Los análisis transcriptómicos a nivel de célula única y espacial revelan que PIGT es un regulador clave del remodelado inmunometabólico en las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) representa uno de los cánceres más prevalentes y letales en todo el mundo, y constituye una proporción importante de la morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer a nivel mundial (Eng et al. ^[2022]). A pesar de los importantes avances en las técnicas quirúrgicas, la quimioterapia sistémica y la terapia dirigida, casi la mitad de los pacientes con CCR desarrollan finalmente metástasis a distancia, siendo el hígado el sitio predominante y de mayor importancia clínica (Cañellas-Socias et al. ^[2024]). La metástasis del cáncer colorrectal en el hígado (MCCR) sigue siendo el principal determinante de la mortalidad relacionada con el CCR, y los pacientes con MCCR presentan una supervivencia a largo plazo significativamente reducida en comparación con aquellos con enfermedad localizada (Abedizadeh et al. ^[2024], Tape ^[2024]). Estas observaciones subrayan la urgente necesidad de dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que permiten la colonización metastásica y la adaptación dentro del microambiente hepático (Al Zein et al. ^[2023], Dong et al. ^[2024]).

Los recientes avances en la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) y la transcriptómica espacial han revolucionado nuestra comprensión de la biología tumoral, permitiendo una resolución sin precedentes de la heterogeneidad intratumoral y la organización espacial del microambiente tumoral (MET) (Liang y Fu ^[2017], Papalexi y Satija ^[2018]). Estas tecnologías han revelado que la metástasis del CCR no es simplemente el resultado de la diseminación de células malignas, sino que implica interacciones complejas entre las células tumorales y las redes inmunitarias, estromales y metabólicas (Morgan et al. ^[2022]). Entre las poblaciones inmunitarias, las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) han surgido como orquestadoras clave de la inmunosupresión y la progresión metastásica, aunque aún no se ha realizado una comparación exhaustiva a nivel de una sola célula entre los sitios primarios y metastásicos (Vlerken-Ysla et al. ^[2023], Wang et al. ^[2022]).

En este estudio, integramos análisis de transcriptómica de una sola célula y espacial para delinear sistemáticamente los paisajes inmunitarios y metabólicos del CCR primario y sus correspondientes metástasis hepáticas. Nuestros hallazgos revelan que el MET metastásico se caracteriza por una mayor abundancia de MDSC y una profunda reprogramación metabólica de las células malignas, con un enriquecimiento de las vías de la glucólisis/gluconeogénesis, la ferroptosis y la biosíntesis de nucleótidos-azúcares. Utilizando un marco de aprendizaje automático, identificamos PIGT como un posible regulador central que vincula la adaptación metabólica al establecimiento de un microambiente inmunosupresor. PIGT se sobreexpresó de forma constante en todas las modalidades de transcriptómica y se validó funcionalmente para promover la invasividad tumoral y la evasión inmune.

En conjunto, estos resultados proporcionan una perspectiva integral multiómica espacial y de una sola célula sobre la reprogramación inmunometabólica de la metástasis hepática del CCR e identifican a PIGT como un prometedor objetivo terapéutico. Nuestro estudio ofrece información mecanicista que relaciona el metabolismo tumoral y la regulación inmune, allanando el camino para intervenciones de precisión contra el CCR metastásico.

Método

Recopilación y procesamiento de datos

En este estudio, integramos datos de secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq), secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) y transcriptómica espacial. Los datos de secuenciación de ARN masiva del CCR se obtuvieron de The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/) así como de los conjuntos de datos GSE1433312 y GSE3883213 (Jorissen et al. ^[2009], Tripathi et al. ^[2014]). Estos conjuntos de datos de transcriptómica masiva se sometieron a control de calidad y normalización, y se recopiló la información clínica correspondiente. Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se obtuvieron de los conjuntos de datos GSE17831814 y GSE22585715 (Che et al. ^[2021], Wang et al. ^[2023]), que abarcan 10 pacientes con CCR primario y 8 pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (Home - GEO - NCBI). Los datos de transcriptómica espacial para los tres cohortes se descargaron de la base de datos oficial de 10X Genomics (https://www.10xgenomics.com/).

Procesamiento y análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula

Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de las muestras de CCR primario y MCCR se procesaron utilizando Seurat (v5.0). Se excluyeron las células que expresaban menos de 200 genes, las células con recuentos de UMI extremadamente altos que sugerían dobletes y las células con una alta proporción de transcritos mitocondriales (> 20%). Los posibles dobletes se identificaron y eliminaron posteriormente utilizando algoritmos computacionales de detección de dobletes.

Para minimizar la variabilidad técnica entre pacientes y conjuntos de datos, primero se normalizaron individualmente las muestras y, posteriormente, se integraron utilizando el algoritmo Harmony. Se realizó la corrección de lotes basándose en la identidad del paciente y el conjunto de datos de secuenciación, generando una representación de baja dimensión armonizada al tiempo que se preservaba la variación biológica. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) sobre los genes altamente variables, seguido de la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) para la visualización. Se construyó un gráfico de vecinos más cercanos compartidos (SNN) y se realizó un agrupamiento basado en gráficos para identificar poblaciones celulares transcripcionalmente distintas.

La anotación de tipos celulares se realizó utilizando genes marcadores canónicos informados en estudios previos de una sola célula del cáncer colorrectal. Se identificaron los genes expresados diferencialmente para cada grupo y se utilizaron para validar las asignaciones de grupos. Se anotaron las principales poblaciones celulares, incluidas las células malignas, las células T, las células B, las células NK, los macrófagos, las MDSC, las células endoteliales, los fibroblastos y los hepatocitos, según los marcadores específicos de linaje establecidos.

Para inferir las variaciones del número de copias cromosómicas (CNV) a gran escala y distinguir las células malignas de las no malignas, se aplicó inferCNV al conjunto de datos de una sola célula integrado y corregido por lotes. Para minimizar el sesgo introducido por la selección de referencia, se utilizaron colectivamente múltiples poblaciones celulares no malignas, incluidas las células inmunitarias y estromales, como células de referencia en lugar de depender de una sola población de referencia. Estas células de referencia se seleccionaron en función de los marcadores de linaje canónicos y la ausencia de características transcripcionales malignas. Los valores de expresión génica se ordenaron según la posición cromosómica y se realizó inferCNV utilizando procedimientos de suavizado y eliminación de ruido de ventana deslizante para reducir el ruido técnico y mejorar la robustez de la señal. Los perfiles de CNV resultantes se visualizaron como mapas de calor para evaluar los patrones de inestabilidad cromosómica en las poblaciones celulares.

Es importante destacar que el análisis de inferCNV se utilizó principalmente para respaldar la identificación de células malignas y caracterizar los patrones de inestabilidad genómica en lugar de inferir mecanismos funcionales. Las conclusiones biológicas posteriores se derivaron de análisis integrados de transcriptómica, trayectoria, comunicación célula-célula, transcriptómica espacial y validación experimental.

Para investigar la comunicación intercelular dentro del microambiente tumoral, se aplicó CellPhoneDB a las poblaciones celulares anotadas. Se identificaron interacciones ligando-receptor significativas mediante pruebas estadísticas basadas en permutaciones, y las intensidades de interacción se agregaron para construir redes de comunicación célula-célula. Los análisis específicos de vías se centraron en las vías de señalización de MIF, SPP1, TGFβ y GALECTIN asociadas con la supresión inmunitaria y la progresión metastásica.

Las trayectorias de diferenciación celular se reconstruyeron utilizando Monocle 3. Se utilizaron los genes altamente variables para la inferencia de trayectoria y el ordenamiento de pseudotiempo. Se analizaron los cambios dinámicos en la expresión génica a lo largo de las trayectorias de diferenciación para identificar los programas transcripcionales asociados con la progresión metastásica y la expresión de PIGT.

Análisis de enriquecimiento funcional

Para investigar las funciones génicas y las características de las vías, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre los genes expresados diferencialmente o los genes específicos del tipo celular. Se utilizaron las bases de datos Gene Ontology (GO) y KEGG para identificar los procesos biológicos y las vías de señalización significativamente enriquecidos, destacando los módulos funcionales clave. Además, se aplicó el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) para cuantificar la actividad de la vía a nivel de una sola célula o en todos los muestras, lo que permite detectar los cambios dinámicos en las vías de señalización críticas.

Selección de características y modelado de aprendizaje automático

En este estudio, se utilizó un muestreo estratificado para construir cohortes de entrenamiento y prueba. Se entrenaron y evaluaron ocho algoritmos de aprendizaje supervisado (Random Forest, XGBoost, GLMNET, PLS, LDA, Decision Tree, CatBoost y LightGBM) utilizando la validación cruzada repetida. La importancia de las características se cuantificó de forma uniforme en todos los modelos utilizando la importancia basada en permutaciones implementada en el marco DALEX. Los genes de mayor rango se identificaron integrando la importancia media intra-modelo y el consenso inter-modelo, al tiempo que se aplicaron el ajuste temprano y el remuestreo de estabilidad para mitigar el sobreajuste y garantizar tanto la interpretabilidad biológica como la robustez estadística.

Análisis de infiltración inmunitaria tumoral

Para caracterizar la composición y los estados funcionales de las células inmunitarias en el microambiente tumoral, se analizaron los datos integrados de secuenciación de ARN de una sola célula. Primero, se identificaron y subdividieron las poblaciones de células inmunitarias, incluidas las células T, las células B, las células NK, los macrófagos y las células dendríticas, en subpoblaciones en función de los genes marcadores canónicos, y se cuantificaron sus proporciones y perfiles transcripcionales. A continuación, se aplicó el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) para puntuar las vías inmunitarias clave, como la señalización de las citocinas, la señalización del receptor de las células T y las vías inflamatorias, revelando los estados inmunitarios activos y los posibles mecanismos inmunosupresores. Además, se utilizó CIBERSORTx para inferir la infiltración inmunitaria a partir de los datos de secuenciación de ARN masiva, lo que validó la robustez de los hallazgos de una sola célula. Los resultados se visualizaron utilizando mapas de calor y diagramas de red para ilustrar las diferencias en la composición inmunitaria y la actividad de las vías entre las poblaciones celulares y las muestras, proporcionando información molecular sobre el microambiente inmunitario tumoral e informando sobre las posibles estrategias inmunoterapéuticas.

Procesamiento de datos de transcriptómica espacial

Los datos de transcriptómica espacial se obtuvieron de tejidos humanos de CCR y tejidos mucosos adyacentes generados utilizando la plataforma 10x Genomics Visium HD en secciones de formalina-parafina (FFPE). Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron con la canalización Space Ranger (10x Genomics), que realiza la alineación al transcriptoma de referencia humano, asigna las lecturas a los códigos de barras espaciales y genera matrices de expresión génica con las coordenadas de tejido correspondientes y las imágenes de histología.

Las matrices de recuento y los metadatos espaciales se importaron a Seurat. Los puntos espaciales de baja calidad se filtraron en función de la profundidad de secuenciación, el recuento de detección de genes y el contenido de genes mitocondriales. Se realizó la normalización y la estabilización de la varianza utilizando SCTransform para corregir la variación técnica al tiempo que se preservaba la heterogeneidad biológica. Se aplicó el análisis de componentes principales (PCA) para la reducción de la dimensionalidad y se construyó un gráfico de vecinos más cercanos compartidos (SNN) para identificar los grupos espaciales. Las etiquetas de los grupos se asignaron a las coordenadas de los tejidos para la visualización de la organización espacial.

Los dominios espaciales y las posibles poblaciones celulares se anotaron integrando los datos de transcriptómica espacial con los conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de referencia disponibles públicamente del CCR. Se utilizó la transferencia de etiquetas guiada por referencia y los genes marcadores canónicos para asignar los tipos de células, incluidas las células tumorales epiteliales, las células estromales, las células endoteliales, las células T, las células B, los neutrófilos y las subpoblaciones de macrófagos.

Para evaluar cuantitativamente la colocalización espacial entre las regiones tumorales y las poblaciones de células inmunitarias, empleamos un análisis de enriquecimiento de vecindad. Las vecindades espaciales se definieron en función de la adyacencia física de los puntos, y se comparó la frecuencia observada de coocurrencia entre dos tipos de células o dominios espaciales con una distribución nula generada mediante la permutación aleatoria de las etiquetas de los tipos de células en todo el tejido, preservando las coordenadas espaciales. Se calcularon las puntuaciones z de enriquecimiento para determinar si una población celular determinada se localizaba preferentemente cerca de las regiones enriquecidas en tumores, los márgenes invasivos del tumor u otros dominios espaciales. Además, se realizó un análisis de coocurrencia basado en la distancia radial para caracterizar la proximidad espacial de las subpoblaciones de macrófagos en relación con las regiones tumorales.

Ensayos de migración, invasión, cicatrización de heridas y viabilidad celular

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (HCT116) se mantuvieron en medio DMEM o RPMI-1640 suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) y antibióticos, en condiciones estándar (37 °C, 5 % de CO₂). Todas las líneas celulares se autenticaron de forma rutinaria y se comprobó que eran negativas para la contaminación por micoplasma.

Para el ensayo de cicatrización de heridas, se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta alcanzar la confluencia total, seguido de la privación de suero durante 4 a 6 horas. Se generó un arañazo lineal uniforme utilizando la punta de una pipeta estéril de 200 µL, y las células desprendidas se eliminaron con PBS. El medio se reemplazó con 1 % de SFB para suprimir la proliferación. Se capturaron imágenes a las 0, 6, 12, 24 y 48 horas utilizando microscopía de contraste de fases en posiciones predefinidas. El área de la herida se cuantificó utilizando el software ImageJ, y la tasa de cierre se calculó como el porcentaje del área inicial de la herida.

Los ensayos de migración en transwell se realizaron utilizando insertos con poros de 8 µm (Corning, formato de 24 pocillos). Se sembraron un total de 1 × 10⁵ células privadas de suero en 200 µL de medio sin suero en la cámara superior, mientras que se añadieron 600 µL de medio que contenía un 10 % de SFB a la cámara inferior como agente quimioatractivo. Después de la incubación durante 12 a 24 horas, las células que migraron a la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,1 % de cristal violeta y se contaron en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente bajo un microscopio óptico.

Para el ensayo de invasión, los insertos se recubrieron previamente con Matrigel (BD Biosciences) para simular la barrera de la matriz extracelular. Se sembraron células privadas de suero (1-2 × 10⁵ por inserto) en la cámara superior con medio sin suero, mientras que se añadió medio con un 10 % de SFB a la cámara inferior. Después de 24 a 48 horas, las células no invasoras de la superficie superior se eliminaron suavemente con un hisopo de algodón. Las células invasoras en la parte inferior de la membrana se fijaron, se tiñeron con 0,1 % de cristal violeta y se cuantificaron como se describió para el ensayo de migración.

La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo CCK-8. Brevemente, se sembraron de 3 a 5 × 10³ células por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante los períodos de tiempo indicados. A continuación, se añadieron 10 µL de reactivo CCK-8 (Dojindo) a cada pocillo y se incubó durante 1 a 2 horas a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces, y los resultados se analizaron estadísticamente para garantizar la reproducibilidad y minimizar los efectos de confusión de la proliferación celular.

Tinción por inmunofluorescencia multiplexada

Recopilamos pares de tejidos primarios de CRC y especímenes de CRLM de nuestra institución para evaluar sistemáticamente la expresión diferencial de PIGT entre los sitios primarios y metastásicos, y para caracterizar aún más las alteraciones asociadas a la metástasis en el microambiente inmunitario tumoral. Para evaluar la infiltración inmunitaria, se seleccionaron CD8 (marcador de células T citotóxicas/efectoras inmunitarias), FOXP3 (marcador de células T reguladoras/inmunosupresoras) y CD163 (macrófago tumoral de tipo M2/marcador inmunosupresor) como indicadores representativos. Se compararon los niveles y las proporciones relativas de la infiltración de células efectoras inmunitarias y células inmunosupresoras entre los tumores primarios y las metástasis hepáticas. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de nuestro hospital, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes.

Análisis estadístico

Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar (DE) o mediana con rango intercuartílico (RIC), según la distribución de los datos. Las diferencias entre dos grupos se evaluaron utilizando la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney U, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de un factor o la prueba de Kruskal-Wallis, con correcciones de comparación múltiple aplicadas según corresponda. Los análisis de correlación se realizaron utilizando coeficientes de correlación de Pearson o Spearman, seleccionados según el tipo y la distribución de la variable. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier con la prueba de rango logarítmico. Todos los análisis estadísticos se realizaron en R (versión 4.3.3), y se consideraron estadísticamente significativos los valores de p de dos colas < 0,05.

Recopilación y procesamiento de datos

En este estudio, integramos datos de secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq), secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) y transcriptómica espacial. Los datos de secuenciación de ARN masiva de pacientes con CRC se obtuvieron de The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/) así como de los conjuntos de datos GSE1433312 y GSE3883213 (Jorissen et al. ^[2009], Tripathi et al. ^[2014]). Estos conjuntos de datos de transcriptómica masiva se sometieron a control de calidad y normalización, y se recopiló la información clínica correspondiente. Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se obtuvieron de los conjuntos de datos GSE17831814 y GSE22585715 (Che et al. ^[2021], Wang et al. ^[2023]), que abarcan 10 pacientes con CRC primario y 8 pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (Home - GEO - NCBI). Los datos de transcriptómica espacial para los tres cohortes se descargaron de la base de datos oficial de 10X Genomics (https://www.10xgenomics.com/).

Procesamiento y análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula

Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de muestras de CRC primario y CRLM se procesaron utilizando Seurat (v5.0). Se excluyeron las células que expresaban menos de 200 genes, las células con recuentos de UMI extremadamente altos que sugerían dobletes y las células con una alta proporción de transcritos mitocondriales (> 20 %). Los posibles dobletes se identificaron y eliminaron posteriormente utilizando algoritmos computacionales de detección de dobletes.

Para minimizar la variabilidad técnica entre pacientes y conjuntos de datos, primero se normalizaron individualmente las muestras y, posteriormente, se integraron utilizando el algoritmo Harmony. Se realizó la corrección de lotes basándose en la identidad del paciente y el conjunto de datos de secuenciación, generando una representación de baja dimensión armonizada al tiempo que se preservaba la variación biológica. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en los genes altamente variables, seguido de la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) para la visualización. Se construyó un gráfico de vecinos compartidos (SNN) y se realizó una agrupación basada en gráficos para identificar poblaciones celulares transcripcionalmente distintas.

La anotación de tipos de células se realizó utilizando genes marcadores canónicos informados en estudios previos de una sola célula de cáncer colorrectal. Se identificaron los genes expresados diferencialmente para cada grupo y se utilizaron para validar las asignaciones de grupos. Se anotaron las principales poblaciones celulares, incluidas las células malignas, las células T, las células B, las células NK, los macrófagos, las MDSC, las células endoteliales, los fibroblastos y los hepatocitos, según los marcadores específicos de la línea establecidos.

Para inferir las variaciones del número de copias cromosómicas (CNV) a gran escala y distinguir las células malignas de las no malignas, se aplicó inferCNV al conjunto de datos de una sola célula integrado y corregido por lotes. Para minimizar el sesgo introducido por la selección de referencia, se utilizaron colectivamente múltiples poblaciones de células no malignas, incluidas las células inmunitarias y las células del estroma, como células de referencia en lugar de depender de una sola población de referencia. Estas células de referencia se seleccionaron en función de los marcadores de línea canónicos y la ausencia de características transcripcionales malignas. Los valores de expresión génica se ordenaron según la posición cromosómica, y se realizó inferCNV utilizando procedimientos de suavizado y desruido de ventana deslizante para reducir el ruido técnico y mejorar la robustez de la señal. Los perfiles de CNV resultantes se visualizaron como mapas de calor para evaluar los patrones de inestabilidad cromosómica en las poblaciones celulares.

Es importante destacar que el análisis de inferCNV se utilizó principalmente para respaldar la identificación de células malignas y caracterizar los patrones de inestabilidad genómica en lugar de inferir mecanismos funcionales. Las conclusiones biológicas posteriores se derivaron de análisis integrados de transcriptómica, trayectoria, comunicación célula-célula, transcriptómica espacial y validación experimental.

Para investigar la comunicación intercelular dentro del microambiente tumoral, se aplicó CellPhoneDB a las poblaciones celulares anotadas. Se identificaron interacciones ligando-receptor significativas mediante pruebas estadísticas basadas en permutaciones, y las intensidades de interacción se agregaron para construir redes de comunicación célula-célula. Los análisis específicos de la vía se centraron en las vías de señalización de MIF, SPP1, TGFβ y GALECTINA asociadas con la supresión inmunitaria y la progresión metastásica.

Las trayectorias de diferenciación celular se reconstruyeron utilizando Monocle 3. Se utilizaron genes altamente variables para la inferencia de trayectoria y el ordenamiento de pseudotiempo. Se analizaron los cambios dinámicos en la expresión génica a lo largo de las trayectorias de diferenciación para identificar los programas transcripcionales asociados con la progresión metastásica y la expresión de PIGT.

Análisis de enriquecimiento funcional

Para investigar las funciones génicas y las características de las vías, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre los genes expresados diferencialmente o los genes específicos del tipo de célula. Se utilizaron las bases de datos Gene Ontology (GO) y KEGG para identificar los procesos biológicos y las vías de señalización significativamente enriquecidos, destacando los módulos funcionales clave. Además, se aplicó el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) para cuantificar la actividad de la vía a nivel de una sola célula o en todos los muestras, lo que permite detectar los cambios dinámicos en las vías de señalización críticas.

Selección de características y modelado de aprendizaje automático

En este estudio, se utilizó el muestreo estratificado para construir cohortes de entrenamiento y prueba. Se entrenaron y evaluaron ocho algoritmos de aprendizaje supervisado (Random Forest, XGBoost, GLMNET, PLS, LDA, Decision Tree, CatBoost y LightGBM) utilizando la validación cruzada repetida. La importancia de las características se cuantificó de forma uniforme en todos los modelos utilizando la importancia basada en permutaciones implementada en el marco DALEX. Los genes de mayor rango final se identificaron mediante la integración de la importancia media intra-modelo y el consenso inter-modelo, mientras que se aplicó la detención temprana y el remuestreo de estabilidad para mitigar el sobreajuste y garantizar tanto la interpretabilidad biológica como la solidez estadística.

Análisis de la infiltración inmunitaria tumoral

Para caracterizar la composición y los estados funcionales de las células inmunitarias en el microambiente tumoral, se analizaron los datos integrados de secuenciación de ARN de una sola célula. Primero, se identificaron y subdividieron las poblaciones de células inmunitarias, incluidas las células T, las células B, las células NK, los macrófagos y las células dendríticas, en subpoblaciones en función de los genes marcadores canónicos, y se cuantificaron sus proporciones y perfiles transcripcionales. A continuación, se aplicó el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) para puntuar las vías inmunitarias clave, como la señalización de las citocinas, la señalización del receptor de las células T y las vías inflamatorias, revelando los estados inmunitarios activos y los posibles mecanismos inmunosupresores. Además, se utilizó CIBERSORTx para inferir la infiltración inmunitaria a partir de los datos de secuenciación de ARN masiva, lo que validó la solidez de los hallazgos de una sola célula. Los resultados se visualizaron utilizando mapas de calor y diagramas de red para ilustrar las diferencias en la composición inmunitaria y la actividad de la vía en las poblaciones celulares y las muestras, proporcionando información molecular sobre el microambiente inmunitario tumoral e informando sobre las posibles estrategias inmunoterapéuticas.

Procesamiento de datos de transcriptómica espacial

Se obtuvieron datos de transcriptómica espacial de CRC humano y tejidos mucosos adyacentes correspondientes, generados utilizando la plataforma 10x Genomics Visium HD en secciones fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). Los datos de secuenciación en bruto se procesaron con el programa Space Ranger (10x Genomics), que realiza la alineación con el transcriptoma de referencia humano, asigna las lecturas a códigos de barras espaciales y genera matrices de expresión génica con las coordenadas de tejido correspondientes e imágenes de histología.

Las matrices de conteo y los metadatos espaciales se importaron a Seurat. Los puntos espaciales de baja calidad se filtraron en función de la profundidad de secuenciación, el recuento de detección de genes y el contenido de genes mitocondriales. Se realizó la normalización y la estabilización de la varianza utilizando SCTransform para corregir la variación técnica, al tiempo que se preserva la heterogeneidad biológica. Se aplicó el análisis de componentes principales (PCA) para la reducción de la dimensionalidad, y se construyó un gráfico de vecinos más cercanos compartidos (SNN) para identificar grupos espaciales. Las etiquetas de los grupos se asignaron nuevamente a las coordenadas de tejido para la visualización de la organización espacial.

Los dominios espaciales y las posibles poblaciones celulares se anotaron integrando los datos de transcriptómica espacial con conjuntos de datos de referencia de ARN de una sola célula disponibles públicamente de CRC. Se utilizó la transferencia de etiquetas guiada por referencia y los genes marcadores canónicos para asignar tipos de células, incluidos células tumorales epiteliales, células estromales, células endoteliales, células T, células B, neutrófilos y subpoblaciones de macrófagos.

Para evaluar cuantitativamente la colocalización espacial entre las regiones tumorales y las poblaciones de células inmunitarias, empleamos un análisis de enriquecimiento de vecindad. Los vecindarios espaciales se definieron en función de la adyacencia física de los puntos, y se comparó la frecuencia observada de coocurrencia entre dos tipos de células o dominios espaciales con una distribución nula generada mediante la permutación aleatoria de las etiquetas de los tipos de células en todo el tejido, al tiempo que se preservan las coordenadas espaciales. Se calcularon las puntuaciones z de enriquecimiento para determinar si una población celular determinada se localizaba preferentemente cerca de las regiones enriquecidas con tumores, los márgenes invasivos del tumor u otros dominios espaciales. Además, se realizó un análisis de coocurrencia basado en la distancia radial para caracterizar la proximidad espacial de las subpoblaciones de macrófagos en relación con las regiones tumorales.

Ensayos de migración, invasión, curación de heridas y viabilidad celular

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (HCT116) se mantuvieron en medio DMEM o RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB) y antibióticos en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO₂). Todas las líneas celulares se autenticaron de forma rutinaria y se comprobó que eran negativas para la contaminación por micoplasma.

Para el ensayo de curación de heridas, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia total, seguido de la privación de suero durante 4 a 6 horas. Se generó un rasguño lineal uniforme utilizando la punta de una pipeta estéril de 200 µL, y las células desprendidas se eliminaron con PBS. El medio se reemplazó con 1% de SFB para suprimir la proliferación. Se capturaron imágenes a las 0, 6, 12, 24 y 48 horas utilizando microscopía de contraste de fase en posiciones predefinidas. El área de la herida se cuantificó utilizando el software ImageJ, y la tasa de cierre se calculó como el porcentaje del área inicial de la herida.

Los ensayos de migración en transwell se realizaron utilizando insertos con poros de 8 µm (Corning, formato de 24 pocillos). Se sembraron un total de 1 × 10⁵ células privadas de suero en 200 µL de medio libre de suero en la cámara superior, mientras que se añadieron 600 µL de medio que contenía un 10% de SFB a la cámara inferior como agente quimioatractivo. Después de la incubación durante 12 a 24 horas, las células que migraron a la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se contaron en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente bajo un microscopio óptico.

Para el ensayo de invasión, los insertos se recubrieron previamente con Matrigel (BD Biosciences) para imitar la barrera de la matriz extracelular. Las células privadas de suero (1–2 × 10⁵ por inserto) se sembraron en la cámara superior con medio libre de suero, mientras que se añadió medio al 10% de SFB a la cámara inferior. Después de 24 a 48 horas, las células no invasivas de la superficie superior se eliminaron suavemente con un hisopo de algodón. Las células invasivas en la parte inferior de la membrana se fijaron, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se cuantificaron como se describió para el ensayo de migración.

La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo CCK-8. Brevemente, se sembraron de 3 a 5 × 10³ células por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante las duraciones indicadas. Luego, se añadieron 10 µL de reactivo CCK-8 (Dojindo) a cada pocillo y se incubaron durante 1 a 2 horas a 37 °C. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces, y los resultados se analizaron estadísticamente para garantizar la reproducibilidad y minimizar los efectos de confusión de la proliferación celular.

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

Recopilamos pares de tejidos primarios de CRC y especímenes de CRLM de nuestra institución para evaluar sistemáticamente la expresión diferencial de PIGT entre los sitios primarios y metastásicos, y para caracterizar aún más las alteraciones asociadas con la metástasis en el microambiente inmunitario tumoral. Para evaluar la infiltración inmunitaria, se seleccionaron CD8 (marcador de células T citotóxicas/efectoras inmunitarias), FOXP3 (marcador de células T reguladoras/inmunosupresoras) y CD163 (macrófago tumoral similar a M2/marcador inmunosupresor) como indicadores representativos. Se compararon los niveles y las proporciones relativas de la infiltración de células efectoras inmunitarias y células inmunosupresoras entre los tumores primarios y las metástasis hepáticas. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de nuestro hospital, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes.

Análisis estadístico

Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar (DE) o mediana con rango intercuartílico (RIC), según la distribución de los datos. Las diferencias entre dos grupos se evaluaron utilizando la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney U, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando el análisis de varianza (ANOVA) de un factor o la prueba de Kruskal-Wallis, con correcciones de comparación múltiple aplicadas según corresponda. Los análisis de correlación se realizaron utilizando coeficientes de correlación de Pearson o Spearman, seleccionados según el tipo y la distribución de la variable. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier con la prueba de rango logarítmico. Todos los análisis estadísticos se realizaron en R (versión 4.3.3), y se consideraron estadísticamente significativos los valores de p de dos colas < 0,05.

Resultados

Características del microambiente tumoral del cáncer colorrectal con metástasis hepáticas

Integramos dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula, GSE178318 y GSE225857, que comprenden 10 pacientes con CRC primario y 8 pacientes con metástasis hepáticas. Después de un riguroso control de calidad y la exclusión de células de baja calidad, se incluyeron un total de 169 928 células y 34 420 características de genes para los análisis posteriores.

Basándonos en conjuntos de datos de referencia bien establecidos y estudios previos, anotamos nueve tipos de células principales: células B, células endoteliales, células T, células NK, células malignas, fibroblastos, MDSC, hepatocitos y macrófagos16-20 (Fig. 1A, B y C) (Berlin et al. ^[2023], Chen et al. ^[2024], Chu et al. ^[2024], Roerink et al. ^[2018], Wu et al. ^[2022]). Coherente con los hallazgos previos, los fibroblastos se redujeron significativamente en las metástasis hepáticas en comparación con los tumores primarios, mientras que las MDSC se enriquecieron notablemente en las lesiones metastásicas, lo que sugiere su posible participación en el proceso metastásico. Los análisis de expresión diferencial entre los sitios primarios y metastásicos identificaron los genes marcadores clave para cada población celular (Fig. 1D y E).

Características de las células malignas en las metástasis hepáticas

La reprogramación biológica de las células de CRC es un impulsor directo de la metástasis hepática. Utilizando inferCNV, analizamos los perfiles de CNV de las células malignas derivadas de los sitios primarios y metastásicos (Fig. 2A y B). Como se esperaba, las células de CRC metastásicas exhibieron amplificaciones y deleciones de número de copias más extensas que las células tumorales primarias, lo que indica una inestabilidad cromosómica pronunciada que involucra los brazos largos o cromosomas enteros.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló patrones de transcripción distintos entre los dos sitios: las células tumorales primarias se enriquecieron en vías proinflamatorias, como las vías de señalización de TNF e IL-17, mientras que las células metastásicas se involucraron predominantemente en vías metabólicas, incluido el ciclo del citrato, la glucólisis/gluconeogénesis, la biosíntesis de aminoácidos y el metabolismo del alanina, el aspartato y el glutamato, lo que refleja las elevadas demandas metabólicas en las células cancerosas metastásicas (Fig. 2C).

Para identificar posibles reguladores clave, aplicamos siete algoritmos de aprendizaje automático para integrar las características diferenciales. PIGT surgió como un gen priorizado de forma constante en varios algoritmos, clasificándose entre los primeros en importancia de las características, lo que sugiere que PIGT puede desempeñar un papel fundamental en la reprogramación metabólica y la modulación del microambiente inmunitario durante la metástasis hepática del CRC (Fig. 2D, E y F).

Dinámica de diferenciación de las células malignas.

La progresión de las células de CRC desde los tumores primarios hasta las metástasis hepáticas es un proceso dinámico y heterogéneo. Utilizando Monocle 3 para el análisis de la trayectoria de la pseudotiempo, observamos una transición gradual de las células malignas desde un fenotipo similar al primario hasta un fenotipo similar al metastásico. En particular, la expresión de PIGT aumentó progresivamente a lo largo de esta trayectoria (Fig. 3A).

Basándose en su patrón de expresión, las células malignas se estratificaron en grupos de alta y baja expresión de PIGT. La visualización del diagrama de burbujas confirmó que las células de alta expresión de PIGT se localizaron predominantemente dentro de las metástasis hepáticas, exhibiendo niveles de expresión significativamente más altos que los de los tumores primarios. Estos hallazgos refuerzan el posible papel de PIGT en la promoción de la adaptación y la progresión metastásica (Fig. 3B, C y D).

Análisis de la comunicación célula-célula.

Para explorar las redes de comunicación intercelular mediadas por las células malignas de alta expresión de PIGT, utilizamos CellPhoneDB para analizar las interacciones ligando-receptor entre los compartimentos maligno, inmunitario y estromal. Los resultados revelaron una comunicación mejorada entre las células cancerosas de alta expresión de PIGT y las MDSC, particularmente a través de las vías de señalización de MIF, SPP1 y TGFβ (Fig. 4A y B).

Estos hallazgos indican que las células tumorales de alta expresión de PIGT pueden remodelar activamente el microambiente tumoral promoviendo las interacciones inmunosupresoras con las MDSC, facilitando así la progresión metastásica (Fig. 4C, D, E, F y G).

La sobreexpresión de PIGT se asocia con un mal pronóstico.

Para evaluar aún más la relevancia clínica de PIGT, realizamos un análisis pan-cáncer. Se descubrió que PIGT se sobreexpresaba en múltiples tipos de cáncer, incluidos BLCA, BRCA, GBM, LUAD y COAD. Los análisis de correlación demostraron una fuerte correlación positiva entre PIGT y los genes relacionados con la invasión en varios cánceres, con la correlación más pronunciada observada en el cáncer colorrectal (Fig. 5A y B).

La validación utilizando tres conjuntos de datos de transcriptómica independientes (TCGA, GSE14333 y GSE38832) confirmó que la alta expresión de PIGT se asoció significativamente con una peor supervivencia general, lo que subraya su posible valor como biomarcador pronóstico y objetivo terapéutico (Fig. 5C, D y E).

Características de la infiltración de células inmunitarias de PIGT.

Investigamos aún más la relación entre la expresión de PIGT y la infiltración de células inmunitarias. El análisis pan-cáncer reveló que la expresión de PIGT se correlacionó significativamente de forma negativa con múltiples poblaciones de células inmunitarias efectoras, incluidas las células T CD8+ y las células citotóxicas, al tiempo que mostró una correlación positiva con los subconjuntos de células inmunosupresoras. Los resultados coherentes en múltiples algoritmos de estimación de la infiltración inmunitaria demostraron que los tumores con alta expresión de PIGT se enriquecieron con poblaciones de células inmunosupresoras (Fig. 6A, B, C y D).

Además, el análisis transcriptómico espacial validó aún más estos hallazgos, mostrando que las células malignas con alta expresión de PIGT estaban rodeadas por abundantes células inmunosupresoras ITGAM⁺ y CD163⁺ dentro del microambiente tumoral (Fig. 6E y F).

En conjunto, estos resultados sugieren que PIGT puede contribuir al establecimiento de un microambiente tumoral inmunosupresor en la metástasis hepática del cáncer colorrectal al modular el metabolismo tumoral y la composición de las células inmunitarias.

La inhibición de PIGT suprime la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la proliferación de las células del cáncer colorrectal

Para investigar el papel funcional de PIGT en la progresión del CRC, realizamos una serie de ensayos fenotípicos in vitro tras la inhibición de PIGT mediada por siRNA en células HCT116. Se confirmó la silenciamiento eficiente de PIGT mediante análisis de qRT-PCR y Western blot.

En consonancia con los hallazgos bioinformáticos, el análisis de qRT-PCR en líneas celulares de CRC con PIGT silenciado demostró una regulación al alza significativa de múltiples genes asociados a la inflamación a nivel de ARNm, lo que apoya aún más la idea de que la supresión de PIGT puede mejorar las respuestas inflamatorias dentro del microambiente tumoral (Fig. 7A y B).

En los ensayos de cicatrización de heridas, las células con PIGT reducido mostraron una tasa de cierre notablemente más lenta en comparación con las células de control, lo que indica una capacidad migratoria alterada. De manera consistente, los ensayos de migración Transwell revelaron una reducción significativa en el número de células migrantes tras la inhibición de PIGT. Además, los ensayos de invasión en matriz de Matrigel demostraron que el potencial invasivo de las células con PIGT silenciado se redujo sustancialmente, lo que sugiere que PIGT contribuye al fenotipo invasivo de las células de CRC (Fig. 8A).

Además, los ensayos de viabilidad celular (CCK-8) mostraron que la inhibición de PIGT condujo a una disminución significativa de la proliferación celular con el tiempo. En conjunto, estos resultados indican que PIGT promueve la migración, la invasión y la proliferación de las células del cáncer colorrectal, y que su supresión atenúa los comportamientos malignos de las células de CRC in vitro (Fig. 8B).

Para dilucidar las posibles funciones biológicas de PIGT en el CRC, integramos datos transcriptómicos de células individuales con la cohorte TCGA CRC y estratificamos a los pacientes según los niveles de expresión de PIGT. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló que las muestras con baja expresión de PIGT estaban predominantemente enriquecidas en vías relacionadas con la inflamación, lo que sugiere un posible vínculo entre la disminución de PIGT y la señalización inflamatoria asociada al tumor (Fig. 8C y D).

Nuestros resultados demostraron que la expresión de PIGT era significativamente menor en las lesiones primarias de cáncer colorrectal que en las metástasis hepáticas correspondientes. De manera consistente, la infiltración de células efectoras inmunitarias, representada por las células T CD8⁺, fue mayor en los tumores primarios en comparación con los sitios de metástasis hepática. En contraste, las poblaciones de células inmunosupresoras, incluidas las células T reguladoras FOXP3⁺ (Tregs) y los macrófagos asociados al tumor tipo M2 CD163⁺, mostraron una infiltración significativamente mayor en las metástasis hepáticas en relación con los tumores colorrectales primarios (Fig. 8E).

En conjunto, estos hallazgos indican que las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal se caracterizan por un microambiente tumoral inmunosupresor, acompañado de una mayor expresión de PIGT.

Características del microambiente tumoral de la metástasis hepática del cáncer colorrectal

Integramos dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células individuales, GSE178318 y GSE225857, que comprenden 10 pacientes con CRC primario y 8 pacientes con metástasis hepáticas. Tras un riguroso control de calidad y la exclusión de células de baja calidad, se incluyeron un total de 169.928 células y 34.420 características de genes para los análisis posteriores.

Basándonos en conjuntos de datos de referencia bien establecidos y estudios previos, anotamos nueve tipos de células principales: células B, células endoteliales, células T, células NK, células malignas, fibroblastos, MDSC, hepatocitos y macrófagos16-20 (Fig. 1A, B y C) (Berlin et al. ^[2023], Chen et al. ^[2024], Chu et al. ^[2024], Roerink et al. ^[2018], Wu et al. ^[2022]). En consonancia con los hallazgos previos, los fibroblastos se redujeron significativamente en las metástasis hepáticas en comparación con los tumores primarios, mientras que las MDSC se enriquecieron notablemente en las lesiones metastásicas, lo que sugiere su posible participación en el proceso metastásico. Los análisis de expresión diferencial entre los sitios primarios y metastásicos identificaron genes marcadores clave para cada población celular (Fig. 1D y E).

Características de las células malignas en las metástasis hepáticas

La reprogramación biológica de las células de CRC es un impulsor directo de la metástasis hepática. Utilizando inferCNV, analizamos los perfiles de CNV de las células malignas derivadas de los sitios primarios y metastásicos (Fig. 2A y B). Como se esperaba, las células de CRC metastásicas exhibieron amplificaciones y deleciones de número de copias más extensas que las células tumorales primarias, lo que indica una pronunciada inestabilidad cromosómica que involucra brazos largos o cromosomas enteros.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló patrones de transcripción distintos entre los dos sitios: las células tumorales primarias se enriquecieron en vías proinflamatorias, como las vías de señalización de TNF e IL-17, mientras que las células metastásicas se involucraron predominantemente en vías metabólicas, incluido el ciclo del citrato, la glucólisis/gluconeogénesis, la biosíntesis de aminoácidos y el metabolismo del alanina, el aspartato y el glutamato, lo que refleja una mayor demanda metabólica en las células cancerosas metastásicas (Fig. 2C).

Para identificar posibles reguladores clave, aplicamos siete algoritmos de aprendizaje automático para integrar las características diferenciales. PIGT surgió como un gen consistentemente priorizado en múltiples algoritmos, clasificándose entre los primeros en importancia de las características, lo que sugiere que PIGT puede desempeñar un papel fundamental en la reprogramación metabólica y la modulación del microambiente inmunitario durante la metástasis hepática del CRC (Fig. 2D, E y F).

Dinámica de diferenciación de las células malignas.

La progresión de las células de CRC desde los tumores primarios hasta las metástasis hepáticas es un proceso altamente dinámico y heterogéneo. Utilizando Monocle 3 para el análisis de la trayectoria de pseudotiempo, observamos una transición gradual de las células malignas desde un fenotipo similar al primario hasta un fenotipo similar a la metástasis. En particular, la expresión de PIGT aumentó progresivamente a lo largo de esta trayectoria (Fig. 3A).

Basándose en su patrón de expresión, las células malignas se estratificaron en grupos de alta y baja expresión de PIGT. La visualización del diagrama de burbujas confirmó que las células con alta expresión de PIGT se localizaban predominantemente dentro de las metástasis hepáticas, exhibiendo niveles de expresión significativamente más altos que los de los tumores primarios. Estos hallazgos refuerzan el posible papel de PIGT en la promoción de la adaptación y la progresión metastásica (Fig. 3B, C y D).

Análisis de la comunicación célula-célula.

Para explorar las redes de comunicación intercelular mediadas por las células malignas con alta expresión de PIGT, empleamos CellPhoneDB para analizar las interacciones ligando-receptor entre los compartimentos maligno, inmunitario y estromal. Los resultados revelaron una comunicación mejorada entre las células cancerosas con alta expresión de PIGT y las MDSC, particularmente a través de las vías de señalización de MIF, SPP1 y TGFβ (Fig. 4A y B).

Estos hallazgos indican que las células tumorales con alta expresión de PIGT pueden remodelar activamente el microambiente tumoral al promover interacciones inmunosupresoras con las MDSC, facilitando así la progresión metastásica (Fig. 4C, D, E, F y G).

La sobreexpresión de PIGT se asocia con un mal pronóstico.

Para evaluar aún más la relevancia clínica de PIGT, realizamos un análisis pan-cáncer. Se descubrió que PIGT se regulaba al alza en múltiples tipos de cáncer, incluidos BLCA, BRCA, GBM, LUAD y COAD. Los análisis de correlación demostraron una fuerte asociación positiva entre PIGT y los genes relacionados con la invasión en varios cánceres, con la correlación más pronunciada observada en el cáncer colorrectal (Fig. 5A y B).

La validación utilizando tres conjuntos de datos transcriptómicos independientes (TCGA, GSE14333 y GSE38832) confirmó que la alta expresión de PIGT se asoció significativamente con una peor supervivencia general, lo que subraya su posible valor como biomarcador pronóstico y objetivo terapéutico (Fig. 5C, D y E).

Características de la infiltración de células inmunitarias y la expresión de PIGT.

Investigamos aún más la relación entre la expresión de PIGT y la infiltración de células inmunitarias. El análisis pan-cáncer reveló que la expresión de PIGT se correlacionó significativamente de forma negativa con múltiples poblaciones de células efectoras inmunitarias, incluidas las células T CD8⁺ y los linfocitos citotóxicos, al tiempo que mostró una correlación positiva con los subconjuntos de células inmunosupresoras. Los resultados consistentes en múltiples algoritmos de estimación de la infiltración inmunitaria demostraron que los tumores con alta expresión de PIGT se enriquecieron con poblaciones de células inmunosupresoras (Fig. 6A, B, C y D).

Además, el análisis transcriptómico espacial validó aún más estos hallazgos, mostrando que las células malignas con alta expresión de PIGT estaban rodeadas por abundantes células inmunosupresoras ITGAM⁺ y CD163⁺ dentro del microambiente tumoral (Fig. 6E y F).

En conjunto, estos resultados sugieren que PIGT puede contribuir al establecimiento de un microambiente tumoral inmunosupresor en la metástasis hepática del cáncer colorrectal al modular el metabolismo tumoral y la composición de las células inmunitarias.

La inhibición de PIGT suprime la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la proliferación de las células del cáncer colorrectal

Para investigar el papel funcional de PIGT en la progresión del CRC, realizamos una serie de ensayos fenotípicos in vitro tras la inhibición de PIGT mediada por siRNA en células HCT116. Se confirmó la silenciamiento eficiente de PIGT mediante análisis de qRT-PCR y Western blot.

En consonancia con los hallazgos bioinformáticos, el análisis de qRT-PCR en líneas celulares de CRC con PIGT silenciado demostró una regulación al alza significativa de múltiples genes asociados a la inflamación a nivel de ARNm, lo que apoya aún más la idea de que la supresión de PIGT puede mejorar las respuestas inflamatorias dentro del microambiente tumoral (Fig. 7A y B).

En los ensayos de cicatrización de heridas, las células con PIGT reducido mostraron una tasa de cierre notablemente más lenta en comparación con las células de control, lo que indica una capacidad migratoria alterada. De manera consistente, los ensayos de migración Transwell revelaron una reducción significativa en el número de células migrantes tras la inhibición de PIGT. Además, los ensayos de invasión en matriz de Matrigel demostraron que el potencial invasivo de las células con PIGT silenciado se redujo sustancialmente, lo que sugiere que PIGT contribuye al fenotipo invasivo de las células de CRC (Fig. 8A).

Además, los ensayos de viabilidad celular (CCK-8) mostraron que la inhibición de PIGT condujo a una disminución significativa de la proliferación celular con el tiempo. En conjunto, estos resultados indican que PIGT promueve la migración, la invasión y la proliferación de las células del cáncer colorrectal, y que su supresión atenúa los comportamientos malignos de las células de CRC in vitro (Fig. 8B).

Para dilucidar las posibles funciones biológicas de PIGT en el CRC, integramos datos transcriptómicos de células individuales con la cohorte TCGA CRC y estratificamos a los pacientes según los niveles de expresión de PIGT. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló que las muestras con baja expresión de PIGT estaban predominantemente enriquecidas en vías relacionadas con la inflamación, lo que sugiere un posible vínculo entre la disminución de PIGT y la señalización inflamatoria asociada al tumor (Fig. 8C y D).

Nuestros resultados demostraron que la expresión de PIGT era significativamente menor en las lesiones primarias de cáncer colorrectal que en las metástasis hepáticas correspondientes. De manera consistente, la infiltración de células efectoras inmunitarias, representada por las células T CD8⁺, fue mayor en los tumores primarios en comparación con los sitios de metástasis hepática. En contraste, las poblaciones de células inmunosupresoras, incluidas las células T reguladoras FOXP3⁺ (Tregs) y los macrófagos asociados al tumor tipo M2 CD163⁺, mostraron una infiltración significativamente mayor en las metástasis hepáticas en relación con los tumores colorrectales primarios (Fig. 8E).

En conjunto, estos hallazgos indican que las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal se caracterizan por un microambiente tumoral inmunosupresor, acompañado de una mayor expresión de PIGT.

Discusión

En este estudio, caracterizamos exhaustivamente el panorama inmunometabólico del CCLM mediante análisis integrales de secuenciación de ARN de una sola célula, transcriptómica espacial y conjuntos de datos de transcriptómica a granel. Nuestros resultados revelaron una remodelación transcripcional y funcional profunda entre los sitios primarios y metastásicos, caracterizada por una mayor inestabilidad cromosómica, reprogramación metabólica y la aparición de un microambiente tumoral (MT) fuertemente inmunosupresor. Entre estos cambios, la sobreexpresión de PIGT surgió como una característica molecular clave de las células tumorales metastásicas, vinculando la adaptación metabólica con la evasión inmune.

La colonización metastásica requiere que las células tumorales ajusten dinámicamente sus estados metabólicos para sobrevivir y proliferar en un microambiente extraño (Su y Karin ^[2023]). Nuestros datos demuestran que las células malignas en las metástasis hepáticas exhiben un enriquecimiento de la glucólisis/gluconeogénesis, la biosíntesis de aminoácidos y el ciclo del citrato, vías esenciales para satisfacer las elevadas demandas de energía y biosíntesis. Estos hallazgos son consistentes con la evidencia previa de que las células de CRC metastásicas adquieren una mayor plasticidad metabólica, lo que permite la adaptación a los gradientes de nutrientes y oxígeno dentro del nicho hepático (Sedlak et al. ^[2023]). La pérdida concomitante de la actividad de la vía inflamatoria en las células metastásicas sugiere además un cambio de fenotipos inmunoestimulantes a fenotipos impulsados metabólicamente (Thier et al. ^[2022]). Esta remodelación metabólica probablemente confiere ventajas selectivas en la colonización del microambiente hepático, que se caracteriza por un alto metabolismo oxidativo y disponibilidad de nutrientes (Zhu y Thompson ^[2019]).

Nuestro estudio identifica a PIGT como un regulador previamente no reconocido del CCLM, que actúa en la intersección del metabolismo tumoral y la supresión inmune. Si bien las investigaciones anteriores se han centrado principalmente en las enzimas metabólicas canónicas, como LDHA, PKM2 y GLS1, para promover la adaptación metastásica del CRC, nuestros hallazgos amplían este paradigma al implicar un componente de la biosíntesis de anclajes GPI en la orquestación de la remodelación inmunometabólica (Wang et al. ^[2025]). A diferencia de las enzimas metabólicas que modulan directamente la producción de energía o la utilización de sustratos, PIGT parece regular el anclaje de proteínas de la superficie celular y la glicosilación, influyendo indirectamente tanto en la captación de nutrientes como en el reconocimiento inmune (Wu et al. ^[2006]). Esta distinción mecanicista destaca una nueva capa de interacción metabólica-inmune que no se había enfatizado previamente en el contexto de la metástasis del CRC (Gamage y Hendrickson ^[2013]).

Coherente con estudios previos, observamos que las células de CRC metastásicas sufren una extensa remodelación metabólica para mantener el crecimiento en el microambiente hepático, caracterizada por la sobreexpresión de la glucólisis, la biosíntesis de aminoácidos y el ciclo del ácido tricarboxílico (Enk et al. ^[2016]). Sin embargo, nuestro análisis va más allá de este cambio metabólico general al revelar que la expresión de PIGT aumenta progresivamente durante la transición de los estados primarios a los metastásicos, lo que sugiere que la remodelación de proteínas dependiente de los anclajes GPI es un mecanismo adaptativo que acompaña a la reprogramación metabólica (Nagpal et al. ^[2008]). Esta observación difiere de los estudios de una sola célula anteriores que atribuyeron principalmente la heterogeneidad metabólica a las diferentes respuestas a la hipoxia o a la actividad mitocondrial, enfatizando en cambio un mecanismo centrado en la remodelación de la superficie celular de la adaptación metabólica (Taylor et al. ^[2023]).

Desde una perspectiva inmunológica, nuestros hallazgos confirman y refinan los modelos actuales del panorama inmune del CCLM. Informes previos han establecido que las células MDSC se acumulan en las lesiones metastásicas, donde promueven la evasión inmune a través de la secreción de SPP1, TGFβ y MIF (Brina et al. ^[2023], Liu et al. ^[2025], Sangaletti et al. ^[2014]). Nuestros resultados corroboran estos hallazgos, pero demuestran además que las células malignas con alta expresión de PIGT amplifican activamente estas interacciones inmunosupresoras, lo que implica un impulso tumoral intrínseco en la configuración del compartimento mieloide. Esto contrasta con las interpretaciones anteriores que consideraban principalmente la activación de las MDSC como una respuesta a la inflamación sistémica en lugar de un proceso iniciado por la señalización de las células tumorales (Zhang et al. ^[2024]). La colocalización espacial de las células tumorales con alta expresión de PIGT con los macrófagos ITGAM⁺ y CD163⁺ subraya un bucle de retroalimentación bidireccional entre la adaptación metabólica y la supresión inmune, en el que la remodelación de glicoproteínas derivadas del tumor promueve el reclutamiento y la función de las MDSC, reforzando así un nicho inmunotolerante (Tabachnick-Cherny et al. ^[2024]).

En línea con estudios oncológicos más amplios, también observamos que PIGT se sobreexpresa ampliamente en múltiples tipos de tumores y se correlaciona positivamente con las firmas genéticas asociadas a la invasión. Sin embargo, su enriquecimiento específico en el CRC metastásico y su estrecha relación con la señalización inmunosupresora lo distinguen de los marcadores metabólicos pancancerosos informados previamente (Nagpal et al. ^[2008], Jiang et al. ^[2007]). Si bien las enzimas como LDHA o PKM2 se correlacionan principalmente con la señalización hipóxica o proliferativa, PIGT integra la organización de la membrana, la transducción de señales y la homeostasis metabólica, lo que la convierte en un nodo molecular único en la regulación metastásica (Yang et al. ^[2025]).

En conjunto, nuestros hallazgos convergen con la literatura previa al reconocer la plasticidad metabólica y la supresión inmune como características distintivas de la metástasis del CRC, pero difieren al identificar una vía molecular no canónica, la biosíntesis de anclajes GPI, mediada por PIGT, como un vínculo central entre estos procesos. Este cambio conceptual amplía la comprensión actual del programa metastásico, pasando de un modelo puramente metabólico o impulsado por el sistema inmune a una red integrada de remodelación inmunometabólica regulada por vías biosintéticas asociadas a la membrana.

Si bien nuestro estudio proporciona nuevas perspectivas sobre las características biológicas del CCLM, se deben reconocer varias limitaciones. En primer lugar, nuestras conclusiones se basan principalmente en análisis transcriptómicos y bioinformáticos, por lo que las asociaciones observadas entre PIGT y la remodelación inmunometabólica siguen siendo correlativas en lugar de causales. Debido a las limitaciones prácticas en los recursos de laboratorio y la financiación, no pudimos realizar experimentos mecanicistas in vitro e in vivo adicionales para validar aún más el papel funcional de PIGT. En segundo lugar, el número relativamente limitado de muestras metastásicas puede no capturar completamente la extensa heterogeneidad del CCLM. Finalmente, aunque nuestros hallazgos sugieren que PIGT puede desempeñar un papel importante en las interacciones tumor-inmune, las vías bioquímicas y los mecanismos de señalización precisos involucrados aún deben dilucidarse. Los estudios futuros que integren cohortes clínicas más amplias, perfiles proteómicos y metabolómicos y experimentos de perturbación funcional serán necesarios para validar y ampliar nuestros hallazgos.

Conclusión

En resumen, este estudio describe la reprogramación inmunometabólica que subyace a la metástasis hepática del cáncer colorrectal e identifica a PIGT como un regulador fundamental que vincula el metabolismo tumoral con la supresión inmune. Al conectar la inestabilidad genómica, la adaptación metabólica y la modulación inmune, PIGT facilita el establecimiento de un nicho metastásico dentro del hígado. Nuestro trabajo destaca a PIGT como un biomarcador pronóstico prometedor y un objetivo terapéutico, ofreciendo un marco conceptual para desarrollar estrategias combinadas metabólicas e inmunes contra el cáncer colorrectal metastásico.

Información complementaria

A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.