La actividad citolítica inmune se correlaciona con las alteraciones del microambiente tumoral en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más común y el segundo más mortal [^[1]], con un pronóstico que depende principalmente de su estadio en el momento del diagnóstico. Es uno de los cánceres más heterogéneos, con cuatro subtipos moleculares consensuados distintos [^[2]]. Se caracteriza principalmente por la inestabilidad genética, ya sea debido a la inestabilidad cromosómica (CIN) [^[3]] o a la deficiencia en el sistema de reparación de errores de emparejamiento de ADN (dMMR) [^[4]], lo que conduce a una alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), generalmente con silenciamiento de MLH1, y la acumulación de más mutaciones [^[5],^[6]]. Estas lesiones del ADN, una vez acumuladas, a menudo generan neoepítopos cancerosos inmunogénicos, que atraerán un gran número de tipos de células inflamatorias al microambiente tumoral (MET), contribuyendo finalmente a su patogénesis [^[7]].

Aunque la opción de tratamiento estándar incluye la extirpación quirúrgica, seguida habitualmente de quimioterapia adyuvante con 5-FU y/o terapia dirigida, dependiendo del estadio del tumor [^[8]], en la última década, la inmunoterapia ha permitido alcanzar tasas de éxito sin precedentes en el control tumoral duradero y ha mejorado el beneficio en la supervivencia de los pacientes con cáncer avanzado. Es importante destacar que las terapias de inhibición de puntos de control inmunitario (ICI) que utilizan anticuerpos monoclonales específicos anti-PD-1/PD-L1 y/o anti-CTLA-4 para tratar a pacientes metastásicos con dMMR/MSI-H han generado un gran entusiasmo por la inmunoterapia en esta enfermedad [^[9],^[10]]. Sin embargo, los pacientes metastásicos con dMMR/MSI-H representan solo una fracción del total de la población de pacientes con CCR, y la gran mayoría de ellos, que tienen un sistema MMR competente o ausencia de inestabilidad de microsatélites (pMMR/MSS), no se beneficiarán de estas terapias ICI.

La deficiencia en el sistema de reparación de errores de emparejamiento de ADN (dMMR) se asocia con un aumento de la inestabilidad genómica y distintos procesos mutacionales en el cáncer colorrectal [^[11]]. Entre estos, la cromotripsia representa un evento genómico catastrófico caracterizado por una extensa fragmentación y reensamblaje de cromosomas que se produce en una sola crisis. Se han notificado eventos cromotrópicos en múltiples tipos de tumores, incluido el cáncer colorrectal, y se asocian con alteraciones estructurales complejas que pueden influir en la evolución del tumor y las interacciones inmunitarias [^[12],^[13]].

Los tumores con cromotripsia se asociaron con una reducción de la infiltración de células T CD8+, una disminución de las respuestas inmunitarias antitumorales y una respuesta más débil a la inmunoterapia con ICI, mientras que los tumores sin cromotripsia se asociaron con una mayor supervivencia tras la inmunoterapia [^[14]].

Las aberraciones del número de copias (CNAs) se observan con frecuencia en los tumores de colon MSS y se asocian con la regulación al alza de los perfiles de expresión génica y sus vías de señalización, lo que promueve la carcinogénesis [^[15]]. Un aumento de la carga del número de copias se asocia con una baja actividad inmunitaria antitumoral, evasión inmunitaria y resistencia a la inmunoterapia [^[16]].

La clasificación de los diferentes subtipos inmunológicos en el CCR puede predecir la respuesta del paciente a las terapias ICI y mejorar la actividad antitumoral [^[17]], y los esfuerzos actuales se centran en cómo podemos reprogramar el MET para mejorar estos enfoques [^[18]]. El MET es el ecosistema que rodea un tumor e incluye la matriz extracelular, los fibroblastos, los vasos sanguíneos y las células estromales. También abarca diferentes tipos de células inmunitarias, incluidas las neutrófilas, las células dendríticas (DCs), las células asesinas naturales (NK), las células T y las células B, las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSCs) y los macrófagos asociados al tumor (TAMs). Su composición puede predecir el pronóstico del paciente y la respuesta a las terapias ICI [^[19],^[20]].

Uno de los componentes cruciales del MET son los linfocitos infiltrantes tumorales (TILs), que mejoran las respuestas inmunitarias antitumorales al reconocer y matar las células cancerosas autólogas [^[21]]. Están compuestos principalmente por células T CD8+/CD4+ [^[22]] y son actualmente uno de los tipos de inmunoterapia contra el cáncer más prometedores debido a su alta eficacia [^[23]]. Dado que el MET contribuye significativamente a la progresión del cáncer [^[24]] y las anomalías en él pueden interrumpir los enfoques inmunoterapéuticos, una mejor comprensión del mismo debería proporcionar nuevos conocimientos sobre la inmunoterapia de la enfermedad. Además, la heterogeneidad del MET no se ha evaluado en profundidad.

Los linfocitos T citotóxicos (CTLs) pueden atacar y matar las células cancerosas a través de la vía de la granzima-perforina [^[25]]. Las perforinas abren poros en la membrana de las células cancerosas diana, facilitando la entrada de las granzimas en ellas, lo que finalmente elimina la célula cancerosa de forma apoptótica [^[25],^[26]]. La actividad citotóxica inmunitaria intratumoral (CYT) es una medida relativamente nueva de la activación inmunitaria, basada en la media geométrica de la expresión de las toxinas mencionadas anteriormente [^[25],^[27]]. Las células cancerosas eliminadas liberan neoepítopos cancerosos que estimulan aún más la inmunidad adaptativa. Sin embargo, las células cancerosas han desarrollado varios mecanismos para escapar de la vigilancia inmunitaria, como la secreción de citocinas o quimiocinas solubles, que pueden reclutar células supresoras [por ejemplo, células T reguladoras (Tregs) y MDSCs] en el MET, o mediante la regulación de la activación de las células T a través de señales coestimuladoras y coinhibidoras (por ejemplo, PD-1, CD86/CD80, CTLA-4, etc.) [^[28]], lo que conduce a un MET inmunosupresor [^[29]].

Dado que la incidencia de CCR está aumentando, y la mayoría de los pacientes con CCR, especialmente aquellos con tumores de CCR pMMR/MSS, siguen teniendo un mal pronóstico o desarrollan resistencia a la inmunoterapia con ICI, nuestro objetivo fue investigar el MET en los pacientes con CCR utilizando análisis de transcriptómica y genómica. Específicamente, buscamos identificar dos subtipos inmunitarios de tumores de CCR asociados con los niveles de CYT de los pacientes y dilucidar sus características inmunológicas y microambientales. En el presente estudio, nuestro objetivo fue identificar los mecanismos responsables de las aberraciones dentro del MET y comprender cómo las células inmunitarias y la CYT se asocian con estas aberraciones con el fin de identificar nuevos objetivos terapéuticos o posibles biomarcadores, mejorando en última instancia el manejo de la enfermedad, mejorando la calidad de vida y aumentando la esperanza de vida de los pacientes.

Si bien la asociación entre el estado MSI-H y la elevada actividad citotóxica inmunitaria en el cáncer colorrectal se ha descrito previamente [^[17],^[27]], aquí ampliamos estos hallazgos integrando la CYT con el estado de competencia inmunitaria, características de inestabilidad genómica a gran escala, incluida la cromotripsia, y las interacciones tumorales-inmunitarias funcionales evaluadas utilizando un sistema de cocultivo 3D dinámico. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que vincula de forma descriptiva los eventos cromotrópicos con los estados inmunitarios definidos por la CYT en el CCR y que combina la estratificación inmunogenómica con los ensayos de extravasación y citotoxicidad de las células inmunitarias en tiempo real.

2. Resultados

2.1. Los tumores de CCR inmunocompetentes son principalmente CYT-altos y demuestran características diferenciales del MET en comparación con los inmunodeficientes

Al comparar la competencia inmunitaria y los niveles citotóxicos entre los tumores, encontramos una alta correlación entre los CCR inmunocompetentes (IC) y los CYT-altos (65,8%, 52/79), mientras que el 71,4% (30/42) de los tumores inmunodeficientes (ID) fueron al mismo tiempo CYT-bajos (Figura 1a). Cabe destacar que la proporción de enfermedad en estadio IV fue comparable entre los tumores CYT-altos y CYT-bajos (17,5% frente a 16,7%, respectivamente), lo que indica que una mayor actividad citotóxica no impide la progresión metastásica (Tabla S3 complementaria). El análisis descriptivo estratificado por edad reveló que tanto los tumores CYT-altos como los CYT-bajos, así como los subgrupos IC e ID, se diagnosticaron principalmente en pacientes ≥50 años, sin un enriquecimiento aparente de fenotipos inmunitarios específicos en el CCR de inicio temprano ( 0,2) se consideraron que tenían una correlación significativa entre ellos. Para todos los análisis de correlación que involucraron firmas de genes inmunes, citoquinas e infiltración de células inmunes, los valores p se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg. Solo se consideraron estadísticamente significativas las correlaciones con un valor p ajustado por FDR < 0,05. Se utilizó CIBERSORT (https://cibersortx.stanford.edu/) para calcular la proporción de 22 infiltrados de células inmunes distintos.

El índice citotóxico (CYT) en cada muestra de CRC se calculó utilizando la media geométrica de la expresión de GZMA y PRF1, como se explicó anteriormente [^[47]], para capturar la actividad efectora citotóxica en lugar de la abundancia de células inmunes. Esta definición excluye intencionalmente los marcadores de linaje, como CD8A y CD8B, que reflejan la cantidad de células T, y se centra en cambio en los genes que codifican la maquinaria citotóxica principal de la granzima y la perforina. Luego, los pacientes se clasificaron en un subgrupo citotóxico con alta expresión de CYT y un subgrupo citotóxico con baja expresión de CYT, en función de los cuartiles superior o inferior del 25 % del índice citotóxico, respectivamente [^[17]].

Se realizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales multivariable de Cox para evaluar el valor pronóstico de la actividad citotóxica (CYT), ajustando por el estadio TNM y el estado de MSI. Se calcularon las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95 % (IC) utilizando el paquete de supervivencia en R (v3.8-6).

4.3. Clasificación del subtipo molecular de consenso (CMS)

Se obtuvieron datos de expresión génica de secuenciación de ARN para el adenocarcinoma de colon de TCGA (TCGA-COAD) utilizando el paquete R TCGAbiolinks (v2.40.0) del Genomic Data Commons, utilizando el flujo de trabajo "STAR—Counts". Los recuentos brutos se transformaron log2 después de filtrar los genes con anotaciones faltantes o vacías y asignar los identificadores Ensembl a los símbolos de los genes en función de las anotaciones proporcionadas por GDC. La clasificación de CMS se realizó utilizando un enfoque basado en firmas, en el que se puntuaron los conjuntos de genes predefinidos que representan CMS1-CMS4 en cada muestra calculando la expresión media de los genes dentro de cada firma, y las muestras se asignaron al subtipo con la puntuación más alta [^[2]]. Todos los análisis se realizaron en R (v4.6).

4.4. Análisis de enriquecimiento funcional de los DEGs

Determinamos los conjuntos de genes y las vías en los que estaban enriquecidos los subgrupos de tumores con citotoxicidad inmune utilizando la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (https://www.genome.jp/kegg/; accedido el 20 de enero de 2025) y el análisis de enriquecimiento funcional de la ontología génica (https://geneontology.org/; accedido el 20 de enero de 2025).

4.5. Firmas inmunes y fracciones celulares

Extrajimos las firmas inmunes y las fracciones de tipos de células en cada subgrupo de citotoxicidad inmune del Atlas del inmunoma del cáncer (TCIA) (https://tcia.at/; accedido el 10 de febrero de 2025) [^[70]]. Las firmas inmunes se expresaron en log2(TPM + 1) y se presentaron como mapas de calor de los valores de expresión media. En concreto, extrajimos 35 firmas génicas específicas de neutrófilos, células NK, monocitos, MDSC, macrófagos, células dendríticas inmaduras, células dendríticas activadas, eosinófilos, células NK CD56bright, células NK T, células dendríticas plasmocitoides, mastocitos, células NK CD56Dim, células CD4 activadas, células B inmaduras, células T colaboradoras tipo 2, células B activadas, células T colaboradoras de memoria efectoras, células CD8 activadas, células CD4 de memoria central, células CD8 de memoria central, células colaboradoras tipo 17, células CD8 de memoria efectoras, células T reguladoras, células B de memoria, células colaboradoras tipo 1, células T gamma-delta, células T colaboradoras foliculares, MHC de clase I, MHC de clase II, MHC de clase no clásica I, MHC de clase no clásica II, antígenos germinales del cáncer, inmunostimuladores e inmunoinhibidores (Tabla S2 complementaria).

4.6. Correlación de CYT con la expresión de los puntos de control inmunitarios, las citoquinas, otros genes relacionados con la inmunidad y el nivel de infiltración inmune

Luego, correlacionamos la expresión de los puntos de control inmunitarios con CYT en todas las muestras tumorales, utilizando TIMER 2.0. (http://timer.cistrome.org/; accedido el 20 de febrero de 2025). La expresión (log2RSEM) de 11 puntos de control inmunitarios (PDCD1 (PD-1), CD274 (PD-L1), PDCD1LG2 (PDL2), CTLA-4, IDO1, IDO2, HAVCR2 (TIM3), ADORA2A (A2AR), LAG3, VISTA (C10orf54) y VTCN1 (B7-H4)) también se correlacionó con el nivel de infiltración inmune en cada muestra tumoral, utilizando la prueba de Spearman, después de corregir por la pureza del tumor [^[68]].

CYT también se correlacionó con la expresión de citoquinas (C1QA, C1QB, C1QC, CXCL9, CXCL10, CXCL11 y CXCL13) y otros genes relacionados con la inmunidad (IL2RB, TIGIT, CCL5, CD96, HLA-DRA, CD8A, GZMH, FASLG, NKG7 y FOXP3), como se describió anteriormente [^[17]].

Además, exploramos la expresión de CD8A en los diferentes subtipos inmunes (C1, C2, C3, C4 y C6), como se definió por Thorsson et al. (2018) [^[48]], así como en los tumores con inestabilidad cromosómica (CIN), genómicamente estables (GS), con mutaciones de inserción-deleción hipermutadas (HM-indel) y tumores con mutaciones de un solo nucleótido hipermutadas (HM-SNV) [^[71]].

4.7. Distribución de la infiltración inmune en diferentes mutaciones génicas

Investigamos si los genes que albergan las mutaciones puntuales somáticas no sinónimas más frecuentes (el 10% superior) o las aberraciones del número de copias somáticas (SCNA) [^[17]] se asocian con la abundancia de infiltrados inmunitarios. La significación estadística de la distribución de los niveles de infiltración inmunitaria en diferentes estados de mutación génica en cada subconjunto inmunitario se estimó utilizando la prueba de rango de Wilcoxon de dos colas.

Las SCNAs incluyeron la deleción profunda (−2), la deleción a nivel de brazo cromosómico (−1), el estado diploide/normal (0), la ganancia a nivel de brazo cromosómico (1) y la alta amplificación (2), según lo definido por GISTIC 2.0 [^[61]]. Exploramos la distribución de cada subconjunto inmunitario en cada estado del número de copias y comparamos el nivel de infiltración para cada SCNA en el CRC con el normal, utilizando la prueba de rango de Wilcoxon de dos colas.

Los CRCs sin datos disponibles sobre la inestabilidad genómica se excluyeron del análisis. Las tasas de mutación silenciosa y no silenciosa fueron el número de mutaciones dividido por la longitud del genoma objetivo en Mb. En la carga de SCNAs, el ‘número de segmentos’ fue igual al número total de segmentos en los perfiles del número de copias de cada muestra.

4.8. Cromotripsia

Exploramos además las tasas de cromotripsia (es decir, la fragmentación de uno o más cromosomas en numerosos fragmentos, que luego se reensamblan de manera desorganizada) con baja y alta confianza (canónica o con otros eventos complejos) en los diferentes subgrupos citolíticos (CYT-alto, CYT-bajo), así como en los diferentes subgrupos de ‘competencia inmunitaria’ (IC e ID) de los CRCs. Para el análisis, utilizamos datos extraídos de la cohorte PCAWG, utilizando Chromothripsis explorer (http://compbio.med.harvard.edu/chromothripsis/; accedido el 20 de marzo de 2025) con los siguientes criterios: 6 puntos de ruptura en la región de cromotripsia, 4 oscilaciones de CN, 4 oscilaciones de CN en 3 estados de CN, 0,13 de pureza y 1,283 de ploidía. Se utilizaron gráficos de Circos para visualizar los perfiles de mutación complejos, como se describió anteriormente [^[12]].

4.9. Heterogeneidad Intra-tumoral

La heterogeneidad intra-tumoral se midió calculando el ancho de la distribución de las Frecuencias de Alelos Variante (VAF), y se asignó una puntuación de Heterogeneidad de Alelos Mutantes (MATH) a cada muestra como la relación entre el ancho y el centro de su distribución de fracciones de alelos mutantes entre los loci mutados específicos del tumor [^[17]].

4.10. Aberraciones del Número de Copias y Genes Impulsores del Cáncer

La identificación de las regiones genómicas con amplificaciones o deleciones significativas (CNAs) y de los genes impulsores del cáncer, basada en la agrupación posicional, se realizó utilizando el análisis GISTIC v2 y los archivos MAF [^[72]]. Se asignó una puntuación G, que tiene en cuenta la amplitud de la aberración, así como la frecuencia de su aparición en cada muestra tumoral. Calculamos las CNAs manteniendo la suma de los cambios medios de los segmentos ≥ 0,6 y ≤ −0,4 entre las muestras somáticas y normales. Se consideraron significativas las regiones con valores q de FDR < 0,1.

4.11. Predicción de Neoepítopos del Cáncer

Estimamos la composición celular de los neoantígenos del cáncer por Mb en los subgrupos CYT e IC/ID, utilizando datos de TCIA (https://tcia.at/; accedido el 1 de abril de 2025) [^[73],^[74]].

4.12. Predicción de la Respuesta a la Terapia con ICI

Se utilizó Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE) (http://tide.dfci.harvard.edu/; accedido el 15 de abril de 2025) para predecir las respuestas de los pacientes a la terapia con ICI en cada subgrupo inmunitario CYT. TIDE evalúa la disfunción y la exclusión inmunitarias del tumor a partir de la expresión génica pretratamiento mediante la modelización de dos mecanismos clave: la disfunción de las células T en los tumores con alta infiltración de células T y la exclusión de las células T en los tumores con baja infiltración. La abundancia de células T se estimó utilizando la expresión de CD8A, CD8B, GZMA, GZMB y PRF1. Se calcularon las puntuaciones de disfunción y exclusión basándose en firmas génicas predefinidas y se integraron en una puntuación TIDE compuesta, con puntuaciones más altas que reflejan una mayor evasión inmunitaria. Posteriormente, se clasificó a los pacientes como respondedores (puntuaciones TIDE bajas) o no respondedores (puntuaciones TIDE altas) a la terapia con ICI [^[75]].

Para la estimación de la abundancia de células T CD8+ dentro del marco de TIDE, se utilizó un conjunto de genes más amplio (CD8A, CD8B, GZMA, GZMB, PRF1) para capturar tanto la identidad de la línea celular como el potencial citotóxico de las células T CD8+.

4.13. Líneas Celulares de CRC y Preparación de Células T

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT-116 y HT-29 se cultivaron en medio McCoy’s 5A suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2.

Las células T se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aisladas de donantes sanos mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll. Las PBMC se activaron utilizando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), según las instrucciones del fabricante, en presencia de 30 U/mL de interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Las células T activadas se cultivaron y se expandieron en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2 durante 24 o 48 horas antes del cocultivo y los ensayos de citotoxicidad, y se utilizaron en todos los ensayos.

4.14. Cultivo Celular de CRC Tridimensional (3D)

Los modelos tumorales 3D se generaron utilizando las células de CRC HCT-116 y HT-29, como se describió anteriormente [^[57],^[76]]. En resumen, ambas líneas celulares de CRC se resuspendieron en una mezcla 1:1 (v/v) de medio McCoy (suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina) y una solución de alginato al 1%, lo que resultó en una concentración final de alginato del 0,5% (p/v).

La suspensión celular resultante se depositó en un baño de gelificación de CaCl2 0,5 M para permitir la formación de esferoides. Posteriormente, los hidrogeles se lavaron con agua destilada y se transfirieron a una placa de 96 pocillos. Los cultivos 3D se mantuvieron durante la noche en medio McCoy suplementado con un 10% de FBS, un 1% de penicilina/estreptomicina y 5 mM de CaCl2 para garantizar la estabilidad del hidrogel.

4.15. Cultivo Celular Dinámico de las Células de CRC HCT-116 y HT-29 con Células T

Se establecieron cocultivos dinámicos utilizando el Dispositivo MIVO de Flujo Único (React4Life, Génova, Italia) para recapitular un TME dinámico 3D. Se contaron las células T y se resuspendieron en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS, un 1% de penicilina-estreptomicina y 30 UI/mL de IL-2 (por 1 × 106 células). La suspensión celular se cargó en la cámara MIVO (volumen de 1,5 mL) para lograr una relación efector:objetivo (E:T) de 10:1 con las células HCT-116 y HT-29.

La circulación de las células T se generó utilizando un sistema de bombeo ajustado a una velocidad de flujo, según las instrucciones del fabricante, para simular condiciones de flujo similares a las capilares. Los hidrogeles de HCT-116 y HT-29 tridimensionales se cultivaron en un compartimento separado y se aislaron físicamente de las células T circulantes mediante una membrana porosa permeable, lo que permite la difusión de factores solubles sin contacto directo entre las células.

Se incluyeron controles positivos y negativos para la migración celular. El control positivo consistió en andamios de alginato 3D vacíos (sin células tumorales) cultivados en RPMI-1640 suplementado con un 40% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina para actuar como un quimioatractante. El control negativo consistió en condiciones sin andamios de alginato y sin suplementación de quimioatractantes, utilizando RPMI-1640 (Invitrogen, Toulouse, Francia) que contiene solo un 10% de FBS, para evaluar la migración de fondo.

4.16. Extravasación e Infiltración de Células T en los Modelos Tumorales 3D de HCT-116 y HT-29

Para evaluar la extravasación y la infiltración de las células T, se recogieron las células después de 24 horas de cocultivo dinámico del medio que rodea los hidrogeles tumorales 3D dentro de los insertos de transwell. Esta recolección permitió la cuantificación de la proporción de células T que se extravasaron del circuito similar a los capilares, sirviendo como un modelo del torrente sanguíneo humano.

También se recogieron las células del compartimento circulatorio para cuantificar la proporción de células que permanecieron en circulación en las diferentes condiciones experimentales, incluidos los controles positivo y negativo. Tanto las células T circulantes (circuito capilar) como las células T extravasadas (nicho tumoral) de muestras triplicadas y grupos de control se recogieron y se contaron utilizando un hemocitómetro Bioanalytic GmbH (Friburgo, Alemania). Estas mediciones se utilizaron para calcular las proporciones de células T que sufrieron extravasación e infiltración tumoral, así como su contribución posterior a la apoptosis de las células tumorales.

4.17. Análisis de Citometría de Flujo

Se realizó citometría de flujo para caracterizar el fenotipo de las poblaciones de células T estándar, circulantes, extravasadas e infiltradas. Las células T circulantes se recuperaron del dispositivo MIVO, las células T migradas de los insertos de transwell y las células T infiltradas de los hidrogeles 3D. Estas poblaciones se compararon con los cultivos estándar de células T utilizados como controles positivos. Las células se lavaron con PBS sin Ca2+/Mg2+ y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD4 y CD8. Las células T se tiñeron con anticuerpos anti-CD4-APC y anti-CD8 (fluorocromo verde).

También se evaluó la apoptosis de las células HCT-116 y HT-29 después del cocultivo dinámico mediante citometría de flujo. Las células cancerosas se recuperaron de los andamios de alginato 3D disolviendo la matriz de alginato utilizando una solución de solubilización de alginato (0,15 M de NaCl, 100 mM de citrato trisódico dihidrato) e incubando durante 30 minutos a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2, según las instrucciones del fabricante.

Las células recuperadas se lavaron con PBS sin Ca2+/Mg2+ y se tiñeron con anexina V y PI para discriminar las poblaciones de células vivas, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y necróticas. En resumen, las células se lavaron, se centrifugaron, se resuspendieron en PBS helado y se centrifugaron de nuevo. Se descartaron los sobrenadantes y se tiñeron los gránulos celulares con solución de anexina V-FITC y PI. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. En paralelo, se evaluó la apoptosis de las células inmunitarias aisladas de todas las etapas experimentales para confirmar su viabilidad y garantizar que la apoptosis detectada en las células cancerosas fuera el resultado de la citotoxicidad mediada por las células inmunitarias.

Después de la incubación, todas las muestras se lavaron y se analizaron utilizando un citómetro de flujo Attune™ (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)). La adquisición y el análisis de datos se realizaron utilizando el software FlowJo (v10.10, Becton, Dickinson and Company (BD), Ashland, Oregón, EE. UU.).

4.18. Ensayo de Citotoxicidad de la Lactato Deshidrogenasa (LDH)

Se utilizó el ensayo de citotoxicidad CyQUANT™ LDH (Thermo Fisher Scientific) para evaluar la actividad citotóxica de las células T activadas contra las líneas celulares HCT-116 y HT-29 a relaciones efector:objetivo (E:T) de 10:1, 5:1 y 2:1. No se incluyó ninguna línea celular no tumorigénica o irrelevante como control de la citotoxicidad no específica en los ensayos de LDH.

Se contaron las células cancerosas y se sembraron en placas de 96 pocillos a 100 μL por pocillo en medio McCoy’s 5A (suplementado con un 10% de FBS y un 1% de estreptomicina-penicilina) para permitir la adherencia. Después de 24 horas de incubación, se eliminó 50 μL del medio de cada pocillo. A continuación, se contaron las células T activadas y se añadieron a las células cancerosas a las relaciones E:T indicadas en 50 μL de medio RPMI-1640 (suplementado con un 10% de FBS y un 1% de estreptomicina-penicilina). Las placas de cocultivo se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Después de la incubación, se transfirieron 50 μL del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 50 μL de una mezcla 1:1 de mezcla de sustrato y tampón de ensayo a cada pocillo que contenía el sobrenadante recogido. Después de 30 minutos de incubación protegida de la luz, se añadió 50 μL de solución de parada para detener la reacción. La placa se leyó a 490 nm (para medir la actividad de la LDH) y a 680 nm (para tener en cuenta el ruido de fondo).

El porcentaje de citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula: % Citotoxicidad = [(Liberación de LDH experimental − Liberación espontánea − Fondo del efector)/(Liberación máxima − Liberación espontánea)] × 100, donde experimental se refiere al pocillo de cocultivo, espontánea a las células cancerosas solas, fondo del efector = células T solas y liberación máxima a las células cancerosas con tampón de lisis.

4.19. Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

Las células HCT-116, HT-29 y T se prepararon según lo descrito anteriormente. Para los experimentos de cocultivo, las células de CRC se sembraron y se dejaron adherir durante 24 h, después de lo cual se añadieron células T en una relación E:T de 10:1. Tras el período de incubación, las células adheridas se recogieron para el aislamiento de ARN con el fin de analizar específicamente la expresión de los genes GZMA y PRF1. El ARN se aisló de los pocillos de cocultivo adheridos sin separación física previa de las poblaciones de células tumorales e inmunitarias.

Se extrajo ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Toulouse, Francia). Después de 24 h de incubación, se retiró el medio de cultivo y se añadió 1 mL de TRIzol para lisar las células, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante 5 min. Posteriormente, se añadió 0,2 mL de cloroformo y, después de 3 min de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 12.000× g durante 15 min a 4 °C. La mezcla se separó en tres fases: una fase orgánica roja inferior que contiene proteínas, una interfase blanca que contiene ADN y una fase acuosa superior que contiene ARN. La fase acuosa superior se transfirió cuidadosamente a un tubo nuevo y se añadió 0,5 mL de isopropanol para precipitar el ARN. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 10 min, el ARN se precipitó por centrifugación a 12.000× g durante 10 min a 4 °C. El precipitado de ARN se lavó con etanol al 70%, se centrifugó a 7500× g durante 5 min a 4 °C, se dejó secar al aire durante 3 min y se disolvió en 60 μL de agua libre de DNasa/RNasa. Se evaluó la concentración y la pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro (Konica Minolta, Marconibaan, Países Bajos).

Se sintetizó ADNc a partir de 1 μg de ARN total utilizando un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante (RevertAid RT, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.). El ARN se combinó con hexámeros aleatorios, dNTP y agua libre de nucleasas, y se calentó a 65 °C durante 5 min, y luego se enfrió inmediatamente sobre hielo durante 5 min. Posteriormente, se añadieron transcriptasa inversa, inhibidor de la RNasa y tampón de reacción, y se realizó la transcripción inversa a 30 °C durante 10 min, seguida de 42 °C durante 30 min y 70 °C durante 15 min. El ADNc sintetizado se almacenó a 4 °C hasta su uso en el análisis de PCR cuantitativa.

Se realizó qPCR para cuantificar los niveles de expresión de ARNm de GZMA y PRF1 utilizando SYBR Green (KAPA SYBR FAST Universal Kit, Sigma-Aldrich, Atenas, Grecia). Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos con un volumen total de 10 μL por pocillo, que contenía mezcla maestra SYBR Green, ADNc, mezcla de cebadores (directo e inverso) y agua libre de nucleasas. Las secuencias de los cebadores utilizadas fueron: GZMA directo: 5′-AGCAGTGGGAGACAGATGGA-3′ e inverso: 5′-TGGGAGGTTCTGAGGTTGAA-3′, PRF1 directo: 5′-TCTGCTCAGGAGTACCGTGA-3′ e inverso: 5′-AGGAGGTCGTTGTTGGTGTT-3′, GAPDH directo: 5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′ e inverso: 5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTTTT-3′ y β-actina directo: 5′-AGAGCTAGAGCTGCCTGAC-3′ e inverso: 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′. Cada muestra se analizó en triplicado técnico, y todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes. Las condiciones de ciclado de la PCR consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. Los niveles de expresión de ARNm relativos se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt, se normalizaron a GAPDH y β-actina y se expresaron en relación con las células de control correspondientes cultivadas solas.

4.1. Recopilación de datos

Obtuvimos datos de secuenciación de ARN (recuentos htseq) de 458 adenocarcinomas de colon (COAD) y 167 adenocarcinomas de recto (READ) de la base de datos TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/). Todos los datos de secuenciación de ARN y los datos clínicos procedieron de tejidos tumorales y sus tejidos normales adyacentes. Todas las muestras tumorales fueron cánceres colorrectales primarios no tratados y se analizaron, como se describió anteriormente [^[17]]. Los análisis se realizaron principalmente utilizando la cohorte TCGA-COAD debido a su mayor tamaño de muestra, mientras que las muestras TCGA-READ se incluyeron cuando estuvieron disponibles, pero no se analizaron como una cohorte independiente debido a la limitada potencia estadística. No se requirió la aprobación ética y el consentimiento informado en este estudio, ya que los datos se obtuvieron de bases de datos de acceso público. Se obtuvieron PBMCs de donantes sanos anónimos con consentimiento informado para su uso en investigación, de acuerdo con las regulaciones institucionales y nacionales en Chipre.

4.2. Identificación de subtipos inmunitarios y cálculo de CYT

El CRC tiene un microambiente tumoral inmunitario (TIME) altamente heterogéneo, que varía desde un fenotipo "inflamado" hasta fenotipos "desérticos" o "excluidos". Calculamos los genes expresados diferencialmente (DEGs) utilizando el paquete "limma" (Bioconductor, Release 3.23) y la transformación voom. Se establecieron |log(FC)| > 1 y un valor p de la tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,1 como los criterios de corte para seleccionar los DEGs, como se describió anteriormente [^[65],^[66]]. Los DEGs se compararon con un total de 2498 genes relevantes inmunológicamente, obtenidos de la base de datos de inmunología y análisis (ImmPort) (https://www.immport.org/) [^[67]].

Luego, estratificamos los tumores en subtipos inmunitarios, utilizando un agrupamiento completo no supervisado. Se utilizaron los 1046 genes inmunitarios más variables para inferir la clasificación de subtipos inmunitarios de los CRCs. Las diferencias en la expresión de genes inmunitarios entre los tumores y las muestras de control se evaluaron utilizando la prueba de Wilcoxon.

El subtipo inmunitario de cada muestra de adenocarcinoma de colon se definió comparando sus características de TME, basándose en la presencia prevista de células estromales e inmunitarias infiltrantes en cada tejido tumoral. La diferencia de las puntuaciones mencionadas anteriormente, denominada "puntuación ESTIMATE", se utilizó para inferir la pureza tumoral y definir cada subtipo inmunitario utilizando ESTIMATE [^[68]]. Finalmente, para confirmar la importancia de las características de TME en los tumores inmunocompetentes (IC), comparamos el índice CYT con las puntuaciones "inmune", "estromal" y "ESTIMATE". El umbral cero para la puntuación ESTIMATE se utilizó de acuerdo con el marco original de ESTIMATE, donde los valores positivos indican tumores enriquecidos con células inmunitarias y estromales, mientras que los valores negativos indican tumores con pocas células inmunitarias. Reconocemos que la puntuación ESTIMATE es una variable continua y que las muestras cercanas al límite cero pueden presentar características inmunitarias intermedias. La clasificación inmune-competente e inmune-deficiente se basó en un corte binario aplicado a una puntuación ESTIMATE continua, lo que puede simplificar demasiado la heterogeneidad inmunitaria en los tumores cerca del límite de clasificación.

Los datos de expresión génica se obtuvieron de tres plataformas diferentes: Agilent G4502A (218 muestras), RNA-Seq (81 muestras) y RNA-Seq-V2 (263 muestras). Las muestras con una puntuación ESTIMATE negativa se clasificaron como inmune-deficientes (ID) y las que tenían una puntuación ESTIMATE positiva, como inmune-competentes (IC). Basándonos en este criterio, nuestra cohorte se compuso de 255 tumores inmune-deficientes y 307 tumores inmune-competentes, respectivamente (Tabla suplementaria S1). Se utilizó Tumor Immune Estimation Resource (TIMER, http://cistrome.org/TIMER; accedido el 10 de enero de 2025) para analizar la relación entre la expresión de puntos de control inmunitarios, citoquinas y otros genes relacionados con la inmunidad y los niveles de infiltración inmunitaria (células B, células T CD4+/CD8+, neutrófilos, macrófagos y DCs) en el TME de los CRCs [^[52],^[69]]. Los resultados con criterios (p < 0,05 y |rho de Pearson| > 0,2) se consideraron que tenían una correlación significativa entre ellos. Para todos los análisis de correlación que involucran firmas de genes inmunitarios, citoquinas e infiltración de células inmunitarias, los valores p se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg. Solo se consideraron estadísticamente significativas las correlaciones con un valor p ajustado por FDR < 0,05. Se utilizó CIBERSORT (https://cibersortx.stanford.edu/) para calcular la proporción de 22 infiltrados de células inmunitarias distintos.

El índice citolítico (CYT) en cada muestra de CRC se calculó utilizando la media geométrica de la expresión de GZMA y PRF1, como se explicó anteriormente [^[47]], para capturar la actividad efectora citotóxica en lugar de la abundancia de células inmunitarias. Esta definición excluye intencionalmente marcadores de linaje como CD8A y CD8B, que reflejan la cantidad de células T, y se centra en cambio en los genes que codifican la maquinaria citotóxica central de granzima-perforina. Los pacientes se clasificaron luego en un subgrupo citolítico de alto CYT y un subgrupo citolítico de bajo CYT, según los cuartiles superior o inferior del índice citolítico, respectivamente [^[17]].

Se realizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales multivariable de Cox para evaluar el valor pronóstico de la actividad citolítica (CYT), ajustando por el estadio TNM y el estado de MSI. Se calcularon las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) utilizando el paquete de supervivencia en R (v3.8-6).

4.3. Clasificación del subtipo molecular de consenso (CMS)

Se obtuvieron datos de expresión génica de RNA-seq para el adenocarcinoma de colon TCGA (TCGA-COAD) utilizando el paquete R TCGAbiolinks (v2.40.0) del Genomic Data Commons, utilizando el flujo de trabajo "STAR—Counts". Los recuentos brutos se transformaron log2 después de filtrar los genes con anotaciones faltantes o vacías y asignar los identificadores Ensembl a los símbolos de los genes en función de las anotaciones proporcionadas por GDC. La clasificación CMS se realizó utilizando un enfoque basado en firmas, en el que se puntuaron los conjuntos de genes predefinidos que representan CMS1-CMS4 en cada muestra calculando la expresión media de los genes dentro de cada firma, y las muestras se asignaron al subtipo con la puntuación más alta [^[2]]. Todos los análisis se realizaron en R (v4.6).

4.4. Análisis de enriquecimiento funcional de los DEGs

Determinamos los conjuntos de genes y las vías en las que estaban enriquecidos los subgrupos tumorales inmunitarios citolíticos utilizando la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (https://www.genome.jp/kegg/; accedido el 20 de enero de 2025) y el análisis de enriquecimiento funcional de la ontología génica (https://geneontology.org/; accedido el 20 de enero de 2025).

4.5. Firmas inmunitarias y fracciones celulares

Extrajimos firmas inmunitarias y fracciones de tipos de células en cada subgrupo inmunitario citolítico del Atlas del inmunoma del cáncer (TCIA) (https://tcia.at/; accedido el 10 de febrero de 2025) [^[70]]. Las firmas inmunitarias se expresaron en log2(TPM + 1) y se presentaron como mapas de calor de los valores de expresión promedio. En concreto, extrajimos 35 firmas génicas específicas para neutrófilos, células NK, monocitos, MDSC, macrófagos, DCs inmaduros, DCs activados, eosinófilos, células CD56bright, células NK T, DCs plasmocitoides, mastocitos, células CD56Dim NK, células CD4 activadas, células B inmaduras, células T colaboradoras tipo 2, células B activadas, células T colaboradoras de memoria efectoras, células CD8 activadas, células CD4 de memoria central, células CD8 de memoria central, células colaboradoras tipo 17, células CD8 de memoria efectoras, Tregs, células B de memoria, células colaboradoras tipo 1, células T gamma-delta, células T colaboradoras foliculares, MHC-clase I, MHC-clase II, MHC-clase no clásica I, MHC-clase no clásica II, antígenos germinales del cáncer, inmunostimuladores e inmunoinhibidores (Tabla suplementaria S2).

4.6. Correlación de CYT con la expresión de puntos de control inmunitarios, citoquinas, otros genes relacionados con la inmunidad y el nivel de infiltración inmunitaria

Luego, correlacionamos la expresión de los puntos de control inmunitarios con CYT en todas las muestras tumorales, utilizando TIMER 2.0. (http://timer.cistrome.org/; accedido el 20 de febrero de 2025). La expresión (log2RSEM) de 11 puntos de control inmunitarios (PDCD1 (PD-1), CD274 (PD-L1), PDCD1LG2 (PDL2), CTLA-4, IDO1, IDO2, HAVCR2 (TIM3), ADORA2A (A2AR), LAG3, VISTA (C10orf54) y VTCN1 (B7-H4)) también se correlacionó con el nivel de infiltración inmunitaria en cada muestra tumoral, utilizando la prueba de Spearman, después de corregir la pureza del tumor [^[68]].

CYT también se correlacionó con la expresión de citocinas (C1QA, C1QB, C1QC, CXCL9, CXCL10, CXCL11 y CXCL13) y otros genes relacionados con la inmunidad (IL2RB, TIGIT, CCL5, CD96, HLA-DRA, CD8A, GZMH, FASLG, NKG7 y FOXP3), como se describió anteriormente [^[17]].

Exploramos además la expresión de CD8A en los diferentes subtipos inmunitarios (C1, C2, C3, C4 y C6), según la clasificación de Thorsson et al. (2018) [^[48]], así como en tumores con inestabilidad cromosómica (CIN), genéticamente estables (GS), con mutaciones de inserción-deleción hipermutadas (HM-indel) y tumores con predominio de mutaciones de un solo nucleótido hipermutadas (HM-SNV) [^[71]].

4.7. Distribución de la infiltración inmune en diferentes mutaciones genéticas

Investigamos si los genes que albergan las mutaciones somáticas puntuales no sinónimas más frecuentes (10% superior) o las aberraciones del número de copias somáticas (SCNA) [^[17]] se asocian con la abundancia de infiltrados inmunitarios. La significación estadística de la distribución de los niveles de infiltración inmune en diferentes estados de mutación génica en cada subconjunto inmunitario se estimó utilizando la prueba de rango de Wilcoxon de dos colas.

Las SCNAs incluyeron deleción profunda (−2), deleción a nivel de brazo cromosómico (−1), diploide/normal (0), ganancia a nivel de brazo cromosómico (1) y alta amplificación (2), según lo definido por GISTIC 2.0 [^[61]]. Exploramos la distribución de cada subconjunto inmunitario en cada estado de número de copias y comparamos el nivel de infiltración para cada SCNA en el CRC con el normal utilizando la prueba de rango de Wilcoxon de dos colas.

Los CRCs sin datos disponibles sobre la inestabilidad genómica se excluyeron del análisis. Las tasas de mutación silenciosa y no silenciosa fueron el número de mutaciones dividido por la longitud del genoma objetivo en Mb. En la carga de SCNAs, el "número de segmentos" fue igual al número total de segmentos en los perfiles de número de copias de cada muestra.

4.8. Cromotripsia

Exploramos además las tasas de cromotripsia (es decir, la fragmentación de uno o más cromosomas en numerosos fragmentos, que luego se reensamblan de manera desorganizada) con baja y alta confianza (canónica o con otros eventos complejos) en los diferentes subgrupos citolíticos (CYT-alto, CYT-bajo), así como en los diferentes subgrupos de "competencia inmune" (IC e ID) de los CRCs. Para el análisis, utilizamos datos extraídos de la cohorte PCAWG, utilizando Chromothripsis explorer (http://compbio.med.harvard.edu/chromothripsis/; accedido el 20 de marzo de 2025) con los siguientes criterios: 6 puntos de ruptura en la región de cromotripsia, 4 oscilaciones de CN, 4 oscilaciones de CN en 3 estados de CN, 0,13 de pureza y 1,283 de ploidía. Se utilizaron diagramas de Circos para visualizar los perfiles de mutación complejos, como se describió anteriormente [^[12]].

4.9. Heterogeneidad intratumoral

La heterogeneidad intratumoral se midió calculando el ancho de la distribución de las frecuencias alélicas variantes (VAF) y se asignó una puntuación de heterogeneidad alélica mutante (MATH) a cada muestra como la relación entre el ancho y el centro de su distribución de fracciones alélicas mutantes entre los loci mutados específicos del tumor [^[17]].

4.10. Aberraciones del número de copias y genes impulsores del cáncer

La identificación de las regiones genómicas con amplificaciones o deleciones significativas (CNAs) y de los genes impulsores del cáncer, basada en la agrupación posicional, se realizó utilizando el análisis GISTIC v2 y los archivos MAF [^[72]]. Se asignó una puntuación G, que tiene en cuenta la amplitud de la aberración, así como la frecuencia de su aparición en cada muestra tumoral. Calculamos las CNAs manteniendo la suma de los cambios medios de los segmentos ≥ 0,6 y ≤ −0,4 entre las muestras somáticas y normales. Se consideraron significativas las regiones con valores q de FDR < 0,1.

4.11. Predicción de neoepítopos del cáncer

Estimamos la composición celular de los neoantígenos del cáncer por Mb en los subgrupos CYT e IC/ID, utilizando datos de TCIA (https://tcia.at/; accedido el 1 de abril de 2025) [^[73],^[74]].

4.12. Predicción de la respuesta a la terapia con ICI

Se utilizó Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE) (http://tide.dfci.harvard.edu/; accedido el 15 de abril de 2025) para predecir las respuestas de los pacientes a la terapia con ICI en cada subgrupo inmunitario CYT. TIDE evalúa la disfunción y la exclusión inmune tumoral a partir de la expresión génica pretratamiento mediante la modelización de dos mecanismos clave: la disfunción de las células T en tumores con alta infiltración de células T y la exclusión de células T en tumores con baja infiltración. La abundancia de células T se estimó utilizando la expresión de CD8A, CD8B, GZMA, GZMB y PRF1. Las puntuaciones de disfunción y exclusión se calcularon en función de las firmas génicas predefinidas y se integraron en una puntuación TIDE compuesta, con puntuaciones más altas que reflejan una mayor evasión inmune. Posteriormente, se clasificó a los pacientes como respondedores (puntuaciones TIDE bajas) o no respondedores (puntuaciones TIDE altas) a la terapia con ICI [^[75]].

Para la estimación de la abundancia de células T CD8+ dentro del marco de TIDE, se utilizó un conjunto de genes más amplio (CD8A, CD8B, GZMA, GZMB, PRF1) para capturar tanto la identidad de la línea celular como el potencial citotóxico de las células T CD8+.

4.13. Líneas celulares de CRC y preparación de células T

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT-116 y HT-29 se cultivaron en medio McCoy's 5A suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.

Las células T se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aisladas de donantes sanos mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll. Las PBMC se activaron utilizando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), según las instrucciones del fabricante, en presencia de 30 U/mL de interleucina-2 humana recombinante (IL-2) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Las células T activadas se cultivaron y se expandieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2 durante 24 o 48 horas antes del cocultivo y los ensayos de citotoxicidad, y se utilizaron en todos los ensayos.

4.14. Cultivo celular de CRC tridimensional (3D)

Los modelos tumorales 3D se generaron utilizando las células de CRC HCT-116 y HT-29, como se describió anteriormente [^[57],^[76]]. En resumen, ambas líneas celulares de CRC se resuspendieron en una mezcla 1:1 (v/v) de medio McCoy (suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina) y una solución de alginato al 1%, lo que resultó en una concentración final de alginato del 0,5% (p/v).

La suspensión celular resultante se dejó caer en un baño de gelificación de CaCl2 0,5 M para permitir la formación de esferoides. Posteriormente, los hidrogeles se lavaron con agua destilada y se transfirieron a una placa de 96 pocillos. Los cultivos 3D se mantuvieron durante la noche en medio McCoy suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 5 mM de CaCl2 para garantizar la estabilidad del hidrogel.

4.15. Cultivo celular dinámico de las células de CRC HCT-116 y HT-29 con células T

Se establecieron cocultivos dinámicos utilizando el dispositivo Single-Flow MIVO (React4Life, Génova, Italia) para recapitular un microentorno tumoral (TME) dinámico 3D. Se contaron las células T y se resuspendieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 30 UI/mL de IL-2 (por 1 × 106 células). La suspensión celular se cargó en la cámara MIVO (volumen de 1,5 mL) para lograr una relación efector:objetivo (E:T) de 10:1 con las células HCT-116 y HT-29.

La circulación de las células T se generó utilizando un sistema de bombeo ajustado a una velocidad de flujo, según las instrucciones del fabricante, para simular condiciones de flujo similares a las capilares. Los hidrogeles de HCT-116 y HT-29 tridimensionales se cultivaron en un compartimento separado y se aislaron físicamente de las células T circulantes mediante una membrana porosa permeable, lo que permite la difusión de factores solubles sin contacto directo entre las células.

Se incluyeron controles positivos y negativos para la migración celular. El control positivo consistió en andamios de alginato 3D vacíos (sin células tumorales) cultivados en RPMI-1640 suplementado con 40% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina para actuar como un quimioatractante. El control negativo consistió en condiciones sin andamios de alginato y sin suplementación de quimioatractantes, utilizando RPMI-1640 (Invitrogen, Toulouse, Francia) que contiene solo 10% de FBS, para evaluar la migración de fondo.

4.16. Extravasación e infiltración de células T en los modelos tumorales 3D de HCT-116 y HT-29

Para evaluar la extravasación y la infiltración de las células T, se recogieron las células después de 24 horas de cocultivo dinámico del medio que rodea los hidrogeles tumorales 3D dentro de los insertos de transwell. Esta recolección permitió la cuantificación de la proporción de células T que se extravasaron del circuito similar a los capilares, lo que sirvió como modelo del torrente sanguíneo humano.

También se recogieron las células T del compartimento circulatorio para cuantificar la proporción de células que permanecieron en circulación en las diferentes condiciones experimentales, incluidos los controles positivos y negativos. Tanto las células T circulantes (circuito capilar) como las células T extravasadas (nicho tumoral) de muestras triplicadas y grupos de control se recogieron y se contaron utilizando un hemocitómetro Bioanalytic GmbH (Friburgo, Alemania). Estas mediciones se utilizaron para calcular las proporciones de células T que sufrieron extravasación e infiltración tumoral, así como su contribución posterior a la apoptosis de las células tumorales.

4.17. Análisis de citometría de flujo

Se realizó citometría de flujo para caracterizar el fenotipo de las poblaciones de células T estándar, circulantes, extravasadas e infiltradas. Las células T circulantes se recuperaron del dispositivo MIVO, las células T migradas de los insertos de transwell y las células T infiltradas de los hidrogeles 3D. Estas poblaciones se compararon con los cultivos estándar de células T utilizados como controles positivos. Las células se lavaron con PBS sin Ca2+/Mg2+ y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD4 y CD8. Las células T se tiñeron con anticuerpos anti-CD4-APC y anti-CD8 (fluorocromo verde).

También se evaluó la apoptosis de las células HCT-116 y HT-29 después del cocultivo dinámico mediante citometría de flujo. Las células cancerosas se recuperaron de los andamios de alginato 3D disolviendo la matriz de alginato utilizando una solución de solubilización de alginato (0,15 M de NaCl, 100 mM de citrato trisódico dihidrato) e incubando durante 30 minutos a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2, según las instrucciones del fabricante.

Las células recuperadas se lavaron con PBS sin Ca2+/Mg2+ y se tiñeron con anexina V y PI para discriminar las poblaciones de células vivas, apoptóticas tempranas, apoptóticas tardías y necróticas. En resumen, las células se lavaron, se centrifugaron, se resuspendieron en PBS helado y se centrifugaron de nuevo. Se descartaron los sobrenadantes y las células se tiñeron con solución de anexina V-FITC y PI. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. En paralelo, se evaluó la apoptosis de las células inmunitarias aisladas de todas las etapas experimentales para confirmar su viabilidad y garantizar que la apoptosis detectada en las células cancerosas fuera el resultado de la citotoxicidad mediada por las células inmunitarias.

Después de la incubación, todas las muestras se lavaron y se analizaron utilizando un citómetro Attune™ (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)). La adquisición y el análisis de datos se realizaron utilizando el software FlowJo (v10.10, Becton, Dickinson and Company (BD), Ashland, Oregón, EE. UU.).

4.18. Ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrogenasa (LDH)

Se utilizó el ensayo de citotoxicidad CyQUANT™ LDH (Thermo Fisher Scientific) para evaluar la actividad citotóxica de las células T activadas contra las líneas celulares HCT-116 y HT-29 a relaciones efector:objetivo (E:T) de 10:1, 5:1 y 2:1. No se incluyó ninguna línea celular no tumorigénica o irrelevante como control de la citotoxicidad no específica en los ensayos de LDH.

Se contaron las células cancerosas y se sembraron en placas de 96 pocillos a 100 μL por pocillo en medio McCoy’s 5A (suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina-penicilina) para permitir la adhesión. Después de 24 horas de incubación, se retiraron 50 μL del medio de cada pocillo. A continuación, se contaron las células T activadas y se añadieron a las células cancerosas en las proporciones E:T indicadas en 50 μL de medio RPMI-1640 (suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina-penicilina). Las placas de cocultivo se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Tras la incubación, se transfirieron 50 μL del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 50 μL de una mezcla 1:1 de Substrate Mix y Assay Buffer a cada pocillo que contenía el sobrenadante recogido. Después de 30 minutos de incubación protegida de la luz, se añadieron 50 μL de Stop Solution para detener la reacción. Se leyó la placa a 490 nm (para medir la actividad de la LDH) y a 680 nm (para tener en cuenta el ruido de fondo).

El porcentaje de citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula: % Citotoxicidad = [(Liberación experimental de LDH − Liberación espontánea − Fondo del efector)/(Liberación máxima − Liberación espontánea)] × 100, donde experimental se refiere al pocillo de cocultivo, espontánea a las células cancerosas solas, fondo del efector = células T solas y liberación máxima a las células cancerosas con tampón de lisis.

4.19. Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

Las células HCT-116, HT-29 y las células T se prepararon como se describió anteriormente. Para los experimentos de cocultivo, las células de CRC se sembraron y se dejaron adherir durante 24 horas, tras lo cual se añadieron las células T en una proporción E:T de 10:1. Tras el período de incubación, se recogieron las células adheridas para el aislamiento de ARN con el fin de analizar específicamente la expresión de los genes GZMA y PRF1. El ARN se aisló de los pocillos de cocultivo adheridos sin separación física previa de las poblaciones de células tumorales e inmunitarias.

Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Toulouse, Francia). Después de 24 horas de incubación, se retiró el medio de cultivo y se añadió 1 mL de TRIzol para lisar las células, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 0,2 mL de cloroformo y, después de 3 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 12.000× g durante 15 minutos a 4 °C. La mezcla se separó en tres fases: una fase orgánica inferior roja que contenía proteínas, una interfase blanca que contenía ADN y una fase acuosa superior que contenía ARN. La fase acuosa superior se transfirió cuidadosamente a un tubo nuevo y se añadieron 0,5 mL de isopropanol para precipitar el ARN. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, el ARN se precipitó por centrifugación a 12.000× g durante 10 minutos a 4 °C. El precipitado de ARN se lavó con un 70% de etanol, se centrifugó a 7500× g durante 5 minutos a 4 °C, se dejó secar al aire durante 3 minutos y se disolvió en 60 μL de agua libre de DNasa/RNasa. Se evaluó la concentración y la pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro (Konica Minolta, Marconibaan, Países Bajos).

Se sintetizó ADNc a partir de 1 μg de ARN total utilizando un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante (RevertAid RT, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.). El ARN se combinó con hexámeros aleatorios, dNTP y agua libre de nucleasas, y se calentó a 65 °C durante 5 minutos, y luego se enfrió inmediatamente sobre hielo durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron la transcriptasa inversa, el inhibidor de la RNasa y el tampón de reacción, y se realizó la transcripción inversa a 30 °C durante 10 minutos, seguida de 42 °C durante 30 minutos y 70 °C durante 15 minutos. El ADNc sintetizado se almacenó a 4 °C hasta su uso en el análisis de PCR cuantitativa.

Se realizó qPCR para cuantificar los niveles de expresión de ARNm de GZMA y PRF1 utilizando SYBR Green (KAPA SYBR FAST Universal Kit, Sigma-Aldrich, Atenas, Grecia). Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos con un volumen total de 10 μL por pocillo, que contenía la mezcla maestra de SYBR Green, ADNc, mezcla de cebadores (directo e inverso) y agua libre de nucleasas. Las secuencias de los cebadores utilizadas fueron: GZMA directo: 5′-AGCAGTGGGAGACAGATGGA-3′ e inverso: 5′-TGGGAGGTTCTGAGGTTGAA-3′, PRF1 directo: 5′-TCTGCTCAGGAGTACCGTGA-3′ e inverso: 5′-AGGAGGTCGTTGTTGGTGTT-3′, GAPDH directo: 5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′ e inverso: 5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTTTT-3′ y β-actina directo: 5′-AGAGCTAGAGCTGCCTGAC-3′ e inverso: 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′. Cada muestra se analizó en triplicado técnico, y todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes. Las condiciones de ciclado de la PCR consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos. Los niveles de expresión de ARNm relativos se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt, se normalizaron con GAPDH y β-actina y se expresaron en relación con las células de control correspondientes cultivadas solas.

5. Conclusiones

En conclusión, este estudio demuestra que la citotoxicidad inmune (CYT) está asociada con los patrones de infiltración inmune, la expresión de puntos de control inmunitario y las características genómicas que, en conjunto, reflejan el contexto inmunitario del cáncer colorrectal. En lugar de servir como un biomarcador pronóstico o predictivo, la CYT debe interpretarse como una métrica transcriptómica descriptiva e integradora que captura aspectos de la activación inmune citotóxica dentro del microambiente tumoral (TME).

Nuestros hallazgos destacan cómo la CYT se correlaciona con el estado de competencia inmune, la inestabilidad de microsatélites y la heterogeneidad del microambiente tumoral, al tiempo que subraya la complejidad de la regulación inmune en el cáncer colorrectal. Dada la naturaleza correlativa de los análisis y las limitaciones interpretativas de los ensayos funcionales, se requerirán estudios longitudinales, multivariados y mecanicistas adicionales para establecer si la CYT tiene relevancia clínica o terapéutica independiente.