Las alteraciones en el microbioma intestinal humano durante la quimioterapia contra el cáncer dependen de la dieta.

El microbioma intestinal humano está determinado principalmente por factores ambientales como la alimentación y los fármacos^[1],^[2]. La ingesta dietética del huésped modifica el entorno de aptitud bacteriana dentro del tracto gastrointestinal, alterando rápidamente la abundancia de taxones y genes microbianos intestinales en cuestión de días^[3],^[4]. De manera similar, los productos farmacéuticos, incluso aquellos que tradicionalmente no se consideran antibióticos, pueden alterar rápidamente el microbioma intestinal^[5]–^[9]. En algunos casos, estas alteraciones inducidas por los fármacos pueden persistir durante meses o años después de la interrupción del tratamiento^[10]–^[12]. Sin embargo, aún no está claro si y cómo la dieta y la ingesta de fármacos interactúan para modificar el microbioma intestinal humano, y si estas interacciones podrían tener consecuencias posteriores en la eficacia del tratamiento o en los perfiles de efectos secundarios.

El tratamiento del cáncer colorrectal (CCR) proporciona un contexto factible y clínicamente relevante para abordar estas preguntas. La quimioterapia contra el cáncer a menudo provoca efectos secundarios gastrointestinales que pueden llevar a los pacientes a modificar drásticamente su ingesta dietética^[13]. Sin embargo, pocos estudios han cuantificado de manera exhaustiva y longitudinal la ingesta dietética durante el tratamiento del CCR^[14], y los estudios existentes se han centrado en la desnutrición y los macronutrientes^[15]. Estas lagunas en el conocimiento han limitado la capacidad de realizar recomendaciones dietéticas informadas o de proponer intervenciones dietéticas específicas para los pacientes durante el tratamiento con el objetivo de mejorar los resultados del tratamiento^[16].

También existe una amplia y creciente literatura sobre el impacto de la quimioterapia contra el cáncer en el microbioma intestinal y, a su vez, la capacidad del microbioma para influir en los resultados del tratamiento^[7],^[17]. Por ejemplo, recientemente identificamos múltiples genes bacterianos intestinales quimioprotectores que aumentan en abundancia durante el tratamiento oral con fluoropirimidinas, contrarrestando la toxicidad del fármaco al contribuir a la eliminación del fármaco^[18] y produciendo vitamina K2^[11]. Los estudios en cultivos celulares sugirieron que las fluoropirimidinas impactan directamente en la estructura de la comunidad microbiana intestinal debido a su capacidad para inhibir el crecimiento de taxones específicos^[18],^[19]; sin embargo, el potencial de cambios concomitantes en la ingesta dietética del huésped para contribuir a los cambios observados en el microbioma intestinal sigue siendo una pregunta abierta.

Aquí, describimos un análisis integrado basado en nuestros datos de secuenciación metagenómica publicados de 40 pacientes con CCR durante el curso de la quimioterapia oral con fluoropirimidinas (NCT04054908)^[18] junto con datos longitudinales sobre la ingesta dietética del huésped. Mostramos que la ingesta dietética del huésped se modificó durante el tratamiento contra el cáncer y explicó los cambios en la diversidad, la composición y el potencial funcional del microbioma intestinal. Estos datos observacionales se utilizaron luego para diseñar experimentos controlados en cultivos celulares que respaldan un papel causal de los nutrientes individuales en la alteración de la abundancia de especies y genes bacterianos intestinales relevantes para los resultados del tratamiento. En conjunto, nuestros resultados (i) refuerzan la importancia de la dieta del huésped en la configuración de las interacciones fármaco-microbioma; (ii) enfatizan la necesidad de tener en cuenta la dieta en los estudios clínicos del microbioma; y (iii) proporcionan una base para diseñar intervenciones dietéticas para optimizar los resultados del tratamiento contra el cáncer.

RESULTADOS

Llevamos a cabo el estudio clínico del microbioma intestinal y la fluoropirimidina oral (GO) (ClinicalTrials.gov NCT04054908), un estudio longitudinal prospectivo que investiga el impacto de las fluoropirimidinas orales en la dieta y el microbioma intestinal^[18]. Se recolectaron muestras de heces en siete puntos temporales que abarcaron desde el pretratamiento hasta después del ciclo 3 de la quimioterapia (Fig. 1a). Se recolectaron datos de recuerdo dietético de 24 horas durante los tres días previos al ciclo 1 (C1), el ciclo 2 (C2) y el ciclo 3 (C3). De los 52 pacientes incluidos, 40 enviaron al menos una muestra de heces, de los cuales 35 enviaron al menos un punto temporal válido de los datos del estudio dietético (Fig. S1). Los pacientes con información dietética se distribuyeron en tres subcohortes (Fig. 1a, Tabla S1): (subcohorte A) CAP como monoterapia o como parte de un régimen estándar de atención (n = 20), (subcohorte B) TAS-102 (trifluridina/tipiracil, n = 6) y (subcohorte C) CAP con bevacizumab e inmunoterapia con pembrolizumab (pacientes que participan en el identificador ClinicalTrials.gov NCT03396926, n = 9). Estos 35 participantes tenían una edad media de 53,0 ± 11,1 años; el 51% eran hombres, el 80% se identificaban como blancos y el 6% se identificaban como hispanos o latinos (Tabla S1). El 86% de los pacientes presentaban tumores en estadios III y IV (TNM), y el 66% había sido sometido a cirugía previa (Tabla S1).

Evaluamos la calidad de la dieta durante el tratamiento utilizando el índice de alimentación saludable (HEI-2020)^[20]. El HEI disminuyó significativamente después de la quimioterapia (Fig. 1b). Investigamos cada uno de los 13 componentes del HEI, encontrando una disminución significativa en la puntuación de cereales refinados (Fig. 1c) y la puntuación de ácidos grasos (Fig. 1d). La disminución de las puntuaciones de cereales refinados y ácidos grasos fue suficiente para explicar la disminución del HEI después de la quimioterapia (Fig. S2a). Observamos disminuciones similares en el Índice de Alimentación Saludable Alternativo^[21] (Fig. S2b–d). La ingesta de macronutrientes también cambió significativamente en C2, con una disminución de las grasas (Fig. 1e) y un aumento de los carbohidratos (Fig. 1f). La ingesta de proteínas y energía total no cambió durante el tratamiento (Fig. S2e,f).

A continuación, buscamos identificar qué características dietéticas individuales variaron durante el tratamiento. Después de la desduplicación de variables dietéticas altamente correlacionadas (Fig. S3a, Tablas S2, S3) y la corrección de falsos descubrimientos de 79 características dietéticas probadas (Tabla S3), identificamos tres micronutrientes y dos grupos de alimentos que cambiaron después de la quimioterapia (Fig. 1g). Los pacientes consumieron menos micronutrientes solubles en grasa, con disminuciones significativas en la teobromina (Fig. 1h), la vitamina K1 (Fig. 1i) y la vitamina E (Fig. 1j). La ingesta de cereales refinados aumentó significativamente (Fig. 1k). La ingesta de frutos secos y semillas disminuyó significativamente (Fig. 1l), lo que fue suficiente para explicar la disminución de la ingesta de grasas y vitamina E en C2 (Fig. S2g–j). Estos cambios dietéticos fueron similares en las tres subcohortes (CAP, TAS102, CAP+IO; Fig. S2k) a pesar de la considerable variación de un paciente a otro (Fig. S3b,c).

La dieta basal se asoció con los resultados del tratamiento. La ingesta basal total de carne, aves y mariscos fue significativamente menor en los pacientes que experimentaron enfermedad progresiva (Fig. S4a,b). Además, encontramos una ingesta basal significativamente menor de carbohidratos, azúcar total, azúcar añadida y verduras ricas en almidón en los pacientes que requirieron retrasos o reducciones de la dosis (Fig. S4c–g). Finalmente, la ingesta basal de teobromina fue significativamente menor en los pacientes que experimentaron síndrome mano-pie (SM-P) en nuestra cohorte (Fig. S4h,i) y en una cohorte independiente de pacientes con CCR tratados con CAP^[11] (Fig. S4j). El índice de masa corporal, la edad, el sexo y el estadio del cáncer no se asociaron significativamente con ninguno de estos resultados del tratamiento (p > 0,05 para todos).

A continuación, evaluamos las interacciones dieta-taxon durante la quimioterapia con la secuenciación del gen del ARNr 16S. Combinamos nuestros estudios dietéticos con un subconjunto de nuestros datos de secuenciación metagenómica GO publicados^[18], lo que resultó en un conjunto de datos de dieta-16S integrado de 85 muestras de 35 pacientes con 71.502 ± 7.872 lecturas de alta calidad por muestra (Tabla S4). Para aprovechar la naturaleza longitudinal de este conjunto de datos combinado, correlacionamos el cambio en la ingesta dietética con el cambio en las métricas de diversidad microbiana, calculando solo los cambios entre los puntos temporales consecutivos dentro del paciente para controlar la variabilidad basal entre pacientes en la dieta y el microbioma inicial (Métodos). Realizamos este análisis para las 79 variables dietéticas desduplicadas (Tabla S3).

Si bien varias variables dietéticas mostraron tendencias interesantes, solo la teobromina fue significativa después de la corrección de múltiples hipótesis (Fig. 2a). Los aumentos en la ingesta de teobromina se correlacionaron positivamente con los aumentos en el número de géneros observados (Fig. 2b) y el índice de Shannon de diversidad (Fig. S5a,b). La teobromina y la calidad de la dieta fueron dos de las cinco variables dietéticas que se asociaron significativamente con los cambios en la composición del microbioma (Fig. 2c–h). Las toxicidades gastrointestinales también se asociaron con mayores disminuciones en la ingesta de teobromina (Fig. 2i).

Investigamos más a fondo la teobromina debido a sus asociaciones con múltiples aspectos del microbioma intestinal y los perfiles de efectos secundarios (Figs. 2, S4h–j). En nuestra cohorte, los postres de chocolate y el té fueron las fuentes más comunes de teobromina (Fig. S5c), y los postres de chocolate representaron la mayor parte del consumo de teobromina (Fig. S5d). La teobromina derivada de los postres de chocolate fue suficiente para explicar las relaciones teobromina-diversidad (Fig. S5e–j) y la relación teobromina-toxicidad gastrointestinal (Fig. S5k,l).

Los cambios en la dieta explicaron parcialmente la dinámica de las bacterias intestinales alteradas por la quimioterapia. Correlacionamos el cambio en la dieta con el cambio en la abundancia de 15 variantes de secuencia de amplicones (ASV) prevalentes que habíamos identificado previamente como alteradas durante la quimioterapia^[18] (Tabla S5). Este análisis identificó 8 interacciones dieta-ASV (Fig. 3a), que incluyen dos interacciones positivas y seis negativas que abarcan 5 ASV únicos (Figs. 3a, S6, Tabla S5).

Las disminuciones en la ingesta de vitamina K1 se relacionaron con las disminuciones en Faecalibacterium prausnitzii (Fig. 3b). F. prausnitzii se redujo durante el tratamiento, y se observaron disminuciones significativamente mayores en los pacientes que disminuyeron su ingesta de vitamina K1 (Fig. 3c). Además, los aumentos en la ingesta de vitamina B12 se relacionaron con el aumento de Lactobacillus fermentum (Fig. 3d). Entre el ciclo 1 y el ciclo 2, L. fermentum se enriqueció exclusivamente en los pacientes con aumento de la vitamina B12 (Fig. 3e).

Dado que L. fermentum se encuentra comúnmente en el yogur y los vegetales fermentados^[22], nos preguntamos si L. fermentum y otras bacterias podrían ser inoculadas directamente a partir de los alimentos. Si bien los alimentos fermentados representaron una minoría de la ingesta de B12 (Fig. 3f), la B12 derivada de los alimentos fermentados explicó la dinámica de L. fermentum (Fig. 3g,h). Luego, correlacionamos el cambio en la dieta con el cambio en la abundancia de ASV para cada una de las 258 ASV prevalentes (n=22.430 interacciones dieta-ASV). De las 258 ASV probadas, Streptococcus y Lactobacillus estuvieron sobrerrepresentados entre el 0,1% superior de las interacciones dieta-ASV positivas (Fig. 3i), incluida una relación significativa entre el yogur y Streptococcus thermophilus (Fig. S7). Streptococcus y Lactobacillus spp. no estuvieron notablemente presentes en el 0,1% superior de las interacciones dieta-ASV negativas (Fig. 3j).

A continuación, utilizamos la secuenciación metagenómica para evaluar las interacciones dieta-gen durante el tratamiento. Combinamos nuestros estudios dietéticos con un subconjunto de nuestros datos de secuenciación metagenómica GO publicados^[18], lo que resultó en un conjunto de datos de dieta-metagenómica integrado de 86 muestras de 35 pacientes con 26,1 ± 1,2 millones de pares de lecturas de alta calidad por muestra (7,71 ± 0,36 gigabasis; Tabla S6). Correlacionamos el cambio en la dieta con el cambio en la abundancia de la familia de genes. Las 4 características dietéticas con el mayor número de interacciones dieta-gen significativas fueron el cobre, los carbohidratos, las legumbres y la calidad de la dieta (Fig. 4a). La calidad de la dieta y los carbohidratos se modificaron constantemente durante el tratamiento (Figs. 1b,f), mientras que el cobre y las legumbres no (Fig. 1g).

Debido a la gran cantidad de interacciones cobre-gen, nos centramos en el cobre. Identificamos 998 interacciones cobre-gen significativas, que incluyen 721 interacciones positivas y 277 negativas (Fig. 4b, Tabla S7). El resultado principal fue una interacción entre el cobre y la piridoxina quinasa (K00868, pdxK), un gen que convierte la vitamina B6 inactiva en su forma activada de piridoxal 5'-fosfato (PLP)^[23] (Fig. 4b). Los aumentos en la ingesta dietética de cobre se asociaron con los aumentos en la pdxK bacteriana (Fig. 4c). Nos dirigimos a la genética bacteriana para investigar el papel causal de pdxK en la sensibilidad bacteriana a los fármacos y al cobre. Cultivamos E. coli BW25113 de tipo salvaje (wt) y ΔpdxK::KanR en M9-Glc ± 250 nM de 5-FU (un metabolito activo de CAP) ± 100 μM de CuSO4 (una fuente de Cu2+, que coincide con el estado de oxidación del cobre dietético^[24],^[25]). El crecimiento de las dos cepas fue comparable en presencia y ausencia de 5-FU (Fig. 4d). Sin embargo, el CuSO4 disminuyó significativamente el crecimiento de ΔpdxK::KanR en relación con wt independientemente del 5-FU (Fig. 4e).

Investigamos más a fondo las interacciones entre la calidad de la dieta y los genes, dado que existen variaciones temporales en el HEI y sus asociaciones con la diversidad bacteriana (Fig. 1b, 2c,e). Identificamos 499 interacciones significativas entre el HEI y los genes, incluyendo 303 interacciones positivas y 196 negativas (Fig. 4f, Tabla S8). El resultado más destacado fue una interacción entre el HEI y un gen de reparación de errores en el ADN (K03572, mutL), donde un mayor consumo de alimentos saludables según el HEI se asoció con un aumento de la bacteria mutL (Fig. 4g). Cultivamos E. coli BW25113 de tipo salvaje (wt) y ΔmutL::KanR en medio M9-Glc ± 500 nM de 5-FU. Si bien el crecimiento de ΔmutL::KanR fue menor que el de wt en ausencia de 5-FU, solo ΔmutL::KanR pudo crecer en presencia de 5-FU (Fig. 4h).

A continuación, realizamos una evolución experimental de la resistencia al 5-FU en las cepas wt y ΔmutL::KanR. Evolucionamos 8 líneas (2 cepas × 4 réplicas) en medio M9-Glc con una serie de diluciones de 5-FU de dos veces. Durante cuatro pases seriados, las células de la concentración más alta de 5-FU con OD600 ≥ 0,03 se transfirieron a un medio fresco a la misma OD inicial (Fig. S8). En este entorno, ΔmutL::KanR desarrolló resistencia al 5-FU significativamente más rápido que wt (Fig. 4i).

Finalmente, investigamos las interacciones entre la dieta y Fusobacterium, dado que Fusobacterium nucleatum está presente en mayor proporción en pacientes con CRC^[26] y se asocia con peores resultados del tratamiento^[27],^[28]. El género Fusobacterium se detectó en menos del 15% de las muestras mediante la secuenciación del gen del ARNr 16S y la metagenómica, lo que nos llevó a cuantificar F. nucleatum utilizando un ensayo de qPCR validado (Fig. 5a, Fig. S9a–c). F. nucleatum se detectó en el 93% de las muestras mediante qPCR (Fig. 5a), incluyendo al menos una muestra de cada paciente (100% de prevalencia). Las abundancias estimadas se correlacionaron significativamente entre los tres métodos (Fig. S9d–f).

F. nucleatum se redujo significativamente durante los primeros tres días de la quimioterapia mediante qPCR (Fig. 5b), sin diferencias consistentes más adelante en el tratamiento. Para determinar si alguna molécula derivada de la dieta podría sensibilizar F. nucleatum a la quimioterapia, correlacionamos los cambios en F. nucleatum con los cambios en cada uno de los 46 micronutrientes cuantificados por ASA24. Un mayor consumo de cobre se asoció con la disminución de F. nucleatum (Figs. 5c–d, S9g–i). Este cobre dietético provino de una variedad de fuentes (Fig. 5e) y no se alteró significativamente durante el tratamiento (Fig. 5f).

Los experimentos de crecimiento in vitro validaron el papel causal del cobre en la supresión de Fusobacterium nucleatum. Cultivamos F. nucleatum DSM15643 anaeróbicamente en un gradiente de CuSO4 y 5-FU (Fig. 5g). La capacidad de crecimiento de F. nucleatum disminuyó ligeramente con 10 μM de cobre y se redujo a la mitad con 750 nM de 5-FU (Fig. 5g,h). Una combinación de 10 μM de cobre y 750 nM inhibió por completo F. nucleatum (Fig. 5g,h), lo que indica un efecto antimicrobiano sinérgico del cobre y el 5-FU para esta especie patógena.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados demuestran claramente que la ingesta dietética cambia notablemente durante la quimioterapia oral con fluoropirimidinas. Observamos una disminución en la calidad de la dieta durante el tratamiento, marcada por un aumento de los cereales refinados y una reducción del consumo de frutos secos. También identificamos varios nutrientes individuales que disminuyeron durante la quimioterapia, incluyendo la vitamina K1, la vitamina E y la teobromina. Nuestros hallazgos amplían las observaciones previas de una disminución en la ingesta de vitamina D durante el tratamiento del CRC^[29],^[30] a una gama más amplia de micronutrientes liposolubles. En particular, la vitamina E previene la neuropatía y la mucositis inducidas por la quimioterapia^[31]–^[33], lo que la convierte en un objetivo interesante para la intervención o suplementación dietética.

El azúcar y la teobromina basales se correlacionaron con los resultados del tratamiento. Sorprendentemente, encontramos menos ajustes de dosis en los pacientes con una mayor ingesta basal de azúcar añadido, a pesar de las directrices actuales de la American Cancer Society que desaconsejan todas las bebidas azucaradas^[34]. Curiosamente, una alta ingesta basal de teobromina se asoció con protección contra el síndrome mano-pie en pacientes de dos cohortes independientes en los Estados Unidos y los Países Bajos. Si la teobromina dietética previene el síndrome mano-pie merece un estudio más profundo, dado que la teobromina inhibe la activación sensorial mediada por TRPV1 relevante para el síndrome mano-pie^[35],^[36].

Nuestros resultados también destacan el potencial de que la dieta y la quimioterapia actúen juntas para moldear la composición del microbioma. La dinámica del microbioma reflejó los cambios en la calidad general de la dieta y la teobromina derivada del chocolate. Sorprendentemente, los cambios en la dieta explicaron la variación en un tercio (5/15) de las bacterias asociadas con la quimioterapia. Esto incluye F. prausnitzii, que se eleva con dietas a base de plantas ricas en vitamina K1^[37] y se ha relacionado con mejores resultados de la inmunoterapia en ratones y pacientes^[38],^[39]. Aunque F. prausnitzii disminuyó constantemente durante la quimioterapia en nuestra cohorte, los sujetos que disminuyeron su ingesta de vitamina K1 experimentaron una disminución 20 veces mayor, lo que motiva un mayor estudio de las dietas a base de plantas durante la quimio- y la inmunoterapia combinadas.

Muchas de las interacciones dieta-microbio más fuertes involucraron bacterias derivadas de los alimentos, lo que ilustra una de las formas en que las heces pueden reflejar la ingesta dietética del huésped. En este estudio, más pacientes enviaron muestras de heces (n = 110) que completaron encuestas dietéticas (n = 86) en cada punto de tiempo emparejado, lo que destaca el valor de la estimación de la dieta a partir de las heces. El trabajo futuro debería integrar explícitamente la abundancia de bacterias derivadas de los alimentos con otros métodos para inferir la dieta a partir de las heces, como el meta-barcoding^[40], la metaproteómica^[41] y la estimación metagenómica de la ingesta dietética^[42].

Cabe destacar que, si bien las propiedades antimicrobianas de las superficies de cobre están bien caracterizadas^[43],^[44], se sabe mucho menos sobre el impacto del cobre dietético en la microbiota intestinal humana. Identificamos cientos de interacciones cobre-microbioma y validamos la relación más importante en ensayos celulares: una interacción positiva entre el cobre y la piridoxina quinasa activadora de la vitamina B6 (pdxK). Sorprendentemente, la deleción de pdxK exacerbó la toxicidad del cobre en E. coli. Un posible mecanismo es que la vitamina B6 actúa como cofactor para la síntesis de grupos hierro-azufre esenciales^[45],^[46], que son interrumpidos por el cobre^[47],^[48]. Curiosamente, el silenciamiento de pdxK aumenta la sensibilidad al cobre en las células de mamíferos^[49], lo que plantea la hipótesis de que esta relación vitamina B6-cobre se conserva en todo el árbol de la vida.

El cobre y el 5-FU inhibieron sinérgicamente la bacteria clínicamente relevante Fusobacterium nucleatum. F. nucleatum utiliza el factor de virulencia FadA para unirse e invadir las células epiteliales^[50]. FadA se combina con el cobre para generar una producción tóxica de especies reactivas de oxígeno^[51], lo que podría contribuir a la sensibilidad al cobre observada de F. nucleatum. Curiosamente, F. nucleatum carece de pdxK^[52], lo que podría aumentar aún más la toxicidad. En conjunto, nuestros hallazgos en E. coli y F. nucleatum sugieren que el cobre dietético afecta a múltiples miembros de la microbiota intestinal humana, lo que amplía el trabajo previo en comunidades microbianas asociadas con el medio ambiente y los cerdos^[53]–^[55].

Aunque nuestros hallazgos plantean varias hipótesis interesantes que se validaron experimentalmente, nuestro pequeño tamaño de muestra (n=35) requiere una mayor validación en cohortes más grandes y multisitio^[56]. Nos sorprendió que la ingesta calórica total no disminuyera significativamente durante la quimioterapia. Una explicación para esta observación es que nuestras encuestas dietéticas se administraron durante tres días de descanso entre tratamientos inmediatamente antes de la primera dosis de cada ciclo^[57], una decisión de diseño del estudio tomada para limitar la carga del paciente durante los días de tratamiento activo. Es posible que se produjeran mayores cambios en la dieta a mitad del ciclo, lo que es consistente con nuestras observaciones previas de cambios más drásticos en la abundancia de genes microbianos en el día 7 del ciclo 1^[18]. Los estudios futuros con encuestas dietéticas más frecuentes y/o puntos de tiempo adicionales son necesarios para evaluar los posibles cambios agudos en la dieta durante el tratamiento activo.

En general, nuestros hallazgos respaldan el papel de la dieta en la configuración del microbioma intestinal durante el tratamiento del cáncer. Nuestros resultados señalan numerosas interacciones dieta-microbioma-quimioterapia que se pueden explorar en modelos de ratón y estudios clínicos, incluido el uso de una dieta rica en vitamina K1 para enriquecer Faecalibacterium o una dieta rica en cobre para agotar Fusobacterium. Nuestro enfoque destaca la utilidad de combinar el análisis dietético longitudinal, el análisis longitudinal del microbioma y los ensayos celulares, elevando la dieta de un factor de confusión pasado por alto a una herramienta manipulable en futuros estudios clínicos del microbioma.

MÉTODOS

Participantes del estudio

Como se describió anteriormente^[18], el estudio del microbioma intestinal y las fluoropirimidinas orales (GO) fue un estudio clínico observacional registrado en ClinicalTrials.gov (NCT04054908; Fig. S1a). El estudio GO fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la UCSF, y todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado. Los participantes fueron reclutados y muestreados, sin ninguna compensación, en la UCSF desde la fecha de inicio del estudio (13/04/2018) hasta la fecha de finalización (30/06/2022). Criterios de inclusión: (i) ≥18 años; (ii) adenocarcinoma de colon-recto confirmado histológicamente; y (iii) se espera que reciba terapia oral con fluoropirimidinas. Criterios de exclusión: (i) VIH positivo; (ii) quimioterapia, biológico o inmunoterapia en las últimas 2 semanas; (iii) exposición a ≥2 semanas de antibióticos en los últimos 6 meses; o (iv) exposición a antibióticos en las últimas 4 semanas. Los pacientes fueron incluidos en una de las tres subcohortes en función de su plan de tratamiento: (A) capecitabina oral (CAP) como parte de la terapia estándar (incluida la radioterapia rectal concurrente); (B) TAS-102 (trifluridina/tipiracil) ± radioembolización con Y-90 (NCT02602327)^[58]; (C) CAP e inmunoterapia (pembrolizumab) (NCT03396926). CAP y TAS-102 se prescribieron de acuerdo con las etiquetas de la FDA y el criterio del investigador para la dosificación de las tabletas orales. Las tabletas de CAP se tomaron dos veces al día durante los días 1-14 de un ciclo de 21 días (sin RT) o durante los días de radiación (RT), mientras que las tabletas de TAS-102 se tomaron dos veces al día durante los días 1-5 y 8-12 de un ciclo de 28 días.

Evaluación dietética

Se pidió a los participantes que completaran 3 recordatorios dietéticos de 24 horas consecutivos utilizando el sistema en línea Automated Self-Administered 24 (ASA24) del National Cancer Institute antes del inicio de los ciclos 1-3 y al final del tratamiento (EOT)^[59]. Para evitar errores de medición en los datos de la dieta, excluimos las encuestas de 24 horas en los extremos de la ingesta calórica: > percentil 99 o < percentil 1 de la ingesta calórica de los datos de NHANES recopilados en 2017-2020^[60],^[61]. En total, esto resultó en la exclusión de 11 períodos de 24 horas (10 registros < 458 kcal, 1 registro > 5105 kcal; Fig. S1b) y la posterior exclusión de dos puntos de tiempo de la muestra (Paciente 6 Ciclo 1 y Paciente 11 Ciclo 2). Las encuestas de 24 horas restantes dentro de cada período de recopilación de 3 días se promediaron para obtener la ingesta diaria media de nutrientes para cada paciente para cada período de muestreo, lo que resultó en un conjunto de datos dietéticos de 86 puntos de tiempo de 35 pacientes (Figs. S1c,d y Tabla S1). El índice de alimentación saludable (HEI)-2020 y el índice de alimentación saludable alternativo (AHEI) se calcularon utilizando scripts R personalizados adaptados del código SAS disponible públicamente del National Cancer Institute^[62]. Dado que la salida de nutrientes de ASA24 no incluye grasas trans, excluimos esta categoría del cálculo del AHEI; como resultado, el AHEI que se muestra aquí tiene un valor máximo de 100 en lugar de 110. Para el análisis de nutrientes y grupos de alimentos individuales, las variables dietéticas se normalizaron para la ingesta total de energía utilizando el método de residuos^[63]. El método de residuos funciona de la siguiente manera: dada la ingesta dietética Dj y las kcal Cj para cada paciente j: (i) se ajustan los coeficientes de regresión b0 y b1 para la ecuación D = b0 + b1C en todos los pacientes simultáneamente; (ii) se calculan los residuos rj = Dj - (b0 + b1Cj); y (iii) se calcula la Dj,ajustada = rj + Davg.

Conjuntos de datos de secuenciación

La recolección de muestras fecales, la preparación de las bibliotecas y la secuenciación se realizaron como se describió previamente en 222 muestras de 40 pacientes con CCRC del estudio clínico GO^[18] y en 156 muestras de 56 pacientes con CCRC en un estudio clínico holandés independiente^[11] (Tabla S9). En el estudio GO, se dispuso de secuenciación del gen 16S rRNA (región V4, cebadores 515F y 806R) y datos sobre la dieta para 85 muestras de 35 pacientes (Tabla S4), mientras que se dispuso de metagenómica y datos sobre la dieta para 86 muestras de los mismos 35 pacientes (Tabla S6). Antes del análisis posterior, las abundancias de taxones y genes se transformaron mediante el centro de la razón logarítmica (CLR).

Procesamiento de datos de secuenciación del gen 16S rRNA

Los cebadores y adaptadores se eliminaron utilizando el comando cutadapt trim-paired en QIIME2 (v2020.11)^[64]. Las secuencias se recortaron a 220 pb (sentido directo) o 150 pb (sentido inverso). El filtrado de calidad, la eliminación del ruido y el filtrado de quimeras se realizaron utilizando dada2 (v1.18.0) con el comando denoise-paired de QIIME2^[65]. La longitud de la secuencia se filtró a 250–255 pb utilizando el comando feature-table filter-seqs de QIIME2. La taxonomía de la variante de secuencia de amplicones (ASV) se asignó utilizando la base de datos SILVA v138^[66]. Se eliminaron las variantes de secuencia que no estaban presentes en al menos 3 muestras con al menos 10 lecturas. Las abundancias relativas de ASV se transformaron posteriormente mediante el centro de la razón logarítmica (CLR) antes del análisis posterior.

Procesamiento de datos de metagenómica

Las lecturas desmultiplexadas se sometieron a la eliminación de adaptadores y al filtrado de calidad con FastP (v0.23.2)^[67], seguido de la eliminación de lecturas del huésped mediante el mapeo al genoma humano (GRCh38) con BMTagger (v3.101)^[68]. Anotamos la taxonomía con MetaPhlAn (v4.0.3)^[69]. Los genes se anotaron con HUMAnN (v3.6)^[69]. Las familias de genes UniRef90 se mapearon posteriormente a grupos ortólogos KEGG. Las abundancias de las familias de genes se transformaron mediante CLR antes del análisis posterior.

Estimación metagenómica de la ingesta dietética

La herramienta de estimación metagenómica de la ingesta dietética (MEDI)^[42] se ejecutó con los parámetros readlength = 100, params.confidence = 0.1, params.threshold = 5 para estimar la ingesta de teobromina a partir de las heces en los conjuntos de datos de metagenómica de los estudios GO y holandés (Tabla S9). Las estimaciones de ASA24 y MEDI de la ingesta de teobromina estuvieron significativamente correlacionadas en el estudio GO (ρ de Spearman = 0.4, p_ = 0.00079); no se realizaron encuestas de ASA24 en el estudio holandés.

Cuantificación por qPCR de Fusobacterium nucleatum

El ADN genómico (gADN) se extrajo utilizando el kit de ADN ZymoBIOMICs 96 MagBead (Zymo D4308) con 2 rondas de agitación de cuentas de 5 minutos, como se describió previamente^[18]. El gADN se utilizó para cuantificar Fusobacterium nucleatum utilizando un par de cebadores publicado y validado previamente (Fn1FWD y Fn1REV; Tabla S10) que se dirige al gen 16S rRNA de F. nucleatum^[70] y un par de cebadores publicado y validado previamente diferente (16SgeneralFWD y 16SgeneralREV; Tabla S10) que se dirige a los genes 16S rRNA bacterianos generales^[71]. Las reacciones se realizaron utilizando los siguientes volúmenes: 4 μL de gADN diluido (1:10 en agua desionizada), 1 μL de stock de cebador de 3 μM y 5 μL de SYBR Select Master Mix for CFX (Thermo Fisher Scientific). Condiciones de ciclado: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 2 min y 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 min^[70],^[71]. Se generaron curvas estándar con gADN de F. nucleatum DSM15643 de cultivo puro. La abundancia de F. nucleatum se normalizó a los amplicones totales del gen 16S rRNA, como se describió^[72]. Las muestras con F. nucleatum por debajo del límite de detección (Ct > 40) se clasificaron como F. nucleatum-negativas. Se detectó F. nucleatum por qPCR en al menos una muestra de cada paciente (prevalencia del 100%). Para los análisis cuantitativos, la abundancia de las muestras F. nucleatum-negativas se estableció en la proporción positiva detectada mínima.

Ensayos de crecimiento de F. nucleatum

Todo el trabajo con F. nucleatum se realizó en una cámara anaeróbica (Coy Laboratory Products) con una atmósfera de 0,03, y las células tomadas se diluyeron a una OD600 inicial de 0,005 y se inocularon en un medio fresco en una placa nueva. Se mantuvieron seis líneas de cultivo independientes para cada cepa, y se realizaron transferencias seriadas durante 4 pasos. La CI50 se definió como la concentración de 5-FU en la que las bacterias mostraron un 50% de OD600 a las 24 horas en relación con el crecimiento de esa cepa en un medio sin fármaco.

Modelado y análisis estadístico

Software.

R (v4.4.2) se utilizó para todos los análisis y la visualización^[75]. La función lme del paquete nlme (v3.1.167) se utilizó para el modelado de efectos mixtos^[76]. Las funciones cor.test, t.test y wilcox.test de stats (v4.4.2) se utilizaron para las correlaciones de Pearson, las correlaciones de Spearman, las pruebas t de Welch, las pruebas de rango con signo de Wilcoxon y las pruebas U de Mann-Whitney. Los paquetes ggplot2 (v.3.5.2) y ggpubr (v0.6.1) se utilizaron para la creación de gráficos^[77],^[78].

Pruebas de hipótesis múltiples.

Para todas las pruebas estadísticas, siempre que se realizaron múltiples pruebas, se aplicó la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg utilizando la función p.adjust, y se consideró significativo un FDR < 0,2.

Selección de dieta.

Se calcularon las correlaciones de Pearson entre todas las variables dietéticas de ASA24, y la variable menos general de cada par altamente correlacionado (ρ > 0,85) se eliminó antes del análisis para aumentar la potencia (Fig. S3a, Tabla S2). Cuando más de dos variables estaban altamente correlacionadas, se mantuvo solo una variable, asegurando que ρ > 0,85 con todas las variables eliminadas en el grupo (Fig. S3a, Tabla S2). Los grupos de alimentos con 0 consumo en >60% de los puntos temporales también se eliminaron (Tabla S2), lo que resultó en 79 características dietéticas de ASA24 utilizadas para el análisis (incluido el HEI; Tabla S3).

Dieta vs. tiempo.

Para modelar las variables dietéticas frente al tiempo, filtramos para incluir solo a los pacientes con al menos 2 puntos temporales. Para aprovechar la naturaleza longitudinal del conjunto de datos, utilizamos un modelo de efectos mixtos de Dieta ~ PrePost + 1|Pt, es decir, todos los puntos temporales posteriores al ciclo 1 de un paciente se asignaron al mismo grupo "posterior". Todos los resultados significativos (FDR < 0,2) se representaron gráficamente con diagramas de caja, comparando la ingesta en el ciclo 1 con la ingesta en el ciclo 2 y en el ciclo 3 utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon. El final del tratamiento no se representó gráficamente, ya que solo 8 pacientes enviaron una encuesta dietética en este punto temporal, y la fecha real del punto temporal de finalización del tratamiento en relación con el ciclo 1 varió de meses entre los pacientes^[18].

Dieta y variables clínicas frente a resultados.

Para modelar el cambio en la dieta frente a los resultados, utilizamos una prueba t de Welch para comparar el cambio en cada característica dietética entre el ciclo 2 y el ciclo 1 con cada resultado. Para modelar la dieta basal y las variables clínicas frente a los resultados, utilizamos la prueba t de Welch para las variables dietéticas y las variables clínicas continuas y la prueba de chi-cuadrado para las variables clínicas categóricas. Los resultados más destacados se representaron gráficamente como diagramas de caja, comparando la ingesta de cada grupo de resultados utilizando una prueba t de Welch.

Cálculos de la diversidad del microbioma.

La diversidad alfa (observada) se calculó como la suma de los géneros observados. La diversidad alfa (Shannon) se calculó aplicando la función diversity de vegan (v2.7.1) a los recuentos de géneros^[79]. La diversidad beta se calculó aplicando la función dist a la composición de géneros transformada por CLR (ordenación euclidiana CLR).

Modelado del cambio en la dieta frente al cambio en el microbioma.

Utilizamos la correlación de Spearman para evaluar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en las variables del microbioma. Para ello, utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyó un par si no hubo cambio en la dieta o no hubo cambio en la característica del microbioma); si menos de 10 pares cumplieron este criterio para una combinación dieta-microbioma determinada, esa interacción no se probó. En nuestro análisis anterior, identificamos 43 ASV como diferencialmente abundantes a lo largo del tiempo^[18]; solo 15 de estos ASV estaban presentes en ≥10 pares y eran evaluables para el análisis de la dieta (Tabla S5). El cambio en el microbioma se calculó como la diferencia en el número de géneros observados transformados por rango (diversidad alfa), el índice de Shannon (diversidad alfa), la distancia euclidiana CLR (diversidad beta), la abundancia de ASV transformada por CLR (taxones) o la abundancia de grupos ortólogos KEGG transformada por CLR (genes). Para aumentar la potencia y disminuir el posible impacto de la contaminación, probamos solo los taxones/genes que se detectaron en al menos 25 muestras (filtro de prevalencia del 10%)^[80]. El cambio en la ingesta dietética se calculó como la diferencia en la ingesta dietética transformada por rango. Para las comparaciones con la diversidad beta, se utilizó el valor absoluto del cambio en la ingesta dietética transformada por rango (es decir, se espera que los grandes aumentos o disminuciones en las características dietéticas relevantes para el microbioma aumenten la distancia en el espacio de ordenación euclidiana CLR).

Visualización del cambio en la dieta frente al cambio en el microbioma.

Se utilizó la correlación de Pearson para cuantificar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en el microbioma, utilizando geomsmooth(method = “lm”) para trazar una línea de regresión lineal de mejor ajuste y un intervalo de confianza del 95 %. Cada punto de datos representa un par de puntos temporales consecutivos dentro del mismo paciente, con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyeron los puntos de datos sin cambios en la dieta o sin cambios en el microbioma). El cambio logarítmico en base 2 se calculó entre cada característica en el tiempo t y t_+1 dentro del par dado, añadiendo un valor pseudocuéntico igual al valor positivo mínimo de la característica en el conjunto de datos antes de la transformación logarítmica. Los diagramas de caja se crearon agrupando los cambios en la dieta en ingesta creciente o decreciente, utilizando la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística. Para la visualización de la dinámica de las ASV a lo largo del tiempo, los pacientes se agruparon en función de si su ingesta de una característica dietética aumentó o disminuyó entre el ciclo 1 y un ciclo posterior. Se trazó la media ± error estándar de la abundancia de ASV en relación con la línea de base para los pacientes en cada uno de estos grupos en todos los puntos temporales del tratamiento, incluidos los puntos temporales sin información dietética disponible, utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías para probar las diferencias entre los grupos.### Sobre-representación de bacterias derivadas de los alimentos.

Streptococcus y Lactobacillus spp. representan bacterias derivadas de los alimentos prevalentes y abundantes^[22]. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para probar la representación de estas ASV en las interacciones dieta-ASV.### Análisis de qPCR de Fusobacterium nucleatum.

Dado que la secuenciación del gen del ARNr 16S de la región V4 clasifica la mayoría de las ASV a nivel de género, pero no a nivel de especie^[81], optamos por comparar la abundancia de Fusobacterium a nivel de género a partir de 16S y MGS frente a la abundancia a nivel de especie de F. nucleatum mediante qPCR. Se utilizó la correlación de Pearson para probar las curvas estándar y las correlaciones entre los diferentes métodos de cuantificación. Evaluamos la relación entre el cambio en la ingesta de 46 micronutrientes y el cambio en F. nucleatum utilizando la correlación de Spearman. Utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del mismo paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta. Los cambios en la dieta y en F. nucleatum se calcularon como la diferencia en la ingesta transformada por rango y en la proporción, respectivamente. Los diagramas de caja se crearon agrupando los cambios en la dieta en ingesta creciente o decreciente, utilizando la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística de la proporción de F. nucleatum.### Experimentos in vitro.

Se comparó el crecimiento utilizando ANOVA de una vía (varianzas iguales) o la prueba t de Welch (varianzas desiguales). Probamos los cambios en la CI50 en el estudio de evolución experimental mediante ANOVA de dos vías (término de interacción cepa*pasaje).

Participantes del estudio

Como se describió anteriormente^[18], el estudio del microbioma intestinal y los fluoropirimidinas orales (GO) fue un estudio clínico observacional registrado en ClinicalTrials.gov (NCT04054908; Fig. S1a). El estudio GO fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la UCSF, y todos los participantes proporcionaron consentimiento informado. Los participantes fueron reclutados y se les tomaron muestras, sin ninguna compensación, en la UCSF desde la fecha de inicio del estudio (13/04/2018) hasta la fecha de finalización (30/06/2022). Criterios de inclusión: (i) ≥18 años de edad; (ii) adenocarcinoma colorrectal confirmado histológicamente; y (iii) se espera que reciban terapia oral con fluoropirimidina. Criterios de exclusión: (i) VIH positivo; (ii) quimioterapia, terapia biológica o inmunoterapia en las últimas 2 semanas; (iii) exposición a ≥2 semanas de antibióticos en los últimos 6 meses; o (iv) exposición a antibióticos en las últimas 4 semanas. Los pacientes fueron incluidos en uno de los tres subgrupos en función de su plan de tratamiento: (A) capecitabina oral (CAP) como parte de la terapia estándar (incluida la radioterapia rectal concurrente); (B) TAS-102 (trifluridina/tipiracil) ± radioembolización con Y-90 (NCT02602327)^[58]; (C) CAP e inmunoterapia (pembrolizumab) (NCT03396926). Las tabletas de CAP y TAS-102 se prescribieron de acuerdo con las indicaciones de la FDA y el criterio del investigador para la dosificación de las tabletas orales. Las tabletas de CAP se tomaron dos veces al día durante los días 1-14 de un ciclo de 21 días (sin RT) o durante los días de radiación (RT), mientras que las tabletas de TAS-102 se tomaron dos veces al día durante los días 1-5 y 8-12 de un ciclo de 28 días.

Evaluación dietética

Se pidió a los participantes que completaran 3 recordatorios dietéticos consecutivos de 24 horas utilizando el sistema en línea Automatizado de Autoadministración 24 (ASA24) del Instituto Nacional del Cáncer antes del inicio de los ciclos 1-3 y al final del tratamiento (EOT)^[59]. Para evitar errores de medición en los datos dietéticos, excluimos los recordatorios de 24 horas en los extremos de la ingesta calórica: > percentil 99 o < percentil 1 de la ingesta calórica de los datos de NHANES recopilados en 2017-2020^[60],^[61]. En total, esto resultó en la exclusión de 11 períodos de 24 horas (10 registros < 458 kcal, 1 registro > 5105 kcal; Fig. S1b) y la posterior exclusión de dos puntos temporales de muestra (Paciente 6, Ciclo 1 y Paciente 11, Ciclo 2). Los recordatorios de 24 horas restantes dentro de cada período de recopilación de 3 días se promediaron para obtener la ingesta diaria promedio de nutrientes para cada paciente para cada período de muestreo, lo que resultó en un conjunto de datos dietéticos de 86 puntos temporales de 35 pacientes (Figs. S1c, d y Tabla S1). El índice de alimentación saludable (HEI)-2020 y el índice de alimentación saludable alternativo (AHEI) se calcularon utilizando scripts R personalizados adaptados del código SAS disponible públicamente del Instituto Nacional del Cáncer^[62]. Dado que la salida de nutrientes de ASA24 no incluye las grasas trans, excluimos esta categoría del cálculo del AHEI; como resultado, el AHEI que se muestra aquí tiene un valor máximo de 100 en lugar de 110. Para el análisis de nutrientes y grupos de alimentos individuales, las variables dietéticas se normalizaron para la ingesta total de energía utilizando el método de residuos^[63]. El método de residuos funciona de la siguiente manera: dada la ingesta dietética Dj y las kcal Cj para cada paciente j: (i) se ajustan los coeficientes de regresión b0 y b1 para la ecuación D = b0 + b1C en todos los pacientes simultáneamente; (ii) se calculan los residuos rj = Dj - (b0 + b1Cj); y (iii) se calcula la Dj,ajustada = rj + Davg normalizada.

Conjuntos de datos de secuenciación

La recolección de muestras fecales, la preparación de bibliotecas y la secuenciación se realizaron como se describió anteriormente en 222 muestras de 40 pacientes con CRC del estudio GO^[18] y en 156 muestras de 56 pacientes con CRC en un estudio clínico holandés independiente^[11] (Tabla S9). En el estudio GO, la secuenciación del gen del ARNr 16S (región V4, cebadores 515F y 806R) y la información dietética estaban disponibles para 85 muestras de 35 pacientes (Tabla S4), mientras que la metagenómica y la información dietética estaban disponibles para 86 muestras de los mismos 35 pacientes (Tabla S6). Antes del análisis posterior, las abundancias de taxones y genes se transformaron mediante la relación logarítmica central (CLR).

Procesamiento de datos de secuenciación del gen del ARNr 16S

Los cebadores y adaptadores se eliminaron utilizando el comando cutadapt trim-paired en QIIME2 (v2020.11)^[64]. Las secuencias se recortaron a 220 pb (directo) o 150 pb (reverso). El filtrado de calidad, la eliminación de ruido y el filtrado de quimeras se realizaron utilizando dada2 (v1.18.0) con el comando denoise-paired de QIIME2^[65]. La longitud de la secuencia se filtró a 250-255 pb utilizando el comando feature-table filter-seqs de QIIME2. La taxonomía de la variante de secuencia amplicon (ASV) se asignó utilizando la base de datos SILVA v138^[66]. Las variantes de secuencia que no estaban presentes en al menos 3 muestras con al menos 10 lecturas se eliminaron. Las abundancias relativas de ASV se transformaron mediante la relación logarítmica central (CLR) antes del análisis posterior.

Procesamiento de datos metagenómicos

Las lecturas desmultiplexadas se sometieron a la eliminación de adaptadores y al filtrado de calidad con FastP (v0.23.2)^[67], seguido de la eliminación de lecturas del huésped mediante el mapeo al genoma humano (GRCh38) con BMTagger (v3.101)^[68]. Se anotó la taxonomía con MetaPhlAn (v4.0.3)^[69]. Los genes se anotaron con HUMAnN (v3.6)^[69]. Las familias de genes UniRef90 se mapearon posteriormente a los grupos ortólogos KEGG. Las abundancias de las familias de genes se transformaron mediante la relación logarítmica central (CLR) antes del análisis posterior.

Estimación metagenómica de la ingesta dietética

La herramienta de estimación metagenómica de la ingesta dietética (MEDI)^[42] se ejecutó con los parámetros readlength = 100, params.confidence = 0.1, params.threshold = 5 para estimar la ingesta de teobromina a partir de las heces en los conjuntos de datos metagenómicos de los estudios GO y holandés (Tabla S9). Los recordatorios de ASA24 y MEDI de la ingesta de teobromina se correlacionaron significativamente en el estudio GO (ρSpearman = 0.4, p_ = 0.00079); no se realizaron recordatorios de ASA24 en el estudio holandés.

Cuantificación de Fusobacterium nucleatum mediante qPCR

El ADN genómico (gDNA) se extrajo utilizando el kit de ADN MagBead ZymoBIOMICs 96 (Zymo D4308) con 2 rondas de 5 minutos de batido con cuentas, como se describió anteriormente^[18]. El gDNA se utilizó para cuantificar Fusobacterium nucleatum utilizando un par de cebadores publicado y validado previamente (Fn1FWD y Fn1REV; Tabla S10) que se dirige al gen del ARNr 16S de F. nucleatum y un par de cebadores publicado y validado previamente (16SgeneralFWD y 16SgeneralREV; Tabla S10) que se dirige a los genes del ARNr 16S bacterianos generales^[71]. Las reacciones se realizaron utilizando los siguientes volúmenes: 4 μL de gDNA diluido (1:10 en agua desionizada), 1 μL de stock de cebador de 3 μM y 5 μL de SYBR Select Master Mix for CFX (Thermo Fisher Scientific). Condiciones de ciclado: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 2 min y 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 min^[70],^[71]. Se generaron curvas estándar con gDNA de F. nucleatum DSM15643 de cultivo puro. La abundancia de F. nucleatum se normalizó a los amplicones totales del gen del ARNr 16S, como se describió^[72]. Las muestras con F. nucleatum por debajo del límite de detección (Ct > 40) se denominaron F. nucleatum-negativas. F. nucleatum se detectó mediante qPCR en al menos una muestra para cada paciente (prevalencia del 100 %). Para los análisis cuantitativos, la abundancia de las muestras F. nucleatum-negativas se estableció en la proporción positiva mínima detectada.

Ensayos de crecimiento de F. nucleatum

Todo el trabajo con F. nucleatum se realizó en una cámara anaeróbica (Coy Laboratory Products) con una atmósfera de 0,03, y las células muestreadas se diluyeron a una OD600 inicial de 0,005 y se inocularon en un medio fresco en una placa nueva. Se mantuvieron seis líneas de cultivo independientes para cada cepa, y se realizaron transferencias seriadas durante 4 pasos. El IC50 se definió como la concentración de 5-FU en la que las bacterias mostraron un 50% de OD600 a las 24 horas en relación con el crecimiento de esa cepa en un medio sin fármaco.

Modelado y análisis estadístico

Software.

Se utilizó R (v4.4.2) para todos los análisis y la visualización^[75]. La función lme del paquete nlme (v3.1.167) se utilizó para el modelado de efectos mixtos^[76]. Las funciones cor.test, t.test y wilcox.test de stats (v4.4.2) se utilizaron para las correlaciones de Pearson, las correlaciones de Spearman, las pruebas t de Welch, las pruebas de rango con signo de Wilcoxon y las pruebas U de Mann-Whitney. Los paquetes ggplot2 (v.3.5.2) y ggpubr (v0.6.1) se utilizaron para la creación de gráficos^[77],^[78].

Pruebas de hipótesis múltiples.

Para todas las pruebas estadísticas, siempre que se realizaron múltiples pruebas, se aplicó la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg utilizando la función p.adjust, y se consideró significativo un FDR < 0,2.

Selección de variables dietéticas.

Se calcularon las correlaciones de Pearson entre todas las variables dietéticas de ASA24, y la variable menos general de cada par altamente correlacionado (ρ > 0,85) se eliminó antes del análisis para aumentar la potencia (Fig. S3a, Tabla S2). Cuando más de dos variables estaban altamente correlacionadas, se mantuvo solo una variable, asegurando que ρ > 0,85 con todas las variables eliminadas en el grupo (Fig. S3a, Tabla S2). También se eliminaron los grupos de alimentos con 0 consumo en >60% de los puntos temporales (Tabla S2), lo que resultó en 79 características dietéticas de ASA24 utilizadas para el análisis (incluido el HEI; Tabla S3).

Dieta vs. tiempo.

Para modelar las variables dietéticas en función del tiempo, filtramos para incluir solo a los pacientes con al menos 2 puntos temporales. Para aprovechar la naturaleza longitudinal del conjunto de datos, utilizamos un modelo de efectos mixtos de Dieta ~ PrePost + 1|Pt, es decir, todos los puntos temporales posteriores al ciclo 1 de un paciente se asignaron al mismo grupo "posterior". Todos los resultados significativos (FDR < 0,2) se representaron con diagramas de caja, y se comparó la ingesta en el ciclo 1 con la ingesta en el ciclo 2 y en el ciclo 3 utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon. No se representaron los datos del final del tratamiento, ya que solo 8 pacientes enviaron un cuestionario dietético en este punto temporal, y la fecha real del punto temporal del final del tratamiento en relación con el ciclo 1 varió en meses de un paciente a otro^[18].

Variables dietéticas y clínicas vs. resultado.

Para modelar el cambio en la dieta en relación con los resultados, utilizamos una prueba t de Welch para comparar el cambio en cada característica dietética entre el ciclo 2 y el ciclo 1 en relación con cada resultado. Para modelar las variables dietéticas y clínicas basales en relación con el resultado, utilizamos la prueba t de Welch para las variables dietéticas y las variables clínicas continuas, y la prueba de chi-cuadrado para las variables clínicas categóricas. Los resultados más destacados se representaron con diagramas de caja, y se comparó la ingesta de cada grupo de resultados utilizando una prueba t de Welch.

Cálculos de la diversidad del microbioma.

La diversidad alfa (observada) se calculó como la suma de los géneros observados. La diversidad alfa (Shannon) se calculó aplicando la función diversity del paquete vegan (v2.7.1) a los recuentos de géneros^[79]. La diversidad beta se calculó aplicando la función dist a la composición de géneros transformada CLR (ordenación euclidiana CLR).

Modelado del cambio en la dieta vs. el cambio en el microbioma.

Utilizamos la correlación de Spearman para evaluar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en las variables del microbioma. Para ello, utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyó un par si no hubo cambio en la dieta o no hubo cambio en la característica del microbioma); si menos de 10 pares cumplieron este criterio para una combinación dieta-microbioma determinada, esa interacción no se probó. En nuestro análisis anterior, identificamos 43 ASV como diferencialmente abundantes a lo largo del tiempo^[18]; solo 15 de estos ASV estaban presentes en ≥10 pares y se pudieron evaluar para el análisis de la dieta (Tabla S5). El cambio en el microbioma se calculó como la diferencia en el rango transformado del número de géneros observados (diversidad alfa), el índice de Shannon (diversidad alfa), la distancia euclidiana CLR (diversidad beta), la abundancia de ASV transformada CLR (taxa) o la abundancia de ortólogos KEGG transformada CLR (genes). Para aumentar la potencia y disminuir el posible impacto de la contaminación, probamos solo los taxa/genes que se detectaron en al menos 25 muestras (filtro de prevalencia del 10%)^[80]. El cambio en la ingesta dietética se calculó como la diferencia en la ingesta dietética transformada por rango. Para las comparaciones con la diversidad beta, se utilizó el valor absoluto del cambio en la ingesta dietética transformada por rango (es decir, se espera que los grandes aumentos o disminuciones en las características dietéticas relevantes para el microbioma aumenten la distancia en el espacio de ordenación euclidiana CLR).

Visualización del cambio en la dieta vs. el cambio en el microbioma.

Se utilizó la correlación de Pearson para cuantificar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en el microbioma, y se utilizó geomsmooth(method = “lm”) para trazar una línea de regresión lineal de mejor ajuste y un intervalo de confianza del 95%. Cada punto de datos representa un par de puntos temporales consecutivos dentro del paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyeron los puntos de datos sin cambio en la dieta o sin cambio en el microbioma). El cambio logarítmico en base 2 se calculó entre cada característica en el tiempo t y t+1 dentro del par dado, y se añadió un pseudocuento igual al valor positivo mínimo de la característica en el conjunto de datos antes de la transformación logarítmica. Los diagramas de caja se crearon agrupando los cambios en la dieta en una ingesta creciente o decreciente, y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística de la proporción de F. nucleatum_. Para la visualización de la dinámica de los ASV a lo largo del tiempo, los pacientes se agruparon en función de si su ingesta de una característica dietética aumentó o disminuyó entre el ciclo 1 y un ciclo posterior. Se trazó la media ± el error estándar de la abundancia de ASV en relación con la línea de base para los pacientes en cada uno de estos grupos en todos los puntos temporales del tratamiento, incluidos los puntos temporales sin información dietética, y se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías para probar las diferencias entre los grupos.

Sobreabundancia de bacterias derivadas de los alimentos.

Streptococcus y Lactobacillus spp. representan bacterias derivadas de los alimentos prevalentes y abundantes^[22]. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para probar la representación de estos ASV en las interacciones dieta-ASV.

Análisis de qPCR de Fusobacterium nucleatum.

Dado que el secuenciamiento del gen del ARNr 16S de la región V4 clasifica la mayoría de los ASV a nivel de género, pero no de especie^[81], optamos por comparar la abundancia de Fusobacterium a nivel de género a partir de 16S y MGS frente a la abundancia a nivel de especie de F. nucleatum mediante qPCR. Se utilizó la correlación de Pearson para probar las curvas estándar y las correlaciones entre los diferentes métodos de cuantificación. Evaluamos la relación entre el cambio en la ingesta de 46 micronutrientes y el cambio en F. nucleatum utilizando la correlación de Spearman. Utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta. Los cambios en la dieta y F. nucleatum se calcularon como la diferencia en la ingesta transformada por rango y la proporción, respectivamente. Se crearon diagramas de caja agrupando los cambios en la dieta en una ingesta creciente o decreciente, y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística de la proporción de F. nucleatum.

Experimentos in vitro.

Se comparó el crecimiento utilizando ANOVA de una vía (varianzas iguales) o la prueba t de Welch (varianzas desiguales). Probamos los cambios en el IC50 en el estudio de evolución experimental mediante ANOVA de dos vías (término de interacción cepa*paso).

Software.

Se utilizó R (v4.4.2) para todos los análisis y la visualización^[75]. La función lme del paquete nlme (v3.1.167) se utilizó para el modelado de efectos mixtos^[76]. Las funciones cor.test, t.test y wilcox.test de stats (v4.4.2) se utilizaron para las correlaciones de Pearson, las correlaciones de Spearman, las pruebas t de Welch, las pruebas de rango con signo de Wilcoxon y las pruebas U de Mann-Whitney. Los paquetes ggplot2 (v.3.5.2) y ggpubr (v0.6.1) se utilizaron para la creación de gráficos^[77],^[78].

Pruebas de hipótesis múltiples.

Para todas las pruebas estadísticas, siempre que se realizaron múltiples pruebas, se aplicó la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg utilizando la función p.adjust, y se consideró significativo un FDR < 0,2.

Selección de variables dietéticas.

Se calcularon las correlaciones de Pearson entre todas las variables dietéticas de ASA24, y la variable menos general de cada par altamente correlacionado (ρ > 0,85) se eliminó antes del análisis para aumentar la potencia (Fig. S3a, Tabla S2). Cuando más de dos variables estaban altamente correlacionadas, se mantuvo solo una variable, asegurando que ρ > 0,85 con todas las variables eliminadas en el grupo (Fig. S3a, Tabla S2). También se eliminaron los grupos de alimentos con 0 consumo en >60% de los puntos temporales (Tabla S2), lo que resultó en 79 características dietéticas de ASA24 utilizadas para el análisis (incluido el HEI; Tabla S3).

Dieta vs. tiempo.

Para modelar las variables dietéticas en función del tiempo, filtramos para incluir solo a los pacientes con al menos 2 puntos temporales. Para aprovechar la naturaleza longitudinal del conjunto de datos, utilizamos un modelo de efectos mixtos de Dieta ~ PrePost + 1|Pt, es decir, todos los puntos temporales posteriores al ciclo 1 de un paciente se asignaron al mismo grupo "posterior". Todos los resultados significativos (FDR < 0,2) se representaron con diagramas de caja, y se comparó la ingesta en el ciclo 1 con la ingesta en el ciclo 2 y en el ciclo 3 utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon. No se representaron los datos del final del tratamiento, ya que solo 8 pacientes enviaron un cuestionario dietético en este punto temporal, y la fecha real del punto temporal del final del tratamiento en relación con el ciclo 1 varió en meses de un paciente a otro^[18].

Variables dietéticas y clínicas vs. resultado.

Para modelar el cambio en la dieta en relación con los resultados, utilizamos una prueba t de Welch para comparar el cambio en cada característica dietética entre el ciclo 2 y el ciclo 1 en relación con cada resultado. Para modelar las variables dietéticas y clínicas basales en relación con el resultado, utilizamos la prueba t de Welch para las variables dietéticas y las variables clínicas continuas, y la prueba de chi-cuadrado para las variables clínicas categóricas. Los resultados más destacados se representaron con diagramas de caja, y se comparó la ingesta de cada grupo de resultados utilizando una prueba t de Welch.

Cálculos de la diversidad del microbioma.

La diversidad alfa (observada) se calculó como la suma de los géneros observados. La diversidad alfa (Shannon) se calculó aplicando la función diversity del paquete vegan (v2.7.1) a los recuentos de géneros^[79]. La diversidad beta se calculó aplicando la función dist a la composición de géneros transformada CLR (ordenación euclidiana CLR).

Utilizamos la correlación de Spearman para evaluar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en las variables del microbioma. Para ello, utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del mismo paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyó un par si no hubo cambio en la dieta o en la característica del microbioma); si menos de 10 pares cumplían este criterio para una combinación dieta-microbioma dada, esa interacción no se probó. En nuestro análisis previo, identificamos 43 ASV (secuencias de amplicón de ARN ribosomal 16S) con abundancia diferencial a lo largo del tiempo^[18]; solo 15 de estos ASV estaban presentes en ≥10 pares y eran evaluables para el análisis de la dieta (Tabla S5). El cambio en el microbioma se calculó como la diferencia en el número transformado por rango de géneros observados (diversidad alfa), índice de Shannon (diversidad alfa), distancia euclidiana CLR (diversidad beta), abundancia de ASV transformada por CLR (taxa) o abundancia de ortólogos KEGG transformada por CLR (genes). Para aumentar la potencia y disminuir el posible impacto de la contaminación, solo probamos los taxa/genes que se detectaron en al menos 25 muestras (filtro de prevalencia del 10%)^[80]. El cambio en la ingesta dietética se calculó como la diferencia en la ingesta dietética transformada por rango. Para las comparaciones con la diversidad beta, se utilizó el valor absoluto del cambio en la ingesta dietética transformada por rango (es decir, se espera que los grandes aumentos o disminuciones en las características dietéticas relevantes para el microbioma aumenten la distancia en el espacio de ordenación euclidiana CLR).

Visualización del cambio en la dieta frente al cambio en el microbioma.

Se utilizó la correlación de Pearson para cuantificar la relación entre el cambio en la ingesta dietética y el cambio en el microbioma, y se utilizó geomsmooth(method = “lm”) para trazar una línea de regresión lineal de mejor ajuste y un intervalo de confianza del 95%. Cada punto de datos representa un par de puntos temporales consecutivos dentro del mismo paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta y para la variable del microbioma (es decir, se excluyeron los puntos de datos sin cambio en la dieta o sin cambio en el microbioma). El cambio en el logaritmo en base 2 se calculó entre cada característica en el tiempo t y t_+1 dentro del par dado, y se agregó un pseudocuento igual al valor positivo mínimo de la característica en el conjunto de datos antes de la transformación logarítmica. Los diagramas de caja se crearon agrupando los cambios en la dieta en aumentos o disminuciones de la ingesta, y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística. Para la visualización de la dinámica de los ASV a lo largo del tiempo, los pacientes se agruparon según si su ingesta de una característica dietética aumentó o disminuyó entre el ciclo 1 y un ciclo posterior. Se trazó la media ± error estándar de la abundancia de ASV en relación con la línea de base para los pacientes en cada uno de estos grupos en todos los puntos temporales del tratamiento, incluidos los puntos temporales sin información dietética disponible, y se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías para probar las diferencias entre grupos.

Sobre-representación de bacterias de origen alimentario.

Streptococcus y Lactobacillus spp. representan bacterias de origen alimentario prevalentes y abundantes^[22]. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para probar la representación de estos ASV en las interacciones dieta-ASV.

Análisis de qPCR de Fusobacterium nucleatum.

Dado que el secuenciamiento del gen de ARN ribosomal 16S de la región V4 clasifica la mayoría de los ASV a nivel de género, pero no de especie^[81], optamos por comparar la abundancia de Fusobacterium a nivel de género a partir de 16S y MGS frente a la abundancia a nivel de especie de F. nucleatum mediante qPCR. Se utilizó la correlación de Pearson para probar las curvas estándar y las correlaciones entre los diferentes métodos de cuantificación. Evaluamos la relación entre el cambio en la ingesta de 46 micronutrientes y el cambio en F. nucleatum utilizando la correlación de Spearman. Utilizamos cada par de puntos temporales consecutivos dentro del mismo paciente con al menos un valor distinto de cero para la dieta. Los cambios en la dieta y en F. nucleatum se calcularon como la diferencia en la ingesta y la proporción transformadas por rango, respectivamente. Los diagramas de caja se crearon agrupando los cambios en la dieta en aumentos o disminuciones de la ingesta, y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación estadística de la proporción de F. nucleatum.

Experimentos in vitro.

Se comparó el crecimiento utilizando ANOVA de una vía (varianzas iguales) o la prueba t de Welch (varianzas desiguales). Probamos los cambios en la CI50 en el estudio de evolución experimental mediante ANOVA de dos vías (término de interacción cepa*pasaje).