Bifidobacterium probiótico modificado genéticamente para la terapia dirigida al tumor en el cáncer de páncreas.

El adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP), que constituye aproximadamente el 90% de los cánceres de páncreas, es una neoplasia altamente agresiva y letal (^[1], ^[2]). La resección quirúrgica, el tratamiento estándar, solo es aplicable al 15-20% de los pacientes en el momento del diagnóstico (^[3]). Más recientemente, la quimioterapia adyuvante ha mejorado la supervivencia de los pacientes sometidos a una resección completa, pero la supervivencia a largo plazo en los pacientes que desarrollan metástasis es desfavorable (^[1], ^[4], ^[5]). El microambiente tumoral (MET) en el ADCP es altamente inmunosupresor, caracterizado por una abundancia de células supresoras derivadas de la médula ósea (^[6], ^[7]), una deficiencia de células dendríticas funcionales (CD) (^[8]), una infiltración limitada de células T efectoras (Teff) (^[9], ^[10]), un aumento de las células T reguladoras (Treg) (^[11]) y una hipoxia severa (^[12]). Estas condiciones también se observan en el MET de otros cánceres difíciles de tratar, como el cáncer de pulmón no microcítico (^[13]), el cáncer de ovario (^[14]), el cáncer de próstata (^[15]) y el cáncer colorrectal (^[16]), lo que limita significativamente la eficacia de las terapias convencionales, como la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia (^[1]). Por lo tanto, existe una necesidad crítica de enfoques terapéuticos innovadores capaces de remodelar el MET inmunosupresor hacia un estado más inmunoactivo.

La interleucina-2 (IL-2), una citocina crucial para la proliferación y activación de las células T (^[17], ^[18]), se ha utilizado como inmunoterapia contra el cáncer para mejorar la actividad de las Teff en el MET (^[19]). A pesar de su potencial, una limitación importante de la terapia con IL-2 es su promoción concomitante de la expansión de las Treg, lo que puede suprimir la actividad de las Teff dentro del MET e impedir las respuestas antitumorales (^[20]–^[22]). Anteriormente, se desarrolló la IL-2 supermutante (SumIL-2), una variante de IL-2 humana (hIL-2) diseñada con seis mutaciones de aminoácidos (F42A, L80F, R81D, L85V, I86V e I92F) para exhibir una unión preferencial al receptor β de la IL-2 (IL-2Rβ, también conocido como CD122) en lugar del IL-2Rα (CD25), lo que resulta en una activación selectiva de las Teff y una activación minimizada de las Treg (^[23]). La SumIL-2 convierte eficazmente el MET inmunosupresor en un estado inmunoactivo. Sin embargo, a pesar de estas mejoras, el tratamiento con IL-2, incluida la SumIL-2, aún sufre de una vida media corta in vivo y toxicidad sistémica (^[24]–^[26]), lo que destaca la necesidad de enfoques de administración dirigidos al tumor.

Las bacterias modificadas genéticamente han surgido como vehículos prometedores para la administración terapéutica dirigida al tumor (^[27], ^[28]). Las especies de Bifidobacterium, un probiótico comensal anaeróbico obligado que se encuentra en el tracto gastrointestinal de los mamíferos (^[29]), ofrecen una alternativa a otras bacterias ampliamente estudiadas, como Escherichia coli, Salmonella Typhimurium y Listeria monocytogenes, para la administración terapéutica dirigida al tumor (^[30], ^[31]). Debido a su naturaleza probiótica anaeróbica obligada, las especies de Bifidobacterium se consideran generalmente seguras (^[30]) y exhiben una mayor propensión a colonizar específicamente el MET hipóxico sin necesidad de atenuación diseñada para la seguridad (^[32]–^[34]) o auxotrofía metabólica (^[33], ^[35]) para la focalización tumoral. Se ha demostrado que las especies de Bifidobacterium presentes en el tracto gastrointestinal desempeñan un papel clave en la respuesta a los inhibidores de los puntos de control inmunitario en ratones [por ejemplo, anti–ligando de muerte programada 1 (anti–PD-L1) y anti-CD47] (^[36], ^[37]). La administración oral de especies de Bifidobacterium conduce a un aumento de la expresión de genes antitumorales dentro de las CD y a una mejora de la activación de las células T, lo que convierte a los no respondedores en respondedores a los inhibidores de los puntos de control inmunitario. Las especies de Bifidobacterium que se translocan del tracto gastrointestinal al MET mejoran la presentación de antígenos de las CD y modulan la actividad de las células T, lo que da como resultado efectos sinérgicos cuando se combinan con la inmunoterapia (^[36]). Además, la producción de metabolitos inmunomoduladores, como la inosina (^[38], ^[39]), el ácido indólico-3-láctico (^[40], ^[41]) y el monofosfato de adenosina cíclico 5′ (^[36]), por las especies de Bifidobacterium puede contribuir a los efectos antitumorales. Estos efectos antitumorales naturales de las especies de Bifidobacterium, junto con su focalización tumoral, ofrecen una ventaja significativa en su uso como plataforma de administración para diversas terapias dirigidas al tumor, que van desde nanopartículas diagnósticas y terapéuticas (^[42]) hasta la expresión génica [por ejemplo, antígenos tumorales (^[43]) y enzimas que activan profármacos (^[44])].

Aquí, modificamos genéticamente Bifidobacterium longum para que secrete continuamente SumIL-2 (BifidoSumIL-2) como un sistema de administración dirigido al tumor que mejora la eficacia terapéutica de la SumIL-2 al tiempo que minimiza la toxicidad sistémica (Fig. 1A). En modelos de tumores subcutáneos, la administración sistémica de BifidoSumIL-2 colonizó selectivamente los tumores y exhibió un potente efecto antitumoral, suprimiendo el crecimiento tumoral a través de un mecanismo dependiente del estimulador de los genes de interferón (STING) y de las células T. En un modelo ortotópico de ADCP, el tratamiento con BifidoSumIL-2 también suprimió el crecimiento tumoral al modular eficazmente los perfiles de las células T CD8+ dentro del MET. La combinación de BifidoSumIL-2 con quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia amplificó aún más la eficacia terapéutica, lo que destaca su importante potencial para el tratamiento del ADCP.

RESULTADOS

La bacteria probiótica B. longum modificada genéticamente secretó SumIL-2 bioactiva in vitro

La SumIL-2 es una variante de IL-2 modificada diseñada para activar selectivamente las células Teff al tiempo que minimiza la activación de las células Treg (^[23]). Las especies de Bifidobacterium son bacterias probióticas conocidas por su capacidad para colonizar tumores y mejorar la eficacia de la inmunoterapia (^[36], ^[37]). Primero, examinamos si B. longum ATCC15697 mejora la eficacia antitumoral de la SumIL-2 (fig. S1). En ratones con tumores MC38 subcutáneos (carcinoma colorrectal murino), la administración intraperitoneal de SumIL-2-Fc, una fusión de SumIL-2 con un dominio Fc diseñado para mejorar la estabilidad y la vida media (^[23]), produjo un efecto aditivo cuando se combinó con la administración intravenosa de B. longum, en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado. Estos resultados sugieren que la modificación genética de B. longum para que secrete SumIL-2 podría proporcionar una estrategia sinérgica y rentable para la administración intratumoral sostenida de IL-2 y una mayor eficacia antitumoral.

Para explorar este enfoque, clonamos el gen SumIL-2 bajo un promotor constitutivo del factor de elongación Tu (Ptuf) en el plásmido pJL21, ya sea fusionado a un péptido señal N-terminal derivado de la proteína secretada hipotética (BLONRS02330) o sin el péptido señal (Fig. 1B). Estos constructos se transformaron en B. longum, y se detectó SumIL-2 en los sobrenadantes de cultivo exclusivamente en el B. longum modificado genéticamente que expresaba SumIL-2 fusionada al péptido señal, mientras que no se detectó SumIL-2 extracelular en el B. longum de tipo salvaje o en la cepa de control que carecía del péptido señal (Fig. 1C). A partir de ahora, el B. longum_ que secreta SumIL-2 se denominará BifidoSumIL-2. A continuación, evaluamos la bioactividad de la SumIL-2 secretada utilizando células reporteras HEK-IL-2 humanas (Fig. 1D). La SumIL-2 secretada exhibió una bioactividad similar en comparación con la hIL-2, con un valor de concentración efectiva mediana de 36 pg/ml para la hIL-2 y 62 pg/ml para la SumIL-2 secretada, lo que sugiere que la producción y secreción por un huésped bacteriano no comprometieron la función de la SumIL-2.

Para evaluar la estabilidad del plásmido en ausencia de selección con antibióticos, realizamos un ensayo de pasajes seriados in vitro en condiciones no selectivas (fig. S2). BifidoSumIL-2 se cultivó en serie diariamente durante 7 días consecutivos en presencia o ausencia de selección con antibióticos. No se observó ninguna diferencia significativa en los recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) entre los cultivos sin antibióticos y los controles seleccionados con antibióticos, lo que confirmó una retención robusta del plásmido durante más de 70 generaciones. Además, la secreción de SumIL-2 se mantuvo después de 7 días sin selección con antibióticos, lo que indica su expresión estable y funcional (fig. S2B).

Para evaluar la eficacia in vivo de BifidoSumIL-2 (Fig. 1E), tratamos a ratones con tumores MC38 subcutáneos establecidos cada 2 días con tres dosis intravenosas de solución salina tamponada con fosfato (PBS; control), B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2, o inyecciones intraperitoneales de hIL-2. El tratamiento con BifidoSumIL-2 suprimió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los otros tratamientos, lo que demostró el efecto aditivo de la combinación de B. longum y SumIL-2 (Fig. 1F). Para explorar el potencial terapéutico más amplio de BifidoSumIL-2, realizamos experimentos similares utilizando ratones con tumores B16F1 subcutáneos (melanoma murino), caracterizados por sus propiedades inmunosupresoras debido a la regulación a la baja del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I y la ausencia de expresión del CMH de clase II (^[45]). El tratamiento con BifidoSumIL-2 suprimió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los otros tratamientos, lo que indica su capacidad para superar la resistencia a los tratamientos con B. longum de tipo salvaje o hIL-2 solos (Fig. 1G). Además, examinamos el efecto de BifidoSumIL-2 en ratones a los que se inyectaron subcutáneamente células tumorales pancreáticas, aisladas principalmente de ratones LSL-KrasG12D/+, LSL-Trp53R172H/+, Pdx-1-Cre (KPC) (Fig. 1H) (^[46]). El tratamiento con BifidoSumIL-2 condujo a una supresión significativamente mayor del tumor en comparación con los tratamientos con PBS y B. longum, sin mostrar ninguna diferencia significativa con el tratamiento con SumIL-2-Fc. En un modelo metastásico de carcinoma de pulmón de Lewis (CPL), en el que las células CPL se inyectaron por vía intravenosa para establecer tumores pulmonares, BifidoSumIL-2 redujo tanto el número como el tamaño de los nódulos pulmonares (fig. S3). En conjunto, estos resultados confirmaron la robusta eficacia antitumoral de BifidoSumIL-2 administrado sistémicamente en múltiples modelos de tumores.

Para evaluar la biodistribución tisular después de la administración sistémica, recogimos y analizamos muestras de tumores y órganos de ratones con tumores B16F1 subcutáneos en varios puntos temporales después de una sola inyección intravenosa de BifidoSumIL-2 (fig. S4A). Desde el día 1 hasta el día 7, BifidoSumIL-2 se detectó de forma constante y exclusiva en los tumores, sin detectarse en la sangre, el hígado, el bazo, el riñón, el corazón o el pulmón, lo que indica su colonización tumoral selectiva (fig. S4, B y C). Para evaluar aún más la eliminación de BifidoSumIL-2, extendimos el seguimiento de las cargas bacterianas intratumorales hasta el día 13 después de la administración. Observamos una disminución progresiva de la carga bacteriana intratumoral con el tiempo. El día 10, uno de los tres tumores mostró una eliminación completa y, el día 13, no se detectaron colonias en ninguno de los tumores examinados, lo que confirmó que BifidoSumIL-2 se eliminó eficazmente por el huésped (fig. S4B). Además, al medir la concentración de IL-2 en los tumores mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA), observamos niveles prolongados de IL-2 en los tumores (fig. S4D). Tenga en cuenta que la IL-2 humana y la IL-2 murina exhiben reactividad cruzada; por lo tanto, los niveles de IL-2 medidos representaron el nivel combinado de la SumIL-2 secretada por BifidoSumIL-2 y la IL-2 murina endógena.

También examinamos la seguridad de BifidoSumIL-2 mediante el control del peso corporal y las respuestas inflamatorias sistémicas tras tres administraciones intravenosas en ratones portadores de tumores B16F1. BifidoSumIL-2 no indujo una pérdida crítica de peso corporal, ya que el peso corporal se mantuvo por encima del 95% del valor basal durante todo el período experimental (Fig. 1G y fig. S5A). Además, evaluamos la posible toxicidad analizando el suero recogido 7 días después de una única administración a ratones sin tumores (fig. S5, B a E). Primero, medimos los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) para evaluar una posible lesión hepática (^[47]). Si bien los niveles de ALT se elevaron significativamente con el tratamiento con B. longum de tipo salvaje, BifidoSumIL-2 y hIL-2, en comparación con el tratamiento con PBS, las elevaciones de AST inducidas por el tratamiento con B. longum de tipo salvaje y BifidoSumIL-2 fueron significativamente menores que las observadas con el tratamiento con hIL-2. La relación AST/ALT no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con PBS, B. longum de tipo salvaje y BifidoSumIL-2, mientras que el tratamiento con hIL-2 causó un aumento significativo, lo que sugiere que BifidoSumIL-2 presenta una menor lesión hepática en comparación con hIL-2. Esto indica que la administración dirigida de SumIL-2 por BifidoSumIL-2 no induce la lesión hepática observada con hIL-2. A continuación, examinamos las citocinas inflamatorias en el suero (fig. S5, F a H) y no observamos aumentos significativos en los niveles de interferón-γ (IFN-γ), factor de necrosis tumoral-α (TNFα) e IL-6 en ningún grupo de tratamiento (hIL-2, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2) en comparación con el grupo de control de PBS. De manera consistente, el análisis del suero recogido 7 días después de tres administraciones intravenosas en ratones portadores de tumores B16F1 también reveló que no hubo aumentos significativos en estas citocinas en ningún grupo de tratamiento en comparación con los controles de PBS (fig. S5, I a L). En conjunto, estos resultados demuestran que BifidoSumIL-2 exhibe una robusta eficacia antitumoral a través de un efecto combinado del chasis B. longum y la actividad de SumIL-2, dirigiéndose selectivamente a los tumores y manteniendo un perfil de seguridad favorable.### BifidoSumIL-2 induce inmunidad antitumoral dependiente de STING y células T

A continuación, investigamos los mecanismos subyacentes responsables de los efectos antitumorales sinérgicos de BifidoSumIL-2. Estudios previos han demostrado que las especies Bifidobacterium activan la respuesta inmune innata a través de la vía de señalización de STING, superando así la resistencia a la inmunoterapia (^[36]). Además, SumIL-2 se une preferentemente a IL-2Rβ en lugar de IL-2Rα, lo que conduce a la activación selectiva de las células Teff y a una activación mínima de las células Treg (^[23]). Por lo tanto, hipotetizamos que la acción combinada de la activación inmune innata mediada por B. longum y la SumIL-2 secretada mejoraría la inmunidad antitumoral al promover la activación y expansión de las células Teff.

Para probar esta hipótesis, primero cocultivamos células mieloides derivadas de la médula ósea (BMDM) y células B16F1 in vitro en presencia de PBS control, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2 y luego aislamos las BMDM para su posterior análisis. El grupo tratado con BifidoSumIL-2 exhibió un aumento en la fosforilación del factor regulador de interferón 3 (pIRF3), un factor de transcripción clave aguas abajo de la activación de STING (fig. S6A) (^[48], ^[49]). En consonancia con esto, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó la expresión de genes dependientes de IRF3, como Ifnβ, Cxcl10 e Isg15 (^[50]) en comparación con el control de PBS y el tratamiento con B. longum de tipo salvaje (fig. S6, B a D). Estos aumentos se abolieron cuando se utilizaron BMDM derivadas de ratones deficientes en STING, lo que confirmó que la activación dependía de STING (fig. S6, A a D). También realizamos experimentos utilizando ratones deficientes en STING (Tmem173−/−). El tratamiento con BifidoSumIL-2 no logró inducir un efecto antitumoral en ratones Tmem173−/− que presentaban un tumor B16F1 subcutáneo, lo que indica que la señalización de STING es necesaria para la eficacia terapéutica (Fig. 2, A y B). Dado que los patrones moleculares asociados a patógenos derivados de BifidoSumIL-2 pueden activar las respuestas inmunes innatas al unirse a los receptores tipo Toll e iniciar la señalización dependiente de MyD88, investigamos si MyD88 contribuyó a los efectos antitumorales (fig. S6, E y F). Sin embargo, la deficiencia de MyD88 no abolió los efectos antitumorales de BifidoSumIL-2. En conjunto, demostramos que la eficacia antitumoral de BifidoSumIL-2 depende de STING, pero es independiente de MyD88.

Además, evaluamos la contribución de la inmunidad adaptativa utilizando ratones deficientes en inmunidad adaptativa (Rag1−/−) que presentaban tumores B16F1 subcutáneos, en los que la eficacia terapéutica de BifidoSumIL-2 se perdió por completo (fig. S6, G y H). Para identificar el subconjunto específico de células T responsable de esta respuesta, realizamos la depleción mediada por anticuerpos in vivo (Fig. 2, C y D). La eficacia de BifidoSumIL-2 se abolió tras la depleción de las células T CD8+, mientras que la depleción de las células T CD4+ no afectó su eficacia, lo que indica que su actividad terapéutica depende de las células T CD8+. En conjunto, estos resultados demuestran que el efecto antitumoral de BifidoSumIL-2 se basa tanto en la activación innata de STING como en la inmunidad adaptativa mediada por células T CD8+.

Para evaluar la respuesta inmune dentro del microambiente tumoral (TME) inducida por BifidoSumIL-2, recogimos tumores B16F1 subcutáneos 7 días después del último tratamiento y primero analizamos las células T mediante citometría de flujo (Fig. 2E y fig. S7A). En comparación con el tratamiento con PBS, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó significativamente el número de células Teff positivas para IFN-γ (CD8+CD44+CD62L−IFN-γ+) y redujo el número de células T agotadas (Tex) (CD8+PD-1hiTCF1−) y células Treg (CD4+FoxP3+CD25+) (Fig. 2, F a H, y fig. S7, B a D). En contraste, el tratamiento con hIL-2 aumentó el número de células Teff positivas para IFN-γ, células Treg y células Tex, mientras que el tratamiento con B. longum redujo tanto el número de células Treg como de células Tex, pero no aumentó el número de células Teff positivas para IFN-γ. Además, el tratamiento con BifidoSumIL-2 indujo una relación significativamente mayor de Teff+/Treg+ que otros grupos, lo que indica que BifidoSumIL-2 indujo un entorno inmune más favorable para la actividad de las células Teff que otros tratamientos (Fig. 2I). En un análisis adicional de las células inmunes infiltrantes tumorales, el tratamiento con BifidoSumIL-2 condujo a un aumento significativo de la infiltración de células dendríticas (DC) (CD11c+MHCII+), células asesinas naturales (NK) (CD3−NK1.1+) y macrófagos (CD11b+F4/80+) en comparación con el control de PBS, mientras que no se observaron diferencias significativas en los neutrófilos (CD11b+Ly6G+) y los monocitos (CD11b+Ly6G−Ly6C+) (figs. S8 y S9). En particular, la infiltración de DC fue significativamente mayor en el grupo tratado con BifidoSumIL-2 que en el grupo tratado con hIL-2. Además, el tratamiento con BifidoSumIL-2 remodeló el perfil de citocinas del TME hacia un estado antitumoral más proinflamatorio, aumentando los niveles de IFN-γ y TNFα (fig. S10) (^[51]). Por último, las poblaciones de células T esplénicas mostraron un aumento significativo de las células T CD8+ positivas para IFN-γ y una disminución de las células Treg, junto con una relación CD8+IFN-γ+/Treg elevada, en el grupo tratado con BifidoSumIL-2. Estos hallazgos sugieren que la función efectora de las células T CD8+ se mejora sistémicamente y no se limita al TME (fig. S11). En conjunto, estos hallazgos demuestran que BifidoSumIL-2 mejoró las respuestas de las células T CD8+ y la infiltración tanto a nivel local dentro del tumor como sistémicamente para promover una respuesta antitumoral favorable.### BifidoSumIL-2 reduce la carga de CPAC ortotópico y remodela el TME

La escasa eficacia de las terapias convencionales en el CPAC se debe principalmente a su TME altamente inmunosupresor, que se caracteriza por una deficiencia de DC, una escasez de células Teff activadas y un enriquecimiento de células Treg (^[9], ^[10]). Basándonos en los hallazgos de los modelos de tumores subcutáneos que mostraron que BifidoSumIL-2 podría suprimir el crecimiento tumoral al promover la activación y la infiltración de las células Teff tanto dentro del tumor como sistémicamente, establecimos a continuación un CPAC ortotópico inyectando directamente células KPC en el páncreas para mejorar la relevancia clínica de nuestro estudio. Dado que se sabe que el CPAC tiene una mala vascularización (^[52]), lo que puede dificultar la colonización de B. longum inyectado por vía intravenosa, primero evaluamos la colonización de B. longum dentro de los tumores KPC ortotópicos. Administramos una cepa de B. longum que secreta luciferasa (BifidoLuci) mediante una única inyección intravenosa, comenzando 12 días después de inyectar células KPC en la cola del páncreas (Fig. 3A y fig. S12A). La imagen de bioluminiscencia in vivo detectó las señales de bioluminiscencia más altas en la región abdominal, alcanzando su punto máximo en el día 3 después de la inyección y disminuyendo posteriormente (Fig. 3B y fig. S12B). Además, después de tres inyecciones intravenosas de BifidoLuci cada 2 días, recogimos tumores pancreáticos y otros órganos el día 7 después de la primera inyección y medimos las señales de bioluminiscencia (Fig. 3C). Detectamos señales de bioluminiscencia significativamente más altas en los tumores pancreáticos en comparación con las de otros órganos (Fig. 3D y fig. S12C). Por lo tanto, demostramos que B. longum inyectado por vía intravenosa coloniza con éxito y selectivamente los tumores KPC ortotópicos.

Para evaluar la capacidad de BifidoSumIL-2 para suprimir el CPAC, administramos BifidoSumIL-2 por vía intravenosa cada 2 días durante un total de tres dosis, comenzando 10 días después de inyectar células KPC que expresaban luciferasa (KPC-luc) en la cola del páncreas (Fig. 4A). Luego, monitoreamos el peso corporal y el crecimiento tumoral midiendo las señales de bioluminiscencia de la región abdominal de los ratones (fig. S13, A a C). El peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos de tratamiento en relación con el valor basal (día 9) (fig. S13A). Durante todo el período experimental, los ratones tratados con BifidoSumIL-2 mostraron consistentemente señales de bioluminiscencia más bajas que los tratados con PBS, SumIL-2-Fc o B. longum de tipo salvaje (fig. S13, B y C). La recolección de tumores al final del experimento reveló que los tumores de los ratones tratados con BifidoSumIL-2 tenían pesos significativamente más bajos que los de los ratones tratados con PBS o B. longum de tipo salvaje (Fig. 4B y fig. S13D).

A continuación, recogimos tumores de CPAC 7 días después del último tratamiento y los analizamos mediante citometría de flujo para evaluar el impacto de BifidoSumIL-2 en las poblaciones de células inmunes dentro del TME de CPAC (Fig. 4, C a G, y fig. S14). Si bien el número de células CD45+ vivas fue comparable entre todos los grupos, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó significativamente la infiltración de células T CD8+ dentro del TME de CPAC en comparación con los controles de PBS, mientras que SumIL-2-Fc no mostró diferencias significativas (fig. S14E). Otras poblaciones inmunes importantes, incluidas las células T CD4+, las células B (NK1.1−B220+), las células NK, las células DC, los neutrófilos, los macrófagos y los monocitos, no difirieron significativamente entre todos los grupos. Dentro del compartimento de células T, si bien el número de células Treg fue comparable entre todos los grupos, tanto el tratamiento con B. longum de tipo salvaje como el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentaron significativamente el número de células Teff dentro del TME de CPAC y mejoraron la relación Teff/Treg en comparación con el grupo de control de PBS, lo que apoya una remodelación del TME dominada por las células T CD8+ (Fig. 4, D a F). Además, la relación Teff/Treg fue significativamente mayor en el grupo tratado con BifidoSumIL-2 que en el grupo tratado con SumIL-2-Fc, lo que apoya el potencial terapéutico de la administración de SumIL-2 mediada por B. longum. Además, el perfilado de alta dimensión de 48 000 células CD8+ vivas mediante citometría de flujo espectral demostró que BifidoSumIL-2 aumentó la abundancia general de células CD8+ similares a células madre (TCF1+) en comparación con PBS, SumIL-2-Fc o el tratamiento con B. longum, y células CD8+ similares a células madre/IFN-γ+ (TCF1+IFN-γ+) dentro del TME de CPAC en comparación con el tratamiento con PBS o SumIL-2-Fc (Fig. 4G y fig. S15). Estas células CD8+ similares a células madre o similares a células madre/IFN-γ+ están asociadas con mejores resultados en los pacientes después de la terapia contra el cáncer (^[53], ^[54]). En conjunto, en un modelo de CPAC ortotópico, B. longum modificado genéticamente colonizó con éxito el tumor y BifidoSumIL-2 moduló el TME hacia un estado inmune más activo al mejorar la relación Teff/Treg positiva para IFN-γ y enriquecer las células CD8+ similares a células madre.### BifidoSumIL-2 mejora la eficacia antitumoral en las terapias combinadas

Las terapias combinadas maximizan los beneficios terapéuticos al tiempo que minimizan la recurrencia o la resistencia tumoral (^[55]). A continuación, exploramos el potencial de combinar BifidoSumIL-2 con terapias oncológicas estándar, como la quimioterapia, la radioterapia y el bloqueo de puntos de control inmunitarios. Primero, examinamos la eficacia terapéutica de su combinación con gemcitabina, un agente de quimioterapia común utilizado en diversos cánceres, incluido el cáncer de páncreas (^[1]). Se administró BifidoSumIL-2 por vía intravenosa, ya sea sola o con inyección intraperitoneal de gemcitabina, y posteriormente se monitorizó la progresión tumoral mediante imagen de bioluminiscencia durante todo el período experimental (fig. 5A y fig. S16). Se monitorizó el peso corporal y este se mantuvo estable en todos los grupos de tratamiento en relación con el valor basal (día 10) (fig. S16A). La imagen de bioluminiscencia mostró una supresión tumoral significativamente mayor con gemcitabina sola o en combinación con BifidoSumIL-2 en comparación con PBS (fig. 5B y fig. S16B). El análisis de los pesos tumorales al final del experimento confirmó además que la combinación de BifidoSumIL-2 y gemcitabina produjo una mayor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con PBS, BifidoSumIL-2 o gemcitabina sola (fig. 5C y fig. S16C). De manera consistente, la combinación de BifidoSumIL-2 y gemcitabina mejoró la supervivencia en comparación con el control PBS y los respectivos grupos de monoterapia (fig. 5D).

Además, exploramos el potencial terapéutico de combinar BifidoSumIL-2 con radiación ionizante (RI) y bloqueo de puntos de control inmunitarios utilizando un anticuerpo anti–PD-L1. Se trató a los ratones con inyecciones intravenosas de BifidoSumIL-2, ya sea sola o en combinación con RI abdominal, con o sin inyección intraperitoneal de un anticuerpo anti–PD-L1 (fig. 5E). Durante todo el período experimental, todos los ratones tratados con la doble combinación de BifidoSumIL-2 y RI o la triple combinación de BifidoSumIL-2, RI y anticuerpo anti–PD-L1 mantuvieron más del 95% de su peso corporal basal (día 9) (fig. S16D). La imagen de bioluminiscencia reveló una supresión numérica del crecimiento tumoral mayor con el tratamiento de triple combinación en comparación con el control PBS y las monoterapias (fig. 5F y fig. S16E). De manera consistente, un análisis adicional de los pesos tumorales al final del experimento confirmó que la triple combinación produjo una inhibición significativamente mayor del crecimiento tumoral en comparación con el control PBS u otras monoterapias, lo que demuestra un efecto aditivo que supera la eficacia de las terapias individuales (fig. 5F y fig. S16F). En el análisis de supervivencia, tanto las combinaciones dobles como las triples demostraron una mediana de supervivencia prolongada en comparación con los controles PBS. Aunque estas diferencias no alcanzaron significación estadística (P = 0,0581), la tendencia de la supervivencia fue consistente con la reducción de la carga tumoral al final del estudio. Para evaluar aún más el efecto antitumoral sistémico de la triple combinación, establecimos un modelo bilateral subcutáneo KPC en el que se administró RI localizada a un tumor, mientras que BifidoSumIL-2 y el anticuerpo anti–PD-L1 se administraron sistémicamente (fig. S16). En este entorno, la triple combinación suprimió significativamente el crecimiento del tumor contralateral no irradiado en comparación con los controles PBS. En conjunto, estos hallazgos destacan el potencial de BifidoSumIL-2 en las terapias combinadas y resaltan su papel en el aumento de la eficacia del tratamiento.

B. longum probiótico modificado que secreta SumIL-2 bioactivo in vitro

SumIL-2 es una variante de IL-2 modificada diseñada para activar selectivamente las células Teff al tiempo que minimiza la activación de las células Treg (^[23]). Las especies Bifidobacterium son bacterias probióticas conocidas por su capacidad para colonizar los tumores y mejorar la eficacia de la inmunoterapia (^[36], ^[37]). Primero, examinamos si B. longum ATCC15697 mejora la eficacia antitumoral de SumIL-2 (fig. S1). En ratones con tumores subcutáneos MC38 (carcinoma colorrectal murino), la administración intraperitoneal de SumIL-2–Fc, una fusión de SumIL-2 con un dominio Fc diseñado para mejorar la estabilidad y la vida media (^[23]), produjo un efecto aditivo cuando se combinó con la administración intravenosa de B. longum, en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado. Estos resultados sugieren que la modificación de B. longum para secretar SumIL-2 podría proporcionar una estrategia sinérgica y rentable para la administración sostenida de IL-2 intratumoral y una mayor eficacia antitumoral.

Para explorar este enfoque, clonamos el gen SumIL-2 bajo un promotor constitutivo del factor de elongación Tu (Ptuf) en el plásmido pJL21, ya sea fusionado a un péptido de señal de secreción N-terminal derivado de la proteína secretada hipotética (BLONRS02330) o sin el péptido de señal (fig. 1B). Estos constructos se transformaron en B. longum, y se detectó SumIL-2 en los sobrenadantes de cultivo exclusivamente en el B. longum modificado que expresaba SumIL-2 fusionado al péptido de señal, mientras que no se detectó SumIL-2 extracelular en el B. longum de tipo salvaje o en la cepa de control que carecía del péptido de señal (fig. 1C). A partir de ahora, el B. longum_ que secreta SumIL-2 se denominará BifidoSumIL-2. A continuación, evaluamos la bioactividad de SumIL-2 secretado utilizando células reporteras HEK–IL-2 (fig. 1D). El SumIL-2 secretado exhibió una bioactividad similar en comparación con hIL-2, con un valor de concentración efectiva mediana de 36 pg/ml para hIL-2 y 62 pg/ml para SumIL-2 secretado, lo que sugiere que la producción y la secreción a partir de un huésped bacteriano no comprometieron la función de SumIL-2.

Para evaluar la estabilidad del plásmido en ausencia de selección con antibióticos, realizamos un ensayo de pasajes seriados in vitro en condiciones no selectivas (fig. S2). BifidoSumIL-2 se cultivó en serie diariamente durante 7 días consecutivos en presencia o ausencia de selección con antibióticos. No se observó ninguna diferencia significativa en los recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) entre los cultivos sin antibióticos y los controles seleccionados con antibióticos, lo que confirmó una retención robusta del plásmido durante más de 70 generaciones. Además, la secreción de SumIL-2 se mantuvo después de 7 días sin selección con antibióticos, lo que indica su expresión estable y funcional (fig. S2B).

Para evaluar la eficacia in vivo de BifidoSumIL-2 (fig. 1E), tratamos a ratones con tumores subcutáneos MC38 establecidos cada 2 días con tres dosis intravenosas de solución salina tamponada con fosfato (PBS; control), B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2, o inyecciones intraperitoneales de hIL-2. El tratamiento con BifidoSumIL-2 suprimió el crecimiento tumoral de manera significativamente mayor que los otros tratamientos, lo que demostró el efecto aditivo de combinar B. longum y SumIL-2 (fig. 1F). Para explorar el potencial terapéutico más amplio de BifidoSumIL-2, realizamos experimentos similares utilizando ratones con tumores subcutáneos B16F1 (melanoma murino), caracterizados por sus propiedades inmunosupresoras debido a la regulación a la baja del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y la ausencia de expresión de MHC de clase II (^[45]). El tratamiento con BifidoSumIL-2 suprimió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los otros tratamientos, lo que indica su capacidad para superar la resistencia a los tratamientos con B. longum de tipo salvaje o hIL-2 solos (fig. 1G). Además, examinamos el efecto de BifidoSumIL-2 en ratones inyectados subcutáneamente con células tumorales pancreáticas, aisladas principalmente de ratones LSL-KrasG12D/+, LSL-Trp53R172H/+, Pdx-1-Cre (KPC) (fig. 1H) (^[46]). El tratamiento con BifidoSumIL-2 condujo a una supresión tumoral significativamente mayor que los tratamientos con PBS y B. longum, sin mostrar ninguna diferencia significativa con el tratamiento con SumIL-2–Fc. En un modelo metastásico de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC), donde las células LLC se inyectaron por vía intravenosa para establecer tumores pulmonares, BifidoSumIL-2 redujo tanto el número como el tamaño de los nódulos pulmonares (fig. S3). En conjunto, estos resultados confirmaron la robusta eficacia antitumoral de BifidoSumIL-2 administrado sistémicamente en múltiples modelos tumorales.

Para evaluar la biodistribución tisular después de la administración sistémica, recolectamos y analizamos muestras de tumores y órganos de ratones con tumores subcutáneos B16F1 en varios puntos temporales después de una sola inyección intravenosa de BifidoSumIL-2 (fig. S4A). Desde el día 1 hasta el día 7, BifidoSumIL-2 se detectó de manera consistente y exclusiva en los tumores, sin detección en la sangre, el hígado, el bazo, el riñón, el corazón o los pulmones, lo que indica su colonización tumoral selectiva (fig. S4, B y C). Para evaluar aún más la eliminación de BifidoSumIL-2, extendimos el monitoreo de las cargas bacterianas intratumorales hasta el día 13 después de la administración. Observamos una disminución progresiva de la carga bacteriana intratumoral con el tiempo. El día 10, uno de los tres tumores mostró una eliminación completa y, el día 13, no se detectaron colonias en ninguno de los tumores examinados, lo que confirmó que BifidoSumIL-2 fue eliminado eficazmente por el huésped (fig. S4B). Además, al medir la concentración de IL-2 en los tumores mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA), observamos niveles prolongados de IL-2 en los tumores (fig. S4D). Tenga en cuenta que la IL-2 humana y la IL-2 murina exhiben reactividad cruzada; por lo tanto, los niveles de IL-2 medidos representaron el nivel combinado de la SumIL-2 secretada por BifidoSumIL-2 y la IL-2 murina endógena.

También examinamos la seguridad de BifidoSumIL-2 mediante el monitoreo del peso corporal y las respuestas inflamatorias sistémicas después de tres administraciones intravenosas en ratones con tumores B16F1. BifidoSumIL-2 no indujo una pérdida de peso crítica, ya que los pesos corporales se mantuvieron por encima del 95% del valor basal durante todo el período experimental (fig. 1G y fig. S5A). Además, evaluamos la posible toxicidad mediante el análisis del suero recolectado 7 días después de una sola administración a ratones sin tumores (fig. S5, B a E). Primero, medimos los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) para evaluar la posible lesión hepática (^[47]). Si bien los niveles de ALT se elevaron significativamente con el tratamiento con B. longum de tipo salvaje, BifidoSumIL-2 y hIL-2 en comparación con el tratamiento con PBS, las elevaciones de AST inducidas por el tratamiento con B. longum de tipo salvaje y BifidoSumIL-2 fueron significativamente menores que las observadas con el tratamiento con hIL-2. La relación AST/ALT no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con PBS, B. longum de tipo salvaje y BifidoSumIL-2, mientras que el tratamiento con hIL-2 causó un aumento significativo, lo que sugiere que BifidoSumIL-2 exhibe una menor lesión hepática en comparación con hIL-2. Esto indica que la administración dirigida de SumIL-2 por BifidoSumIL-2 no induce la lesión hepática observada con hIL-2. A continuación, examinamos las citocinas inflamatorias en el suero (fig. S5, F a H) y no observamos aumentos significativos en los niveles de interferón-γ (IFN-γ), factor de necrosis tumoral-α (TNFα) e IL-6 en ningún grupo de tratamiento (hIL-2, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2) en comparación con el grupo de control PBS. De manera consistente, el análisis del suero recolectado 7 días después de tres administraciones intravenosas en ratones con tumores B16F1 también reveló que no hubo aumentos significativos en estas citocinas en ningún grupo de tratamiento en comparación con los controles PBS (fig. S5, I a L). En conjunto, estos resultados demuestran que BifidoSumIL-2 exhibe una robusta eficacia antitumoral a través de un efecto combinado del chasis B. longum y la actividad de SumIL-2, dirigiéndose selectivamente a los tumores y manteniendo un perfil de seguridad favorable.

BifidoSumIL-2 induce inmunidad antitumoral dependiente de STING y las células T

A continuación, investigamos los mecanismos subyacentes responsables de los efectos antitumorales sinérgicos de BifidoSumIL-2. Estudios previos han demostrado que las especies Bifidobacterium activan la respuesta inmune innata a través de la vía de señalización STING, superando así la resistencia a la inmunoterapia (^[36]). Además, SumIL-2 se une preferentemente a IL-2Rβ en lugar de IL-2Rα, lo que conduce a la activación selectiva de las células Teff y a una activación mínima de las células Treg (^[23]). Por lo tanto, hipotetizamos que la acción combinada de la activación inmune innata mediada por B. longum y la SumIL-2 secretada mejoraría la inmunidad antitumoral al impulsar la activación y la expansión de las células Teff.

Para poner a prueba esta hipótesis, primero cultivamos en cocultivo células mieloides derivadas de la médula ósea (CMDO) y células B16F1 in vitro, en presencia de PBS como control, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2, y luego aislamos las CMDO para su posterior análisis. El grupo tratado con BifidoSumIL-2 mostró un aumento en la fosforilación del factor regulador de interferón 3 (pIRF3), un factor de transcripción clave aguas abajo de la activación de STING (fig. S6A) (^[48], ^[49]). En consonancia con esto, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó la expresión de genes dependientes de IRF3, como Ifnβ, Cxcl10 e Isg15 (^[50]), en comparación con el control de PBS y el tratamiento con B. longum de tipo salvaje (fig. S6, de la B a la D). Estos aumentos desaparecieron cuando se utilizaron CMDO derivadas de ratones deficientes en STING, lo que confirmó que la activación dependía de STING (fig. S6, de la A a la D). También realizamos experimentos utilizando ratones deficientes en STING (Tmem173−/−). El tratamiento con BifidoSumIL-2 no logró generar un efecto antitumoral en ratones Tmem173−/− que presentaban el tumor B16F1 subcutáneo, lo que indica que la señalización de STING es necesaria para la eficacia terapéutica (fig. 2, A y B). Dado que los patrones moleculares asociados a patógenos derivados de BifidoSumIL-2 pueden activar las respuestas inmunitarias innatas al unirse a los receptores tipo Toll e iniciar la señalización dependiente de MyD88, investigamos si MyD88 contribuía a los efectos antitumorales (fig. S6, E y F). Sin embargo, la deficiencia de MyD88 no abolió los efectos antitumorales de BifidoSumIL-2. En conjunto, demostramos que la eficacia antitumoral de BifidoSumIL-2 depende de STING, pero es independiente de MyD88.

Además, evaluamos la contribución de la inmunidad adaptativa utilizando ratones deficientes en inmunidad adaptativa (Rag1−/−) que presentaban tumores B16F1 subcutáneos, en los que la eficacia terapéutica de BifidoSumIL-2 se perdió por completo (fig. S6, G y H). Para identificar el subconjunto específico de células T responsable de esta respuesta, realizamos la depleción mediada por anticuerpos in vivo (fig. 2, C y D). La eficacia de BifidoSumIL-2 se abolió tras la depleción de las células T CD8+, mientras que la depleción de las células T CD4+ no afectó su eficacia, lo que indica que su actividad terapéutica depende de las células T CD8+. En conjunto, estos resultados demuestran que el efecto antitumoral de BifidoSumIL-2 se basa tanto en la activación innata de STING como en la inmunidad adaptativa mediada por células T CD8+.

Para evaluar la respuesta inmunitaria dentro del microambiente tumoral (MET) inducida por BifidoSumIL-2, recolectamos tumores B16F1 subcutáneos 7 días después del tratamiento final y primero analizamos las células T mediante citometría de flujo (fig. 2E y fig. S7A). En comparación con el tratamiento con PBS, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó significativamente el número de células Teff positivas para IFN-γ (CD8+CD44+CD62L−IFN-γ+) y redujo el número de células T agotadas (Tex) (CD8+PD-1hiTCF1−) y células Treg (CD4+FoxP3+CD25+) (fig. 2, de la F a la H, y fig. S7, de la B a la D). Por el contrario, el tratamiento con hIL-2 aumentó el número de células Teff positivas para IFN-γ, células Treg y células Tex, mientras que el tratamiento con B. longum redujo tanto el número de células Treg como de células Tex, pero no aumentó el número de células Teff positivas para IFN-γ. Además, el tratamiento con BifidoSumIL-2 indujo una proporción significativamente mayor de células Teff positivas para IFN-γ/células Treg que los otros grupos, lo que indica que BifidoSumIL-2 indujo un entorno inmunitario más favorable para la actividad de las células Teff que otros tratamientos (fig. 2I). En un análisis adicional de las células inmunitarias infiltrantes tumorales, el tratamiento con BifidoSumIL-2 condujo a un aumento significativo de la infiltración de células dendríticas (CD) (CD11c+MHCII+), células asesinas naturales (NK) (CD3−NK1.1+) y macrófagos (CD11b+F4/80+) en comparación con el control de PBS, mientras que no se observaron diferencias significativas en los neutrófilos (CD11b+Ly6G+) y los monocitos (CD11b+Ly6G−Ly6C+) (figs. S8 y S9). En particular, la infiltración de CD fue significativamente mayor en el grupo tratado con BifidoSumIL-2 que en el grupo tratado con hIL-2. Además, el tratamiento con BifidoSumIL-2 remodeló el perfil de citocinas del MET hacia un estado antitumoral más proinflamatorio, aumentando los niveles de IFN-γ y TNFα (fig. S10) (^[51]). Por último, las poblaciones de células T esplénicas mostraron un aumento significativo de las células T CD8 positivas para IFN-γ y una disminución de las células Treg, junto con una proporción elevada de células CD8+IFN-γ+/células Treg, en el grupo tratado con BifidoSumIL-2. Estos hallazgos sugieren que la función efectora de las células T CD8+ se mejora sistémicamente y no se limita al MET (fig. S11). En conjunto, estos hallazgos demuestran que BifidoSumIL-2 mejoró las respuestas de las células T CD8+ y la infiltración tanto a nivel local dentro del tumor como sistémicamente para promover una respuesta antitumoral favorable.

BifidoSumIL-2 reduce la carga de PDAC ortotópico y remodela el MET

La escasa eficacia de las terapias convencionales en el cáncer de páncreas ductal (CPD) se debe principalmente a su MET altamente inmunosupresor, que se caracteriza por la deficiencia de CD, la escasez de células Teff activadas y el enriquecimiento de células Treg (^[9], ^[10]). Basándonos en los hallazgos de los modelos de tumores subcutáneos que mostraron que BifidoSumIL-2 podía suprimir el crecimiento tumoral al promover la activación y la infiltración de células Teff tanto dentro del tumor como sistémicamente, establecimos a continuación un CPD ortotópico inyectando directamente células KPC en el páncreas para mejorar la relevancia clínica de nuestro estudio. Dado que se sabe que el CPD tiene una mala vascularización (^[52]), lo que puede dificultar la colonización de B. longum inyectado por vía intravenosa, inicialmente evaluamos la colonización de B. longum dentro de los tumores KPC ortotópicos. Administramos una cepa de B. longum que secreta luciferasa (BifidoLuci) mediante una única inyección intravenosa, comenzando 12 días después de inyectar células KPC en la cola del páncreas (fig. 3A y fig. S12A). La imagen de bioluminiscencia in vivo detectó las señales de bioluminiscencia más altas en la región abdominal, alcanzando su punto máximo en el día 3 después de la inyección y disminuyendo posteriormente (fig. 3B y fig. S12B). Además, después de tres inyecciones intravenosas de BifidoLuci cada 2 días, recolectamos tumores pancreáticos y otros órganos en el día 7 después de la primera inyección y medimos las señales de bioluminiscencia (fig. 3C). Detectamos señales de bioluminiscencia significativamente más altas en los tumores pancreáticos en comparación con las de otros órganos (fig. 3D y fig. S12C). Por lo tanto, demostramos que B. longum inyectado por vía intravenosa coloniza con éxito y selectivamente los tumores KPC ortotópicos.

Para evaluar la capacidad de BifidoSumIL-2 para suprimir el CPD, administramos BifidoSumIL-2 por vía intravenosa cada 2 días durante un total de tres dosis, comenzando 10 días después de inyectar células KPC que expresaban luciferasa (KPC-luc) en la cola del páncreas (fig. 4A). Luego, monitoreamos el peso corporal y el crecimiento tumoral midiendo las señales de bioluminiscencia de la región abdominal de los ratones (fig. S13, de la A a la C). El peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos de tratamiento en relación con la línea de base (día 9) (fig. S13A). A lo largo del período experimental, los ratones tratados con BifidoSumIL-2 mostraron consistentemente señales de bioluminiscencia más bajas que los tratados con PBS, SumIL-2-Fc o B. longum de tipo salvaje (fig. S13, de la B a la C). La recolección de tumores en el punto final del experimento reveló que los tumores de los ratones tratados con BifidoSumIL-2 tenían pesos significativamente más bajos que los de los ratones tratados con PBS o B. longum de tipo salvaje (fig. 4B y fig. S13D).

A continuación, recolectamos tumores de CPD 7 días después del tratamiento final y los analizamos mediante citometría de flujo para evaluar el impacto de BifidoSumIL-2 en las poblaciones de células inmunitarias dentro del MET del CPD (fig. 4, de la C a la G, y fig. S14). Aunque el número de células CD45+ vivas fue comparable entre todos los grupos, el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentó significativamente la infiltración de células T CD8+ dentro del MET del CPD en comparación con los controles de PBS, mientras que SumIL-2-Fc no mostró una diferencia significativa (fig. S14E). Otras poblaciones inmunitarias importantes, incluidas las células T CD4+, las células B (NK1.1−B220+), las células NK, las CD, los neutrófilos, los macrófagos y los monocitos, no difirieron significativamente entre todos los grupos. Dentro del compartimento de células T, si bien el número de células Treg fue comparable entre todos los grupos, tanto B. longum de tipo salvaje como el tratamiento con BifidoSumIL-2 aumentaron significativamente el número de células Teff dentro del MET del CPD y mejoraron la proporción de Teff/Treg en comparación con el grupo de control de PBS (fig. 4, de la D a la F). Además, la proporción de Teff/Treg fue significativamente mayor en el grupo tratado con BifidoSumIL-2 que en el grupo tratado con SumIL-2-Fc, lo que respalda el potencial terapéutico de la administración de SumIL-2 mediada por B. longum. Un perfilado de alta dimensión adicional de 48 000 células CD8+ vivas mediante citometría de flujo espectral demostró que BifidoSumIL-2 aumentó la abundancia general de células CD8+ de tipo tronco (TCF1+), en comparación con PBS, SumIL-2-Fc o el tratamiento con B. longum, y células CD8+ de tipo tronco positivas para IFN-γ (TCF1+IFN-γ+) dentro del MET del CPD, en comparación con el tratamiento con PBS o SumIL-2-Fc (fig. 4G y fig. S15). Estas células CD8+ de tipo tronco o de tipo tronco/IFN-γ+ están asociadas con mejores resultados en los pacientes después de la terapia contra el cáncer (^[53], ^[54]). En conjunto, en un modelo de CPD ortotópico, B. longum modificado genéticamente colonizó con éxito el tumor y BifidoSumIL-2 moduló el MET hacia un estado inmunitario más activo al mejorar la proporción de células Teff positivas para IFN-γ/células Treg y enriquecer las células CD8+ de tipo tronco.

BifidoSumIL-2 mejora la eficacia antitumoral en las terapias combinadas

Las terapias combinadas maximizan los beneficios terapéuticos al tiempo que minimizan la recurrencia o la resistencia tumoral (^[55]). A continuación, exploramos el potencial de combinar BifidoSumIL-2 con terapias contra el cáncer estándar, como la quimioterapia, la radioterapia y el bloqueo de puntos de control inmunitarios. Primero, examinamos la eficacia terapéutica de su combinación con gemcitabina, un agente de quimioterapia común que se utiliza en varios tipos de cáncer, incluido el CPD (^[1]). BifidoSumIL-2 se administró por vía intravenosa, ya sea solo o con inyección intraperitoneal de gemcitabina, y posteriormente se monitoreó la progresión tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia durante todo el período experimental (fig. 5A y fig. S16). Se monitoreó el peso corporal y este se mantuvo estable en todos los grupos de tratamiento en relación con la línea de base (día 10) (fig. S16A). Las imágenes de bioluminiscencia mostraron una supresión tumoral significativamente mayor con gemcitabina sola o en combinación con BifidoSumIL-2 en comparación con PBS (fig. 5B y fig. S16B). El análisis de los pesos tumorales en el punto final del experimento confirmó además que la combinación de BifidoSumIL-2 y gemcitabina resultó en una mayor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con PBS, BifidoSumIL-2 o gemcitabina sola (fig. 5C y fig. S16C). De manera consistente, la combinación de BifidoSumIL-2 y gemcitabina mejoró la supervivencia en comparación con el control de PBS y los respectivos grupos de monoterapia (fig. 5D).

Además, exploramos el potencial terapéutico de combinar BifidoSumIL-2 con radiación ionizante (RI) y bloqueo de puntos de control inmunitario mediante el uso de un anticuerpo anti–PD-L1. Los ratones fueron tratados con inyecciones intravenosas de BifidoSumIL-2, solas o en combinación con RI abdominal, con o sin inyección intraperitoneal de un anticuerpo anti–PD-L1 (fig. 5E). Durante todo el período experimental, todos los ratones tratados con la doble combinación de BifidoSumIL-2 y RI, o con la triple combinación de BifidoSumIL-2, RI y anticuerpo anti–PD-L1, mantuvieron más del 95% de su peso corporal basal (día 9) (fig. S16D). La imagen de bioluminiscencia reveló una supresión numéricamente mayor del crecimiento tumoral con el tratamiento de triple combinación en comparación con el control de PBS y las monoterapias (fig. 5F y fig. S16E). De manera consistente, un análisis adicional de los pesos tumorales al final del experimento confirmó que la triple combinación resultó en una inhibición significativamente mayor del crecimiento tumoral en comparación con el control de PBS o cualquier otra monoterapia, lo que demuestra un efecto aditivo que supera la eficacia de las terapias individuales (fig. 5F y fig. S16F). En el análisis de supervivencia, tanto las combinaciones dobles como las triples demostraron una mediana de supervivencia prolongada en comparación con los controles de PBS. Aunque estas diferencias no alcanzaron significación estadística (P = 0,0581), la tendencia de la supervivencia fue consistente con la reducción de la carga tumoral al final del estudio. Para evaluar aún más el efecto antitumoral sistémico de la triple combinación, establecimos un modelo subcutáneo bilateral KPC en el que se administró RI localizada a un tumor, mientras que BifidoSumIL-2 y el anticuerpo anti–PD-L1 se administraron sistémicamente (fig. S16). En este entorno, la triple combinación suprimió significativamente el crecimiento del tumor contralateral no irradiado en comparación con los controles de PBS. En conjunto, estos hallazgos resaltan el potencial de BifidoSumIL-2 en las terapias combinadas y destacan su papel en el aumento de la eficacia del tratamiento.

DISCUSIÓN

A pesar de los recientes avances terapéuticos, el Cáncer de Páncreas Ductal Adenoide (CPDA) sigue siendo un cáncer altamente letal con un mal pronóstico debido a su microambiente tumoral inmunosupresor (TME) (^[1], ^[2]). En este estudio, nuestro objetivo fue lograr la administración dirigida de fármacos al tumor de SumIL-2, un análogo de IL-2 diseñado para activar selectivamente las células T efectoras, mediante el uso de B. longum. Modificamos genéticamente B. longum para que secrete SumIL-2 (BifidoSumIL-2) o luciferasa (BifidoLuci) y confirmamos la colonización selectiva de B. longum modificado en modelos tumorales subcutáneos, así como en un modelo ortotópico de CPDA con células KPC después de la administración sistémica (fig. 3 y fig. S4). BifidoSumIL-2 exhibió efectos antitumorales en modelos tumorales subcutáneos con células B16F1, MC38 y KPC (fig. 1, E a H). BifidoSumIL-2 funcionó a través de mecanismos dependientes de STING y de las células T CD8+ (fig. 2, A a C), lo que condujo a un aumento de la relación Teff/Treg tanto en el modelo de flanco B16F1 (fig. 1, D a H) como en los modelos ortotópicos de CPDA (fig. 4, F y G). La combinación de BifidoSumIL-2 con terapias convencionales, que incluyen quimioterapia, radiación e inmunoterapia, mejoró aún más la inhibición del crecimiento tumoral y la supervivencia en modelos ortotópicos de CPDA (fig. 5).

Las bacterias han despertado un interés significativo como "fármacos vivos" para la terapia del cáncer debido a su versatilidad y capacidad para prosperar en los TME hipóxicos, lo que permite la administración dirigida de fármacos y minimiza los efectos fuera del objetivo (^[28], ^[30]). Aunque el Bacillus Calmette-Guérin intravesical sigue siendo la única terapia bacteriana viva aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el cáncer hasta la fecha, un número creciente de estudios clínicos que investigan cepas modificadas (^[56]–^[58]), que incluyen E. coli, S. Typhimurium, L. monocytogenes y otras, destacan el potencial de traslación de las bacterias como plataformas de administración terapéutica programables. Entre estas, B. longum podría ofrecer una ventaja distinta como plataforma de administración dirigida al tumor, en comparación con las bacterias facultativas comúnmente utilizadas, como E. coli y S. Typhimurium. Como anaerobio obligado, B. longum coloniza selectivamente las regiones tumorales hipóxicas sin necesidad de modificaciones adicionales de la cepa para diseñar auxotrofía metabólica o atenuar la toxicidad (^[29], ^[30]). Los estudios preclínicos sugieren que las especies Bifidobacterium pueden actuar en sinergia con la inmunoterapia, probablemente a través de la activación inmune innata mediada por STING dentro del TME para superar la falta de respuesta inmune (^[36], ^[37]). Además, ciertas cepas de Bifidobacterium producen metabolitos como la inosina (^[39]) y el ácido indólico-3-láctico (^[59]–^[61]), que han demostrado actividad antitumoral (^[38]–^[41]). En este estudio, se espera que el BifidoSumIL-2 colonizado en el tumor ejerza un efecto aditivo a través de un mecanismo dual: la activación de la vía STING mediada por B. longum de la inmunidad innata y la activación selectiva de las células Teff inducida por SumIL-2. La activación de la inmunidad innata mediada por STING induce interferones de tipo I y citocinas inflamatorias, lo que mejora la presentación de antígenos a las células T y establece un puente entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas (^[62]). Al mismo tiempo, SumIL-2 impulsa la expansión y activación robustas de las células Teff sobre las células Treg, fortaleciendo la inmunidad adaptativa (^[23]). Como resultado, el tratamiento con BifidoSumIL-2 expandió preferentemente las células Teff sobre las células Treg dentro del TME e inhibió el crecimiento tumoral tanto en los modelos de flanco como en los modelos ortotópicos de CPDA, cambiando eficazmente el TME hacia un estado más inmunológicamente activo. Además, dado que la mayoría de las terapias contra el cáncer se administran en combinación, incluidos múltiples regímenes de quimioterapia, quimiorradioterapia o inmunoterapia combinada con radioterapia y/o quimioterapia, BifidoSumIL-2 ofrece una estrategia para mejorar los tratamientos estándar contra el cáncer. Este estudio demuestra que BifidoSumIL-2 combinado con gemcitabina o radiación y anticuerpos anti–PD-L1 condujo a una mayor inhibición del crecimiento tumoral que las monoterapias solas, lo que subraya su potencial en la terapia del cáncer.

En resumen, presentamos una prueba de concepto para un enfoque de inmunoterapia bacteriana viva que utiliza B. longum modificado genéticamente para secretar SumIL-2 para tratar el desafiante tumor de CPDA. Nuestros resultados sugieren que la administración de proteínas terapéuticas mediada por Bifidobacterium es una estrategia prometedora para remodelar el TME y mejorar las respuestas inmunes antitumorales en tumores sólidos difíciles. Las investigaciones futuras se centrarán en la evaluación preclínica a largo plazo para evaluar la durabilidad de la respuesta antitumoral, caracterizar la posible toxicidad tardía y los efectos fuera del objetivo de BifidoSumIL-2 y controlar el desarrollo de resistencia. El conjunto de herramientas de ingeniería de Bifidobacterium también está poco desarrollado en comparación con otros huéspedes bacterianos. Una mayor disponibilidad de partes genéticas bien caracterizadas (por ejemplo, promotores constitutivos e inducibles, etiquetas de secreción y de visualización en la superficie), estrategias de mantenimiento sin antibióticos y enfoques de biocontención pueden mejorar el diseño de la cepa para la traslación humana. Además, aunque el presente estudio utilizó la administración intravenosa, la viabilidad y el potencial terapéutico de la administración oral merecen una mayor investigación, dado su potencial para mejorar la traslación clínica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas y plásmidos bacterianos

B. longum ATCC15697 se utilizó en todo este estudio. El plásmido (pJL21) se derivó de B. longum MSK17.29, obtenido del repositorio de cepas bacterianas simbióticas del Duchossois Family Institute de la Universidad de Chicago. Los genes SumIL-2 y NanoLuc se insertaron en el pJL21 bajo el promotor del factor de elongación Tu (Ptuf) derivado de Bifidobacterium bifidum, ya sea con o sin una señal peptídica de secreción derivada de una proteína secretada hipotética (BLONRS02330). Las secuencias de estas partes genéticas se incluyen en la tabla S1. La transformación de B. longum ATCC15697 se realizó según lo descrito anteriormente (^[63], ^[64]). En resumen, se inoculó 2 ml de un cultivo nocturno en 100 ml de medio de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) que contiene 0,05% (p/p) de cisteína HCl y 20% (p/p) de glucosa y se incubó a 37 °C hasta que se alcanzó una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,6 a 0,9 (normalmente de 9 a 16 horas). Luego, los cultivos se enfriaron en hielo y se recolectaron mediante centrifugación a >4500 rpm durante 10 min a 4 °C. El pellet celular se lavó dos veces con tampón de lavado a 0 °C [0,5 M de sacarosa (Sigma-Aldrich) y 1,36 mM de ácido cítrico (Sigma-Aldrich), pH 5,8], se resuspendió en 2 ml de tampón de almacenamiento [tampón de lavado suplementado con 10% de glicerol (Sigma-Aldrich)] y se almacenó a −80 °C hasta la transformación posterior. Para la transformación, se electroporaron 50 μl de células B. longum_ ATCC15697 electrocompetentes (25 μF, 200 Ω, 2000 V) seguido de una recuperación durante 1 hora a 37 °C en medio MRS que contiene 0,05% de cisteína HCl. Posteriormente, las células transformadas se sembraron en placas de agar de medio clostridial reforzado (RCM) que contienen 0,05% de cisteína HCl y clorafenicol (5 μg/ml) y se cultivaron a 37 °C. Las colonias individuales se sembraron y se validó la presencia del gen mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las colonias. Los productos de PCR se confirmaron mediante secuenciación de Sanger en el Centro de Secuenciación de ADN de la Universidad de Chicago.### Líneas celulares de mamíferos

Las células HEK-Blue IL-2 reporteras se compraron a InvivoGen y se cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor (Gibco), penicilina-estreptomicina (Pen-Strep; 100 U/ml; Gibco), normocina (100 μg/ml; InvivoGen) y puromicina (1 μg/ml; InvivoGen). Las células MC38 (MC38-OTI, carcinoma de colon) y LLC se compraron a la Colección de Cultivos Celulares Estadounidenses, mientras que las células B16F1 (B16F1-OVA, melanoma) fueron un regalo de Y.-X. Fu (Universidad de Tsinghua). Las células KPC, proporcionadas por el laboratorio de H. G. Munshi (Universidad de Northwestern), se aislaron de tejidos tumorales espontáneos obtenidos de ratones LSL-KrasG12D/+, LSL-Trp53R172H/+, Pdx-1-Cre (^[46]). Las células KPC-luc se seleccionaron como clones únicos con puromicina (5 μg/ml; InvivoGen, San Diego, CA) después de la infección estable con lentivirus que expresan luciferasa. Todas las células tumorales se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de SFB inactivado por calor y Pen-Strep (100 U/ml) a 37 °C en 5% de CO2 y se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma antes de su uso.### Recolección de sobrenadantes, ELISA y ensayo de bioactividad in vitro

B. longum ATCC15697 de tipo salvaje se cultivó en medio MRS con 0,05% de cisteína HCl y 100 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,3). La cepa B. longum transformada se cultivó en el mismo medio con un suplemento adicional de clorafenicol (5 μg/ml). Las células se cultivaron en medio MRS tamponado, ya que la acidificación del medio durante el crecimiento en cultivos por lotes comprometió la bioactividad de SumIL-2. Se inoculó un volumen correspondiente a una DO600 de ~0,4 en 100 ml y se cultivó a 37 °C durante 8 horas, lo que resultó en una DO600 final de alrededor de 1,0. Después del cultivo, las muestras se transfirieron a hielo y se añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich) en una dilución de 1:10, según las instrucciones del fabricante. Luego, las muestras se centrifugaron a 10 000 rpm durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga preenfriada. Se recolectaron los sobrenadantes y se repitió el paso de centrifugación. Los sobrenadantes resultantes se almacenaron a −20 °C hasta su análisis posterior.

La concentración de SumIL-2 en los sobrenadantes se midió utilizando un kit ELISA de IL-2 humana (R&D Systems), siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes del análisis, los sobrenadantes de BifidoSumIL-2 se diluyeron 1:100 en tampón de reactivo (R&D Systems) debido al límite de detección (15 a 1000 pg/ml). Después del análisis, la concentración de IL-2 por DO600 en el sobrenadante se recalculó.

Para evaluar la bioactividad de SumIL-2 secretada por BifidoSumIL-2, se sembraron 50.000 células HEK-Blue IL-2 reporter en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía DMEM suplementado con 10% de FBS y Pen-Strep (100 U/ml). Los sobrenadantes de BifidoSumIL-2, con concentraciones determinadas previamente mediante ELISA, se diluyeron seriadamente en DMEM para obtener las concentraciones deseadas. Luego, se añadió un volumen de 20 μl de cada dilución a los pocillos. Se añadió hIL-2 recombinante a pocillos separados a concentraciones finales que oscilaron entre 1 y 250 pg/ml, y se utilizó como control positivo. La placa se incubó durante la noche a 37 °C en 5% de CO2. Al día siguiente, se tomaron 20 μl de sobrenadante de cada pocillo y se añadieron a 180 μl de la solución QUANTI-Blue preparada por pocillo. Luego, se incubó a 37 °C durante 1 hora. El nivel de fosfatasa alcalina secretada por las células HEK-Blue IL-2 reporter se midió evaluando la absorbancia de la solución a 635 nm (OD635) utilizando un lector de placas espectrofotométricas (Tecan Infinite 200 PRO).

Ensayo de retención de plásmidos

Las suspensiones de BifidoSumIL-2 se diluyeron 1:2000 en medio MRS fresco suplementado con 0,05% de cisteína HCl y 100 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,3), sin clorafenicol, y se cultivaron diariamente hasta alcanzar una OD600 máxima de 1,9. Las suspensiones se pasaron seriadamente cada día, y se sembraron 2,5 μl de diluciones seriadas 10 veces en agar RCM con o sin clorafenicol (5 μg/ml). Se contaron las UFC y se calcularon las UFC/ml en consecuencia.

Modelos tumorales in vivo

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de Envigo, y ratones hembra Tmem173−/−, Rag1−/− y MyD88−/− se adquirieron del Jackson Laboratory. Se utilizaron ratones de entre 6 y 10 semanas de edad para todos los experimentos. Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (ACUP n.º 72213). Todos los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, temperaturas de 20 °C a 23 °C y una humedad de 30% a 70%.

Para los modelos tumorales subcutáneos en la región lateral, se inyectaron células MC38 y B16F1 (1 × 106 células en 100 μl de PBS) por vía subcutánea en la región lateral de los ratones. Para el modelo tumoral bilateral KPC, se inyectaron 1 × 106 células KPC por vía subcutánea en una región lateral (designada como el tumor local) y 5 × 105 células KPC en la región lateral contralateral (tumor distal). Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula: (longitud × anchura × altura)/2 (mm3). El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3. Se retiraron los ratones cuando los volúmenes tumorales individuales superaron los 2000 mm3. Para un modelo metastásico de LLC, se inyectaron células LLC (2 × 105) por vía intravenosa, y el tratamiento se inició el día 7.

Para el modelo ortotópico de CPDA, se inyectaron células KPC o KPC-luc (2 × 105 a 5 × 105 células en 50 μl de PBS) directamente en la cola del páncreas de ratones anestesiados con isoflurano. El tratamiento se inició entre los días 10 y 12. El crecimiento del tumor KPC-luc se controló mediante imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de imágenes in vivo (IVIS; Lumina XR). Se administró d-luciferina (XenoLight) por vía intraperitoneal a los ratones 30 minutos antes de la imagen IVIS. Se utilizaron los programas Living Image (versión 4.5, Xenogen) y Aura para adquirir una secuencia de imágenes. Se dibujó la región de interés en la zona superior del abdomen y se midieron los datos de flujo de fotones. Se controlaron los pesos corporales de los ratones durante el período experimental según fuera necesario.

Para los tratamientos contra el cáncer, las cantidades de una sola dosis fueron las siguientes: B. longum de tipo salvaje, BifidoSumIL-2 o BifidoLuci, 5 × 106 UFC por ratón (equivalente a 100 μl de suspensión bacteriana ajustada a una OD600 de aproximadamente 0,1); hIL-2, 10 μg por ratón (Roche); SumIL-2–Fc, 5 μg por ratón (un regalo de Y.-X. Fu); gemcitabina (Sigma-Aldrich), 100 μg por ratón; anti–PD-L1 (10F.9G2, BioXCell), anti-CD8 (2.43, BioXCell) o anticuerpos anti-CD4 (GK1.5, BioXCell), 100 μg por ratón; radiación abdominal, 10 gray (XRad 225Cx). A menos que se especifique lo contrario, las monoterapias se administraron de la siguiente manera: B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2 (por vía intravenosa, tres veces, cada dos días); hIL-2, SumIL-2–Fc, gemcitabina o anti–PD-L1 (por vía intraperitoneal, tres veces, cada dos días); y radiación abdominal (una sola dosis al inicio del tratamiento). Las terapias combinadas consistieron en las dosis combinadas de las respectivas monoterapias. Una inyección intravenosa de 100 μl de PBS se utilizó como control y se administró en los mismos días que las demás inyecciones.

Análisis histológico

Para el análisis de nódulos de LLC, se recogieron los pulmones 20 días después de la inyección del tumor para el examen histológico. Los pulmones se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 2 días y se enviaron al Centro de Recursos de Tejidos Humanos de la Universidad de Chicago para su inclusión y procesamiento. Las secciones de tejido se tiñeron utilizando un tinte automático Leica Bond RX, se escanearon utilizando un escáner de portaobjetos completo CRi Pannoramic SCAN ×40 y se analizaron con QuPath (v0.1.2) e ImageJ (v1.53a).

Biodistribución de BifidoSumIL-2 y ELISA para IL-2 derivado de tejido

Se administró una sola inyección intravenosa de BifidoSumIL-2 a ratones con tumores B16F1 subcutáneos que habían alcanzado aproximadamente 100 mm3. A los 1, 3, 7, 10 y 13 días después de la inyección, se recogieron los tumores y los órganos (hígado, bazo, riñón, corazón y pulmón), junto con los tumores y los órganos de ratones no tratados con tumores como controles. Los tumores y los órganos se colocaron sobre hielo y se cortaron por la mitad. Una mitad se utilizó inmediatamente para el análisis de la biodistribución de BifidoSumIL-2, mientras que la otra se pesó y se almacenó a −80 °C para el análisis de ELISA.

Para el análisis de la biodistribución, se pesaron las muestras y se homogeneizaron en 1 ml de PBS utilizando cuentas de acero inoxidable (5 mm de diámetro, QIAGEN) y un homogeneizador PowerLyzer 24 (QIAGEN). Los homogeneizados se diluyeron seriadamente y se sembraron en placas de agar RCM presecadas y prerreducidas que contenían clorafenicol (5 μg/ml), y luego se incubaron a 37 °C. Simultáneamente, se recogieron 100 μl de sangre en tubos tratados con EDTA y se sembraron en placas de agar RCM que contenían clorafenicol (5 μg/ml). El límite de detección se indica en la figura.

Para el análisis de ELISA, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (100×, Halt) según las instrucciones del fabricante antes de descongelar. Los tejidos tumorales se homogeneizaron con 1 ml de PBS. Se utilizó un kit de ELISA para IL-2 humana (Invitrogen) para la detección de IL-2. El resultado se calculó como una concentración de IL-2 (picogramos) por peso de tejido (gramos).

Biodistribución de BifidoLuci en el modelo ortotópico de CPDA

Los ratones con tumores KPC ortotópicos recibieron una sola inyección intravenosa de BifidoLuci. Para las imágenes de bioluminiscencia in vivo, se administraron 100 μl de Fluorofurimazina (333 nmol, AOBIOUS) por vía intravenosa antes de cada sesión de imagen, y se controló la intensidad de la bioluminiscencia corporal diariamente desde los días 1 hasta 6 utilizando el IVIS (Lumina XR). Para el análisis de la biodistribución, se administró BifidoLuci por vía intravenosa tres veces cada dos días a ratones con tumores KPC ortotópicos. Tres días después del último tratamiento, se administró una inyección intravenosa de 100 μl de Fluorofurimazina, y luego se recogieron los tumores y los órganos. Los tejidos recogidos se colocaron en una placa de 12 pocillos y se visualizaron utilizando el IVIS (Lumina XR).

Perfilado de células inmunitarias

Al séptimo día después del último tratamiento con PBS, hIL-2, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2, se recogieron los tumores y los bazo de ratones con tumores B16F1 subcutáneos u tumores KPC ortotópicos de CPDA y se colocaron en un tampón de aislamiento [RPMI 1640 (VWR) suplementado con 5% de FBS inactivado por calor (Gibco), Pen-Strep (100 U/ml) y 10 mM de Hepes (Gibco)]. Los tejidos se cortaron finamente y se digirieron durante 1 hora a 37 °C con colagenasa IV (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) y desoxirribonucleasa I (200 μg/ml; Sigma-Aldrich). Después de la digestión, las suspensiones celulares se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm y se lavaron en un tampón de aislamiento antes de la tinción. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: CD16/CD32 (2.4G2) de BioXcell; CD45 (30-F11), CD11b (M1/70), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), NK1.1 (PK136), CD3 (17A2), CD11c (N418), F4/80 (BM8), Ly6C (HK1.4), MHCII (M5/114.15.2), PD-1 (29F.1A12) y Tim3 (RMT3-23), CD19 (ID3), CD86 (GL-1), INOS (CXNFT) y CD206 (C068C2) de BioLegend; Ly6G (1A8), NK1.1 (PK136), CD8 (53-6.7), F4/80 (T45-2342), TCF1 (S33-966) y CD11c (HL3) de BD Biosciences. Se excluyeron las células muertas utilizando el kit de tinción de células muertas fijas amarillas LIVE/DEAD (Invitrogen). Los datos de citometría de flujo se adquirieron utilizando un Cytek Aurora y se analizaron con FlowJo (v10.8.1).

Prueba de lesión hepática y medición de citocinas en suero y en el microambiente tumoral

Los ratones de tipo salvaje recibieron una sola inyección intravenosa de B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2, PBS o inyecciones intraperitoneales de hIL-2. Se recogieron muestras de suero al séptimo día después de las inyecciones. Se utilizaron kits de ensayo AST/ALT de Sigma-Aldrich para la detección de AST/ALT. Los resultados se calcularon siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la medición de citocinas, se recogieron muestras de suero del seno venoso retroorbital al séptimo día después del último tratamiento con PBS, hIL-2, B. longum de tipo salvaje o BifidoSumIL-2. Se recogieron los tumores al séptimo día después del último tratamiento, se homogeneizaron y se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos para recoger los sobrenadantes. A todas las muestras se añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (Thermo Fisher Scientific). Se midieron las citocinas inflamatorias utilizando un kit de panel de inflamación para ratón LEGENDplex (13-plex) (BioLegend).

Estudio de cocultivo triple in vitro, Western blot y RT-qPCR

Para generar BMDM, se extrajeron células de la médula ósea de los fémures y las tibias de ratones C57BL/6 de tipo salvaje o Tmem173−/−. Después de la lisis de los glóbulos rojos con tampón de amonio-cloruro-potasio (Corning), las células restantes se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, Pen-Strep (100 U/ml), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) recombinante (20 ng/ml; R&D Systems) e IL-4 recombinante para ratón (10 ng/ml; PeproTech). Al cuarto día, el medio se reemplazó por completo con medio fresco precalentado que contenía las mismas concentraciones de GM-CSF e IL-4. Al sexto día, las células semisuspendidas y ligeramente adheridas se recogieron mediante una suave pipeteo y se utilizaron como BMDM. Para el sistema de cocultivo triple, se cocultivaron BifidoSumIL-2 (4 × 106 UFC) con BMDM (4 × 105 células) aisladas de ratones de tipo salvaje o Tmem173−/−, en presencia de células B16F1 (4 × 104 células) in vitro. Después de 24 horas de incubación, se aislaron los BMDM utilizando el kit de selección positiva FITC para ratón EasySep II (STEMCELL Technologies) con un anticuerpo anti-CD45 para ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BioLegend). Luego, se extrajeron proteínas totales y ARN para el análisis de Western blot y la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR), respectivamente.

Se prepararon lisados celulares completos utilizando tampón de lisis y extracción RIPA (Thermo Fisher Scientific) suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas Halt y cóctel de inhibidores de fosfatasas de un solo uso Halt (Thermo Fisher Scientific). Se separaron cantidades iguales de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con 5% de albúmina sérica bovina en tampón salino tamponado con Tris que contiene Tween 20 (TBST) durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios (anti-IRF3, Cell Signaling Technology; anti-pIRF3, Cell Signaling Technology; anti-α-actina, Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 °C. Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y se detectaron las señales utilizando el sustrato de Western blot ECL Pierce (Thermo Fisher Scientific).

Se extrajo ARN total utilizando el kit RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN), seguido de la síntesis de ADNc utilizando el kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. Se realizó RT-qPCR utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Los niveles de expresión del gen diana se normalizaron con respecto a la β-actina, y la cuantificación relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCT. Secuencias de los primers: mCxcl10-F, 5′-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3′; mCxcl10-R, 5′-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3′; mIfnβ-F, 5′-CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC-3′; mIfnβ-R, 5′-GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT-3′; mIsg15-F, 5′-GGTGTCCGTGACTAACTCCAT-3′; y mIsg15-R, 5′-TGGAAAGGGTAAGACCGTCCT-3′.

Análisis estadístico

Las curvas de crecimiento tumoral se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los gráficos de barras de carga tumoral se analizaron utilizando ANOVA de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Para otros gráficos de barras, se aplicó ANOVA de una vía o pruebas t de dos colas de Student. Los datos se presentan como medias ± SEM. Los números de muestras y réplicas se muestran como puntos de datos individuales o se detallan en las leyendas de las figuras. GraphPad Prism se utilizó para todos los análisis estadísticos y la generación de figuras. Se consideró estadísticamente significativo un valor P de