El metabolito de folato derivado del microbioma intestinal suprime la progresión del cáncer colorrectal.

La producción bacteriana de ácido folínico disminuye en el cáncer colorrectal murino y humano

En el ciclo del metabolismo de un carbono, los folatos actúan como cofactores esenciales que facilitan la transferencia de unidades de un carbono para procesos anabólicos clave, incluida la síntesis, reparación y metilación del ADN ^[19] (Figura 1a). El ácido folínico (5-formiltetrahidrofolato) no es un donante de un carbono, sino más bien un reservorio químico estable de folatos reducidos producido a partir de 5,10-metilenetetrahidrofolato mediante una reacción secundaria catalizada por la enzima serina hidroximetiltransferasa (SHMT), que en las bacterias está codificada por el gen glyA ^[20] (Figura 1a). Utilizando nuestra plataforma de metabolómica establecida de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para folatos ^[17], verificamos que los niveles de ácido folínico intestinal dependen de la presencia de una microbiota funcional. Se detectó ácido folínico en el intestino de ratones colonizados convencionalmente, pero estaba prácticamente ausente en ratones libres de gérmenes (Figura 1b). Estos datos establecen que la microbiota intestinal es la principal fuente de ácido folínico luminal en condiciones de ingesta adecuada de folato. Para evaluar la relevancia del ácido folínico producido por la microbiota en el contexto del cáncer colorrectal (CCR), ampliamos nuestro análisis al modelo de ratón C57BL/6J-Il10−/− (IL10KO) de CCR asociado a colitis ^[21]. Sorprendentemente, la abundancia de ácido folínico en el ciego fue aproximadamente 10 veces menor en los ratones IL10KO en comparación con los de tipo salvaje (WT), lo que sugiere que la microbiota en los ratones IL10KO presenta una deficiencia en la producción de ácido folínico (Figura 1c).

Para determinar si la pérdida de la producción microbiana de ácido folínico también es una característica del CCR humano, evaluamos la abundancia del gen glyA en la microbiota de pacientes con CCR (Figura 1d). El análisis metagenómico de muestras de heces humanas reveló una reducción significativa en el recuento de genes glyA en pacientes con CCR en comparación con los controles sanos ^[22] (Figura 1e). Sorprendentemente, observamos una disminución progresiva en la abundancia microbiana de glyA que se correlacionó con la gravedad de la enfermedad avanzada, lo que sugiere que la disminución en la producción microbiana de ácido folínico está relacionada con la malignidad y la metástasis del CCR (Figura 1e, f) ^[22], ^[23].

Para investigar los factores bacterianos que subyacen a la disminución observada del ácido folínico fecal en el CCR, realizamos un secuenciamiento del ARN ribosomal 16S de la microbiota en muestras fecales de ratones IL10KO y controles WT. El análisis cladograma de Análisis Discriminante Lineal del Tamaño del Efecto (LEfSe) reveló una firma inflamatoria y pro-CCR en los animales IL10KO, caracterizada por una expansión de la familia Christensenellaceae y una pérdida de clados homeostáticos como Lactobacillaceae, Bacilli y varias líneas dentro de Proteobacteria (como Burkholderiales, Alphaproteobacteria y Betaproteobacteria) (Figura 1g). Las clases anaeróbicas abundantes como Clostridia y Bacteroidia no mostraron cambios uniformes a nivel de clase. Para determinar si estos cambios se corresponden con una pérdida de la capacidad biosintética de ácido folínico, realizamos un análisis BLAST de la proteína SHMT bacteriana codificada por el gen glyA en la comunidad humana de comensales de 119 miembros definida (hCom2) ^[24] para identificar la distribución taxonómica de glyA. Este análisis reveló que glyA se conserva dentro de anaerobios estrictos específicos que se agrupan dentro de grupos de comensales intestinales homeostáticos centrales, incluidos los principales lactobacilos y las principales líneas de Clostridiales que degradan carbohidratos, que están disminuidos en el CCR ^[12], ^[13] (Figura 1h). Las líneas de Lactobacillaceae y Proteobacteria positivas para SHMT que dominan el intestino WT con niveles adecuados de ácido folínico también se redujeron significativamente en los ratones IL10KO (Figura 1g, h). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que la deficiencia de ácido folínico fecal observada en el CCR no se debe a cambios amplios en los taxones bacterianos abundantes, sino a la disminución selectiva de cepas bacterianas específicas que contienen glyA.

El ácido folínico aumenta la expresión de E-caderina y suprime la transición epitelio-mesenquimal en las células de CCR humano

El ácido folínico se considera un vitámero de folato no tóxico y actúa como un agente protector de la mucosa en entornos clínicos ^[25]. Confirmamos que el ácido folínico por sí solo no mata las células cancerosas, incubando células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano HT29 con diferentes concentraciones de ácido folínico durante 4 días in vitro (Figura 2a). Si bien no se observaron efectos tóxicos evidentes en un ensayo de viabilidad celular, las células HT29 incubadas con ácido folínico exhibieron una remodelación morfológica dramática de las colonias. Los controles tratados con el vehículo se comportaron como las células HT29 en cultivo; en lugar de detenerse para formar una monocapa epitelial estructurada al alcanzar la confluencia, estas células se apilaron en multicapas desorganizadas superpuestas, similares a las mesenquimales, características de las células HT29 parentales indiferenciadas ^[26] (Figura 2b). Sin embargo, las células HT29 tratadas con ácido folínico parecían más epiteliales y menos mesenquimales en su morfología. La cuantificación del volumen/área de cada colonia confirmó que el ácido folínico indujo una remodelación de las células en forma de monocapa en comparación con los controles (Figura 2b). Basándonos en esta observación, hipotetizamos que el ácido folínico previene o invierte la transición epitelio-mesenquimal (TEM) de las células de CCR in vitro (Figura 2c). La pérdida de proteínas de unión adherentes entre células epiteliales, como la E-caderina, es una característica de la TEM en el CCR ^[27] (Figura 2c). En consecuencia, los niveles de E-caderina aumentaron significativamente en las células HT29 tratadas con ácido folínico en comparación con las células tratadas con el vehículo, según lo medido mediante inmunocitoquímica (Figura 2d) y análisis de Western blot (Figura 2e). Por lo tanto, si bien el ácido folínico no es citotóxico, aumenta los niveles de proteína de E-caderina en las células de CCR in vitro.

A continuación, queríamos investigar si un aumento de la E-caderina y una mejora de la morfología similar al epitelio en las células HT29 son suficientes para reducir su capacidad metastásica in vitro. Utilizando un ensayo de migración transdérmica ^[28] (Figura 2f), encontramos que las células HT29 tratadas con ácido folínico eran menos migratorias, como lo determinó el número significativamente menor de unidades formadoras de colonias (UFC) en el lado basolateral (Figura 2g). Coherente con nuestros resultados anteriores, las células tratadas con ácido folínico en las transdérmicas mostraron altos niveles de E-caderina (Figura 2h). El análisis de microscopía electrónica de transmisión de las células en las transdérmicas también mostró un aumento en el número y la densidad de proteínas de las conexiones entre células en el tratamiento con ácido folínico en comparación con los controles (Figura 2i). Estos datos demuestran que el ácido folínico regula la plasticidad de las células de CCR al mantener la expresión de E-caderina, reforzando las uniones entre células epiteliales y reduciendo directamente la capacidad migratoria in vitro.

El ácido folínico inhibe la calpaína-2 e invierte la transición epitelio-mesenquimal del CCR

A continuación, buscamos identificar el mecanismo por el cual el ácido folínico reduce la TEM en las células de CCR. Utilizando un análisis proteómico de unión al objetivo en lisados de células HT29 incubados con ácido folínico, identificamos la calpaína-2 (CAPN2) y su subunidad catalítica (CAPNS) como posibles objetivos de unión (Figura 3a). Esta interacción se vio respaldada por un análisis de acoplamiento in silico, que mostró que el ácido folínico se une a la subunidad catalítica de CAPN2 (Figura 3b). En particular, el grupo 5-formilo del ácido folínico unido está orientado hacia la cisteína catalítica en el sitio activo de CAPN2, lo que sugiere que este vitámero de folato actúa como un inhibidor selectivo de la actividad de la proteasa calpaína. Para caracterizar bioquímicamente esta interacción ligando-proteína, clonamos, sobreexpresamos y purificamos la CAPNS humana para ensayos de unión in vitro. La proteína recombinante se incubó con concentraciones equimolares de cinco vitámeros de folato distintos, y los folatos unidos a la proteína se cuantificaron posteriormente mediante LC-MS para evaluar la afinidad de unión competitiva. El ácido folínico (5-formil-tetrahidrofolato) exhibió la mayor afinidad de unión a la subunidad catalítica de CAPN2, seguido del 5-metil-tetrahidrofolato (Figura 3c). Este patrón indica que las modificaciones en la posición N^[5] del anillo de pteridina son determinantes críticos de la unión a CAPN2. Para probar si el ácido folínico funciona como un inhibidor competitivo, realizamos un ensayo de desplazamiento de ligando utilizando un inhibidor covalente conocido y potente de CAPN2 (CAPN2i, CAS No: 110115-07-6). La proteína purificada preincubada con ácido folínico demostró un desplazamiento dependiente de la dosis del vitámero tras la adición de CAPN2i, según lo medido por LC-MS (Figura 3d). Estos datos confirman que el ácido folínico y el CAPN2i ocupan competitivamente el mismo bolsillo de unión catalítica.

Estudios previos han establecido que la CAPN2 se sobreexpresa en el CCR e inhibir su actividad suprime la carga tumoral in vivo ^[29], ^[30]. Mecánicamente, se sabe que la CAPN2 promueve la progresión del CCR al impulsar una firma génica proinflamatoria, un proceso mediado por la activación del factor de transcripción proinflamatorio NF-κB ^[29]. Dado nuestro descubrimiento de que el ácido folínico inhibe la CAPN2 y suprime la TEM in vitro, a continuación, buscamos investigar si la CAPN2 promueve de forma nativa la TEM en las células de CCR y modula directamente la expresión del marcador epitelial E-caderina. Para evaluar esto, utilizamos la edición del genoma CRISPR-Cas9 para generar una línea celular HT29 con deleción de CAPN2 (KO) (Figura 3e) y realizamos ensayos de migración transdérmica junto con la cuantificación de E-caderina. Si bien las células HT29 WT exhibieron una robusta capacidad migratoria, las células CAPN2KO mostraron una notable reducción de ~10 veces en la migración, lo que sugiere que la depleción de CAPN2 es suficiente para atenuar el fenotipo TEM de las células de CCR in vitro (Figura 3f). En consecuencia, las células CAPN2KO demostraron niveles marcadamente elevados de E-caderina en comparación con los controles WT (Figura 3g).

Dado que la CAPN2 se sobreexpresa con frecuencia en tumores agresivos y resistentes a la quimioterapia del CCR ^[31], ^[32], a continuación, investigamos si los niveles elevados de expresión de CAPN2 son capaces de impulsar de forma independiente la TEM. Para probar esto, generamos una línea celular con sobreexpresión de CAPN2 (OE) tratando progresivamente las células HT29 con dosis crecientes de SN-38, el metabolito activo del fármaco de quimioterapia irinotecán ^[29] (Figura 3h). Estas células resistentes a SN-38 exhibieron una marcada regulación al alza de CAPN2, lo que coincidió con un aumento significativo en la migración celular y una disminución concomitante en la expresión de E-caderina (Figura 3h, i). Estos datos indican que los niveles elevados de proteína CAPN2 son una característica de la TEM asociada a la resistencia a la quimioterapia en el CCR.

Finalmente, para determinar si el tratamiento con ácido folínico puede revertir activamente un fenotipo mesenquimal establecido, aislamos las células de CCR mesenquimales migradas de la parte inferior de las cámaras transdérmicas iniciales y las transferimos a ensayos transdérmicos secundarios para el tratamiento con ácido folínico (Figura 3j). Sorprendentemente, la administración de ácido folínico suprimió potently la migración posterior de estas células mesenquimales preaisladas. Este rescate fenotípico se vio respaldado por una regulación al alza concomitante de los niveles de proteína de E-caderina (Figura 3j, k), lo que demuestra en conjunto que el ácido folínico inhibe la CAPN2, lo que puede reducir la progresión del CCR e invertir la TEM (Figura 3l).

La síntesis microbiana de ácido folínico en el intestino mejora la homeostasis epitelial y de la mucosa del colon in vivo

Para determinar si el ácido folínico microbiano promueve la expresión de E-caderina y la homeostasis intestinal in vivo, utilizamos el probiótico comensal Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), que puede producir naturalmente todos los derivados de folato ^[33]. Utilizando la recombinación Lambda Red ^[34], eliminamos el gen glyA para generar una cepa de EcN modificada genéticamente (EcN glyA KO) con una capacidad atenuada para producir ácido folínico (Figura adicional 1). Los ratones C57BL/6J fueron gavados cada dos semanas con 109 UFC de EcN de tipo salvaje (WT) o EcN glyA KO durante 12 semanas (Figura 4a). Si bien ambas cepas colonizaron a niveles equivalentes (Figura 4b), el análisis de LC-MS confirmó una reducción significativa en la producción de ácido folínico fecal en el grupo glyA KO (Figura 4c).

Después de 14 semanas, se sacrificaron los animales y se recolectó tejido del colon para su análisis. Sorprendentemente, el EcN glyA KO colonizado en el colon de los ratones parecía presentar signos de inflamación, caracterizados por un engrosamiento visible y un aumento de las irregularidades a lo largo del colon en comparación con el grupo EcN WT ^[35] (Figura 4d). Este cambio morfológico se produjo con una ligera, aunque no significativa, reducción de la longitud del colon en los ratones a los que se administró EcN glyA KO en comparación con los ratones EcN WT, lo que indica inflamación intestinal y daño tisular ^[36] (Figura 4e). En consonancia con estos cambios macroscópicos, los niveles fecales de lipocalina-2 (LCN-2), un biomarcador de la inflamación intestinal ^[37], mostraron un aumento progresivo y significativo en la semana 11 en el grupo glyA KO (Figura 4f).

De manera consistente, los niveles séricos de la citocina antiinflamatoria interleucina 10 (IL-10) ^[38] fueron menores en los ratones a los que se administró EcN glyA KO en comparación con el grupo WT (Figura 4g). Además, la tinción inmunofluorescente de secciones de colon mostró que los ratones colonizados con WT mantuvieron una mejor homeostasis epitelial y de la mucosa, evidenciado por una expresión significativamente mayor de E-caderina (Figura 4h) y mucina 2 (MUC2) (Figura 4i) en comparación con el grupo EcN glyA KO. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y el análisis histológico de las secciones de colon revelaron además que la colonización con glyA KO se asoció con un aumento de la infiltración inflamatoria y una disminución de las células caliciformes, a pesar de no observarse una diferencia significativa en la longitud de las criptas (Figura 4j). En conjunto, estos datos sugieren que el ácido folínico de origen microbiano es esencial para mantener la homeostasis intestinal y prevenir la inflamación.

Basándonos en nuestros resultados en ratones C57BL/6J de tipo salvaje, analizamos a continuación el efecto de la producción bacteriana de ácido folínico en el aumento de la expresión de E-caderina y la reducción de la inflamación crónica en el modelo de ratón C57BL/6J-Il10−/− (IL10KO) asociado a la colitis. A los ratones IL10KO se les administró por vía oral EcN WT o EcN glyA KO cada dos semanas durante 20 semanas (Figura 2a ampliada). Después de 21 semanas, se sacrificaron los animales y se recolectó tejido del colon para su análisis. Como se esperaba, todos los colones de los ratones IL10KO mostraron signos significativos de colitis, incluido el sangrado cecal y el engrosamiento estructural, en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura 2b ampliada). Si bien los colones colonizados con EcN WT mostraron una morfología más uniforme y menos engrosada en comparación con el grupo EcN glyA KO, el efecto no pareció ser consistente en todos los ratones. No se observó ningún cambio significativo en la longitud del colon entre los grupos (Figura 2c ampliada). De manera consistente, si bien la colonización con EcN WT se asoció con una reducción significativa de la LCN-2 fecal en la semana 10, este efecto antiinflamatorio se anuló en la semana 21 (Figura 2d ampliada). El análisis inmunofluorescente de la expresión de E-caderina y MUC2 en las secciones de colon mostró ligeros aumentos en el grupo EcN WT en comparación con el grupo EcN glyA KO (Figura 2e, f ampliada). Finalmente, el análisis histológico de las secciones de colon mostró una mejoría en la morfología de las criptas en el grupo EcN WT, sin cambios significativos en el número de células caliciformes en comparación con el grupo EcN glyA KO (Figura 2g ampliada). Estos hallazgos indican que, si bien el ácido folínico microbiano es suficiente para mejorar la homeostasis epitelial y suprimir la inflamación en ratones de tipo salvaje inmunocompetentes o en ratones con inflamación leve, su eficacia antiinflamatoria se pierde en los estados inflamatorios crónicos y avanzados característicos del modelo IL10KO.

Dado nuestros hallazgos in vitro, investigamos a continuación si la producción bacteriana de ácido folínico podría ejercer un efecto terapéutico más específico sobre la tumorigénesis del colon. Hipotetizamos que las propiedades estructurales y estabilizadoras del epitelio del ácido folínico proporcionarían un beneficio antineoplásico que persiste incluso en un entorno altamente inflamatorio debido a su inhibición de la proteasa CAPN2 pro-carcinogénica. Para probar esto, utilizamos un modelo de CRC inducido por azoximetano (AOM) en ratones IL10KO ^[39] para determinar si el ácido folínico suprime la tumorigénesis independientemente de su falta de eficacia en la resolución de la inflamación crónica. Brevemente, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con AOM cada semana durante las primeras 6 semanas, con administraciones orales concomitantes de EcN WT o EcN glyA KO cada dos semanas durante 14 semanas (Figura 5a). El análisis del contenido de agua fecal, indicativo de obstrucción o disfunción intestinal ^[40], mostró un aumento significativo en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT a partir de la semana 11 (Figura 5b). Morfológicamente, los colones del grupo EcN glyA KO mostraron un pronunciado engrosamiento de la mucosa y la presencia de formaciones nodulares similares a tumores, mientras que el grupo EcN WT mostró un fenotipo más uniforme y atenuado (Figura 5c). Los colones del grupo EcN glyA KO también mostraron una distorsión arquitectónica significativa y longitudes reducidas, lo que indica aún más un daño estructural grave y una patología asociada al tumor en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5c, d). El análisis histológico de las secciones de colon indicó un aumento significativo en el número de tumores de colon y eventos de invasión linfovascular en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5e, f). Además, el grupo EcN glyA KO también mostró una alta puntuación para el grado tumoral y la invasión de la mucosa en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5g, h). El análisis de LCN-2 fecal confirmó que la inflamación crónica no se resolvió en ambos grupos (Figura 3 ampliada). Un análisis de los niveles de proteína CAPN2 en el colon mostró un aumento significativo en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT, lo que indica un aumento de la carga tumoral de CRC (Figura 5i). El análisis de E-caderina y MUC2 en las secciones de colon mostró un aumento significativo en el grupo EcN WT en comparación con el grupo EcN glyA KO, lo que sugiere que, en el contexto de la CRC, el ácido folínico puede mejorar la integridad y la función de barrera del epitelio intestinal (Figura 5j, k). En general, estos resultados sugieren que, si bien el ácido folínico microbiano no es suficiente para resolver la inflamación crónica, es suficiente para atenuar significativamente la progresión de la CRC in vivo al inducir la homeostasis del epitelio intestinal.

Para determinar si la producción de ácido folínico microbiano moldea la estructura general de la comunidad del microbioma, realizamos un secuenciamiento de ARNr 16S en todos los modelos experimentales in vivo (Figura 6). En ratones WT, el análisis PCoA reveló que el estado de colonización alteró significativamente la diversidad β, con un ligero cambio en la diversidad α, lo que indica que la producción de ácido folínico microbiano es un determinante clave del ensamblaje de la comunidad en un entorno homeostático (Figura 6a-c). Las abundancias taxonómicas a nivel de filo y clase, y el análisis LEfSe, no reflejaron enriquecimientos distintos asociados a la salud o a la enfermedad en ninguno de los grupos, lo que sugiere que el ácido folínico ejerce de forma independiente efectos beneficiosos sobre la homeostasis intestinal y la integridad de la barrera (Figura 6d-f). Curiosamente, los ratones IL10KO colonizados con EcN glyA KO mostraron una diversidad α significativamente mayor en comparación con los controles EcN WT, lo que probablemente refleja la expansión de taxones oportunistas (Figura 6g-i). Las abundancias taxonómicas a nivel de filo y clase y el análisis LEfSe confirmaron que la colonización con la cepa EcN glyA KO deficiente en ácido folínico impulsa el microbioma hacia un estado alterado, caracterizado por cambios taxonómicos específicos que están ausentes en los modelos colonizados con EcN WT o en los modelos sanos (Figura 6j-l). Sorprendentemente, en el modelo de CRC inducido por AOM, no observamos diferencias significativas en la diversidad α o β entre los grupos EcN WT y EcN glyA KO, lo que se refleja además en las abundancias a nivel de filo y clase y en el análisis LEfSe (Figura 6m-r). Esto sugiere que, en el contexto de la tumorigénesis inducida químicamente, los efectos antineoplásicos protectores del ácido folínico son intrínsecos a la actividad de señalización del metabolito en lugar de ser una consecuencia secundaria del remodelamiento del microbioma a nivel de la comunidad.

En el ciclo del metabolismo del carbono, los folatos sirven como cofactores esenciales que facilitan la transferencia de unidades de carbono para procesos anabólicos clave, incluida la síntesis, la reparación y la metilación del ADN ^[19] (Figura 1a). El ácido folínico (5-formiltetrahidrofolato) no es un donante de carbono, sino un reservorio químico estable de folatos reducidos producido a partir de 5,10-metilenetetrahidrofolato mediante una reacción secundaria catalizada por la enzima serina hidroximetiltransferasa (SHMT), que en las bacterias está codificada por el gen glyA ^[20] (Figura 1a). Utilizando nuestra plataforma de metabolómica establecida de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ^[17], verificamos que los niveles de ácido folínico intestinal dependen de la presencia de un microbioma funcional. Se detectó ácido folínico en el intestino de los ratones colonizados convencionalmente, pero estaba prácticamente ausente en los ratones germivoros (Figura 1b). Estos datos establecen el microbioma intestinal como la principal fuente de ácido folínico luminal en condiciones de ingesta adecuada de folato. Para evaluar la relevancia del ácido folínico de origen microbiano en el contexto del cáncer colorrectal (CRC), ampliamos nuestro análisis al modelo de ratón C57BL/6J-Il10−/− (IL10KO) de CRC asociado a la colitis ^[21]. Sorprendentemente, la abundancia cecal de ácido folínico fue aproximadamente 10 veces menor en los ratones IL10KO en comparación con los de tipo salvaje, lo que sugiere que el microbioma de los ratones IL10KO es deficiente en la producción de ácido folínico (Figura 1c).

Para determinar si la pérdida de la producción de ácido folínico microbiano también es una característica del CRC humano, evaluamos la abundancia del gen glyA en el microbioma de los pacientes con CRC (Figura 1d). El análisis metagenómico de las muestras de heces humanas reveló una reducción significativa en el recuento de genes glyA en los pacientes con CRC en comparación con los controles sanos ^[22] (Figura 1e). Sorprendentemente, observamos una disminución progresiva en la abundancia microbiana de glyA que se correlacionó con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que el agotamiento de la producción de ácido folínico microbiano está relacionado con la malignidad y la metástasis del CRC (Figura 1e, f) ^[22], ^[23].

Para investigar los factores bacterianos que subyacen al agotamiento observado del ácido folínico fecal en el CRC, realizamos un secuenciamiento de ARNr 16S del microbioma en las muestras de heces de los ratones IL10KO y los controles WT. El análisis cladograma de análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe) reveló una firma pro-inflamatoria y pro-CRC en los animales IL10KO, caracterizada por una expansión de la familia Christensenellaceae y una pérdida de clados homeostáticos como Lactobacillaceae, Bacilli y varias líneas dentro de Proteobacteria (como Burkholderiales, Alphaproteobacteria y Betaproteobacteria) (Figura 1g). Las clases anaeróbicas abundantes como Clostridia y Bacteroidia no mostraron cambios uniformes a nivel de clase. Para determinar si estos cambios se correspondían con una pérdida de la capacidad biosintética de ácido folínico, realizamos un análisis BLAST de la proteína SHMT bacteriana codificada por el gen glyA en la comunidad humana de 119 miembros (hCom2) ^[24] para identificar la distribución taxonómica de glyA. Este análisis reveló que glyA se conserva dentro de anaerobios estrictos específicos que se agrupan dentro de grupos de comensales intestinales homeostáticos centrales, incluidos los principales lactobacilos y las principales líneas de Clostridiales que degradan los carbohidratos, que se agotan en el CRC ^[12], ^[13] (Figura 1h). Las líneas de Lactobacillaceae y Proteobacteria positivas para SHMT que dominan el intestino WT rico en ácido folínico también se agotaron significativamente en los ratones IL10KO (Figura 1g, h). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que la deficiencia de ácido folínico fecal observada en el CRC no se debe a cambios amplios en los taxones bacterianos abundantes, sino a la disminución selectiva de cepas bacterianas específicas que contienen glyA.

El ácido folínico aumenta la expresión de E-caderina y suprime la transición epitelio-mesenquimal en las células de CRC humanas.

El ácido fólico se considera un vitámero de folato no tóxico y actúa como un agente protector de la mucosa en entornos clínicos^[25]. Confirmamos que el ácido fólico, por sí solo, no mata las células cancerosas, incubando células epiteliales de adenocarcinoma de colon humano HT29 con diferentes concentraciones de ácido fólico durante 4 días in vitro (Figura 2a). Si bien no se observaron efectos tóxicos evidentes en un ensayo de viabilidad celular, las células HT29 incubadas con ácido fólico exhibieron una notable remodelación morfológica de las colonias. Los controles tratados con el vehículo se comportaron como las células HT29 en cultivo; en lugar de detenerse para formar una monocapa epitelial estructurada al alcanzar la confluencia, estas células se apilaron en múltiples capas desorganizadas superpuestas, similares a las células HT29 parentales indiferenciadas^[26] (Figura 2b). Sin embargo, las células HT29 tratadas con ácido fólico parecían más epiteliales y menos mesenquimales en su morfología. La cuantificación del volumen/área de cada colonia confirmó que el ácido fólico indujo una remodelación de las células similar a una monocapa en comparación con los controles (Figura 2b). Basándonos en esta observación, hipotetizamos que el ácido fólico previene o revierte la transición epitelio-mesenquimal (TEM) de las células de CRC in vitro (Figura 2c). La pérdida de proteínas de unión adherentes entre células epiteliales, como la E-caderina, es una característica distintiva de la TEM en el CRC^[27] (Figura 2c). En consonancia con esto, los niveles de E-caderina aumentaron significativamente en las células HT29 tratadas con ácido fólico en comparación con las células tratadas con el vehículo, según lo medido mediante inmunocitoquímica (Figura 2d) y análisis de Western blot (Figura 2e). Por lo tanto, si bien el ácido fólico no es citotóxico, aumenta los niveles de proteína E-caderina en las células de CRC in vitro.

A continuación, quisimos investigar si un aumento de la E-caderina y una mejora de la morfología similar al epitelio en las células HT29 son suficientes para reducir su capacidad metastásica in vitro. Utilizando un ensayo de migración transwell^[28] (Figura 2f), encontramos que las células HT29 tratadas con ácido fólico eran menos migratorias, como lo determinó el número significativamente reducido de unidades formadoras de colonias (UFC) en el lado basolateral (Figura 2g). En consonancia con nuestros resultados anteriores, las células tratadas con ácido fólico en los transwells mostraron altos niveles de E-caderina (Figura 2h). El análisis de microscopía electrónica de transmisión de las células en los transwells también mostró un aumento en el número y la densidad de proteínas de las conexiones entre células en el tratamiento con ácido fólico en comparación con los controles (Figura 2i). Estos datos demuestran que el ácido fólico regula la plasticidad de las células de CRC al mantener la expresión de E-caderina, reforzando las uniones entre células epiteliales y reduciendo directamente la capacidad migratoria in vitro.

El ácido fólico inhibe la calpaína-2 y revierte la transición epitelio-mesenquimal del CRC

A continuación, buscamos identificar el mecanismo por el cual el ácido fólico reduce la TEM en las células de CRC. Utilizando un análisis proteómico de interacción con el objetivo en lisados de células HT29 incubados con ácido fólico, identificamos la calpaína-2 (CAPN2) y su subunidad catalítica (CAPNS) como posibles objetivos de unión (Figura 3a). Esta interacción se confirmó aún más mediante un análisis de acoplamiento in silico, que mostró que el ácido fólico se une a la subunidad catalítica de CAPN2 (Figura 3b). En particular, el grupo 5-formilo del ácido fólico unido está orientado hacia la cisteína catalítica en el sitio activo de CAPN2, lo que sugiere que este vitámero de folato actúa como un inhibidor selectivo de la actividad proteasa de la calpaína. Para caracterizar bioquímicamente esta interacción ligando-proteína, clonamos, sobreexpresamos y purificamos la CAPNS humana para ensayos de unión in vitro. La proteína recombinante se incubó con concentraciones equimolares de cinco vitámeros de folato distintos, y los folatos unidos a la proteína se cuantificaron posteriormente mediante LC-MS para evaluar la afinidad de unión competitiva. El ácido fólico (5-formil-tetrahidrofolato) exhibió la mayor afinidad de unión a la subunidad catalítica de CAPN2, seguido del 5-metil-tetrahidrofolato (Figura 3c). Este patrón indica que las modificaciones en la posición N^[5] del anillo de pteridina son determinantes críticos de la unión a CAPN2. Para probar si el ácido fólico funciona como un inhibidor competitivo, realizamos un ensayo de desplazamiento de ligando utilizando un inhibidor covalente conocido y potente de CAPN2 (CAPN2i, CAS No: 110115-07-6). La proteína purificada preincubada con ácido fólico demostró un desplazamiento dependiente de la dosis del vitámero tras la adición de CAPN2i, según lo medido por LC-MS (Figura 3d). Estos datos confirman que el ácido fólico y el CAPN2i ocupan competitivamente el mismo bolsillo de unión catalítica.

Estudios previos han establecido que la CAPN2 se sobreexpresa en el CRC e inhibir su actividad suprime la carga tumoral in vivo^[29],^[30]. Mecánicamente, se sabe que la CAPN2 promueve la progresión del CRC al impulsar una firma génica proinflamatoria, un proceso mediado por la activación del factor de transcripción proinflamatorio NF-κB^[29]. Dado nuestro descubrimiento de que el ácido fólico inhibe la CAPN2 y suprime la TEM in vitro, a continuación, buscamos investigar si la CAPN2 promueve de forma nativa la TEM en las células de CRC y modula directamente la expresión del marcador epitelial E-caderina. Para evaluar esto, utilizamos la edición del genoma CRISPR-Cas9 para generar una línea celular HT29 con deleción de CAPN2 (KO) (Figura 3e) y realizamos ensayos de migración transwell junto con la cuantificación de E-caderina. Si bien las células HT29 WT exhibieron una robusta capacidad migratoria, las células CAPN2KO mostraron una notable reducción de ~10 veces en la migración, lo que sugiere que la depleción de CAPN2 es suficiente para atenuar el fenotipo TEM de las células de CRC in vitro (Figura 3f). En consonancia con esto, las células CAPN2KO demostraron una expresión de E-caderina marcadamente elevada en comparación con los controles WT (Figura 3g).

Dado que la CAPN2 se sobreexpresa con frecuencia en tumores de CRC agresivos y resistentes a la quimioterapia^[31],^[32], a continuación, investigamos si la expresión elevada de CAPN2 es capaz de impulsar de forma independiente la TEM. Para probar esto, generamos una línea celular con sobreexpresión de CAPN2 (OE) tratando progresivamente las células HT29 con dosis crecientes de SN-38, el metabolito activo del fármaco de quimioterapia irinotecán^[29] (Figura 3h). Estas células resistentes a SN-38 exhibieron una notable sobreexpresión de CAPN2, lo que coincidió con un aumento significativo en la migración celular y una disminución concomitante en la expresión de E-caderina (Figura 3h,i). Estos datos indican que los niveles elevados de proteína CAPN2 son una característica de la TEM asociada a la resistencia a la quimioterapia en el CRC.

Finalmente, para determinar si el tratamiento con ácido fólico puede revertir activamente un fenotipo mesenquimal establecido, aislamos las células de CRC mesenquimales migradas del fondo de las cámaras transwell iniciales y las transferimos a ensayos transwell secundarios para el tratamiento con ácido fólico (Figura 3j). Sorprendentemente, la administración de ácido fólico suprimió potently la migración posterior de estas células mesenquimales preaisladas. Este rescate fenotípico se apoyó en una regulación concomitante de los niveles de proteína E-caderina (Figura 3j,k), lo que demuestra en conjunto que el ácido fólico inhibe la CAPN2, lo que puede reducir la progresión del CRC y revertir la TEM (Figura 3l).

La síntesis microbiana de ácido fólico mejora la homeostasis epitelial y de la mucosa del colon in vivo

Para determinar si el ácido fólico microbiano promueve la expresión de E-caderina y la homeostasis intestinal in vivo, utilizamos el probiótico comensal Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), que puede producir naturalmente todos los derivados de folato^[33]. Utilizando la recombinación Lambda Red^[34], eliminamos el gen glyA para generar una cepa de EcN modificada genéticamente (EcN glyA KO) con una capacidad reducida para producir ácido fólico (Figura de datos suplementarios 1). Los ratones C57BL/6J fueron gavados cada dos semanas con 109 UFC de EcN WT o EcN glyA KO durante 12 semanas (Figura 4a). Si bien ambas cepas colonizaron a niveles equivalentes (Figura 4b), el análisis de LC-MS confirmó una reducción significativa en la producción de ácido fólico en las heces en el grupo glyA KO (Figura 4c).

Después de 14 semanas, se sacrificaron los animales y se recolectó el tejido del colon para su análisis. Sorprendentemente, los colones de ratones colonizados con EcN glyA KO parecían exhibir signos de inflamación, caracterizados por un engrosamiento visible y un aumento de las irregularidades a lo largo del colon en comparación con el grupo EcN WT^[35] (Figura 4d). Este cambio morfológico ocurrió con una ligera, pero no significativa, reducción en la longitud del colon en los ratones gavados con EcN glyA KO en comparación con los ratones EcN WT, lo que indica inflamación intestinal y daño tisular^[36] (Figura 4e). En consonancia con estos cambios macroscópicos, los niveles fecales de lipocalina-2 (LCN-2), un biomarcador de la inflamación intestinal^[37], mostraron un aumento progresivo y significativo a partir de la semana 11 en el grupo glyA KO (Figura 4f).

En consonancia con esto, los niveles séricos de la citocina antiinflamatoria interleucina 10 (IL-10)^[38] disminuyeron en los ratones gavados con EcN glyA KO en comparación con el WT (Figura 4g). Además, el tinte inmunofluorescente de las secciones del colon mostró que los ratones colonizados con WT mantuvieron una mejor homeostasis epitelial y de la mucosa, evidenciada por una expresión significativamente mayor de E-caderina (Figura 4h) y mucina 2 (MUC2) (Figura 4i) en comparación con el grupo EcN glyA KO. El tinte con hematoxilina y eosina (H&E) y el análisis histológico de las secciones del colon revelaron además que la colonización glyA KO se asoció con una mayor infiltración inflamatoria y una depleción de las células caliciformes, a pesar de no haber una diferencia significativa en la longitud de las criptas (Figura 4j). En conjunto, estos datos sugieren que el ácido fólico derivado de los microbios es esencial para mantener la homeostasis intestinal y prevenir la inflamación.

La síntesis microbiana de ácido fólico suprime la progresión del CRC en presencia de inflamación crónica in vivo

Basándonos en nuestros resultados en ratones C57BL/6J de tipo salvaje, analizamos a continuación el efecto de la producción bacteriana de ácido fólico en el aumento de la expresión de E-caderina y la reducción de la inflamación crónica en el modelo de ratón C57BL/6-Il10−/− (IL10KO) asociado a la colitis. Los ratones IL10KO fueron gavados cada dos semanas con EcN WT o EcN glyA KO durante 20 semanas (Figura de datos suplementarios 2a). Después de 21 semanas, se sacrificaron los animales y se recolectó el tejido del colon para su análisis. Como se esperaba, todos los colones de ratones IL10KO exhibieron signos significativos de colitis, incluido el sangrado cecal y el engrosamiento estructural, en comparación con los controles de tipo salvaje (Figura de datos suplementarios 2b). Si bien los colones colonizados con EcN WT exhibieron una morfología más uniforme y menos engrosada en comparación con el grupo EcN glyA KO, el efecto no pareció ser consistente en todos los ratones. No se observó un cambio significativo en la longitud del colon entre los grupos (Figura de datos suplementarios 2c). En consonancia con esto, si bien la colonización con EcN WT se asoció con una reducción significativa de la LCN-2 en las heces en la semana 10, este efecto antiinflamatorio se perdió en la semana 21 (Figura de datos suplementarios 2d). El análisis inmunofluorescente de la expresión de E-caderina y MUC2 en las secciones del colon mostró pequeños aumentos en el grupo EcN WT en comparación con el grupo EcN glyA KO (Figura de datos suplementarios 2e,f). Finalmente, el análisis histológico de las secciones del colon mostró una mejor morfología de las criptas en el grupo EcN WT, sin cambios significativos en el número de células caliciformes en comparación con el grupo EcN glyA KO (Figura de datos suplementarios 2g). Estos hallazgos indican que si bien el ácido fólico microbiano es suficiente para mejorar la homeostasis epitelial y suprimir la inflamación en los ratones de tipo salvaje inmunocompetentes o en ratones con inflamación leve, su eficacia antiinflamatoria se pierde en los estados inflamatorios crónicos avanzados característicos del modelo IL10KO.

Dado nuestros hallazgos in vitro, investigamos a continuación si la producción microbiana de ácido fólico podría ejercer un efecto terapéutico más específico sobre la tumorigénesis del colon. Planteamos la hipótesis de que las propiedades estructurales y estabilizadoras del epitelio del ácido fólico proporcionarían un beneficio antineoplásico que persiste incluso en un entorno altamente inflamatorio, debido a su inhibición de la proteasa CAPN2, pro-carcinogénica. Para probar esto, utilizamos un modelo de CRC inducido por azoximetano (AOM) en ratones IL10KO^[39] para determinar si el ácido fólico suprime la tumorigénesis independientemente de su falta de eficacia en la resolución de la inflamación crónica. Brevemente, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con AOM cada semana durante las primeras 6 semanas, con gavajes concurrentes cada dos semanas de EcN WT o bacterias EcN glyA KO durante 14 semanas (Figura 5a). El análisis del contenido de agua fecal, indicativo de obstrucción o disfunción intestinal^[40], mostró un aumento significativo en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT a partir de la semana 11 (Figura 5b). Morfológicamente, los colones del grupo EcN glyA KO exhibieron un marcado engrosamiento de la mucosa y la presencia de formaciones nodulares similares a tumores, mientras que el grupo EcN WT mostró un fenotipo más uniforme y atenuado (Figura 5c). Los colones del grupo EcN glyA KO también exhibieron una distorsión arquitectónica significativa y longitudes reducidas, lo que indica aún más un daño estructural grave y una patología asociada al tumor en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5c, d). El análisis histológico de las secciones de colon indicó un aumento significativo en el número de tumores de colon y eventos de invasión linfovascular en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5e, f). Además, el grupo EcN glyA KO también mostró una puntuación alta para el grado tumoral y la invasión de la mucosa en comparación con el grupo EcN WT (Figura 5g, h). El análisis de LCN-2 fecal confirmó que la inflamación crónica no se resolvió en ninguno de los dos grupos (Figura 3 del material suplementario). Un análisis de los niveles de proteína CAPN2 colónica mostró un aumento significativo en el grupo EcN glyA KO en comparación con el grupo EcN WT, lo que indica un aumento de la carga tumoral de CRC (Figura 5i). El análisis de E-caderina y MUC2 en las secciones de colon mostró un aumento significativo en el grupo EcN WT en comparación con el grupo EcN glyA KO, lo que sugiere que, en el contexto de la CRC, el ácido fólico puede mejorar la integridad del epitelio intestinal y la función de barrera (Figura 5j, k). En general, estos resultados sugieren que, si bien el ácido fólico microbiano es insuficiente para resolver la inflamación crónica, es suficiente para atenuar significativamente la progresión de la CRC in vivo al inducir la homeostasis del epitelio intestinal.

El ácido fólico microbiano suprime la progresión de la CRC sin una reestructuración importante de la microbiota intestinal

Para determinar si la producción de ácido fólico microbiano moldea la estructura general de la comunidad microbiana, realizamos un secuenciamiento de ARNr 16S en todos los modelos experimentales in vivo (Figura 6). En ratones WT, el análisis PCoA reveló que el estado de colonización alteró significativamente la diversidad β, con un pequeño cambio en la diversidad α, lo que indica que la producción de ácido fólico microbiano es un determinante clave del ensamblaje de la comunidad en un entorno homeostático (Figura 6a-c). Las abundancias taxonómicas a nivel de filo y clase, y el análisis LEfSe, no reflejaron enriquecimientos distintos asociados a la salud o a la enfermedad en ninguno de los dos grupos, lo que sugiere que el ácido fólico ejerce de forma independiente efectos beneficiosos sobre la homeostasis intestinal y la integridad de la barrera (Figura 6d-f). Curiosamente, los ratones IL10KO colonizados con EcN glyA KO exhibieron una diversidad α significativamente mayor en comparación con los controles EcN WT, lo que probablemente refleja la expansión de taxones oportunistas (Figura 6g-i). Las abundancias taxonómicas a nivel de filo y clase, y el análisis LEfSe, confirmaron que la colonización con la cepa EcN glyA KO deficiente en ácido fólico impulsa la microbiota hacia un estado alterado, caracterizado por cambios taxonómicos específicos que están ausentes en los modelos colonizados con EcN WT o sanos (Figura 6j-l). Sorprendentemente, en el modelo de CRC inducido por AOM, no observamos diferencias significativas en la diversidad α o β entre los grupos EcN WT y EcN glyA KO, lo que se refleja aún más en las abundancias a nivel de filo y clase, y en el análisis LEfSe (Figura 6m-r). Esto sugiere que, en el contexto de la tumorigénesis inducida químicamente, los efectos antineoplásicos protectores del ácido fólico son intrínsecos a la actividad de señalización del metabolito en lugar de ser una consecuencia secundaria de la remodelación de la microbiota a nivel de la comunidad.

Discusión

Este estudio identifica un papel previamente no caracterizado del ácido fólico microbiano como un metabolito endógeno que suprime activamente la progresión del cáncer colorrectal (CRC). Mostramos que las bacterias productoras de ácido fólico están disminuidas en los modelos de ratón de CRC asociado a colitis y en las cohortes metagenómicas clínicas humanas con una gravedad de la enfermedad en aumento. Nuestros ensayos in vitro utilizando células HT29 muestran que el tratamiento con ácido fólico disminuye la metástasis, lo que se media a través de la inhibición de la calpaína-2. La administración de un solo microorganismo, EcN de tipo salvaje, que puede producir ácido fólico, mejoró la homeostasis del epitelio y la mucosa y la tumorigénesis en el colon en comparación con la cepa EcN glyA KO. Si bien se ha documentado previamente que EcN mejora los resultados de la CRC, nuestros hallazgos demuestran que su eficacia protectora se atenúa drásticamente cuando su capacidad para producir ácido fólico se elimina genéticamente mediante la deleción de glyA.

La utilidad clínica del ácido fólico está bien establecida; debido a su estabilidad química y farmacocinética, es el folato de elección para la quimioterapia adyuvante, donde estabiliza la unión de 5-fluorouracilo (5-FU) con la timidilato sintasa^[41],^[42]. Sin embargo, esta mayor potencia a menudo se acompaña de graves efectos secundarios gastrointestinales, que incluyen inflamación, daño, resistencia a los fármacos y disbiosis intestinal^[43]. Debido a que estos resultados suelen ocurrir en pacientes que reciben co-terapias altamente citotóxicas (por ejemplo, fluoropirimidina, metotrexato), históricamente ha sido difícil determinar si el ácido fólico es causal o correlativo con estos resultados. No hay informes sobre los efectos de la producción de folato por parte de la microbiota en la terapéutica y los resultados de la CRC. Nuestros datos sugieren un cambio de paradigma, en el que el aumento de las concentraciones locales de ácido fólico en el colon mediante la producción microbiana dirigida puede proporcionar beneficios terapéuticos al tiempo que se evitan la toxicidad sistémica asociada con la suplementación farmacológica en dosis altas. Nuestros hallazgos también destacan el papel de la calpaína-2 (CAPN2) en esta vía. Demostramos que el ácido fólico suprime la metástasis de la CRC al inhibir la CAPN2, una cisteína proteasa intracelular conocida por promover la progresión tumoral y la resistencia a la terapia en numerosos cánceres, incluidos el cáncer de pulmón, mama, páncreas y colon^[44]-^[46]. Si bien se ha demostrado que la inhibición farmacológica dirigida de la CAPN2 atenúa el crecimiento tumoral y reduce la metástasis^[47], la expresión ubicua de la CAPN2 en los tejidos de los mamíferos a menudo conduce a efectos adversos no dirigidos. Al aprovechar la microbiota intestinal como un biorreactor localizado, podemos lograr los efectos antimetastásicos de la inhibición de la CAPN2 con mayor precisión.

El folato no puede ser sintetizado naturalmente por los humanos y debe obtenerse a través de la dieta, la suplementación o la producción microbiana^[48]. Nuestro estudio subraya la importancia de la microbiota en esta cadena de suministro metabólica, ya que las dietas deficientes en folato pueden exacerbar la progresión de la CRC al limitar las reservas de ácido fólico microbiano^[49]. En el futuro, la caracterización de los consorcios bacterianos precisos, como Lactiplantibacillus, Lactococcus, Bifidobacterium y Streptococcus, capaces de producir ácido fólico a altos niveles, será esencial para desarrollar terapias probióticas de próxima generación. La investigación futura también debería investigar si los perfiles de la microbiota específicos del paciente, en particular aquellos enriquecidos con cepas productoras de folato, se correlacionan con una mejor respuesta a la quimioterapia y una remisión a largo plazo de la CRC. Este estudio ofrece potencialmente un nuevo enfoque en la terapia del cáncer colorrectal al alterar la microbiota para producir metabolitos beneficiosos, como el ácido fólico, para mantener la integridad del epitelio y la mucosa en el huésped.

Métodos

Estudios en ratones

Se compraron ratones macho C57BL/6J (de 6 semanas de edad) y ratones macho y hembra C57BL/6J-Il10−/− (IL10KO) (de 11 a 16 semanas de edad; B6.129P2-Il10tm1Cgn/J) de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se criaron en el Servicio de Modelos de Investigación Biomédica (BRMS) de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los animales se transfieren al laboratorio de Chaudhari para los experimentos. Los ratones macho libres de gérmenes (de 6 a 8 semanas de edad) se obtuvieron del Centro Nacional de Recursos de Roedores Gnotobióticos (NGRRC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y se criaron en el Recurso Compartido Gnotobiótico (GSR) del BRMS de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los animales libres de gérmenes se mantuvieron en un ambiente controlado en aisladores gnotobióticos flexibles de plástico.

A cada ratón se le administró por vía oral 100 μL de EcN WT o glyA KO a 1010 UFC/mL diluido en 1x DPBS. Este tratamiento se repitió cada dos semanas durante todo el experimento.

Todos los animales se alojaron en instalaciones de animales con temperatura controlada, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con acceso libre a alimentos y agua. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes del sacrificio. Los tejidos y las muestras fecales se congelaron inmediatamente sobre hielo seco y se almacenaron a −80 °C hasta su posterior análisis. Para el suero, se dejó que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugó a 1000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.

Metabolómica del folato

Extracción de folato bacteriano:

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), se sembró en placas de caldo Luria (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 15 g/L de agar) a partir de cultivos de reserva al 25% en glicerol y se incubó aeróbicamente a 37 °C durante 16 a 18 horas. Para EcN glyA KO, se utilizaron placas LB con kanamicina (25 μg/mL). Se utilizaron colonias individuales para inocular tubos de cultivo de 10 mL que contenían 5 mL de caldo LB líquido. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C a 150 revoluciones por minuto (RPM), luego se subcultivaron en medios LB diluidos (1:9 LB:M9) hasta la fase logarítmica media (M9 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 5 g/L de NaCl y 1 mM de MgSO4).

Después de alcanzar la fase logarítmica media, los cultivos se centrifugaron a 4000 x g durante 5 minutos, se eliminó el medio y se pesaron los gránulos. Después de pesar, se utilizaron 200 μL de tampón de extracción bacteriana frío (20 mM de ácido ascórbico, 20 mM de BME, 50:50 de metanol y agua) para resuspender cada gránulo y se transfirió a un tubo de homogeneización con perlas de 2 mL (Fisher Scientific, 02681374) con perlas de vidrio (Bertin Technologies, P000928-LYSK0-A.0). Las muestras se homogeneizaron durante 1 minuto a 4 m/s (Bead Ruptor Elite, Omni International) antes de centrifugarse a 18200 x g durante 10 minutos a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un tubo de Eppendorf limpio de 1,5 mL. Las muestras se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos.

Después del secado, las muestras se resuspendieron en 200 μL de tampón de extracción de folato (20 mM de ácido ascórbico, 20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME, pH 8,1, ajustado con NaOH, preparado fresco) con estándares internos añadidos. Las muestras se mantuvieron en hielo a menos que se indique lo contrario. A cada muestra, se añadieron 5 μL de suero de rata agrupado (Santa Cruz Biotechnology, sc-45135) y la muestra se agitó brevemente para mezclar, antes de incubar a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, los tubos se almacenaron en hielo antes de hervirse a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos para eliminar los restos.

Los sobrenadantes se filtraron mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando una placa SPE de 96 pocillos con fase inversa polimérica Strata-X de 33 μm (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (acetato de amonio 20 mM y β-mercaptoetanol (BME) 20 mM) mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos después de cada adición de disolvente. Los sobrenadantes de las muestras se hicieron pasar a través de la columna y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se transfirieron a una placa limpia de 96 pocillos y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (metanol y agua 50:50, acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se transfirieron a viales para autosensor (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se adquirió de MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).### Extracción de folato de heces y ciego

El tejido del ciego congelado se cortó sobre hielo seco o se pesó un pellet fecal congelado por ratón para la extracción. Se utilizaron aproximadamente 20-50 mg de tejido para la extracción. La muestra se añadió a un tubo de homogeneización con microesferas de 2 mL (Fisher Scientific, 02681374) con microesferas de vidrio (Bertin Technologies, P000928-LYSK0-A.0). A continuación, se añadieron 200 μL (para muestras 50 mg) de tampón de extracción de folato (ácido ascórbico 20 mM, acetato de amonio 20 mM y β-mercaptoetanol (BME) 20 mM, pH 8,1, ajustado con hidróxido de sodio, preparado fresco) con estándares internos añadidos a cada muestra de tejido y se homogeneizó durante 1 minuto a 4 m/s (Bead Ruptor Elite, Omni International). Los homogeneizados se mantuvieron en hielo, a menos que se indique lo contrario. Los homogeneizados se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se añadió suero de rata agrupado (Santa Cruz Biotechnology, sc-45135), 5 μL (para muestras 50 mg), a cada muestra, seguido de una breve agitación para mezclar e incubación a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, los tubos se almacenaron en hielo antes de hervirlos a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos para sedimentar los restos. Los sobrenadantes se filtraron mediante SPE utilizando una placa SPE de 96 pocillos con fase inversa polimérica Strata-X de 33 μm (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Después de cada adición de disolvente, las muestras se hicieron pasar a través de la columna mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos. Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM, pH 8,1). El sobrenadante de la muestra se hizo pasar a través de la columna y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se transfirieron a una placa limpia de 96 pocillos y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (metanol y agua 50:50, acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se transfirieron a viales para autosensor (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se adquirió de MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).### LC-MS

La metabolómica por LC-MS se realizó utilizando un sistema de LC ultraalto rendimiento Vanquish (Thermo Scientific) acoplado a un instrumento de espectrometría de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Scientific). La cromatografía se realizó utilizando una columna de fase inversa polar C18 (Phenomenex, 00D-4748-AN; Luna Omega Polar C18, tamaño de partícula de 1,6 μm, columna de 2,1 × 100 mm). La cámara de la columna y el precalentador se ajustaron a 40 °C. El disolvente A fue 95% de H2O y 5% de metanol con 5 mM de DMHA (Acros Organics, 314740250) pH 8,1, ajustado con ácido fórmico. El disolvente B fue 100% de metanol con 5 mM de DMHA. Todos los disolventes fueron de grado LC-MS y se adquirieron de Fisher Chemical (Thermo Scientific, CAS 67-56-1). El tiempo total de ejecución fue de 12 minutos. El caudal se mantuvo constante a 0,4 mL/min. El gradiente cromatográfico fue el siguiente: 5% de disolvente B durante 0,5 minutos, aumento lineal al 85% de B durante 5,2 minutos, aumento al 100% de B durante 1,3 minutos y disminución al 5% para equilibrar la columna durante 4 minutos. El efluente de la columna se analizó por espectrometría de masas desde el inicio de la ejecución hasta los 5 minutos, después de lo cual el flujo se dirigió al desecho durante el resto de la ejecución. La ionización se realizó utilizando una fuente HESI en modo negativo a 2500 V. El flujo de gas nitrógeno se ajustó a 50 (envoltura), 10 (auxiliar) y 1 (barrido) en unidades arbitrarias. El tubo de transferencia de iones se mantuvo a 325 °C con el vaporizador a 350 °C. La cuantificación se realizó utilizando Freestyle versión 1.8.65.0 (Thermo Fisher) y MAVEN78 versión 2.10.21 para identificar y calcular las áreas de los picos integrados. La curación manual confirmó la identificación de los picos y los parámetros. Todas las señales se normalizaron a los estándares internos (metotrexato, ácido fólico-d2) para la variación de la inyección. La identificación de folatos sin estándares disponibles se realizó utilizando SIRIUS versión 6.3.3 y comparaciones con resultados publicados anteriormente.### Recuento de glyA

Los datos metagenómicos se descargaron de NCBI. La calidad de las secuencias de la muestra de cada conjunto de datos se comprobó con FastQC. Ninguno de los conjuntos de datos seleccionados mostró problemas significativos de control de calidad. Los metagenomas se ensamblaron utilizando SPAdes en modo metagenómico. A continuación, se utilizó bowtie2 para alinear las lecturas a los metagenomas ensamblados. Se ejecutó Bowtie-build para construir una referencia para el metagenoma, seguido de bowtie2. Se utilizó Samtools para convertir el archivo bam resultante en un archivo sam. Se utilizaron las herramientas de Picard para identificar las lecturas duplicadas. Se utilizó Prokka para anotar los genomas. Se ejecutó Prokka con el metagenoma y las opciones compatibles. A continuación, se utilizó un script de bash para procesar la salida de Prokka para eliminar las líneas que contienen "#" y luego conservar solo las líneas con "ID=". Cualquier metagenoma que resultara en errores al ejecutar cualquiera de estos programas se descartó del análisis futuro.

Se utilizó un script personalizado, htseqcount.py, para aplicar HTSeq y determinar el número de recuentos asignados a cada gen. Se utilizó un segundo script personalizado, comparegene_abudnaces.py, para determinar los recuentos asignados al gen de interés divididos por el número total de lecturas asignadas a un gen. Este recuento normalizado se utilizó para comparar la abundancia del gen de interés en las muestras metagenómicas con el estado de la enfermedad determinado por los metadatos del estudio original.### Alineamiento de la secuencia de SHMT

Para examinar la similitud de la secuencia de la proteína SHMT en 119 especies bacterianas intestinales (hCom2)^[24], se utilizó SHMT de E. coli (número de acceso UniProt: NP_417046.1) como consulta para las búsquedas de proteínas con BLAST (BLASTP) utilizando NCBI BLAST contra la base de datos de proteínas RefSeq Select. El tamaño de la palabra se estableció en 6 y se aplicaron los parámetros de puntuación predeterminados. Para cada especie bacteriana, se seleccionó el mejor resultado en función del valor E (valor de expectativa) más bajo y se utilizó la puntuación de alineamiento máxima correspondiente para el análisis comparativo y la visualización en un mapa de calor.### Secuenciación de ARNr 16S

La secuenciación del gen de ARNr 16S se realizó por Zymo Research (Irvine, CA) utilizando el Servicio de secuenciación dirigida ZymoBIOMICS®. El ADN genómico se extrajo utilizando el Kit de ADN ZymoBIOMICS®-96 MagBead o el Kit de mini-preparación de ADN ZymoBIOMICS® según los protocolos del fabricante. La región V3-V4 del gen de ARNr 16S bacteriano se amplificó y se prepararon las bibliotecas utilizando el Kit de preparación de bibliotecas NGS Quick-16S™ (Zymo Research). Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq (kit de 600 ciclos). Los variantes de secuencia de amplicones (ASV) se infirieron utilizando la canalización DADA2 (Callahan et al.^[50]) y las secuencias quiméricas se eliminaron durante el procesamiento. La asignación taxonómica y los análisis de diversidad se realizaron utilizando QIIME v1.9.1 (Caporaso et al.^[51]) con la base de datos de referencia de Zymo Research.### Ensayos in vitro

Las células HT29 (ATCC HTB-38, EE. UU.) se sembraron a una densidad de 2,0 × 106 células por frasco de 75 cm2. Las células se cultivaron en frascos de cultivo celular a 37 °C, 5% de CO2. Las células se subcultivaron a una confluencia de ~90% (~6 días) con una solución de 0,25% de tripsina y 0,02% de EDTA. El DMEM (GenClone, 25-500) se suplementó con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina y estreptomicina (medio completo).

Ensayo de UFC

Se sembraron células HT29 a 100 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con 25 μM de ácido folínico en DMSO o 0,5% de DMSO y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 7 días, cambiando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Se lavaron suavemente las células con 1 mL de DPBS 1x, se añadió 1 mL de cristal violeta al 0,1% en 20% de metanol por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se lavó suavemente 3 veces con 1x DPBS. Las UFC se visualizaron utilizando un sistema de imagen iBright (Invitrogen). El volumen/área de cada colonia se calculó a partir de la tabla de datos de análisis de recuento de colonias generada por el instrumento iBright utilizando la configuración Universal, Visible Crystal Violet.### Inmunocitoquímica

Las células HT29 se sembraron a 40 000 células/pocillo en 100 μL en placas de vidrio de 96 pocillos (Cellvis, NC0536760) y se trataron con 25 μM de ácido folínico en DMSO o 0,5% de DMSO durante 10 días, cambiando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Las células se lavaron tres veces con PBS 1x y se bloquearon en PBS que contiene 4% de suero de burro (GeneTex, GTX27475) y 0,3% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C con agitación suave. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces en PBS (5 minutos por lavado) a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo diluidos en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después de lavar con PBS, los núcleos se tiñeron con DAPI (1:3000 en PBS) durante 5 minutos. Las células se lavaron de nuevo con PBS antes de la imagen. Las imágenes se adquirieron utilizando conjuntos de filtros apropiados en un microscopio confocal Nikon A1R+ en la Instalación de bioquímica óptica (BOC) de la UW-Madison. El anticuerpo primario utilizado para la tinción de inmunocitoquímica por fluorescencia fue E-caderina (1:1000; Cell Signaling Technology). Se utilizó IgG de conejo (H+L) conjugada con Alexa Fluor™ 488 (1:500, Thermo Fisher) como anticuerpo secundario.### Análisis de Western blot

Se lisaron tejidos de colon de ratón (~30 mg) o células HT29 en 100-200 μL de tampón de lisis celular 1x frío (Cell Signaling Technology) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). El tejido se homogeneizó utilizando un Bead Ruptor Elite (Omni International, Kennesaw, GA). Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 10 min a 4°C, y se recogieron los sobrenadantes. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de Bradford (Thermo Scientific) con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Las proteínas se mezclaron con un tampón de carga 4x suplementado con β-mercaptoetanol, se hirvieron a 100°C durante 10 min y se separaron en geles Bis-Tris SDS-PAGE prefabricados (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF utilizando transferencia en húmedo a 30 V durante 1 h. Las membranas se bloquearon en el tampón de bloqueo StartingBlock™ (Thermo Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en 5% de BSA en TBS-T durante la noche a 4°C. Después del lavado con TBS-T, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP diluidos en 5% de BSA en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Las tiras se revelaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Scientific). Las imágenes de las tiras se obtuvieron del sistema de imagen iBright (Invitrogen). Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el sistema de imagen iBright (Invitrogen) con detección automática de bandas y se normalizaron a la proteína total. Los anticuerpos primarios utilizados para el western blot son: E-caderina (1:1000; Cell Signaling Technology) y Calpaína-2 (1:1000; Cell Signaling Technology). Se utilizó IgG-HRP anti-ratón (1:5000; Santa Cruz) como anticuerpo secundario.

Ensayos de transwell

Las células HT29 se sembraron en insertos de tamaño de poro de 8,0 μm en placas de 24 pocillos (Costar 3422) a una densidad de 50.000 células en 200 μL de medio libre de suero en el lado apical y 500 μL de medio completo en el lado basolateral. Las células se trataron inmediatamente con 25 μM de ácido fólico (FA) en DMSO o 0,5% de DMSO. Los medios basolaterales y apicales con FA o DMSO se cambiaron cada 3-4 días. Después del tratamiento, los insertos de transwell se retiraron y se transfirieron a una nueva placa de 24 pocillos. Las células se lavaron suavemente x 1 con 1x DPBS y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 20% de metanol en el lado basolateral, como se describió anteriormente. Las células apicales adheridas al inserto de transwell se fijaron con 10% de formaldehído tamponado neutro, se lavaron 3 veces con 1x PBS y se tiñeron con E-caderina y DAPI como se describió anteriormente.

Para generar suficientes células mesenquimales para sembrar en nuevas placas de transwell, las células HT29 se sembraron en insertos de tamaño de poro de 8 μm en placas de 6 pocillos (Costar 3428) a una densidad de 200.000 células por inserto en 1 mL de medio libre de suero y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante ~12 días. Cuando suficientes células migraron y formaron colonias en el lado basolateral, las células mesenquimales se transfirieron a nuevas placas de transwell (Costar 3422) y se trataron con 25 μM de ácido fólico (FA) en DMSO o 0,5% de DMSO, como se describió anteriormente.

Microscopía electrónica

Las células HT29 en transwells se fijaron en un fijador de Karnovsky modificado (2,5% de glutaraldehído/2,0% de formaldehído en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (PB), pH=7,2), se postfijaron en 1,0% de óxido de osmio en 0,1 M de PB, se deshidrataron en una serie de etanol, se transicionaron en acetona y se incluyeron en Embed 812 (EMS, Morgantown, PA). Las muestras polimerizadas se seccionaron (80 nm) en un ultramicrotomo y las secciones se colocaron en rejillas de 2x1 de Cu recubiertas con formvar y se postcolorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones se observaron a 80 kV en un TEM FEI CM120 y se obtuvieron imágenes en una cámara digital AMT (Danvers, MA) BioSprint12.

Proteómica de interacción con el objetivo

Alteración integral de la solubilidad del proteoma basada en lisado

Los gránulos de células HT29 congeladas se descongelaron sobre hielo y se resuspendieron en tampón de lisis (1 X PBS pH 7,4, 1 mM MgCl2, inhibidor de proteasas). Los proteomas se extrajeron utilizando un homogeneizador dounce (20 golpes). Los extractos se centrifugaron a 300 x g durante 3 min para eliminar cualquier célula no rota. El extracto crudo resultante se diluyó a 2 mg/mL en tampón de lisis. Cada compuesto se añadió al tampón de lisis a una concentración de 2 X. Para iniciar el experimento, se combinó un volumen igual de extracto crudo y tampón de tratamiento, para obtener una concentración final de proteína de 1 mg/mL y una concentración de compuesto de 10 μM, y se incubó durante 30 min. Después de la incubación, un volumen igual de cada muestra se transfirió a 10 tubos de PCR. Los tubos de PCR se calentaron a través de un gradiente térmico que oscilaba entre 48°C y 58°C durante 3 min para inducir la desnaturalización térmica. Un volumen igual de cada tubo de PCR se agrupó. Se añadió un volumen igual de tampón de extracción (1 X PBS pH 7,4, 1% NP-40, inhibidores de proteasas) a cada muestra agrupada para obtener una concentración final de NP-40 del 0,5%. Las muestras se incubaron durante 10 min a 4°C en un agitador rotatorio. Las muestras extraídas se centrifugaron a 21.000 x g durante 90 min para separar los agregados insolubles de la proteína soluble. Se recogió un volumen igual de cada fracción soluble y se preparó para el análisis LC-MS/MS.

Preparación de muestras para LC-MS/MS

Las muestras (15-20 μg de proteína) se diluyeron en tampón de preparación (400 mM EPPS pH 8,5, 1% SDS, 10 mM tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió yodoacetamida a una concentración final de 10 mM a cada muestra y se incubó durante 25 min en la oscuridad. Finalmente, se añadió DTT a cada muestra a una concentración final de 10 mM. Se realizó un intercambio de tampón utilizando un protocolo SP3 modificado^[52]. Brevemente, se añadieron ~250 μg de cada partícula SpeedBead Magnetic Carboxylate modificada (Cytiva; 45152105050250, 65152105050250) en una proporción de 1:1 a cada muestra. Se añadió etanol al 100% a cada muestra para obtener una concentración final de etanol de al menos el 50%. Las muestras se incubaron con agitación suave durante 15 min. Las muestras se lavaron tres veces con etanol al 80%. La proteína se eluyó de las cuentas SP3 utilizando 200 mM EPPS pH 8,5 que contenía tripsina (ThermoFisher Scientific) y Lys-C (Wako). Las muestras se digirieron durante la noche a 37°C con agitación vigorosa. Se añadió acetonitrilo a cada muestra para obtener una concentración final del 30%. Cada muestra se etiquetó, en presencia de las cuentas SP3, con ~65 μg de reactivos TMTpro-16plex^[53],^[54] (ThermoFisher Scientific). Los diseños experimentales para cada experimento se describieron en las tablas de datos fuente correspondientes. Tras la confirmación de un etiquetado satisfactorio (>97%), se eliminaron los reactivos TMTpro en exceso mediante la adición de hidroxilamina a una concentración final de 0,3%. El volumen total de cada muestra se agrupó y el acetonitrilo se eliminó por centrifugación al vacío durante una hora. La muestra agrupada se acidificó utilizando ácido fórmico y los péptidos se desalaron utilizando una cartucha Sep-Pak Vac 50 mg tC18 (Waters). Los péptidos se eluyeron en 70% de acetonitrilo, 1% de ácido fórmico y se secaron por centrifugación al vacío. Los péptidos se resuspendieron en 10 mM de bicarbonato de amonio pH 8, 5% de acetonitrilo y se fraccionaron por HPLC de fase inversa a pH básico. En total, se recogieron 24 fracciones. Las fracciones se secaron en un centrífugo al vacío, se resuspendieron en 5% de acetonitrilo, 1% de ácido fórmico y se desalaron mediante una etapa de punta. Finalmente, 12 de las 24 fracciones se analizaron por LC-MS/MS.

Adquisición de datos de espectrometría de masas

Los datos se recogieron en un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse (ThermoFisher Scientific) acoplado a una bomba de LC Proxeon EASY-nLC 1000 (ThermoFisher Scientific). Los péptidos se separaron utilizando un gradiente de 120 min a 500 nL/min en una columna de 30 cm (diámetro interno de 100 μm, Accucore, 2,6 μm, 150 Å) empaquetada en el laboratorio. La espectrometría de movilidad iónica de forma de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) se habilitó durante la adquisición de datos con voltajes de compensación (CV) establecidos en -40 V, -60 V y -80 V. Los datos MS1 se recogieron utilizando el Orbitrap (resolución de 60.000; tiempo de inyección máximo de 50 ms; AGC 4 × 105). Se requirieron estados de carga determinados entre 2 y 6 para la secuenciación, y se utilizó una ventana de exclusión dinámica de 60 s. El modo dependiente de datos se estableció como tiempo de ciclo (1 s). Los escaneos MS2 se realizaron en el Orbitrap con fragmentación HCD (ventana de aislamiento de 0,5 Da; resolución de 50.000; NCE 36%; tiempo de inyección máximo de 86 ms; AGC 1 × 105).

Análisis de datos de espectrometría de masas

Los archivos brutos se convirtieron primero a mzXML y los picos monoisotópicos se reasignaron utilizando Monocle. La búsqueda de la base de datos incluyó todas las entradas humanas de Uniprot (descargadas en febrero de 2020). La base de datos se concatenó con una compuesta por todas las secuencias de proteínas en orden inverso. También se añadieron las secuencias de las proteínas contaminantes comunes (por ejemplo, tripsina, queratinas, etc.). Las búsquedas se realizaron utilizando el algoritmo de búsqueda Comet. Las búsquedas se realizaron utilizando una tolerancia de masa de 50 ppm para los iones precursores y una tolerancia de masa de 0,02 Da para los iones producto.

Los ajustes de espectro-péptido (PSM) se ajustaron a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1%. El filtrado de PSM se realizó utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) como se describió anteriormente^[55] considerando los siguientes parámetros: registro de expectativa de cometa, diferencia de secuencia delta de registro de expectativa de cometa (porcentaje de diferencia entre el primer éxito y el siguiente éxito con una secuencia de péptido diferente), fallos de escisión, longitud del péptido, estado de carga, precisión de la masa del precursor y fracción de iones coincidentes. Cada ejecución se filtró por separado. La FDR a nivel de proteína se estimó posteriormente a nivel de conjunto de datos. Para cada proteína en todas las muestras, las probabilidades posteriores informadas por el modelo LDA para cada péptido se multiplicaron para obtener una estimación de probabilidad a nivel de proteína. Utilizando el método Picked FDR^[56], las proteínas se filtraron al nivel objetivo de FDR del 1%.

Para la cuantificación de iones reporteros, se escaneó una ventana de 0,003 Da alrededor del m/z teórico de cada ion reportero y se utilizó el m/z más intenso. Las intensidades de los iones reporteros se ajustaron para corregir las impurezas isotópicas de los diferentes reactivos TMTpro según las especificaciones del fabricante. Los péptidos se filtraron para incluir solo aquellos con una relación señal-ruido (SN) sumada de 160 o más en todos los canales. Para cada proteína, los valores de SN de TMTpro de los péptidos filtrados se sumaron para generar la cuantificación de proteínas.

Expresión y purificación de la proteína CAPN2

Se generó un plásmido pET-28a que expresa la subunidad catalítica de CAPN2 por Craig Bingman en el Core de Cristalografía de Bioquímica de la Universidad de Wisconsin-Madison y se transformó en células KRK (Promega, Madison WI). Se inoculó una colonia única de células KRK que expresan CAPN2 recombinante con una etiqueta 6xHis N-terminal en el plásmido pET-28a en 5 mL de LB con kanamicina y se cultivó durante la noche a 37°C con agitación. Al día siguiente, se expandieron 2 mL de cultivo a 50 mL y se indujo la expresión de proteínas con 0,2 mM de IPTG y 10 mM de ramnosa. La cultura se cultivó a 37°C durante la noche con agitación. Al día siguiente, se retiraron 1 mL de cultivo para evaluar la expresión de proteínas. Tanto la alícuota de 1 mL como los 49 mL restantes de cultivo se centrifugaron a 8000 x g durante 15 min. Los gránulos de los 49 mL se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80°C a la espera de la confirmación de la expresión de proteínas.

Los gránulos de 1 mL se resuspendieron en 100 μL de tampón de lisis y se sometieron a sonicación en 3 ciclos de 15 segundos, con intervalos de 1 minuto sobre hielo entre los ciclos. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 8000 x g durante 5 minutos. Se mezclaron 20 μL de lisado con 6 μL de tampón de muestra de Laemmli que contenía el agente reductor de muestras NuPAGE (Thermo Fisher) y se hirvieron a 100 °C durante 5 minutos. Todo el volumen de la muestra se sometió a análisis de western blot para confirmar la expresión de la proteína. Las membranas se incubaron con anticuerpo primario anti-His de ratón (Proteintech, 66005-1-Ig) durante la noche a 4 °C, seguido de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Invitrogen, 62-6520) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se reveló con el reactivo ECL y se visualizó en el sistema de imagen iBright CL1500.

Tras la confirmación de la expresión de la proteína a partir de la cultura de 1 mL, el resto del gránulo congelado de 49 mL se descongeló y se lisó mediante sonicación en 5 mL de tampón de lisis, según se describe anteriormente. El lisado celular se aclaró mediante centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos. El lisado aclarado se incubó con 1 mL de resina de purificación de His-Tag cOmplete™ (Roche) (50% de suspensión en tampón de lavado IMAC) durante 1 hora a 4 °C en un agitador de tubos. La mezcla se drenó a través de columnas de flujo por gravedad y la resina se lavó dos veces con 10 mL de tampón de lavado IMAC y se incubó con 1 mL de tampón de elución IMAC durante 5 minutos antes de la elución. La proteína eluida se mezcló inmediatamente con 10 μL de solución quelante de Mg:EDTA para evitar la autolisis. La expresión de la proteína se validó utilizando el reactivo de etiquetado No-Stain (Invitrogen, A44717), según se describe anteriormente.

Antes del ensayo de unión a 5-f-THF y la cuantificación de proteínas, el eluato se intercambió a un tampón de equilibrio IMAC utilizando un filtro centrífugo Amicon® Ultra (10 kDa MWCO, Millipore, UFC801008), con ocho ciclos de dilución/concentración en 5 mL de tampón de equilibrio IMAC, para reducir la cantidad de Mg:EDTA e imidazol que podrían interferir con estos pasos.

Ensayos de unión a CAPN2

Se utilizó la subunidad catalítica purificada de CAPN2 (100 mg/mL) en cada réplica del ensayo de unión en 100 μL de tampón de unión (25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,01% Triton X-100, 5% glicerol, 1 mM DTT, 0,2% ácido ascórbico, pH 7,25). CAPN2 se incubó con concentraciones equimolares de folatos (10 μM) a 37 °C durante 30 minutos. La proteína se purificó utilizando la purificación IMAC, según se describe anteriormente, y se sometió a análisis metabolómico de folatos para la cuantificación de folatos. Para el ensayo de desplazamiento de CAPN2, la proteína purificada se incubó con concentraciones crecientes de ácido folínico a 37 °C durante 30 minutos en tampón de unión. La proteína unida se purificó utilizando la purificación IMAC, seguida de la incubación con 100 nM de CAPN2i a 37 °C durante 30 minutos en tampón de unión. El ácido folínico desplazado se separó de la proteína utilizando la purificación IMAC y se midió utilizando la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para el análisis metabolómico de folatos.

Generación de la línea celular CAPN2KO

Se utilizó un kit de desactivación de genes (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.) que contenía tres ARNg sintetizados químicamente (secuencias espaciadoras: AGTTCTGGCAATACGGCGAG, GAGCAGCTCCCCGTCCTTGG, GGCGTATGCCTTCTCCAGCA) dirigidos al gen CAPN2 y una proteína recombinante de nucleasa SpCas9 (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.). Se utilizó el sistema de transfección Neon (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) para electroporar los ARNg complejos con SpCas9 en las células HT29. Después de 72 horas, se extrajo el ADN genómico utilizando la solución de extracción de ADN QuickExtract™ (LGC Genomics LLC, Alexandria, MN, EE. UU.). El gen CAPN2 se amplificó utilizando cebadores (IDT, Coralville, IA, EE. UU.). La edición del gen CCR5 se midió utilizando la secuenciación de Sanger analizada con el software ICE Analysis (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.) para confirmar la desactivación del gen.

Generación de la línea celular CAPN2OE

La línea celular CAPN2OE se generó según se describe previamente^[29]. Brevemente, las células HT29 se incubaron con 1 nM de SN-38 (Sigma, H0165) durante 24 horas en un medio DMEM completo, seguido de la recuperación en un tampón sin fármaco durante aproximadamente 2 semanas. La dosis del fármaco se duplicó en cada exposición consecutiva, hasta que se obtuvieron células resistentes que podían dividirse en 60 μM de SN-38. Las células se dejaron recuperarse en un medio DMEM completo durante 2 semanas antes de su uso en cualquier experimento.

Eliminación del gen glyA de E. coli Nissle y cuantificación in vivo

Se utilizó el sistema de recombinación lambda red para eliminar el gen glyA de EcN utilizando un método descrito previamente^[34] con los siguientes oligonucleótidos: 5’ – GCTAAAGCTTTTAAGAAGGAGATATACATATGTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCG – 3’ y 5’ – GCTATCTAGATTATGCGTAAACCGGGTAACGTGC – 3’. La cuantificación in vivo de EcN se realizó en muestras fecales utilizando cebadores específicos de EcN: (5’ – ATACTACGACGGTAAATGGT – 3’ y 5’ - TACATCAGTATCGGTAGCAT – 3’); y se normalizó a los cebadores bacterianos 16S (5’ – TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA – 3’; y 5′ – AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT – 3’). Las muestras fecales pre y post-colonización se pesaron y se diluyeron en PBS 1x a una concentración de 5 mg/mL y 0,5 mg/mL. Se realizó una qPCR en estas muestras por triplicado utilizando el SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) y se ejecutó en el QuantStudio (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizaron cebadores (IDT, Coralville, IA, EE. UU.) que amplifican el gen EcN fimA para medir la cantidad de EcN en las heces. Se utilizaron cebadores que amplifican el gen 16S para medir la cantidad de todas las bacterias en las heces.

Tinción con hematoxilina y eosina e inmunofluorescencia

Los tejidos del colon fijados en formalina y embebidos en parafina se seccionaron con un grosor de 2-5 μm y se secaron a 65 °C durante 25 minutos antes de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), E-caderina o mucina 2 (MUC2) utilizando el tinte automático Leica ST5010 (Leica Biosystems) según el protocolo del Laboratorio de Patología Experimental de Animales de la UWCC. Las secciones de H&E se trataron secuencialmente con xileno, etanol graduado, hematoxilina MX 560, Define MX, tampón azul 8 y eosina 515 tricrómica, seguido de la deshidratación con etanol y la aclaración en xileno. Las láminas de E-caderina y MUC2 se sometieron a HIER (recuperación del epítopo inducida por calor) en solución de Tris-EDTA pH 9,0 (10 mM de base de Tris, 1 mM de EDTA, 0,05% de Tween 20) durante 3 minutos en la cámara de desnaturalización (Biocare Medical, Concord, CA). Las láminas se enfriaron durante 20 minutos, se lavaron en PBS 1x y se bloquearon con suero de cabra al 10% (Sigma, St. Louis, MO) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la incubación con anticuerpo primario en PBS con 1% de suero de cabra y 0,1% de Triton X-100 a 1:200 durante la noche a 4 °C. Las láminas se lavaron 3 veces con PBS 1x y se incubaron con Alexafluor Goat anti-rabbit 488 a 1:1000 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación secundaria, las láminas se lavaron 3 veces con PBS 1x, seguido de un lavado con agua destilada y se montaron con una cubierta utilizando Prolong Gold con DAPI (Thermo Fisher Scientific, P36931). Las imágenes se adquirieron con un microscopio Nikon iLas2 TIRF/STORM/Epifluorescencia y se midió la intensidad media de píxeles de cada tinción utilizando ImageJ.

Análisis histológico de H&E

La adquisición de imágenes y la codificación fueron realizadas por un investigador independiente y todos los análisis (longitud de las criptas, número de células caliciformes y % de área de inflamación) se realizaron de forma ciega. La longitud de las criptas y el número de células caliciformes por cripta se midieron utilizando el software QuPath v0.6.0. Se analizaron cinco criptas por ratón/imagen, midiendo la distancia desde la base de la cripta hasta la superficie luminal y el número de células caliciformes por cripta. El % de área de inflamación, analizando las mismas 5 criptas por ratón utilizadas para la longitud de las criptas y el número de células caliciformes, se cuantificó utilizando ImageJ. Se aplicó un umbral uniforme a la tinción de hematoxilina. Las células agrupadas se separaron utilizando la función de cuencas hidrográficas. El área de inflamación se cuantificó utilizando la función "Analizar partículas" con un umbral de tamaño de 0-infinito píxeles y un rango de circularidad de 0,00-1,00. El número de tumores, el grado, la invasión y los eventos de invasión linfovascular se puntuaron según las pautas publicadas de forma ciega^[57],^[58].

Análisis de lipocalina-2 fecal

Los niveles de lipocalina-2 fecal se cuantificaron utilizando un kit ELISA Mouse Lipocalin-2/NGAL DuoSet (R&D Systems, DY1857) según las instrucciones del fabricante. Las placas de pocillos de 96 pocillos de alta unión (Corning, 3590) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo de captura diluido en PBS. Las placas se lavaron con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 y se bloquearon con 1% de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras fecales se homogeneizaron en 300-500 μL de PBS que contenía 0,1% de Tween-20, se centrifugaron (18.200 x g, 10 min, 4 °C) y se recogió el sobrenadante para su análisis. Los sobrenadantes se diluyeron 5x-25x en diluyente de reactivo. Las muestras y los estándares se añadieron a la placa y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se aplicaron secuencialmente el anticuerpo de detección y la HRP-estreptavidina con pasos de lavado intermedios. La señal se desarrolló utilizando el sustrato TMB (R&D Systems, DY999B) y se detuvo con la solución de detención (R&D Systems, DY994). La absorbancia se midió a 450 nm con corrección de longitud de onda a 540 nm. Las concentraciones se calcularon a partir de la curva estándar.

Medición de la citocina IL-10 en suero

Se utilizó el panel de respuesta antiviral para ratón LEGENDplex™ con placa de fondo plano (BioLegend, 740622) para medir los niveles de citocina IL-10 en suero. Para los estándares, se añadieron 25 μL de matriz A a una placa de ensayo, seguido de la adición de 25 μL de soluciones de estándares diluidas en serie. Para las muestras de suero, se añadieron 25 μL de tampón de ensayo a la placa de ensayo, seguido de la adición de 25 μL de muestras de suero diluidas 4-8x. Se añadieron 25 μL de perlas mezcladas a cada pocillo y la placa se agitó a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de aspirar y lavar la placa, se añadieron 25 μL de anticuerpos de detección a la placa, seguido de agitación a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadieron 25 μL de SA-PE a cada pocillo, seguido de agitación a 3.000 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar y lavar la placa, las perlas de la placa se resuspendieron en 150 μL de tampón de lavado 1X mediante pipeteo y la placa se leyó en el citómetro de flujo Attune NxT en el Laboratorio de Citometría de Flujo del Centro Oncológico UW-Madison (UWCCC). Los datos se analizaron utilizando el software de análisis de datos LEGENDplex™ (BioLegend). Las poblaciones de perlas se distinguieron por FSC/SSC y la intensidad del tinte interno medida en el canal APC (670 nm), y las señales del reportero se cuantificaron en el canal PE (574 nm).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SEM para gráficos de barras y diagramas de dispersión, a menos que se especifique lo contrario. Los diagramas de violín muestran la distribución de los datos, con la línea central que indica la mediana y las líneas punteadas que representan todos los puntos de datos. Cada punto de datos representa una réplica biológica individual, a menos que se especifique lo contrario, según se define en las leyendas de las figuras. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Welch de dos colas no pareada. Para los datos que no se distribuyen normalmente, se aplicó la prueba de Mann-Whitney. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó ANOVA de una vía seguido de pruebas de comparación múltiple post hoc apropiadas. Cuando no se cumplieron los supuestos de normalidad, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizó un cálculo de potencia para determinar el número total de animales necesarios para cada estudio. Brevemente, se consideró un punto final dicotómico para dos grupos de estudio independientes con un error esperado en la media del 10% y una diferencia de al menos el 75%. Una tasa de falsos positivos del 10% y una tasa de falsos negativos del 20% (potencia) identificaron un tamaño de muestra de al menos n=4 para cada grupo de estudio. Se consideró que un valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo. Los valores de p exactos se informan en las figuras.

Gráficos

Las ilustraciones esquemáticas se crearon utilizando BioRender. Las estructuras químicas se generaron utilizando ChemDraw. Las estructuras de acoplamiento molecular y las visualizaciones estructurales se representaron utilizando PyMOL.

Estudios en ratones

Se adquirieron ratones macho C57BL/6J (de 6 semanas de edad) y ratones macho y hembra C57BL/6J-Il10−/− (IL10KO) (de 11 a 16 semanas de edad; B6.129P2-Il10tm1Cgn/J) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se criaron en las instalaciones de Modelos de Investigación Biomédica (BRMS) de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los animales se transfieren al laboratorio Chaudhari para los experimentos. Se obtuvieron ratones macho germófobos (de 6 a 8 semanas de edad) del Centro Nacional de Recursos de Roedores Gnotobióticos (NGRRC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y se criaron en las instalaciones de Recursos Compartidos Gnotobióticos (GSR) de BRMS de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los animales germófobos se mantuvieron en un ambiente controlado en aisladores gnotobióticos de película plástica flexible.

A cada ratón se le administró por vía oral 100 μL de EcN WT o glyA KO a 1010 UFC/mL diluidos en 1x DPBS. Este tratamiento se repitió cada dos semanas durante toda la duración de cada experimento.

Todos los animales se alojaron en instalaciones para animales con temperatura controlada, bajo un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, con acceso libre a alimentos y agua. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas antes del sacrificio. Los tejidos y las muestras fecales se congelaron rápidamente en hielo seco y se almacenaron a −80 °C hasta su posterior análisis. Para el suero, se permitió que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugó a 1000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison.

Metabolómica del folato

Extracción de folato bacteriano:

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), se sembró en placas de caldo Luria (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 15 g/L de agar) a partir de cultivos de glicerol al 25% y se incubó aeróbicamente a 37 °C durante 16 a 18 horas. Para EcN glyA KO, se utilizaron placas LB con kanamicina (25 μg/mL). Se utilizaron colonias individuales para inocular tubos de cultivo de 10 mL que contenían 5 mL de LB líquido. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C a 150 revoluciones por minuto (RPM) y luego se subcultivaron en medios LB diluidos (1:9 LB:M9) hasta la fase logarítmica media (M9 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 5 g/L de NaCl y 1 mM de MgSO4).

Después de alcanzar la fase logarítmica media, los cultivos se pelletizaron mediante centrifugación a 4000 x g durante 5 minutos, se eliminó el medio y se pesaron los pellets. Después de pesar, se utilizaron 200 μL de tampón de extracción bacteriana frío (20 mM de ácido ascórbico, 20 mM de BME, 50:50 de metanol y agua) para resuspender cada pellet y se transfirió a un tubo de homogeneización con perlas de 2 mL (Fisher Scientific, 02681374) con perlas de vidrio (Bertin Technologies, P000928-LYSK0-A.0). Las muestras se homogeneizaron durante 1 minuto a 4 m/s (Bead Ruptor Elite, Omni International) antes de ser centrifugadas a 18200 x g durante 10 minutos a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un tubo de Eppendorf limpio de 1,5 mL. Las muestras se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos.

Después del secado, las muestras se resuspendieron en 200 μL de tampón de extracción de folato (20 mM de ácido ascórbico, 20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME, pH 8,1, ajustado con NaOH, preparado fresco) con estándares internos añadidos. Los extractos se mantuvieron en hielo, a menos que se indique lo contrario. A cada muestra, se añadieron 5 μL de suero de rata agrupado (Santa Cruz Biotechnology, sc-45135) y la muestra se agitó brevemente para mezclar, antes de incubar a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, los tubos se almacenaron en hielo antes de hervirlos a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos para pelletizar los restos.

Los sobrenadantes se filtraron mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando una placa SPE polimérica de fase inversa Strata-X de 33 μm de 96 pocillos (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME) mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos después de cada adición de disolvente. Los sobrenadantes de la muestra se pasaron a través de la columna y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se colocaron en una placa de 96 pocillos limpia y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (50:50 de metanol y agua, 20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se transfirieron a viales para autosampler (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se compraron a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se compró a MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).

Extracción de folato fecal y cecal

El tejido cecal congelado se cortó sobre hielo seco o se pesó un pellet fecal congelado por ratón para la extracción. Se utilizaron aproximadamente 20-50 mg de tejido para la extracción. La muestra se añadió a un tubo de homogeneización con perlas de 2 mL (Fisher Scientific, 02681374) con perlas de vidrio (Bertin Technologies, P000928-LYSK0-A.0). Luego, se añadieron 200 μL (para muestras 50 mg) de tampón de extracción de folato (20 mM de ácido ascórbico, 20 mM de acetato de amonio y 20 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH 8,1, ajustado con hidróxido de sodio, preparado fresco) con estándares internos añadidos a cada muestra de tejido y se homogeneizó durante 1 minuto a 4 m/s (Bead Ruptor Elite, Omni International). Los homogeneizados se mantuvieron en hielo, a menos que se indique lo contrario. Los homogeneizados se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se añadieron 5 μL (para muestras 50 mg) de suero de rata agrupado (Santa Cruz Biotechnology, sc-45135) a cada muestra, seguido de una breve agitación para mezclar e incubar a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, los tubos se almacenaron en hielo antes de hervirlos a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos para pelletizar los restos. Los sobrenadantes se filtraron mediante SPE utilizando una placa SPE polimérica de fase inversa Strata-X de 33 μm de 96 pocillos (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Después de cada adición de disolvente, las muestras se pasaron a través de la columna mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos. Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME, pH 8,1). El sobrenadante de la muestra se pasó a través de la columna y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se colocaron en una placa de 96 pocillos limpia y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (50:50 de metanol y agua, 20 mM de acetato de amonio y 20 mM de BME). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se transfirieron a viales para autosampler (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se compraron a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se compró a MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).

LC-MS

La metabolómica por LC-MS se realizó utilizando un sistema de LC ultra de alto rendimiento Vanquish (Thermo Scientific) acoplado a un instrumento de espectrometría de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Scientific). La cromatografía se realizó utilizando una columna de fase inversa polar C18 (Phenomenex, 00D-4748-AN; Luna Omega Polar C18, tamaño de partícula de 1,6 μm, columna de 2,1 × 100 mm). La cámara de la columna y el precalentador se ajustaron a 40 °C. El disolvente A fue 95% de H2O y 5% de metanol con 5 mM de DMHA (Acros Organics, 314740250) pH 8,1, ajustado con ácido fórmico. El disolvente B fue 100% de metanol con 5 mM de DMHA. Todos los disolventes fueron de grado LC-MS comprados a Fisher Chemical (Thermo Scientific, CAS 67-56-1). El tiempo total de ejecución fue de 12 minutos. El caudal se mantuvo constante en 0,4 mL/min. El gradiente cromatográfico fue el siguiente: 5% de disolvente B durante 0,5 minutos, aumento lineal al 85% de B durante 5,2 minutos, aumento al 100% de B durante 1,3 minutos y disminución al 5% para equilibrar la columna durante 4 minutos. El efluente de la columna se analizó por espectrometría de masas desde el inicio de la ejecución hasta los 5 minutos, después de lo cual el flujo se dirigió al desecho durante el resto de la ejecución. La ionización se realizó utilizando una fuente HESI en modo negativo a 2500 V. El flujo de nitrógeno se ajustó a 50 (envoltura), 10 (auxiliar) y 1 (barrido) en unidades arbitrarias. El tubo de transferencia de iones se mantuvo a 325 °C con el vaporizador a 350 °C. La cuantificación se realizó utilizando Freestyle versión 1.8.65.0 (Thermo Fisher) y MAVEN78 versión 2.10.21 para identificar y calcular las áreas de los picos integrados. La curación manual confirmó la identificación de los picos y los parámetros. Todas las señales se normalizaron a los estándares internos (metotrexato, ácido fólico-d2) para la variación de la inyección. La identificación de folatos sin estándares disponibles se realizó utilizando SIRIUS versión 6.3.3 y comparaciones con resultados publicados anteriormente.

Los sobrenadantes se filtraron mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando una placa SPE de 96 pocillos con fase inversa polimérica Strata-X de 33 μm (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM) mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos después de cada adición de disolvente. Los sobrenadantes de las muestras se hicieron pasar a través de la columna, y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se trasladaron a una placa limpia de 96 pocillos, y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (metanol y agua 50:50, acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se trasladaron a viales para autosensor (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se adquirió de MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).

Extracción de folato de heces y ciego

El tejido del ciego congelado se cortó sobre hielo seco o se pesó un pellet fecal congelado por ratón para la extracción. Se utilizaron aproximadamente 20-50 mg de tejido para la extracción. La muestra se añadió a un tubo de homogeneización con microesferas de 2 mL (Fisher Scientific, 02681374) con microesferas de vidrio (Bertin Technologies, P000928-LYSK0-A.0). A continuación, se añadieron 200 μL (para muestras 50 mg) de tampón de extracción de folato (ácido ascórbico 20 mM, acetato de amonio 20 mM y β-mercaptoetanol (BME) 20 mM, pH 8,1, ajustado con hidróxido de sodio, preparado fresco) con estándares internos añadidos a cada muestra de tejido y se homogeneizó durante 1 minuto a 4 m/s (Bead Ruptor Elite, Omni International). Los homogeneizados se mantuvieron en hielo, a menos que se indique lo contrario. Los homogeneizados se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se añadió suero de rata agrupado (Santa Cruz Biotechnology, sc-45135), 5 μL (para muestras 50 mg), a cada muestra, seguido de una breve agitación para mezclar e incubación a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, los tubos se almacenaron en hielo antes de hervirlos a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 5 minutos para sedimentar los restos. Los sobrenadantes se filtraron mediante SPE utilizando una placa SPE de 96 pocillos con fase inversa polimérica Strata-X de 33 μm (Phenomenex, 8E-S100-AGB). Después de cada adición de disolvente, las muestras se hicieron pasar a través de la columna mediante centrifugación a 3000 x g durante 30 segundos. Los pocillos SPE se acondicionaron utilizando 200 μL de metanol y se equilibraron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión (acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM, pH 8,1). El sobrenadante de la muestra se hizo pasar a través de la columna y los pocillos se enjuagaron utilizando 200 μL de tampón de resuspensión. Las placas SPE se trasladaron a una placa limpia de 96 pocillos, y los metabolitos se eluyeron utilizando dos pasadas de 100 μL de tampón de elución (metanol y agua 50:50, acetato de amonio 20 mM y BME 20 mM). Las muestras eluidas se secaron en un SpeedVac (Thermo Scientific, Savant SPD120 y Savant UVS450) a 35 °C durante 90 minutos. Las muestras secas se resuspendieron en 40 μL de tampón de resuspensión y se trasladaron a viales para autosensor (Fisher Scientific, 3452232) para el análisis por LC-MS. El ácido ascórbico y el acetato de amonio para la extracción de folato se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, sc-202686 y sc-203818). El BME se adquirió de MP Biomedicals (MP Biomedicals, 190242). El agua para la extracción de folato se obtuvo de un sistema de purificación de agua GenPure Pro (Thermo Scientific, 50131948).

LC-MS

La metabolómica por LC-MS se realizó utilizando un sistema de LC ultraalto rendimiento Vanquish (Thermo Scientific) acoplado a un instrumento de espectrometría de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Scientific). La cromatografía se realizó utilizando una columna de fase inversa polar C18 (Phenomenex, 00D-4748-AN; Luna Omega Polar C18, tamaño de partícula de 1,6 μm, columna de 2,1 × 100 mm). La cámara de la columna y el precalentador se ajustaron a 40 °C. El disolvente A fue 95% de H2O y 5% de metanol con 5 mM de DMHA (Acros Organics, 314740250) pH 8,1, ajustado con ácido fórmico. El disolvente B fue 100% de metanol con 5 mM de DMHA. Todos los disolventes fueron de grado LC-MS y se adquirieron de Fisher Chemical (Thermo Scientific, CAS 67-56-1). El tiempo total de ejecución fue de 12 minutos. El caudal se mantuvo constante a 0,4 mL/min. El gradiente cromatográfico fue el siguiente: 5% de disolvente B durante 0,5 minutos, aumento lineal al 85% de B durante 5,2 minutos, aumento al 100% de B durante 1,3 minutos y disminución al 5% para equilibrar la columna durante 4 minutos. El efluente de la columna se analizó por espectrometría de masas desde el inicio de la ejecución hasta los 5 minutos, después de lo cual el flujo se dirigió al desecho durante el resto de la ejecución. La ionización se realizó utilizando una fuente HESI en modo negativo a 2500 V. El flujo de gas nitrógeno se ajustó a 50 (envoltura), 10 (auxiliar) y 1 (barrido) en unidades arbitrarias. El tubo de transferencia de iones se mantuvo a 325 °C con el vaporizador a 350 °C. La cuantificación se realizó utilizando Freestyle versión 1.8.65.0 (Thermo Fisher) y MAVEN78 versión 2.10.21 para identificar y calcular las áreas de los picos integrados. La curación manual confirmó la identificación de los picos y los parámetros. Todas las señales se normalizaron a los estándares internos (metotrexato, ácido fólico-d2) para la variación de la inyección. La identificación de los folatos sin estándares disponibles se realizó utilizando SIRIUS versión 6.3.3 y comparaciones con resultados publicados anteriormente.

Recuento de glyA

Los datos metagenómicos se descargaron de NCBI. La calidad de las secuencias de las muestras de cada conjunto de datos se comprobó con FastQC. Ninguno de los conjuntos de datos seleccionados mostró problemas significativos de control de calidad. Los metagenomas se ensamblaron utilizando SPAdes en modo metagenómico. A continuación, se utilizó bowtie2 para alinear las lecturas a los metagenomas ensamblados. Se ejecutó Bowtie-build para construir una referencia para el metagenoma, seguido de bowtie2. Se utilizó Samtools para convertir el archivo bam resultante en un archivo sam. Se utilizaron las herramientas de Picard para identificar las lecturas duplicadas. Se utilizó Prokka para anotar los genomas. Se ejecutó Prokka con el metagenoma y las opciones compatibles. A continuación, se utilizó un script bash para procesar la salida de Prokka para eliminar las líneas que contienen "#" y luego conservar solo las líneas con "ID=". Cualquier metagenoma que resultara en errores al ejecutar cualquiera de estos programas se descartó del análisis futuro.

Se utilizó un script personalizado, htseqcount.py, para aplicar HTSeq para determinar el número de recuentos asignados a cada gen. Se utilizó un segundo script personalizado, comparegene_abudnaces.py, para determinar los recuentos asignados al gen de interés divididos por el número total de lecturas asignadas a un gen. Este recuento normalizado se utilizó para comparar la abundancia del gen de interés en las muestras metagenómicas con el estado de la enfermedad determinado por los metadatos del estudio original.

Alineamiento de la secuencia de SHMT

Para examinar la similitud de la secuencia de la proteína SHMT en 119 especies bacterianas intestinales (hCom2)^[24], se utilizó SHMT de E. coli (número de acceso UniProt: NP_417046.1) como consulta para las búsquedas de proteínas con BLAST (BLASTP) utilizando NCBI BLAST contra la base de datos de proteínas RefSeq Select. El tamaño de la palabra se estableció en 6 y se aplicaron los parámetros de puntuación predeterminados. Para cada especie bacteriana, se seleccionó la mejor coincidencia en función del valor E más bajo (valor de expectativa), y la puntuación de alineamiento máxima correspondiente se utilizó para el análisis comparativo y la visualización en un mapa de calor.

Secuenciación del ARNr 16S

La secuenciación del gen del ARNr 16S se realizó por Zymo Research (Irvine, CA) utilizando el Servicio de secuenciación dirigida ZymoBIOMICS®. El ADN genómico se extrajo utilizando el Kit de ADN ZymoBIOMICS®-96 MagBead o el Kit de ADN ZymoBIOMICS® DNA Miniprep según los protocolos del fabricante. La región V3-V4 del gen del ARNr 16S bacteriano se amplificó y se prepararon las bibliotecas utilizando el Kit de preparación de bibliotecas NGS Quick-16S™ (Zymo Research). Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq (kit de 600 ciclos). Las variantes de secuencia de amplicones (ASV) se infirieron utilizando la canalización DADA2 (Callahan et al.^[50]), y las secuencias quiméricas se eliminaron durante el procesamiento. La asignación taxonómica y los análisis de diversidad se realizaron utilizando QIIME v1.9.1 (Caporaso et al.^[51]) con la base de datos de referencia de Zymo Research.

Ensayos in vitro

Las células HT29 (ATCC HTB-38, EE. UU.) se sembraron a una densidad de 2,0 × 106 células por frasco de 75 cm2. Las células se cultivaron en frascos de cultivo celular a 37 °C, 5% de CO2. Las células se subcultivaron a aproximadamente el 90% de confluencia (~6 días) con una solución de tripsina al 0,25% y EDTA al 0,02%. El DMEM (GenClone, 25-500) se suplementó con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina y estreptomicina (medio completo).

Ensayo de UFC

Se sembraron células HT29 a 100 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con 25 μM de ácido folínico en DMSO o 0,5% de DMSO y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 7 días, cambiando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Se lavaron suavemente las células con 1 mL de DPBS 1x, se añadió 1 mL de cristal violeta al 0,1% en metanol al 20% por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego se lavaron suavemente 3 veces con DPBS 1x. Las UFC se visualizaron utilizando un sistema de imagen iBright (Invitrogen). El volumen/área de cada colonia se calculó a partir de la tabla de datos de análisis del recuento de colonias generada por el instrumento iBright utilizando la configuración Universal, Visible Crystal Violet.

Inmunocitoquímica

Se sembraron células HT29 a 40 000 células/pocillo en 100 μL en placas de vidrio de 96 pocillos (Cellvis, NC0536760) y se trataron con 25 μM de ácido folínico en DMSO o 0,5% de DMSO durante 10 días, cambiando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Las células se lavaron tres veces con PBS 1x y se bloquearon en PBS que contiene 4% de suero de burro (GeneTex, GTX27475) y 0,3% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C con agitación suave. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces en PBS (5 minutos por lavado) a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo diluidos en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después de lavar con PBS, los núcleos se tiñeron con DAPI (1:3000 en PBS) durante 5 minutos. Las células se lavaron de nuevo con PBS antes de la imagen. Las imágenes se adquirieron utilizando conjuntos de filtros apropiados en un microscopio confocal Nikon A1R+ en la Instalación de Bioquímica Óptica (BOC) en UW–Madison. El anticuerpo primario utilizado para la tinción de inmunocitoquímica por fluorescencia fue E-caderina (1:1000; Cell Signaling Technology). Se utilizó IgG de conejo (H+L) cruzado y adsorbido con Alexa Fluor™ 488 (1:500, Thermo Fisher) como anticuerpo secundario.

Ensayo de UFC

Se sembraron células HT29 a 100 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con 25 μM de ácido folínico en DMSO o 0,5% de DMSO y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante 7 días, cambiando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Se lavaron suavemente las células con 1 mL de DPBS 1x, se añadió 1 mL de cristal violeta al 0,1% en metanol al 20% por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego se lavaron suavemente 3 veces con DPBS 1x. Las UFC se visualizaron utilizando un sistema de imagen iBright (Invitrogen). El volumen/área de cada colonia se calculó a partir de la tabla de datos de análisis del recuento de colonias generada por el instrumento iBright utilizando la configuración Universal, Visible Crystal Violet.

Inmunocitoquímica

Se sembraron células HT29 a una densidad de 40.000 células/pocillo en 100 μL en placas de vidrio de 96 pocillos (Cellvis, NC0536760) y se trataron con 25 μM de ácido fólico en DMSO o 0,5% de DMSO durante 10 días, reemplazando el medio y el tratamiento cada 3-4 días. Las células se lavaron tres veces con 1x PBS y se bloquearon en PBS que contenía 4% de suero de burro (GeneTex, GTX27475) y 0,3% de Triton X-100 durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C con agitación suave. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces en PBS (5 min por lavado) a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo diluidos en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después del lavado con PBS, los núcleos se tiñeron con DAPI (1:3000 en PBS) durante 5 min. Las células se lavaron nuevamente con PBS antes de la obtención de imágenes. Las imágenes se adquirieron utilizando conjuntos de filtros apropiados en un microscopio confocal Nikon A1R+ en el Centro Óptico de Bioquímica (BOC) de la Universidad de Wisconsin-Madison. El anticuerpo primario utilizado para la tinción de inmunocitoquímica por fluorescencia fue E-caderina (1:1000; Cell Signaling Technology). Se utilizó IgG anti-conejo (H+L) cruzado y adsorbido con Alexa Fluor™ 488 (1:500, Thermo Fisher) como anticuerpo secundario.

Análisis de Western blot

Se lisaron tejidos de colon de ratón (~30 mg) o células HT29 en 100-200 μL de tampón de lisis celular 1x frío (Cell Signaling Technology) suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). El tejido se homogeneizó utilizando un Bead Ruptor Elite (Omni International, Kennesaw, GA). Las muestras se centrifugaron a 18200 x g durante 10 min a 4 °C y se recogieron los sobrenadantes. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de Bradford (Thermo Scientific) con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Las proteínas se mezclaron con tampón de carga 4x suplementado con β-mercaptoetanol, se hirvieron a 100 °C durante 10 min y se separaron en geles prefabricados Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF utilizando transferencia en húmedo a 30 V durante 1 h. Las membranas se bloquearon en tampón de bloqueo StartingBlock™ (Thermo Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en 5% de BSA en TBS-T durante la noche a 4 °C. Después del lavado con TBS-T, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP diluidos en 5% de BSA en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Los resultados se visualizaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Scientific). Las imágenes de los resultados se obtuvieron del sistema de obtención de imágenes iBright (Invitrogen). Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el sistema de obtención de imágenes iBright (Invitrogen) con detección automática de bandas y se normalizaron a la proteína total. Los anticuerpos primarios utilizados para el western blot son: E-caderina (1:1000; Cell Signaling Technology) y Calpaína-2 (1:1000; Cell Signaling Technology). Se utilizó IgG anti-conejo-HRP (1:5000; Santa Cruz) como anticuerpo secundario.

Ensayos de transwell

Se sembraron células HT29 en insertos de tamaño de poro de 8,0 μm en placas de 24 pocillos (Costar 3422) a una densidad de 50.000 células en 200 μL de medio libre de suero en el lado apical y 500 μL de medio completo en el lado basolateral. Las células se trataron inmediatamente con 25 μM de ácido fólico (FA) en DMSO o 0,5% de DMSO. Los medios basolateral y apical con FA o DMSO se reemplazaron cada 3-4 días. Después del tratamiento, los insertos de transwell se retiraron y se transfirieron a una nueva placa de 24 pocillos. Las células se lavaron suavemente x 1 con 1x DPBS y se tiñeron con 0,1% de violeta de cristal en 20% de metanol en el lado basolateral, como se describió anteriormente. Las células apicales adheridas al inserto de transwell se fijaron con 10% de formaldehído tamponado neutro, se lavaron 3 veces con 1x PBS y se tiñeron con E-caderina y DAPI como se describió anteriormente.

Para generar suficientes células mesenquimales para sembrar en nuevas placas de transwell, se sembraron células HT29 en insertos de tamaño de poro de 8 μm en placas de 6 pocillos (Costar 3428) a una densidad de 200.000 células por inserto en 1 mL de medio libre de suero y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante ~12 días. Cuando suficientes células migraron y formaron colonias en el lado basolateral, las células mesenquimales se transfirieron a nuevas placas de transwell (Costar 3422) y se trataron con 25 μM de ácido fólico (FA) en DMSO o 0,5% de DMSO, como se describió anteriormente.

Microscopía electrónica

Las células HT29 en transwells se fijaron en un fijador de Karnovsky modificado (2,5% de glutaraldehído/2,0% de formaldehído en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (PB), pH = 7,2), se postfijaron en 1,0% de tetróxido de osmio en 0,1 M de PB, se deshidrataron en una serie de grados de etanol, se transicionaron en acetona y se incluyeron en Embed 812 (EMS, Morgantown, PA). Las muestras polimerizadas se seccionaron (80 nm) en un ultramicrotomo y las secciones se colocaron en rejillas de 2x1 de Cu recubiertas con formvar y se postcolorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones se observaron a 80 kV en un TEM FEI CM120 y se obtuvieron imágenes en una cámara digital AMT (Danvers, MA) BioSprint12.

Proteómica de interacción con el objetivo

Alteración integral de la solubilidad del proteoma basada en lisado

Los gránulos de células HT29 congelados se descongelaron sobre hielo y se resuspendieron en tampón de lisis (1 X PBS pH 7,4, 1 mM MgCl2, inhibidor de proteasas). Los proteomas se extrajeron utilizando un homogeneizador dounce (20 golpes). Los extractos se centrifugaron a 300 x g durante 3 min para eliminar cualquier célula no rota. El extracto resultante se diluyó a 2 mg/mL en tampón de lisis. Cada compuesto se añadió al tampón de lisis a una concentración 2X. Para iniciar el experimento, se combinó un volumen igual de extracto crudo y tampón de tratamiento, para obtener una concentración final de proteína de 1 mg/mL y una concentración de compuesto de 10 μM, y se incubó durante 30 min. Después de la incubación, un volumen igual de cada muestra se transfirió a 10 tubos de PCR. Los tubos de PCR se calentaron en un gradiente térmico que oscilaba entre 48 °C y 58 °C durante 3 min para inducir la desnaturalización térmica. Un volumen igual de cada tubo de PCR se agrupó. Se añadió un volumen igual de tampón de extracción (1 X PBS pH 7,4, 1% NP-40, inhibidores de proteasas) a cada muestra agrupada para obtener una concentración final de NP-40 del 0,5%. Las muestras se incubaron durante 10 min a 4 °C en un agitador rotatorio. Las muestras extraídas se centrifugaron a 21.000 x g durante 90 min para separar los agregados insolubles de la proteína soluble. Se recogió un volumen igual de cada fracción soluble y se preparó para el análisis LC-MS/MS.

Preparación de muestras para LC-MS/MS

Las muestras (15-20 μg de proteína) se diluyeron en tampón de preparación (400 mM EPPS pH 8,5, 1% de SDS, 10 mM de tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió yodoacetamida a una concentración final de 10 mM a cada muestra y se incubó durante 25 min en la oscuridad. Finalmente, se añadió DTT a cada muestra a una concentración final de 10 mM. Se realizó un intercambio de tampón utilizando un protocolo SP3 modificado^[52]. Brevemente, se añadieron ~250 μg de cada partícula SpeedBead Magnetic Carboxylate modificada (Cytiva; 45152105050250, 65152105050250) en una proporción de 1:1 a cada muestra. Se añadió 100% de etanol a cada muestra para obtener una concentración final de etanol de al menos 50%. Las muestras se incubaron con agitación suave durante 15 min. Las muestras se lavaron tres veces con 80% de etanol. La proteína se eluyó de las cuentas SP3 utilizando 200 mM de EPPS pH 8,5 que contenía tripsina (ThermoFisher Scientific) y Lys-C (Wako). Las muestras se digirieron durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa. Se añadió acetonitrilo a cada muestra para obtener una concentración final del 30%. Cada muestra se etiquetó, en presencia de las cuentas SP3, con ~65 μg de reactivos TMTpro-16plex^[53],^[54] (ThermoFisher Scientific). Los diseños experimentales para cada experimento se describieron en las tablas de datos fuente correspondientes. Tras la confirmación de un etiquetado satisfactorio (>97%), se eliminaron los reactivos TMTpro en exceso mediante la adición de hidroxilamina a una concentración final de 0,3%. El volumen total de cada muestra se agrupó y el acetonitrilo se eliminó por centrifugación al vacío durante una hora. La muestra agrupada se acidificó utilizando ácido fórmico y los péptidos se desalaron utilizando una cartucha Sep-Pak Vac 50 mg tC18 (Waters). Los péptidos se eluyeron en 70% de acetonitrilo, 1% de ácido fórmico y se secaron por centrifugación al vacío. Los péptidos se resuspendieron en 10 mM de bicarbonato de amonio pH 8, 5% de acetonitrilo y se fraccionaron por HPLC de fase inversa a pH básico. En total, se recogieron 24 fracciones. Las fracciones se secaron en un centrífugo de vacío, se resuspendieron en 5% de acetonitrilo, 1% de ácido fórmico y se desalaron mediante una etapa de punta. Finalmente, 12 de 24 fracciones se analizaron por LC-MS/MS.

Adquisición de datos de espectrometría de masas

Los datos se recogieron en un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse (ThermoFisher Scientific) acoplado a una bomba de LC Proxeon EASY-nLC 1000 (ThermoFisher Scientific). Los péptidos se separaron utilizando un gradiente de 120 min a 500 nL/min en una columna de 30 cm (diámetro interno de 100 μm, Accucore, 2,6 μm, 150 Å) empaquetada en el laboratorio. Se habilitó la espectrometría de movilidad iónica de campo de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) durante la adquisición de datos con voltajes de compensación (CV) establecidos en -40 V, -60 V y -80 V. Los datos MS1 se recogieron utilizando el Orbitrap (resolución de 60.000; tiempo de inyección máximo de 50 ms; AGC 4 × 105). Se requirieron estados de carga determinados entre 2 y 6 para el secuenciamiento, y se utilizó una ventana de exclusión dinámica de 60 s. El modo dependiente de datos se estableció como tiempo de ciclo (1 s). Los escaneos MS2 se realizaron en el Orbitrap con fragmentación HCD (ventana de aislamiento de 0,5 Da; resolución de 50.000; NCE 36%; tiempo de inyección máximo de 86 ms; AGC 1 × 105).

Análisis de datos de espectrometría de masas

Los archivos brutos se convirtieron primero a mzXML y los picos monoisotópicos se reasignaron utilizando Monocle. La búsqueda de la base de datos incluyó todas las entradas humanas de Uniprot (descargadas en febrero de 2020). La base de datos se concatenó con una compuesta por todas las secuencias de proteínas en orden inverso. También se añadieron las secuencias de las proteínas contaminantes comunes (por ejemplo, tripsina, queratinas, etc.). Las búsquedas se realizaron utilizando el algoritmo de búsqueda Comet. Las búsquedas se realizaron utilizando una tolerancia de 50 ppm para los iones precursores y una tolerancia de 0,02 Da para los iones de producto. La modificación de TMTpro en los residuos de lisina y péptidos N-terminales (+304,2071 Da) y la carbamidometilación de los residuos de cisteína (+57,0215 Da) se establecieron como modificaciones estáticas, mientras que la oxidación de los residuos de metionina (+15,9949 Da) se estableció como una modificación variable.

Los ajustes de espectro-péptido (PSM) se ajustaron a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1%. El filtrado de PSM se realizó utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) como se describió anteriormente^[55] considerando los siguientes parámetros: registro de expectativas de cometa, diferencia de secuencia delta de registro de expectativas de cometa (porcentaje de diferencia entre el primer resultado y el siguiente resultado con una secuencia de péptido diferente), cortes perdidos, longitud del péptido, estado de carga, precisión de la masa del precursor y fracción de iones coincidentes. Cada ejecución se filtró por separado. La FDR a nivel de proteína se estimó posteriormente a nivel de conjunto de datos. Para cada proteína en todas las muestras, las probabilidades posteriores informadas por el modelo LDA para cada péptido se multiplicaron para obtener una estimación de probabilidad a nivel de proteína. Utilizando el método Picked FDR^[56], las proteínas se filtraron al nivel objetivo de FDR del 1%.

Para la cuantificación de iones de reportero, se escaneó una ventana de 0,003 Da alrededor del m/z teórico de cada ion de reportero y se utilizó el m/z más intenso. Las intensidades de los iones de reportero se ajustaron para corregir las impurezas isotópicas de los diferentes reactivos TMTpro de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los péptidos se filtraron para incluir solo aquellos con una relación señal-ruido (SN) sumada de 160 o más en todos los canales. Para cada proteína, los valores de SN de TMTpro de los péptidos filtrados se sumaron para generar la cuantificación de proteínas.

Alteración integral de la solubilidad del proteoma basada en lisado

Se descongelaron en hielo los gránulos celulares de HT29 congelados y se resuspendieron en tampón de lisis (1 X PBS pH 7.4, 1 mM MgCl2, inhibidor de proteasas). Los proteomas se extrajeron utilizando un homogeneizador dounce (20 golpes). Los extractos se centrifugaron a 300 x g durante 3 minutos para eliminar cualquier célula no rota. El extracto resultante se diluyó a 2 mg/mL en tampón de lisis. Se añadió cada compuesto al tampón de lisis a una concentración 2 X. Para iniciar el experimento, se combinaron volúmenes iguales de extracto crudo y tampón de tratamiento, para obtener una concentración final de proteína de 1 mg/mL y una concentración de compuesto de 10 μM, y se incubó durante 30 minutos. Después de la incubación, se transfirió un volumen igual de cada muestra a 10 tubos de PCR. Los tubos de PCR se calentaron a lo largo de un gradiente térmico que oscilaba entre 48 °C y 58 °C durante 3 minutos para inducir la desnaturalización térmica. Se mezcló un volumen igual de cada tubo de PCR. Se añadió un volumen igual de tampón de extracción (1 X PBS pH 7.4, 1% NP-40, inhibidores de proteasas) a cada muestra agrupada para obtener una concentración final de NP-40 del 0,5%. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a 4 °C en un agitador rotatorio. Las muestras extraídas se centrifugaron a 21.000 x g durante 90 minutos para separar los agregados insolubles de la proteína soluble. Se recogió un volumen igual de cada fracción soluble y se preparó para el análisis LC-MS/MS.

Preparación de muestras para LC-MS/MS

Las muestras (15-20 μg de proteína) se diluyeron en tampón de preparación (400 mM EPPS pH 8.5, 1% SDS, 10 mM tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió yodoacetamida a una concentración final de 10 mM a cada muestra y se incubó durante 25 minutos en la oscuridad. Finalmente, se añadió DTT a cada muestra hasta una concentración final de 10 mM. Se realizó un intercambio de tampón utilizando un protocolo SP3 modificado^[52]. Brevemente, se mezclaron aproximadamente 250 μg de cada partícula SpeedBead Magnetic Carboxylate modificada (Cytiva; 45152105050250, 65152105050250) en una proporción de 1:1 y se añadieron a cada muestra. Se añadió etanol al 100% a cada muestra para obtener una concentración final de etanol de al menos el 50%. Las muestras se incubaron con agitación suave durante 15 minutos. Las muestras se lavaron tres veces con etanol al 80%. La proteína se eluyó de las cuentas SP3 utilizando 200 mM EPPS pH 8.5 que contenía tripsina (ThermoFisher Scientific) y Lys-C (Wako). Las muestras se digirieron durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa. Se añadió acetonitrilo a cada muestra para obtener una concentración final del 30%. Cada muestra se etiquetó, en presencia de las cuentas SP3, con aproximadamente 65 μg de reactivos TMTpro-16plex^[53],^[54] (ThermoFisher Scientific). Los diseños experimentales para cada experimento se describieron en las tablas de datos fuente correspondientes. Tras la confirmación de un etiquetado satisfactorio (>97%), se desactivaron los reactivos TMTpro en exceso mediante la adición de hidroxilamina hasta una concentración final del 0,3%. El volumen total de cada muestra se agrupó y el acetonitrilo se eliminó mediante centrifugación al vacío durante una hora. La muestra agrupada se acidificó utilizando ácido fórmico y los péptidos se desalaron utilizando una cartucha Sep-Pak Vac 50 mg tC18 (Waters). Los péptidos se eluyeron en acetonitrilo al 70%, ácido fórmico al 1% y se secaron mediante centrifugación al vacío. Los péptidos se resuspendieron en bicarbonato de amonio al 10 mM pH 8, acetonitrilo al 5% y se fraccionaron mediante HPLC de fase inversa a pH básico. En total, se recogieron 24 fracciones. Las fracciones se secaron en una centrífuga al vacío, se resuspendieron en acetonitrilo al 5%, ácido fórmico al 1% y se desalaron mediante stage-tip. Los péptidos finales se eluyeron en acetonitrilo al 70%, ácido fórmico al 1%, se secaron y, finalmente, se resuspendieron en acetonitrilo al 5%, ácido fórmico al 5%. Al final, 12 de las 24 fracciones se analizaron mediante LC-MS/MS.

Adquisición de datos de espectrometría de masas

Los datos se recogieron en un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse (ThermoFisher Scientific) acoplado a una bomba de LC Proxeon EASY-nLC 1000 (ThermoFisher Scientific). Los péptidos se separaron utilizando un gradiente de 120 minutos a 500 nL/min en una columna de 30 cm (diámetro interno de 100 μm, Accucore, 2,6 μm, 150 Å) empaquetada en el laboratorio. Se habilitó la espectrometría de movilidad iónica de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) durante la adquisición de datos con voltajes de compensación (CV) establecidos en -40 V, -60 V y -80 V. Los datos MS1 se recogieron utilizando el Orbitrap (resolución de 60.000; tiempo máximo de inyección de 50 ms; AGC 4 × 105). Se requirieron estados de carga determinados entre 2 y 6 para el secuenciamiento, y se utilizó una ventana de exclusión dinámica de 60 s. El modo dependiente de datos se estableció como tiempo de ciclo (1 s). Los escaneos MS2 se realizaron en el Orbitrap con fragmentación HCD (ventana de aislamiento de 0,5 Da; resolución de 50.000; NCE 36%; tiempo máximo de inyección de 86 ms; AGC 1 × 105).

Análisis de datos de espectrometría de masas

Los archivos brutos se convirtieron primero a mzXML y los picos monoisotópicos se reasignaron utilizando Monocle. La búsqueda de la base de datos incluyó todas las entradas humanas de Uniprot (descargada en febrero de 2020). La base de datos se concatenó con una compuesta por todas las secuencias de proteínas en orden inverso. Las secuencias de las proteínas contaminantes comunes (por ejemplo, tripsina, queratinas, etc.) también se añadieron. Las búsquedas se realizaron utilizando el algoritmo de búsqueda Comet. Las búsquedas se realizaron utilizando una tolerancia de 50 ppm para el ion precursor y una tolerancia de 0,02 Da para el ion producto. TMTpro en residuos de lisina y extremos N de péptidos (+304,2071 Da) y carbamidometilación de residuos de cisteína (+57,0215 Da) se establecieron como modificaciones estáticas, mientras que la oxidación de residuos de metionina (+15,9949 Da) se estableció como una modificación variable.

Los ajustes de espectro-péptido (PSM) se ajustaron a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1%. El filtrado de PSM se realizó utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) como se describió anteriormente^[55] considerando los siguientes parámetros: logaritmo de expectación de Comet, diferencia de logaritmo de expectación de secuencia diferente de Comet (porcentaje de diferencia entre el primer resultado y el siguiente resultado con una secuencia de péptido diferente), fallos de escisión, longitud del péptido, estado de carga, precisión de la masa del precursor y fracción de iones coincidentes. Cada ejecución se filtró por separado. La FDR a nivel de proteína se estimó posteriormente a nivel de conjunto de datos. Para cada proteína en todas las muestras, las probabilidades posteriores informadas por el modelo LDA para cada péptido se multiplicaron para obtener una estimación de probabilidad a nivel de proteína. Utilizando el método Picked FDR^[56], las proteínas se filtraron al nivel objetivo de FDR del 1%.

Para la cuantificación de iones reporteros, se escaneó una ventana de 0,003 Da alrededor del m/z teórico de cada ion reportero y se utilizó el m/z más intenso. Las intensidades de los iones reporteros se ajustaron para corregir las impurezas isotópicas de los diferentes reactivos TMTpro de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los péptidos se filtraron para incluir solo aquellos con una relación señal-ruido (SN) sumada de 160 o más en todos los canales. Para cada proteína, los valores de SN de TMTpro de los péptidos filtrados se sumaron para generar la cuantificación de proteínas.

Expresión y purificación de la proteína CAPN2

Se generó un plásmido pET-28a que expresa la subunidad catalítica de CAPN2 por Craig Bingman en el Crystal Core de Bioquímica de la Universidad de Wisconsin-Madison y se transformó en células KRK (Promega, Madison WI). Se inoculó una sola colonia de células KRK que expresan CAPN2 recombinante con una etiqueta 6xHis N-terminal en un plásmido pET-28a en 5 mL de LB con kanamicina y se cultivó durante la noche a 37 °C con agitación. Al día siguiente, se expandieron 2 mL de cultivo a 50 mL y se indujo la expresión de proteínas con 0,2 mM de IPTG y 10 mM de ramnosa. El cultivo se incubó a 37 °C durante la noche con agitación. Al día siguiente, se retiraron 1 mL de cultivo para evaluar la expresión de proteínas. Tanto la alícuota de 1 mL como los 49 mL restantes de cultivo se centrifugaron a 8000 x g durante 15 minutos. Los gránulos de los 49 mL se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C a la espera de la confirmación de la expresión de proteínas.

Los gránulos de 1 mL se resuspendieron en 100 μL de tampón de lisis y se sonicaron en 3 pulsos de 15 s, con intervalos de 1 minuto sobre hielo entre los pulsos. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 8000 x g durante 5 minutos. Se mezclaron 20 μL de lisados con 6 μL de tampón de Laemmli que contenía agente reductor NuPAGE (Thermo Fisher) y se hirvieron a 100 °C durante 5 minutos. Todo el volumen de la muestra se sometió a análisis de Western blot para confirmar la expresión de proteínas. Los Western blots se sondearon con anticuerpo primario anti-His de ratón (Proteintech, 66005-1-Ig) durante la noche a 4 °C, seguido de anticuerpo secundario HRP anti-IgG de ratón (Invitrogen, 62-6520) durante 1 h a temperatura ambiente. El Western blot se reveló con reactivo ECL y se obtuvo la imagen en el sistema de imagen iBright CL1500.

Tras la confirmación de la expresión de proteínas a partir del cultivo de 1 mL, se descongeló el gránulo de 49 mL restante y se lisó mediante sonicación en 5 mL de tampón de lisis como se describe anteriormente. El lisado celular se aclaró mediante centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos. El lisado aclarado se incubó con 1 mL de resina de purificación de His-Tag cOmplete™ (Roche) (50% de suspensión en tampón de lavado IMAC) durante 1 h a 4 °C en un agitador rotatorio. La mezcla se drenó a través de columnas de flujo por gravedad y la resina se lavó dos veces con 10 mL de tampón de lavado IMAC y se incubó con 1 mL de tampón de elución IMAC durante 5 minutos antes de la elución. La proteína eluida se mezcló inmediatamente con 10 μL de solución quelante de Mg:EDTA para evitar la autolisis. La expresión de proteínas se validó utilizando el reactivo de etiquetado No-Stain (Invitrogen, A44717) como se describe anteriormente.

Antes del ensayo de unión a 5-f-THF y la cuantificación de proteínas, el eluído se intercambió en tampón de equilibrio IMAC utilizando un filtro centrífugo Amicon® Ultra (10 kDa MWCO, Millipore, UFC801008), con ocho rondas de dilución/concentración en 5 mL de tampón de equilibrio IMAC, para reducir la cantidad de Mg:EDTA e imidazol que podrían interferir con estos pasos.

Ensayos de unión de CAPN2

Se utilizó la subunidad catalítica purificada de CAPN2 (100 mg/mL) en cada réplica del ensayo de unión en 100 μL de tampón de unión (25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,01% Triton X-100, 5% glicerol, 1 mM DTT, 0,2% ácido ascórbico, pH 7,25). CAPN2 se incubó con concentraciones equimolares de folatos (10 μM) a 37 °C durante 30 minutos. La proteína se purificó utilizando la purificación IMAC como se describe anteriormente y se sometió a análisis de metabolómica de folatos para la cuantificación de folatos. Para el ensayo de desplazamiento de CAPN2, la proteína purificada se incubó con concentraciones crecientes de ácido folínico a 37 °C durante 30 minutos en tampón de unión. La proteína unida se purificó utilizando la purificación IMAC, seguida de la incubación con 100 nM de CAPN2i a 37 °C durante 30 minutos en tampón de unión. El ácido folínico desplazado se separó de la proteína utilizando la purificación IMAC y se midió utilizando la metabolómica de folatos LC-MS.

Generación de la línea celular CAPN2KO

Se utilizó un kit de eliminación de genes (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.) que contenía tres ARNs guía sintetizados químicamente (secuencias espaciadoras: AGTTCTGGCAATACGGCGAG, GAGCAGCTCCCCGTCCTTGG, GGCGTATGCCTTCTCCAGCA) dirigidos al gen CAPN2 y una proteína recombinante de nucleasa SpCas9 (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.). Se utilizó el sistema de transfección Neon (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) para electroporar los ARNs guía complejos con SpCas9 en las células HT29. Después de 72 horas, se extrajo el ADN genómico utilizando la solución de extracción de ADN QuickExtract™ (LGC Genomics LLC, Alexandria, MN, EE. UU.). El gen CAPN2 se amplificó utilizando cebadores (IDT, Coralville, IA, EE. UU.). La edición del gen CCR5 se midió utilizando el secuenciamiento de Sanger analizado utilizando el software ICE Analysis (EditCo Bio, Redwood City, CA, EE. UU.) para confirmar la eliminación del gen.

Generación de la línea celular CAPN2OE

La línea celular CAPN2OE se generó como se describió anteriormente^[29]. Brevemente, las células HT29 se incubaron con 1 nM de SN-38 (Sigma, H0165) durante 24 horas en un medio DMEM completo, seguido de la recuperación en un tampón sin fármaco durante aproximadamente 2 semanas. La dosis del fármaco se duplicó en cada exposición consecutiva, hasta que se obtuvieron células resistentes que pudieran dividirse en 60 μM de SN-38. Las células se dejaron recuperarse en un medio DMEM completo durante 2 semanas antes de su uso en cualquier experimento.

Eliminación del gen glyA de E. coli Nissle y cuantificación in vivo

Se utilizó el sistema de recombinación lambda red para eliminar el gen glyA de EcN utilizando un método descrito previamente^[34] con los siguientes oligonucleótidos: 5’ – GCTAAAGCTTTTAAGAAGGAGATATACATATGTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCG – 3’ y 5’ – GCTATCTAGATTATGCGTAAACCGGGTAACGTGC – 3’. La cuantificación in vivo de EcN se realizó en muestras fecales utilizando cebadores específicos para EcN: (5’ – ATACTACGACGGTAAATGGT – 3’ y 5’ - TACATCAGTATCGGTAGCAT – 3’); y se normalizó con cebadores para la bacteria 16S (5’ – TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA – 3’; y 5′ – AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT – 3’). Las muestras fecales pre- y post-colonización se pesaron y se diluyeron en PBS 1x hasta una concentración de 5 mg/mL y 0,5 mg/mL. Se realizó una qPCR en estas muestras por triplicado utilizando SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) y se ejecutó en el QuantStudio (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Se utilizaron cebadores (IDT, Coralville, IA, USA) que amplifican el gen fimA de EcN para medir la cantidad de EcN en las heces. Se utilizaron cebadores que amplifican el gen 16S para medir la cantidad de todas las bacterias en las heces.

Tinción con hematoxilina y eosina e inmunofluorescencia

Los tejidos del colon fijados en formalina e incluidos en parafina se seccionaron con un grosor de 2-5 μm y se secaron a 65 °C durante 25 minutos antes de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), E-caderina o mucina 2 (MUC2) utilizando el Leica ST5010 Autostainer XL (Leica Biosystems) según el protocolo del Laboratorio de Patología Animal Experimental de la UWCC. Las secciones de H&E se trataron secuencialmente con xileno, etanol graduado, Hematoxilina MX 560, Define MX, Buffer Azul 8 y Eosina 515 Tricrómica, seguido de la deshidratación con etanol y la aclaración en xileno. Las láminas de E-caderina y MUC2 se sometieron a HIER (recuperación de epítopos inducida por calor) en solución de Tris-EDTA pH 9.0 (10 mM de base de Tris, 1 mM de EDTA, 0,05% de Tween 20) durante 3 minutos en la cámara de desnaturalización (Biocare Medical, Concord, CA). Luego, las láminas se enfriaron durante 20 minutos, se lavaron en PBS 1x y se bloquearon con suero de cabra al 10% (Sigma, St. Louis, MO) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la incubación con anticuerpo primario en PBS con 1% de suero de cabra y 0,1% de Triton X-100 a una dilución de 1:200 durante la noche a 4 °C. Luego, las láminas se lavaron 3 veces con PBS 1x y se incubaron con Alexafluor Goat anti-rabbit 488 a una dilución de 1:1000 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las láminas se lavaron 3 veces con PBS 1x, seguido de un lavado con DH2O, y se montaron con una cubierta utilizando Prolong Gold con DAPI (Thermo Fisher Scientific, P36931). Las imágenes se adquirieron con un microscopio Nikon iLas2 TIRF/STORM/Epifluorescencia y se midió la intensidad media de píxeles de cada tinción utilizando ImageJ.

Análisis histológico con H&E

La adquisición de imágenes y la codificación fueron realizadas por un investigador independiente y todos los análisis (longitud de las criptas, número de células caliciformes y % de área de inflamación) se realizaron de forma ciega. La longitud de las criptas y el número de células caliciformes por cripta se midieron utilizando el software QuPath v0.6.0. Se analizaron cinco criptas por ratón/imagen, midiendo la distancia desde la base de la cripta hasta la superficie luminal y el número de células caliciformes por cripta. El % de área de inflamación, analizando las mismas 5 criptas por ratón utilizadas para la longitud de las criptas y el número de células caliciformes, se cuantificó utilizando ImageJ. Se aplicó un umbral uniforme a la tinción con hematoxilina. Las células agrupadas se separaron utilizando la función de cuencas hidrográficas. El área de inflamación se cuantificó utilizando la función "Analizar partículas" con un umbral de tamaño de 0 a infinito píxeles^[2] y un rango de circularidad de 0,00 a 1,00. El número de tumores, el grado, la invasión y los eventos de invasión linfovascular se puntuaron según las pautas publicadas de forma ciega^[57],^[58].

Análisis de lipocalina-2 fecal

Los niveles de lipocalina-2 fecal se cuantificaron utilizando un kit ELISA Mouse Lipocalin-2/NGAL DuoSet (R&D Systems, DY1857) según las instrucciones del fabricante. Las placas de 96 pocillos de alta unión (Corning, 3590) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo de captura diluido en PBS. Las placas se lavaron con PBS que contiene 0,05% de Tween-20 y se bloquearon con 1% de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras fecales se homogeneizaron en 300-500 μL de PBS que contiene 0,1% de Tween-20, se centrifugaron (18.200 x g, 10 min, 4 °C) y el sobrenadante se recogió para el análisis. Los sobrenadantes se diluyeron 5x-25x en diluyente de reactivo. Las muestras y los estándares se añadieron a la placa y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se aplicaron secuencialmente el anticuerpo de detección y la estreptavidina-HRP, con pasos de lavado intermedios. La señal se desarrolló utilizando el sustrato TMB (R&D Systems, DY999B) y se detuvo con la solución de detención (R&D Systems, DY994). La absorbancia se midió a 450 nm con corrección de longitud de onda a 540 nm. Las concentraciones se calcularon a partir de la curva estándar.

Medición de la citocina IL-10 en suero

LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel with V-Bottom Plate (BioLegend, 740622) se utilizó para medir los niveles de citocina IL-10 en suero. Para los estándares, se añadieron 25 μL de Matrix A a una placa de ensayo, seguido de la adición de 25 μL de soluciones de estándares diluidas en serie. Para las muestras de suero, se añadieron 25 μL de tampón de ensayo a la placa de ensayo, seguido de la adición de 25 μL de muestras de suero diluidas 4-8 veces. Se añadieron 25 μL de perlas mezcladas a cada pocillo y la placa se agitó a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de aspirar y lavar la placa, se añadieron 25 μL de anticuerpos de detección a la placa, seguido de agitación a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, se añadieron 25 μL de SA-PE a cada pocillo, seguido de agitación a 3.000 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar y lavar la placa, las perlas de la placa se resuspendieron en 150 μL de tampón de lavado 1X mediante pipeteo y la placa se leyó en el citómetro de flujo Attune NxT en el Laboratorio de Citometría de Flujo del Centro Oncológico UW-Madison (UWCCC). Los datos se analizaron utilizando el software de análisis de datos LEGENDplex™ (BioLegend). Las poblaciones de perlas se distinguieron por FSC/SSC e intensidad del tinte interno medida en el canal APC (670 nm), y las señales del reportero se cuantificaron en el canal PE (574 nm).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SEM para gráficos de barras y diagramas de dispersión, a menos que se especifique lo contrario. Los diagramas de violín muestran la distribución de los datos, con la línea central que indica la mediana y las líneas punteadas que representan todos los puntos de datos. Cada punto de datos representa un replicado biológico individual, a menos que se especifique lo contrario, según se define en las leyendas de las figuras. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Welch de dos colas no pareada. Para los datos que no se distribuyen normalmente, se aplicó la prueba de Mann-Whitney. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó ANOVA de una vía seguido de pruebas de comparación múltiple post hoc apropiadas. Cuando no se cumplieron los supuestos de normalidad, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizó un cálculo de potencia para determinar el número total de animales necesarios para cada estudio. En resumen, se consideró un punto final dicotómico para dos grupos de estudio independientes con un error esperado en la media del 10% y una diferencia de al menos el 75%. Una tasa de falsos positivos del 10% y una tasa de falsos negativos del 20% (potencia) identificaron un tamaño de muestra de al menos n=4 para cada grupo de estudio. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Los valores de p exactos se informan en las figuras.

Gráficos

Las ilustraciones esquemáticas se crearon utilizando BioRender. Las estructuras químicas se generaron utilizando ChemDraw. Las estructuras de acoplamiento molecular y las visualizaciones estructurales se representaron utilizando PyMOL.