumores AKP. Esto fue respaldado aún más por el análisis GOBP, que mostró la regulación al alza de las vías de activación de células T y vías inflamatorias en los tumores AKP (Figura S3D). En comparación con las células IEL de AKP, las células IEL de pro-Met mostraron un perfil citotóxico, como lo indica la expresión de genes como Gzma, Gzmb, Ifitm1, Ifitm2 y Cd226. Paradójicamente, esto se acompañó de una menor expresión de Ifng, Nkg7 y Il2rb (Figura S3E). En consecuencia, el análisis GOBP mostró la regulación al alza de la muerte celular programada mediada por granzimas y la señalización y la respuesta de defensa, pero también una menor señalización de la activación de células T en las células T CD8αβ+ IEL de pro-Met (Figura S3D). Estos datos indican una falta de activación de las células T CD8αβ+ en los tumores pro-Met.

Estados distintos de las células T en las primeras etapas en los tumores AKP y pro-Met en las células T mapeadas por destino

El secuenciamiento de ARN de célula única reveló perfiles transcripcionales distintos que discriminan los estados de las células T citotóxicas y naïve en los tumores AKP y pro-Met, respectivamente. A continuación, comparamos los fenotipos de reclutamiento de células T en etapas temprana y tardía con las respuestas inmunes preexistentes residentes en el intestino, siguiendo el mismo diseño experimental que se muestra en la Figura 3A. Las células T CD4+ TIL no mapeadas por destino (Tomato−) tuvieron frecuencias comparables de células CD62L+ en los diferentes modelos de tumores y puntos de tiempo. En contraste, las células T CD4+ TIL mapeadas por destino (Tomato+) mostraron una proporción significativamente mayor de células CD62L+ en los tumores pro-Met que en los tumores AKP durante las primeras etapas (Figura 5A). Tanto las células T CD8αβ+ TIL como las células T Tomato− mostraron un mayor enriquecimiento de células CD62L+ en los tumores pro-Met que en los tumores AKP. Sin embargo, en la etapa tardía, la proporción de células que expresan CD62L fue similar entre las células T CD4+ o CD8αβ+ Tomato+ en ambos modelos de tumores (Figuras 5A y 5B). En conjunto, estos datos indican que el colon contiene un grupo basal de células T CD4+ y CD8αβ+ CD62L+, que probablemente residen dentro de los parches del colon y los folículos linfoides aislados. El mapeo de destino de estas células naïve que residen en el colon y los ganglios linfáticos durante el CRC temprano mostró además que estas células se diferenciaron en estados efectores activados solo en los tumores AKP, mientras que en los tumores pro-Met, permanecieron en gran medida en un estado naïve.

Si bien la secreción de IFN-γ entre las células T TIL no mapeadas por destino (CD4+ y CD8αβ+ Tomato−) no se vio significativamente afectada por el tipo o la etapa del tumor, las células T infiltrantes tumorales mapeadas por destino mostraron una mayor producción de IFN-γ en los tumores AKP en etapa temprana que en los tumores pro-Met en etapa temprana o en los tumores en etapa tardía (Figuras 5C y D). En consecuencia, las células T Tregs FoxP3+ fueron más frecuentes entre las células T CD4+ Tomato+ que infiltran los tumores pro-Met en etapa temprana que en los tumores AKP, mientras que no se observó ninguna diferencia en el compartimento no mapeado por destino (Figura 5E). Este enriquecimiento temprano de las células T Tregs FoxP3+ entre las células T mapeadas por destino en los tumores pro-Met sugiere que el entorno inmunosupresor se establece en las primeras etapas del desarrollo tumoral pro-metastásico, lo que podría contribuir al fracaso de la diferenciación de las células T efectoras en este modelo. Además, de manera consistente con el entorno de activación reducido, una proporción menor de células T CD8αβ+ Tomato+ que infiltran los tumores pro-Met expresaron PD-1 que las que se encuentran en los tumores AKP en una etapa temprana, una diferencia que no se observó entre las células T CD8αβ+ Tomato− (Figura 5F). En conjunto, estos hallazgos refuerzan que las células T CD4+ y CD8αβ+ mapeadas por destino en el CRC pro-metastásico adquieren un estado hipoactivado temprano, similar al de las células T recién mapeadas por destino en las etapas tardías de los modelos de CRC AKP y pro-Met.

Para evaluar cómo la progresión tumoral influyó en el estado de activación de las células T reclutadas en las primeras etapas, se administró tamoxifeno antes de la inyección del tumor, y se analizaron las células T Tomato+ mapeadas por destino seis semanas después (Figuras 5G-M). Las células T CD4+ reclutadas en los tumores AKP y pro-Met mostraron una disminución de CD62L en comparación con sus niveles en el punto de tiempo temprano, aunque las células T CD4+ en los tumores pro-Met conservaron una expresión ligeramente mayor de CD62L (Figuras 5A y H). Además, estas células T CD4+ mapeadas por destino en las primeras etapas perdieron su capacidad para producir IFN-γ en el modelo AKP (p=0,019), lo que las hizo funcionalmente similares a las que se encuentran en los tumores pro-Met (Figuras 5C e I). De manera consistente, las frecuencias de células T CD4+ mapeadas por destino en los tumores AKP fueron comparables a las observadas en los tumores pro-Met (Figura 5J). Las células T CD8αβ+ mapeadas por destino en las primeras etapas en los tumores AKP mantuvieron un estado de activación más alto en el punto de tiempo tardío, como lo indica la disminución persistente de CD62L, la producción sostenida de IFN-γ y la expresión elevada de PD-1. En contraste, las células T CD8αβ+ en los tumores pro-Met permanecieron en un estado inactivo (Figuras 5B, D, F y K-M). Estos datos indican que, aunque los tumores AKP inducen una activación robusta de las células T CD4+ y CD8αβ+ en las primeras etapas, solo las células T CD8αβ+ pueden mantener este estado de activación temprano a medida que progresan los tumores, lo que puede ser la base del aumento del crecimiento del tumor primario observado tras la depleción de las células T CD8+.

Los tumores AKP inducen la expansión clonal de las células T CD4+

Dado que se observaron distintas trayectorias de las células T en las primeras etapas en los modelos AKP y pro-Met, a continuación, investigamos si estas trayectorias se asociaron con una composición clonal divergente de las células T CD4+ y CD8αβ+ infiltrantes tumorales. Caracterizamos el repertorio de células T CD4+ y CD8αβ+ en los modelos simulado, AKP y pro-Met utilizando el conjunto de datos de secuenciamiento de ARN de célula única/TCR. La expansión clonal fue prominente entre las células T CD4+ que infiltraron los tumores AKP y el epitelio no tumoral adyacente (Figuras 6A y S4A). En consecuencia, la superposición clonal fue alta entre los compartimentos IEL y tumoral, con un MHI promedio de 0,57 (Figura 6B). En contraste, los tumores pro-Met y las células IEL CD4+ mostraron un repertorio de TCR diverso, similar a la diversidad observada en las células IEL simuladas, y por lo tanto exhibieron una menor superposición clonal entre los dos compartimentos (MHI=0,13) (Figuras 6A, B y S4A). El análisis de la distribución de los grupos reveló que el 42% y el 40% de las células en los 20 clones CD4+ más expandidos se localizaron en el grupo 0 (células IEL Th1) y el grupo 5 (células tumorales Th1), respectivamente (Figuras 6C y D). Las células T CD4+ restantes en los 20 clones más expandidos se distribuyeron entre el grupo Th17 4 (8%), el grupo Dock2hi 6 (5%), el grupo Tfh 2 (2%) y el grupo naïve/células madre TCF7hi 3 (2%). Esta distribución se alineó bien con los perfiles transcripcionales de estos grupos, con la mayoría de las expansiones que se producen en los grupos citotóxicos y activados. Además, 16 de los 20 clones más expandidos provinieron de los tumores AKP y las células IEL, mientras que los cuatro restantes provinieron de las células IEL y las células infiltrantes tumorales de pro-Met (Figura 6D). Estos datos confirman que los tumores no metastásicos AKP son más inmunogénicos que los tumores pro-Met, lo que conduce a una expansión clonal robusta de las células T CD4+.

Las células T CD8αβ+ exhibieron dinámicas clonales distintas en comparación con las células T CD4+. En primer lugar, no se observó expansión clonal en las células T CD8αβ+ infiltrantes tumorales en los modelos AKP o pro-Met. Sin embargo, se observó una expansión clonal moderada en las células IEL CD8αβ+ en ambos grupos AKP y pro-Met; su D50 fue solo ligeramente menor que el observado en el control simulado (Figura S4B). Además, hubo una superposición clonal mínima entre los compartimentos tumoral e IEL en ambos modelos de tumores (Figura S4C). La mayoría (90%) de los 20 clones de células T CD8αβ+ más expandidos se asignaron al grupo citotóxico IEL 0 (Figura S4D).

Dado que se observa una marcada expansión clonal de los linfocitos T CD4+ en ratones inyectados con organoides AKP, a continuación, buscamos identificar las especificidades de los TCR de estos clones expandidos. Seleccionamos 21 clones de linfocitos T CD4+, reconstruimos sus TCR en hibridomas NFAT-GFP y confirmamos su capacidad funcional para responder a la estimulación de los TCR tras el tratamiento con anti-CD3 (Figuras S4E, F y Tabla suplementaria 1). A continuación, probamos los hibridomas que mostraron respuestas robustas al anti-CD3 para evaluar su reactividad contra antígenos tumorales, microbianos y dietéticos mediante un ensayo de cribado in vitro ^[37], ^[38] (Figura 6E). Si bien ninguno de los clones probados reconoció los antígenos tumorales, un clon (TCR17) mostró reactividad a una dieta estándar, y otro clon (TCR99) reaccionó a las heces recogidas de ratones de control SPF, AKP o portadores de tumores pro-Met (Figura S4F). Para delimitar los candidatos dietéticos y microbianos, examinamos estos clones para evaluar su reactividad contra proteínas dietéticas definidas y especies comensales presentes en la microbiota Oligo-MM^[12], que abarca las principales especies que se encuentran en la microbiota SPF^[39], incluidas las de nuestro centro (Figura 6E). También probamos la reactividad contra Helicobacter hepaticus, que se ha asociado previamente con la inmunidad antitumoral en un modelo de CCRC^[40]. El clon TCR17, reactivo a la dieta, que se detectó en los tumores pro-Met y en los IEL, no mostró reactividad a las proteínas de caseína, zeína o soja purificadas (Figura 6E). Entre los clones de TCR probados para detectar microbios específicos, TCR427, que se detectó en los tumores pro-Met, respondió solo a los lisados de Turicimonas muris. Por el contrario, TCR99 reconoció varias especies bacterianas, incluidas Blautia coccoides, Turicimonas muris, Bifidobacterium longum, Clostridium clostridioforme, Clostridium innocuum y Helicobacter hepaticus (Figura 6E). Sin embargo, TCR99 no respondió a Flavonifactor plautii o Bacteroides caecimuris, lo que sugiere una reactividad amplia pero selectiva. TCR99 es un clon común compartido entre los tumores AKP y los IEL pro-Met. Cabe destacar que los dos clones de TCR que responden a los antígenos microbianos (TCR427 y TCR99) se localizaron principalmente en el cúmulo Tfh 2, además de los cúmulos Th1 0 y 5 (Figura 6E). Dada la estabilidad de microsatélites de los organoides utilizados, la expansión de las células T observada y la actividad antitumoral probablemente se producen independientemente del reconocimiento clásico de neoantígenos, posiblemente a través de células T con reactividad cruzada o la activación independiente de antígenos de moléculas inducidas por el estrés^[8], ^[41]. Los patrones de reactividad de los TCR indican que las respuestas antimicrobianas y dietéticas contribuyen a la composición del repertorio de células T durante la progresión tumoral. En general, estos resultados revelan una marcada expansión de las células T en respuesta a los tumores AKP, lo que se asoció con la diferenciación de células T efectoras y antitumorales. La expansión clonal de las células T se dirigió, en parte, hacia antígenos no tumorales derivados de la dieta y la microbiota, lo que sugiere un papel para el repertorio inmunitario homeostático en estado estacionario en las respuestas tumorales.

La expresión de MHCII intrínseca al tumor modula el resultado tumoral

Tras definir la arquitectura clonal y las amplias especificidades antigénicas del repertorio inducido por el tumor, a continuación, abordamos si las células T mapeadas por destino son funcionalmente capaces de controlar el crecimiento de las células tumorales, o si esta capacidad difiere según el potencial metastásico. Establecimos un sistema de cocultivo de organoides tumorales utilizando células T aisladas del tumor y del epitelio adyacente de ratones iSellTomato dos semanas después de la trasplantación ortotópica con tumores AKP o pro-Met. Siguiendo nuestra estrategia de mapeo de destino in vivo (véase la Figura 3A), clasificamos las células T CD4+ y CD8+ en tres subconjuntos distintos: células T ingenuas o de memoria central (CD62L+), células T efectoras o de memoria residentes (CD62L−) Tomato− y células T efectoras recientemente activadas y mapeadas por destino (CD62L−) Tomato+. Estas poblaciones se cocultivaron posteriormente con organoides tumorales pro-Met disociados, y se cuantificó la recuperación de los organoides, la liberación de citocinas y los cambios en el fenotipo de las células tumorales cinco días después (Figura 7A). Solo las células T mapeadas por destino derivadas del microambiente tumoral (TME) no metastásico de AKP demostraron actividad antitumoral, reduciendo el número de organoides pro-Met sanos en comparación con otras condiciones (Figuras 7B-D y S5A). Este efecto supresor fue específico del TME no metastásico, ya que las células T CD62L− Tomato+ mapeadas por destino derivadas de los tumores pro-Met no lograron controlar el crecimiento de los organoides (Figuras 7B-D y S5A).

Para investigar el mecanismo que impulsa esta actividad antitumoral, analizamos el perfil de citocinas en los sobrenadantes del cocultivo. Detectamos la secreción de IFN-γ exclusivamente en los cocultivos que contenían las células T mapeadas por destino citotóxicas derivadas de AKP (Figura 7E), mientras que no se observaron diferencias significativas en la secreción de TNF-α en ninguna de las condiciones (Figura S5B). La adición de un anticuerpo bloqueador anti-IFN-γ abolió este efecto citotóxico, lo que confirmó que la muerte de las células tumorales observada dependía de IFN-γ (Figuras 7C-E). IFN-γ es una citocina pleiotrópica que se sabe que aumenta la visibilidad de las células tumorales al aumentar la maquinaria de presentación de antígenos, incluido MHCI y MHCII. En consonancia con esto, observamos una mayor expresión de MHCI y MHCII en la superficie de las células de los organoides específicamente en presencia de las células T mapeadas por destino derivadas de AKP que producen IFN-γ (Figura 7F y G). Estos hallazgos validan funcionalmente el modelo iSellTomato, demostrando que enriquece específicamente las células T inducidas por el tumor capaces de suprimir el tumor mediada por IFN-γ, un estado funcional que está alterado en las células T reclutadas en los tumores pro-metastásicos.

Las divergentes respuestas de las células T inducidas por los tumores AKP y pro-Met nos llevaron a preguntarnos si esto refleja diferencias genómicas subyacentes entre las dos líneas. Para abordar esto, realizamos una secuenciación del exoma completo (WES) en ambas líneas de organoides. Sorprendentemente, las dos líneas presentaban una carga mutacional muy comparable, compartiendo 1102 variantes somáticas, con solo 137 mutaciones específicas de AKP y 129 mutaciones específicas de pro-Met identificadas, cada una de las cuales representaba menos del 12% de la carga mutacional total (Tabla suplementaria 2). Se confirmaron las mutaciones impulsoras esperadas en Apc, Kras y Tp53 en el conjunto de mutaciones compartidas, lo que es consistente con el origen clonal común de ambas líneas. Entre las mutaciones específicas de pro-Met, encontramos varias alteraciones en genes relacionados con la regulación inmunitaria, incluidas las mutaciones en Hivep1, Ppp2r5a, Sp110 y Nucks1, que pueden influir en la expresión de genes relacionados con la inmunidad y en los programas reguladores asociados al cromatín (Tabla suplementaria 2). Sin embargo, no se detectaron mutaciones en los genes centrales de presentación de antígenos, y la divergencia mutacional general entre las líneas siguió siendo modesta. Estos datos sugieren que las diferencias funcionales entre AKP y pro-Met es poco probable que estén impulsadas por una divergencia genómica importante y, en cambio, apuntan a la reprogramación transcripcional o epigenética como el mecanismo principal de evasión inmunitaria. En consonancia con esto, se ha demostrado que la reprogramación pro-metastásica en el CCRC está impulsada por la plasticidad epigenética, incluida la aparición de programas transcripcionales similares a los fetales y basales/escamosos que convergen en la pérdida de GATA6, en lugar de por alteraciones genéticas adicionales^[42].

Dada la prominente expansión clonal de las células T CD4+ observada exclusivamente en el modelo AKP, lo que sugiere una presentación de antígenos dependiente de MHCII productiva, examinamos directamente la expresión de MHCII en las células tumorales de ambos modelos. El análisis citométrico de flujo de tumores ex vivo en etapa temprana reveló una reducción específica del tumor en la expresión de MHCII en las células tumorales pro-Met en comparación con los tumores AKP, mientras que la expresión de MHCII en el epitelio colónico adyacente siguió siendo comparable entre los dos modelos (Figura 8A). Para probar directamente si esta pérdida de MHCII es un impulsor causal de la evasión inmunitaria y la metástasis, generamos una línea de organoides AKP deficiente en MHCII mediante la eliminación del transactivador de la clase II (Ciita) utilizando CRISPR/Cas9 (AKP.CiitaKO) (Figuras 8B y S5C). Si bien los tamaños de los tumores primarios de colon fueron comparables entre los ratones trasplantados con AKP.CiitaKO o su línea tipo salvaje parental (Figura 8C), la pérdida de MHCII resultó en una reducción en la frecuencia de las células T CD4+ infiltrantes en el tumor (Figura 8D). Además, el análisis scTCR-seq reveló que las células T CD4+ que infiltran los tumores AKP.CiitaKO exhibieron un D50 más alto en comparación con los tumores AKP de tipo salvaje, lo que indica un fracaso en la expansión clonal característica de las respuestas inducidas por los tumores AKP (Figuras 8E y S5D). En la etapa tardía de la progresión tumoral, los ratones que portaban tumores AKP.CiitaKO desarrollaron tumores primarios de colon significativamente más grandes que los que portaban tumores AKP de tipo salvaje, y aproximadamente el 28% de los ratones AKP.CiitaKO desarrollaron macrometástasis hepáticas. Por el contrario, ninguno de los ratones trasplantados con el modelo parental AKP desarrolló metástasis (Figura 8F). En un experimento complementario, la sobreexpresión de Ciita en los organoides pro-Met (pro-Met.CiitaOE) no alteró el tamaño del tumor de colon en etapa tardía ni la metástasis hepática (Figura S5E), lo que sugiere que, si bien la pérdida de MHCII es fundamental, restaurarla por sí sola no es suficiente para superar los programas multifacéticos de evasión inmunitaria establecidos en los tumores pro-metastásicos. Finalmente, evaluamos el impacto de la pérdida de MHCII en las interacciones físicas entre el tumor y las células T utilizando el sistema uLIPSTIC. La proporción de células T CD4+ o CD8αβ+ que interactúan con el tumor no cambió en AKP.CiitaKO en comparación con los tumores AKP de tipo salvaje, y de manera similar, pro-Met.CiitaOE no rescató las interacciones de las células T en relación con los tumores pro-Met de tipo salvaje (Figura S5F). Esto sugiere que las interacciones físicas entre el tumor y las células T están reguladas por mecanismos independientes de MHCII en ambos modelos. En conjunto, estos hallazgos identifican a MHCII intrínseco al tumor como un regulador clave de las respuestas de las células T CD4+ que restringe el crecimiento del tumor primario.

Perfil inmunológico de modelos ortotópicos de CCRC con distinto potencial metastásico

Para investigar la infiltración de linfocitos T en los tumores de colon y el epitelio colónico sano adyacente, implementamos modelos ortotópicos de CCRC guiados por colonoscopio^[21], ^[22]. Inyectamos las siguientes líneas de organoides tumorales de ratón en las paredes del colon de ratones inmunocompetentes B6: 1) AKP, que alberga mutaciones Apc−/−, KrasG12D y Tp53−/−^[21], ^[23], ^[24], y 2) línea pro-metastásica (pro-Met) que se generó mediante múltiples pasajes in vivo_ de la línea AKP (Figuras 1A, S1A y B). Para cada una de estas líneas de organoides tumorales trasplantadas, evaluamos el crecimiento del tumor de colon, la metástasis hepática y el fenotipo de las células T en una etapa temprana (dos semanas después de la inyección del tumor) y en una etapa tardía (6-7 semanas después de la inyección del tumor) del desarrollo del CCRC. Este análisis temporal nos permitió determinar cuándo surgen las diferencias en la agresividad tumoral y la infiltración inmunitaria y cómo evolucionan con el tiempo. Si bien el diámetro promedio del tumor de colon fue comparable entre ambos modelos de organoides tumorales en la etapa temprana del CCRC, los tumores pro-Met fueron más grandes en la etapa tardía del CCRC (Figura 1B). Se observaron metástasis hepáticas solo en el modelo pro-Met en la etapa tardía del CCRC (Figuras 1C y S1C). Estas observaciones establecen a AKP y pro-Met como modelos de CCRC primario coincidentes que divergen marcadamente en el comportamiento metastásico, lo que proporciona un marco para una mayor investigación de su TME primario.

Para determinar cómo difieren la morfología tumoral y la infiltración inmune entre los diferentes modelos y en los distintos puntos temporales, realizamos un análisis histopatológico de los colones de ratones portadores de tumores AKP y pro-Met, tanto en las etapas iniciales como en las tardías. Realizamos una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) combinada con inmunohistoquímica (IHC) para tdTomato (para delimitar las células tumorales) y CD4 y CD8 para evaluar la infiltración de células T en las lesiones del colon (Figura 1D). Ambos tipos de tumores fueron consistentes con adenocarcinoma en la mayoría de los tumores analizados, con invasión que se extendía hasta la capa muscular en una etapa temprana (Figura 1D). En la etapa tardía, ambos modelos se clasificaron uniformemente como adenocarcinomas y exhibieron una extensión transmural desde la mucosa hasta la serosa (Figuras 1D y S1D). Para cuantificar la progresión tumoral, utilizamos una puntuación de gravedad tumoral integrando los grados de necrosis, fibroplasia y displasia epitelial. Utilizando esta métrica, los tumores AKP mostraron un aumento en la gravedad a medida que progresaban de las etapas iniciales a las tardías, lo que refleja un empeoramiento histopatológico progresivo con el tiempo. En contraste, los tumores pro-Met no mostraron un cambio significativo dependiente de la etapa, lo que es consistente con la presencia de un estado histopatológico más avanzado en una etapa temprana. Los tumores pro-Met en etapa temprana obtuvieron una puntuación intermedia, que no fue significativamente diferente de los tumores AKP en etapa temprana o de los tumores pro-Met en etapa tardía, mientras que los tumores AKP y pro-Met en etapa tardía fueron indistinguibles (Figura 1E). La evaluación por IHC indicó que ambos tumores estaban altamente infiltrados con células T CD4+ y, en menor medida, con células T CD8+ en la etapa temprana. Sin embargo, en la etapa tardía, las células T CD4+ y CD8+ se detectaron principalmente en la periferia del tumor, con menos infiltración dentro del lecho tumoral (Figura 1D). Para evaluar cuantitativamente estas diferencias inmunes, realizamos citometría de flujo en tejidos tumorales del colon para medir la acumulación de células T en los diferentes modelos y puntos temporales. Observamos una mayor acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ en los tumores AKP en etapa temprana en comparación con los tumores pro-Met en las etapas temprana y tardía (Figura 1F). Además de los tumores del colon, examinamos el epitelio adyacente no tumoral (para los linfocitos intraepiteliales, denominados IEL) para que sirviera como línea de base de referencia y para evaluar si los tumores alteran las regiones adyacentes no tumorales. Los IEL del colon de ratones inyectados con placebo se utilizaron como controles para tener en cuenta el posible daño causado por la inyección colonoscópica. El epitelio no tumoral de los ratones inyectados con AKP y pro-Met mostró una acumulación de IEL CD4+ y CD8αβ+ comparable a la de los controles inyectados con placebo (Figura 1G). Estos datos sugieren que el modelo AKP establece un entorno tumoral más inflamado que el modelo pro-Met en las etapas tempranas del desarrollo del CCRC.

Para complementar los modelos de organoides e incluir un modelo de CCRC dMMR ampliamente utilizado, inyectamos ortotópicamente la línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 y su derivado (MC38 LVM2), que se cultivó dos veces en el hígado del ratón (Figura 1A). En la etapa temprana, los ratones trasplantados con células MC38 o MC38 LVM2 desarrollaron tumores de colon comparables en tamaño a los tumores pro-Met en etapa tardía y significativamente más grandes que los tumores AKP en etapa temprana (p = 0,0352 para MC38 frente a AKP; p = 0,0052 para MC38 LVM2 frente a AKP) (Figura S1E). A pesar de esto, no se detectaron metástasis hepáticas en las líneas celulares MC38. Debido a que los ratones que portaban tumores MC38 presentaban morbilidad más allá del punto temporal temprano, todos los análisis posteriores de este modelo se realizaron exclusivamente 2 semanas después de la inyección. El análisis de citometría de flujo reveló que los tumores MC38 y MC38 LVM2 albergaban frecuencias comparables de células T CD4+ y CD8αβ+. Aunque MC38 representa un modelo de CCRC dMMR, la acumulación de células T CD4+ en los tumores MC38 fue menor que la observada en los tumores AKP en etapa temprana (p = 0,0042 para MC38; p = 0,0057 para MC38 LVM2) (Figura S1F). En el epitelio no tumoral, las frecuencias de IEL CD4+ y CD8αβ+ en los ratones inyectados con MC38 fueron similares a las de los controles inyectados con MC38 LVM2 y placebo (Figura S1G). Estos resultados sugieren que, aunque los tumores MC38 y MC38 LVM2 crecen de forma más agresiva que los modelos de organoides probados, proporcionan un sistema de CCRC ortotópico dMMR adecuado para analizar las respuestas de las células T en el sitio tumoral. En conjunto, estos datos indican distintas respuestas de las células T en los modelos de CCRC ortotópicos con patrones de crecimiento divergentes, estabilidad de microsatélites y potencial metastásico.

Los tumores AKP no metastásicos inducen potentes respuestas tempranas de las células T

La divergencia en etapa temprana en la acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ entre los tumores AKP y pro-Met sugiere que estos modelos establecen distintos microambientes inmunes al inicio del tumor. Esto nos llevó a realizar dos enfoques complementarios para investigar más a fondo estas diferencias. En primer lugar, evaluamos el potencial de las células T para interactuar directamente con las células tumorales AKP y pro-Met en la etapa temprana del CCRC, dado que la IHC confirmó su estrecha proximidad a ambos tipos de tumores en este momento (Figura 1D). Para lograr esto, primero adaptamos el sistema LIPSTIC universal (uLIPSTIC) a nuestros modelos de CCRC^[25],^[26]. Las líneas de organoides AKP y pro-Met que expresan Sortasa A (SrtA) se inyectaron ortotópicamente en las paredes del colon de ratones que expresan G5 Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC (Figuras 2A y S1H). El tratamiento de estos ratones con tamoxifeno indujo la expresión de SrtA en las células de la cresta y las células epiteliales tímicas, evitando así el rechazo de los tumores que expresan SrtA (Figura 2A)^[27]. Dos semanas después de la inyección del tumor, los ratones recibieron una inyección del sustrato biotina-LPETG y los tumores se recolectaron para el análisis de citometría de flujo. Los tumores AKP y pro-Met expresaron SrtA, la etiqueta FLAG y biotina en su superficie, lo que confirmó su capacidad para transferir el sustrato biotina-LPETG a las células T que expresan G5 mediante la interacción intercelular (Figura 2B). Si bien los tumores pro-Met mostraron interacciones mínimas con las células CD8αβ+ y no mostraron interacción detectable con las células CD4+, una fracción considerable de células T CD4+ y CD8αβ+ interactuó con los tumores AKP (Figura 2C). En comparación con las células T que no interactúan (biotina−), una mayor proporción de células T biotina+ expresaron los marcadores de activación PD-1, Tbet y CD44, lo que sugiere que las interacciones entre las células T y los tumores AKP son biológicamente funcionales (Figura 2D). Las células del epitelio del colon no marcaron ninguna célula inmune dentro de los IEL del colon, la lámina propia (LP) o los ganglios linfáticos mesentéricos (mLN), lo que apoya aún más que cualquier etiquetado observado en el tumor se origina a partir de interacciones con las células tumorales que expresan SrtA (Figuras S1I y J). Para determinar si las células T αβ son los principales interactores inmunes en este modelo, analizamos todas las poblaciones CD45+ infiltrantes tumorales, incluidas las células B y varias líneas celulares mieloides. Descubrimos que las células T αβ constituyen la gran mayoría (~70%) de la fracción que interactúa con biotina+, mientras que las poblaciones innatas como los eosinófilos, los neutrófilos y los macrófagos mostraron un etiquetado de biotina mínimo (Figura S1K). Esto revela que, a pesar de que las células T representan una minoría del infiltrado total de CD45+, son la población inmune más interactiva con las células tumorales. Estos hallazgos revelan que los tumores AKP en etapa temprana respaldan el compromiso productivo de las células T, mientras que los tumores pro-Met evitan en gran medida tales interacciones, estableciendo trayectorias inmunes divergentes entre los dos tipos de tumores.

Para determinar si las interacciones físicas capturadas por uLIPSTIC identifican una población funcionalmente relevante, primero clasificamos las células T CD4+ que infiltran el tumor biotina+ y biotina− de los ratones que portan tumores AKP y realizamos una secuenciación de TCR de una sola célula (scTCR-seq) (Figura 2E). Estimamos la diversidad clonal con el índice de diversidad 50 (D50) de TCRβ, con valores que van de 0 (menos diverso) a 0,5 (más diverso)^[28]. También utilizamos el índice de Morisita-Horn (MHI) para determinar la superposición clonal entre los compartimentos biotina+ y biotina−, con 1 que indica una superposición clonal del 100%. Las células T CD4+ biotina+ exhibieron un D50 significativamente menor en comparación con la fracción biotina−, lo que demuestra que el compromiso físico con el tumor está asociado con la expansión clonal (y S1L). Además, se observó una superposición clonal mínima entre los compartimentos biotina+ y biotina−, como lo indica el bajo MHI (Figura 2E). En segundo lugar, para evaluar la potencia funcional del repertorio que interactúa, co-cultivamos células T biotina+ y biotina− αβ con organoides pro-Met (Figura 2F). Tanto las células T biotina+ como las biotina− αβ exhibieron capacidad de matar, con la fracción biotina+ que redujo significativamente la supervivencia de los organoides en comparación con la fracción biotina− (Figura 2G y S1M). Esta actividad citotóxica se acompañó de un fenotipo activado CD44hi PD-1+ (Figura 2H). Tanto las fracciones de células T biotina+ como biotina− indujeron una robusta producción de citocinas en relación con los organoides cultivados solos, como lo demuestran los niveles aumentados de IFN-γ y TNF-α en los sobrenadantes de co-cultivo. Aunque la secreción de citocinas no fue significativamente diferente entre las condiciones biotina+ y biotina− (Figuras 2I y J), las células T biotina+ indujeron una mayor regulación de la expresión de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHCI) en los organoides tumorales pro-Met (Figura 2K). La expresión de la clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHCII) también se elevó de manera similar en ambas condiciones que contenían células T en comparación con los organoides solos, sin una diferencia significativa observada entre las fracciones biotina+ y biotina− (Figura 2L). Dado que la expresión de MHCI es a menudo más sensible a la exposición de bajo nivel de citocinas y a las señales dependientes del contacto que MHCII^[29], la mayor regulación de MHCI por la fracción biotina+ puede indicar una interacción efectora más fuerte con las células tumorales. Estos hallazgos indican que las células T que interactúan físicamente con los tumores AKP in vivo constituyen una población clonamente expandida, activada y funcionalmente citotóxica con una mayor capacidad de modulación tumoral.

Un sistema de mapeo de destino para identificar las células T inducidas por el tumor en el CCRC ortotópico

El sistema de CCRC ortotópico-uLIPSTIC es una herramienta poderosa para capturar las interacciones celulares directas durante la corta ventana de administración del sustrato. Sin embargo, un obstáculo importante en la caracterización de las respuestas inmunitarias adaptativas a los tumores en los sistemas policlonales es la incapacidad de distinguir las células T reclutadas recientemente que responden a los tumores (o a las perturbaciones relacionadas con el tumor) de las células T residentes en los tejidos que ocupan el sitio de trasplante antes de la introducción del tumor. Esta distinción es particularmente desafiante en el entorno intestinal, dado el gran número de linfocitos residentes que participan en las respuestas inmunitarias en curso contra los antígenos luminales^[30],^[31]. Para abordar este desafío y complementar el sistema uLIPSTIC, combinamos los modelos de CCRC ortotópicos con un enfoque de mapeo de destino para rastrear el reclutamiento y la activación de las células T periféricas en el colon^[21],^[22],^[32],^[33]. El tratamiento con tamoxifeno de los ratones SellCreERT2 X Rosa26CAG-LSL-tdTomato (iSellTomato) etiqueta permanentemente las células T ingenuas que expresan la selectina L (Sell, CD62L+) como Tomato+. Esta estrategia permitió enriquecer las células T "ex-ingenuas" (CD62L− Tomato+) y seguir el destino de las células T inducidas por el tumor^[32],^[33].

Para validar la eficiencia del etiquetado de las células T en ratones iSellTomato en condiciones homeostáticas, recolectamos el mLN, el epitelio del colon y la lámina propia poco después de la administración de tamoxifeno para el análisis por citometría de flujo (Figuras S2A y B). En todos los compartimentos, más de la mitad de las células CD62L+ eran Tomato+. Como se esperaba, la mayoría de las células T CD4+ y CD8αβ+ en el mLN expresaban CD62L. En contraste, aproximadamente el 20-40% de las células T CD4+ y CD8αβ+ en el epitelio del colon y la lámina propia eran CD62L+, principalmente debido al etiquetado de las células T naïvas presentes de forma natural en los folículos linfoides aislados y los parches colónicos ^[34]. El tinte por inmunofluorescencia (IF) y la imagen confocal confirmaron la presencia de células Tomato+ que se colocalizan con las estructuras de agregados linfoides en el colon (Figura S2B). Para validar aún más que el sistema iSellTomato también podría utilizarse para etiquetar y rastrear las células T durante el crecimiento tumoral establecido, los ratones fueron tratados con tamoxifeno cuatro semanas después de la implantación de tumores AKP o pro-Met y se analizaron un día después (Figura S2C). El tinte por IF confirmó la presencia de células T CD3+ Tomato+ dentro de los colones con tumores, y estas células se localizaban predominantemente en los agregados linfoides (Figura S2D). Estos hallazgos demuestran que el etiquetado iSellTomato sigue siendo eficaz en etapas posteriores de la progresión tumoral y puede utilizarse para rastrear las células T recién reclutadas en el colon con tumores. A lo largo de este estudio, el término "mapeo del destino" se refiere específicamente a estas células T CD62L− Tomato+. Dado que la disminución de la expresión de CD62L puede ocurrir después de la activación de las células T en múltiples ubicaciones anatómicas, esta población probablemente incluye células que se activan en los ganglios linfáticos que drenan el tumor, las estructuras linfoides colónicas o dentro del microambiente tumoral (TME) en sí. Por lo tanto, el sistema iSellTomato no tiene como objetivo identificar exclusivamente las células T específicas del tumor, sino más bien enriquecer la oleada de células T policlonales que se reclutan y activan durante el período definido de establecimiento tumoral, lo que permite distinguirlas de los linfocitos residentes en los tejidos preexistentes.

Para investigar la dinámica del reclutamiento y la activación de las células T en modelos ortotópicos de CRC, inyectamos los organoides tumorales y las líneas celulares descritas previamente en las paredes del colon de los ratones iSellTomato y administramos tamoxifeno antes o cuatro semanas después de la inyección del tumor. Dos semanas después de la administración de tamoxifeno, recolectamos tumores de colon y epitelio de ratones con tumores e inyectados con un placebo para el análisis por citometría de flujo (Figura 3A). En la etapa temprana, observamos una mayor acumulación de células T CD4+ y CD8αβ+ CD62L− Tomato+ recién reclutadas y con mapeo del destino en el AKP no metastásico en comparación con los tumores de colon pro-Met (Figuras 3B y C). En la etapa tardía, el reclutamiento de células T CD4+ y CD8αβ+ a los tumores AKP no metastásicos disminuyó a niveles comparables a los observados en ambas etapas del modelo pro-Met (Figuras 3B y C). Tanto los tumores MC38 como los MC38 LVM2 mostraron tasas de reclutamiento de células T comparables a las de los tumores AKP pMMR en etapa temprana (Figura 3D). El modelo AKP en etapa temprana resultó en una mayor acumulación de células T CD4+ recién reclutadas en el epitelio del colon adyacente, mientras que otros modelos mostraron patrones de reclutamiento comparables al control con placebo (Figura 3E). En contraste, ni el modelo de organoides ni el modelo de línea celular afectaron la acumulación de células T CD8αβ+ recién reclutadas en el epitelio del colon adyacente (Figuras 3F y G). Estos datos indican aún más que los tumores AKP no metastásicos desencadenan una nueva acumulación de células T y fomentan un microambiente más inflamado, en contraste con los tumores pro-Met, que parecen evadir tales nuevas respuestas desde la etapa temprana, lo que provoca una respuesta de las células T similar a la que se observa en el CRC en etapa tardía.

La alteración de la respuesta temprana de las células T no es suficiente para impulsar la metástasis de los tumores AKP

Las diferencias fenotípicas tempranas de las células T entre los modelos AKP y pro-Met nos llevaron a investigar si el microambiente de las células T más inflamado en los tumores AKP podría afectar su progresión metastásica. Primero, determinamos si la ausencia de metástasis después de la implantación de tumores AKP refleja una incapacidad intrínseca de las células AKP para colonizar el hígado. Tras la inyección intrasplénica ^[35], ^[36], tanto las líneas celulares tumorales AKP como las pro-Met fueron igualmente capaces de formar metástasis hepáticas, lo que indica que los tumores AKP son competentes para crecer en el hígado cuando se les da acceso directo, y que su resultado no metastásico en el modelo ortotópico se debe probablemente a una diseminación deficiente en lugar de a la incapacidad de colonizar el hígado (Figura S2E).

Luego, investigamos directamente el papel de las células T en la configuración del tumor primario AKP y los resultados metastásicos. Inyectamos ortotópicamente tumores AKP y pro-Met en ratones inmunodeficientes Rag1−/− (RKO), que carecen de células T y B funcionales. A las seis semanas después de la inyección, los tumores de colon AKP y pro-Met en los ratones RKO alcanzaron tamaños comparables a los observados en los huéspedes inmunocompetentes. Coherente con sus fenotipos en ratones inmunocompetentes, los tumores pro-Met formaron metástasis hepáticas, mientras que los tumores AKP permanecieron no metastásicos (Figura S2F). Para probar específicamente el impacto de las células T en el fenotipo AKP observado, realizamos el agotamiento de anticuerpos de las células T CD4+ o CD8+ en ratones C57BL/6 trasplantados con organoides tumorales AKP (Figura S2G). El agotamiento eficiente de las células T CD4+ o CD8+ se confirmó mediante citometría de flujo (Figura S2H). En el punto de tiempo temprano, los tamaños de los tumores AKP fueron comparables entre los grupos. Sin embargo, en la etapa tardía, los ratones con células CD8+ agotadas desarrollaron tumores significativamente más grandes, mientras que los ratones con células T CD4+ agotadas mostraron tamaños de tumores intermedios entre el control de isotipo y las condiciones de células T CD8+ agotadas (Figura S2I). Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD4+ alteró la activación de las células T CD8+, lo que redujo su producción de IFN-γ y la expresión de PD-1, mientras que el agotamiento de las células CD8 tuvo efectos mínimos en la activación de las células T CD4+ (Figuras S2J y K). No obstante, no se detectaron metástasis hepáticas en ninguno de los grupos experimentales, lo que sugiere que los programas transcripcionales intrínsecos en los tumores AKP y pro-Met probablemente desempeñan un papel dominante en la determinación de su destino metastásico. Aunque ni la focalización de las células T CD4+ ni la de las células T CD8+ fueron suficientes para impulsar la progresión metastásica en los tumores AKP, nuestros datos refuerzan el papel de las células T en la configuración del TME primario. Esto nos llevó a investigar cómo las células T CD4+ y CD8αβ+ se adaptan funcionalmente a los distintos TME de AKP y pro-Met, independientemente de su capacidad para determinar los resultados metastásicos.

Perfil transcripcional de las células T recién reclutadas en la etapa temprana de tumores no metastásicos y pro-metastásicos de CRC

Para determinar cómo los programas de adaptación temprana de las células T divergen en los modelos de CRC AKP y pro-Met, nos centramos en el enfoque de mapeo del destino iSellTomato, que permite el seguimiento de las células T "ex-naïvas" policlonales etiquetadas en el momento de la implantación del tumor y durante las primeras etapas del desarrollo tumoral. Este enfoque nos permitió evaluar cómo las células T recién reclutadas se adaptan al TME. Los ratones iSellTomato fueron trasplantados con organoides AKP o pro-Met, o se sometieron a un procedimiento de control (ver Figura 3A). Dos semanas después, clasificamos las células T CD62L− Tomato+ aisladas de los tumores de colon y el epitelio no tumoral y realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula y del receptor de células T (scRNA/TCR-seq) utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium para definir los programas transcripcionales inducidos por cada tipo de tumor. La visualización UMAP y la agrupación no supervisada de las células T CD4+ con mapeo del destino las clasificaron en ocho grupos transcripcionalmente distintos en los tumores y el epitelio linfocitario intraepitelial (ILE) del colon (Figura 4A). Los grupos 0 y 5 correspondieron a las células citotóxicas/Th1 del ILE y el tumor, respectivamente, y se caracterizaron por la alta expresión de genes como Nkg7, Ccl5, Cxcr3, Tbx21, Ifng, Cd44, Cd226 y Bhlhe40. En contraste, el grupo 1 se caracterizó por la expresión de Sell, S1pr1, Igfbp4, Il7r y Ccr7, que son marcadores clásicos de las células T naïvas. El grupo 3 también expresó marcadores asociados con la tronquidad, como Tcf7 y Slamf6. Los grupos 1 y 3 mostraron una disminución de los marcadores de activación, como Cd44, Il2ra y Pdcd1 (Figuras 4A-C). Los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) de AKP y el ILE adyacente se enriquecieron en los grupos citotóxicos/Th1, mientras que los TIL de pro-Met se representaron predominantemente en los grupos 1 y 3 similares a las células naïvas (Figuras 4A-D). Cabe destacar que, aunque nuestra clasificación se enriqueció con células T CD62L− Tomato+ ex-naïvas, las células de los grupos 1 y 3 conservaron un perfil similar a las células naïvas a nivel transcripcional.

Los ILE y los TIL de pro-Met CD4+ también se enriquecieron en el grupo 2, que mostró una firma de células T foliculares auxiliares (Tfh) caracterizada por la expresión de Cxcr5, Bcl6, Il21 y Tox2. La firma de células T helper 17 (Th17) se asignó al grupo 4, marcada por Rorc, Il17a y Il17re, y estuvo dominada por los TIL de pro-Met CD4+. El grupo 7 incluyó células T reguladoras (Tregs) definidas por la expresión de Foxp3, Il10 y Gzmb. Los TIL de pro-Met CD4+ se enriquecieron ligeramente más en este grupo que los TIL de AKP CD4+ (Figuras 4A-D).

Como lo indican las distribuciones de los grupos y los genes expresados diferencialmente seleccionados, los tumores AKP y el ILE adyacente se enriquecieron con células citotóxicas y Th1, mientras que las células T CD4+ y el ILE de los tumores pro-Met expresaron genes de firma similares a las células naïvas, Tfh y Th17 (Figuras 4D, E y S3A). El análisis de enriquecimiento de procesos biológicos de la ontología génica (GOBP) respaldó aún más esta dicotomía, mostrando la regulación al alza de las vías de migración de linfocitos, activación y respuesta inmune mediada por citocinas en las células T CD4+ de AKP, en contraste con la regulación al alza de la traducción citoplasmática y la curación de heridas mediada por angiogénesis en las células T CD4+ de pro-Met (Figura 4F). Estos análisis sugieren que los tumores AKP inducen una activación robusta de las células T CD4+ y programas de diferenciación citotóxica que los tumores pro-Met no logran inducir.

Las células T CD8αβ+ con mapeo del destino se clasificaron en cuatro grupos principales. Similar a los TIL de pro-Met CD4+, los TIL de pro-Met CD8αβ+ mostraron un fenotipo similar a las células naïvas/troncales. Un total del 78% de los TIL de pro-Met CD8αβ+ (en comparación con el 54% de sus contrapartes AKP) se localizaron en el grupo 1, caracterizado por la alta expresión de Ccr7, Sell, Lef1, S1pr1, Tcf7 y Il7r (Figuras S3B y C). En contraste, el 23% de los TIL de AKP CD8αβ+ (en comparación con el 9% de sus contrapartes pro-Met) se localizaron en un grupo efector citotóxico 2, marcado por la expresión de marcadores de activación y estimulación del TCR, como Ccl5, Nkg7, Nr4a1, Dusp5, Icos, Ctla4, Tigit, Il2rb y Pdcd1 (Figuras S3B y C), lo que refleja un estado más activado en los tumores AKP. Esto fue respaldado aún más por el análisis GOBP, que mostró la regulación al alza de las vías de activación de las células T y la inflamación en los tumores AKP (Figura S3D). En comparación con el ILE de AKP, el ILE de pro-Met mostró un perfil citotóxico, como lo indica la expresión de genes como Gzma, Gzmb, Ifitm1, Ifitm2 y Cd226. Paradójicamente, esto se acompañó de una menor expresión de Ifng, Nkg7 y Il2rb (Figura S3E). En consecuencia, el análisis GOBP mostró la regulación al alza de la muerte celular programada mediada por granzimas y la señalización y la respuesta de defensa, pero también una menor señalización de la activación de las células T en las células T CD8αβ+ del ILE de pro-Met (Figura S3D). Estos datos indican una falta de activación de las células T CD8αβ+ en los tumores pro-Met.

Distintos estados tempranos de las células T en los tumores AKP y pro-Met en las células T con mapeo del destino

scRNA-seq reveló perfiles transcripcionales distintos que diferencian los estados de células T citotóxicas y células T naïvas en los tumores AKP y pro-Met, respectivamente. A continuación, comparamos los fenotipos de reclutamiento de células T en etapas temprana y tardía con las respuestas inmunitarias residentes en el intestino preexistentes, siguiendo el mismo diseño experimental que se muestra en la Figura 3A. Las células T CD4+ TIL Tomato−, cuya historia celular no se rastreó, presentaron frecuencias comparables de células CD62L+ en los diferentes modelos tumorales y puntos temporales. En contraste, las células T CD4+ TIL Tomato+, cuya historia celular se rastreó, mostraron una proporción significativamente mayor de células CD62L+ en los tumores pro-Met que en los tumores AKP durante las etapas tempranas (Figura 5A). Tanto las células T CD8αβ+ TIL Tomato− como las Tomato+ mostraron un enriquecimiento más pronunciado de células CD62L+ en los tumores pro-Met que en los tumores AKP. Sin embargo, en la etapa tardía, la proporción de células que expresan CD62L fue similar entre las células T CD4+ o CD8αβ+ Tomato+ en ambos modelos tumorales (Figuras 5A y 5B). En conjunto, estos datos indican que el colon contiene un reservorio basal de células T CD4+ y CD8αβ+ CD62L+, que probablemente residen dentro de las placas colónicas y los folículos linfoides aislados. El rastreo de la historia celular de estas células naïvas que residen en el colon y los ganglios linfáticos regionales durante el CRC temprano mostró además que estas células se diferenciaron en estados efectores activados solo en los tumores AKP, mientras que en los tumores pro-Met, permanecieron en gran medida en un estado naïvo.

Si bien la secreción de IFN-γ entre las células TIL cuya historia celular no se rastreó (CD4+ y CD8αβ+ Tomato−) no se vio significativamente afectada por el tipo o la etapa del tumor, las células T infiltrantes tumorales cuya historia celular se rastreó mostraron una mayor producción de IFN-γ en los tumores AKP en etapa temprana que en los tumores pro-Met en etapa temprana o en etapa tardía (Figuras 5C y D). En consecuencia, las Tregs FoxP3+ fueron más frecuentes entre las células T CD4+ Tomato+ que infiltran los tumores pro-Met en etapa temprana que en los tumores AKP, mientras que no se observó ninguna diferencia en el compartimento de células cuya historia celular no se rastreó (Figura 5E). Este enriquecimiento temprano de las Tregs FoxP3+ entre las células T cuya historia celular se rastreó en los tumores pro-Met sugiere que el entorno inmunosupresor se establece en las etapas más tempranas del desarrollo tumoral pro-metastásico, lo que podría contribuir al fracaso de la diferenciación de las células T efectoras en este modelo. Además, en consonancia con el entorno de activación reducido, una proporción menor de células T CD8αβ+ Tomato+ que infiltran los tumores pro-Met expresaron PD-1 en comparación con las de los tumores AKP en una etapa temprana, una diferencia que no se observó entre las células T CD8αβ+ Tomato− (Figura 5F). En conjunto, estos hallazgos refuerzan que las células T CD4+ y CD8αβ+ cuya historia celular se rastreó en el CRC pro-metastásico adquieren un estado hipoactivado temprano, similar al de las células T cuya historia celular se rastreó en las etapas tardías de los modelos de CRC AKP y pro-Met.

Para evaluar cómo la progresión tumoral influyó en el estado de activación de las células T reclutadas en etapas tempranas, se administró tamoxifeno antes de la inyección del tumor, y las células T Tomato+ cuya historia celular se rastreó se analizaron seis semanas después (Figuras 5G-M). Las células T CD4+ reclutadas en los tumores AKP y pro-Met mostraron una disminución de la expresión de CD62L en comparación con sus niveles en el punto temporal temprano, aunque las células T CD4+ en los tumores pro-Met conservaron una expresión ligeramente mayor de CD62L (Figuras 5A y H). Además, estas células T CD4+ cuya historia celular se rastreó en etapas tempranas perdieron su capacidad para producir IFN-γ en el modelo AKP (p=0,019), lo que las hizo funcionalmente similares a las de los tumores pro-Met (Figuras 5C e I). En consecuencia, las frecuencias de Tregs CD4+ cuya historia celular se rastreó en los tumores AKP fueron comparables a las observadas en los tumores pro-Met (Figura 5J). Las células T CD8αβ+ cuya historia celular se rastreó en etapas tempranas en los tumores AKP mantuvieron un estado de activación más alto en el punto temporal tardío, como lo indica la disminución persistente de CD62L, la producción sostenida de IFN-γ y la expresión elevada de PD-1. En contraste, las células T CD8αβ+ en los tumores pro-Met permanecieron en un estado inactivo (Figuras 5B, D, F y K-M). Estos datos indican que, aunque los tumores AKP inducen una activación temprana robusta de las células T CD4+ y CD8αβ+, solo las células T CD8αβ+ pueden mantener este estado de activación temprano a medida que los tumores progresan, lo que puede ser la base del aumento del crecimiento del tumor primario observado tras la depleción de las células T CD8+.

Los tumores AKP inducen la expansión clonal de las células T CD4+

Dado que se observaron distintas trayectorias de las células T en etapas tempranas en los modelos AKP y pro-Met, a continuación, investigamos si estas trayectorias estaban asociadas con una composición clonal divergente de las células T CD4+ y CD8αβ+ infiltrantes tumorales. Caracterizamos el repertorio de células T CD4+ y CD8αβ+ en los modelos de control, AKP y pro-Met utilizando el conjunto de datos de scRNA/TCR-seq. La expansión clonal fue prominente entre las células T CD4+ que infiltraron los tumores AKP y el epitelio adyacente no tumoral (Figuras 6A y S4A). En consecuencia, la superposición clonal fue alta entre los compartimentos IEL y tumoral, con un MHI promedio de 0,57 (Figura 6B). En contraste, los tumores pro-Met y las células T CD4+ IEL mostraron un repertorio de TCR diverso, similar a la diversidad observada en el IEL de control, y por lo tanto exhibieron una menor superposición clonal entre los dos compartimentos (MHI=0,13) (Figuras 6A, B y S4A). El análisis de la distribución de clústeres reveló que el 42% y el 40% de las células en los 20 clústeres de células T CD4+ más expandidos se localizaron en el clúster 0 (IEL Th1) y el clúster 5 (Tumor Th1), respectivamente (Figuras 6C y D). Las células T CD4+ restantes en los 20 clústeres más expandidos se distribuyeron entre el clúster Th17 4 (8%), el clúster Dock2hi 6 (5%), el clúster Tfh 2 (2%) y el clúster naïvo/troncal TCF7hi 3 (2%). Esta distribución se alineó bien con los perfiles transcripcionales de estos clústeres, con la mayoría de las expansiones que ocurrieron en los clústeres citotóxicos y activados. Además, 16 de los 20 clústeres más expandidos fueron de tumores AKP y IEL, mientras que los cuatro restantes fueron de IEL y células T infiltrantes tumorales pro-Met (Figura 6D). Estos datos confirman que los tumores no metastásicos AKP son más inmunogénicos que los tumores pro-Met, lo que conduce a una expansión clonal robusta de las células T CD4+.

Las células T CD8αβ+ exhibieron dinámicas clonales distintas en comparación con las células T CD4+. En primer lugar, no se observó expansión clonal en las células T CD8αβ+ infiltrantes tumorales en los modelos AKP o pro-Met. Sin embargo, se observó una expansión clonal moderada en las células T CD8αβ+ IEL en ambos grupos AKP y pro-Met; su D50 fue solo ligeramente menor que la observada en el control de control (Figura S4B). Además, hubo una superposición clonal mínima entre los compartimentos tumoral e IEL en ambos modelos tumorales (Figura S4C). La mayoría (90%) de los 20 clústeres de células T CD8αβ+ más expandidos se asignaron al clúster IEL citotóxico 0 (Figura S4D).

Dado que se observó una pronunciada expansión clonal de las células T CD4+ en los ratones inyectados con organoides AKP, a continuación, buscamos identificar las especificidades de TCR de estos clústeres expandidos. Seleccionamos 21 clústeres de células T CD4+, reconstruimos sus TCR en hibridomas NFAT-GFP y confirmamos su capacidad funcional para responder a la estimulación de TCR después del tratamiento con anti-CD3 (Figuras S4E, F y Tabla Suplementaria 1). Luego, probamos los hibridomas que mostraron respuestas robustas a anti-CD3 para detectar la reactividad contra antígenos tumorales, microbianos y dietéticos utilizando un ensayo de detección in vitro^[37],^[38] (Figura 6E). Si bien ninguno de los clústeres probados reconoció los antígenos tumorales, un clúster (TCR17) mostró reactividad a una dieta estándar, y otro clúster (TCR99) reaccionó a las heces recolectadas de ratones de control SPF, AKP o portadores de tumores pro-Met (Figura S4F). Para reducir los candidatos dietéticos y microbianos, probamos estos clústeres para detectar la reactividad contra proteínas dietéticas definidas y especies comensales presentes en el microbiota Oligo-MM^[12], que abarca las principales especies que se encuentran en el microbiota SPF^[39], incluidas las de nuestra instalación (Figura 6E). También probamos la reactividad contra Helicobacter hepaticus, que se ha asociado previamente con la inmunidad antitumoral en un modelo de CRC^[40]. El clúster reactivo a la dieta TCR17, que se detectó en los tumores pro-Met y el IEL, no mostró reactividad a las proteínas de caseína, zeína o soja purificadas (Figura 6E). Entre los clústeres de TCR probados para detectar microbios específicos, TCR427, que se detectó en los tumores pro-Met, respondió solo a los lisados de Turicimonas muris. En contraste, TCR99 reconoció varias especies bacterianas, incluidas Blautia coccoides, Turicimonas muris, Bifidobacterium longum, Clostridium clostridioforme, Clostridium innocuum y Helicobacter hepaticus (Figura 6E). Sin embargo, TCR99 no respondió a Flavonifactor plautii o Bacteroides caecimuris, lo que sugiere una reactividad amplia pero selectiva. TCR99 es un clúster público compartido entre los tumores AKP y el IEL pro-Met. En particular, los dos clústeres de TCR que responden a los antígenos microbianos (TCR427 y TCR99) se localizaron principalmente en el clúster Tfh 2, además de los clústeres Th1 0 y 5 (Figura 6E). Dado que los organoides utilizados son microsatélites estables, la expansión de las células T observada y la actividad antitumoral probablemente se producen independientemente del reconocimiento clásico de neoantígenos, posiblemente a través de células T de reacción cruzada o la participación independiente de antígenos de moléculas inducidas por el estrés^[8],^[41]. Los patrones de reactividad de TCR indican que las respuestas antimicrobianas y dietéticas contribuyen a la composición del repertorio de células T durante la progresión tumoral. En general, estos resultados revelan una marcada expansión de las células T en respuesta a los tumores AKP que se acopló con la diferenciación de células T efectoras y antitumorales. La expansión clonal de las células T se dirigió en parte a antígenos no tumorales derivados de la dieta y el microbiota, lo que sugiere un papel para el repertorio inmunitario homeostático en estado estacionario en las respuestas tumorales.

La expresión de MHCII intrínseca al tumor modula el resultado tumoral

Habiendo definido la arquitectura clonal y las amplias especificidades antigénicas del repertorio inducido por el tumor, a continuación, abordamos si las células T cuya historia celular se rastreó son funcionalmente capaces de controlar el crecimiento de las células tumorales, o si esta capacidad difiere con el potencial metastásico. Establecimos un sistema de cocultivo de organoides tumorales utilizando células T aisladas del tumor y el epitelio adyacente de los ratones iSellTomato dos semanas después de la trasplantación ortotópica con tumores AKP o pro-Met. Siguiendo nuestra estrategia de rastreo de la historia celular in vivo (ver Figura 3A), clasificamos las células T CD4+ y CD8+ en tres subconjuntos distintos: células naïvas o de memoria central (CD62L+), células residentes efectoras o de memoria (CD62L−) Tomato− y células efectoras recientemente activadas cuya historia celular se rastreó (CD62L−) Tomato+. Estas poblaciones se cocultivaron luego con organoides tumorales pro-Met disociados, y se cuantificó la recuperación de organoides, la liberación de citocinas y los cambios en el fenotipo de las células tumorales cinco días después (Figura 7A). Solo las células T cuya historia celular se rastreó derivadas del entorno tumoral no metastásico AKP demostraron actividad antitumoral, reduciendo el número de organoides pro-Met sanos en comparación con otras condiciones (Figuras 7B-D y S5A). Este efecto supresor fue específico del entorno tumoral no metastásico, ya que las células T CD62L− Tomato+ cuya historia celular se rastreó derivadas de los tumores pro-Met no lograron controlar el crecimiento de los organoides (Figuras 7B-D y S5A).

Para investigar el mecanismo que impulsa esta actividad antitumoral, analizamos el perfil de citocinas en los sobrenadantes del cocultivo. Detectamos la secreción de IFN-γ exclusivamente en los cocultivos que contenían las células T citotóxicas cuya historia celular se rastreó derivadas de AKP (Figura 7E), mientras que no se observaron diferencias significativas en la secreción de TNF-α en ninguna de las condiciones (Figura S5B). La adición de un anticuerpo bloqueador anti-IFN-γ abolió este efecto citotóxico, lo que confirmó que la muerte de las células tumorales observada dependía de IFN-γ (Figuras 7C-E). IFN-γ es una citocina pleiotrópica que se sabe que aumenta la visibilidad de las células tumorales al regular al alza la maquinaria de presentación de antígenos, incluido MHCI y MHCII. En consecuencia, observamos una regulación al alza de la expresión superficial de MHCI y MHCII en las células de los organoides específicamente en presencia de las células T cuya historia celular se rastreó derivadas de AKP que producen IFN-γ (Figura 7F y G). Estos hallazgos validan funcionalmente el modelo iSellTomato, demostrando que enriquece específicamente para las células T inducidas por el tumor capaces de la supresión tumoral mediada por IFN-γ, un estado funcional que se ve afectado en las células T reclutadas en los tumores pro-metastásicos.

Las respuestas divergentes de las células T inducidas por los tumores AKP y pro-Met nos llevaron a preguntarnos si esto refleja diferencias genómicas subyacentes entre las dos líneas celulares. Para abordar esto, realizamos una secuenciación del exoma completo (WES) en ambas líneas de organoides. Sorprendentemente, las dos líneas presentaban una carga mutacional muy comparable, compartiendo 1102 variantes somáticas, con solo 137 mutaciones específicas de AKP y 129 mutaciones específicas de pro-Met identificadas, cada una representando menos del 12% de la carga mutacional total (tabla suplementaria 2). Se confirmaron las mutaciones impulsoras esperadas en Apc, Kras y Tp53 en el conjunto de mutaciones compartidas, lo que es consistente con el origen clonal común de ambas líneas. Entre las mutaciones específicas de pro-Met, encontramos varias alteraciones en genes relacionados con la regulación inmune, incluidas mutaciones en Hivep1, Ppp2r5a, Sp110 y Nucks1, que pueden influir en la expresión de genes relacionados con la inmunidad y en los programas reguladores asociados al cromatín (tabla suplementaria 2). No obstante, no se detectaron mutaciones en los genes centrales de presentación de antígenos, y la divergencia mutacional general entre las líneas siguió siendo modesta. Estos datos sugieren que las diferencias funcionales entre AKP y pro-Met probablemente no estén impulsadas por una divergencia genómica importante, sino que apuntan hacia la reprogramación transcripcional o epigenética como el mecanismo principal de evasión inmune. En consonancia con esto, se ha demostrado que la reprogramación pro-metastásica en el CCRC está impulsada por la plasticidad epigenética, incluida la aparición de programas transcripcionales de tipo fetal y basal/escamoso que convergen en la pérdida de GATA6, en lugar de por alteraciones genéticas adicionales^[42].

Dado que se observó una prominente expansión clonal de las células T CD4+ exclusivamente en el modelo AKP, lo que sugiere una presentación de antígenos dependiente de MHCII productiva, examinamos directamente la expresión de MHCII en las células tumorales de ambos modelos. El análisis citométrico de flujo de tumores ex vivo en etapa temprana reveló una reducción específica del tumor en la expresión de MHCII en las células tumorales de pro-Met en comparación con los tumores AKP, mientras que la expresión de MHCII en el epitelio del colon adyacente permaneció comparable entre los dos modelos (Figura 8A). Para probar directamente si esta pérdida de MHCII es un impulsor causal de la evasión inmune y la metástasis, generamos una línea de organoides AKP deficiente en MHCII mediante la inactivación del transactivador de la clase II (Ciita) utilizando CRISPR/Cas9 (AKP.CiitaKO) (Figuras 8B y S5C). Si bien el tamaño de los tumores primarios del colon en etapa temprana fue comparable entre los ratones trasplantados con AKP.CiitaKO o su línea parental de tipo salvaje AKP (Figura 8C), la pérdida de MHCII resultó en una reducción en la frecuencia de células T CD4+ infiltrantes tumorales (Figura 8D). Además, el análisis scTCR-seq reveló que las células T CD4+ que infiltran los tumores AKP.CiitaKO exhibieron un D50 más alto en comparación con los tumores AKP de tipo salvaje, lo que indica un fallo en la expansión clonal característica de las respuestas inducidas por los tumores AKP (Figuras 8E y S5D). En la etapa tardía de la progresión tumoral, los ratones que portaban tumores AKP.CiitaKO desarrollaron tumores primarios del colon significativamente más grandes que los que portaban tumores AKP de tipo salvaje, y aproximadamente el 28% de los ratones AKP.CiitaKO desarrollaron macrometástasis hepáticas. En contraste, ninguno de los ratones trasplantados con el modelo parental AKP desarrolló metástasis (Figura 8F). En un experimento complementario, la sobreexpresión de Ciita en los organoides pro-Met (pro-Met.CiitaOE) no alteró el tamaño del tumor del colon en etapa tardía ni la metástasis hepática (Figura S5E), lo que sugiere que, si bien la pérdida de MHCII es crítica, restaurarla por sí sola no es suficiente para superar los programas multifacéticos de evasión inmune establecidos en los tumores pro-metastásicos. Finalmente, evaluamos el impacto de la pérdida de MHCII en las interacciones físicas entre el tumor y las células T utilizando el sistema uLIPSTIC. La proporción de células T CD4+ o CD8αβ+ que interactúan con el tumor y que son positivas para biotina no cambió en AKP.CiitaKO en comparación con los tumores AKP de tipo salvaje, y de manera similar, pro-Met.CiitaOE no rescató las interacciones de las células T en relación con los tumores pro-Met de tipo salvaje (Figura S5F). Esto sugiere que las interacciones físicas entre el tumor y las células T están reguladas por mecanismos independientes de MHCII en ambos modelos. En conjunto, estos hallazgos identifican a MHCII intrínseco al tumor como un regulador clave de las respuestas de las células T CD4+ que restringe el crecimiento del tumor primario.

Discusión

Proporcionamos una caracterización detallada de la clonalidad, los estados de activación y las interacciones celulares de las células T CD4+ y CD8+ en modelos de CCRC con distinto potencial metastásico. Utilizando modelos de CCRC ortotópicos acoplados con el mapeo temporal del destino de las células T, descubrimos trayectorias de activación temprana divergentes de las células T infiltrantes tumorales que reflejan el potencial metastásico de los tumores. Los tumores AKP no metastásicos elicitan una fuerte respuesta inmune citotóxica y sesgada hacia Th1 en las células T reclutadas recientemente, acompañada de una mayor expansión clonal de las células T CD4+. Esto contrasta con los fenotipos similares a los de células T ingenuas y reguladoras de las células T reclutadas en los tumores pro-metastásicos durante la misma ventana temprana, lo que sugiere un estado acelerado de hipoactivación inmune^[13],^[43]. Estos hallazgos contribuyen a la creciente comprensión de que la inmunidad antitumoral en el CCRC es heterogénea, variando ampliamente con la etapa del cáncer, los factores intrínsecos al tumor y las señales del microambiente tumoral, y es fundamental para predecir los resultados de la enfermedad.

Estudios previos han demostrado que el infiltrado inmune general y su organización espacial, definidos como Immunoscore, superan al estado de inestabilidad de microsatélites en la predicción de la supervivencia del paciente^[44]-^[46]. Nuestros datos demuestran además que tanto la calidad como la cantidad de la infiltración y activación temprana de las células T difieren marcadamente entre los entornos no metastásicos y pro-metastásicos. Además, las células T reclutadas tempranamente, en particular las células T CD8+, conservaron su estado de activación inicial a medida que el CCRC progresaba, mientras que las células T CD4+ exhibieron un declive gradual en su estado de activación. Estos hallazgos se relacionan con observaciones recientes en el CCRC humano, donde los tumores pMMR en etapa temprana mostraron una robusta infiltración y activación de las células T que disminuyeron a medida que los tumores avanzaron y metastatizaron^[47]. Estos hallazgos reflejan la importancia de la activación inmune temprana y sugieren que puede predecir los resultados del cáncer.

La dinámica clonal distinta de las células T CD4+ y CD8+ explorada en nuestro estudio tiene múltiples implicaciones importantes. En primer lugar, la distinta expansión clonal de las células T CD4+ observada en los dos modelos tumorales indica que las diferencias en la clonalidad del TCR pueden estar asociadas con el resultado de la enfermedad. Un estudio previo informó que el aumento de la expansión clonal del TCR en pacientes con melanoma metastásico fue predictivo de su respuesta al tratamiento con ICB y la supervivencia general^[48]. Otro estudio sugirió que el tratamiento con ICB puede aumentar la expansión clonal en pacientes con CCRC pMMR a niveles comparables con el CCRC dMMR, lo que destaca que la expansión clonal localizada aún puede ocurrir en los tumores pMMR^[47]. Estos estudios evaluaron la clonalidad del TCR considerando el total de linfocitos T infiltrantes tumorales sin distinguir entre los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+^[47],^[48]. Nuestros datos revelaron que las células T CD4+ experimentan una mayor expansión clonal que las células T CD8+ en el modelo AKP no metastásico. Esto apunta a una posible contribución de ciertos clones de células T CD4+ en la configuración de la inmunidad antitumoral, aunque los resultados de la depleción de células T CD4+ o CD8+ o los experimentos con animales inmunodeficientes sugieren que el repertorio por sí solo no puede determinar los resultados metastásicos.

Además de la dinámica clonal del TCR observada en los tejidos tumorales, nuestros hallazgos revelaron una extensa superposición clonal entre las células T CD4+ que infiltran los tumores y el epitelio del colon adyacente no tumoral, particularmente en el modelo AKP no metastásico. Estos hallazgos, incluida la especificidad de la microbiota y los antígenos alimentarios de algunos de nuestros clones expandidos, sugieren que las respuestas antitumorales intestinales pueden aprovechar los repertorios de TCR preexistentes utilizando los circuitos inmunes mucosos en curso para potenciar o subvertir las respuestas antitumorales. Esta hipótesis está respaldada por un estudio reciente que demostró que la colonización con bacterias filamentosas segmentadas (SFB) mejora la eficacia de la ICB en ratones que portan tumores B16 que expresan antígenos derivados de SFB^[49]. Esta mejora fue mediada por la reprogramación de las células T CD4+ "ex-Th17" específicas de SFB hacia un fenotipo similar a Th1 caracterizado por la secreción de IFN-γ y TNF-α, lo que a su vez aumentó la citotoxicidad de las células T CD8+^[50]. Otro estudio informó que la colonización con Helicobacter hepaticus redujo la carga tumoral en un modelo de CCRC AOM/DSS al inducir estructuras linfoides terciarias peritumorales que apoyaron la regresión tumoral^[40]. Estos estudios respaldan aún más un informe previo de que los tumores humanos de pulmón y colon están abundantemente infiltrados por células T CD8+ "espectadoras" no específicas del tumor^[41]. En conjunto, estos datos amplían nuestra comprensión de las respuestas inmunes antitumorales y señalan nuevas vías terapéuticas.

Aunque se han descrito múltiples mecanismos de evasión inmune^[51], la falta de interacción directa entre el tumor y las células T implica posibles defectos en la formación de la sinapsis inmune, las vías de procesamiento y presentación de antígenos o las alteraciones en los ligandos celulares^[51]. Por ejemplo, las células tumorales pueden adquirir defectos genéticos o epigenéticos que conducen a la regulación a la baja de la expresión de MHCI y MHCII en la superficie, lo que dificulta el reconocimiento de las células T^[52]. Nuestro hallazgo de que la expresión intrínseca al tumor de MHCII modula la respuesta temprana de las células T CD4+ sugiere una capa mecánica similar, colocando la presentación de antígenos por la propia célula tumoral, y no solo por las células presentadoras de antígenos profesionales, como un determinante del compromiso productivo de las células T CD4+ en el CCRC^[53]-^[55]. No obstante, la restauración de MHCII en los organoides pro-metastásicos no fue suficiente para rescatar las interacciones de las células T o alterar el resultado tumoral, lo que indica que la regulación a la baja de MHCII opera dentro de un programa de evasión inmune más amplio en lugar de como un único interruptor decisivo. La expresión de MHCII en los tumores se ha relacionado con las respuestas antitumorales dependientes de las células T CD4+ y los resultados mejorados en varios cánceres humanos^[53],^[56],^[57], y nuestros resultados sugieren que su pérdida temprana puede ser uno de los eventos iniciadores que distinguen al CCRC propenso a la metástasis.

Además de la alteración de la presentación de antígenos, las células cancerosas pueden afectar la citotoxicidad mediada por granzima y perforina a través de diversas adaptaciones moleculares, como el aumento de la blandura celular y la remodelación del citoesqueleto de actina para impedir físicamente la formación adecuada de la sinapsis inmune ^[58], ^[59]. Estos estudios sugieren que alterar el destino metastásico de un tipo de tumor probablemente requiere la reversión de múltiples mecanismos de evasión. Por ejemplo, demostramos que la depleción de células T CD4+ o CD8+ por sí sola no indujo un comportamiento metastásico en la línea tumoral AKP, lo que indica que probablemente se requieren mutaciones tumorales intrínsecas adicionales o alteraciones microambientales más allá de la modulación inmune para conferir un fenotipo metastásico. Estos hallazgos también se suman al creciente reconocimiento del papel de las células T no específicas del tumor en la potenciación de los resultados tumorales. Los primeros estudios clínicos que datan de 1976 mostraron que la administración intravesical de Bacillus Calmette–Guérin (BCG), una vacuna atenuada de Mycobacterium bovis desarrollada originalmente para la tuberculosis, reduce significativamente la recurrencia y la progresión del cáncer de vejiga no invasivo, estableciéndola como la primera inmunoterapia exitosa para un tumor sólido ^[60], ^[61]. Estudios más recientes han informado que la vacunación con ARNm contra el COVID-19 puede conducir a la regresión tumoral espontánea mediante la activación del programa de IFN de tipo I, lo que resulta en una mejora de la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico o melanoma metastásico ^[62]-^[64]. Elucidar los mecanismos que rigen el entorno inmunitario y median las interacciones entre las células tumorales y las células T podría revelar nuevos objetivos terapéuticos e informar estrategias para mejorar la inmunidad antitumoral. En conjunto, estos resultados definen un proceso temporal en el que la calidad de la respuesta temprana de las células T distingue el cáncer colorrectal con y sin potencial metastásico. Si bien esta divergencia inmune temprana por sí sola no es suficiente para dictar el destino metastásico, la modulación del MHCII intrínseco al tumor representa un nodo que acopla la interacción de las células T CD4+ al control del crecimiento tumoral primario, lo que podría influir en la diseminación metastásica. Estos hallazgos sugieren que el fracaso de la interacción inmune local productiva es un marcador temprano del cáncer colorrectal propenso a la metástasis, y que restaurar la inmunidad temprana de las células T, mejorar la inmunogenicidad tumoral o aprovechar el entorno antigénico de la mucosa puede ofrecer nuevas estrategias terapéuticas.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio se basó en modelos ortotópicos que reproducen las características clave del cáncer colorrectal primario y metastásico, aunque no capturan las etapas más tempranas de la tumorigénesis. Además, el proceso de pasaje in vivo utilizado para derivar la línea pro-Met de la línea AKP probablemente seleccionó mutaciones que aumentaron la capacidad metastásica al tiempo que anulaban la inmunidad antitumoral en la línea pro-Met. Aunque se examinaron modelos adicionales de cáncer colorrectal, como MC38 y MC38 LVM2, las diferencias en la agresividad, la cinética y el comportamiento metastásico limitaron las comparaciones directas. Además, nuestro enfoque de mapeo de destino identificó eficazmente aproximadamente el 60% de las células T reclutadas recientemente; por lo tanto, el etiquetado incompleto puede subestimar los patrones de activación raros. También reconocemos que la población CD62L– Tomato+ es heterogénea y puede incluir células T ex-naïve que se activaron fuera del microambiente tumoral (TME) antes de migrar posteriormente al tumor. Por lo tanto, no se puede suponer que todas las células etiquetadas hayan sido sensibilizadas en respuesta a los antígenos derivados del tumor. Además, la identidad de los antígenos reconocidos por varios de los clones más expandidos sigue siendo desconocida, lo que impide establecer una relación definitiva entre la expansión clonal observada y la inmunidad antitumoral.

Limitaciones del estudio

Nuestro estudio se basó en modelos ortotópicos que reproducen las características clave del cáncer colorrectal primario y metastásico, aunque no capturan las etapas más tempranas de la tumorigénesis. Además, el proceso de pasaje in vivo utilizado para derivar la línea pro-Met de la línea AKP probablemente seleccionó mutaciones que aumentaron la capacidad metastásica al tiempo que anulaban la inmunidad antitumoral en la línea pro-Met. Aunque se examinaron modelos adicionales de cáncer colorrectal, como MC38 y MC38 LVM2, las diferencias en la agresividad, la cinética y el comportamiento metastásico limitaron las comparaciones directas. Además, nuestro enfoque de mapeo de destino identificó eficazmente aproximadamente el 60% de las células T reclutadas recientemente; por lo tanto, el etiquetado incompleto puede subestimar los patrones de activación raros. También reconocemos que la población CD62L– Tomato+ es heterogénea y puede incluir células T ex-naïve que se activaron fuera del microambiente tumoral (TME) antes de migrar posteriormente al tumor. Por lo tanto, no se puede suponer que todas las células etiquetadas hayan sido sensibilizadas en respuesta a los antígenos derivados del tumor. Además, la identidad de los antígenos reconocidos por varios de los clones más expandidos sigue siendo desconocida, lo que impide establecer una relación definitiva entre la expansión clonal observada y la inmunidad antitumoral.

Métodos

Ratones

El cuidado y la experimentación con animales fueron coherentes con las directrices del NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rockefeller (IACUC Protocol 25036-H). Los ratones C57BL/6J (000664), Rosa26CAG–LSL-tdTomato-WPRE (007914), Rag1−/− (002216) se compraron a Jackson Laboratories y se alojaron en nuestras instalaciones. Los ratones SellCreERT2 fueron proporcionados por Michel Nussenzweig (Rockefeller) ^[32], ^[33]. Los ratones Pou2f3CreERT2-IRES-EGFP (037511) fueron proporcionados por Jakob von Moltke (U de Washington) ^[65]. Los ratones Rosa26uLIPSTIC (038221) fueron proporcionados por Gabriel Victora (Rockefeller) ^[26]. Varias de estas cepas se cruzaron en nuestras instalaciones para obtener las cepas finales descritas en otra parte del texto. Todas las cepas se generaron y mantuvieron en un fondo C57BL/6J, y los experimentos de trasplante ortotópico con líneas tumorales C57BL/6 se realizaron en ratones receptores sincénicos. Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en un ciclo fijo de 12 horas de luz/oscuridad, con alimentos y agua disponibles ad libitum. Se utilizaron ratones adultos machos y hembras (de 8 a 16 semanas de edad) en los experimentos, a menos que se especifique lo contrario.

Organoides tumorales y líneas celulares

Los organoides naïve AKP ^[24] (denominados aquí AKP) y los organoides pro-Met se generaron y proporcionaron por Ömer Yilmaz (MIT). Los organoides pro-Met se generaron mediante tres pasajes in vivo de los organoides naïve AKP. Específicamente, los organoides naïve AKP se inyectaron ortotópicamente en el colon y los animales se mantuvieron hasta que se detectaron metástasis hepáticas. Los tumores hepáticos se aislaron, se digirieron y se expandieron in vitro como organoides, como se describió anteriormente para la generación de organoides ^[24]. Este proceso se repitió dos veces para generar los organoides AKP metastásicos terciarios (denominados aquí pro-Met). Después de cada pasaje in vivo, los organoides se generaron a partir de tumores hepáticos 6 a 10 semanas después de la inyección ortotópica.

Todos los organoides tumorales se cultivaron resuspendiendo las células de los organoides en un 60% de matrigel en un medio ADF+ frío (Advanced DMEM F12 suplementado con un 5% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, un 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina y un 1% de HEPES). En una placa de 6 pocillos, se colocaron gotas de 40 μL de la suspensión celular y se incubaron a 37 °C durante 20 minutos, seguido de la adición de 3 mL de medio ADF+ precalentado.

MC38 y MC38 LVM2 fueron proporcionados por Sohail Tavazoie (Rockefeller). MC38 LVM2 se generó mediante dos pasajes in vivo de MC38: MC38 se inyectó intrasplénicamente en ratones, y los nódulos hepáticos individuales se disecaron después del crecimiento, se cortaron en trozos pequeños y se digirieron en 1 mg/mL de colagenasa tipo VIII en DMEM sin suero durante 30 a 45 minutos mientras se agitaba a 37 °C. Las células individuales se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm en una suspensión de células individuales. Las células se resuspendieron en 5 mL de tampón de lisis ACK y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de un lavado con PBS, las células se expandieron in vitro antes de reinyectarse en el bazo del ratón. Los tumores hepáticos secundarios se aislaron y se expandieron, lo que dio como resultado el MC38 Liver Metastasis 2 (LVM2). Las líneas celulares MC38 y MC38 LVM2 se cultivaron en medio DMEM+ (DMEM suplementado con un 10% de SFB inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES, 50 μg/mL de sulfato de gentamicina y un 1% de penicilina-estreptomicina).

Generación de organoides SrtA

Para producir retrovirus que expresen SrtA, 4x10^[5] células BOSC23 ^[66] resuspendidas en 2 mL de DMEM (suplementado con un 10% de SFB y un 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de glutamina) se colocaron en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, 1,5 μg de plásmido SrtA ^[26] (pMP71-eGFP-P2A-SrtA-PDGF; proporcionado por Gabriel Victora) y 1,5 μg de plásmido de envoltura pECO se mezclaron en 250 μL de medio OptiMEM, se suplementaron con 6 μL de FuGENE y se incubaron durante 20 minutos. La mezcla se añadió gota a gota a las células BOSC23 y se incubó a 37 °C. 72 horas después, se recogió el sobrenadante del virus y se almacenó a −80 °C para su uso posterior.

Para generar organoides AKP y pro-Met que expresen SrtA, los organoides se disociaron en células individuales como se describió anteriormente. 2x10^[5] células de organoides resuspendidas en menos de 50 μL de medio ADF+ se mezclaron con 500 μL de sobrenadante de virus SrtA descrito anteriormente, 5 μg de polibreno, 10 μM de Y-27632 y se colocaron en una placa de 12 pocillos. Las células se centrifugaron durante 1,5 horas a 2230 rpm, 25 °C y luego se incubaron en una incubadora a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y se cultivaron en matrigel como se describió anteriormente para el cultivo de organoides. Las células GFP+ SrtA+ FLAG+ AKP y pro-Met se clasificaron y se expandieron in vitro para su uso futuro.

Generación de organoides AKP.CiitaKO

Los organoides AKP se disociaron en células individuales como se describió anteriormente y se resuspendieron en 100 μL de OPTI-MEM. Los complejos ribonucleoproteicos (RNP) se formaron mezclando 1,64 μL (0,1 nmol) de Alt-R Cas9 (IDT) con 3 μL (0,3 nmol) de sgRNA sintética (IDT) e incubando a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Luego, se añadieron las células a la mezcla de RNP, se transfirieron 100 μL a una cubeta de 2 mm de espacio y se electroporaron utilizando un electroporador NEPA21 con los siguientes parámetros de pulso de poring: 175 V, 5 ms de duración, 50 ms de intervalo, dos pulsos. Los organoides electroporados se resuspendieron suavemente en un medio mínimo precalentado y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de colocarlos en Matrigel.

Los sgRNA utilizados para la electroporación fueron:

sgRNA CIITA: AGGUCCUUGAUUAUAUCGUG

Generación de organoides pro-Met.CiitaOE

Los organoides pro-Met se disociaron en células individuales como se describió anteriormente, y 1x10^[5] células de organoides resuspendidas en menos de 500 μL de medio ADF+ se mezclaron con 10 μL de vector viral CIITA (pLV[Exp]-Puro-EF1A>mCiita [NM001302618.1], Vector Builder, VB900125-2432nxx), 5 μg de polibreno, 10 μM de Y-27632 y se colocaron en una placa de 12 pocillos. Las células se centrifugaron durante 1,5 horas a 2230 rpm, 25 °C y luego se incubaron en una incubadora a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y se cultivaron en matrigel como se describió anteriormente para el cultivo de organoides. Las células MHCII+ pro-Met se clasificaron y se expandieron in vitro_ para su uso futuro.

Inyecciones de tumores guiadas por colonoscopia

Se realizó una colonoscopia utilizando el sistema de colonoscopio Karl Storz, compuesto por la cámara Image 1 Spies H3-Z HD (parte TH100), Image 1 Connect y H3-Link, CCU modular (partes TC200, TC300), Power LED 300 y cable de luz (partes TL300 y 495ND), telescopio Hopkins (parte 64301AA)^[22],^[24]. Para la inyección guiada por colonoscopia, se ensambla una aguja de inyección personalizada (Hamilton, 7803-05), una jeringa (Hamilton, 7656-01), una aguja de transferencia (Hamilton, 7770-02) y un colonoscopio en una vaina de examen (parte 61029DK). Los ratones fueron anestesiados con 2-5% de isoflurano antes y durante el procedimiento. Para preparar las células para los trasplantes ortotópicos de organoides, primero se disociaron los organoides con PBS frío, se lavaron y luego se disociaron con TrypLE Express durante 30 minutos a 37 °C, se pasaron a través de un filtro de 70 μm, se lavaron y se resuspendieron en medio ADF+ (descrito en la sección de organoides tumorales y líneas celulares), 10% de matrigel, 1% de azul de metileno esterilizado por filtración y 10 μM de suplemento de Y-27632. Las células se administraron en 3 inyecciones (7x104 células en 50 μL por inyección), separadas aproximadamente 0,5 cm en el colon distal y el recto. Para preparar las células MC38 y MC38 LVM2 para las inyecciones ortotópicas, las células se disociaron con tripsina-EDTA (0,25%) durante 3 minutos, se lavaron y se resuspendieron en medio DMEM+ (descrito en la sección de organoides tumorales y líneas celulares), 10% de matrigel, 1% de azul de metileno esterilizado por filtración y 10 μM de suplemento de Y-27632. Se realizaron tres inyecciones de 2x104 células por 50 μL por ratón.### Inyecciones tumorales intrasplénicas

Los ratones fueron anestesiados con 2-5% de isoflurano y se les inyectó ketamina para la analgesia perioperatoria a 0,1 mg/gramo de peso corporal. Se afeitó el vello del flanco abdominal y se desinfectó la piel con betadina y etanol al 70%. Se realizó una pequeña incisión subcostal izquierda para acceder al bazo. El bazo se exteriorizó suavemente y se inyectaron 5x105 células de organoides AKP o pro-Met en PBS (disociadas como se describe anteriormente) en el bazo utilizando una jeringa de insulina. Los vasos sanguíneos esplénicos y su conexión con el páncreas se cauterizaron cuidadosamente con un lápiz térmico y se extirpó el bazo del animal. El páncreas se reposicionó dentro de la cavidad abdominal. El peritoneo se cerró con suturas de poliamida 6 y la incisión de la piel se cerró con clips.### Histopatología

Se recolectaron tumores de colon representativos (o colones enteros con tumores procesados en forma de rollos suizos) de ratones a los que se inyectaron ortotópicamente organoides AKP o pro-Met, 2 y 6-7 semanas después de la inyección, se fijaron en 4% de paraformaldehído durante la noche, se deshidrataron con etanol al 50% seguido de etanol al 70%, luego se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina utilizando un procesador de tejidos (Leica ASP6025, Leica Biosystems, Deer Park, IL). Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 5 μm, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron mediante un patólogo veterinario certificado (S.E.C.). Los cambios microscópicos dentro de los tumores y el tejido intestinal adyacente se clasificaron para necrosis y fibrosis (desmoplasia) en una escala numérica de 0 a 4, donde 0 = normal, 1 = mínimo (70%). Los cambios epiteliales en el sitio de implantación de las células de organoides se clasificaron en una escala de 0 a 4, donde 0 = normal, 1 = hiperplasia, 2 = displasia, 3 = adenoma y 4 = adenocarcinoma, según los criterios histopatológicos para tumores de colon en roedores^[67],^[68]. Se generó una puntuación de patología compuesta para cada ratón sumando todas las puntuaciones de las subcategorías. Las imágenes de H&E e inmunohistoquímica se adquirieron utilizando un escáner de portaobjetos Olympus VS200 (Evident Scientific, Hamburgo, Alemania) y se analizaron con el software OlyVIA versión 3.4.1 (Olympus, Alemania).### Inmunohistoquímica

Se evaluaron todos los colones para los subconjuntos de células T (CD4 y CD8) y tdTomato utilizando un método de inmunohistoquímica previamente validado por el Laboratorio de Patología Comparada del MSK. Brevemente, las secciones fijadas en formalina y incluidas en parafina se tiñeron utilizando una plataforma de tinción automatizada (Leica Bond RX, Leica Biosystems). Después de la desparafinización y la recuperación del epítopo inducida por calor, las secciones del intestino grueso se incubaron con anticuerpo anti-CD4 (dilución 1:250; 14-9766-82, clon 4SM95), anti-CD8a (dilución 1:1000; 14-0808-82, clon 4SM15) o tdTomato (dilución 1:2000; LS-C340696). Luego, se aplicó un anticuerpo secundario de conejo anti-ratón (para la inmunohistoquímica de CD4 y CD8) o un anticuerpo de conejo anti-cabra (para la inmunohistoquímica de tdTomato; BA-4001, BA5000, Vector Laboratories) y un sistema de detección de polímeros (PK6100, Vector Laboratories) a los tejidos. Se utilizó tetracloruro de 3,3'-diaminobenceno (DAB) como cromógeno y las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se examinaron mediante microscopía óptica. Se utilizaron tejidos linfoides (timo, bazo y ganglios linfáticos) de ratones no tratados o piel que expresa tdTomato de ratones genéticamente modificados como controles positivos.### Tinción de inmunofluorescencia (IF)

El colon de ratón se disecó sobre hielo, se abrió longitudinalmente y se lavó con PBS frío. Los rollos suizos de tejido de colon se fijaron en 4% de PFA a 4 °C durante la noche, se lavaron tres veces con PBS y se transfirieron a 30% de sacarosa durante al menos 16 horas. El tejido se congeló en OCT, se cortó en secciones de 20 μm en un criostato y se mantuvo a -20 °C hasta la tinción. Las secciones congeladas montadas en portaobjetos se descongelaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron dos veces con PBS durante 5 minutos cada una y una vez durante 10 minutos en 0,1% de Triton X-100 en PBS. Las secciones se bloquearon durante 30 minutos en el tampón de bloqueo (1x BD Perm/Wash Buffer, 1:200 Fc block). Luego, las secciones se incubaron con anticuerpos conjugados (1:100 AF488 anti-ratón CD8a, 1:100 AF647 anti-ratón CD3) en el tampón de bloqueo durante 1 hora a 37 °C. Después de tres lavados en PBS durante 5 minutos cada uno, las secciones teñidas se montaron con Fluoromount-G con DAPI y se mantuvieron a 4 °C hasta la obtención de imágenes.### Obtención de imágenes de microscopía para IF

Las imágenes de IF (ratones de control) se adquirieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 980. Se obtuvieron vistas de toda la sección en mosaico utilizando un objetivo de 5x/0,16 NA a una resolución de 1024 x 1024 píxeles. Las regiones que contenían agregados de tdTomato se identificaron y se obtuvieron imágenes a mayor aumento utilizando un objetivo de 20x/0,8 NA, con pilas Z en mosaico recopiladas a una resolución de 2048 x 2048 píxeles. Todas las imágenes se adquirieron con la misma potencia láser, ganancia del detector y configuración de desplazamiento en todas las muestras. Los escaneos de mosaico se unieron automáticamente utilizando el software Zeiss ZEN, y las series de imágenes de pila Z se importaron a Fiji (ImageJ) para la proyección de intensidad máxima. Se adquirieron imágenes de pila Z adicionales (ratones AKP y pro-Met) utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Olympus FV4000 con un objetivo de 20x/0,80 NA a una resolución de 1024 x 1024 píxeles. La adquisición y el procesamiento de imágenes se realizaron utilizando el software Olympus cellSens/FV4000, y las series de imágenes de pila Z se importaron a Fiji (ImageJ) para la proyección de intensidad máxima.### Administración de tamoxifeno

El tamoxifeno (50 mg/mL) se disolvió en aceite de maíz y 10% de etanol, se agitó a 45 °C durante 3-4 horas y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Los ratones iSellTomato se trataron con dos dosis de tamoxifeno (5 mg/dosis) por sonda oral en los días -3 y -1 en relación con la inyección del tumor o del control (para el análisis en el punto temporal temprano), o alrededor de los días +29, +31 (4 semanas) después de la inyección del tumor. Los ratones Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC utilizados para el trasplante ortotópico de tumores se trataron con tres dosis de tamoxifeno (5 mg/dosis, con un día de diferencia) al menos una semana antes de las inyecciones del tumor.### Depleción de anticuerpos

Para la depleción de células T CD4+ o CD8+, los ratones C57BL/6 se inyectaron intraperitonealmente con 200 μg/ratón de anticuerpos depletores anti-CD4 (clon GK1.5), anti-CD8 (clon 2.43) o control de isotipo (clon LTF-2) dos días antes de la inyección ortotópica del tumor AKP. La administración de anticuerpos se repitió el día de la inyección del tumor y cada 5-7 días hasta el análisis.### Administración de sustrato para el etiquetado uLIPSTIC

El ácido biotín-aminohexanoico-LPETGS, carboxiamida terminal, con una pureza del 95% (biotín-LPTEG), se compró a LifeTein (síntesis personalizada) y se prepararon soluciones madre de 20 mM en PBS. Para los experimentos de etiquetado uLIPSTIC, se inyectaron seis dosis del sustrato biotín-LPETG intraperitonealmente, con 20 minutos de diferencia, durante un período de 2 horas (8 μmol/1.ª dosis, seguido de 2 μmol para cada dosis posterior). Los ratones se sacrificaron para el análisis por citometría de flujo 1 hora después de la última inyección de sustrato.### Aislamiento de células T del epitelio del colon y los tumores

Los linfocitos intraepiteliales del colon (IEL) se aislaron según lo descrito previamente^[69]. Brevemente, se recolectaron y lavaron los colones en PBS y 1 mM de ditiotreitol (DTT) seguido de 30 mM de EDTA. Los IEL se recuperaron del sobrenadante de los lavados de DTT y EDTA. Los linfocitos de los tumores del colon se obtuvieron mediante la digestión del tejido en 6 mL de RPMI suplementado con 2% de FBS, 100 μg/mL de DNasa I y 2 mg/mL de colagenasa 8 durante 45 minutos a 37 °C. Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación de gradiente utilizando Percoll. Luego, las suspensiones de células simples se resuspendieron en PBS + 0,5% de BSA + 1 mM de EDTA (PBE) y se incubaron con anticuerpos fluorescentes para la tinción de superficie durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBE antes de la citometría de flujo (análisis o clasificación).### Citometría de flujo, tinción y estrategia de clasificación

Las suspensiones de células simples se resuspendieron en PBS + 0,5% de BSA + 1 mM de EDTA (PBE) y se incubaron con anticuerpos fluorescentes para la tinción de superficie durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBE antes de la citometría de flujo. Se utilizó la siguiente estrategia de clasificación para examinar las células T CD4+ o CD8+: linfocitos simples (según el tamaño y el tinte de células viables/muertas Aqua o NIR), CD45+, TCRβ+, CD8β−/+, CD4+/−. Para el análisis de los ratones iSellTomato, se añadió la siguiente estrategia de clasificación: CD62L− y Tomato+ o Tomato−. Se utilizó la misma estrategia de clasificación descrita anteriormente para los ratones iSellTomato (CD62L− y Tomato+) para la clasificación de células sometidas a secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq). Las células T se clasificaron en un instrumento FACSymphony. Para los experimentos uLIPSTIC, se utilizó la siguiente estrategia de clasificación para examinar las células tumorales: células simples viables (según el tamaño y el tinte de células viables/muertas NIR), EpCAM+, CD45−, Tomato+, FLAG+, biotina+, SrtA-GFP+.

La tinción intranuclear de Foxp3 se realizó utilizando el kit de tinción de células T reguladoras de ratón Foxp3 según las instrucciones del kit. Para el análisis de la secreción de citocinas, las células mononucleares totales aisladas del epitelio del colon o los tumores se colocaron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C con 100 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 200 ng/mL de ionóforo y 2 mM de monensina durante 4 horas. La tinción intracelular de IFN-γ se realizó en tampón Perm/Wash después de la fijación y la permeabilización en tampón Fix/Perm según las instrucciones del kit. Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro FACSymphony A5 y se analizaron utilizando el paquete de software FlowJo 10.### Cocultivos de organoides y células T

Las células T aisladas de los tumores AKP en ratones Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC, según se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos para citometría de flujo, según se describe. Las células T aisladas de ratones iSellTomato, según se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos para citometría de flujo, según se describe. Las células T CD62L+, CD62L− Tomato− y CD62L− Tomato+ CD4+ y CD8β+ se clasificaron en un clasificador de células BD FACS Aria III utilizando una boquilla de 70 μm a 45 psi. Para la cocultivo combinada de células CD4+ y CD8β+, las células se agruparon a partir de las células IEL del colon y del tumor (ya sea de ratones AKP o pro-Met), y las células se agruparon a partir de n=4–5 animales por condición por experimento. Para las células T aisladas de los modelos iSellTomato y Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC, se cocultivaron 4500 células T y 4000 células T, respectivamente, con 1000 células de organoides pro-Met que se disociaron antes del cocultivo, según se describe anteriormente. Las células se cocultivaron en un volumen final de 10 μL en un 50% de matrigel. Se añadió TCM caliente suplementado con 10 ng/mL de IL-2 murina recombinante (R&D), 20 ng/mL de IL-7 murina recombinante (R&D) y 10 ng/mL de complejo IL-15/IL-15Rα murino recombinante (ThermoFisher) a las gotas de cocultivo solidificado. El día 5, las coculturas se visualizaron mediante un microscopio Keyence BZ-X810 en modo de campo claro con un objetivo de 2X y un zoom digital de 1,5X. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a −80 °C para el análisis posterior de citocinas mediante un ensayo de cuentas citométricas, según las instrucciones del fabricante.

Tras la visualización y la recogida de sobrenadantes, las coculturas se disociaron utilizando TrypLE durante 30 minutos para facilitar la digestión del matrigel y de los organoides. Las muestras se disociaron aún más mediante pipeteo, se lavaron con PBS y se procesaron para la tinción y el análisis por citometría de flujo.### Preparación de la biblioteca scRNA-seq

Las células T aisladas de ratones iSellTomato, según se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos Biolegend TotalSeq C individuales (1:100) para permitir el etiquetado a nivel de muestra. Las células CD62L− Tomato+ CD4+ o CD8β+ se clasificaron en un clasificador de células BD FACS Aria III utilizando una boquilla de 70 μm a 45 psi. Las muestras se agruparon, se evaluó la viabilidad y se cargaron rápidamente en un solo pocillo del dispositivo microfluídico Chromium de 10X Genomics. Se generó una biblioteca de expresión génica de una sola célula siguiendo el protocolo del fabricante para un kit de reactivo Chromium Next GEM Single Cell 5’ v2 (Dual Index), VDJ, con tecnología Feature Barcode para la proteína de superficie celular (para capturar las etiquetas de muestra TotalSeq C). Las bibliotecas se secuenciaron en una celda de flujo NovaSeq S1.### Preparación de la biblioteca scTCR-seq

Las células individuales se clasificaron por indexación utilizando un clasificador FACS Symphony en placas de 96 pocillos que contenían 5 μL de tampón de lisis (tampón TCL, Qiagen 1031576) suplementado con un 1% de β-mercaptoetanol y se congelaron a −80 °C antes de la RT-PCR. La extracción de ARN y la RT-PCR para TCRβ se realizaron como se describió anteriormente^[70]. Los productos de PCR se etiquetaron y se enviaron para la secuenciación MiSeq^[71] utilizando el kit TrueSeq Nano (Illumina). Los archivos fastq de MiSeq se desmultiplexaron, los pares de lecturas se ensamblaron utilizando PANDASEQ^[72] y se combinaron utilizando el conjunto de herramientas FASTX. Las lecturas desmultiplexadas se asignaron a los pocillos mediante etiquetas y los archivos FASTA resultantes se alinearon y analizaron utilizando IMGT/HighV-QUEST (imgt.org/HighV-QUEST)^[73]. Las células que compartían secuencias de nucleótidos CDR3 TCR idénticas se definieron como clones. Solo se incluyeron en el análisis las secuencias de unión en fase de TCRβ.### Análisis de datos scRNA-seq y scTCR-seq

Los archivos FASTQ de secuenciación en bruto se filtraron, se alinearon y se generaron las etiquetas de características utilizando Cell Ranger v7.0.1. Las muestras se ejecutaron en la misma celda de flujo utilizando 15 etiquetas de características individuales para separar las células TIL y IEL de las condiciones Sham, AKP y pro-Met. El análisis VDJ se realizó utilizando el modo cellranger VDJ con la configuración predeterminada. En total, cellranger recuperó 8903 células con una mediana de 7357 lecturas por célula, y el 84% de ellas presentaban lecturas VDJ. Las matrices resultantes se cargaron en R y se analizaron utilizando los paquetes R tidyomics (v1.0) y Seurat (v5.3). Se excluyeron del análisis posterior las células que no presentaban o presentaban más de una lectura ADT. A continuación, eliminamos las células que mostraban más del 10% de la expresión génica total mitocondrial del análisis. Los datos de expresión se normalizaron utilizando SCTransform. Se realizó una reducción de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales (PCA) y se aplicó UMAP para visualizar los grupos. Se calcularon todas las posibilidades de agrupación utilizando FindClusters con el algoritmo de Louvain y, a continuación, se volvieron a comprobar mediante relaciones jerárquicas y significación biológica. La resolución de agrupación final se decidió en función de la diferencia biológica entre los tipos de células T y se realizó la anotación del tipo de célula utilizando los paquetes de enriquecimiento ClusterProfiler (v4.6.2) y fgsea (v1.24.0) y la curación manual. Se determinaron los genes expresados diferencialmente utilizando la función FindMarkers de los marcadores de cada grupo y entre los grupos. Las células CD4+ y CD8+ se separaron utilizando Cd4 (>0,5 de expresión) y Cd8b1 (>1 de expresión). Tras la separación, las células T CD4+ y CD8+ se reprocesaron utilizando los métodos mencionados anteriormente y se incluyeron en el análisis un total de 1680 células T CD4+ y 1592 células T CD8+. Se realizó el enriquecimiento funcional para las figuras utilizando fgsea (v1.24.0) frente a GO BP (c5.go.bp.v7.5.1.symbols). Los gráficos generados en R se crearon utilizando ggplot2 (v3.5.2), el paquete de visualización iSEE (v2.10.0). Los archivos rds completos y separados, así como los datos procesados, están disponibles en GEO: GSE311111: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE311111 (token gxinqgkszzabpiz).

El análisis clonal de TCR se realizó procesando el archivo filteredcontigannotations.csv de cellranger. En resumen, solo se utilizaron para el análisis estadístico las células que contenían TRA, TRB, TRATRB, TRA dual y/o TRB dual. Las células que albergaban los mismos genes V y J y la longitud CDR3, así como el emparejamiento TRA y TRB, se anotaron como relacionadas clonalmente. Las células que contenían solo TRA o TRB también se asignaron como parte del mismo núcleo TRATRB si tenían una secuencia CDR3 exacta. El índice de superposición de Morisita horn se calculó con la función mh(data, CI = 0.95, resample = 100) en el paquete R divo v1.0.2. La diversidad del repertorio de TCR se analizó mediante el índice de diversidad 50 (D50), que se calculó clasificando los clonotipos por frecuencia y definiendo D50 como la proporción de clonotipos necesarios para alcanzar el 50% de las células dentro de cada grupo.### Expresión de TCR en hibridomas NFAT-GFP

Utilizamos el vector retroviral pMSCV-mCD4-PIG TCR-OTII, como se describió anteriormente, para transducir las células hibridomas NFAT-GFP 58α–β– con construcciones de TCR sintéticas^[38]. Las secuencias de TCR se enumeran en la Tabla S1. pMSCV-mCD4-PIG TCR-OTII, nuestro vector principal para la expresión de TCR, fue proporcionado a Twist Bioscience. Las secuencias de los genes TCR α y β seleccionados (21 TCR en total) se obtuvieron del archivo filteredcontigannotations.csv de scRNA-seq. Se sintetizó una secuencia diana que consistía en los genes TCR α y β separados por un péptido de escisión P2A (Twist Bioscience) y se utilizó para reemplazar el gen TCR OTII en el plásmido pMSCV-mCD4-PIG. La línea celular de empaquetamiento retroviral Platinum-E (RV-101) se utilizó para el empaquetamiento viral de los vectores pMSCV-mCD4-PIG TCR generados por Twist. Las células Platinum-E se cultivaron en una placa de 96 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 60-80% y se transfectaron con los vectores pMSCV-mCD4-PIG TCR como un complejo ADN-lípido utilizando Lipofectamine 3000 (L3000001) siguiendo las instrucciones del fabricante. El sobrenadante del cultivo que contenía partículas virales se recogió 24 horas después de la transfección. A continuación, se centrifugaron 2,5 x 104 células NFAT-GFP, se resuspendieron en 200 μL del sobrenadante que contenía el virus suplementado con 10 μg/mL de sulfato de protamina y se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo plano. Las células NFAT-GFP se transfectaron por centrifugación a 1000xg a 32 °C durante 120 minutos, se pipetearon y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2. A continuación, las células se transfirieron a un matraz y se incubaron durante 1-2 semanas con 10 ml de medio de cultivo (DMEM con un 10% de FCS, penicilina-estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) bajo selección con puromicina (1 μg/mL). Tras la selección y la propagación, se confirmó la expresión de TCR en las células NFAT-GFP mediante citometría de flujo.### Preparación de extractos antigénicos

Extractos antigénicos tumorales:

Los lisados de organoides in vitro de AKP y pro-Met se prepararon disociando los organoides en células individuales, según se describe anteriormente. Las células se resuspendieron en PBS a 1x107 células/mL. La suspensión celular se sometió a 5 ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y en un baño de agua a 56 °C. Las células se centrifugaron a 1700 g durante 5 minutos para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se utilizó como fuente de lisados tumorales y se utilizaron 5 μL para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP. Para preparar el lisado tumoral ex vivo de AKP, se recogieron los tumores de AKP 2 semanas después de las inyecciones ortotópicas de organoides AKP en ratones SPF. Los tumores se cortaron en trozos pequeños y se resuspendieron en PBS suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Los tejidos se calentaron durante 1 hora a 56 °C, seguido de 4 ciclos de congelación-descongelación. Los tubos se centrifugaron para eliminar los restos de tejido y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP.### Extractos antigénicos microbianos:

Se prepararon extractos fecales totales disolviendo una pequeña cantidad de heces en 200 μL de PBS y centrifugando brevemente en una centrífuga de mesa durante 3-5 segundos para eliminar las partículas fecales grandes. El sobrenadante se transfirió a otro tubo, se centrifugó a 10 000 g durante 10 minutos y, a continuación, el pellet bacteriano se resuspendió en 200 μL de PBS. El lisado fecal se inactivó por calor a 75 °C durante 1 hora. Para preparar extractos antigénicos bacterianos de la especie MM12, las bacterias recuperadas de los cultivos de glicerol se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C durante 1-2 días en un medio AAM+ líquido (que contiene 18 g/L de BHI, 15 g/L de caldo de tripticasa de soja, 5 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de K2HPO4, 0,5 g/L de d-glucosa, 0,25 g/L de cisteína-HCl.H2O, 0,25 g/L de Na2S.9H2O, 1 mg/L de hemina, 0,5 mg/L de vitamina K3, 3% de FCS inactivado por calor). Las bacterias se colocaron en placas de agar Columbia (CBA) y se cultivaron anaeróbicamente durante 48-72 horas (sistemas anaeróbicos). Se aislaron colonias individuales y se cultivaron en un medio AAM+ líquido durante la noche. Se centrifugaron 2 mL de medio líquido a 10 000 g durante 10 minutos en tubos Eppendorf estériles y se resuspendieron en 1 mL de PBS estéril y se inactivaron por calor a 75 °C durante 1 hora antes de su uso. Helicobacter hepaticus fue proporcionado por Dan Littman (NYU) y se cultivó como se describió anteriormente^[74]. Se midió la densidad óptica (OD) de los lisados fecales y bacterianos utilizando un nanodrop y se normalizó a OD ≤ 1, y se utilizó 1 μL de lisados fecales o bacterianos por pocillo en el ensayo de cocultivo in vitro descrito a continuación.### Extractos antigénicos dietéticos:

Las mezclas de antígenos de alimentos y proteínas dietéticas (para caseína, soja y zeína) se prepararon como se describió anteriormente^[75]. En resumen, los pellets de alimentos sólidos se muelen utilizando un mortero y se resuspenden 50 mg de polvo en 1 mL de PBS y se utilizan 50 μg de 50 mg/mL de solución en el ensayo de cocultivo in vitro.### Cribado in vitro de la especificidad del TCR

Al menos siete días antes del ensayo del reportero NFAT-GFP, se inyectaron por vía subcutánea a ratones C57BL/6 CD45.1+ 1x106 células de melanoma B16-Flt3L^[38],^[76] para enriquecer las células dendríticas (DC) en el bazo. Los tumores se recogieron no más de 4 semanas después de las inyecciones. El día del experimento, se recogieron los bazos de ratones CD45.1 inyectados con tumores y se digirieron en 400 U/mL de colagenasa D y 10 μM de EDTA. Se lisaron los glóbulos rojos utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos. Las células CD11c+ dendríticas se enriquecieron utilizando microesferas anti-CD11c de ratón UltraPure.

Para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP, se cultivaron 5x10⁴ células dendríticas esplénicas en 100 μL en una placa de 96 pocillos de fondo plano en U y se incubaron con los antígenos de interés durante 2-4 horas a 37 °C y 5% de CO2. Los antígenos se obtuvieron según se describe anteriormente. A continuación, se cocultivaron 1x10⁴ células NFAT-GFP transducidas con TCR en una placa de 96 pocillos con las células dendríticas preincubadas. Después de 18-40 horas, las células se tiñeron con Live/Dead Zombie NIR, TCRβ, CD4 y CD45, y se midió la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Como control positivo, se determinó la capacidad de respuesta del TCR de cada línea de hibridoma NFAT-GFP mediante estimulación con anti-CD3 (0,5 μg/pocillo).

Secuenciación del exoma completo (WES) de tumores

Los organoides tumorales AKP y pro-Met (1x10⁶ cada uno, en forma de gránulos congelados) se enviaron a GENEWIZ (Azenta Life Sciences, South Plainfield, NJ) para la secuenciación del exoma completo. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el panel del exoma de ratón Twist y se secuenciaron con lecturas pareadas de 150 pb en una plataforma Illumina. Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el flujo de trabajo bioinformático de GENEWIZ. En resumen, las lecturas sin procesar se recortaron con Trimmomatic (v0.39), se alinearon con el genoma de referencia Mus musculus GRCm38 utilizando Sentieon (202308) y se procesaron para el marcado de duplicados. Las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las pequeñas inserciones/deleciones (indels) somáticas se identificaron utilizando el algoritmo Sentieon TNseq. Las variantes se normalizaron con bcftools (v1.13) y se anotaron utilizando Ensembl Variant Effect Predictor (VEP, versión 104). Un archivo de anotación de mutaciones somáticas conjuntas (MAF) anotado generado por GENEWIZ se importó a R y se analizó utilizando el paquete maftools. Los genes mutados de forma única en los tumores AKP o pro-Met se identificaron comparando los perfiles de mutación a nivel de gen entre las muestras, y las frecuencias de mutación se compararon utilizando la función mafCompare.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v.10. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando el software FlowJo. Los datos de los gráficos muestran la media y se consideraron significativos los valores de p < 0,05. Se utilizó Adobe Illustrator para ensamblar y editar las figuras. Se utilizaron R Studio versión 2023.06.0+421 y R versión 4.3.2 para analizar los datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq).

Ratones

El cuidado y la experimentación con los animales fueron coherentes con las directrices del NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rockefeller (IACUC Protocol 25036-H). Los ratones C57BL/6J (000664), Rosa26CAG–LSL-tdTomato-WPRE (007914), Rag1−/− (002216) se compraron a Jackson Laboratories y se alojaron en nuestras instalaciones. Los ratones SellCreERT2 fueron proporcionados por Michel Nussenzweig (Rockefeller)^[32],^[33]. Los ratones Pou2f3CreERT2-IRES-EGFP (037511) fueron proporcionados por Jakob von Moltke (U of Washington)^[65]. Los ratones Rosa26uLIPSTIC (038221) fueron proporcionados por Gabriel Victora (Rockefeller)^[26]. Varias de estas cepas se cruzaron en nuestras instalaciones para obtener las cepas finales descritas en el texto. Todas las cepas se generaron y mantuvieron en un fondo C57BL/6J, y los experimentos de trasplante ortotópico con líneas tumorales C57BL/6 se realizaron en ratones receptores sincénicos. Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en un ciclo fijo de 12 horas de luz/oscuridad, con comida y agua disponibles ad libitum. Se utilizaron ratones adultos machos y hembras (de 8 a 16 semanas de edad) en los experimentos, a menos que se especifique lo contrario.

Organoides tumorales y líneas celulares

Los organoides AKP nativos^[24] (denominados aquí AKP) y los organoides pro-Met fueron generados y proporcionados por Ömer Yilmaz (MIT). Los organoides pro-Met se generaron mediante tres pasajes in vivo de los organoides AKP nativos. Específicamente, los organoides AKP nativos se inyectaron ortotópicamente en el colon y los animales se mantuvieron hasta que se detectaron metástasis hepáticas. Los tumores hepáticos se aislaron, se digirieron y se expandieron in vitro como organoides, como se describió anteriormente para la generación de organoides^[24]. Este proceso se repitió dos veces para generar los organoides AKP metastásicos terciarios (denominados aquí pro-Met). Después de cada pasaje in vivo, los organoides se generaron a partir de tumores hepáticos 6-10 semanas después de la inyección ortotópica.

Todos los organoides tumorales se cultivaron resuspendiendo las células de los organoides en un 60% de matrigel en medio ADF+ frío (Advanced DMEM F12 suplementado con un 5% de suero fetal bovino (SFB) inactivado térmicamente, un 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina y un 1% de HEPES). En una placa de 6 pocillos, se colocaron gotas de 40 μL de la suspensión celular y se incubaron a 37 °C durante 20 minutos, seguido de la adición de 3 mL de medio ADF+ precalentado.

MC38 y MC38 LVM2 fueron proporcionados por Sohail Tavazoie (Rockefeller). MC38 LVM2 se generó mediante dos pasajes in vivo de MC38: MC38 se inyectó intrasplénicamente en ratones, y los nódulos hepáticos individuales se disecaron después del crecimiento, se cortaron en trozos pequeños y se digirieron en 1 mg/mL de colagenasa tipo VIII en DMEM sin suero durante 30-45 minutos mientras se agitaba a 37 °C. Las células individuales se filtraron a través de un filtro celular de 70 μm en una suspensión de células individuales. Las células se resuspendieron en 5 mL de tampón de lisis ACK y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de un lavado con PBS, las células se expandieron in vitro antes de reinyectarse en el bazo del ratón. Los tumores hepáticos secundarios se aislaron y se expandieron, dando lugar a MC38 Liver Metastasis 2 (LVM2). Las líneas celulares MC38 y MC38 LVM2 se cultivaron en medio DMEM+ (DMEM suplementado con un 10% de SFB inactivado térmicamente, 2 mM de glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES, 50 μg/mL de sulfato de gentamicina y un 1% de penicilina-estreptomicina).

Generación de organoides SrtA

Para producir retrovirus que expresen SrtA, se resuspendieron 4x10⁵ células BOSC23^[66] en 2 mL de DMEM (suplementado con un 10% de SFB y un 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de glutamina) y se colocaron en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, se mezclaron 1,5 μg de plásmido SrtA^[26] (pMP71-eGFP-P2A-SrtA-PDGF; proporcionado por Gabriel Victora) y 1,5 μg de plásmido de envoltura pECO en 250 μL de medio OptiMEM, se suplementó con 6 μL de FuGENE y se incubó durante 20 minutos. La mezcla se añadió por goteo a las células BOSC23 y se incubó a 37 °C. 72 horas después, se recogió el sobrenadante del virus y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.

Para generar organoides AKP y pro-Met que expresen SrtA, los organoides se disociaron en células individuales como se describe anteriormente. Se mezclaron 2x10⁵ células de organoides resuspendidas en menos de 50 μL de medio ADF+ con 500 μL de sobrenadante de virus SrtA descrito anteriormente, 5 μg de polibreno, 10 μM de Y-27632 y se colocaron en una placa de 12 pocillos. Las células se centrifugaron durante 1,5 horas a 2230 rpm, 25 °C y luego se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y se cultivaron en matrigel como se describe anteriormente para el cultivo de organoides. Las células AKP y pro-Met GFP+ SrtA+ FLAG+ se clasificaron y se expandieron in vitro para su uso futuro.

Generación de organoides AKP.CiitaKO

Los organoides AKP se disociaron en células individuales como se describe anteriormente y se resuspendieron en 100 μL de OPTI-MEM. Se formaron complejos ribonucleoproteicos (RNP) mezclando 1,64 μL (0,1 nmol) de Alt-R Cas9 (IDT) con 3 μL (0,3 nmol) de sgRNA sintético (IDT) e incubando durante 10-20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron las células a la mezcla de RNP, se transfirieron 100 μL a una cubeta de 2 mm de separación y se electroporaron utilizando un electroporador NEPA21 con los siguientes parámetros de pulso de poración: 175 V, 5 ms de duración, 50 ms de intervalo, dos pulsos. Los organoides electroporados se resuspendieron suavemente en medio mínimo precalentado y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de colocarlos en Matrigel.

Los sgRNA utilizados para la electroporación fueron:

sgRNA CIITA: AGGUCCUUGAUUAUAUCGUG

Generación de organoides pro-Met.CiitaOE

Los organoides pro-Met se disociaron en células individuales como se describe anteriormente, y se mezclaron 1x10⁵ células de organoides resuspendidas en menos de 500 μL de medio ADF+ con 10 μL de vector viral CIITA (pLV[Exp]-Puro-EF1A>mCiita [NM001302618.1], Vector Builder, VB900125-2432nxx), 5 μg de polibreno, 10 μM de Y-27632 y se colocaron en una placa de 12 pocillos. Las células se centrifugaron durante 1,5 horas a 2230 rpm, 25 °C y luego se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y se cultivaron en matrigel como se describe anteriormente para el cultivo de organoides. Las células pro-Met MHCII+ se clasificaron y se expandieron in vitro_ para su uso futuro.

Inyecciones de tumores guiadas por colonoscopia

Se realizó una colonoscopia utilizando el sistema de colonoscopio Karl Storz compuesto por una cámara Image 1 Spies H3-Z HD (parte TH100), Image 1 Connect y H3-Link, CCU modular (partes TC200, TC300), Power LED 300 y cable de luz (partes TL300 y 495ND), telescopio Hopkins (parte 64301AA)^[22],^[24]. Para la inyección guiada por colonoscopia, se ensambla una aguja de inyección personalizada (Hamilton, 7803-05), una jeringa (Hamilton, 7656-01), una aguja de transferencia (Hamilton, 7770-02) y un colonoscopio en una vaina de examen. Los ratones se anestesiaron con un 2-5% de isoflurano antes y durante el procedimiento. Para preparar las células para los trasplantes ortotópicos de organoides, primero se disociaron los organoides en frío con PBS, se lavaron y luego se disociaron con TrypLE Express durante 30 minutos a 37 °C, se pasaron a través de un filtro celular de 70 μm, se lavaron y se resuspendieron en medio ADF+ (descrito en Organoides tumorales y líneas celulares), 10% de matrigel, 1% de azul de metileno esterilizado por filtración y 10 μM de Y-27632. Las células se administraron en 3 inyecciones (7x10⁴ células en 50 μL por inyección), separadas aproximadamente 0,5 cm en el colon distal y el recto. Para preparar las células MC38 y MC38 LVM2 para las inyecciones ortotópicas, las células se disociaron con tripsina-EDTA (0,25%) durante 3 minutos, se lavaron y se resuspendieron en medio DMEM+ (descrito en Organoides tumorales y líneas celulares), 10% de matrigel, 1% de azul de metileno esterilizado por filtración y 10 μM de Y-27632. Se realizaron tres inyecciones de 2x10⁴ células por 50 μL por ratón.

Inyecciones de tumores intrasplénicas

Los ratones se anestesiaron con un 2-5% de isoflurano y se inyectaron con ketamina para la analgesia perioperatoria a 0,1 mg/gramo de peso corporal. Se afeitó el pelo de la región lateral abdominal, y la piel se desinfectó con betadina y etanol al 70%. Se realizó una pequeña incisión subcostal izquierda para acceder al bazo. El bazo se exteriorizó suavemente, y se inyectaron 5x10⁵ células de organoides AKP o pro-Met en PBS (disociadas como se describe anteriormente) en el bazo utilizando una jeringa de insulina. Los vasos sanguíneos esplénicos y su conexión con el páncreas se cauterizaron cuidadosamente utilizando un bolígrafo térmico, y el bazo se extirpó del animal. El páncreas se reposicionó dentro de la cavidad abdominal. El peritoneo se cerró con suturas de poliamida 6, y la incisión de la piel se cerró con clips.

Histopatología

Se recogieron tumores de colon representativos (o todo el colon con tumores procesados en rollos suizos) de ratones inyectados ortotópicamente con organoides AKP o pro-Met 2 y 6-7 semanas después de la inyección, se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante la noche, se deshidrataron con un 50% de etanol seguido de un 70% de etanol, luego se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina utilizando un procesador de tejidos (Leica ASP6025, Leica Biosystems, Deer Park, IL). Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 5 μm, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron mediante un patólogo veterinario certificado (S.E.C.). Los cambios microscópicos dentro de los tumores y el tejido intestinal adyacente se clasificaron para necrosis y fibrosis (desmoplasia) en una escala numérica de 0 a 4, donde 0 = normal, 1 = mínimo (70%). Los cambios epiteliales en el sitio de implantación de las células de los organoides se clasificaron en una escala de 0 a 4, donde 0 = normal, 1 = hiperplasia, 2 = displasia, 3 = adenoma y 4 = adenocarcinoma, según los criterios histopatológicos para los tumores de colon en roedores^[67],^[68]. Se generó una puntuación de patología compuesta para cada ratón sumando todas las puntuaciones de las subcategorías. Las imágenes de H&E e inmunohistoquímica se adquirieron utilizando un escáner de portaobjetos Olympus VS200 (Evident Scientific, Hamburgo, Alemania) y se analizaron con el software OlyVIA versión 3.4.1 (Olympus, Alemania).

Inmunohistoquímica

Todas las lesiones fueron evaluadas para determinar los subconjuntos de células T (CD4 y CD8) y tdTomato mediante un método de inmunohistoquímica (IHQ) previamente validado por el Laboratorio de Patología Comparada del MSK. En resumen, las secciones fijadas en formalina y embebidas en parafina se tiñeron utilizando una plataforma de tinción automatizada (Leica Bond RX, Leica Biosystems). Después de la desparafinación y la recuperación del epítopo inducida por calor, las secciones del intestino grueso se incubaron con anticuerpos anti-CD4 (dilución 1:250; 14-9766-82, clon 4SM95), anti-CD8a (dilución 1:1000; 14-0808-82, clon 4SM15) o tdTomato (dilución 1:2000; LS-C340696). A continuación, se aplicaron a los tejidos un anticuerpo secundario anti-ratón (para la IHQ de CD4 y CD8) o un anticuerpo anti-cabra (para la IHQ de tdTomato; BA-4001, BA5000, Vector Laboratories) y un sistema de detección de polímeros (PK6100, Vector Laboratories). Se utilizó tetracloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) como cromógeno y las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se examinaron mediante microscopía óptica. Se utilizaron tejidos linfoides (timo, bazo y ganglios linfáticos) de ratones no inmunizados o piel que expresaba tdTomato de ratones genéticamente modificados como controles positivos.

Tinción por inmunofluorescencia (IF)

El colon de ratón se disecó sobre hielo, se abrió longitudinalmente y se lavó con PBS frío. Se fijaron rollos suizos de tejido del colon en PFA al 4% a 4 °C durante la noche, se lavaron tres veces con PBS y se transfirieron a un 30% de sacarosa durante al menos 16 horas. El tejido se congeló en OCT, se cortó en secciones de 20 μm en un criostato y se mantuvo a −20 °C hasta la tinción. Las secciones congeladas montadas en portaobjetos se descongelaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron dos veces con PBS durante 5 minutos cada una y una vez durante 10 minutos en 0,1% de Triton X-100 en PBS. Las secciones se bloquearon durante 30 minutos en tampón de bloqueo (1x BD Perm/Wash Buffer, 1:200 Fc block). A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos conjugados (1:100 AF488 anti-ratón CD8a, 1:100 AF647 anti-ratón CD3) en tampón de bloqueo durante 1 hora a 37 °C. Después de tres lavados en PBS durante 5 minutos cada uno, las secciones teñidas se montaron con Fluoromount-G con DAPI y se mantuvieron a 4 °C hasta la obtención de imágenes.

Obtención de imágenes de microscopía para IF

Las imágenes de IF (ratones control) se obtuvieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 980. Se obtuvieron vistas de secciones completas en mosaico utilizando un objetivo de 5x/0,16 NA a una resolución de 1024 x 1024 píxeles. Se identificaron las regiones que contenían agregados de tdTomato y se obtuvieron imágenes a mayor aumento utilizando un objetivo de 20x/0,8 NA, con pilas Z en mosaico obtenidas a una resolución de 2048 x 2048 píxeles. Todas las imágenes se obtuvieron con la misma potencia láser, ganancia del detector y ajustes de offset en todas las muestras. Los escaneos en mosaico se unieron automáticamente utilizando el software Zeiss ZEN, y las series de imágenes de pilas Z se importaron a Fiji (ImageJ) para la proyección de máxima intensidad. Se obtuvieron imágenes adicionales de pilas Z (ratones AKP y pro-Met) utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Olympus FV4000 con un objetivo de 20x/0,80 NA a una resolución de 1024 x 1024 píxeles. La adquisición y el procesamiento de imágenes se realizaron utilizando el software Olympus cellSens/FV4000, y las series de imágenes de pilas Z se importaron a Fiji (ImageJ) para la proyección de máxima intensidad.

Administración de tamoxifeno

El tamoxifeno (50 mg/mL) se disolvió en aceite de maíz y 10% de etanol, se agitó a 45 °C durante 3-4 horas y se almacenó a −20 °C hasta su uso. Los ratones iSellTomato recibieron dos dosis de tamoxifeno (5 mg/dosis) por sonda oral en los días −3 y −1 en relación con la inyección del tumor o del control (para el análisis en el momento inicial), o alrededor de los días +29, +31 (4 semanas) después de la inyección del tumor. Los ratones Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC utilizados para el trasplante ortotópico de tumores recibieron tres dosis de tamoxifeno (5 mg/dosis, con un día de diferencia) al menos una semana antes de las inyecciones del tumor.

Depleción de anticuerpos

Para la depleción de células T CD4+ o CD8+, los ratones C57BL/6 recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μg/ratón de anticuerpos depletores anti-CD4 (clon GK1.5), anti-CD8 (clon 2.43) o de control isotípico (clon LTF-2) dos días antes de la inyección ortotópica del tumor AKP. La administración de anticuerpos se repitió el día de la inyección del tumor y cada 5-7 días hasta el análisis.

Administración de sustrato para el etiquetado uLIPSTIC

Se compró ácido biotín-aminohexanoico-LPETGS, carboxiamida terminal, con una pureza del 95% (biotín-LPTEG) a LifeTein (síntesis a medida) y se prepararon soluciones madre al 20 mM en PBS. Para los experimentos de etiquetado uLIPSTIC, se inyectaron intraperitonealmente seis dosis del sustrato biotín-LPETG, con 20 minutos de diferencia, durante un período de 2 horas (8 μmol/1.ª dosis, seguido de 2 μmol para cada dosis posterior). Los ratones se sacrificaron para el análisis por citometría de flujo 1 hora después de la última inyección del sustrato.

Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores

Los linfocitos intraepiteliales del colon (LIE) se aislaron según lo descrito previamente^[69]. En resumen, se recogieron y lavaron los colones en PBS y 1 mM de ditiotreitol (DTT) seguido de 30 mM de EDTA. Los LIE se recuperaron del sobrenadante de los lavados con DTT y EDTA. Los linfocitos de los tumores del colon se obtuvieron mediante la digestión del tejido en 6 mL de RPMI suplementado con 2% de FBS, 100 μg/mL de DNaseI y 2 mg/mL de colagenasa 8 durante 45 minutos a 37 °C. Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación de gradiente utilizando Percoll. A continuación, las suspensiones de células simples se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente, como se describe en la sección de citometría de flujo, antes del análisis o la clasificación por citometría de flujo.

Citometría de flujo, tinción y estrategia de clasificación

Las suspensiones de células simples se resuspendieron en PBS + 0,5% de BSA + 1 mM de EDTA (PBE) y se incubaron con anticuerpos marcados fluorescentemente para la tinción de superficie durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBE antes de la citometría de flujo. Se utilizó la siguiente estrategia de clasificación para examinar las células T CD4+ o CD8+: linfocitos simples viables (basados en el tamaño y el tinte de células viables/muertas Aqua o NIR), CD45+, TCRβ+, CD8β−/+, CD4+/−. Para el análisis de los ratones iSellTomato, se añadió la siguiente estrategia de clasificación: CD62L− y Tomato+ o Tomato−. Se utilizó la misma estrategia de clasificación descrita anteriormente para los ratones iSellTomato (CD62L− y Tomato+) para la clasificación de células que se sometieron a secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Las células T se clasificaron en un instrumento FACSymphony. Para los experimentos uLIPSTIC, se utilizó la siguiente estrategia de clasificación para examinar las células tumorales: células simples viables (basadas en el tamaño y el tinte de células viables/muertas NIR), EpCAM+, CD45−, Tomato+, FLAG+, Biotin+, SrtA-GFP+.

La tinción intranuclear de Foxp3 se realizó utilizando el kit de tinción de células T reguladoras Foxp3 Mouse Regulatory T Cell Staining Kit según las instrucciones del kit. Para el análisis de la secreción de citocinas, las células mononucleares totales aisladas del epitelio del colon o de los tumores se colocaron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C con 100 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), 200 ng/mL de ionomicina y 2 mM de monensina durante 4 horas. La tinción intracelular de IFN-γ se realizó en tampón Perm/Wash después de la fijación y la permeabilización en tampón Fix/Perm según las instrucciones del kit. Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro FACSymphony A5 y se analizaron utilizando el paquete de software FlowJo 10.

Co-cultivos de organoides y células T

Las células T aisladas de los tumores AKP en los ratones Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC, como se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos de citometría de flujo, como se describe. Las células T aisladas de los ratones iSellTomato, como se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos de citometría de flujo, como se describe anteriormente. Las células T CD62L+, CD62L− Tomato− y CD62L− Tomato+ CD4+ y CD8β+ se clasificaron en un clasificador de células BD FACS Aria III utilizando una boquilla de 70 μm a 45 psi. Para el co-cultivo combinado de CD4+ y CD8β+, las células se agruparon a partir de los LIE del colon y del tumor (de los ratones AKP o pro-Met), y las células se agruparon a partir de n=4-5 animales por condición por experimento. Para las células T aisladas de los modelos iSellTomato y Pou2f3CreERT2 uLIPSTIC, se co-cultivaron 4500 células T y 4000 células T, respectivamente, con 1000 células de organoides pro-Met que se disociaron antes del co-cultivo, como se describe anteriormente. Las células se co-cultivaron en un volumen final de 10 μL en un 50% de matrigel. Se añadió TCM caliente suplementado con 10 ng/mL de interleucina-2 recombinante de ratón (R&D), 20 ng/mL de interleucina-7 recombinante de ratón (R&D) y 10 ng/mL de complejo de interleucina-15/IL-15Rα recombinante de ratón (ThermoFisher) a las gotas de co-cultivo solidificado. El día 5, se obtuvieron imágenes de los co-cultivos utilizando un microscopio Keyence BZ-X810 en modo de campo claro con un objetivo de 2X y un zoom digital de 1,5X. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a −80 °C para el análisis posterior de citocinas mediante un ensayo de cuentas citométricas, realizado según las instrucciones del fabricante.

Tras la obtención de imágenes y la recogida de sobrenadantes, los co-cultivos se disociaron utilizando TrypLE durante 30 minutos para facilitar la digestión del matrigel y de los organoides. Las muestras se disociaron aún más mediante pipeteo, se lavaron con PBS y se procesaron para la tinción y el análisis por citometría de flujo.

Preparación de la biblioteca de scRNA-seq

Las células T aisladas de los ratones iSellTomato, como se describe anteriormente (Aislamiento de células T del epitelio del colon y de los tumores), se tiñeron con anticuerpos individuales Biolegend TotalSeq C (1:100) para permitir la codificación a nivel de muestra. Las células CD62L− Tomato+ CD4+ o CD8β+ se clasificaron en un clasificador de células BD FACS Aria III utilizando una boquilla de 70 μm a 45 psi. Las muestras se agruparon, se evaluó su viabilidad y se cargaron rápidamente en un solo pocillo del dispositivo microfluídico Chromium de 10X Genomics. Se generó una biblioteca de expresión génica unicelular siguiendo el protocolo del fabricante para un kit de reactivos Chromium Next GEM Single Cell 5’ v2 (Dual Index), VDJ, con tecnología de barra de características (para capturar las barras de muestra TotalSeq C). Las bibliotecas se secuenciaron en una celda de flujo NovaSeq S1.

Preparación de la biblioteca de scTCR-seq

Las células simples se clasificaron por índice utilizando un clasificador FACSymphony en placas de 96 pocillos que contenían 5 μL de tampón de lisis (tampón TCL, Qiagen 1031576) suplementado con 1% de β-mercaptoetanol y se congelaron a −80 °C antes de la RT-PCR. La extracción de ARN y la RT-PCR para TCRβ se realizaron como se describe anteriormente^[70]. Los productos de PCR se codificaron por barras y se enviaron para la secuenciación MiSeq^[71] utilizando el kit TrueSeq Nano (Illumina). Los archivos fastq de MiSeq se desmultiplexaron, se ensamblaron los extremos de las lecturas utilizando PANDASEQ^[72] y se combinaron utilizando el conjunto de herramientas FASTX. Las lecturas desmultiplexadas se asignaron a los pocillos por código de barras, y los archivos FASTA resultantes se alinearon y analizaron utilizando IMGT/HighV-QUEST (imgt.org/HighV-QUEST)^[73]. Las células que compartían secuencias de nucleótidos idénticas de la región CDR3 de TCR se definieron como clones. Solo se incluyeron en el análisis las secuencias de unión en fase de TCRβ.

Análisis de datos de scRNA-seq y scTCR-seq

Los archivos FASTQ sin procesar fueron filtrados, alineados y se generaron las etiquetas de características utilizando Cell Ranger v7.0.1. Las muestras se procesaron en el mismo flujo celular utilizando 15 etiquetas de características individuales para separar las células TIL e IEL de las condiciones Sham, AKP y pro-Met. El análisis VDJ se realizó utilizando el modo cellranger VDJ con la configuración predeterminada. En total, cellranger recuperó 8903 células con una mediana de 7357 lecturas por célula, y el 84% de ellas presentaba lecturas VDJ. Las matrices resultantes se cargaron en R y se analizaron utilizando los paquetes R tidyomics (v1.0) y Seurat (v5.3). Las células que presentaban cero o más de una lectura ADT fueron excluidas de los análisis posteriores. A continuación, se eliminaron las células que mostraban más del 10% de la expresión total de genes mitocondriales del análisis. Los datos de expresión se normalizaron utilizando SCTransform. Se realizó una reducción de dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales (PCA) y se aplicó UMAP para visualizar los grupos. Se calcularon todas las posibilidades de agrupación utilizando FindClusters con el algoritmo de Louvain y luego se volvieron a verificar mediante relaciones jerárquicas y significancia biológica. La resolución final de la agrupación se decidió según la diferencia biológica entre los tipos de células T y se realizó la anotación del tipo de célula utilizando los paquetes de enriquecimiento ClusterProfiler (v4.6.2) y fgsea (v1.24.0) y la curación manual. Los genes expresados diferencialmente se determinaron utilizando la función FindMarkers de marcadores de cada grupo y entre los grupos. Las células CD4+ y CD8+ se separaron utilizando Cd4 (>0.5 de expresión) y Cd8b1 (>1 de expresión). Después de la separación, las células T CD4+ y CD8+ se reprocesaron utilizando los métodos mencionados anteriormente y se incluyeron un total de 1680 células T CD4+ y 1592 células T CD8+ en el análisis. El enriquecimiento funcional para las figuras se realizó utilizando fgsea (v1.24.0) en relación con GO BP (c5.go.bp.v7.5.1.symbols). Los gráficos generados en R se produjeron utilizando ggplot2 (v3.5.2), el paquete de visualización iSEE (v2.10.0). Los archivos rds completos y separados, así como los datos procesados, están disponibles en GEO: GSE311111: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE311111 (token gxinqgkszzabpiz).

El análisis clonal del TCR se realizó procesando el archivo de salida filteredcontigannotations.csv de cellranger. Brevemente, solo se utilizaron las células que contenían TRA, TRB, TRATRB, TRA dual y/o contigs TRB dual para el análisis estadístico. Las células que albergaban los mismos genes V y J y la longitud CDR3, así como el emparejamiento TRA y TRB, se anotaron como relacionadas clonalmente. Las células que contenían solo TRA o TRB también se asignaron como parte del mismo núcleo TRATRB si tenían una secuencia CDR3 exacta. El índice de superposición de Morisita horn se calculó con la función mh(data, CI = 0.95, resample = 100) en el paquete R divo v1.0.2. La diversidad del repertorio de TCR se analizó mediante el índice de Diversidad 50 (D50), que se calculó clasificando los clonotipos por frecuencia y definiendo D50 como la proporción de clonotipos necesarios para alcanzar el 50% de las células dentro de cada grupo.

Expresión de TCR en hibridomas NFAT-GFP

Utilizamos el vector retroviral pMSCV-mCD4-PIG TCR-OTII como se describió previamente para transducir las células hibridomas NFAT-GFP 58α–β– con constructos de TCR sintéticos^[38]. Las secuencias de TCR se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. pMSCV-mCD4-PIG TCR-OTII, nuestro vector principal para la expresión de TCR, fue proporcionado a Twist Bioscience. Las secuencias de los genes TCR α y β seleccionados (21 TCR en total) se obtuvieron del archivo de salida filteredcontigannotations.csv del scRNA-seq. Se sintetizó una secuencia objetivo que consistía en los genes TCR α y β separados por un péptido de auto-escisión P2A (Twist Bioscience) y se utilizó para reemplazar el gen TCR OTII en el plásmido pMSCV-mCD4-PIG. La línea celular de empaquetamiento retroviral Platinum-E (RV-101) se utilizó para el empaquetamiento viral de los vectores pMSCV-mCD4-PIG TCR generados por Twist. Las células Platinum-E se cultivaron en una placa de 96 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 60-80% y se transfectaron con los vectores pMSCV-mCD4-PIG TCR como un complejo ADN-lípido utilizando Lipofectamine 3000 (L3000001) siguiendo las instrucciones del fabricante. El sobrenadante de cultivo que contenía partículas virales se recolectó 24 horas después de la transfección. A continuación, se centrifugaron 2,5 x 104 células NFAT-GFP, se resuspendieron en 200 μl del sobrenadante que contenía el virus suplementado con 10 μg/ml de sulfato de protamina y se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo plano. Las células NFAT-GFP se transfectaron por centrifugación a 1000xg a 32 °C durante 120 minutos, se pipetearon de arriba abajo y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Luego, las células se transfirieron a un matraz y se incubaron durante 1 a 2 semanas con 10 ml de medio de cultivo (DMEM con 10% de FCS, penicilina-estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) bajo selección con puromicina (1 μg/mL). Después de la selección y la propagación, se confirmó la expresión de TCR en las células NFAT-GFP utilizando citometría de flujo.

Preparación de extractos antigénicos

Extractos antigénicos tumorales:

Los lisados de organoides in vitro de AKP y pro-Met se prepararon disociando los organoides en células individuales como se describió anteriormente. Las células se resuspendieron en PBS a 1x107 células/mL. La suspensión celular se sometió a 5 ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y baño de agua a 56 °C. Las células se centrifugaron a 1700 g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se utilizó como fuente de lisados tumorales, y se utilizaron 5 μL para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP. Para preparar el lisado tumoral ex vivo de AKP, los tumores de AKP se recolectaron 2 semanas después de las inyecciones ortotópicas de organoides AKP en ratones SPF. Los tumores se cortaron en trozos pequeños y se resuspendieron en PBS suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Los tejidos se calentaron durante 1 hora a 56 °C, seguido de 4 ciclos de congelación-descongelación. Los tubos se centrifugaron para eliminar los restos de tejido y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP.

Extractos antigénicos microbianos:

Los extractos fecales totales se prepararon disolviendo una pequeña cantidad de heces en 200 μL de PBS y se centrifugaron brevemente en una centrífuga de mesa durante 3-5 segundos para eliminar las partículas fecales grandes. El sobrenadante se transfirió a otro tubo, se centrifugó a 10 000 g durante 10 minutos y luego el pellet bacteriano se resuspendió en 200 μL de PBS. El lisado fecal se inactivó por calor a 75 °C durante 1 hora. Para preparar extractos antigénicos bacterianos de la especie MM12, las bacterias recuperadas de los cultivos de glicerol se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C durante 1-2 días en medio AAM+ líquido (que contiene 18 g/L de BHI, 15 g/L de caldo de tripticasa de soja, 5 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de K2HPO4, 0,5 g/L de d-glucosa, 0,25 g/L de cisteína-HCl.H2O, 0,25 g/L de Na2S.9H2O, 1 mg/L de hemina, 0,5 mg/L de vitamina K3, 3% de FCS inactivado por calor). Luego, las bacterias se colocaron en placas de agar de sangre de Columbia (CBA) y se cultivaron anaeróbicamente durante 48-72 horas (sistemas anaeróbicos). Se aislaron colonias individuales y se cultivaron en medio AAM+ líquido durante la noche. Se centrifugaron 2 mL de medio líquido a 10 000 g durante 10 minutos en tubos de Eppendorf estériles y se resuspendieron en 1 mL de PBS estéril y se inactivaron por calor a 75 °C durante 1 hora antes de su uso. Helicobacter hepaticus fue proporcionado por Dan Littman (NYU) y se cultivó como se describió previamente^[74]. La densidad óptica (OD) de los lisados fecales y bacterianos se midió utilizando un nanodrop y se normalizó a OD ≤ 1, y se utilizó 1 μL de lisados fecales o bacterianos por pocillo en el ensayo de cocultivo in vitro descrito a continuación.

Extractos antigénicos dietéticos:

Las mezclas de antígenos de proteínas alimentarias y dietéticas (para caseína, soja y zeína) se prepararon como se describió previamente^[75]. Brevemente, las partículas de alimentos sólidas se muelen utilizando un mortero y se resuspenden 50 mg de polvo en 1 mL de PBS y se utilizan 50 μg de 50 mg/mL de solución en cada pocillo en el ensayo de cocultivo in vitro.

Extractos antigénicos tumorales:

Los lisados de organoides in vitro de AKP y pro-Met se prepararon disociando los organoides en células individuales como se describió anteriormente. Las células se resuspendieron en PBS a 1x107 células/mL. La suspensión celular se sometió a 5 ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y baño de agua a 56 °C. Las células se centrifugaron a 1700 g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se utilizó como fuente de lisados tumorales, y se utilizaron 5 μL para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP. Para preparar el lisado tumoral ex vivo de AKP, los tumores de AKP se recolectaron 2 semanas después de las inyecciones ortotópicas de organoides AKP en ratones SPF. Los tumores se cortaron en trozos pequeños y se resuspendieron en PBS suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Los tejidos se calentaron durante 1 hora a 56 °C, seguido de 4 ciclos de congelación-descongelación. Los tubos se centrifugaron para eliminar los restos de tejido y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP.

Extractos antigénicos microbianos:

Los extractos fecales totales se prepararon disolviendo una pequeña cantidad de heces en 200 μL de PBS y se centrifugaron brevemente en una centrífuga de mesa durante 3-5 segundos para eliminar las partículas fecales grandes. El sobrenadante se transfirió a otro tubo, se centrifugó a 10 000 g durante 10 minutos y luego el pellet bacteriano se resuspendió en 200 μL de PBS. El lisado fecal se inactivó por calor a 75 °C durante 1 hora. Para preparar extractos antigénicos bacterianos de la especie MM12, las bacterias recuperadas de los cultivos de glicerol se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C durante 1-2 días en medio AAM+ líquido (que contiene 18 g/L de BHI, 15 g/L de caldo de tripticasa de soja, 5 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de K2HPO4, 0,5 g/L de d-glucosa, 0,25 g/L de cisteína-HCl.H2O, 0,25 g/L de Na2S.9H2O, 1 mg/L de hemina, 0,5 mg/L de vitamina K3, 3% de FCS inactivado por calor). Luego, las bacterias se colocaron en placas de agar de sangre de Columbia (CBA) y se cultivaron anaeróbicamente durante 48-72 horas (sistemas anaeróbicos). Se aislaron colonias individuales y se cultivaron en medio AAM+ líquido durante la noche. Se centrifugaron 2 mL de medio líquido a 10 000 g durante 10 minutos en tubos de Eppendorf estériles y se resuspendieron en 1 mL de PBS estéril y se inactivaron por calor a 75 °C durante 1 hora antes de su uso. Helicobacter hepaticus fue proporcionado por Dan Littman (NYU) y se cultivó como se describió previamente^[74]. La densidad óptica (OD) de los lisados fecales y bacterianos se midió utilizando un nanodrop y se normalizó a OD ≤ 1, y se utilizó 1 μL de lisados fecales o bacterianos por pocillo en el ensayo de cocultivo in vitro descrito a continuación.

Extractos antigénicos dietéticos:

Las mezclas de antígenos de proteínas alimentarias y dietéticas (para caseína, soja y zeína) se prepararon como se describió previamente^[75]. Brevemente, las partículas de alimentos sólidas se muelen utilizando un mortero y se resuspenden 50 mg de polvo en 1 mL de PBS y se utilizan 50 μg de 50 mg/mL de solución en cada pocillo en el ensayo de cocultivo in vitro.

Cribado in vitro de la especificidad del TCR

Al menos siete días antes del ensayo del reportero NFAT-GFP, se inyectaron por vía subcutánea a ratones C57BL/6 CD45.1+ 1x106 células de melanoma B16-Flt3L^[38],^[76] para enriquecer las células dendríticas (DCs) en el bazo. Los tumores se recolectaron no más de 4 semanas después de las inyecciones. El día del experimento, se recolectaron los bazos de ratones CD45.1 inyectados con tumores y se digirieron en 400 U/mL de colagenasa D y 10 μM de EDTA. Se lisaron los glóbulos rojos utilizando el tampón de lisis de glóbulos rojos. Las células dendríticas CD11c+ se enriquecieron utilizando MicroBeads UltraPure para ratones CD11c.

Para el ensayo de cocultivo NFAT-GFP, se cultivaron 5x104 DCs esplénicas en 100 μL en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se pulsaron con los antígenos de interés durante 2-4 horas a 37 °C y 5% de CO2. Los antígenos se obtuvieron como se describió anteriormente. A continuación, se cocultivaron 1x104 células TCR-transducidas NFAT-GFP en una placa de 96 pocillos con las DCs pre-pulsadas. Después de 18-40 horas, las células se tiñeron con Live/Dead Zombie NIR, TCRβ, CD4 y CD45.1, y se midió la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Como control positivo, se determinó la capacidad de respuesta de TCR de cada línea de hibridoma NFAT-GFP mediante estimulación con anti-CD3 (0,5 μg/pocillo).

Secuenciación del exoma completo (WES) de los tumores

Los organoides tumorales de AKP y pro-Met (1x106 cada uno, en forma de gránulos congelados) se enviaron a GENEWIZ (Azenta Life Sciences, South Plainfield, NJ) para realizar la secuenciación del exoma completo. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el panel del exoma de ratón Twist y se secuenciaron con lecturas de 150 pares de bases en una plataforma Illumina. Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el flujo de trabajo bioinformático de GENEWIZ. En resumen, las lecturas sin procesar se recortaron con Trimmomatic (v0.39), se alinearon al genoma de referencia Mus musculus GRCm38 utilizando Sentieon (202308) y se procesaron para marcar los duplicados. Los variantes de un solo nucleótido (SNV) y las pequeñas inserciones/deleciones (indels) somáticas se identificaron utilizando el algoritmo TNseq de Sentieon. Los variantes se normalizaron con bcftools (v1.13) y se anotaron utilizando Ensembl Variant Effect Predictor (VEP, versión 104). Un archivo de anotación de mutaciones somáticas conjuntas (MAF) anotado generado por GENEWIZ se importó a R y se analizó utilizando el paquete maftools. Los genes que presentaban mutaciones únicas en los tumores de AKP o pro-Met se identificaron comparando los perfiles de mutación a nivel de gen entre las muestras, y las frecuencias de mutación se compararon utilizando la función mafCompare.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v.10. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando el software FlowJo. Los datos de los gráficos muestran la media y se consideraron significativos los valores de p