El análisis de perfilado a nivel de célula única identifica una población de neutrófilos CCR2(+) asociada con la metástasis hepática del cáncer colorrectal en un modelo murino.

Las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (CRLMs) son un factor determinante importante del pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal (CRC) [^[1]]. El hígado es el sitio metastásico más común en el CRC, y aproximadamente el 25-30% de los pacientes con CRC desarrollan metástasis hepáticas durante el curso de la enfermedad [^[2]]. Las estrategias de tratamiento actuales incluyen la resección quirúrgica, la ablación por radiofrecuencia, la quimioterapia y los enfoques biológicos o inmunoterapéuticos [^[3]]. A pesar de estos avances, la mayoría de los pacientes con metástasis hepáticas experimentan finalmente recurrencia y progresión de la enfermedad, lo que subraya la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas.

El hígado es un órgano inmunológicamente tolerogénico con una actividad inmunitaria compleja, lo que puede contribuir a su alta susceptibilidad a la colonización metastásica [^[4]], particularmente en los cánceres gastrointestinales como el CRC [^[5],^[6]] y el cáncer de páncreas [^[7]], así como en el melanoma [^[8]] y el cáncer de pulmón [^[9],^[10]]. Dentro de este microambiente inmunitario único, las poblaciones de células mieloides desempeñan funciones críticas en la configuración de los nichos premetastásicos y metastásicos [^[11]]. Las células CD11b+Gr1+ representan una población mieloide heterogénea que comprende tanto linajes granulocíticos como monocíticos [^[12],^[13]]. Derivadas de los progenitores de granulocitos y monocitos (GMP), estas células son componentes críticos del microambiente inmunitario tumoral (TIME) y se han relacionado con la metástasis y la recurrencia tumoral [^[14],^[15]].

El CRLM se desarrolla a través de un proceso continuo y de múltiples etapas, que progresa desde la micrometástasis latente hasta la macrometástasis manifiesta. Durante este proceso, los linajes mieloides se desplazan desde la médula ósea hacia el sistema circulatorio y se reclutan en los nichos premetastásicos [^[16]] en respuesta a la señalización de quimiocinas [^[17],^[18]], estableciendo así un entorno propicio para la progresión tumoral a través de la supresión de la inmunidad antitumoral [^[19]] y la promoción de la metástasis tumoral [^[20]]. Es importante destacar que el reclutamiento de células mieloides no es uniforme en todos los contextos metastásicos. Por ejemplo, se ha informado que el reclutamiento dependiente de CCL2/CCR2 de células mieloides CD11b+Gr1mid promueve el CRLM, pero no la metástasis hepática del melanoma, lo que sugiere una regulación específica del contexto tumoral del tráfico de células mieloides [^[14]]. Sin embargo, las células CD11b+Gr1+ comprenden poblaciones granulocíticas y monocíticas heterogéneas, y la identidad precisa del linaje, la ontogenia y la especialización funcional de las células mieloides responsivas a CCR2 en el CRLM aún no se comprenden completamente.

El tráfico de células mieloides guiado por quimiocinas es un determinante clave de la formación del nicho metastásico. Entre estas vías, el eje CCL2/CCR2 se ha relacionado repetidamente con la diseminación del CRC y la metástasis hepática. CCR2 (receptor de quimiocinas C-C motif 2) se asocia clásicamente con el reclutamiento de monocitos, macrófagos y células supresoras mieloides (Mo-MDSCs) [^[4]]. En el CRC, las células metastásicas dormientes CCR2+ de CRC pueden responder a la CCL7 secretada por las Mo-MDSCs para impulsar el crecimiento metastásico a través de la vía JAK/STAT3 [^[21]], mientras que los macrófagos asociados al tumor (TAM) CCR2+ se reclutan desde la médula ósea en respuesta a la CCL2 derivada del tumor [^[22]]. La activación impulsada por TCF4 de la vía CCL2/CCR2 promueve aún más el reclutamiento de macrófagos y la polarización de tipo M2 en los sitios metastásicos [^[23]]. En conjunto, estos hallazgos respaldan la idea de que existe un papel importante para las interacciones dependientes de CCR2 entre las células metastásicas de CRC y las células mieloides inmunosupresoras [^[24]].

Sin embargo, la mayoría de los estudios de CCR2 en la metástasis del CRC se han centrado en las células monocíticas, los macrófagos o las propias células tumorales. Esta visión centrada en los monocitos puede pasar por alto la heterogeneidad de las poblaciones mieloides CD11b+Gr1+, particularmente el linaje de los neutrófilos. Aunque CCR2 no se considera convencionalmente un receptor de quimiocinas asociado a los neutrófilos, la evidencia emergente indica que los neutrófilos pueden adquirir CCR2 funcional en condiciones inflamatorias y patológicas, lo que permite su movilización desde la médula ósea y su reclutamiento en los tejidos periféricos [^[25],^[26]]. Dada la creciente conciencia de la heterogeneidad de los neutrófilos en el cáncer [^[27]], si CCR2 marca un subconjunto de neutrófilos pro-metastásicos distinto en el CRLM y cómo estas células contribuyen a la formación del nicho metastásico hepático, sigue siendo en gran medida inexplorado y justifica una mayor investigación.

Nuestra hipótesis es que el compartimento de células mieloides CCR2+ en el CRLM puede no ser exclusivamente monocítico y podría incluir una población de tipo neutrofílico distinta con características transcripcionales potencialmente asociadas con la formación del nicho metastásico. Los resultados primarios de este estudio fueron identificar y caracterizar esta población mediante secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), definir su trayectoria de diferenciación inferida, examinar la comunicación intercelular predicha con los neutrófilos maduros e identificar programas transcriptómicos circulantes asociados con la progresión del CRLM. Para abordar esta cuestión, utilizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) para resolver la heterogeneidad de las células CD11b+Gr1+ de la médula ósea en un modelo de inyección intrasplénica de MC38 de CRLM. Identificamos una población de tipo neutrofílico CCR2+ caracterizada por un fenotipo CD11b+Gr1+Ly6Ghi que estaba enriquecida en ratones con CRLM. A través de análisis transcriptómicos integrados de una sola célula y a granel, la inferencia de la comunicación célula-célula identificó una interacción FN1-CD44 predicha entre las células de tipo neutrofílico CCR2+ y los neutrófilos maduros, que se asoció con la activación transcripcional del programa de transición epitelial-mesenquimal (EMT) [^[28],^[29]]. Además, los transcriptomas de la sangre periférica implicaron aún más que la señalización JAK-STAT y TGF-β se asociaron con el enriquecimiento de la población de tipo neutrofílico CCR2+ [^[30]]. En conjunto, estos hallazgos derivados del transcriptoma resaltan esta población como un posible contribuyente al CRLM y proporcionan una base para una futura investigación funcional. Definir esta población puede revisar la comprensión actual centrada en los monocitos de la señalización de CCR2 en el CRLM y revelar un mecanismo no reconocido mediado por neutrófilos de la progresión metastásica.

2. Materiales y Métodos

2.1. Modelo de ratón, recolección de muestras y clasificación por FACS

Se obtuvieron ratones macho C57BL/6J de seis semanas de edad del Centro de Organismos Modelo de Shanghái (Shanghái, China). Todos los experimentos y procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Junta de Investigación Científica de la Segunda Universidad Militar (Número de Aprobación: 2022-011). El CRLM se estableció en 8 ratones por grupo mediante la inyección intrasplénica de 2 × 105 células MC38 seguida de esplenectomía. Brevemente, los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg, i.p.) y xilazina (10 mg/kg, i.p.), se expuso el bazo y se inyectaron las células tumorales suspendidas en 100 µL de PBS; después de 2 minutos, se extirpó el bazo para evitar que las células residuales proliferaran en el sitio de inyección y se suturó la pared abdominal por capas. Los ratones de control se sometieron a esplenectomía al mismo tiempo y recibieron el mismo volumen de PBS. Durante la necropsia, se recolectaron los hígados y se fotografiaron para documentar la formación de tumores macroscópicos. Se registraron el peso del hígado y el peso corporal, y se calculó la relación peso del hígado/peso corporal como una medida aproximada de la carga tumoral hepática. En total, para la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), se utilizaron muestras de médula ósea de un ratón con CRLM y un ratón de control. Para la secuenciación de ARN a granel (bulk RNA-seq), se analizaron 15 muestras, que comprendían 4 muestras de médula ósea y 4 muestras de sangre de ratones con CRLM y 3 muestras de médula ósea y 4 muestras de sangre de ratones de control. Los animales fueron sacrificados 14 días después de la cirugía, y se recolectaron la médula ósea y la sangre periférica para la secuenciación de ARN de una sola célula y a granel. Las células de la médula ósea se obtuvieron lavando los fémures y las tibias con RPMI-1640 suplementado con 2% de suero fetal bovino, y los eritrocitos se eliminaron con tampón de lisis ACK (Gibco, Thermo Fisher Scientific, número de catálogo A1049201). Para aislar el compartimento CD11b+Gr1+, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD45 (APC-Cy7, número de catálogo 557659, BD), CD11b (FITC, número de catálogo 557396, BD) y Gr1 (APC, número de catálogo 553129, BD); se centrifugaron a 400× g; y se resuspendieron en 300 µL de PBS. Las células de la médula ósea se clasificaron primero en función de FSC-A y SSC-A para excluir los desechos, seguido de la discriminación de singulete utilizando FSC-A y FSC-H y la selección de células viables. Luego, se seleccionaron los leucocitos CD45+ y las células mieloides CD11b+Gr1+ se clasificaron dentro de la población CD45+ como la población principal. Las células CD45+CD11b+Gr1+ se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (citómetro de flujo BD FACSCelesta, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) y se procesaron para la preparación de la biblioteca de scRNA-seq.

2.2. Procesamiento de datos de scRNA-seq

Los datos de secuenciación sin procesar generados en un NovaSeq 6000 (Illumina) se procesaron con CellRanger (v3.1.0). Los archivos BCL se convirtieron a FASTQ y se alinearon con el genoma del ratón (mm10). Los análisis posteriores se realizaron utilizando Seurat (v4.0.2) [^[31]]. Se retuvieron las células con 100-5500 genes y una fracción mitocondrial inferior al 15%. La detección de dobletes se realizó en cada muestra antes de la integración utilizando DoubletFinder (v2.0), identificando 1029 dobletes en la muestra de control y 1115 en la muestra de CRLM. Todos los dobletes se eliminaron antes de la integración, con 12 688 y 15 288 singuletes retenidos, respectivamente. Las 15 288 células del grupo modelo y las 12 688 células del grupo de control se integraron en un solo objeto utilizando FindIntegrationAnchors e IntegrateData y luego se normalizaron y escalaron con NormalizeData y ScaleData, utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los genes marcadores se definieron mediante una fracción de detección mínima del 25% (min.pct = 0,25) y un umbral de log2FC de 0,25; los DEG se filtraron aún más a un valor de p ajustado < 0,05 y |avg_log2FC| > 1. Las 2000 características variables principales se utilizaron para RunPCA, y los primeros 20 componentes principales (PC), seleccionados por JackStrawPlot y ElbowPlot, se utilizaron para la agrupación y UMAP a una resolución de 0,8. Los tipos de células se anotaron utilizando la base de datos CellMarker, SingleR (v1.4.1) y los marcadores publicados. Para la sub-agrupación de neutrófilos, se utilizaron los primeros 5 PC a una resolución de 0,5.

2.3. Trayectoria de pseudotiempo y análisis de velocidad de ARN

Las trayectorias de diferenciación se construyeron con Monocle (v2.18.0) [^[32]] ordenando las células a lo largo del pseudotiempo utilizando los DEG de la función FindAllMarkers de Seurat. La cinética de los genes dependiente del pseudotiempo se visualizó como mapas de calor BEAM y se trazaron las tendencias de los genes marcadores por grupo. La velocidad de ARN se estimó con scVelo (v0.2.4) [^[33]], que utiliza los recuentos de ARNm empalmado y no empalmado para inferir el estado prospectivo de las células individuales [^[34]]; se infirieron las tasas de transcripción, empalme y degradación específicas de los genes y se proyectaron como vectores de velocidad en el UMAP.

2.4. Expresión diferencial y enriquecimiento funcional

Los DEG de scRNA-seq dentro de los grupos se identificaron con las funciones FindMarkers y FindAllMarkers de Seurat, y los genes centrales de la secuenciación de ARN a granel se derivaron de los módulos significativos de WGCNA. El enriquecimiento GO de los DEG CCR2+ de neutrófilos se realizó y se visualizó con GOplot (v1.0.2), evaluando los procesos biológicos, las funciones moleculares y los componentes celulares a p < 0,05. Los genes centrales y los DEG de los módulos clave se analizaron con ClueGO (v2.5.8) y CluePedia (v1.5.8) en Cytoscape (v3.8.0) en comparación con KEGG y las categorías de Proceso Biológico, Componente Celular, Función Molecular y Sistema Inmunitario GO, con el enriquecimiento evaluado mediante el método de reducción escalonada de Bonferroni (p < 0,05). Para las comparaciones a nivel de vía, se evaluaron los conjuntos de genes HALLMARK mediante GSEA y se visualizaron con pheatmap (v1.0.12), y GSVA (v1.38.2) [^[35]] con msigdbr (v7.4.1) se utilizó para comparar las vías KEGG (conjuntos de genes seleccionados C2) entre las muestras de sangre de CRLM y de control.

2.5. Análisis de comunicación célula-célula

La comunicación intercelular ligando-receptor entre los estados mieloides CD11b+Gr1+ se infirió con CellChat (v1.1.3) [^[36]] para los grupos modelo y control. Se cuantificaron los patrones de señalización entrantes y salientes y las intensidades relativas de las vías a partir de la expresión de ligandos y receptores, y se comparó la comunicación general entre los grupos. Las vías de señalización CCL y FN1, que mostraron una actividad significativa, se seleccionaron para un análisis detallado de la interacción entre la población neutrófila CCR2+ y MatureNeu.

2.6. Comparación con un conjunto de datos de infección externo

Para evaluar si el estado neutrófilo CCR2+ surge en condiciones inflamatorias, recuperamos datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de células CD11b+Gr1+ de la médula ósea de ratones infectados con E. coli (GSE137539) [^[13]] utilizando GEOquery (v2.58.0), incluidos los ejemplos GSM4081545, GSM4081546, GSM4081549 y GSM4081550. Estos datos se procesaron con los mismos parámetros que se utilizaron para el conjunto de datos interno.

2.7. Secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq) y WGCNA

Se construyeron redes de coexpresión a partir de la matriz de expresión de la secuenciación de ARN masiva utilizando WGCNA (v1.70-3) [^[37]]. Se calcularon las correlaciones de Pearson por pares y se transformaron en una matriz de adyacencia ponderada utilizando una potencia de umbral suave de 8, seleccionada para aproximar una topología sin escala. TOM y su disimilitud (1-TOM) se utilizaron para agrupar los genes coexpresados en módulos, visualizados como un dendrograma jerárquico, con un tamaño mínimo de módulo de 50, un tamaño máximo de módulo de 6000 y una altura de corte de fusión de 0,4. Se calcularon la membresía del módulo (MM) y la significancia del gen (GS) para relacionar los módulos con los grupos de muestra, y los genes centrales (|MM| > 0,75 y |GS| > 0,2) se conservaron para el análisis y la visualización posteriores. Las correlaciones módulo-rasgo y la significancia del gen central se evaluaron con la corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini-Hochberg (FDR).

2.8. Análisis citométrico de flujo de células de la médula ósea

Para la validación mediante citometría de flujo, se utilizaron 6 ratones por grupo. Las células de la médula ósea se obtuvieron de ratones CRLM y control mediante el lavado de los huesos femorales y tibiales con medio RPMI-1640 suplementado con un 2% de suero bovino fetal. Los eritrocitos se eliminaron utilizando el tampón de lisis ACK. Las suspensiones de células individuales se tiñeron con un tinte de viabilidad y anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD45, CD11b, Gr1, Ly6G y CCR2. Se utilizaron el siguiente tinte de viabilidad y anticuerpos: Fixable Viability Stain 510 (BD Biosciences, n.º de catálogo 564406), anti-CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, n.º de catálogo 557659), anti-CD11b-FITC (BD Biosciences, n.º de catálogo 557396), anti-Gr1-APC (BD Biosciences, n.º de catálogo 553129), anti-Ly6G-PE (BD Biosciences, n.º de catálogo 551461) y anti-CCR2-PE-Cy7 (Biolegend, n.º de catálogo 150612). Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en 300 µL de PBS para la adquisición citométrica de flujo en un citómetro de flujo BD FACSCelesta. Las células de la médula ósea se clasificaron inicialmente en función de FSC-A y SSC-A para excluir los restos celulares, y luego se realizó la discriminación de células individuales. Se excluyeron las células muertas positivas para FVS510, y las células viables se utilizaron para el análisis posterior. A continuación, se seleccionaron los leucocitos CD45+ y, a continuación, se realizó la clasificación de las células mieloides CD11b+Gr1+ como la población principal, de acuerdo con la estrategia de clasificación FACS utilizada para la secuenciación de ARN unicelular. Dentro del compartimento CD45+CD11b+Gr1+, se evaluó la expresión de Ly6G y CCR2, y se identificaron y cuantificaron las células doblemente positivas Ly6G+CCR2+. Se aplicó la misma estrategia de clasificación a todas las muestras. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (v 10.8.1).

2.9. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism (v8.0.1), R (v4.0.5) y Python (v3.8.10), con visualización utilizando ggplot2 (v3.3.5) y seaborn (v0.11.2). Para las comparaciones de dos grupos, se utilizó una prueba t de Student de dos colas, y para las comparaciones de tres grupos, se utilizó una ANOVA de una vía, con un valor de p < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Las pruebas estadísticas específicas, los métodos de corrección y los umbrales para los análisis de secuenciación de ARN unicelular y secuenciación de ARN masiva se describen en las subsecciones correspondientes anteriores.

2.1. Modelo de ratón, recolección de muestras y clasificación por FACS

Se obtuvieron ratones macho C57BL/6J de seis semanas de edad del Centro de Organismos Modelo de Shanghái (Shanghái, China). Todos los experimentos y procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Junta de Investigación Científica de la Segunda Universidad Militar (Número de Aprobación: 2022-011). Se estableció CRLM en 8 ratones por grupo mediante inyección intrasplénica de 2 × 105 células MC38 seguida de esplenectomía. Brevemente, los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg, i.p.) y xilazina (10 mg/kg, i.p.), se expuso el bazo y se inyectaron células tumorales suspendidas en 100 µL de PBS; después de 2 minutos, se extirpó el bazo para evitar que las células residuales proliferaran en el sitio de inyección, y la pared abdominal se suturó en capas. Los ratones de control se sometieron a esplenectomía al mismo tiempo y recibieron el mismo volumen de PBS. Durante la necropsia, se recolectaron los hígados y se fotografiaron para documentar la formación de tumores macroscópicos. Se registraron el peso del hígado y el peso corporal, y se calculó la relación hígado/peso corporal como una medida indirecta del tamaño del tumor hepático. En total, para la secuenciación de ARN unicelular, se utilizaron muestras de médula ósea de un ratón CRLM y un ratón de control. Para la secuenciación de ARN masiva, se analizaron 15 muestras, que comprendían 4 muestras de médula ósea y 4 muestras de sangre de ratones CRLM y 3 muestras de médula ósea y 4 muestras de sangre de ratones de control. Los animales fueron sacrificados 14 días después de la cirugía, y se recolectaron la médula ósea y la sangre periférica para la secuenciación de ARN unicelular y masiva. Las células de la médula ósea se obtuvieron lavando los huesos femorales y tibiales con RPMI-1640 suplementado con un 2% de suero bovino fetal, y los eritrocitos se eliminaron con el tampón de lisis ACK (Gibco, Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo A1049201). Para aislar el compartimento CD11b+Gr1+, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD45 (APC-Cy7, n.º de catálogo 557659, BD), CD11b (FITC, n.º de catálogo 557396, BD) y Gr1 (APC, n.º de catálogo 553129, BD); se centrifugaron a 400× g; y se resuspendieron en 300 µL de PBS. Las células de la médula ósea se clasificaron inicialmente en función de FSC-A y SSC-A para excluir los restos celulares, seguida de la discriminación de células individuales utilizando FSC-A y FSC-H y la selección de células viables. A continuación, se seleccionaron los leucocitos CD45+, y a continuación, se clasificaron las células mieloides CD11b+Gr1+ dentro de la población CD45+ como la población principal. Las células CD45+CD11b+Gr1+ se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (citómetro de flujo BD FACSCelesta, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) y se procesaron para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN unicelular.

2.2. Procesamiento de datos de secuenciación de ARN unicelular

Los datos de secuenciación sin procesar generados en un NovaSeq 6000 (Illumina) se procesaron con CellRanger (v3.1.0). Los archivos BCL se convirtieron a FASTQ y se alinearon al genoma del ratón (mm10). Los análisis posteriores se realizaron utilizando Seurat (v4.0.2) [^[31]]. Se conservaron las células con entre 100 y 5500 genes y una fracción mitocondrial inferior al 15%. La detección de dobletes se realizó en cada muestra antes de la integración utilizando DoubletFinder (v2.0), identificando 1029 dobletes en la muestra de control y 1115 en la muestra de CRLM. Todos los dobletes se eliminaron antes de la integración, conservando 12 688 y 15 288 células individuales, respectivamente. Las 15 288 células del grupo modelo y las 12 688 células del grupo control se integraron en un único objeto utilizando FindIntegrationAnchors e IntegrateData y, a continuación, se normalizaron y escalaron con NormalizeData y ScaleData, utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni para las comparaciones múltiples. Los genes marcadores se definieron mediante una fracción de detección mínima del 25% (min.pct = 0,25) y un umbral de log2FC de 0,25; los DEG se filtraron aún más a un valor de p ajustado < 0,05 y |avg_log2FC| > 1. Se utilizaron las 2000 características variables principales para RunPCA, y los primeros 20 componentes principales (PC), seleccionados por JackStrawPlot y ElbowPlot, se utilizaron para la agrupación y UMAP con una resolución de 0,8. Los tipos de células se anotaron utilizando la base de datos CellMarker, SingleR (v1.4.1) y los marcadores publicados. Para la subagrupación de neutrófilos, se utilizaron los primeros 5 PC con una resolución de 0,5.

2.3. Trayectoria de pseudotiempo y análisis de velocidad de ARN

Las trayectorias de diferenciación se construyeron con Monocle (v2.18.0) [^[32]] ordenando las células a lo largo del pseudotiempo utilizando los DEG de la función FindAllMarkers de Seurat. La cinética de los genes dependiente del pseudotiempo se visualizó como mapas de calor BEAM, y se trazaron las tendencias de los genes marcadores por grupo. La velocidad de ARN se estimó con scVelo (v0.2.4) [^[33]], que utiliza los recuentos de ARNm empalmado y no empalmado para inferir el estado prospectivo de las células individuales [^[34]]; se infirieron las tasas de transcripción, empalme y degradación específicas de los genes y se proyectaron como vectores de velocidad en el UMAP.

2.4. Expresión diferencial y enriquecimiento funcional

Los DEG de scRNA-seq dentro de los grupos se identificaron con las funciones FindMarkers y FindAllMarkers de Seurat, y los genes centrales de la secuenciación de ARN masiva se derivaron de los módulos significativos de WGCNA. El enriquecimiento GO de los DEG de neutrófilos CCR2+ se realizó y se visualizó con GOplot (v1.0.2), evaluando los procesos biológicos, las funciones moleculares y los componentes celulares con p < 0,05. Los genes centrales y los DEG de los módulos clave se analizaron con ClueGO (v2.5.8) y CluePedia (v1.5.8) en Cytoscape (v3.8.0) frente a KEGG y las categorías de Proceso Biológico, Componente Celular, Función Molecular y Sistema Inmunitario de GO, con el enriquecimiento evaluado mediante el método de reducción paso a paso de Bonferroni (p < 0,05). Para las comparaciones a nivel de vía, se evaluaron los conjuntos de genes HALLMARK mediante GSEA y se visualizaron con pheatmap (v1.0.12), y GSVA (v1.38.2) [^[35]] con msigdbr (v7.4.1) se utilizó para comparar las vías KEGG (conjuntos de genes seleccionados C2) entre las muestras de sangre de CRLM y control.

2.5. Análisis de comunicación intercelular

La comunicación intercelular ligando-receptor entre los estados mieloides CD11b+Gr1+ se infirió con CellChat (v1.1.3) [^[36]] para los grupos modelo y control. Se cuantificaron los patrones de señalización entrantes y salientes y las intensidades relativas de las vías a partir de la expresión de ligandos y receptores, y se comparó la comunicación general entre los grupos. Las vías de señalización CCL y FN1, que mostraron una actividad significativa, se seleccionaron para un análisis detallado de la interacción entre la población neutrófila CCR2+ y MatureNeu.

2.6. Comparación con un conjunto de datos de infección externo

Para evaluar si el estado neutrófilo CCR2+ surge en condiciones inflamatorias, recuperamos datos de secuenciación de ARN unicelular de células CD11b+Gr1+ de la médula ósea de ratones infectados con E. coli (GSE137539) [^[13]] utilizando GEOquery (v2.58.0), incluidos los ejemplos GSM4081545, GSM4081546, GSM4081549 y GSM4081550. Estos datos se procesaron con los mismos parámetros que se utilizaron para el conjunto de datos interno.

2.7. Secuenciación de ARN masiva y WGCNA

Se construyeron redes de coexpresión a partir de la matriz de expresión de la secuenciación de ARN masiva utilizando WGCNA (v1.70-3) [^[37]]. Se calcularon las correlaciones de Pearson por pares y se transformaron en una matriz de adyacencia ponderada utilizando una potencia de umbral suave de 8, seleccionada para aproximar una topología sin escala. TOM y su disimilitud (1-TOM) se utilizaron para agrupar los genes coexpresados en módulos, visualizados como un dendrograma jerárquico, con un tamaño mínimo de módulo de 50, un tamaño máximo de módulo de 6000 y una altura de corte de fusión de 0,4. Se calcularon la membresía del módulo (MM) y la significancia del gen (GS) para relacionar los módulos con los grupos de muestra, y los genes centrales (|MM| > 0,75 y |GS| > 0,2) se conservaron para el análisis y la visualización posteriores. Las correlaciones módulo-rasgo y la significancia del gen central se evaluaron con la corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini-Hochberg (FDR).

2.8. Análisis citométrico de flujo de células de la médula ósea

Para la validación mediante citometría de flujo, se utilizaron 6 ratones por grupo. Se recolectaron células de la médula ósea de ratones con metástasis de cáncer colorrectal al hígado (CRLM) y de ratones control mediante la perfusión de los huesos femorales y tibiales con medio RPMI-1640 suplementado con un 2% de suero bovino fetal. Los eritrocitos se eliminaron utilizando el tampón de lisis ACK. Las suspensiones de células simples se tiñeron con un colorante de viabilidad y anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD45, CD11b, Gr1, Ly6G y CCR2. Se utilizaron el siguiente colorante de viabilidad y anticuerpos: Fixable Viability Stain 510 (BD Biosciences, n.º de catálogo 564406), anti-CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, n.º de catálogo 557659), anti-CD11b-FITC (BD Biosciences, n.º de catálogo 557396), anti-Gr1-APC (BD Biosciences, n.º de catálogo 553129), anti-Ly6G-PE (BD Biosciences, n.º de catálogo 551461) y anti-CCR2-PE-Cy7 (Biolegend, n.º de catálogo 150612). Después de la tinción, las células se lavaron y se resuspendieron en 300 µL de PBS para la adquisición citométrica de flujo en un citómetro de flujo BD FACSCelesta. Las células de la médula ósea se clasificaron inicialmente en función de FSC-A y SSC-A para excluir los restos celulares, y luego se realizó la discriminación de células individuales. Se excluyeron las células muertas positivas para FVS510 y se utilizaron las células viables para el análisis posterior. A continuación, se seleccionaron los leucocitos CD45+ y, a continuación, se realizó la clasificación de las células mieloides CD11b+Gr1+, que constituyen la población principal, de acuerdo con la estrategia de clasificación FACS utilizada para la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq). Dentro del compartimento CD45+CD11b+Gr1+, se evaluó la expresión de Ly6G y CCR2, y se identificaron y cuantificaron las células doblemente positivas Ly6G+CCR2+. Se aplicó la misma estrategia de clasificación a todas las muestras. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (v 10.8.1).

2.9. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism (v8.0.1), R (v4.0.5) y Python (v3.8.10), con visualización utilizando ggplot2 (v3.3.5) y seaborn (v0.11.2). Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student de dos colas, y para las comparaciones entre tres grupos, se utilizó una ANOVA de una vía, considerando un valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo. Las pruebas estadísticas específicas, los métodos de corrección y los umbrales para los análisis de scRNA-seq y RNA-seq a granel se describen en las subsecciones correspondientes anteriores.

3. Resultados

3.1. Atlas de célula única de las líneas CD11b+Gr1+ de la médula ósea en CRLM

Las células CD11b+Gr1+ de la médula ósea de ratones sometidos a inyección intrasplénica de células MC38 se clasificaron mediante FACS y se analizaron mediante scRNA-seq. Después del control de calidad, se retuvieron 15.288 y 12.688 células de alta calidad de los grupos modelo y control, respectivamente, con 17.330 genes detectados en total. La agrupación basada en gráficos UMAP resolvió ocho grupos, que se anotaron utilizando SingleR y marcadores canónicos y se asignaron a cinco poblaciones, es decir, neutrófilos (Neu—Camp y Lcn2), progenitores mieloides (MPs—Elane y Mpo), monocitos (Mono—Csf1r y Ccr2), células B (Fcrla y Cd79b) y células T (Cd3d y Ccl5) (Figura 1A, C, E), con las proporciones de los grupos que se muestran en la Figura 1B y la agrupación integrada sobre los 10 genes variables principales que se muestran en la Figura 1D. La movilización de las células CD11b+Gr1+ en CRLM se reflejó en una mayor abundancia de neutrófilos que de monocitos. Surgió un grupo de neutrófilos distinto en el grupo modelo, pero estuvo casi ausente en el grupo control. Mostró una mayor expresión de Ccr2 al tiempo que conservaba los marcadores de progenitores mieloides y se designó como una población de neutrófilos similar a CCR2+.

3.2. Surge una población de neutrófilos similar a CCR2+ a lo largo de la trayectoria de diferenciación de los neutrófilos

El análisis de pseudotiempo de Monocle de los MPs y los neutrófilos situó la población de neutrófilos similar a CCR2+ en una etapa de diferenciación avanzada, estrechamente alineada con los neutrófilos maduros y surgiendo en un punto de ramificación distinto a medida que los MPs progresaban a través de estados intermedios (Figura 1F). Los genes ordenados por pseudotiempo se resolvieron en cuatro categorías (Figura 1G): los marcadores de MP (Mpo, Ctsg y Elane) alcanzaron su punto máximo al principio, seguidos de los genes de proliferación (Stmn1 y Mki67); los neutrófilos luego hicieron la transición de Ly6G− a Ly6G+ con la regulación ascendente de Lcn2 y Camp, y los neutrófilos maduros expresaron Ccl6, Il1b y Retnlg (Figura 1I). Los marcadores de neutrófilos maduros (Lcn2, Camp y S100a8/9) aumentaron y se estabilizaron, mientras que Elane y Mpo disminuyeron a niveles casi indetectables, pero aumentaron bruscamente en el punto de ramificación, lo que indica que este grupo era la población de neutrófilos similar a CCR2+. La velocidad del ARN (Figura 1H) fue consistente con la diferenciación bidireccional de los MPs en neutrófilos y monocitos; los vectores de velocidad cerca de la población de neutrófilos similar a CCR2+ fueron más cortos en el grupo CRLM que en los controles, lo que sugiere una dinámica alterada del estado celular en el contexto tumoral.

3.3. La población de neutrófilos similar a CCR2+ forma un estado terminal distinto con características proliferativas y biosintéticas

La sub-agrupación del compartimento de neutrófilos, siguiendo el continuo precursor-inmaduro-maduro establecido [^[12], ^[13], ^[27]], agrupó los 11 grupos en seis estados: proNeu1, proNeu2, preNeu, ImmatureNeu, MatureNeu y poblaciones de neutrófilos similares a CCR2+ (Figura 2A). El grupo CRLM mostró una mayor proporción de MatureNeu y menores proporciones de proNeu1/proNeu2, lo que indica un cambio hacia una diferenciación más avanzada (Figura 2B). Entre los 10 genes variables principales (Figura 2C, D), proNeu1/proNeu2 expresó Cebpe y Stmn1; ImmatureNeu/MatureNeu expresó Mmp8, Mmp9 y Retnlg; MatureNeu expresó preferentemente Ccl6 e Il1b; y la población de neutrófilos similar a CCR2+ expresó de forma única Mpo, Ccr2, Ctsg y Fn1. El enriquecimiento GO de los genes de neutrófilos similar a CCR2+ destacó el ensamblaje de ribosomas (GO 0005840), la traducción citoplasmática (GO 0002181), la unión al ARNr (GO 0019843), la unión al ARNm (GO 0003729) y la regulación positiva del ciclo celular (GO 1901989) (Figura 2E), lo que indica un estado transcripcional y biosintéticamente activo. El ordenamiento de pseudotiempo situó la rama de neutrófilos similar a CCR2+ predominantemente en el grupo CRLM (Figura 2F): los neutrófilos progresaron desde proNeu1/proNeu2 a través de preNeu, ImmatureNeu y poblaciones de neutrófilos similar a CCR2+ hasta MatureNeu. El mapa de calor BEAM mostró genes pre-rama compartidos para esta población y MatureNeu que divergieron posteriormente (Figura 2G), con la población de neutrófilos similar a CCR2+ que reguló específicamente al alza Fn1, Ccr2, Ctsg y Mpo junto con los marcadores de proliferación Mki67 y Stmn1. La velocidad del ARN (Figura 2H) indicó que, a diferencia de los controles, esta población no se alineó con un solo subgrupo, sino que representó un estado terminal alternativo que se predijo que interactuaría con MatureNeu (Figura 2I).

3.4. Inferencia de la comunicación FN1-CD44 y CCL6 entre la población de neutrófilos similar a CCR2+ y los neutrófilos maduros

La inferencia de CellChat de la comunicación ligando-receptor (Figura 3D) vinculó la población de neutrófilos similar a CCR2+ con los neutrófilos maduros a través de dos interacciones. Ccl6, expresado en gran medida por ImmatureNeu y MatureNeu, se infirió, basándose en las anotaciones de CellChatDB, que señalaba a la población de neutrófilos similar a CCR2+ a través de Ccr1 y Ccr2; dado que CCR2 es canónicamente un receptor de CCL2 para monocitos y macrófagos, una respuesta de neutrófilos inferida a CCL6 dentro del compartimento CD11b+Gr1+ es notable. Recíprocamente, se infirió que FN1 de la población de neutrófilos similar a CCR2+ se unía a CD44 en MatureNeu. Ambas vías fueron más activas en el grupo tumoral (Figura 3A-C), con la señalización de CCL mediada por CCL6-CCR1 y CCL6-CCR2 y la señalización de FN1 mediada predominantemente por FN1-CD44. Por lo tanto, la inferencia situó a esta población como señalizando a MatureNeu principalmente a través de FN1-CD44 al tiempo que recibía señales de CCL6 a cambio (Figura 3F-H). La comparación HALLMARK entre los tres estados (Figura 3E) mostró que esta población reguló al alza G2MCHECKPOINT, REACTIVEOXYGENSPECIESPATHWAY, ANGIOGENESIS y PI3KAKTMTORSIGNALING, mientras que MatureNeu reguló al alza programas inflamatorios (INFLAMMATORYRESPONSE y vías relacionadas con el factor de crecimiento transformante-β, la interleucina y el interferón) y programas relacionados con la tumorigénesis (EPITHELIALMESENCHYMALTRANSITION, P53PATHWAY y NOTCHSIGNALING). Dado que Fn1 y Cd44 son genes clave asociados a EMT, estos patrones son consistentes con la inferencia de que la población de neutrófilos similar a CCR2+ puede estar vinculada transcripcionalmente a MatureNeu.

3.5. La población de neutrófilos similar a CCR2+ no se recupera en la infección microbiana

Para probar si una población de neutrófilos similar a CCR2+ también surgiría en una inflamación no relacionada con el cáncer, analizamos GSE137539 (células Gr1+ de la médula ósea de ratones infectados con E. coli), con GSM4081549/GSM4081550 que sirvió como grupo de infección y GSM4081545/GSM4081546 que sirvió como control, y para la visualización, utilizamos las anotaciones de Xie et al. (Figura S1A, B). Después de aislar los MPs y los neutrófilos para el análisis de Monocle con los mismos marcadores (Figura S1C, D), observamos que ninguno de los cuatro grupos mostró una rama de neutrófilos similar a CCR2+ o una mayor expresión de Ccr2, y las proporciones de neutrófilos no difirieron entre los grupos (Figura S1E). Por lo tanto, el estado de neutrófilos similar a CCR2+ no se recuperó en este entorno de infección, lo que sugiere que su aparición no es una característica genérica de la granulopoyesis inflamatoria.

3.6. La transcriptómica a granel vincula el compartimento circulatorio con JAK-STAT y TGF-β

Realizamos una secuenciación de ARN a granel y WGCNA en 15 muestras (CRLM: 4 médula ósea, 4 sangre; control: 3 médula ósea, 4 sangre; Figura 4A y Figura S3). Una potencia de umbral suave de 8 logró una topología sin escala (R2 = 0,85—Figura S2A, B), y la agrupación jerárquica dissTOM con corte de árbol dinámico particionó los genes en 15 módulos de coexpresión (Figura 4B, Figura S2C, D). La correlación módulo-fenotipo (Figura 4C) identificó MEcyan, MEturquoise y MEgreen como significativamente asociados con CRLM. Los genes de MEcyan se enriquecieron en la diferenciación de células mieloides (GO proceso inmunitario (Figura 4D, E)) e incluyeron factores de transcripción de diferenciación de neutrófilos Gata1, Jun y Klf2. La expresión del eigengene de los cuatro módulos más relevantes (MEturquoise p < 0,1; MEcyan, MEbrown, MEgreen p < 0,01) se muestra en la Figura 4F, con las relaciones módulo-muestra que se muestran en la Figura S2E.

El análisis de genes de centro ( |MM| > 0,75, |GS| > 0,2) mostró que MEturquoise comprendía miembros de quimiocinas (Ccr1, Ccr2, Ccl5, Ccl6, Ccl7 y Ccl9) e integrinas (Itga2, Itga2b, Itga5 y Itga6, y Itgb1, Itgb3 y Itgb5) (Figura 5B, D), enriquecidas en la interacción citocina-receptor citocina (mmu04060), JAK-STAT (mmu04630), la interacción ECM-receptor (mmu04512) y la señalización de TGF-β (mmu04350) (Figura 5A, D). El módulo MEgreen de la sangre CRLM incluyó Igf1r, Pik3ca, Sos2, Bbc3, Nfkb1 y Smad3 (Figura 5C, E), enriquecido en vías asociadas al cáncer (Vías en el cáncer colorrectal mmu05210, Carcinoma hepatocelular mmu05225). Coherente con los hallazgos de célula única, los genes de centro de la sangre CRLM convergieron en la señalización de JAK-STAT (mmu04630) y TGF-β (mmu04350), ambas implicadas en la metástasis tumoral (Figura 5F) [^[38], ^[39]].

3.7. Validación por citometría de flujo del enriquecimiento de la población de neutrófilos similar a CCR2+ en la médula ósea de ratones con CRLM

Para establecer el modelo de metástasis hepática de cáncer colorrectal MC38 (CRLM), los ratones se sometieron a una inyección intrasplénica de células MC38 seguida de esplenectomía, mientras que los ratones de control recibieron PBS. El día 14 después de la inyección, las imágenes macroscópicas del hígado mostraron lesiones tumorales visibles en los ratones inoculados con MC38, mientras que no se observaron lesiones tumorales en los controles de esplenectomía tratados con PBS (Figura 6A). De manera consistente, la relación hígado/peso corporal, utilizada como indicador de la carga tumoral hepática, aumentó significativamente en el grupo CRLM en comparación con el grupo de control (p < 0,0001), lo que confirmó aún más el establecimiento exitoso del modelo y el aumento del tamaño del hígado asociado al tumor (Figura 6B). Para validar la población de neutrófilos CCR2+ identificada mediante scRNA-seq, se realizó citometría de flujo utilizando el compartimento mieloide CD45+CD11b+Gr1+ como puerta principal, lo que es consistente con la estrategia de clasificación utilizada para scRNA-seq. La estrategia de clasificación se puede encontrar en la Figura S4. Aunque se detectaron poblaciones de neutrófilos CCR2+ tanto en los ratones de control como en los ratones CRLM, la proporción fue significativamente mayor en los ratones CRLM que en los controles (p = 0,0031), lo que apoya el enriquecimiento de la población de neutrófilos que expresan CCR2 durante la progresión de CRLM (Figura 6C, D).

3.1. Atlas de una sola célula de las líneas CD11b+Gr1+ de la médula ósea en CRLM

Las células CD11b+Gr1+ de la médula ósea de ratones sometidos a una inyección intrasplénica de células MC38 se clasificaron mediante FACS y se analizaron mediante scRNA-seq. Después del control de calidad, se retuvieron 15.288 y 12.688 células de alta calidad de los grupos modelo y control, respectivamente, con 17.330 genes detectados en total. La agrupación basada en gráficos UMAP resolvió ocho grupos, que se anotaron utilizando SingleR y marcadores canónicos y se asignaron a cinco poblaciones, es decir, neutrófilos (Neu—Camp y Lcn2), progenitores mieloides (MPs—Elane y Mpo), monocitos (Mono—Csf1r y Ccr2), células B (Fcrla y Cd79b) y células T (Cd3d y Ccl5) (Figura 1A, C, E), con las proporciones de los grupos que se muestran en la Figura 1B y la agrupación integrada de los 10 genes variables principales que se muestran en la Figura 1D. La movilización de las células CD11b+Gr1+ en CRLM se reflejó en una mayor abundancia de neutrófilos que de monocitos. Surgió un grupo de neutrófilos distinto en el grupo modelo, pero estuvo casi ausente en el grupo de control. Mostró una mayor expresión de Ccr2 al tiempo que conservaba los marcadores de progenitores mieloides y se designó como una población de neutrófilos similar a CCR2+.

3.2. Una población de neutrófilos similar a CCR2+ emerge a lo largo de la trayectoria de diferenciación de neutrófilos

El análisis de pseudotiempo de Monocle de los MPs y neutrófilos colocó la población de neutrófilos similar a CCR2+ en una etapa de diferenciación avanzada, estrechamente alineada con los neutrófilos maduros y surgiendo en un punto de ramificación distinto a medida que los MPs progresaban a través de estados intermedios (Figura 1F). Los genes ordenados por pseudotiempo se resolvieron en cuatro categorías (Figura 1G): los marcadores de MP (Mpo, Ctsg y Elane) alcanzaron su punto máximo al principio, seguidos de los genes de proliferación (Stmn1 y Mki67); luego, los neutrófilos hicieron la transición de Ly6G− a Ly6G+ con la regulación al alza de Lcn2 y Camp, y los neutrófilos maduros expresaron Ccl6, Il1b y Retnlg (Figura 1I). Los marcadores de neutrófilos maduros (Lcn2, Camp y S100a8/9) aumentaron y se estabilizaron, mientras que Elane y Mpo disminuyeron a niveles casi indetectables, pero aumentaron bruscamente en el punto de ramificación, lo que indica que este grupo era la población de neutrófilos similar a CCR2+. La velocidad del ARN (Figura 1H) fue consistente con la diferenciación bidireccional de los MPs en neutrófilos y monocitos; los vectores de velocidad cerca de la población de neutrófilos similar a CCR2+ fueron más cortos en el grupo CRLM que en los controles, lo que sugiere una dinámica alterada del estado celular en el contexto tumoral.

3.3. La población de neutrófilos similar a CCR2+ forma un estado terminal distinto con características proliferativas y biosintéticas

La sub-agrupación del compartimento de neutrófilos, siguiendo el continuo precursor-inmaduro-maduro establecido [^[12], ^[13], ^[27]], agrupó los 11 grupos en seis estados: proNeu1, proNeu2, preNeu, ImmatureNeu, MatureNeu y poblaciones de neutrófilos similares a CCR2+ (Figura 2A). El grupo CRLM mostró una mayor proporción de MatureNeu y menores proporciones de proNeu1/proNeu2, lo que indica un cambio hacia una diferenciación más avanzada (Figura 2B). Entre los 10 genes variables principales (Figura 2C, D), proNeu1/proNeu2 expresó Cebpe y Stmn1; ImmatureNeu/MatureNeu expresó Mmp8, Mmp9 y Retnlg; MatureNeu expresó preferentemente Ccl6 y Il1b; y la población de neutrófilos similar a CCR2+ expresó de forma única Mpo, Ccr2, Ctsg y Fn1. El enriquecimiento de GO de los genes de neutrófilos CCR2+ destacó el ensamblaje de ribosomas (GO 0005840), la traducción citoplasmática (GO 0002181), la unión al ARNr (GO 0019843), la unión al ARNm (GO 0003729) y la regulación positiva del ciclo celular (GO 1901989) (Figura 2E), lo que indica un estado transcripcional y biosintéticamente activo. El ordenamiento de pseudotiempo colocó la rama de neutrófilos CCR2+ predominantemente en el grupo CRLM (Figura 2F): los neutrófilos progresaron desde proNeu1/proNeu2 a través de preNeu, ImmatureNeu y poblaciones de neutrófilos similares a CCR2+ hasta MatureNeu. El mapa de calor BEAM mostró genes pre-rama compartidos para esta población y MatureNeu que divergieron posteriormente (Figura 2G), con la población de neutrófilos similar a CCR2+ que reguló específicamente al alza Fn1, Ccr2, Ctsg y Mpo junto con los marcadores de proliferación Mki67 y Stmn1. La velocidad del ARN (Figura 2H) indicó que, a diferencia de los controles, esta población no se alineó con un solo subgrupo, sino que representó un estado terminal alternativo que, según se predijo, interactuará con MatureNeu (Figura 2I).

3.4. Inferencia de la comunicación FN1-CD44 y CCL6 entre la población de neutrófilos similar a CCR2+ y los neutrófilos maduros

La inferencia de CellChat de la comunicación ligando-receptor (Figura 3D) vinculó la población de neutrófilos similar a CCR2+ con los neutrófilos maduros a través de dos interacciones. Ccl6, expresado en gran medida por ImmatureNeu y MatureNeu, se infirió, según las anotaciones de CellChatDB, que señalaba a la población de neutrófilos similar a CCR2+ a través de Ccr1 y Ccr2; dado que CCR2 es canónicamente un receptor de CCL2 para monocitos y macrófagos, una respuesta de neutrófilos inferida a CCL6 dentro del compartimento CD11b+Gr1+ es notable. Recíprocamente, se infirió que FN1 de la población de neutrófilos similar a CCR2+ se unía a CD44 en MatureNeu. Ambas vías fueron más activas en el grupo tumoral (Figura 3A-C), con la señalización de CCL mediada por CCL6-CCR1 y CCL6-CCR2 y la señalización de FN1 mediada predominantemente por FN1-CD44. Por lo tanto, la inferencia posicionó esta población como señalizadora a MatureNeu principalmente a través de FN1-CD44 al tiempo que recibía señales de CCL6 a cambio (Figura 3F-H). La comparación de HALLMARK entre los tres estados (Figura 3E) mostró que esta población reguló al alza G2MCHECKPOINT, REACTIVEOXYGENSPECIESPATHWAY, ANGIOGENESIS y PI3KAKTMTORSIGNALING, mientras que MatureNeu reguló al alza programas inflamatorios (INFLAMMATORYRESPONSE y vías relacionadas con el factor de crecimiento transformante-β, la interleucina y el interferón) y programas relacionados con la tumorigénesis (EPITHELIALMESENCHYMALTRANSITION, P53PATHWAY y NOTCHSIGNALING). Dado que Fn1 y Cd44 son genes clave asociados a EMT, estos patrones son consistentes con la inferencia de que la población de neutrófilos similar a CCR2+ puede estar vinculada transcripcionalmente a MatureNeu.

3.5. La población de neutrófilos similar a CCR2+ no se recupera en la infección microbiana

Para probar si una población de neutrófilos similar a CCR2+ también surgiría en una inflamación no relacionada con el cáncer, analizamos GSE137539 (células Gr1+ de la médula ósea de ratones infectados con E. coli), con GSM4081549/GSM4081550 que sirvió como grupo de infección y GSM4081545/GSM4081546 que sirvió como control, y para la visualización, utilizamos las anotaciones de Xie et al. (Figura S1A, B). Después de aislar los MPs y los neutrófilos para el análisis de Monocle con los mismos marcadores (Figura S1C, D), observamos que ninguno de los cuatro grupos mostró una rama de neutrófilos CCR2+ o una mayor expresión de Ccr2, y las proporciones de neutrófilos no difirieron entre los grupos (Figura S1E). Por lo tanto, el estado de neutrófilos CCR2+ no se recuperó en este entorno de infección, lo que sugiere que su aparición no es una característica genérica de la granulopoyesis inflamatoria.

3.6. La transcriptómica a granel vincula el compartimento circulatorio con JAK-STAT y TGF-β

Realizamos secuenciación de ARN a granel y WGCNA en 15 muestras (CRLM: 4 médula ósea, 4 sangre; placebo: 3 médula ósea, 4 sangre; Figura 4A y Figura S3). Una potencia de umbral suave de 8 logró una topología sin escala (R2 = 0,85—Figura S2A, B), y la agrupación jerárquica dissTOM con corte de árbol dinámico particionó los genes en 15 módulos de coexpresión (Figura 4B, Figura S2C, D). La correlación módulo-fenotipo (Figura 4C) identificó MEcyan, MEturquoise y MEgreen como significativamente asociados con CRLM. Los genes de MEcyan se enriquecieron en la diferenciación de células mieloides (GO proceso inmunitario (Figura 4D, E)) e incluyeron factores de transcripción de diferenciación de neutrófilos Gata1, Jun y Klf2. La expresión del eigengene de los cuatro módulos más relevantes (MEturquoise p < 0,1; MEcyan, MEbrown, MEgreen p < 0,01) se muestra en la Figura 4F, con las relaciones módulo-muestra que se muestran en la Figura S2E.

El análisis de genes de centro ( |MM| > 0,75, |GS| > 0,2) mostró que MEturquoise comprendía miembros de quimiocinas (Ccr1, Ccr2, Ccl5, Ccl6, Ccl7 y Ccl9) e integrinas (Itga2, Itga2b, Itga5 y Itga6, y Itgb1, Itgb3 y Itgb5) (Figura 5B, D), enriquecidas en interacción citocina-receptor citocina (mmu04060), JAK-STAT (mmu04630), interacción ECM-receptor (mmu04512) y señalización de TGF-β (mmu04350) (Figura 5A, D). El módulo MEgreen de la sangre CRLM incluyó Igf1r, Pik3ca, Sos2, Bbc3, Nfkb1 y Smad3 (Figura 5C, E), enriquecido en vías asociadas al cáncer (Vías en el cáncer colorrectal mmu05210, Carcinoma hepatocelular mmu05225). Coherente con los hallazgos de una sola célula, los genes de centro de la sangre CRLM convergieron en la señalización de JAK-STAT (mmu04630) y TGF-β (mmu04350), ambas implicadas en la metástasis tumoral (Figura 5F) [^[38], ^[39]].

3.7. Validación citométrica de flujo del enriquecimiento de la población de neutrófilos similar a CCR2+ en la médula ósea de ratones CRLM

Para establecer el modelo de metástasis hepática de cáncer colorrectal MC38 (CRLM), los ratones se sometieron a una inyección intrasplénica de células MC38 seguida de esplenectomía, mientras que los ratones de control recibieron PBS. El día 14 después de la inyección, las imágenes macroscópicas del hígado mostraron lesiones tumorales visibles en los ratones inoculados con MC38, mientras que no se observaron lesiones tumorales en los controles de esplenectomía tratados con PBS (Figura 6A). De manera consistente, la relación hígado/peso corporal, utilizada como indicador de la carga tumoral hepática, aumentó significativamente en el grupo CRLM en comparación con el grupo de control (p < 0,0001), lo que confirmó aún más el establecimiento exitoso del modelo y el aumento del tamaño del hígado asociado al tumor (Figura 6B). Para validar la población de neutrófilos CCR2+ identificada mediante scRNA-seq, se realizó citometría de flujo utilizando el compartimento mieloide CD45+CD11b+Gr1+ como puerta principal, lo que es consistente con la estrategia de clasificación utilizada para scRNA-seq. La estrategia de clasificación se puede encontrar en la Figura S4. Aunque se detectaron poblaciones de neutrófilos CCR2+ tanto en los ratones de control como en los ratones CRLM, la proporción fue significativamente mayor en los ratones CRLM que en los controles (p = 0,0031), lo que apoya el enriquecimiento de la población de neutrófilos que expresan CCR2 durante la progresión de CRLM (Figura 6C, D).

4. Discusión

En este estudio, utilizamos la secuenciación de ARN de una sola célula para caracterizar la heterogeneidad de las células mieloides CD11b+Gr1+ de la médula ósea en un modelo murino de metástasis hepática de cáncer colorrectal. Identificamos un subconjunto CCR2+ similar a neutrófilos, enriquecido en ratones con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (CRLM), caracterizado por un fenotipo CD11b+Gr1+Ly6Ghi y la expresión de Ccr2, Mpo, Ctsg y Fn1. Los análisis de trayectoria y velocidad del ARN ubicaron esta población a lo largo del continuo de diferenciación de neutrófilos y sugirieron que representa un estado terminal alternativo de neutrófilos en lugar de una población monocítica convencional. Funcionalmente, la población CCR2+ similar a neutrófilos mostró programas de transcripción relacionados con la actividad del ciclo celular, la biosíntesis de proteínas, las especies reactivas del oxígeno, la angiogénesis y la señalización PI3K-AKT-mTOR. El análisis de la comunicación célula-célula predijo además una interacción recíproca entre la población CCR2+ similar a neutrófilos y los neutrófilos maduros, que comprende la señalización entrante CCL6-CCR1/CCR2 y la señalización saliente FN1-CD44 hacia MatureNeu. En paralelo, el análisis transcriptómico global del compartimento circulatorio vinculó los módulos génicos asociados a CRLM con la señalización JAK-STAT, la interacción receptor-ECM y la señalización TGF-β. En conjunto, estos hallazgos identifican la población CCR2+ similar a neutrófilos como una población mieloide asociada a CRLM que se había subestimado y proporcionan un marco transcriptómico para futuros estudios funcionales.

Estas observaciones amplían la visión tradicional centrada en los monocitos de la biología de CCR2 en el cáncer. Anteriormente se pensaba que estaba restringido en gran medida a los monocitos, pero cada vez se reconoce más que CCR2 es funcionalmente relevante también para los neutrófilos [^[40]]. Puede mediar la movilización tanto de monocitos como de neutrófilos desde la médula ósea hacia la sangre periférica [^[41],^[42]], contribuye a la acumulación de neutrófilos en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide [^[25]] y se ha relacionado con el reclutamiento de neutrófilos a tejidos inflamados y metastásicos [^[43],^[44]]. Aquí, presentamos un informe computacional basado en una sola célula de un subconjunto CCR2+ similar a neutrófilos en la médula ósea de ratones con CRLM, asociado con la progresión metastásica y la colonización hepática. Si bien trabajos anteriores han establecido que los monocitos CCR2+ se reclutan en los sitios primarios y metastásicos, donde se diferencian en TAMs inmunosupresores asociados con un mal pronóstico en el cáncer colorrectal [^[21],^[22],^[23]], el posible papel de la población CCR2+ similar a neutrófilos en la metástasis hepática del cáncer colorrectal ha permanecido en gran medida inexplorado. Nuestros datos sugieren que, en CRLM, la expresión de CCR2 no se limita al compartimento monocítico; también marca un estado distinto similar a neutrófilos, que podría estar asociado con la remodelación del nicho metastásico y la colonización hepática. En particular, la secuenciación de ARN global mostró una disminución de Ccr2 en la médula ósea, pero un aumento de Ccr2 en la sangre periférica de ratones con CRLM en relación con los controles. Dado que Ccr2 se interpreta comúnmente como un transcrito asociado a monocitos en los análisis de células mieloides, esta divergencia nos llevó a examinar si una población que no es monocítica que expresa CCR2 podría contribuir a la señal CCR2 circulante en CRLM.

La identidad de esta población está respaldada tanto por la expresión de marcadores como por los análisis de trayectoria. Aunque la expresión de Ccr2 en este subconjunto fue modesta en relación con los monocitos, lo que es consistente con la baja expresión inducible que se informa en entornos no tumorales [^[26]], el grupo se definió transcripcionalmente por genes asociados a neutrófilos, incluidos Ly6g, S100a8/9 y Retnlg, en lugar de genes de la línea monocítica, como Ly6c2 y Csf1r, un hallazgo que argumenta en contra de un simple artefacto de contaminación por monocitos. Además, los análisis de pseudotiempo y velocidad del ARN ubicaron la población CCR2+ similar a neutrófilos dentro del continuo de diferenciación de neutrófilos, donde se infirió que emerge cerca de la diferenciación terminal y representa un estado terminal alternativo en ratones con CRLM. Estos hallazgos sugieren que la granulopoyesis asociada al tumor puede generar un estado de neutrófilos que expresa CCR2, distinto de los neutrófilos maduros convencionales.

La inferencia de la comunicación célula-célula sugirió además que las poblaciones CCR2+ similares a neutrófilos pueden participar en una señalización bidireccional con los neutrófilos maduros. Se predijo que CCL6 de ImmatureNeu y MatureNeu señalizaría a la población CCR2+ similar a neutrófilos a través de CCR1 y CCR2, mientras que FN1 de esta población se infirió que interactuaría con CD44 en MatureNeu. Dado que esta inferencia se basa en la expresión de ligandos y receptores en lugar de en una alteración funcional, el par FN1-CD44 debe interpretarse como un eje de comunicación previsto. No obstante, su asociación con los programas de transcripción relacionados con EMT plantea la posibilidad de que la interacción entre los subconjuntos de neutrófilos pueda contribuir a la remodelación de la matriz extracelular en el nicho metastásico. En la secuenciación de ARN global de la sangre periférica, la disparidad en Il1b y Tgfb1 entre la sangre y la médula ósea se hizo más pronunciada, lo que es consistente con un programa circulatorio proinflamatorio y pro-metastásico. En los 15 grupos de muestras, el enriquecimiento HALLMARK indicó que los programas asociados al tumor estaban más fuertemente enriquecidos en la sangre periférica que en la médula ósea, incluidos la señalización EMT y TGF-β, un patrón corroborado en el análisis KEGG. En relación con la sangre del grupo de control, la sangre de CRLM mostró una regulación al alza de los programas asociados a EMT, que abarcan las vías de señalización JAK-STAT (mmu04630) y TGF-β (mmu04350), junto con las vías del cáncer colorrectal (mmu05210) y la interacción citocina-receptor de citocinas (mmu04060). En conjunto, los datos de una sola célula y los datos globales mostraron que los programas inflamatorios y de remodelación de la matriz circulatorios están asociados con la progresión de CRLM.

Los neutrófilos son un componente central de la inmunidad innata, y la alteración de la homeostasis por el daño tisular o el desarrollo tumoral desencadena su movilización desde la médula ósea [^[27]]. Después de una fase circulatoria transitoria, los neutrófilos se reclutan en los tejidos afectados en respuesta a las quimiocinas liberadas por las células neoplásicas, los macrófagos y los fibroblastos [^[45]], y en los sitios metastásicos, muestran plasticidad funcional y adoptan fenotipos dependientes del contexto, moldeados por sus estados de polarización y el TIME [^[46]]. En este estudio, el programa circulatorio asociado a CRLM se enriqueció con genes relacionados con la metástasis y la progresión, incluidos Smad3, Pik3ca y Nfkb1, y los genes centrales del módulo convergieron en vías relacionadas con la metástasis, la tumorigénesis, la inflamación y la señalización de quimiocinas. En particular, la población CCR2+ similar a neutrófilos solo se detectó en el modelo MC38 de CRLM. Para evaluar si este subconjunto era una característica genérica del estrés granulopoyético, examinamos un conjunto de datos disponible públicamente de células Gr1+ de la médula ósea de ratones infectados con E. coli (GSE137539) [^[13]], y no se recuperó una población equivalente de neutrófilos CCR2+, lo que sugiere que este subconjunto no es simplemente un producto de la infección microbiana o la inflamación general. En consonancia con la especificidad del contexto de la enfermedad, la metástasis hepática de melanoma B16F10 no recluta subconjuntos CD11b+Gr1+ [^[14]]. Estos hallazgos respaldan la posibilidad de que una población CCR2+ similar a neutrófilos emerja preferentemente en el contexto de CRLM. En términos más generales, son consistentes con la noción de que las respuestas de las células mieloides CD11b+Gr1+ varían sustancialmente entre los tipos de tumores, los contextos inflamatorios y los modelos metastásicos. En conjunto, estas observaciones sugieren que la aparición de la población CCR2+ es preferentemente asociada con el contexto de CRLM, y se suman a la evidencia de que los correceptores de quimiocinas pueden expresarse en los neutrófilos en lugar de exclusivamente en los monocitos y los macrófagos, lo que añade una capa de complejidad a la regulación mediada por quimiocinas de la metástasis.

Interpretamos la población CCR2+ similar a neutrófilos como un estado de neutrófilos transitorio o alternativo, distinto tanto de los neutrófilos maduros convencionales como de los progenitores granulocíticos clásicos, con características de transcripción que se superponen a las de los PMN-MDSC. También observamos una mayor transcripción de Tgfb1 en el grupo CRLM. Se ha informado que los PMN-MDSC reclutados en los sitios primarios de melanoma promueven EMT a través de HGF y TGF-β [^[47],^[48]], y nuestro programa de EMT asociado a FN1-CD44 inferido, acompañado de la regulación al alza de Tgfb1, es consistente con este paradigma, lo que sugiere que la población CCR2+ similar a neutrófilos identificada aquí puede representar un estado granulocítico relacionado con los PMN-MDSC. TGF-β polariza tanto los neutrófilos asociados al tumor hacia el fenotipo pro-tumoral N2 [^[46],^[49]] como media EMT con deposición de fibronectina, mientras que el bloqueo de TGF-β abole la polarización N2, pero puede mejorar el reclutamiento de CD11b+Gr1+ en el cáncer de mama [^[15]], lo que subraya que la relación TGF-β-CD11b+Gr1+ es recíproca y dependiente del contexto. Si los neutrófilos asociados al tumor circulatorios se derivan genuinamente de los PMN-MDSC sigue siendo una cuestión sin resolver [^[50]]. En general, nuestros hallazgos basados en el transcriptoma son consistentes con un modelo en el que los neutrófilos pueden adoptar un fenotipo inmunosupresor y pro-tumoral asociado con la señalización de TGF-β y están transcripcionalmente vinculados a los programas inflamatorios y de remodelación de la matriz relacionados con Tgfb1 y Fn1, que potencialmente involucran a los neutrófilos maduros que expresan Cd44 en los procesos relacionados con EMT. Sin embargo, este modelo requiere pruebas funcionales directas.

Estos hallazgos tienen posibles implicaciones clínicas y de investigación. La identificación de una población CCR2+ similar a neutrófilos asociada a CRLM sugiere que las estrategias dirigidas a CCR2 que se están evaluando actualmente en ensayos clínicos para la inmunoterapia dirigida a monocitos pueden merecer una reevaluación en el contexto de la biología de los neutrófilos. Desde una perspectiva de investigación, los programas de transcripción identificados aquí, en particular el eje FN1-CD44 y las firmas asociadas a TGF-β, proporcionan objetivos candidatos e hipótesis mecanísticas para futuros estudios funcionales, que incluyen el rastreo de linaje, la transferencia adoptiva y los experimentos de alteración in vivo en modelos de CRLM.

Este estudio tiene varias limitaciones. Nuestros hallazgos se derivan principalmente de la inferencia transcriptómica de una sola célula y global, por lo tanto, la identidad propuesta de la población CCR2+ similar a neutrófilos, la interacción FN1-CD44/EMT y los programas asociados a JAK-STAT/TGF-β requieren validación a nivel de proteína, funcional y in vivo. La identidad de esta población se interpreta provisionalmente como un estado de neutrófilos transitorio con características de transcripción similares a las de los PMN-MDSC, en espera de la validación funcional y a nivel de proteína. Además, los niveles modestos de expresión de Ccr2 y el abandono inherente de la secuenciación de ARN de una sola célula justifican aún más la confirmación de la expresión de CCR2 en la superficie de las células Ly6G+. Además, el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula se basó en un solo animal por grupo, lo que limita la evaluación de la variabilidad interindividual; la red WGCNA se construyó a partir de 15 muestras en el umbral mínimo recomendado; y no había conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de la médula ósea de CRLM disponibles externamente para una validación independiente. A pesar de estas limitaciones, nuestro estudio proporciona evidencia transcriptómica de una población CCR2+ similar a neutrófilos asociada a CRLM que se había subestimado y vincula este subconjunto con la diferenciación de neutrófilos, la comunicación intercelular y los programas de señalización pro-metastásica circulatorios. Estos hallazgos amplían la visión actual centrada en los monocitos de la biología de CCR2 y proporcionan una base para futuros estudios mecanísticos dirigidos a la progresión metastásica mediada por neutrófilos.

5. Conclusiones

En resumen, el análisis integrado de la transcriptómica a nivel de célula única y de muestras masivas identificó un subconjunto de neutrófilos similares a CCR2+, poco estudiado hasta ahora, que se encuentra enriquecido en la médula ósea de ratones CRLM (metástasis hepáticas colorrectales) a los que se les inyectó MC38 en el bazo. Este subconjunto se ubicó a lo largo de la trayectoria de diferenciación de los neutrófilos y se asoció con la señalización FN1-CD44 en neutrófilos maduros, junto con la sobreexpresión de genes relacionados con la EMT (transición epitelio-mesenquimal), como Il1b, Tgfb1 y Cd44, así como con los programas JAK-STAT y TGF-β. Dada la función establecida de las PMN-MDSC (células supresoras derivadas de mieloides) en la inducción de la EMT y la metástasis, esta población de neutrófilos similares a CCR2+ puede representar un estado granulocítico asociado a CRLM con una posible relevancia pro-metastásica. Nuestros hallazgos sugieren que las células que expresan CCR2 asociadas a CRLM pueden incluir neutrófilos, y no solo monocitos, y que este subconjunto parece estar preferentemente asociado al contexto de CRLM. Aunque estas asociaciones derivadas de la transcriptómica siguen siendo hipótesis que deben ser investigadas y requieren una validación funcional e in vivo en el futuro, nuestro estudio proporciona un marco para la futura investigación de la formación del nicho metastásico mediado por neutrófilos en CRLM.