Microrobots multiestadio con liberación dependiente del pH de nanopartículas recubiertas con membrana plaquetaria.

Los métodos convencionales de administración de fármacos, como la administración oral y la inyección intravenosa, se basan en la dispersión sistémica de los fármacos, lo que conlleva una mala localización en las áreas afectadas y un alto riesgo de efectos secundarios no deseados. En contraste, los sistemas de administración de fármacos dirigidos están cuidadosamente diseñados para sortear las barreras biológicas y liberar los agentes terapéuticos con precisión en sitios específicos, mejorando la eficacia terapéutica y minimizando los efectos secundarios (^[1]). Con los avances en la micro y nanotecnología, han surgido varias técnicas de administración innovadoras, que mejoran notablemente el rendimiento de las estrategias terapéuticas, incluyendo la inmunoterapia catalítica dirigida (^[2]), el trasplante de células madre (^[3]) y la terapia quimio-fototérmica (^[4]).

Se han utilizado diversos enfoques de administración de fármacos, que abarcan desde la nanoescala hasta la macroescala, para abordar las barreras biológicas, incluidas las membranas celulares y los sistemas de órganos. En este contexto, las nanomedicinas han recibido una atención considerable debido a su alta relación superficie-volumen, su capacidad de ajuste estructural y su facilidad de funcionalización. Las nanopartículas diseñadas, en particular, destacan como prometedores vehículos de administración de fármacos capaces de superar las barreras biológicas y lograr una focalización específica de la enfermedad (^[5]). Su tamaño les permite atravesar las barreras celulares a través de mecanismos como la endocitosis, la transcytosis y la difusión pasiva, que se ven potenciados por el efecto de permeabilidad y retención mejorada en los tumores.

A la nanoescala, la especificidad del direccionamiento puede mejorarse mediante estrategias de modificación de la superficie de las nanopartículas, como el recubrimiento químico, la bioconjugación con carbohidratos, anticuerpos y péptidos, y/o el recubrimiento biomimético con membranas celulares naturales (^[6]–^[9]). En particular, el recubrimiento con membranas celulares naturales, derivadas de plaquetas, eritrocitos, macrófagos, células cancerosas y bacterias, puede conferir las propiedades biológicas de la membrana celular de origen a la superficie de la nanopartícula, incluyendo el direccionamiento homotípico, la evasión inmunitaria y una vida útil prolongada en la circulación (^[10]). Este enfoque se ha utilizado con éxito en terapias para el cáncer (^[11]), la trombosis (^[12]), las enfermedades cardíacas (^[13]), la desintoxicación (^[14]) y la vacunación (^[15]). Específicamente, se sabe que las plaquetas tienen una alta afinidad de unión a las células cancerosas a través de interacciones específicas receptor-ligando de la membrana, como la integrina α6β1 en las plaquetas con ADAM-9 en las células cancerosas y la P-selectina en las plaquetas con PSGL-1 o CD24 en las células cancerosas (^[16]). Esta observación ha llevado al desarrollo activo de nanopartículas recubiertas con membrana de plaquetas (PNP) para dirigir las células cancerosas y el microentorno tumoral en aplicaciones terapéuticas (^[17]). Sin embargo, los métodos actuales de administración sistémica y dirigida al tumor producen una eficacia de direccionamiento limitada, con menos del 0,7% de la dosis total administrada acumulándose en el sitio de la enfermedad deseado (^[18]). Esta ineficiencia se debe principalmente al complejo entorno dentro del cuerpo humano, caracterizado por una hemodinámica rápida, la eliminación inmunitaria, el sistema reticuloendotelial, la filtración renal y múltiples barreras estructurales, incluyendo el epitelio, el endotelio y la matriz extracelular (^[19]).

Se pueden lograr capacidades de direccionamiento adicionales con la integración de dispositivos a microescala. Por ejemplo, la microelectrónica avanzada y varios mecanismos de propulsión permiten capacidades multifuncionales, como la detección en tiempo real, el control de navegación preciso y la liberación de fármacos a demanda (^[20]). Como ejemplo representativo de estos sistemas, los microrobots han demostrado un gran potencial para la administración de fármacos específica del sitio. A diferencia de las nanopartículas, que dependen pasivamente de las interacciones bioquímicas para el direccionamiento, los microrobots pueden ser guiados activamente dentro del cuerpo utilizando campos externos, como campos magnéticos (^[21]), ópticos (^[22]) y estímulos acústicos (^[23]); o propulsados por mecanismos de auto-activación como reacciones catalíticas (^[24]) y el movimiento basado en microorganismos (^[25]). El control magnético es especialmente atractivo debido a su penetración mínimamente invasiva en los tejidos profundos, lo que permite una navegación programable y una acumulación en sitios específicos con alta precisión (^[21]). Además, los microrobots ofrecen una gran flexibilidad de diseño para integrar estrategias de carga avanzadas, incluyendo el llenado microfluídico, lo que los hace adecuados para la encapsulación de diversas modalidades farmacéuticas (^[26]).

A pesar de estos avances en los sistemas de administración de fármacos a micro y nanoescala, los enfoques de administración a una sola escala a menudo tienen dificultades para lograr una localización terapéutica suficiente, porque la administración oral debe superar las barreras fisiológicas jerárquicas que abarcan desde la macroescala hasta las micro/nanoescalas (^[27]–^[29]). A lo largo del tracto gastrointestinal (GI), las modalidades farmacéuticas se encuentran con microentornos fisiológicos dinámicamente cambiantes, incluyendo diferentes niveles de pH, actividad enzimática, capas de moco gruesas y movimiento peristáltico, lo que plantea obstáculos importantes para la administración oral de fármacos. Los fármacos administrados por vía oral deben resistir la acidez gástrica, penetrar la capa de moco intestinal y acumularse con éxito en los sitios tumorales dentro de los intestinos, al tiempo que evitan la degradación enzimática y la dilución (^[30]). Los microrobots son muy eficaces para navegar a través de las barreras a macroescala; sin embargo, tienen una capacidad limitada para penetrar en las interfaces biológicas a nanoescala. En contraste, las nanopartículas pueden atravesar las interfaces a nanoescala, como las membranas celulares, pero carecen de una capacidad de direccionamiento adecuada a macroescala. Estas fortalezas complementarias motivan un enfoque de administración de fármacos multietapa versátil que integra la navegación a micro/macroescala con la interacción a nanoescala y la liberación sensible al microentorno dentro de una plataforma jerárquica. Este marco es ampliamente aplicable en diversas enfermedades y afecciones del tracto gastrointestinal y es particularmente relevante en contextos donde se desea una administración intestinal localizada, como el cáncer de colon.

Aquí, desarrollamos una plataforma de administración de fármacos multietapa que integra microrobots magnéticos, sellado sensible al pH y PNP en un único sistema funcional. Nuestro sistema, denominado p-bots (microrobots cargados con PNP), combina las capacidades de navegación a macroescala de los microrobots magnéticos con las propiedades de direccionamiento miméticas de plaquetas de los PNP. La arquitectura de microrobots rellenable permite una estrategia de magnetización basada en una cámara rellenable, lo que permite la formación de una capa magnética interna para la actuación. Además, la capa de sellado sensible al pH protege la carga durante el tránsito gástrico en condiciones ácidas y luego se degrada en condiciones similares a las intestinales, lo que permite una liberación autónoma y específica del sitio sin un estímulo externo. La arquitectura rellenable también proporciona flexibilidad para cargar diferentes cargas terapéuticas y modalidades farmacéuticas, que van desde soluciones acuosas para una liberación relativamente rápida hasta formulaciones encapsuladas en hidrogel para una liberación más prolongada, lo que amplía la aplicabilidad terapéutica del sistema. Evaluamos esta estrategia multietapa en un modelo de cáncer de colon in vitro que presenta un canal microfluídico con estructuras similares a las vellosidades, pH y condiciones de flujo que imitan el tracto gastrointestinal, y validamos además la locomoción del microrobot en tejidos porcinos del tracto gastrointestinal ex vivo, compatibles y plegados. En conjunto, este enfoque jerárquico aborda las limitaciones de los sistemas de administración de fármacos de una sola etapa convencionales y amplía las posibilidades de las estrategias de administración oral para dirigir sitios de enfermedad complejos y de difícil acceso.

RESULTADOS

Diseño y fabricación de microrobots magnéticos y sensibles al pH para la administración de fármacos dirigida en múltiples etapas

La administración oral es una vía no invasiva, fácil de usar y que facilita el cumplimiento del paciente, con un gran potencial para el tratamiento del cáncer de colon, ya que permite un tratamiento localizado directamente dentro del tracto gastrointestinal (^[31]). Sin embargo, lograr una acumulación de fármacos específica del sitio a través de la administración oral sigue siendo un desafío debido a la complejidad anatómica del tracto gastrointestinal y su entorno dinámico. Para abordar estos desafíos, desarrollamos un sistema multietapa que presenta una combinación única de PNP dirigidas a las células cancerosas encapsuladas en un portador de microrobots sensible al pH.

La figura 1A resume el proceso de fabricación de microrobots magnéticos para la administración de fármacos dirigida en múltiples etapas. En primer lugar, los microrobots rellenable se imprimen utilizando polimerización de dos fotones (2PP) y se preparan las nanopartículas biomiméticas. Las nanomedicinas se introducen en la cámara del microrobot mediante carga al vacío. Una vez completamente cargados y limpiados, los microrobots se sellan inmediatamente con un material sensible al pH, compuesto por un copolímero de ácido metacrílico y acrilato de etilo, utilizando recubrimiento por inmersión para minimizar la evaporación de la solución. Validamos la plataforma utilizando un modelo microfluídico in vitro que imita el colon. El direccionamiento preciso se logra aprovechando las características a micro y nanoescala del sistema. En la etapa 1, la navegación del microrobot se controla mediante un campo magnético tridimensional (3D) aplicado externamente, lo que permite un movimiento preciso a través de un canal microfluídico que imita el tracto gastrointestinal. El microrobot puede ser guiado hacia un sitio objetivo que alberga un esferoide de cáncer de colon. El cambio de pH local en el sitio objetivo desencadena la degradación de la capa de sellado, liberando la solución de nanopartículas. La segunda etapa del direccionamiento se logra a través de la acción de los PNP, que exhiben una alta afinidad por las células cancerosas del colon, lo que mejora la administración terapéutica.

Como se ilustra en la figura 1B, prevemos la aplicación de este sistema de microrobots magnéticos para la administración oral de nanomedicinas para el cáncer de colon. Su sellado sensible al pH protegería eficazmente el fármaco del entorno ácido durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal. A diferencia de los sistemas previamente reportados que se basan en mecanismos de liberación activados por calor o luz (^[32], ^[33]), que requieren unidades de control externas y enfrentan problemas como la mala penetración en los tejidos, nuestro sistema aprovecha el gradiente de pH natural del tracto gastrointestinal. Los microrobots permanecerían estables y liberarían selectivamente la carga al encontrarse con el entorno intestinal.

Diseño y caracterización de microrobots para el direccionamiento de la etapa 1

La primera etapa de direccionamiento combina la localización magnética del microrobot con la liberación activada por el pH de la carga de nanopartículas. Diseñamos el microrobot rellenable con una forma esférica para permitir un movimiento multimodal, incluyendo el rodamiento, el giro y el bamboleo (^[32]). El diámetro de 550 μm se seleccionó como un compromiso práctico entre la capacidad de carga interna, la fidelidad de la fabricación, la fiabilidad del sellado y la eficiencia de la fabricación. Este tamaño proporciona suficiente espacio interno para la carga y la formación de la capa magnética interna, al tiempo que es compatible con la fabricación de alta resolución de la matriz de poros de 40 μm utilizada para la carga al vacío y la matriz de protrusiones de 5 μm para un sellado preciso (figura 2A). Estos microrobots se fabricaron utilizando la impresión 3D de alta resolución basada en 2PP con resina biocompatible IP-Q, que proporciona la precisión submicrométrica necesaria para imprimir características complejas a microescala. Se ha informado que IP-Q es citocompatible después del postprocesamiento estándar y se ha utilizado en dispositivos y plataformas microestructuradas impresas en 2PP para estudios basados en células, incluyendo la cocultivo a largo plazo con esferoides celulares 3D (^[34], ^[35]). En la impresión 3D, la estructura se divide en capas y se imprime secuencialmente; la optimización de la eficiencia de la impresión requiere equilibrar el grosor de la capa y la resolución. Las capas más gruesas reducen el número total de capas y el tiempo de impresión, pero pueden comprometer la resolución estructural. Evaluamos el efecto de los grosores de capa de 3,5, 2,5 y 1,5 μm en los resultados de la impresión mediante imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM), que revelaron que solo el grosor de capa de 1,5 μm reprodujo con éxito todas las características del microrobot, incluyendo la tapa superior, mientras que los ajustes más gruesos no lograron imprimir la tapa superior (figura 2B).

Hemos fabricado con éxito una serie de microrobots y establecimos un proceso optimizado de limpieza y postcurado, lo que resultó en una cámara interna limpia, como lo confirman las características microestructurales claras (fig. S1). Después de la impresión y el postprocesamiento, los microrobots se someten a un procedimiento de magnetización que permite el llenado de la cámara. En resumen, se carga una suspensión de micropartículas de neodimio, hierro y boro (NdFeB) en la cámara interna mediante centrifugación, lo que permite que las partículas sedimenten y formen una capa magnética estable en el fondo de la cámara después del secado del disolvente. Esta capa magnética se aísla posteriormente de la carga del fármaco mediante una fina capa de barrera de polidimetilsiloxano (PDMS), y luego se someten los microrobots a una postmagnetización utilizando un magnetizador de impulsos para definir una orientación magnética consistente en toda la serie. Tras la magnetización, la carga se introduce al vacío a través de los poros de la tapa, lo que permite una carga uniforme en toda la serie impresa [fig. 2C (a)]. Se utiliza una solución acuosa de rodamina B (RhB) como fármaco modelo de molécula pequeña debido a su fuerte absorbancia. La presión del vacío aplicado impulsó eficazmente la solución hacia las cámaras internas, y la posterior centrifugación eliminó cualquier exceso de solución, lo que resultó en superficies de partículas limpias con la estructura restante de la tapa claramente distinguible [fig. 2C (b)]. Cabe destacar que el proceso de carga a 4 °C previene eficazmente la rápida evaporación del pequeño volumen interno (∼60 nl), preservando el contenido del fármaco para experimentos posteriores.

Tras la carga del fármaco, todos los microrobots se sellaron con éxito utilizando una capa de polímero sensible al pH. Esta medida garantizaría la retención de la carga en condiciones gástricas y la liberación controlada en los intestinos. Como se ilustra en la fig. 2D, el material de sellado, un copolímero de ácido metacrílico y acrilato de etilo que se utiliza habitualmente en el recubrimiento entérico para formas farmacéuticas sólidas orales, se modificó aún más con un 15 % en peso de polietilenglicol, con un peso molecular de 400, para mejorar la viscosidad y facilitar un sellado uniforme por inmersión. Para validar la respuesta al pH del sellado, se sumergieron láminas de vidrio recubiertas con el copolímero en un fluido gástrico simulado (SGF), que no mostró disolución visible después de 1 hora [fig. 2E (a) y (b)]. Sin embargo, cuando se transfirió a un fluido intestinal simulado (SIF), el recubrimiento del copolímero comenzó a disolverse después de 25 minutos y se disolvió casi por completo en 45 minutos, lo que confirmó una degradación eficaz activada por el pH en condiciones similares a las intestinales [fig. 2E (c)].

El sellado por inmersión de la serie de microrobots utilizando la capa de copolímero optimizada sobre una lámina de vidrio, seguido de un secado al aire, resultó en una capa de sellado fina y continua en estrecho contacto con las tapas superiores de los microrobots. Como se muestra en la fig. 2 (F y G), tanto la microscopía electrónica de barrido (SEM) como la microscopía óptica confirmaron que los poros y las protuberancias de la tapa estaban completamente cubiertos con el polímero sensible al pH, lo que garantiza una protección completa de la carga. Para evaluar la estabilidad del sellado, que es fundamental para preservar las dosis de fármaco encapsuladas durante el tránsito a través del estómago, se sumergieron los microrobots cargados y sellados en SGF a 37 °C. Después de 60 minutos, la capa de sellado permaneció intacta y no se observó ninguna fuga de la solución acuosa de RhB (RhB-H2O) (fig. 2H). En cambio, la inmersión en SIF desencadenó una liberación gradual de RhB-H2O de la cámara, con un marcado cambio de color de los microrobots de rojo oscuro a rojo claro en 45 minutos, lo que indica que la mayor parte de la carga se liberó [fig. 2I (a)]. Para evaluar aún más la robustez de la capa de sellado sensible al pH en condiciones gastrointestinales relevantes, ampliamos el estudio de liberación para incluir valores de pH intermedios (pH 3, 4, 5 y 6), además de SGF y SIF. Los microrobots sellados y cargados con RhB-H2O se incubaron en cada medio durante 1 hora, y la liberación de la carga se cuantificó midiendo la absorbancia de la solución circundante. Los microrobots sellados permanecieron estables, con una fuga prematura mínima, en SGF y en el rango de pH de 3 a 6. En cambio, se observó una liberación sustancialmente mayor en SIF después de 1 hora (fig. S2). En conjunto, estos resultados demuestran que la capa de sellado proporciona una protección eficaz en condiciones similares a las gástricas y en condiciones de pH intermedio, al tiempo que permite la liberación activada en condiciones similares a las intestinales.

A continuación, examinamos una solución de Pluronic F-127 (PF127) como una matriz de carga alternativa para modular la cinética de liberación, debido al cambio de fase que experimenta PF127 en respuesta a la temperatura. Como se muestra en la fig. 2I (b), los microrobots cargados con un 1,0 % en peso de RhB suspendido en solución de PF127 (RhB-PF127) a 4 °C y sellados utilizando el mismo proceso mostraron un perfil de liberación mucho más retrasado en comparación con los microrobots cargados con RhB-H2O. Los análisis visuales y cuantitativos revelaron que más del 80 % de la carga se liberó en 15 minutos para el grupo de microrobots cargados con RhB-H2O, mientras que el grupo cargado con RhB-PF127 liberó solo alrededor del 20 % de la carga en el mismo período de tiempo, lo que requirió 60 minutos para superar el 80 % de la liberación de la carga (fig. 2J). Estos resultados confirman que nuestro sistema de microrobots permite la liberación de carga activada por el pH, específica del entorno y con una cinética ajustable, lo que sugiere un gran potencial para la administración oral en todo el tracto gastrointestinal.

Diseño y caracterización de nanomédicamentos recubiertos con membrana de plaquetas para el direccionamiento en etapa 2

La interacción entre las plaquetas y las células tumorales en el microentorno del cáncer de colon es un factor crucial en la iniciación, la progresión y la metástasis del tumor (^[36]). Basándonos en este fenómeno biológico, preparamos nanopartículas (PNP) que exhiben una alta capacidad de direccionamiento contra el cáncer de colon. Para preparar nanopartículas biomiméticas recubiertas con membrana de plaquetas (PNP-DOX) cargadas con doxorrubicina (DOX), primero se prepararon derivados de membrana de plaquetas (PLT-Vs) aislando las plaquetas de la sangre total mediante centrifugación secuencial, seguida de ciclos de congelación-descongelación y sonicación. Estas PLT-Vs se recubrieron directamente sobre los núcleos de nanopartículas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas con DOX (BNP-DOX) mediante sonicación, lo que impartió las propiedades de la membrana de plaquetas a las nanopartículas (fig. 3A).

Se utilizaron varios métodos de caracterización de nanopartículas para evaluar el grado de recubrimiento de la membrana de plaquetas sobre las nanopartículas. Según los resultados de la dispersión de luz dinámica (DLS), el diámetro medio de las nanopartículas desnudas (BNP) fue de aproximadamente 137 ± 0,4 nm, lo que aumentó a 150 ± 4,6 nm después del recubrimiento con PLT-V, lo que indica un aumento de aproximadamente 13,5 nm, correspondiente al grosor de la fina capa de PLT-V. El potencial zeta también cambió de -20 ± 0,42 mV a -24 ± 0,55 mV, que es similar al potencial zeta de PLT-Vs medido en -29 ± 0,61 mV (fig. 3B). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron claramente que una membrana celular unilamelar envolvía los núcleos de BNP (fig. 3C). Además, utilizamos el análisis de Western blot para investigar la transferencia de proteínas de superficie derivadas de plaquetas a las PNP. En concreto, las proteínas de superficie relacionadas con las plaquetas (P-selectina) y las proteínas implicadas en la interacción tumoral (α6, β3 y P-selectina) se identificaron en todas las plaquetas, PLT-Vs y las nanopartículas recubiertas con membrana final (fig. 3D). La visualización de fluorescencia confocal verificó la integridad del recubrimiento de la membrana de plaquetas alrededor de las BNP después de la captación celular. Observamos la colocalización de BNP y PLT-Vs después de la captación celular, lo que indica una estructura núcleo-cáscara estable (fig. 3E). Basándonos en estudios previos, se seleccionó la DOX como fármaco modelo para evaluar nuestro sistema de administración dirigida en un modelo de cáncer de colon in vitro (^[37]). Después de desalar la DOX-hidrocloruro para obtener su estado hidrofóbico (^[38]), se prepararon BNP-DOX utilizando un método de emulsión simple, lo que logró una capacidad de carga de aproximadamente 33 ± 0,51 %. Después del recubrimiento con PLT-V, las PNP-DOX exhibieron una capacidad de carga de 32 ± 2,0 %. El perfil de liberación mostró patrones bifásicos similares para BNP y PNP, con un 64 % y un 66 %, respectivamente, del fármaco encapsulado liberado en 24 horas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C (fig. S3). Se confirmó la estabilidad del almacenamiento a largo plazo en agua desionizada y en medios de cultivo a 4 °C durante 7 días. Las PNP mantuvieron su tamaño en ambas condiciones, lo que indica una alta estabilidad coloidal (fig. S4).

A continuación, caracterizamos la liberación de PNP de los microrobots. La solución de PNP optimizada se cargó en los microrobots utilizando los procesos de carga al vacío y sellado por inmersión descritos anteriormente. Para los microrobots cargados con PNP (p-bots), el diámetro se amplió a 910 μm, con un volumen de cámara de 280 nl. Este ajuste de tamaño proporcionó un volumen de carga adecuado, minimizó la evaporación de la solución y redujo el riesgo de agregación de PNP. Como se muestra en la fig. 3F, los p-bots sumergidos en SGF durante 2 horas no mostraron cambios notables, lo que demostró tanto la estabilidad de las soluciones de PNP encapsuladas como la robustez de la estrategia de carga y sellado en diferentes tipos de carga. Posteriormente, investigamos el perfil de liberación en SIF. Como se muestra en la fig. 3G, se formó un rastro de liberación rosa alrededor de la tapa del p-bot en los primeros 15 minutos, lo que indica el inicio de la liberación. Con el tiempo, la intensidad del color en el interior de la cámara disminuyó gradualmente, lo que es consistente con un perfil de liberación dependiente del tiempo. El comportamiento de la liberación se controló cuantitativamente midiendo la absorbancia de la solución de PNP de RhB liberada. Como se ilustra en la fig. 3H, aproximadamente el 25 % de las PNP encapsuladas se liberaron en 15 minutos, en comparación con el 20 % de liberación observado en los microrobots cargados con RhB-PF127. La liberación continuó con el tiempo, alcanzando más del 80 % en 105 minutos, lo que indica un perfil de liberación dependiente del tiempo y controlado del sistema de microrobots.

Por último, analizamos el tamaño y el índice de polidispersidad (PDI) de las nanopartículas antes y después de la carga en los microrobots. Los resultados mostraron que ni las BNP ni las PNP aumentaron de tamaño después de la carga en los microrobots, lo que sugiere que no se produjo ninguna agregación dentro de los microrobots. Aunque el PDI de BNP y PNP mostró un ligero aumento de 0,11 a 0,21 y de 0,10 a 0,22, respectivamente, los valores en ambos casos seguían reflejando una distribución monodispersa (fig. 3I).

Validación in vitro en un modelo microfluídico de cáncer de colon y evaluación ex vivo de la locomoción de los microrobots

Evaluamos la capacidad del sistema para dirigirse y matar las células cancerosas de colon en ensayos celulares bidimensionales (2D) y en una plataforma microfluídica avanzada que imita el colon. En primer lugar, para fabricar la plataforma microfluídica, ensamblamos un sustrato de PDMS con una estructura superficial similar a las vellosidades intestinales que presenta crestas de 150 μm de altura a lo largo de un microcanal que contiene un camino sinuoso y un sitio de destino (fig. 4A). Se cultivaron células epiteliales normales del colon (HCOEPC) en el sustrato y, a continuación, se colocó un esferoide de cáncer de colon HCT116 en el sitio de destino. La imagen de fluorescencia en 3D en la dirección Z mostró que las HCOEPC se cultivaron uniformemente en las estructuras de la superficie del sustrato [fig. 4A (a)]. El esferoide HCT116 se colocó en la capa de HCOEPC en el sitio de destino [fig. 4A (b)]. Confirmamos que los p-bots podían navegar por el camino sinuoso (fig. 4B y vídeo S1) bajo control de un campo magnético externo (MFG-100-i, Magnebotix) y llegar al esferoide de cáncer de colon (fig. 4C). Para simular el lavado del fármaco por el flujo luminal, se introdujeron nanopartículas o p-bots bajo presión hidrostática durante 30 minutos, seguido de pasos de lavado para eliminar las nanopartículas o los p-bots no unidos, y se realizó un paso de lavado adicional 12 horas después.

Comparamos la capacidad de direccionamiento de los BNPs y los PNPs hacia diversas células del colon en ensayos celulares 2D. Los PNPs y los BNPs mostraron una afinidad de unión comparable para las células epiteliales normales del colon. Por el contrario, en comparación con los BNPs, los PNPs mostraron una unión 3,1 y 2,4 veces mayor a las líneas celulares de cáncer de colon SW480 y HCT116, respectivamente, lo que confirma la capacidad de direccionamiento hacia el cáncer de colon de las membranas de las plaquetas (Fig. 4D). Además, el bloqueo de la P-selectina en los PNPs con un anticuerpo anti-P-selectina redujo la unión a las células HCT116 en aproximadamente un 63,3%, mientras que las nanopartículas recubiertas con membrana de glóbulos rojos mostraron niveles de unión comparables a los de los BNPs (fig. S5). Estos resultados confirman que las proteínas de la superficie de la membrana de las plaquetas, en particular la P-selectina, contribuyen al direccionamiento tumoral mediado por la membrana de las plaquetas.

Luego, evaluamos la capacidad de direccionamiento de la nanomedicina en una plataforma microfluídica que imita el colon, utilizando varias configuraciones: BNPs, PNPs, un microrobot cargado con PNPs y dos microrobots cargados con PNPs. Cuando se administraron 0,84 μg de nanopartículas en la plataforma microfluídica, la cantidad fue equivalente a la carga total de nanopartículas liberadas de dos microrobots (volumen del reservorio del microrobot = 280 nl; concentración de la solución de nanopartículas = 1,5 mg/ml). La diferencia en la intensidad media de fluorescencia en el sitio del esferoide entre los BNPs y los PNPs no fue estadísticamente significativa. Sin embargo, la administración de PNPs a través de dos microrobots resultó en una señal 3,4 veces mayor en comparación con la administración de PNPs solos, e incluso con un solo microrobot, se observó una señal 1,9 veces mayor (Fig. 4, E y F). En consonancia con estas observaciones, la cuantificación normalizada por dosis de la carga de nanopartículas retenida confirmó aún más la mayor eficiencia de administración del sistema de microrobots. A pesar de recibir la misma dosis administrada (0,84 μg), el grupo de 2 p-bots logró aproximadamente 4,57 veces más retención de nanopartículas dentro de los esferoides en comparación con los PNPs administrados solos, lo que corresponde a un aumento en la eficiencia de retención de aproximadamente 8,75% para la administración basada en nanopartículas a aproximadamente 37,41% para la administración basada en robots (fig. S6). Estos resultados indican que el uso de p-bots para administrar PNPs mejora sustancialmente la eficiencia de retención en los esferoides de cáncer de colon al mitigar el lavado en entornos con estructuras complejas y en condiciones de flujo.

Luego, evaluamos los efectos citotóxicos de los diferentes métodos de administración de nanopartículas contra las líneas celulares de cáncer de colon después de un tratamiento de 24 horas. En condiciones de incubación estática, el análisis del kit de conteo celular-8 (CCK-8) mostró que los PNP-DOXs exhibieron valores de concentración inhibitoria media (IC50) de 4,9 ± 0,52, 1,4 ± 0,24 y 2,0 ± 0,34 μg/ml para las células HCOEPC, SW480 y HCT116, respectivamente. En comparación con los BNP-DOXs, los valores de IC50 para los PNP-DOXs fueron modestamente más bajos en las líneas celulares de cáncer de colon SW480 y HCT116 (fig. S7). Sin embargo, la incubación estática, en la que las células están continuamente expuestas a las nanopartículas administradas durante todo el período de tratamiento, no captura la selectividad del cáncer y los efectos de lavado presentes en los entornos fisiológicos. Para imitar mejor estas condiciones, realizamos un ensayo adicional que incorporó un paso de lavado después de una fase de direccionamiento de 30 minutos. En estas condiciones, los valores de IC50 de los PNP-DOXs para todos los tipos de células fueron consistentemente más altos en todos los tipos de células probados en comparación con los obtenidos en la incubación estática. Los valores de IC50 de los PNP-DOXs para las células de cáncer de colon (SW480: 7,22 ± 5,01 μg/ml, HCT116: 8,64 ± 2,87 μg/ml) fueron significativamente más bajos que los de las células epiteliales normales (HCOEPC: 24,5 ± 1,35 μg/ml), lo que indica una mayor selectividad del cáncer mediada por el direccionamiento basado en la membrana de las plaquetas (Fig. 4G y fig. S8). Estas observaciones sugieren que el recubrimiento de la membrana de las plaquetas promueve una adhesión estable a las células cancerosas a través de interacciones específicas mediadas por receptores (^[17]), mejorando así la citotoxicidad selectiva en condiciones fisiológicamente relevantes.

Siguiendo las mismas condiciones de administración de fármacos, se evaluó la citotoxicidad dentro de la plataforma microfluídica que imita el colon, que comprende epitelio normal del colon y esferoides cancerosos dispuestos en estructuras complejas que dificultan la administración de nanopartículas, utilizando una tinción combinada con Calcein AM y etidio homodímero-1. La figura 4 (H e I) ilustra que la administración de PNP-DOX utilizando uno o dos microrobots, en comparación con los PNP-DOXs solos, mejora la citotoxicidad contra las células de cáncer de colon en 3,1 y 4,3 veces, respectivamente. Cabe destacar que los BNP-DOXs y los PNP-DOXs administrados sin microrobots exhibieron 2,0 y 1,5 veces más citotoxicidad hacia el epitelio normal del colon, respectivamente, en comparación con los PNP-DOXs administrados a través de dos microrobots. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (fig. S9). Estos resultados son consistentes con las expectativas, porque la extensión de la exposición al epitelio normal del colon cuando se administran BNP-DOXs y PNP-DOXs solos es mayor que cuando los PNPs se liberan a través de microrobots. Nuestra plataforma que imita el colon tiene varias limitaciones, incluida la falta de peristalsis y una capa mucosa. Sin embargo, estos resultados demuestran una prueba de concepto alentadora para sistemas de múltiples etapas que combinan la administración directa de nanopartículas a través de microrobots y el direccionamiento eficiente por parte de los PNPs para reducir los efectos secundarios fuera del objetivo y mejorar la citotoxicidad específica.

Para extender esta prueba de concepto más allá de la plataforma microfluídica y examinar aún más la viabilidad del diseño propuesto en condiciones más fisiológicamente relevantes y a mayor escala, examinamos a continuación el ensamblaje de la cadena de microrobots y la locomoción ex vivo en tejidos gastrointestinales. Con una orientación de magnetización consistente, cada microrobot se comporta como un imán permanente en miniatura con una polaridad magnética definida, lo que permite un ensamblaje sencillo de la cadena a través de interacciones dipolo-dipolo magnéticas [Fig. 4J (a)]. Esta configuración de cadena admite la locomoción de "caminata" en la superficie bajo control magnético. Específicamente, el campo magnético rotatorio aplicado [Fig. 4J (b)] rota alrededor de un eje prescrito que se encuentra en el plano. El ángulo en el plano determina la dirección de la traslación del microrobot. Demostramos además una locomoción robusta en tejidos de intestino y estómago porcinos ex vivo (videos S2 y S3), lo que proporciona evidencia de que el diseño propuesto del microrobot sigue siendo funcional en entornos gastrointestinales más fisiológicamente relevantes. La cadena ensamblada mantuvo una caminata estable en superficies de tejidos flexibles, irregulares y plegadas, en lugar de solo en sustratos planos idealizados. En particular, la cadena de microrobots pudo atravesar superficies de estómago plegadas al tiempo que mantenía una locomoción controlada en el tejido intestinal (Fig. 4K), lo que destaca la adaptabilidad del diseño a la topografía compleja del tracto gastrointestinal. Para evaluar aún más la discrepancia de escala entre el modelo de laboratorio y la implementación in vivo práctica, realizamos simulaciones magnetostáticas de una configuración de imanes permanentes. El perfil de campo-distancia correspondiente (fig. S10) muestra que la densidad de flujo magnético se mantiene en el nivel de 10 mT durante más de 400 mm, lo que está por encima del punto de referencia de actuación validado experimentalmente utilizado en este estudio (5 mT a 1 Hz). Estos resultados respaldan la viabilidad de generar campos magnéticos suficientes para la actuación del microrobot a distancias de separación macroscópicas relevantes para la implementación práctica.

Diseño y fabricación de microrobots magnéticos y sensibles al pH para la administración dirigida de fármacos en múltiples etapas

La administración oral es una vía no invasiva, fácil de usar y que facilita el cumplimiento del paciente, con un gran potencial para el tratamiento del cáncer de colon, ya que permite un tratamiento localizado directamente dentro del tracto gastrointestinal (^[31]). Sin embargo, lograr una acumulación de fármacos específica del sitio a través de la administración oral sigue siendo un desafío debido a la complejidad anatómica del tracto gastrointestinal y su entorno dinámico. Para abordar estos desafíos, desarrollamos un sistema de múltiples etapas que presenta una combinación única de PNPs de direccionamiento de células cancerosas encapsulados en un portador de microrobots sensible al pH.

La figura 1A resume el proceso de fabricación de microrobots magnéticos para la administración dirigida de fármacos en múltiples etapas. Primero, se imprimen microrobots rellenable utilizando polimerización de dos fotones (2PP), y se preparan nanopartículas biomiméticas. Los fármacos se introducen en la cámara del microrobot mediante carga al vacío. Una vez completamente cargados y limpiados, los microrobots se sellan inmediatamente con un material sensible al pH, compuesto por un copolímero de ácido metacrílico y acrilato de etilo, utilizando recubrimiento por inmersión para minimizar la evaporación de la solución. Validamos la plataforma utilizando un modelo microfluídico que imita el colon in vitro. El direccionamiento preciso se logra aprovechando las características micro y nano del sistema. En la etapa 1, la navegación del microrobot se controla mediante un campo magnético tridimensional (3D) aplicado externamente, lo que permite un movimiento preciso a través de un canal microfluídico que imita el tracto gastrointestinal. El microrobot se puede dirigir hacia un sitio objetivo que alberga un esferoide de cáncer de colon. El cambio de pH local en el sitio objetivo desencadena la degradación de la capa de sellado, liberando la solución de nanopartículas. La segunda etapa de direccionamiento se logra a través de la acción de los PNPs, que exhiben una alta afinidad por las células de cáncer de colon, mejorando así la administración terapéutica.

Como se ilustra en la figura 1B, imaginamos aplicar este sistema de microrobots magnéticos para la administración oral de nanomedicamentos para el cáncer de colon. Su sellado sensible al pH protegería eficazmente el fármaco del entorno ácido durante su tránsito a través del tracto gastrointestinal. A diferencia de los sistemas informados previamente que se basan en mecanismos de liberación activados por calor o luz (^[32], ^[33]), que requieren unidades de control externas y enfrentan problemas como la mala penetración en los tejidos, nuestro sistema aprovecha el gradiente de pH natural del tracto gastrointestinal. Los microrobots permanecerían estables y liberarían selectivamente la carga al encontrar el entorno intestinal.

Diseño y caracterización de microrobots para el direccionamiento de la etapa 1

La primera etapa de direccionamiento combina la localización magnética del microrobot con la liberación activada por el pH de la carga de nanopartículas. Diseñamos el microrobot rellenable con una forma esférica para permitir un movimiento multimodal, que incluye rodadura, giro y bamboleo (^[32]). Se seleccionó un diámetro de 550 μm como un compromiso práctico entre la capacidad de carga interna, la fidelidad de la fabricación, la fiabilidad del sellado y la eficiencia de la fabricación. Este tamaño proporciona suficiente espacio interno para la carga de carga y la formación de la capa magnética interna, al tiempo que es compatible con la fabricación de alta resolución de la matriz de poros de 40 μm utilizada para la carga al vacío y la matriz de protrusiones de 5 μm para un sellado preciso (Fig. 2A). Estos microrobots se fabricaron utilizando la impresión 3D de alta resolución basada en 2PP con resina biocompatible IP-Q, que proporciona la precisión a nivel submicrométrico necesaria para imprimir características micro a escala complejas. Se ha informado que IP-Q es biocompatible después del postprocesamiento estándar y se ha utilizado en dispositivos y plataformas microestructuradas impresas en 2PP para estudios basados en células, incluido el cocultivo a largo plazo con esferoides celulares 3D (^[34], ^[35]). En la impresión 3D, la estructura se divide en capas y se imprime secuencialmente; la optimización de la eficiencia de la impresión requiere equilibrar el grosor de la capa y la resolución. Las capas más gruesas reducen el número total de capas y el tiempo de impresión, pero pueden comprometer la resolución estructural. Evaluamos el efecto de los grosores de capa de 3,5, 2,5 y 1,5 μm en los resultados de la impresión mediante imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM), que revelaron que solo el grosor de capa de 1,5 μm reprodujo con éxito todas las características del microrobot, incluida la tapa superior, mientras que los ajustes más gruesos no lograron imprimir la tapa superior (Fig. 2B).

Imprimimos con éxito una serie de microrobots y establecimos un proceso optimizado de limpieza y postcurado, lo que resultó en una cámara interna limpia, como lo confirman las características microestructurales claras (fig. S1). Después de la impresión y el postprocesamiento, los microrobots se someten a un procedimiento de magnetización que permite el llenado de la cámara. En resumen, se carga una suspensión de micropartículas de neodimio, hierro y boro (NdFeB) en la cámara interna mediante centrifugación, lo que permite que las partículas sedimenten y formen una capa magnética estable en el fondo de la cámara después del secado del disolvente. Esta capa magnética se aísla posteriormente de la carga del fármaco mediante una fina capa de barrera de polidimetilsiloxano (PDMS), y los microrobots se postmagnetizan utilizando un magnetizador de impulsos para definir una orientación magnética consistente en toda la serie. Tras la magnetización, la carga se introduce al vacío a través de los poros de la tapa, lo que permite una carga uniforme en toda la serie impresa [fig. 2C (a)]. Se utiliza una solución acuosa de rodamina B (RhB) como fármaco modelo de molécula pequeña debido a su fuerte absorbancia. La presión del vacío aplicado impulsó eficazmente la solución hacia las cámaras internas, y la posterior centrifugación eliminó cualquier exceso de solución, lo que resultó en superficies de partículas limpias con la estructura restante de la tapa claramente distinguible [fig. 2C (b)]. Cabe destacar que el proceso de carga a 4 °C previene eficazmente la rápida evaporación del pequeño volumen interno (∼60 nl), preservando el contenido del fármaco para experimentos posteriores.

Tras la carga del fármaco, todos los microrobots se sellaron con éxito utilizando una capa de polímero sensible al pH. Esta medida garantizaría la retención de la carga en condiciones gástricas y la liberación controlada en los intestinos. Como se ilustra en la fig. 2D, el material de sellado, un copolímero de ácido metacrílico y acrilato de etilo que se utiliza habitualmente en el recubrimiento entérico para formas farmacéuticas sólidas orales, se modificó aún más con un 15 % en peso de polietilenglicol, con un peso molecular de 400, para mejorar la viscosidad y facilitar un sellado uniforme por inmersión. Para validar la respuesta al pH del sellado, las láminas de vidrio recubiertas con copolímero se sumergieron en un fluido gástrico simulado (SGF), que no mostró disolución visible después de 1 hora [fig. 2E (a) y (b)]. Sin embargo, cuando se transfirió a un fluido intestinal simulado (SIF), el recubrimiento de copolímero comenzó a disolverse después de 25 minutos y se disolvió casi por completo en 45 minutos, lo que confirmó una degradación eficaz activada por el pH en condiciones similares a las intestinales [fig. 2E (c)].

El sellado por inmersión de la serie de microrobots utilizando la capa de copolímero optimizada sobre una lámina de vidrio, seguido de un secado al aire, resultó en una capa de sellado fina y continua en estrecho contacto con las tapas superiores de los microrobots. Como se muestra en la fig. 2 (F y G), tanto la microscopía electrónica de barrido (SEM) como la microscopía óptica confirmaron que los poros y las protuberancias de la tapa estaban completamente cubiertos por el polímero sensible al pH, lo que garantiza una protección completa de la carga. Para evaluar la estabilidad del sellado, que es fundamental para preservar las dosis de fármaco encapsuladas durante el tránsito a través del estómago, los microrobots cargados y sellados se sumergieron en SGF a 37 °C. Después de 60 minutos, la capa de sellado permaneció intacta y no se observó ninguna fuga de la solución acuosa de RhB (RhB-H2O) (fig. 2H). En cambio, la inmersión en SIF desencadenó una liberación gradual de RhB-H2O de la cámara, con un marcado cambio de color de los microrobots de rojo oscuro a rojo claro en 45 minutos, lo que indica que la mayor parte de la carga se liberó [fig. 2I (a)]. Para evaluar aún más la robustez de la capa de sellado sensible al pH en condiciones gastrointestinales relevantes, ampliamos el estudio de liberación para incluir valores de pH intermedios (pH 3, 4, 5 y 6), además de SGF y SIF. Los microrobots sellados y cargados con RhB-H2O se incubaron en cada medio durante 1 hora, y la liberación de la carga se cuantificó midiendo la absorbancia de la solución circundante. Los microrobots sellados permanecieron estables, con una fuga prematura mínima, en SGF y en el rango de pH de 3 a 6. En cambio, se observó una liberación sustancialmente mayor en SIF después de 1 hora (fig. S2). En conjunto, estos resultados demuestran que la capa de sellado proporciona una protección eficaz en condiciones similares a las gástricas y en condiciones de pH intermedio, al tiempo que permite la liberación activada en condiciones similares a las intestinales.

A continuación, examinamos una solución de Pluronic F-127 (PF127) como matriz de carga alternativa para modular la cinética de liberación, debido al cambio de fase que experimenta PF127 en respuesta a la temperatura. Como se muestra en la fig. 2I (b), los microrobots cargados con un 1,0 % en peso de RhB suspendido en solución de PF127 (RhB-PF127) a 4 °C y sellados utilizando el mismo proceso mostraron un perfil de liberación mucho más retrasado en comparación con los microrobots cargados con RhB-H2O. Los análisis visuales y cuantitativos revelaron que más del 80 % de la carga se liberó en 15 minutos para el grupo de microrobots cargados con RhB-H2O, mientras que el grupo cargado con RhB-PF127 liberó solo alrededor del 20 % de la carga en el mismo período de tiempo, lo que requirió 60 minutos para superar el 80 % de la liberación de la carga (fig. 2J). Estos resultados confirman que nuestro sistema de microrobots permite la liberación de carga activada por el pH, específica del entorno y con una cinética ajustable, lo que sugiere un gran potencial para la administración oral en todo el tracto gastrointestinal.

Diseño y caracterización de nanomédicamentos recubiertos con membrana de plaquetas para el direccionamiento en etapa 2

La interacción entre las plaquetas y las células tumorales en el microentorno del cáncer de colon es un factor crucial en la iniciación, la progresión y la metástasis del tumor (^[36]). Basándonos en este fenómeno biológico, preparamos nanopartículas (PNP) que exhiben una alta capacidad de direccionamiento contra el cáncer de colon. Para preparar nanopartículas biomiméticas recubiertas con membrana de plaquetas (PNP-DOX) cargadas con doxorrubicina (DOX), primero se prepararon derivados de membrana de plaquetas (PLT-Vs) aislando las plaquetas de la sangre total mediante centrifugación secuencial, seguida de ciclos de congelación-descongelación y sonicación. A continuación, estos PLT-Vs se recubrieron directamente sobre los núcleos de nanopartículas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas con DOX (BNP-DOX) mediante sonicación, lo que impartió las propiedades de la membrana de plaquetas a las nanopartículas (fig. 3A).

Se utilizaron varios métodos de caracterización de nanopartículas para evaluar el grado de recubrimiento de la membrana de plaquetas sobre las nanopartículas. Según los resultados de la dispersión de luz dinámica (DLS), el diámetro medio de las nanopartículas desnudas (BNP) era de aproximadamente 137 ± 0,4 nm, lo que aumentó a 150 ± 4,6 nm después del recubrimiento con PLT-V, lo que indica un aumento de aproximadamente 13,5 nm, correspondiente al grosor de la fina capa de PLT-V. El potencial zeta también cambió de -20 ± 0,42 mV a -24 ± 0,55 mV, que es similar al potencial zeta de PLT-Vs medido en -29 ± 0,61 mV (fig. 3B). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron claramente que una membrana celular unilamelar envolvía los núcleos de BNP (fig. 3C). Además, utilizamos el análisis de Western blot para investigar la transferencia de proteínas de superficie derivadas de plaquetas a las PNP. En concreto, las proteínas de superficie relacionadas con las plaquetas (P-selectina) y las proteínas implicadas en la interacción tumoral (α6, β3 y P-selectina) se identificaron en todas las plaquetas, los PLT-Vs y las nanopartículas recubiertas con membrana finales (fig. 3D). La visualización de fluorescencia confocal verificó la integridad del recubrimiento de la membrana de plaquetas alrededor de las BNP después de la captación celular. Observamos la colocalización de BNP y PLT-Vs después de la captación celular, lo que indica una estructura núcleo-cáscara estable (fig. 3E). Basándonos en estudios anteriores, se seleccionó la DOX como fármaco modelo para evaluar nuestro sistema de administración dirigida en un modelo de cáncer de colon in vitro (^[37]). Después de desalar el clorhidrato de DOX para obtener su estado hidrofóbico (^[38]), se prepararon BNP-DOX utilizando un método de emulsión simple, lo que logró una capacidad de carga de aproximadamente 33 ± 0,51 %. Después del recubrimiento con PLT-V, las PNP-DOX exhibieron una capacidad de carga de 32 ± 2,0 %. El perfil de liberación mostró patrones bifásicos similares para BNP y PNP, con un 64 % y un 66 %, respectivamente, del fármaco encapsulado liberado en 24 horas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C (fig. S3). Se confirmó la estabilidad del almacenamiento a largo plazo en agua desionizada y en medios de cultivo a 4 °C durante 7 días. Las PNP mantuvieron su tamaño en ambas condiciones, lo que indica una alta estabilidad coloidal (fig. S4).

A continuación, caracterizamos la liberación de PNP de los microrobots. La solución de PNP optimizada se cargó en los microrobots utilizando los procesos de carga al vacío y sellado por inmersión descritos anteriormente. Para los microrobots cargados con PNP (p-bots), el diámetro se amplió a 910 μm, con un volumen de cámara de 280 nl. Este ajuste de tamaño proporcionó un volumen de carga adecuado, minimizó la evaporación de la solución y redujo el riesgo de agregación de PNP. Como se muestra en la fig. 3F, los p-bots sumergidos en SGF durante 2 horas no mostraron cambios notables, lo que demuestra tanto la estabilidad de las soluciones de PNP encapsuladas como la robustez de la estrategia de carga y sellado en diferentes tipos de carga. Posteriormente, investigamos el perfil de liberación en SIF. Como se muestra en la fig. 3G, se formó un rastro de liberación rosa alrededor de la tapa del p-bot en los primeros 15 minutos, lo que indica el inicio de la liberación. Con el tiempo, la intensidad del color en el interior de la cámara disminuyó gradualmente, lo que es consistente con un perfil de liberación progresivo y dependiente del tiempo. El comportamiento de la liberación se controló cuantitativamente midiendo la absorbancia de la solución de PNP etiquetada con RhB liberada. Como se ilustra en la fig. 3H, aproximadamente el 25 % de las PNP encapsuladas se liberaron en 15 minutos, en comparación con el 20 % de liberación observado en los microrobots cargados con RhB-PF127. La liberación continuó con el tiempo, alcanzando más del 80 % en 105 minutos, lo que indica un perfil de liberación controlado y dependiente del tiempo del sistema de microrobots.

Por último, analizamos el tamaño y el índice de polidispersidad (PDI) de las nanopartículas antes y después de la carga en los microrobots. Los resultados mostraron que ni las BNP ni las PNP aumentaron de tamaño después de la carga en los microrobots, lo que sugiere que no se produjo ninguna agregación en el interior de los microrobots. Aunque el PDI de las BNP y las PNP mostró un ligero aumento de 0,11 a 0,21 y de 0,10 a 0,22, respectivamente, los valores en ambos casos seguían reflejando una distribución monodispersa (fig. 3I).

Validación in vitro en un modelo microfluídico de cáncer de colon y evaluación ex vivo de la locomoción de los microrobots

Evaluamos la capacidad del sistema para dirigirse y matar las células cancerosas de colon en ensayos celulares bidimensionales (2D) y en una plataforma microfluídica avanzada que imita el colon. En primer lugar, para fabricar la plataforma microfluídica, ensamblamos un sustrato de PDMS con una estructura similar a las vellosidades intestinales que presenta crestas de 150 μm de altura a lo largo de un microcanal que contiene un camino sinuoso y un sitio de destino (fig. 4A). Las células epiteliales normales del colon (HCOEPC) se cultivaron en el sustrato y, a continuación, se colocó un esferoide de cáncer de colon HCT116 en el sitio de destino. La imagen de fluorescencia en 3D en la dirección Z mostró que las HCOEPC se cultivaron uniformemente en las estructuras de la superficie del sustrato [fig. 4A (a)]. El esferoide HCT116 se colocó en la capa de HCOEPC en el sitio de destino [fig. 4A (b)]. Confirmamos que los p-bots podían navegar por el camino sinuoso (fig. 4B y película S1) bajo control de un campo magnético externo (MFG-100-i, Magnebotix) y llegar al esferoide de cáncer de colon (fig. 4C). Para simular el lavado del fármaco por el flujo luminal, se introdujeron nanopartículas o p-bots bajo presión hidrostática durante 30 minutos, seguido de pasos de lavado para eliminar las nanopartículas o los p-bots no unidos, con un paso de lavado adicional realizado 12 horas después.

Comparamos la capacidad de direccionamiento de los BNPs y los PNPs hacia diversas células del colon en ensayos celulares 2D. Los PNPs y los BNPs mostraron una afinidad de unión comparable para las células epiteliales normales del colon. Por el contrario, en comparación con los BNPs, los PNPs mostraron una unión 3,1 y 2,4 veces mayor a las líneas celulares de cáncer de colon SW480 y HCT116, respectivamente, lo que confirma la capacidad de direccionamiento hacia el cáncer de colon de las membranas plaquetarias (fig. 4D). Además, el bloqueo de la P-selectina en los PNPs con un anticuerpo anti-P-selectina redujo la unión a las células HCT116 en aproximadamente un 63,3%, mientras que las nanopartículas recubiertas con membrana de glóbulos rojos mostraron niveles de unión comparables a los de los BNPs (fig. S5). Estos resultados confirman que las proteínas de superficie de la membrana plaquetaria, en particular la P-selectina, contribuyen al direccionamiento tumoral mediado por la membrana plaquetaria.

A continuación, evaluamos la capacidad de direccionamiento de la nanomedicina en una plataforma microfluídica que simula el colon, utilizando diversas configuraciones: BNPs, PNPs, un microrobot cargado con PNPs y dos microrobots cargados con PNPs. Cuando se administraron 0,84 μg de nanopartículas en la plataforma microfluídica, la cantidad fue equivalente a la carga total de nanopartículas liberadas de dos microrobots (volumen del reservorio del microrobot = 280 nl; concentración de la solución de nanopartículas = 1,5 mg/ml). La diferencia en la intensidad media de fluorescencia en el sitio del esferoide entre los BNPs y los PNPs no fue estadísticamente significativa. Sin embargo, la administración de PNPs a través de dos microrobots produjo una señal 3,4 veces mayor en comparación con la administración de PNPs solos, e incluso con un solo microrobot, se observó una señal 1,9 veces mayor (fig. 4, E y F). En consonancia con estas observaciones, la cuantificación normalizada por dosis de la carga de nanopartículas retenida confirmó aún más la mayor eficiencia de administración del sistema de microrobots. A pesar de recibir la misma dosis administrada (0,84 μg), el grupo de 2 p-bots logró aproximadamente 4,57 veces más retención de nanopartículas dentro de los esferoides en comparación con los PNPs administrados solos, lo que corresponde a un aumento en la eficiencia de retención de aproximadamente 8,75% para la administración basada en nanopartículas a aproximadamente 37,41% para la administración basada en robots (fig. S6). Estos resultados indican que el uso de p-bots para administrar PNPs mejora sustancialmente la eficiencia de retención en los esferoides de cáncer de colon al mitigar el lavado en entornos con estructuras complejas y bajo condiciones de flujo.

A continuación, evaluamos los efectos citotóxicos de los diferentes métodos de administración de nanopartículas contra las líneas celulares de cáncer de colon después de un tratamiento de 24 horas. En condiciones de incubación estática, el análisis del kit de conteo celular-8 (CCK-8) mostró que los PNP-DOXs exhibieron valores de concentración inhibitoria media (IC50) de 4,9 ± 0,52, 1,4 ± 0,24 y 2,0 ± 0,34 μg/ml para las células HCOEPC, SW480 y HCT116, respectivamente. En comparación con los BNP-DOXs, los valores de IC50 para los PNP-DOXs fueron ligeramente más bajos en las líneas celulares de cáncer de colon SW480 y HCT116 (fig. S7). Sin embargo, la incubación estática, en la que las células están continuamente expuestas a las nanopartículas administradas durante todo el período de tratamiento, no captura la selectividad del cáncer y los efectos de lavado presentes en los entornos fisiológicos. Para simular mejor estas condiciones, realizamos un ensayo adicional que incorporó un paso de lavado después de una fase de direccionamiento de 30 minutos. En estas condiciones, los valores de IC50 de los PNP-DOXs para todos los tipos de células fueron consistentemente más altos en todos los tipos de células probados en comparación con los obtenidos en la incubación estática. Los valores de IC50 de los PNP-DOXs para las células de cáncer de colon (SW480: 7,22 ± 5,01 μg/ml, HCT116: 8,64 ± 2,87 μg/ml) fueron significativamente más bajos que los de las células epiteliales normales (HCOEPC: 24,5 ± 1,35 μg/ml), lo que indica una mayor selectividad del cáncer mediada por el direccionamiento basado en la membrana plaquetaria (fig. 4G y fig. S8). Estas observaciones sugieren que el recubrimiento de la membrana plaquetaria promueve una adhesión estable a las células cancerosas a través de interacciones específicas mediadas por receptores (^[17]), mejorando así la citotoxicidad selectiva en condiciones fisiológicamente relevantes.

Siguiendo las mismas condiciones de administración de fármacos, se evaluó la citotoxicidad dentro de la plataforma microfluídica que simula el colon, que comprende epitelio normal del colon y esferoides cancerosos dispuestos en estructuras complejas que dificultan la administración de nanopartículas, utilizando una tinción combinada con Calcein AM y etidio homodímero-1. La figura 4 (H e I) ilustra que la administración de PNP-DOX utilizando uno o dos microrobots, en comparación con los PNP-DOXs solos, mejora la citotoxicidad contra las células de cáncer de colon en 3,1 y 4,3 veces, respectivamente. Cabe destacar que los BNP-DOXs y los PNP-DOXs administrados sin microrobots exhibieron 2,0 y 1,5 veces más citotoxicidad hacia el epitelio normal del colon, respectivamente, en comparación con los PNP-DOXs administrados a través de dos microrobots. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (fig. S9). Estos resultados son consistentes con las expectativas, porque la extensión de la exposición al epitelio normal del colon cuando los BNP-DOXs y los PNP-DOXs se administran solos es mayor que cuando los PNPs se liberan a través de microrobots. Nuestra plataforma que simula el colon tiene varias limitaciones, incluida la falta de peristalsis y una capa mucosa. Sin embargo, estos resultados demuestran una prueba de concepto alentadora para sistemas multietapa que combinan la administración directa de nanopartículas a través de microrobots y el direccionamiento eficiente por parte de los PNPs para reducir los efectos secundarios fuera del objetivo y mejorar la citotoxicidad específica.

Para extender esta prueba de concepto más allá de la plataforma microfluídica y examinar aún más la viabilidad del diseño propuesto en condiciones más fisiológicamente relevantes y a mayor escala, a continuación, examinamos el ensamblaje de la cadena de microrobots y la locomoción ex vivo en tejidos gastrointestinales. Con una orientación de magnetización consistente, cada microrobot se comporta como un imán permanente en miniatura con una polaridad magnética definida, lo que permite un ensamblaje sencillo de la cadena a través de interacciones dipolo-dipolo magnéticas [fig. 4J (a)]. Esta configuración de cadena admite la locomoción de "caminata" en la superficie bajo control magnético. Específicamente, el campo magnético rotatorio aplicado [fig. 4J (b)] rota alrededor de un eje prescrito que se encuentra en el plano. El ángulo en el plano determina la dirección de la traslación del microrobot. Demostramos además una locomoción robusta en tejidos de intestino y estómago porcinos ex vivo (videos S2 y S3), lo que proporciona evidencia de que el diseño propuesto del microrobot sigue siendo funcional en entornos gastrointestinales más fisiológicamente relevantes. La cadena ensamblada mantuvo una caminata estable en superficies de tejido flexibles, irregulares y plegadas, en lugar de solo en sustratos planos idealizados. En particular, la cadena de microrobots pudo atravesar superficies de estómago plegadas al tiempo que mantenía una locomoción controlada en el tejido intestinal (fig. 4K), lo que destaca la adaptabilidad del diseño a la topografía compleja del tracto gastrointestinal. Para evaluar aún más la discrepancia de escala entre el modelo de laboratorio y el despliegue in vivo práctico, realizamos simulaciones magnetostáticas de una configuración de imanes permanentes. El perfil de campo-distancia correspondiente (fig. S10) muestra que la densidad de flujo magnético se mantiene en el nivel de 10 mT durante más de 400 mm, lo que está por encima del punto de referencia de actuación validado experimentalmente utilizado en este estudio (5 mT a 1 Hz). Estos resultados respaldan la viabilidad de generar campos magnéticos suficientes para la actuación del microrobot a distancias de separación macroscópicas relevantes para el despliegue práctico.

DISCUSIÓN

La innovación clave de nuestro sistema radica en la integración de las capacidades de direccionamiento a través de diferentes escalas. La configuración de nuestro sistema multiescala aborda una brecha crítica en la administración de fármacos jerárquica: los microrobots proporcionan la navegación a escala de órgano, mientras que los PNPs confieren la capacidad de direccionamiento celular. Además, el mecanismo de liberación activado por el pH respondió a los cambios ambientales, como los presentes en el tracto gastrointestinal. Nuestro enfoque elimina la necesidad de disparadores externos térmicos u ópticos, que están limitados por la penetración in vivo limitada. Este trabajo también introduce una estrategia de magnetización habilitada por una cámara rellenable como un avance metodológico adicional. Esta estrategia proporciona una ruta sencilla para la actuación magnética al tiempo que preserva la visibilidad de la carga y la liberación.

Los microrobots mantuvieron la integridad estructural en condiciones ácidas, lo que confirma que el recubrimiento de copolímero de ácido metacrílico y acrilato de etilo protegió eficazmente los fármacos encapsulados durante el tránsito a través de un entorno gastrointestinal simulado (es decir, una trayectoria de serpentín microfluídica). Observamos una liberación de fármacos dependiente del pH una vez que los microrobots llegaron al entorno intestinal simulado en el sitio objetivo. La guía magnética en el modelo microfluídico que simula el colon permitió la localización precisa de los microrobots cerca del esferoide canceroso en el sitio objetivo. Una vez liberados, los PNPs mostraron una mayor afinidad de unión a las células de cáncer de colon. Si bien la densa matriz extracelular de los tejidos tumorales puede presentar barreras físicas para la penetración intersticial profunda de nanopartículas de aproximadamente 150 nm (^[39]), nuestro sistema multietapa prioriza la maximización de la retención localizada contra el lavado luminal. Esta alta densidad de localización superficial crea un gradiente de concentración sostenido en el sitio objetivo, lo que facilita posteriormente tanto la internalización de nanopartículas como la difusión de doxorrubicina en el tumor. Cuantitativamente, esta estrategia de doble etapa mejoró la retención de nanopartículas dentro del esferoide canceroso en 3,4 veces y aumentó la citotoxicidad en 4,3 veces en comparación con las nanopartículas administradas solas, lo que destaca la ventaja práctica de integrar el direccionamiento multiescala en la administración oral. Más allá del modelo microfluídico, la magnetización consistente de los microrobots individuales también permitió su ensamblaje en estructuras similares a cadenas a través de interacciones dipolo-dipolo magnéticas, lo que proporcionó un modo de locomoción de "caminata" eficaz bajo un campo magnético rotatorio. Esta capacidad se validó aún más en tejidos de intestino y estómago porcinos ex vivo, donde los microrobots ensamblados mostraron una locomoción robusta en superficies de tejido flexibles y plegadas. Su capacidad para atravesar los pliegues del tejido en ambos órganos demuestra que la estrategia de actuación propuesta no se limita a los canales microfluídicos planos y puede funcionar en entornos gastrointestinales más fisiológicamente relevantes.

A pesar de estos resultados prometedores, persisten desafíos técnicos. El proceso de fabricación actual, en particular la técnica de impresión 2PP de alta resolución, necesita optimización para la producción a gran escala con el fin de satisfacer los requisitos prácticos y clínicos. Las investigaciones futuras podrían explorar métodos de fabricación alternativos, como la impresión 3D de alta resolución de tipo "roll-to-roll" (^[40]) y la litografía suave (^[41]), para mejorar la escalabilidad y reducir los costos de producción. Además, aunque la estrategia de PNP mejora las interacciones específicas del cáncer, las variaciones de un donante a otro en la composición de la membrana pueden introducir una variabilidad sutil en el rendimiento del direccionamiento. Abordar esta variabilidad a través de una preparación estandarizada de la membrana será esencial para la futura traducción para garantizar una eficiencia de direccionamiento constante. Además, nuestro modelo microfluídico que simula el colon proporciona un entorno controlable y reproducible como prueba de concepto en lugar de una réplica fisiológica completa del entorno gastrointestinal in vivo. Su principal fortaleza es que captura varias barreras clave relevantes para la administración local, incluido el lavado impulsado por el flujo, el confinamiento de la vía, la localización del sitio objetivo y la liberación en la vecindad de una estructura que simula un tumor. Sin embargo, no reproduce la complejidad total del tracto gastrointestinal, como la deformación peristáltica, la cobertura de la mucosa, la geometría heterogénea del lumen o el tránsito a larga distancia desde el sitio de administración hasta el sitio de la enfermedad. En consecuencia, los experimentos actuales validan principalmente la actuación magnética local, la liberación localizada y la retención bajo flujo, en lugar de la navegación a escala del tracto gastrointestinal completo. Por lo tanto, la validación futura en modelos animales será esencial para evaluar la biodistribución, la eficacia terapéutica y la seguridad.

En general, este estudio establece una plataforma de microrobots que sirve como prueba de concepto e integra micro y nanotecnologías a través de un mecanismo de liberación sensible al entorno, una estrategia de magnetización habilitada por una cámara rellenable y un direccionamiento jerárquico a diferentes escalas. Si bien se requiere un mayor desarrollo antes de su aplicación clínica, este enfoque de doble etapa ofrece una base para avanzar en las estrategias de administración oral con el fin de superar las complejas barreras fisiológicas que se encuentran en el cuerpo humano. Este enfoque innovador tiene el potencial de mejorar la precisión y la eficacia de las intervenciones terapéuticas dirigidas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fabricación de microrobots, magnetización, carga de fármacos y sellado

Todos los modelos 3D se crearon utilizando un software de diseño asistido por computadora comercial (Autodesk Inventor 2022), y los archivos del modelo se exportaron como archivos STL. Los microrobots se fabricaron siguiendo el protocolo descrito previamente (^[26]). Se utilizó una impresora 2PP comercial (Photonic Professional GT2, Nanoscribe, con un objetivo de inmersión de 10×) para fabricar estas estructuras utilizando la resina comercial IP-Q. Después de la impresión, los microrobots se limpiaron sumergiéndolos en monometiléter de propilenglicol (PGMEA) durante 1 hora y en alcohol isopropílico (IPA) durante 10 minutos. Una vez que se limpiaron a fondo, se secaron con nitrógeno y se sometieron a un post-curado bajo luz ultravioleta (UV) (Form Cure, λ = 405 nm) durante 2 horas.

Se preparó una solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 10% (p/v) (peso molecular promedio ∼1.300.000; Sigma-Aldrich, 437190). Luego, se preparó una suspensión de micropartículas de NdFeB dispersando micropartículas de NdFeB (masa = 500 mg) en 1 ml de la solución de PVP. La suspensión magnética se cargó en las cámaras del microrobot mediante centrifugación a 2500 fuerzas centrífugas relativas (rcf) durante 3 minutos, lo que promueve la sedimentación de las partículas en la cámara y favorece la formación de una capa de partículas compactas en el fondo de la cámara. Se eliminó la suspensión residual que rodeaba a los microrobots y los microrobots se secaron a 60 °C para eliminar el disolvente y estabilizar la capa magnética interna. Para aislar físicamente la capa magnética del fármaco posterior, se formó una fina capa de barrera de PDMS de la siguiente manera: los microrobots se sumergieron en resina de PDMS (10:1) y se centrifugaron a 2500 rcf durante 3 minutos para que la capa de PDMS cubriera la región del fondo de la cámara sobre la capa de NdFeB. El PDMS se curó a 60 °C para generar una barrera protectora que separa la capa magnética de la carga del fármaco. Después de la formación de la capa interna de NdFeB, los microrobots se sometieron a una post-magnetización utilizando un magnetizador de impulsos (M-10-30, ASC Scientific) aplicando cinco pulsos de magnetización con un campo magnético máximo de aproximadamente 2,5 T para definir una dirección de magnetización consistente en todos los microrobots.

Los microrobots magnetizados se llenaron con la carga utilizando un método de carga asistida por vacío. Brevemente, se colocó una gota de solución de carga sobre la matriz de microrobots y la matriz se colocó en un desecador conectado a una bomba. La presión de vacío facilitó la entrada de la solución a través de los poros de la tapa de los microrobots. Una vez que se llenaron por completo, se eliminó el exceso de solución mediante centrifugación (utilizando un recubridor de centrifugación de Laurell Technologies) y los microrobots cargados se almacenaron en un refrigerador a 4 °C para minimizar la evaporación de la carga. La solución sensible al pH se recubrió sobre una lámina de vidrio mediante centrifugación durante 15 segundos a 400 rpm y luego se utilizó inmediatamente para el sellado por inmersión. Se utilizó un reómetro (Anton Paar, MCR 302) para sellar mecánicamente los microrobots con la capa de sellado de pH.

Preparación de plaquetas y derivados de membrana

Se obtuvo sangre humana que contenía una solución de citrato de sodio como anticoagulante de Cambridge Bioscience y el acceso a las muestras se gestionó a través del Banco de Tejidos de Imperial College Healthcare (ICHTB). ICHTB está aprobado por Wales REC3 para la liberación de material humano para investigación (17/WA/0161). Las muestras utilizadas en este estudio se emitieron bajo la subcolección ENGMS21_025. La sangre se centrifugó a 100 g durante 20 minutos a temperatura ambiente, separando los glóbulos rojos (GR) y el plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP se centrifugó posteriormente a 800 g durante 20 minutos a temperatura ambiente para obtener un pellet de plaquetas. Este pellet se resuspendió en tampón PBS que contenía 2 μM de PGE1 y 1× inhibidor de proteasas (A32955, Thermo Fisher Scientific) y luego se almacenó a −80 °C. Todos los pasos de centrifugación se realizaron con una aceleración y desaceleración mínimas para evitar la activación de las plaquetas durante el proceso de recolección. Los derivados de la membrana de las plaquetas se produjeron mediante tres ciclos repetidos de congelación y descongelación. Después de cada descongelación, las suspensiones de plaquetas se centrifugaron a 6600 g durante 10 minutos y se lavaron con tampón PBS que contenía 1× inhibidor de proteasas. La suspensión de membrana de plaquetas en agua se sometió a sonicación con punta a 20% de amplitud con un intervalo de 2 segundos encendido y 1 segundo apagado durante 1,5 minutos en un baño de hielo utilizando un sonificador con punta (VCX 500, Sonics & Materials Inc.).

Preparación de nanopartículas recubiertas con membrana de PLT y membrana de GR

El clorhidrato de DOX (D4193, VWR) se desaló a su forma base libre. Específicamente, se disolvieron 5,5 mg de clorhidrato de DOX en 1 ml de metanol y se añadieron 20 μl de trietilamina (TEA, 471283, Sigma-Aldrich). Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad y secar bajo nitrógeno (N2), el DOX desalado se extrajo con 1 ml de cloroformo con agitación suave y se recogió. Este ciclo de extracción con cloroformo y soplado con N2 se repitió para eliminar cualquier sal restante y el DOX base libre seco se almacenó a −20 °C para su uso posterior. Utilizando el método de emulsión simple, se sintetizaron nanopartículas de DOX cargadas. Se mezclaron 2 mg de DOX y 4 mg de Resomer RG 502 H, poli(ácido láctico-co-glicólico) (719897, Merck) en 200 μl de diclorometano (DCM). Esta solución se emulsionó en 1,2 ml de una solución de alcohol polivinílico (PVA) al 5% (p/v) (81381, Sigma-Aldrich) en agua desionizada (DI) utilizando un sonificador con punta (VCX 500, Sonics & Materials Inc.) al 30% de amplitud con un ciclo de 1 segundo encendido, 1 segundo apagado durante 5 minutos, en un baño de hielo. Esta emulsión se introdujo luego en 4 ml de una solución de PVA al 0,5% (p/v) en agua DI y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para evaporar el DCM. La emulsión se volvió a sonicar en las mismas condiciones. La emulsión agua/aceite/agua resultante se añadió gota a gota a 8 ml de una solución de PVA al 5% (p/v) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para facilitar una mayor evaporación del disolvente. Para recoger las nanopartículas, se añadieron 35 ml de agua DI, seguidos de centrifugación a 20.130 g durante 20 minutos a 4 °C. Las nanopartículas se resuspendieron en agua DI con una cantidad igual de sacarosa (A15583, Thermo Fisher Scientific) y se liofilizaron para su uso posterior. Para crear nanopartículas (PNP), se mezclaron nanopartículas de PLGA y derivados de la membrana de plaquetas en agua DI a una relación de peso membrana/núcleo de 1:1. Esta mezcla se sonicó al 35% de amplitud con un ciclo de 2 segundos encendido, 1 segundo apagado durante 2 minutos y se lavó mediante centrifugación a 20.130 g durante 15 minutos a 4 °C. Para las nanopartículas marcadas con 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobencenosulfonato (DiD, excitación 644 nm/emisión 665 nm, V22887, Thermo Fisher Scientific) y que contienen DOX, se añadió 0,1% en peso de DiD en relación con el peso de PLGA al DOX en DCM. Las nanopartículas cargadas con rodamina 6G se prepararon sustituyendo un peso equivalente de rodamina 6G (Sigma-Aldrich, 252433) por DOX en DCM, siguiendo los mismos procedimientos de preparación de nanopartículas descritos anteriormente. Las nanopartículas recubiertas con membrana de GR se prepararon utilizando el mismo método que las PNP.

Caracterización de las PNP

El tamaño y el potencial zeta de la superficie de las nanopartículas y las PNP-Vs se evaluaron mediante DLS utilizando un Malvern Zetasizer Nano-ZS. Para el análisis TEM, las muestras se adsorbieron y se secaron sobre rejillas de cobre recubiertas de carbono de 400 mallas (CF400-CU-50, Electron Microscopy Sciences) a temperatura ambiente, se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 1% (22400, Electron Microscopy Sciences) durante 30 segundos y se obtuvieron imágenes con un TEM (JEM-2100Plus, JEOL Ltd). Para confirmar la integridad del recubrimiento de la membrana de plaquetas en las PNP después de la internalización celular, primero se prepararon PLT-Vs teñidas con 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina perclorato (DiO). El colorante DiO (1 μM) se mezcló con una suspensión de PLT-V en PBS durante 1 hora a 37 °C. Se eliminó el exceso de colorante DiO y las PLT-Vs teñidas con DiO se recogieron utilizando un tubo de corte molecular de 10 kDa (UFC901008, Merck). Las nanopartículas de PLGA marcadas con DiD se recubrieron con PLT-Vs teñidas con DiO como se describió anteriormente. Las nanopartículas preparadas (200 μg/ml) se incubaron con células HCT116 a 37 °C durante 4 horas, se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% (p/v) en PBS, y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342. Se capturaron imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal (SP8, Leica). Para la determinación del rendimiento de carga del fármaco, las PNP pesadas se disolvieron en 1 ml de dimetilsulfóxido (276855, Sigma-Aldrich) utilizando sonicación en baño durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 20.133 g durante 15 minutos, el DOX en el sobrenadante se recogió, se secó y se resuspendió en 10 ml de tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS).

Western blot de proteínas de la membrana de plaquetas

Se realizaron análisis de Western blot para confirmar la herencia de las proteínas de la membrana de plaquetas a las BNP. Antes de la extracción de proteínas, las PNP (aproximadamente 500 μg de masa de nanopartículas) se lavaron tres veces con tampón PBS mediante centrifugación a 20.130 g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar las proteínas no unidas. Las muestras de proteínas de plaquetas lisadas, PLT-Vs y PNP se prepararon con una concentración mínima de 1,5 mg/ml utilizando un kit de ensayo de ácido bicinquinónico (23227, Thermo Fisher Scientific). Las muestras de proteínas (20 μg) mezcladas con tampón de carga de muestra (1610747, Bio-Rad) que contenía 5% de 2-mercaptoetanol (1610710, Bio-Rad) se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron por pocillo. Como se cargaron 8 μl de estándar de proteínas preteñido (1610374, Bio-Rad) por pocillo como referencia de peso molecular en cada gel, las proteínas se separaron en geles Precast TGX Stain-Free Mini-PROTEAN al 4-20% (4568096, Bio-Rad) en un tampón de ejecución (1610732, Bio-Rad). La electroforesis se realizó a 80 V para el gel de apilamiento y a 100 V para el gel de resolución. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (1704157, Bio-Rad) utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (1704150, Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de bloquear la membrana con 1% de albúmina sérica bovina (A2153, Sigma-Aldrich) en tampón tris (TBS, 1706435, Bio-Rad) con 0,01% de Tween 20 (1706531, Bio-Rad) (TBST), las membranas se incubaron con anticuerpos primarios específicos para Integrina α6 (3750, Cell Signaling Technology), Integrina β3 (13166S, Cell Signaling Technology) y P-selectina (84298S, Cell Signaling Technology) a una dilución de 1:1000 durante la noche a 4 °C. Luego, se incubaron anticuerpos secundarios de IgG de cabra anti-conejo marcados con IRDye 680RD (926-68071, LI-COR) a 1:15.000 a temperatura ambiente durante 1 hora y se obtuvieron imágenes utilizando el imager Odyssey CLx (LI-COR).

Modelo microfluídico de cáncer de colon in vitro y evaluación de la locomoción ex vivo

El chip microfluídico consta de un sustrato y un canal similares a las vellosidades, ambos hechos de PDMS (10:1) utilizando una técnica de moldeo. El molde del sustrato similar a las vellosidades se creó utilizando una impresora 2PP, mientras que el molde del canal se fabricó con una impresora 3D (Prusa SL1S).

Antes de la siembra celular, el microchip microfluídico completamente ensamblado se esterilizó mediante irradiación UV durante 1 hora. El canal se recubrió con fibronectina (50 μg/ml, F1141, Merck) durante 1 hora. Después del recubrimiento, el canal se lavó con DPBS, y se introdujeron HCOEPCs (2 × 106 células/ml) en el canal, permitiéndoles adherirse durante 1 hora a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Las células no adheridas se eliminaron mediante lavado con medio de cultivo celular, y las HCOEPCs se cultivaron durante 48 horas adicionales para formar una capa epitelial estable. Para la formación de esferoides, se sembraron 2 × 104 células HCT116 en una placa de 96 pocillos con fondo en U (174925, Thermo Fisher Scientific) y se cultivaron durante 5 días hasta que se formaron los esferoides. Luego, se transfirió un esferoide al sitio objetivo en la plataforma microfluídica y se incubó durante 24 horas adicionales para facilitar la adhesión al epitelio. El medio de cocultivo fue una mezcla 1:1 de medio de cultivo de células epiteliales normales y medio de cultivo de células cancerosas (medio del chip). El medio del chip se perfundió a través del microchip microfluídico utilizando un flujo impulsado por presión hidrostática cada 24 horas. Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2.

La locomoción del microrobot se activó utilizando un generador de campo magnético externo (MFG-100-I, Magnebotix). Para la activación con campo rotatorio, se aplicó un campo magnético rotatorio uniforme con una magnitud de 5 mT a una frecuencia de rotación de 1 Hz. La locomoción ex vivo se evaluó utilizando tejidos de estómago e intestino de cerdo para evaluar la movilidad del sistema de microrobots propuesto en superficies gastrointestinales fisiológicamente relevantes, flexibles y plegadas.

Ensayo de adhesión a células epiteliales normales del colon y células cancerosas

Las células HCOEPC, SW480 y HCT116 (2 × 106) se sembraron en placas de seis pocillos separadas y se cultivaron durante la noche. Luego, las células se expusieron a una solución con nanoformulaciones liofilizadas marcadas con DiD (200 μg/ml) a 4 °C durante 30 minutos en sus respectivos medios de cultivo. Después de tres lavados con PBS para eliminar las nanopartículas no unidas, las células se incubaron a 37 °C durante 2 horas para permitir que las nanopartículas unidas se internalizaran. Las células se separaron mediante tratamiento con 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 15575020, Thermo Fisher Scientific) y luego se recolectaron después de la centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Posteriormente, se fijaron con 4 % de paraformaldehído durante 10 minutos. Los gránulos se lavaron una vez con solución de citometría de flujo [PBS con 2 % (v/v) de FBS] y luego se resuspendieron en 500 μl de la solución de citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia de las nanopartículas dentro de las células se midió utilizando un analizador de células BD LSRFortessa, y los datos de intensidad de fluorescencia media se analizaron utilizando el software FlowJo versión 10. Las PNPs se prebloquearon con anticuerpo anti-P-selectina para validar la orientación mediada por la membrana plaquetaria. Brevemente, las PNPs (1 mg/ml) se preincubaron con anticuerpo anti-P-selectina (20 μg/ml; 14-0628-82, Thermo Fisher Scientific) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo.

Medición de la citotoxicidad utilizando CCK-8

La citotoxicidad se evaluó utilizando CCK-8 (Sigma-Aldrich, 96992). Las células HCOEPC, SW480 y HCT116 se sembraron a una densidad de 10 000 células por pocillo. Después de 24 horas de tratamiento con varias concentraciones de nanopartículas cargadas con DOX, el medio se reemplazó con 100 μl de medio fresco. Posteriormente, se agregaron 10 μl de solución de CCK-8 y las células se incubaron durante 3 horas a 37 °C con 5 % de CO2. Las absorbancias se midieron a 450 y 650 nm utilizando un lector de placas (SpectraMax M5, Molecular Devices), y la viabilidad celular se calculó a partir de los datos (n = 3 experimentos independientes y n = 3 réplicas técnicas). Para los ensayos de lavado diseñados para evaluar la citotoxicidad dependiente de la orientación, primero se expusieron las células a PNP-DOXs durante 30 minutos para permitir la unión de las nanopartículas. Luego, el medio se reemplazó para eliminar las nanopartículas no unidas, seguido de una incubación adicional de 24 horas antes de realizar el ensayo de CCK-8 como se describió anteriormente.

Demostración in vitro de la orientación y la eficacia antitumoral

Las BNP-DOXs y PNP-DOXs marcadas con DiD se prepararon a una concentración de 4,2 μg/ml en el medio del chip. También se prepararon microrobots que contenían 0,42 μg de PNP-DOX. Se introdujo un volumen de 200 μl de nanopartículas o microrobots marcados con DiD en el microcanal recubierto con epitelio de colon bajo un flujo impulsado por presión hidrostática durante 30 minutos, con restablecimientos de presión cada 10 minutos. Las nanopartículas o microrobots no unidos se lavaron con DPBS durante 30 minutos, seguido de un paso de lavado adicional 12 horas después. El tratamiento continuó durante un total de 24 horas. La expresión de DiD se visualizó utilizando un microscopio (AMF4300, EVOS) en los puntos de cáncer de colon. La intensidad se midió utilizando el software ImageJ. Para cuantificar la carga administrada por esferoide, se recolectaron esferoides de cáncer individuales y se disociaron mediante colagenasa IV (1 mg/ml; 17104-019, Thermo Fisher Scientific) a 37 °C durante 15 minutos. Las células se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos y se lisaron con 100 μl de tampón de lisis [50 mM de tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 % de Triton X-100 y DNasa I (10 U/ml)]. Los lisados se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos a 4 °C para eliminar los desechos celulares, y el sobrenadante se centrifugó posteriormente a 20 000 g durante 30 minutos a 4 °C para concentrar las nanopartículas. El gránulo enriquecido con nanopartículas se resuspendió en 200 μl de PBS, y la absorbancia de DOX se cuantificó utilizando un lector de placas (SpectraMax M5, Molecular Devices) a una longitud de onda de 485 nm. La carga de nanopartículas retenida por esferoide se calculó utilizando una curva de calibración generada a partir de nanopartículas cargadas con DOX con concentraciones conocidas y luego se normalizó a la dosis administrada. Para analizar la eficacia antitumoral, las plataformas microfluídicas se tiñeron con 1 μM de Calcein AM y 4 μM de etidio homodímero-1 para la eficacia antitumoral durante 15 minutos a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 y se lavaron; luego, la fluorescencia verde y roja se visualizaron utilizando un microscopio (AMF4300, EVOS), y la relación de fluorescencia roja a verde se calculó utilizando el software ImageJ para evaluar la citotoxicidad.

Análisis estadístico

El número de réplicas independientes se especifica en la leyenda de la figura para cada figura. Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se realizaron utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para las comparaciones entre tres o más grupos, seguido de pruebas post hoc de Tukey. Los datos se analizaron utilizando el software Prism 8.0.1 (GraphPad) y se presentan como media ± DE. La significación estadística se indica mediante *, , o *, que corresponden a valores de P de