Los mecanismos por los cuales las vesículas y partículas extracelulares derivadas del tumor (VPE) promueven la permeabilidad vascular durante la formación del nicho premetastásico siguen sin estar claros. Aquí, demostramos que las VPE tumorales inducen rápidamente la permeabilidad vascular en el plazo de 1 hora tras su administración en ratones hembra, creando un entorno favorable que mejora la siembra metastásica. En lugar de actuar directamente sobre las células endoteliales, las VPE activan la señalización NF-κB y JAK-STAT en los macrófagos intersticiales, lo que conduce a la secreción de IL-6 y al aumento de la permeabilidad vascular. El agotamiento de los macrófagos intersticiales reduce notablemente la permeabilidad vascular inducida por las VPE y la metástasis.
Identificamos la integrina α5 asociada a las vesículas extracelulares (ITGα5) como un determinante funcional importante de este proceso, ya que promueve la activación de los macrófagos y la secreción de IL-6 sin afectar la captación de las VPE. Las VPE derivadas de tumores de cáncer colorrectal con alta ITGα5 inducen de manera similar la secreción de IL-6 y la permeabilidad vascular en los macrófagos. En conjunto, estos hallazgos definen un eje VPE-macrófago-IL-6 que impulsa la permeabilidad vascular durante la formación del nicho premetastásico e identifican la ITGα5 asociada a las VPE como un mediador clave de la progresión metastásica y un posible objetivo terapéutico.
Resumen: Los mecanismos por los cuales los vehículos y partículas extracelulares derivados del tumor (EVP) promueven la permeabilidad vascular durante la formación del nicho premetastásico siguen sin estar claros. Aquí, demostramos que los EVP tumorales inducen rápidamente un aumento de la permeabilidad vascular en el plazo de 1 hora tras su administración en ratones hembra, creando un entorno permisivo que mejora la siembra metastásica. En lugar de actuar directamente sobre las células endoteliales, los EVP activan las vías de señalización NF-κB y JAK-STAT en los macrófagos intersticiales, lo que conduce a la secreción de IL-6 y al aumento de la permeabilidad vascular. El agotamiento de los macrófagos intersticiales reduce notablemente el aumento de la permeabilidad vascular inducido por los EVP y la metástasis. Identificamos la integrina α5 asociada a los vehículos extracelulares (ITGα5) como un determinante funcional importante de este proceso, ya que promueve la activación de los macrófagos y la secreción de IL-6 sin afectar la captación de los EVP. Los EVP derivados de tumores de cáncer colorrectal con alta expresión de ITGα5 inducen de manera similar la secreción de IL-6 y la permeabilidad vascular en los macrófagos. En conjunto, estos hallazgos definen un eje EVP–macrófago–IL-6 que impulsa la permeabilidad vascular durante la formación del nicho premetastásico e identifican la ITGα5 asociada a los EVP como un mediador clave de la progresión metastásica y un posible objetivo terapéutico.
Contenido similar que están viendo otros usuarios
La tenascina C perivascular desencadena la activación secuencial de macrófagos y células endoteliales para generar un nicho vascular pro-metastásico en los pulmones
Artículo
Acceso abierto
25 de abril de 2022
Regulación mecánica de la actividad de los vehículos extracelulares durante la progresión tumoral
Artículo
6 de agosto de 2025
El bloqueo del péptido intestinal vasoactivo suprime el crecimiento tumoral al regular la polarización y la función de los macrófagos en ratones portadores de tumores CT26
Artículo
Acceso abierto
17 de enero de 2023
Temas
Microentorno tumoral
Metástasis
Cáncer MainMetastasis es una fase crítica de la progresión tumoral, y sigue siendo un desafío importante en el tratamiento del cáncer y una de las principales causas de mortalidad por cáncer1. Por lo tanto, dilucidar los procesos moleculares y celulares fundamentales que impulsan las distintas etapas de la metástasis es crucial para identificar nuevas dianas terapéuticas. Para establecer la metástasis, las células tumorales primero deben intravasar en la circulación, sobrevivir en el torrente sanguíneo, luego extravasar en los tejidos distales y colonizarlos2. La extravasación de células malignas en los tejidos distantes puede verse facilitada por la permeabilidad vascular3. El pulmón es muy eficiente para atrapar las células cancerosas circulantes en los capilares debido a la restricción del tamaño y, por lo tanto, es un sitio frecuente de metástasis4. Las células endoteliales (CE) vasculares pulmonares proporcionan barreras físicas e inmunológicas a los fluidos, las proteínas y las células5. Para extravasar del torrente sanguíneo hacia los órganos distantes, las células cancerosas interrumpen la integridad de la barrera endotelial, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad vascular5. El tumor primario facilita la metástasis a través de la secreción de factores solubles y vesículas y partículas extracelulares (VPE), que crean un microambiente de apoyo en los órganos distantes. Nuestro trabajo anterior demostró que la formación del nicho premetastásico (NPM) precede a la llegada de las células cancerosas6,7,8,9. La permeabilidad vascular es una característica distintiva de la formación del NPM pulmonar y representa un paso temprano en la cascada que conduce a la metástasis pulmonar10,11,12. En consecuencia, al llegar al NPM, las células cancerosas aprovechan el aumento de la permeabilidad vascular para infiltrar el órgano y establecer lesiones metastásicas. En consecuencia, las estrategias dirigidas a reducir la permeabilidad endotelial vascular han demostrado ser prometedoras para disminuir la carga metastásica10,11,13. Las VPE, que contribuyen a la formación del NPM, son un grupo diverso de vesículas a nanoescala que se liberan activamente por las células14. Las VPE empaquetan selectivamente una carga que comprende proteínas, ARN, ADN y lípidos, y actúan como vehículos en la comunicación intercelular a larga distancia, tanto en la fisiología normal como en la patología, particularmente en el desarrollo del cáncer y la metástasis15,16. Un trabajo previo de nuestro grupo demostró que, dentro de las 24 horas posteriores a la administración de VPE derivadas del tumor, se detecta una fuga vascular tanto en los pulmones como en los cerebros de animales no expuestos previamente17. Sin embargo, el mecanismo por el cual las VPE derivadas del tumor inducen la permeabilidad vascular aún no se ha explorado. Estudios previos han demostrado que los factores solubles secretados por las células cancerosas, incluidos el VEGF, el TGFβ y el TNF, son potentes inductores de la permeabilidad vascular11,18,19. Además, la apoptosis endotelial20 y la necroptosis21 promueven la permeabilidad y la extravasación de las células cancerosas. Las VPE también comprometen la barrera endotelial a través de múltiples mecanismos. Los microARN asociados a las VPE aumentan la permeabilidad vascular al interrumpir las uniones adherentes y las uniones estrechas o a través del remodelado de la actina13,22,23, mientras que las proteínas transferidas por las VPE modulan aún más estos procesos24,25. Estos hallazgos resaltan la importancia de la integridad endotelial como barrera contra la extravasación. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales las VPE regulan la permeabilidad vascular en los diferentes tipos de cáncer y en la progresión tumoral siguen sin estar claros.
Aquí, centrándonos en el pulmón como sitio de metástasis futura, nos propusimos analizar los eventos que inician la permeabilidad vascular durante la formación del NPM, comparando modelos de cáncer caracterizados por diferentes niveles de permeabilidad vascular. Sorprendentemente, descubrimos que las VPE específicas de las células cancerosas modulaban la permeabilidad vascular a través de su efecto sobre los macrófagos intersticiales pulmonares (MIP), en lugar de un efecto directo sobre las CE. La capacidad de las VPE para inducir la fuga vascular dependía de su expresión de integrina α5 (ITGα5). Específicamente, las VPE enriquecidas con ITGα5 activaron la señalización de NF-κB y STAT3 en los MIP, lo que desencadenó la secreción de IL-6, lo que a su vez indujo la permeabilidad vascular en las CE. Además, demostramos que la permeabilidad inducida por las VPE con tropismo pulmonar se acompañó de un aumento de la incidencia de extravasación y metástasis. En conjunto, estos hallazgos revelan que las VPE tumorales promueven la permeabilidad vascular premetastásica a través de un eje de señalización macrófago-endotelial dependiente de ITGα5, facilitando así la extravasación de las células cancerosas y la siembra metastásica, e identifican esta vía como una posible diana para limitar la metástasis.
Resultados
Modelos ortotópicos de tumores y VPE derivadas de tumores inducen diferentes grados de fuga vascular en los pulmones
Dado que el pulmón es susceptible a la metástasis y la fuga vascular, una característica distintiva del NPM pulmonar, buscamos identificar los tipos de tumores capaces de inducir la permeabilidad vascular pulmonar. Comparamos modelos metastásicos con tropismo pulmonar (melanoma B16F10, osteosarcoma K7M2 y cáncer de mama 4T1) con la línea de cáncer de mama no metastásico 67NR. Para evaluar la fuga vascular, implantamos ortotópicamente estas líneas de células cancerosas en ratones. La permeabilidad pulmonar se evaluó 14 días después, un punto de tiempo correspondiente a la formación del NPM. Descubrimos que diferentes tipos de tumores inducían diferentes grados de fuga, con B16F10 y K7M2 mostrando una permeabilidad endotelial significativamente mayor que 4T1 y 67NR (Fig. 1a).
Fig. 1: Modelos ortotópicos de tumores y VPE derivadas de tumores inducen diferentes grados de fuga vascular en los pulmones.
a,b, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. a, Pulmones de ratones con tumores durante 14 días. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos incluyen 3, 11, 13, 9 y 11 imágenes para los pulmones de PBS, 4T1, 67NR, B16F10 y K7M2, respectivamente, de n = 1 para PBS y n = 4 ratones por grupo para los tumores, de un experimento independiente. Escala, 100 µm. b, Pulmones de ratones con tumores en diferentes puntos de tiempo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos incluyen 9, 15, 18 y 18 imágenes para PBS y pulmones a los 2 días, 4 días y 7 días, respectivamente, de n = 4, 6 y 5 ratones por grupo, respectivamente, en dos experimentos independientes. Escala, 100 µm. c, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) del peso tumoral (mg) en diferentes puntos de tiempo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos se obtuvieron de n = 4, 6 y 5 ratones a los 2 días, 4 días y 7 días, respectivamente, en dos experimentos independientes. Escala, 50 mm. d, Imagen de inmunofluorescencia representativa. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los tejidos pulmonares exhiben expresión de VE-caderina (verde) y dextrano (rojo) de n = 3 ratones, en un experimento independiente. Escala, 50 µm. e, Análisis de inmunofluorescencia y análisis estadístico asociado. Izquierda: los tejidos pulmonares exhiben expresión de vWF (cian) y dextrano (rojo), con tinción para DAPI (azul). Derecha: cuantificación del porcentaje de dextrano colocalizado con los vasos sanguíneos circundantes positivos para vWF. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos se obtuvieron de n = 5 ratones, en dos experimentos independientes. Escala, 20 µm. f, Análisis de inmunofluorescencia y análisis estadístico asociado. Izquierda: los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los tejidos pulmonares exhiben expresión de endomucina (verde), vWF (cian) y dextrano (rojo). Derecha: cuantificación del porcentaje de dextrano colocalizado con las arterias o venas circundantes. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos se obtuvieron de n = 7 ratones, en dos experimentos independientes. Escala, 20 µm. g, Imágenes representativas (izquierda y centro) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo), 1 h después de la administración de 10 µg de VPE de tumores B16F10 (izquierda) y tumores K7M2 (centro). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos incluyen 12 imágenes por grupo de n = 4 ratones, en dos experimentos independientes. Escala, 100 µm. h, Imágenes representativas (izquierda y centro) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo), 1 h después de la administración de 10 µg de VPE de diferentes líneas celulares. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos incluyen 22, 15, 18, 18 y 21 imágenes para los pulmones de 4T1, Melan-A, B16F10, osteoblastos y K7M2, respectivamente, de n = 2 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. Escala, 100 µm.
Datos fuente
A continuación, examinamos el punto de tiempo más temprano en el que se podía detectar cambios en la permeabilidad, que fue tan pronto como 2 días después de la implantación de B16F10. En particular, el aumento del volumen tumoral en puntos de tiempo posteriores no aumentó aún más la fuga vascular (Fig. 1b, c).
Nuestras observaciones también sugirieron una posible correlación entre la extravasación preferencial de dextrano de alto peso molecular alrededor de los vasos sanguíneos más grandes, en lugar de los microvasos, dentro del pulmón. Para investigar este fenómeno más a fondo, teñimos el tejido pulmonar de ratones con tumores ortotópicos durante 14 días para detectar el factor de von Willebrand (vWF), que se expresa fuertemente en el endotelio de las venas y las arterias, pero no en los capilares26, junto con la VE-caderina, que se expresa de manera homogénea en todo el endotelio pulmonar27 (Fig. 1d y Datos suplementarios extendidos Fig. 1a). Nuestros hallazgos revelaron que más del 80 % de la fuga se observó alrededor de los vasos sanguíneos más grandes que expresan vWF en lugar de los capilares (Fig. 1e).
Para investigar si la permeabilidad vascular se produce en las venas y/o las arterias, realizamos una tinción para endomucina, que se expresa en el endotelio venoso y capilar, pero no en la mayoría de los endotelios arteriales28. Observamos niveles similares de fuga de dextrano alrededor de las venas y las arterias en los pulmones de ratones con tumores B16F10 14 días después de la implantación del tumor (Fig. 1f). Este hallazgo indica que los macrovasos son susceptibles a la fuga vascular inducida por el tumor en las primeras etapas de la progresión del cáncer, lo que destaca el papel fundamental de la permeabilización vascular durante las etapas iniciales de la metástasis.
Anteriormente, demostramos que la fuga vascular se detecta en el pulmón 24 h después de la administración de VPE derivadas del melanoma B16f1029. Por lo tanto, examinamos los puntos de tiempo más tempranos en los que se podía observar la fuga vascular y encontramos una permeabilidad similar a la 1 h y a las 24 h después de la inyección de VPE (Datos suplementarios extendidos Fig. 1b). Dado que el intervalo de tiempo de 1 h nos permitiría investigar el efecto específico de la fuga vascular inducida por las VPE por separado de otros posibles efectos de las VPE (como el reclutamiento de células inmunitarias y el remodelado de la MEC), nos centramos en este punto de tiempo para una mayor investigación.
Para validar si las VPE tumorales podían inducir la permeabilidad vascular en un grado similar al observado en los ratones con tumores, aislamos las VPE de los explantes de tumores B16F10 y K7M2 y las administramos por vía retro-orbital en ratones no expuestos previamente. En 1 h, las VPE derivadas de los tumores B16F10 y K7M2 indujeron una fuga vascular significativa, comparable a la de los ratones con tumores (Fig. 1g). Para probar si las VPE derivadas de las células tumorales son el principal impulsor de la fuga vascular in vivo, utilizamos tumores deficientes en Rab27a, que carecen de un regulador clave de la biogénesis de las VPE30,31. Los tumores deficientes en Rab27a indujeron una fuga reducida a pesar de un tamaño tumoral similar (Datos suplementarios extendidos Fig. 1c). Para validar si las VPE derivadas de las células cancerosas son suficientes para inducir la fuga vascular, aislamos las VPE de múltiples líneas de células cancerosas y evaluamos su captación y efectos en el pulmón 1 h después de la inyección. Si bien todas las VPE se captaron en diferentes grados (Datos suplementarios extendidos Fig. 1d), solo las VPE de B16F10 y K7M2 aumentaron la fuga vascular, mientras que las VPE de 4T1, Melan-A y osteoblastos primarios no lo hicieron (Fig. 1h). De forma consistente, el medio de cultivo (CM) empobrecido en EVP no indujo permeabilidad vascular, lo que confirma que el efecto está mediado específicamente por los EVP (Figura ampliada 1e). Para excluir aún más la contribución de contaminantes solubles copurificados, los EVP derivados del tumor se purificaron mediante ultracentrifugación de gradiente de densidad de iodixanol32. Las fracciones enriquecidas en EVP se identificaron mediante microscopía electrónica de transmisión y Western blot (Figura ampliada 1f, g), y las fracciones 3-5 se seleccionaron para experimentos in vivo. Los EVP aislados mediante gradiente de densidad exhibieron una capacidad comparable para inducir fugas vasculares en relación con las preparaciones iniciales (Figura ampliada 1h), lo que confirma que los efectos vasculares observados están mediados por los EVP.
La fuga vascular aguda promueve la extravasación de células cancerosas y la metástasis pulmonar.
Tras observar un aumento de la permeabilidad vascular en el plazo de 1 hora tras la inyección de EVP, probamos si este proceso promueve la extravasación de células cancerosas y la metástasis pulmonar. Se inyectaron EVP que inducían diferentes niveles de fuga, seguidos, 1 hora después, de la inyección en la vena de la cola de las células tumorales correspondientes, y la metástasis se evaluó después de 14 días (Fig. 2a). Descubrimos que los EVP de B16F10 (alta fuga) aumentaron los focos metastásicos en comparación con PBS, mientras que los EVP de Melan-A (baja fuga) no tuvieron ningún efecto (Fig. 2b). Estos hallazgos se confirmaron utilizando células B16F10 que expresaban luciferasa, y la imagen de bioluminiscencia reprodujo la cuantificación histológica (Figura ampliada 2a-c). De manera similar, los EVP de K7M2 aumentaron los focos metastásicos, mientras que los EVP de 4T1 no lo hicieron (Fig. 2c). Para probar si la fuga inducida por EVP facilita la extravasación de modelos de baja fuga, se administraron EVP de K7M2 1 hora antes de la inyección de células 4T1. Esto aumentó las metástasis pulmonares de 4T1 en comparación con PBS, mientras que los EVP de 4T1 no tuvieron ningún efecto (Fig. 2d), lo que indica que la permeabilidad vascular inducida por EVP mejora el potencial metastásico.
Fig. 2: La fuga vascular aguda promueve la extravasación de células cancerosas y la metástasis pulmonar.
a, Ilustración esquemática del experimento. b, Imágenes representativas de los pulmones de ratón a las 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola de 50.000 células B16F10 (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) del número relativo de macrometástasis en comparación con PBS. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 9 ratones por grupo para PBS y B16F10 y n = 4 ratones para Melan-A en tres experimentos independientes. c. Imagen de inmunofluorescencia representativa del lóbulo pulmonar a las 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola con 300.000 células K7M2 y el análisis estadístico asociado del número relativo de metástasis en comparación con PBS. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul y las células K7M2 en rojo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 13, 7 y 12 ratones por grupo para PBS, 4T1 y K7M2, en tres experimentos independientes. Barra de escala, 500 µm. d, Tinción con H&E representativa de los pulmones de ratones después de la inyección en la vena de la cola con 50.000 células 4T1 durante 14 días y el análisis estadístico asociado del número de metástasis. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía, con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 4, 10 y 8 ratones por grupo para PBS, 4T1 y K7M2, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 800 µm. e, Ilustración esquemática del experimento de extravasación. f, Imagen de inmunofluorescencia representativa del tejido pulmonar del ratón 4 días después de la inyección en la vena de la cola de células B16F10 marcadas. Los tejidos pulmonares exhiben la expresión de CD31 (rojo) y células B16F10 (blanco). Los datos se obtuvieron de n = 5 ratones, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 5 µm. g, Cuantificación del porcentaje de células B16F10 (izquierda) o células 4T1 (derecha) que se extravasan en el tejido en relación con el recuento total de células. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos se obtuvieron de n = 5 y 4 ratones por grupo para los experimentos de B16F10 y 4T1, respectivamente, en dos experimentos independientes. h, Cuantificación del porcentaje de focos de células individuales o focos multicelulares en el tejido, en relación con el recuento total de células. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada. Los datos se obtuvieron de n = 9 y 4 ratones por grupo para los experimentos de B16F10 y 4T1, respectivamente, en dos experimentos independientes. Los paneles a y e se crearon en BioRender; Dror, S. https://biorender.com/r2y9ui3 (2026).
Datos fuente
Para confirmar que este efecto se debe a la permeabilidad vascular, se utilizó histamina como control positivo33 (Figura ampliada 2d). La histamina aumentó la metástasis en una medida similar a los EVP, sin que se observara un efecto aditivo cuando se combinaron los tratamientos (Figura ampliada 2e), lo que sugiere un mecanismo compartido. El antihistamínico bloqueó la permeabilidad inducida por histamina, pero no la inducida por EVP, lo que indica que los efectos de EVP son independientes de la histamina (Figura ampliada 2f). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el aumento de la permeabilidad vascular es suficiente para promover la metástasis y representa un proceso temprano impulsado por EVP.
Estudios previos mostraron que, tras la inyección en la vena de la cola, la mayoría de las células B16F10 se extravasan en los pulmones al cuarto día, mientras que las células no extravasadas probablemente mueren34,35. Para determinar si el aumento de la metástasis refleja una extravasación mejorada, las células tumorales se marcaron con un tinte citoplásmico antes de la inyección. El endotelio pulmonar se visualizó mediante la inyección retro-orbital del anticuerpo CD31-PE, seguida de la perfusión y la obtención de imágenes tridimensionales (3D) de todo el órgano36. Cuantificamos la proporción de células tumorales extravasadas en el parénquima pulmonar y los focos tumorales multicelulares en el día 4 (Fig. 2e, f y Figura ampliada 2g). Una sola dosis de EVP de B16F10 1 hora antes de la inyección de células tumorales aumentó significativamente la extravasación (Fig. 2g), mientras que los EVP de 4T1 no tuvieron ningún efecto. No se observó ninguna diferencia en los focos multicelulares entre los grupos tratados con PBS y EVP en ninguno de los modelos (Fig. 2h), lo que indica que la permeabilidad vascular, en lugar de una proliferación mejorada, impulsa principalmente la siembra metastásica.
Fig. 3: La fuga vascular pulmonar está mediada por las IM.
a-d, Los EVP derivados de B16F10 y K7M2 se marcaron con PKH67; PBS y solo el tinte sirvieron como controles. Los EVP (10 µg) se inyectaron retro-orbitalmente y, 1 hora después, se extrajeron los pulmones y se analizaron mediante citometría de flujo. a, Imagen representativa del análisis de citometría de flujo de las células EVP+ del total de células vivas. Los datos se obtuvieron de n = 5 ratones, en dos experimentos independientes. b, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células CD31+ EVP+ y células inmunitarias CD45+ EVP+ del total de células EVP+. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 5 y 7 ratones para B16F10 y K7M2, en tres experimentos independientes. c, Imagen representativa del análisis de inmunofluorescencia. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los tejidos pulmonares exhiben la expresión de VE-caderina (izquierda) y CD45 (derecha) (ambos en rojo), EVP (verde) y DAPI (azul). Los datos se obtuvieron de n = 3 ratones, de un experimento independiente. Barra de escala, 20 µm. d, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células EVP+ en diferentes poblaciones inmunitarias. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák (izquierda) y una prueba t no pareada con corrección de Welch (derecha) (IM/AM). Los datos se obtuvieron de n = 6 ratones para macrófagos, monocitos, IM y AM, n = 4 ratones para neutrófilos B16F10 y n = 5 ratones para neutrófilos K7M2, en tres experimentos independientes. e, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células EVP+ en diferentes subpoblaciones de IM. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 13 ratones, en tres experimentos independientes. f, Arriba, Ilustración esquemática del experimento in vitro de permeabilidad. Abajo, Efecto de los EVP de B16F10/PBS en la permeabilidad de los monocapas de HPAEC según un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 7 pocillos en dos experimentos independientes. g, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 23, 10, 8 y 9 imágenes para B16F10 (IgG, CSF1R) y K7M2 (IgG, CSF1R), respectivamente, de n = 3 ratones por grupo para B16F10 y n = 2 ratones por grupo para K7M2, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. h, Ilustración esquemática del experimento de depleción de IM. i, Imagen representativa de los pulmones de ratón 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola con células B16F10 (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 4 y 9 ratones en los grupos de PBS y EVP, respectivamente, en dos experimentos independientes. j, Imagen de inmunofluorescencia representativa del tejido pulmonar del ratón 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola con células K7M2 y el análisis estadístico asociado del número de metástasis. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul y las células K7M2 en rojo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 4 y 5 ratones en los grupos de IgG y CSF1R, respectivamente, en un experimento independiente. Barra de escala, 500 µm. k, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 16 y 15 imágenes para IgG y CSF1R, respectivamente, de n = 4 ratones por grupo en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. l, Peso tumoral (mg). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 4 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. m, Análisis de supervivencia de ratones precondicionados con EVP derivados de B16F10 seguido de la inyección intravenosa de células tumorales B16F10, con o sin depleción de IM. Los datos se obtuvieron de n = 10 ratones por grupo, en un experimento independiente. P = 0,0006 (Mantel-Cox). El panel h se creó en BioRender; Dror, S. https://biorender.com/a6p1rri (2026).
Datos fuente
Para comprender cómo los EVP aumentan la permeabilidad vascular, identificamos las poblaciones de células pulmonares que captan los EVP derivados del tumor. Se administraron EVP marcados con un tinte lipofílico de B16F10 o K7M2 por vía retro-orbital y las células pulmonares se evaluaron mediante citometría de flujo 1 hora después. Las células endoteliales CD31+ representaron aproximadamente el 30-40% de las células EVP+, mientras que las células inmunitarias CD45+ representaron aproximadamente el 60-70% (Fig. 3a, b y Figura ampliada 3a), según lo confirmado por inmunofluorescencia (Fig. 3c). Dado que la mayoría de los EVP fueron captados por las células inmunitarias, caracterizamos aún más las poblaciones inmunitarias que captaron los EVP en el pulmón (Fig. 3d y Figura ampliada 3b). Entre las poblaciones inmunitarias, los monocitos F4/80+ representaron aproximadamente el 40% y los macrófagos el 20% de la captación de EVP (Fig. 3d y Figura ampliada 3b). Dentro de los macrófagos, las IM CD11B+CD64+MerTK+CD11C−LY6C−37 representaron aproximadamente el 70% de la captación de EVP, mientras que los macrófagos alveolares (AM) CD11C+CD64+MerTK+CD11B−LY6C−37 contribuyeron al resto. Los neutrófilos (CD11B+LY6G+)38 representaron una pequeña fracción (Fig. 3d).
Fig. 3: La fuga vascular pulmonar está mediada por las IM.
a-d, Los EVP derivados de B16F10 y K7M2 se marcaron con PKH67; PBS y solo el tinte sirvieron como controles. Los EVP (10 µg) se inyectaron retro-orbitalmente y, 1 hora después, se extrajeron los pulmones y se analizaron mediante citometría de flujo. a, Imagen representativa del análisis de citometría de flujo de las células EVP+ del total de células vivas. Los datos se obtuvieron de n = 5 ratones, en dos experimentos independientes. b, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células CD31+ EVP+ y células inmunitarias CD45+ EVP+ del total de células EVP+. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 5 y 7 ratones para B16F10 y K7M2, en tres experimentos independientes. c, Imagen representativa del análisis de inmunofluorescencia. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los tejidos pulmonares exhiben la expresión de VE-caderina (izquierda) y CD45 (derecha) (ambos en rojo), EVP (verde) y DAPI (azul). Los datos se obtuvieron de n = 3 ratones, de un experimento independiente. Barra de escala, 20 µm. d, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células EVP+ en diferentes poblaciones inmunitarias. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák (izquierda) y una prueba t no pareada con corrección de Welch (derecha) (IM/AM). Los datos se obtuvieron de n = 6 ratones para macrófagos, monocitos, IM y AM, n = 4 ratones para neutrófilos B16F10 y n = 5 ratones para neutrófilos K7M2, en tres experimentos independientes. e, Análisis de citometría de flujo de los porcentajes de células EVP+ en diferentes subpoblaciones de IM. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 13 ratones, en tres experimentos independientes. f, Arriba, Ilustración esquemática del experimento de permeabilidad in vitro. Abajo, Efecto de los EVP de B16F10/PBS en la permeabilidad de los monocapas de HPAEC según un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 7 pocillos en dos experimentos independientes. g, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 23, 10, 8 y 9 imágenes para B16F10 (IgG, CSF1R) y K7M2 (IgG, CSF1R), respectivamente, de n = 3 ratones por grupo para B16F10 y n = 2 ratones por grupo para K7M2, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. h, Ilustración esquemática del experimento de depleción de IM. i, Imagen representativa de los pulmones de ratón 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola con células B16F10 (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Los datos se obtuvieron de n = 4 y 9 ratones en los grupos de PBS y EVP, respectivamente, en dos experimentos independientes. j, Imagen de inmunofluorescencia representativa del tejido pulmonar del ratón 2 semanas después de la inyección en la vena de la cola con células K7M2 y el análisis estadístico asociado del número de metástasis. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul y las células K7M2 en rojo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 4 y 5 ratones en los grupos de IgG y CSF1R, respectivamente, en un experimento independiente. Barra de escala, 500 µm. k, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 16 y 15 imágenes para IgG y CSF1R, respectivamente, de n = 4 ratones por grupo en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. l, Peso tumoral (mg). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 4 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. m, Análisis de supervivencia de ratones precondicionados con EVP derivados de B16F10 seguido de la inyección intravenosa de células tumorales B16F10, con o sin depleción de IM. Los datos se obtuvieron de n = 10 ratones por grupo, en un experimento independiente. P = 0,0006 (Mantel-Cox). El panel h se creó en BioRender; Dror, S. https://biorender.com/a6p1rri (2026). Cabe destacar que IM1 e IM2 son macrófagos residentes en el tejido, localizados cerca de los vasos sanguíneos grandes, lo que concuerda con los sitios de permeabilidad vascular (Fig. 1e), mientras que IM3 deriva de monocitos y se encuentra en el parénquima37,39, lo que sugiere un papel de los IM residentes en la mediación de la permeabilidad. Dado que las células endoteliales y las células inmunitarias constituyen las poblaciones principales que captan las EVPs en el pulmón, nuestro objetivo fue identificar el tipo de célula específico responsable de alterar la barrera endotelial. Para ello, realizamos un ensayo de permeabilidad in vitro utilizando células endoteliales pulmonares primarias. El tratamiento directo con EVPs de B16F10 no alteró la permeabilidad endotelial (Fig. 3f); por lo tanto, las EVPs no afectan a las células endoteliales directamente. A continuación, probamos la necesidad de las poblaciones inmunitarias mediante el agotamiento selectivo. Los macrófagos alveolares (AM) se agotaron utilizando liposomas de clodronato, los IM se agotaron utilizando anti-CSF1R, los neutrófilos se agotaron utilizando anti-Ly6G y los monocitos se agotaron utilizando anti-Ly6C, y la eficiencia del agotamiento se confirmó mediante citometría de flujo (Fig. 3d del material suplementario). El agotamiento de los AM o los neutrófilos no tuvo ningún efecto sobre la permeabilidad inducida por las EVPs (Fig. 4a del material suplementario). En cambio, el agotamiento de los IM con anti-CSF1R redujo significativamente la permeabilidad vascular (>80% B16F10, >55% K7M2; Fig. 3g). Si bien el agotamiento de monocitos redujo la permeabilidad vascular (23%), el efecto fue notablemente menos pronunciado en comparación con el agotamiento de los IM (Fig. 3g y Fig. 4a del material suplementario). Por lo tanto, concluimos que, aunque los monocitos reclutados contribuyen a la inducción de la permeabilidad vascular, los IM desempeñan un papel más importante en la regulación de la permeabilidad vascular. Por lo tanto, nos centramos en nuestros estudios mecanicistas en la población de IM. Para evaluar si la permeabilidad dependiente de los IM impulsa la metástasis, agotamos los IM antes de la inyección de EVPs y células tumorales (Fig. 3h). El agotamiento de los IM redujo la carga metastásica en aproximadamente un 50% en ambos modelos (Fig. 3i, j). En un modelo tumoral ortotópico, el tratamiento con anti-CSF1R cada dos días durante 10 días redujo la permeabilidad vascular sin afectar el crecimiento del tumor primario (Fig. 3k, l). El agotamiento de los IM también prolongó significativamente la supervivencia tras la administración de EVPs y células tumorales (Fig. 3m). La captación de EVPs no afectó a la proliferación o la fagocitosis de los IM (Fig. 4b, c del material suplementario). Para determinar si los macrófagos sensibles a las EVPs eran residentes en el tejido o derivados de monocitos, evaluamos la expresión de CCR2 en los macrófagos EVP+. En condiciones basales, CCR2 se expresa principalmente en los monocitos circulantes y en el subconjunto IM3, que deriva de los monocitos reclutados, mientras que IM1 e IM2 son macrófagos residentes en el tejido, de larga duración y CCR2−37,40. Coherente con nuestro análisis de captación, las EVPs se internalizaron predominantemente en las poblaciones IM1 e IM2 CCR2− (Fig. 4d del material suplementario), lo que indica que los macrófagos sensibles a las EVPs son residentes en el tejido en lugar de ser reclutados recientemente. Estos datos sugieren que las EVPs derivadas del tumor reprograman directamente los IM residentes sin inducir su expansión o reclutamiento.
La secreción de IL-6 por los IM mejora la permeabilidad vascular.
La permeabilidad vascular inducida por las EVPs se produjo predominantemente en los vasos grandes vWF+ (Fig. 1e). Los IM residen en el espacio intersticial entre el endotelio y el epitelio40. Cabe destacar que el análisis de inmunofluorescencia reveló que los IM se localizaban con frecuencia cerca de los vasos vWF+, mientras que los monocitos se encontraban más distales (Fig. 4a y Fig. 5a del material suplementario), lo que sugiere una señalización paracrina entre los IM y las células endoteliales40.
Fig. 4: La secreción de IL-6 por los IM mejora la permeabilidad vascular.
a, Análisis de inmunofluorescencia de secciones de pulmón teñidas con vWF (rojo), CSF1R (cian), F4/80 (verde), marcador de monocitos Ly6C (blanco) y DAPI (azul). Las flechas blancas indican los IM (células F4/80+CSF1R+Ly6C−) localizados en estrecha proximidad a los vasos positivos para vWF. Las flechas amarillas indican los monocitos (células F4/80+Ly6C+) que se localizan más lejos de los vasos sanguíneos. Los datos se obtuvieron de n = 3 ratones, de un experimento independiente, escala, 50 µm. b, El efecto del secretoma de B16F10 tratado con IM sobre la permeabilidad de los monocapas de HPAEC evaluado mediante un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 3 experimentos independientes, con tres pocillos por grupo. c, GSEA de los genes expresados diferencialmente comunes utilizando conjuntos de genes Hallmark, que muestra las vías de señalización que cambian significativamente con una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,1. NES, puntuación de enriquecimiento normalizada. d, Análisis de la matriz de citocinas del secretoma de los IM 3 h después del tratamiento con EVPs de B16F10/K7M2/4T1 o PBS. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía. Los datos del secretoma se obtuvieron de los IM aislados de cuatro ratones diferentes y se combinaron en un único experimento. e, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo determinada por la aparición de dextrano inyectado por vía intravenosa (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Para B16F10, los datos se obtuvieron de 38, 16 y 14 imágenes para IgG, IL-6 y CXCL2, respectivamente, de n = 8 ratones para IgG y n = 4 ratones para IL-6 y CXCL2, en dos experimentos independientes. Para K7M2, los datos se obtuvieron de 30, 27 y 12 imágenes para IgG, IL-6 y CXCL2, respectivamente, de n = 8 ratones para IgG y IL-6 y n = 4 ratones para CXCL2, en dos experimentos independientes. Escala, 100 µm. f, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo tras la inyección intraperitoneal de 500 nM de proteína IL-6. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de tres y diez imágenes para PBS e IL-6, respectivamente, con n = 1 ratón por grupo de PBS y n = 3 ratones por grupo de IL-6, de un experimento independiente. Escala, 100 µm. g, Efecto de la proteína recombinante de IL-6 (40 nM) sobre la permeabilidad de los monocapas de HPAEC evaluado mediante un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Para el grupo de PBS y el grupo de IL-6, n = 13 pocillos, en tres experimentos independientes. h, Análisis de inmunofluorescencia de las células HPAEC teñidas con ZO1 (cian), VE-cadherina (verde) y DAPI (azul). Las células HPAEC se trataron con 40 nM de IL-6 (izquierda) y secretoma de IM (derecha) durante 1 h. Los datos se obtuvieron de n = 3 pocillos en un experimento independiente. Escala, 20 µm. i, Imagen representativa de los pulmones de ratón a las 2 semanas después de la inyección en la cola de 50 000 células B16F10 (izquierda) y análisis estadístico asociado para el número de metástasis (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 14 ratones por grupo, en tres experimentos independientes. j, Imagen de inmunofluorescencia representativa del lóbulo pulmonar a las 2 semanas después de la inyección en la cola de 300 000 células K7M2 (izquierda) y análisis estadístico asociado para el número relativo de metástasis (derecha). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul y las células K7M2 aparecen en rojo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 8 ratones para IgG y n = 9 ratones para IL-6, en dos experimentos independientes. Escala, 500 µm. Datos fuente.
Para probar si los factores derivados de los IM median la permeabilidad, se aislaron los IM y se trataron con EVPs de B16F10 (1 µg/ml, 3 h) y su CM se aplicó a las células endoteliales. El CM de los IM tratados con EVPs aumentó significativamente la permeabilidad de las células endoteliales en comparación con el CM de control (Fig. 4b). De manera similar, el CM de los IM tratados con EVPs de K7M2 aumentó la permeabilidad en relación con los IM tratados con EVPs de 4T1 (Fig. 5b del material suplementario), lo que indica una reprogramación de los IM específica del tumor.
Para identificar los cambios funcionales de los IM que se producen en respuesta a la captación de EVPs, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en los IM EVP+ activados por flujo ex vivo (Tabla suplementaria 1). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló un enriquecimiento de las vías IL-6–JAK–STAT3, inflamatorias y TNF–NF-κB (Fig. 4c, Fig. 5c del material suplementario y Tabla suplementaria 2). De manera consistente, los IM EVP+ redujeron la expresión de los genes asociados a M2 (Cd206, Retnla, Egr1 y Cd163) y mantuvieron o aumentaron la expresión de los marcadores M1 (Cd40, Cd86, Gpr18 y Cd68), lo que indica un cambio hacia un estado proinflamatorio (Fig. 5d del material suplementario).
Para identificar las citocinas efectoras, nos propusimos identificar las citocinas específicas inducidas en los IM por la captación de EVPs, realizando un ensayo de matriz de citocinas y midiendo la expresión de ARN. En comparación con las EVPs de 4T1, las EVPs de B16F10 y K7M2 aumentaron la secreción de IL-6, CXCL2, CCL3 y TNF (Fig. 4d, Fig. 5e del material suplementario). De manera consistente, las EVPs que no inducen permeabilidad (4T1 y Melan-A) no alteraron la expresión de ARNm de las citocinas, mientras que las EVPs de B16F10 y K7M2 aumentaron significativamente los transcritos de IL-6, CXCL2, CCL3 y TNFα en los IM (Fig. 5f del material suplementario). La inducción de citocinas fue detectable a la 1 h y aumentó a las 3 h, lo que indica una activación transcripcional rápida (Fig. 5g del material suplementario).
Para evaluar la relevancia funcional de la regulación de las citocinas, se trató a los ratones con anticuerpos neutralizantes antes de la administración de EVPs. La neutralización de CCL3 o TNF no tuvo ningún efecto, mientras que la neutralización de CXCL2 redujo la permeabilidad solo en el modelo de B16F10. En cambio, la neutralización de IL-6 redujo significativamente la permeabilidad vascular en los modelos de B16F10 y K7M2 (Fig. 4e y Fig. 5h del material suplementario), lo que identificó a IL-6 como un mediador clave.
Se ha establecido que la capacidad de IL-6 para inducir la permeabilidad vascular in vitro e in vivo41,42. De hecho, la IL-6 recombinante aumentó la permeabilidad vascular in vivo y en las células endoteliales de la arteria pulmonar humana (HPAEC) (Fig. 4f, g) y alteró la organización de la VE-cadherina y la ZO1 de forma similar al CM de los IM tratados con EVPs (Fig. 4h). En particular, la administración de IL-6 restauró la permeabilidad vascular en los ratones con IM agotados (Fig. 5i del material suplementario), lo que indica que IL-6 actúa aguas abajo de la activación de los IM y aguas arriba de la disfunción endotelial. Por último, la neutralización de IL-6 redujo significativamente la metástasis inducida por las EVPs en ambos modelos (Fig. 4i, j), lo que demuestra que la IL-6 derivada de los IM es necesaria para la permeabilidad vascular y la siembra metastásica.
ITGα5 en las EVPs induce la permeabilidad vascular y la metástasis.
Aunque las EVPs de diferentes líneas celulares tumorales se captaron de forma similar en el pulmón (Fig. 1d del material suplementario), solo las EVPs de líneas celulares específicas, como B16F10 y K7M2, indujeron la permeabilidad vascular (Fig. 1h). Para identificar la carga que induce la permeabilidad, realizamos espectrometría de masas (MS) en las EVPs de B16F10, K7M2, 4T1 y Melan-A (Tabla suplementaria 3). El análisis de vías de las proteínas compartidas por las EVPs que inducen una alta permeabilidad vascular (B16F10 y K7M2) en comparación con las EVPs que inducen una baja permeabilidad vascular (Melan-A y 4T1) reveló un enriquecimiento de las vías relacionadas con la adhesión, incluidas las uniones adherentes y las interacciones célula-matriz (Fig. 5a y Tabla suplementaria 4). Por lo tanto, nos centramos en el análisis de las proteínas de adhesión enriquecidas en las EVPs que inducen la permeabilidad8,43.
Fig. 5: ITGα5 en las EVPs induce la permeabilidad vascular y la metástasis.
a, Análisis de vías de las proteínas compartidas entre las EVPs de B16F10 y K7M2 y ausentes en las EVPs de Melan-A y 4T1. b, Análisis de Western blot de ITGα5 en las EVPs de diferentes líneas celulares cancerosas. CD9 se utilizó como control de carga. Los datos se obtuvieron de n = 2 experimentos independientes. c, Análisis de Western blot de la expresión de ITGα5 en las EVPs de B16F10 y K7M2 derivadas de células de control o ITGα5-KO. Los datos se obtuvieron de n = 2 experimentos independientes. d, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con corrección de Welch. Para B16F10, los datos se obtuvieron de 19 y 31 imágenes para las células de control y ITGα5-KO, respectivamente, con n = 6 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. Para K7M2, los datos se obtuvieron de 28 y 29 imágenes para las células de control y ITGα5-KO, respectivamente, con n = 6 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. Escala, 100 µm. e, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para B16F10, los datos se obtuvieron de 11 imágenes para cada grupo, con n = 4 ratones por grupo, en un experimento independiente. f, Efecto de los EVPs de control y ITGα5-KO sobre la permeabilidad de monocapas de HPAEC, evaluado mediante un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Šídák. Para B16F10, los datos se obtuvieron de n = 10, 10 y 11 pocillos para PBS, control y células ITGα5-KO, en tres experimentos independientes. Para K7M2, los datos se obtuvieron de n = 12, 16 y 14 pocillos para PBS, control y células ITGα5-KO, en tres experimentos independientes. g, Cuantificación del porcentaje de células B16F10 que se extravasan en el tejido en relación con el recuento total de células, tras la exposición a EVPs de control e ITGα5-KO. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t bilateral no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 6 ratones de control y n = 4 ratones ITGα5-KO, en dos experimentos independientes. h, Imágenes representativas de los pulmones de ratón a las 2 semanas después de la inyección intravenosa de 50.000 células B16F10 (izquierda) y el análisis estadístico asociado para el número de metástasis (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 11 ratones para el control y n = 12 ratones para las células ITGα5-KO, en tres experimentos independientes. i, Imágenes de fluorescencia representativas del lóbulo pulmonar a las 2 semanas después de la inyección intravenosa con 300.000 células K7M2 (izquierda) y el análisis estadístico asociado para el número relativo de metástasis (derecha). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul y las células K7M2 en rojo. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 15 ratones para el control KO y n = 13 ratones para ITGα5 KO, en tres experimentos independientes. Barra de escala, 500 µm. j, Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 37 y 35 imágenes para el control y la sobreexpresión de ITGα5 (OE), con n = 6 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. k, Análisis RT-PCR de IMs después del tratamiento con EVPs de control y ITGα5 OE 67NR. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t pareada. Los datos se obtuvieron de n = 6 pocillos por grupo, en tres experimentos independientes. l, Tinción representativa con H&E de los pulmones de ratones después de la inyección intravenosa con 100.000 células 67NR durante 21 días y el análisis estadístico asociado para el número de metástasis. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 14 ratones por grupo, en tres experimentos independientes. Barra de escala, 1 mm. m, Imágenes representativas de los tumores de ratón a las 4 semanas después de la inyección intratibial de 1 × 106 células K7M2 (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 10 ratones para el control y n = 8 ratones para las células ITGα5-KO, en un experimento independiente. Barra de escala, 2 mm. n, Imágenes representativas con H&E de los pulmones de ratón a las 4 semanas después de la inyección intratibial de 1 × 106 células K7M2 (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 9 ratones para el control y n = 8 ratones para las células ITGα5-KO, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 2 mm. Datos fuente. Para determinar qué proteína(s) de los EVPs están implicadas en la permeabilidad vascular, primero comparamos la expresión de proteínas de adhesión conocidas del conjunto de genes de adhesión GSEA con las proteínas de adhesión identificadas en nuestros resultados de MS (Tabla suplementaria 5). CDH2, NCAM1 e ITGα5 se expresaron en gran medida en los EVPs de B16F10 y K7M2, pero en bajo grado o estaban ausentes en los controles (Figura de datos extendidos 6a). La tinción de Western confirmó su enriquecimiento en los EVPs que inducen fugas (Figura 5b y Figura de datos extendidos 6b). Para evaluar la función, se redujo la expresión de CDH2 y se eliminó la expresión de NCAM1 e ITGα5 en las células tumorales, y se confirmó la reducción eficiente en las células y los EVPs (Figura 5c y Figura de datos extendidos 6c). Si bien la reducción de la expresión de CDH2 o NCAM1 no tuvo ningún efecto (Figura de datos extendidos 6d), la pérdida de ITGα5 redujo significativamente la fuga vascular pulmonar inducida por los EVPs de B16F10 y K7M2 (Figura 5d). Es importante destacar que la pérdida de ITGα5 no afectó a las características de los EVPs, incluidos los marcadores (Figura de datos extendidos 6e), la morfología (Figura de datos extendidos 6f), la distribución del tamaño y el número (Figura de datos extendidos 6g) y la captación por las células pulmonares, incluidas las IMs (Figura de datos extendidos 6h, i). Para evaluar si la captación de EVPs dependía de las interacciones integrina-fibronectina, pretratamos los EVPs con un péptido RGD sintético, que bloquea la unión del ligando por varias integrinas que reconocen RGD, incluido ITGα5 (ref. 44). El tratamiento con RGD no tuvo ningún efecto sobre la captación total de EVPs en el pulmón ni sobre la proporción de IMs positivas para EVPs, lo que indica que la internalización de los EVPs no depende de las interacciones de los ligandos que se unen a RGD (Figura de datos extendidos 7a). Para explorar qué integrinas asociadas a los EVPs podrían facilitar la captación pulmonar, analizamos ITGα3 e ITGα4, que se enriquecieron de forma diferente en los EVPs derivados de varias líneas celulares tumorales y se unen a secuencias de ligandos que no son RGD en la laminina y la fibronectina, respectivamente45,46. ITGα3 e ITGα4 contribuyeron a la captación de EVPs, ya que su pérdida redujo la captación pulmonar sin afectar a la permeabilidad (Figura de datos extendidos 7b-e). Estos datos sugieren que ITGα5 es necesario para la señalización posterior y no para la administración de los EVPs. Además, la implantación ortotópica de tumores B16F10 deficientes en ITGα5 no alteró el crecimiento del tumor primario, pero redujo significativamente la fuga vascular pulmonar (Figura 5e y Figura de datos extendidos 7f). Los EVPs que carecían de ITGα5 también mostraron una permeabilidad reducida in vitro (Figura 5f), una disminución de la extravasación de células tumorales (Figura 5g) y una reducción de la carga metastásica en ambos modelos (Figura 5h, i). Por el contrario, la sobreexpresión de ITGα5 en las células 67NR (que son poco metastásicas e inducen una permeabilidad vascular mínima (Figura 1a)) aumentó la ITGα5 de los EVPs (Figura de datos extendidos 7g), mejoró la permeabilidad vascular (Figura 5j) e indujo la expresión de ARNm de IL-6 en las IMs (Figura 5k), lo que aumentó la metástasis pulmonar (Figura 5l). En un modelo de educación ortotópica, el precondicionamiento con EVPs deficientes en ITGα5 redujo la metástasis a pesar de aumentar el peso del tumor primario (Figura 5m, n), lo que apoya aún más el papel de la ITGα5 asociada a los EVPs en la progresión metastásica. Estos datos sugieren que los EVPs tumorales enriquecidos con ITGα5 son necesarios y suficientes para inducir la permeabilidad vascular pulmonar, facilitar la extravasación de las células tumorales y, por lo tanto, promover la metástasis.
ITGα5 en los EVPs induce la fuga vascular a través de la activación de la señalización de NF-κB
Para validar aún más el papel de ITGα5 en la fuga vascular, los EVPs se pretrataron con el inhibidor específico de ITGα5, el derivado peptídico estable AV347. La eficacia de la inhibición se confirmó mediante la reducción de la unión de los EVPs marcados con fluorescencia a los pocillos recubiertos con fibronectina (Figura de datos extendidos 8a), lo que es consistente con los informes anteriores48. AV3 no afectó a la captación de EVPs en el pulmón ni a la captación por los subconjuntos inmunitarios, incluidas las IMs (Figura de datos extendidos 8b-d), lo que confirma que ITGα5 funciona en la señalización posterior y no en la internalización.
Figura 6: ITGα5 en los EVPs induce la fuga vascular a través de la activación de la señalización de NF-κB.
a, b. Imágenes representativas (izquierda) y análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo después del tratamiento con EVPs con AV3. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para B16F10, los datos se obtuvieron de 8 y 11 imágenes para el control y el inhibidor, con n = 3 ratones por grupo. Para K7M2, los datos se obtuvieron de 11 y 12 imágenes para el control y el inhibidor, con n = 3 ratones por grupo. Para SK-192, los datos se obtuvieron de 16 y 19 imágenes para el control y el inhibidor, con n = 5 ratones por grupo, en dos experimentos independientes. Barra de escala, 100 µm. c, Efecto de AV3, un inhibidor de ITGα5, sobre la permeabilidad de las monocapas de HPAEC según un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para K7M2, los datos se obtuvieron de n = 13 y 15 pocillos para el control y AV3, en cuatro experimentos independientes. Para SK-192, los datos se obtuvieron de n = 10 pocillos por grupo en tres experimentos independientes. d, GSEA de los genes expresados diferencialmente comunes utilizando conjuntos de genes Hallmark, que muestra las vías de señalización que cambian significativamente con FDR < 0,1. e, Análisis RT-PCR de IMs tratadas con EVPs de control o ITGα5-KO de células B16F10 y K7M2 durante 3 h. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t pareada. Para CXCL2, los datos se obtuvieron de n = 5 pocillos por grupo, en dos experimentos independientes. Para IL-6, los datos se obtuvieron de n = 6 pocillos para el control B16F10 y n = 5 pocillos para B16F10 KO y células K7M2, en dos experimentos independientes. f, Cantidad normalizada de IL-6 secretada en el medio de macrófagos, tras el tratamiento con EVPs con AV3. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para K7M2, los datos se obtuvieron de n = 10 y 12 pocillos para el control y AV3, en cuatro experimentos independientes. Para SK-192, los datos se obtuvieron de n = 8 y 9 pocillos para el control y AV3, en tres experimentos independientes. g, Análisis de Western blot de p-IKKβ/α y p-STAT3, a los 10 min, 30 min, 1 h, 2 h y 4 h después del tratamiento con 5 µg ml−1 de EVPs de K7M2 (izquierda) y la cuantificación respectiva (derecha). IKKβ, STAT3 y β-actina se utilizaron como controles de carga. Los datos se obtuvieron de un experimento independiente. h, Análisis de Western blot de p-IKKβ/α tras el tratamiento de EVPs de K7M2 y SK-MEL-192 con el inhibidor AV3 (izquierda) y la cuantificación correspondiente (derecha). IKKβ y β-actina se utilizaron como controles de carga. Los datos representan la media ± SEM. Los datos se obtuvieron de dos experimentos independientes. i, Análisis de inmunofluorescencia de macrófagos humanos 2 h después del tratamiento con EVPs de K7M2, que muestra la expresión de p65 (rojo). Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Barra de escala, 20 µm. Los datos se obtuvieron de dos experimentos independientes. j, Luminiscencia relativa en el CM de las células reporteras THP-1 Lucia (NF-κB) tras el tratamiento con EVPs. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 4 pocillos, en dos experimentos independientes. k, Concentración de IL-6 secretada (pg ml−1) en el medio de macrófagos después del tratamiento con EVPs. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para PBS y B16F10, los datos se obtuvieron de n = 6 pocillos, en tres experimentos independientes. Para K7M2 y SK-MEL-192, los datos se obtuvieron de n = 4 pocillos en dos experimentos independientes. l, Efecto de TPCA-1, un inhibidor de NF-κB, sobre la permeabilidad de las monocapas de HPAEC según un ensayo de permeabilidad in vitro. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Para PBS y B16F10, los datos se obtuvieron de n = 6 y 5 pocillos por grupo, en dos experimentos independientes. Para SK-MEL-192 y K7M2, los datos se obtuvieron de n = 13 y 11 pocillos por grupo, en tres experimentos independientes. Datos fuente.
Para evaluar la relevancia humana, utilizamos EVPs de melanoma humano SK-Mel-192, que expresan ITGα5 (Figura de datos extendidos 8e). Estos EVPs indujeron la fuga vascular en ratones, que se redujo tras el tratamiento con AV3 (Figura 6b). AV3 por sí solo no tuvo ningún efecto sobre la secreción de IL-6 (Figura de datos extendidos 8f). 8f), excluyendo los efectos directos sobre los macrófagos. A continuación, tratamos macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con EVP ± AV3 y aplicamos su CM a las células endoteliales (CE). Si bien los EVP de control aumentaron la permeabilidad, el CM de los macrófagos expuestos a los EVP tratados con AV3 redujo la permeabilidad endotelial (Fig. 6c), lo que indica que la inhibición de ITGα5 puede reducir la permeabilidad endotelial inducida por los EVP de tumores humanos. A continuación, nuestro objetivo fue definir los mecanismos a través de los cuales ITGα5 controla la permeabilidad vascular. Realizamos un análisis de ARN-seq de células inmunitarias del pulmón (IM) tratadas durante 3 h con EVP con o sin ITGα5 (KO) o EVP de control, ya sea de B16F10 o de K7M2 (Tabla suplementaria 6). GSEA arrojó resultados consistentes en ambos modelos; ITGα5 es necesario para la activación de IL-6–STAT3, TNF–NF-κB y vías inflamatorias (Fig. 6d, Fig. 8g,h de los datos ampliados y Tabla suplementaria 7), lo que coincide con los datos in vivo (Fig. 4c). La transcripción inversa (RT)–PCR confirmó la reducción de la expresión de IL-6 y CXCL2 tras la pérdida de ITGα5 (Fig. 6e). De manera similar, el tratamiento con AV3 redujo la secreción de IL-6 de los macrófagos humanos (Fig. 6f). El análisis de la red de regulación génica identificó factores de transcripción relacionados con NF-κB entre los principales reguladores (Tabla suplementaria 8). De manera consistente, el tratamiento con EVP aumentó la fosforilación de IKKβ, seguido de la activación de STAT3 (Fig. 6g), lo que sugiere una activación secuencial de NF-κB–STAT3. La inhibición de ITGα5 redujo los niveles de p-IKKβ, la translocación nuclear de p65 (Fig. 6h,i) y la actividad del reportero de NF-κB (Fig. 6j), lo que indica que ITGα5 impulsa la activación de NF-κB. La inhibición farmacológica de NF-κB (TPCA-1) redujo notablemente la secreción de IL-6 (Fig. 6k) y disminuyó la permeabilidad endotelial cuando el CM de los macrófagos tratados con EVP se aplicó a las CE (Fig. 6l). En conjunto, estos hallazgos demuestran que ITGα5 activa la señalización de NF-κB en los macrófagos, lo que conduce a la activación de STAT3, la secreción de IL-6 y la permeabilidad vascular. Los EVP derivados de tumores de cáncer colorrectal promueven el aumento de ITGα5, la secreción de IL-6 y la permeabilidad vascular. Para evaluar la relevancia clínica, analizamos los conjuntos de datos de The Cancer Genome Atlas y descubrimos que una alta expresión de ITGα5 se asoció con una peor supervivencia general en múltiples tipos de cáncer, incluido el cáncer colorrectal (Fig. 9a de los datos ampliados). Coherente con estos datos, los EVP de la línea celular de cáncer colorrectal murino CT26, derivados de explantes tumorales o células cultivadas, expresaron ITGα5 e indujeron fugas vasculares in vivo (Fig. 7a,b).
Fig. 7: Los EVP derivados de tumores de cáncer colorrectal promueven el aumento de ITGα5, la secreción de IL-6 y la permeabilidad vascular.
Imagen completa.
a, Análisis de Western blot de la expresión de ITGα5 en EVP derivados de células de cáncer colorrectal CT26 y explantes de tejido tumoral. CD9 se utilizó como control de carga. Los datos se obtuvieron de un experimento independiente. b, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos incluyen 13 imágenes por grupo, de n = 3 ratones por grupo, de un experimento independiente. PBS se utilizó como control. c, Análisis de Western blot de ITGα5 en EVP de 24 tumores de cáncer colorrectal (negro) y tejidos adyacentes (rojo). Alix se utilizó como control de carga. Los datos se obtuvieron de un experimento independiente. d, Expresión relativa de ITGα5 del análisis de Western blot en la Fig. 7c. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 25 muestras en cada grupo, de un experimento independiente. e, Concentración de IL-6 en el medio de macrófagos humanos tras el tratamiento con EVP de muestras de cáncer colorrectal (tumor y tejido adyacente). Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 25 muestras en cada grupo, en un experimento independiente, con n = 2 pocillos por grupo en el experimento. f, Imágenes representativas (izquierda) y el análisis estadístico asociado (derecha) de la permeabilidad vascular in vivo. Los núcleos teñidos con DAPI aparecen en azul. Se realizó un análisis estadístico de la permeabilidad vascular in vivo de ratones tratados con EVP de tumor o tejido adyacente. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de 16 y 17 imágenes para el tejido adyacente y el tejido tumoral, de n = 4 EVP, en un experimento independiente. Debido a la falta de material, se inyectaron 1 μg de EVP por ratón. g, Análisis estadístico de la permeabilidad vascular in vitro de CE tratadas con CM de macrófagos humanos expuestos a EVP de tumor o tejido adyacente de cáncer colorrectal. Los datos representan la media ± SEM, analizados mediante una prueba t no pareada con la corrección de Welch. Los datos se obtuvieron de n = 15 y 13 pocillos para cuatro tejidos adyacentes y tumores, en un experimento independiente. h. Modelo de permeabilidad vascular mediada por EVP en los pulmones. Los EVP derivados de tumores que expresan ITGα5 se dirigen a las IM en el pulmón. Esta captación estimula la secreción de la citocina IL-6, que, a su vez, aumenta la permeabilidad de las CE. Este aumento de la permeabilidad facilita la extravasación de las células cancerosas y, en última instancia, promueve la metástasis. Creado en BioRender; Dror, S. https://biorender.com/4csl597 (2026).
Datos de origen.
A continuación, examinamos una cohorte de 25 participantes con cáncer colorrectal (estadios 2-4) (Tabla suplementaria 9), aislando EVP de tumores primarios y tejidos adyacentes correspondientes. Ambas fuentes tenían marcadores canónicos de EVP (CD81 y CD9) (Fig. 9b de los datos ampliados), con perfiles de tamaño y concentración similares (Fig. 9c de los datos ampliados). Sin embargo, los EVP derivados de tumores exhibieron una mayor expresión de ITGα5 (Fig. 7c,d). Funcionalmente, los EVP derivados de tumores indujeron una secreción de IL-6 significativamente mayor en los macrófagos que los EVP de tejido adyacente (Fig. 7e). In vivo, los EVP de tumores de cáncer colorrectal, pero no los EVP de tejidos adyacentes correspondientes, aumentaron la fuga vascular en ratones inmunodeprimidos (Fig. 7f). De manera consistente, el CM de macrófagos tratados con EVP derivados de tumores aumentó la permeabilidad endotelial, mientras que los EVP derivados de tejidos adyacentes no tuvieron ningún efecto (Fig. 7g).
En conjunto, nuestros hallazgos indican que, si bien ITGα3 e ITGα4 median la captación de EVP en los pulmones, ITGα5 impulsa la permeabilidad vascular a través de la activación de NF-κB, lo que conduce a la secreción de IL-6 de las IM. Esto altera la integridad de la barrera endotelial, promoviendo la extravasación de las células tumorales y la metástasis pulmonar (Fig. 7h).
Discusión
Estudios previos establecieron que la capacidad de los EVP para aumentar la permeabilidad vascular pulmonar está mediada principalmente por los efectos directos de los EVP sobre las CE. Esto, a su vez, da como resultado la remodelación de las uniones estrechas y las uniones adherentes endoteliales y la transferencia directa de microARN de EVP a las CE13,49,50. Otros estudios han demostrado que los EVP pueden transferir proteínas a las CE que alteran la permeabilidad vascular24,51.
Revelamos un mecanismo en el que la captación directa de EVP por las CE no tiene un impacto discernible en la permeabilidad vascular. En cambio, nuestros hallazgos señalan un mecanismo alternativo e indirecto por el cual la captación de EVP enriquecidos con ITGα5 por las IM ubicadas cerca del endotelio es esencial para la fuga vascular en el pulmón premetastásico. Mostramos que, tras la captación de EVP por las IM, los EVP estimulan la secreción de citocinas, principalmente IL-6, para promover la permeabilidad endotelial41. La depleción de IM o el bloqueo de IL-6 in vivo redujeron significativamente la capacidad de los EVP para inducir la fuga vascular y, simultáneamente, redujeron el número de lesiones metastásicas en los ratones. Además, los EVP derivados de tumores de participantes con cáncer colorrectal se enriquecieron con ITGα5, indujeron la secreción de IL-6 en los macrófagos y promovieron la fuga endotelial. Coherente con estos hallazgos, una alta expresión tumoral de ITGα5 se correlacionó con una reducción de la supervivencia general en múltiples tipos de cáncer. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la evaluación de los niveles de ITGα5 específicamente en los EVP circulantes representa una importante dirección futura con un potencial valor diagnóstico y pronóstico.
Si bien los tumores B16F10, K7M2 y 4T1 son todos capaces de metastatizar a los pulmones, la capacidad de inducir la permeabilidad vascular varía ampliamente entre estos modelos de cáncer. En particular, a pesar del alto potencial metastásico de los tumores 4T1, los EVP derivados de 4T1 inducen una permeabilidad vascular relativamente leve. Por lo tanto, la capacidad metastásica de los tumores 4T1 probablemente se basa en otros mecanismos, como el reclutamiento de neutrófilos52.
En nuestro estudio, identificamos un mecanismo que implica a las IM como guardianes de la progresión metastásica. Las IM y los AM constituyen las dos poblaciones primarias de macrófagos pulmonares residentes. En contraste con los AM, que residen en estrecha proximidad a las células epiteliales alveolares, las IM se encuentran predominantemente en el espacio intersticial entre el endotelio microvascular y el epitelio alveolar37,39. Esta distinta localización subraya la posible influencia que las IM pueden ejercer sobre las CE circundantes. En comparación con los AM, las IM son menos frecuentes y relativamente poco estudiadas, especialmente en el cáncer. Investigaciones previas sugirieron que las IM son capaces de secretar citocinas proinflamatorias, como IL-6 y TNF, tanto en ratones como en humanos39, lo que coincide con nuestro estudio actual. Si bien reconocemos que es poco probable que las IM actúen solas y que otras células residentes o reclutadas en el pulmón pueden participar en la remodelación vascular inducida por EVP, nuestros hallazgos demuestran el papel predominante y central de las IM en la inducción de la fuga vascular y, posteriormente, en la promoción de la extravasación y la metástasis. Nuestros datos identifican a IL-6 como el principal mediador de la fuga vascular inducida por EVP dentro del período de tiempo temprano. Sin embargo, nuestros estudios de neutralización también indican que otras citocinas probablemente actúan junto con IL-6 para modular la permeabilidad endotelial y la formación de PMN. El papel de IL-6 en el aumento de la permeabilidad endotelial in vitro53, principalmente mediante la alteración de la cadherina VE y las proteínas de las uniones estrechas, está bien establecido54. Nuestros hallazgos de que la permeabilidad vascular es inducida por la secreción de IL-6 de las IM y el bloqueo de IL-6 da como resultado una reducción notable tanto en la fuga vascular como en la metástasis in vivo no solo respaldan los hallazgos in vitro establecidos, sino que también sugieren una base mecanicista de cómo los EVP tumorales pueden preparar y explotar las poblaciones de células dentro del microambiente premetastásico para facilitar la metástasis.
Si bien algunas integrinas, como ITGα4 e ITGα3, median la captación de EVP en los pulmones, identificamos a ITGα5 como la carga de EVP necesaria y suficiente para inducir la permeabilidad vascular y facilitar la metástasis mediada por las IM. Descubrimos un vínculo entre la expresión de ITGα5 en los EVP y la inducción de la secreción de IL-6 de las IM a través de la señalización de NF-κB. La pérdida o inhibición de ITGα5 en los EVP reduce la fuga vascular, la extravasación de células cancerosas y la metástasis en los pulmones, mientras que la sobreexpresión de ITGα5 en los EVP promueve estos procesos. No obstante, si bien ITGα5 tiene un papel central en la activación de IM mediada por EVP, la fuga vascular no se abolió por completo tras la pérdida de ITGα5, lo que sugiere que otros componentes de EVP (proteínas, lípidos o ARN) pueden contribuir, lo que justifica futuras investigaciones. La ausencia de ITGα5 en los EVP no impide la capacidad de las IM para captar los EVP, pero dificulta significativamente la activación de NF-kB, la señalización de STAT y la secreción de IL-6, lo que, en consecuencia, disminuye su efecto sobre la vasculatura adyacente. Si bien nuestros datos demuestran que los EVP que contienen ITGα5 activan la señalización de NF-κB en las IM, las interacciones receptor-ligando precisas que subyacen a esta respuesta aún deben dilucidarse por completo y representan una importante dirección para futuros estudios mecanicistas.
ITGα5 está regulado al alza en un espectro de tumores y está estrechamente asociado con la progresión tumoral y la metástasis55,56,57. Además, también se ha relacionado a ITGα5 con la angiogénesis y se correlaciona con una mayor infiltración inmune dentro del microambiente tumoral58,59. Si bien el papel preciso de ITGα5 en la influencia de la permeabilidad vascular no se ha explorado, algunas evidencias sugieren un aumento de los niveles de citocinas proinflamatorias, IL-6 y TNF, en los tumores que expresan niveles elevados de ITGα5 (refs. 59,60). Confirmamos que esta elevación de citocinas proinflamatorias se asocia con un aumento de la permeabilidad in vitro. Nuestra investigación también detalla la cinética de la inducción de la permeabilidad vascular tanto por los tumores como por sus EVPs, y revela un período de tiempo notablemente corto para la inducción de la permeabilidad vascular pulmonar. Este hallazgo brindó la oportunidad de profundizar en la influencia específica de una única dosis de EVP sobre la permeabilidad de las células endoteliales pulmonares y la extravasación de células, al tiempo que se minimizan los efectos confusores asociados con el tratamiento con EVP. Esto contrasta con estudios previos que demostraron la importancia de la permeabilidad vascular después del crecimiento tumoral o múltiples inyecciones de EVPs in vivo13,23, lo que podría introducir otras variables, como la infiltración y modulación inmune, la angiogénesis y la remodelación de la MEC15. Aunque nuestros análisis muestran una rápida activación de NF-κB seguida de la inducción de IL-6, no mapeamos completamente la secuencia temporal de estos eventos y, por lo tanto, reconocemos que la relación cinética entre la señalización de la integrina y la liberación de citocinas aún debe aclararse. Nuestra investigación destaca el potente impacto de una única dosis de EVP, enfatizando el papel fundamental de la permeabilidad vascular en los procesos de extravasación y metástasis. En resumen, nuestro estudio ofrece una perspectiva sobre la influencia de las IM en la mediación de los efectos de los EVPs derivados del tumor tanto en la permeabilidad vascular como en la progresión de los eventos metastásicos. Identificamos interacciones entre los EVPs, las IM, la IL-6 y la ITGα5, y dilucidamos sus importantes funciones en la regulación de la permeabilidad vascular y el avance de los procesos metastásicos, presentando así varias oportunidades terapéuticas potenciales. Métodos Aprobación ética Todos los procedimientos cumplieron con las regulaciones éticas pertinentes. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de AAALAS (protocolo WCM 0709–666A). Se monitorearon los animales para evaluar su estado de salud y se les sacrificó si fue necesario. Las muestras de tumores humanos se obtuvieron del Centro Oncológico Yonsei (YCC). Todos los participantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito que autorizaba la publicación de datos desidentificados, según los protocolos aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital Severance, la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei (IRB n.º 4-2019-0811) y Weill Cornell Medicine (IRB n.º 0604008488). Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los números de participantes femeninos y masculinos se obtuvieron de los registros médicos y se indican en la Tabla Suplementaria 9. El sexo no se utilizó como variable en el análisis de datos y nuestros hallazgos no se aplican solo a un sexo. Líneas celulares y cultivo celular Las células B16F10 (CRL-6475), K7M2 (CRL-2836) y 4T1 (CRL-2539) se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares de Tipo Americano, mientras que las células SK-MEL-192 se obtuvieron del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Las células se cultivaron en DMEM o RPMI (Corning) suplementado con 10% de FBS (Gibco) y 1× penicilina-estreptomicina (100 U por ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina; Thermo Fisher Scientific). La línea celular 67NR (de F. Miller) se cultivó en RPMI con 10% de FBS y 1× penicilina-estreptomicina. Las células Melan-A (Wellcome Trust Functional Genomics Cell Bank) se cultivaron en RPMI suplementado con 10% de FBS, 1× penicilina-estreptomicina y 0,2 µM de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (Sigma). Las HPAECs (PromoCell, C-12241) se cultivaron en medio de crecimiento EC 2 (PromoCell). Todos los experimentos se realizaron utilizando células en pasajes 3-8. Las células THP-1 Lucia se compraron a InvivoGen (thpl-nfkbv2). Los osteoblastos primarios y las IM se aislaron de huesos y pulmones de ratón, respectivamente, según se describe a continuación. Para el aislamiento de EVPs, el FBS se eliminó de los EVPs mediante ultracentrifugación a 100.000 g durante 4 h. Luego, las células se cultivaron en un medio desprovisto de EVPs durante 3 días y se recolectaron los sobrenadantes. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 y se analizaron rutinariamente para confirmar que eran negativas para Mycoplasma. Aislamiento y caracterización de EVPs Los EVPs se purificaron mediante ultracentrifugación secuencial61. Se eliminó la contaminación celular del CM a los 3-4 días o de los sobrenadantes de explantes de tejido mediante centrifugación a 500 g durante 10 min, seguida de 3000 g durante 20 min y 12 000 g durante 20 min para eliminar los cuerpos apoptóticos y las vesículas grandes. Los EVPs se sedimentaron a 100 000 g durante 70 min en tubos de 38 ml o 94 ml (355631 o 355628, Beckman Coulter), se lavaron en PBS y se resedimentaron a 100 000 g utilizando rotores 70Ti o 45Ti (Beckman Coulter Optima XE o XPE) a 10 °C. Los pellets de EVP finales se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante el ensayo BCA (Pierce, Thermo Fisher Scientific). Para los explantes de tejido, los tumores primarios (B16F10 o K7M2) se picaron en trozos de tamaño milimétrico y se cultivaron durante la noche en RPMI con 1× penicilina-estreptomicina. Se recolectaron los sobrenadantes y se filtraron a través de un filtro de 70 µm. El tamaño y la concentración de los EVPs se midieron utilizando ZetaView (Particle Metrix) para muestras de ratón o NanoSight NS500 (Malvern Instruments, láser de 405 nm) para muestras humanas. Para los gradientes de densidad de iodixanol, los pellets de EVP crudos se resuspendieron y se ajustaron a 45% de iodixanol (OptiPrep, solución madre al 60%) en un volumen final de 4 ml, se cargaron en el fondo del tubo y se superpusieron con capas de 1 ml de 35%, 30%, 28%, 26%, 24%, 22% (×2), 20% y 10% de iodixanol, seguidas de ~200 µl de PBS. Los gradientes se centrifugaron a 141 000 g durante 16 h a 10 °C en un rotor SW28 Ti. Se recolectaron un total de 12 fracciones de 1 ml desde la parte superior hasta la inferior, se diluyeron en PBS y se ultracentrifugaron a 100 000 g durante 70 min a 10 °C para eliminar el iodixanol. Los pellets se resuspendieron en PBS para los análisis posteriores. Marcado de EVPs Los EVPs se marcaron con CellVue burgundy (eBioscience) o PKH67 (Sigma) según las instrucciones del fabricante, se lavaron en 20 ml de PBS y se sedimentaron mediante ultracentrifugación (100 000 g, 70 min, 10 °C). Tinción inmunofluorescente de tejidos y células Para los tejidos, se fijaron dos lóbulos pulmonares por ratón en PBS con 4% de PFA durante la noche y luego se incubaron en 30% de sacarosa en PBS durante la noche. Los tejidos se equilibraron en 1:1 de 30% de sacarosa y compuesto Tissue-Tek OCT durante 1 h, se incluyeron en OCT y se congelaron sobre hielo seco. Las secciones criotómicas (10 µm) se procesaron utilizando protocolos estándar de inmunofluorescencia. Las secciones se secaron, se bloquearon (PBS con 3% de BSA y 0,2% de Triton X-100) y se incubaron con anticuerpos primarios (Tabla Suplementaria 10) durante la noche a 4 °C. Después del lavado, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios (Tabla Suplementaria 10) durante 1 h, se tiñeron con DAPI (1 µg/ml) y se montaron con ProLong Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, P36970). Para las HPAECs, las células se fijaron con 4% de PFA, se permeabilizaron con 0,2% de Triton X-100 durante 2 min y se tiñeron como se describió anteriormente. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal LSM 880 (Zeiss) con un objetivo de contraste de interferencia diferencial de ×40 y se analizaron utilizando Zen Blue (Zeiss). Análisis histológico Los tejidos pulmonares se fijaron en 4% de PFA durante la noche a 4 °C y se sometieron a inclusión en parafina. Los tejidos pulmonares incluidos en parafina se cortaron en secciones de 7 µm de espesor y las secciones se procesaron para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y se montaron con medio VectaMount (Vector Laboratories). Las diapositivas se escanearon con PANNORAMIC 250 Flash (versión 2.6, 3DHISTECH) con un objetivo de ×20 (apertura numérica: 0.8) (Zeiss). El número de metástasis se contó manualmente y el área de cada lesión se midió con el software FIJI62. Citometría de flujo La digestión y la tinción se realizaron siguiendo un protocolo publicado previamente38. Brevemente, los tejidos pulmonares se picaron y luego se digirieron a 37 °C durante 1 h con un cóctel enzimático: colagenasa A (1 mg/ml), dispasa (1 mg/ml) y DNasa I (0,1 mg/ml) (Roche, Sigma-Aldrich). Las suspensiones celulares simples se filtraron y luego se lavaron con PBS que contenía 2 mM de EDTA y 3% de BSA. Las células aisladas se sometieron a lisis de glóbulos rojos y se incubaron con los anticuerpos primarios (Tabla Suplementaria 10). Para definir la viabilidad celular, se utilizó DAPI (Thermo Fisher). Los datos se adquirieron utilizando un Aurora (Cytek) y se analizaron con FCS Express 7 Research Edition (De Novo Software). Microscopía electrónica de transmisión La microscopía electrónica de transmisión se realizó como se describió previamente63. Brevemente, los EVPs (0,1 mg/ml en PBS) se adsorbieron sobre rejillas recubiertas con Formvar/carbono durante 1 min. Luego, las rejillas se tiñeron negativamente con cuatro aplicaciones secuenciales de 1,5% de uranil acetato acuoso, con secado entre cada aplicación. Después de la tinción, las rejillas se secaron al aire y se examinaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 que funciona a 100 kV y está equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada Veleta 2k × 2K (Olympus-SIS). Aislamiento de IM Los pulmones se digirieron y se tiñeron como se describió anteriormente. Las IM se tiñeron con los anticuerpos enumerados (Tabla Suplementaria 10) y se clasificaron utilizando un BD FACS Melody. Normalmente, se recolectaron entre 100 000 y 300 000 células de cada pulmón. Las células se cultivaron en RPMI con 10% de FBS, GM-CSF (20 ng/ml), 1 mM de piruvato de sodio y 1× penicilina-estreptomicina durante 24 h y luego se sometieron a tratamiento con EVPs. Aislamiento y cultivo de osteoblastos primarios Los osteoblastos primarios de ratón se aislaron de los huesos de ratón BALB/c como se describió previamente64. Brevemente, se recolectaron los huesos (tibia, fémur y húmero) de ratonas de 7 semanas de edad y se lavaron para eliminar el contenido de la médula ósea utilizando αMEM (BioConcept) suplementado con 2,2 g de NaHCO3, 1× penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,375× aminoácidos MEM (BioConcept) y 10% de FBS desprovisto de EVPs. Los fragmentos de hueso se picaron y se cultivaron en placas de 10 cm con 10 ml de medio de digestión que contenía 1 mg/ml de colagenasa II (Sigma, C6885) durante 90 min a 37 °C. Luego, el medio se reemplazó con medio basal para permitir la migración y la adhesión de las células. Después de 3 días, las células se desprendieron utilizando colagenasa I (Thermo Fisher Scientific) seguida de TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific). La identidad de los osteoblastos se confirmó en los pasajes 3-5 mediante la tinción con rojo de Alizarina S (>97% de pureza). El CM de los osteoblastos en el pasaje 3-5 se recolectó para el aislamiento de EVPs. Enriquecimiento de monocitos y diferenciación en macrófagos Se aislaron PBMCs de buffy coats de donantes sanos. Se diluyó sangre total (20 ml) 1:1 con PBS, se colocó sobre 30 ml de Ficoll-Paque y se centrifugó a 400 g durante 30 min a 20 °C (sin freno). Se eliminó la capa de plasma y se recolectaron las células mononucleares, se lavaron con PBS y se filtraron a través de una malla de 40 µm. Las células se resuspendieron a 12,5 × 106 células por ml en PBS que contenía 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA y se incubaron con MicroBeads CD14 (relación 4:1) según las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron, se pasaron por una segunda columna para aumentar la pureza y se eluyeron. Las células CD14+ se cultivaron en SFM de macrófagos (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 1% de suero humano, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y GM-CSF (50 ng/ml; PeproTech). Las células no adherentes se eliminaron después de 1 h y en el día 3 mediante el reemplazo del medio. Los macrófagos se utilizaron para los experimentos en el día 5 (ref. 65). Ensayo de células THP-1 Lucia (NF-κB) Las células se diferenciaron en macrófagos mediante el tratamiento con 100 nM de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato durante 24 h, seguido de un período de recuperación de 48 h en medio fresco. La luminiscencia impulsada por NF-κB se midió utilizando el kit de ensayo THP-1-NF-κB-luc2 (InvivoGen) según las instrucciones del fabricante. Para el análisis de citocinas, las IM o los macrófagos humanos se trataron con EVPs (1 µg/ml) durante 1 h o 3 h. Se recolectó el CM y se analizó utilizando un kit de matriz de citocinas de ratón Proteome Profiler (R&D Systems) o ELISA (IL-6 humana, R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Las intensidades de la señal se cuantificaron utilizando ChemiDoc (Bio-Rad) o análisis estándar de ELISA. Análisis de Western blot Se generó lisado celular total (TCL) y lisado de EVP mediante la lisis de células en tampón RIPA (Sigma-Aldrich). Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 12 000 g durante 15 min a 4 °C. El lisado claro se mezcló con tampón de muestra SDS. Las muestras (tanto TCL como EVPs) se hirvieron durante 5 minutos y se separaron de 2,5 a 10 μg de muestras en un gel Novex 4-12% o 4-20% Bis-Tris Plus (Life Technologies) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (0,45 μm; Bio-Rad). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de la incubación con anticuerpo primario durante la noche a 4 °C y la incubación con anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Los inmunoblots se analizaron con ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) y se analizaron con Image Lab (versión 6.1, Bio-Rad). Todos los anticuerpos utilizados y sus diluciones se enumeran (Tabla suplementaria 10).
Modelos in vivo
Se monitorizaron los ratones para detectar efectos adversos y se sacrificaron si fue necesario. Se utilizaron ratones hembra BALB/cJ y C57BL/6 (Jackson Laboratory), de 7 a 12 semanas de edad, y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra ni se aplicó aleatorización o enmascaramiento. Se excluyeron los ratones que murieron antes de los puntos finales del estudio. Todos los animales se alojaron en jaulas en un entorno libre de patógenos específicos, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, un rango de temperatura de 20-25 °C y una humedad del 30-70%, en el centro de animales del Weill Cornell Medical College.
Se utilizaron ratones BALB/cJ (6-8 semanas) para la implantación de células 4T1 y K7M2 y para el tratamiento con EVPs derivados de osteoblastos, células 4T1 o células K7M2. Se utilizaron ratones C57BL/6 (6-8 semanas) para la implantación de B16F10 y el tratamiento con EVPs de B16F10 o Melan-A.
Para la implantación de tumores, se inyectaron 5 × 105 células 67NR o 4T1 (50 μl de PBS) en el cojín adiposo mamario (BALB/cJ), se inyectaron 5 × 105 células B16F10 (100 μl de PBS) por vía subcutánea en ratones C57BL/6 y se inyectaron 1 × 106 células K7M2 (10 μl de PBS) en la tibia (BALB/cJ). Los ratones de control recibieron PBS. Los tumores no excedieron el volumen máximo permitido según nuestro protocolo IACUC (2 cm3) en ningún experimento.
Para el bloqueo de CSF1R, los ratones C57BL/6 con tumores B16F10 recibieron anti-CSF1R (BE0213) o IgG control (BE0090, BioXCell) por vía intraperitoneal (200 μg por ratón) cada dos días, comenzando 2 días después de la implantación (tres dosis en total).
Para los experimentos de "educación" de EVPs, se inyectaron 10 μg de EVPs de control o ITGα5-KO por vía retro-orbital cada dos días durante 3 semanas, seguido de la inyección tibial de 1 × 106 células K7M2. Los ratones fueron sacrificados 4 semanas después.
Para los ensayos de metástasis experimentales, se inyectaron 5 × 104 células B16F10 o 4T1 a través de la vena caudal y se evaluaron las metástasis después de 14 días; para K7M2, se inyectaron 5 × 105 células y se analizaron los ratones después de 2,5 semanas. Cuando se indicó, las células tumorales se inyectaron 1 h después de la administración de EVPs.
Las células AM se agotaron mediante la administración intranasal de liposomas o clorhidrato (Liposoma; 60 μl por ratón). La eficiencia del agotamiento se evaluó después de 72 h o seguida del tratamiento con EVPs.
Para la neutralización in vivo, se administraron por vía intraperitoneal anticuerpos contra CSF1R (BE0213), Ly6G (BE0320), Ly6C (BE0203), IL-6 (BE0046), TNF (BE0058) o IgG control (BE0090, BioXCell) (200 μg por ratón) 18 h antes del tratamiento con EVPs. Se administraron anti-CXCL2 (MAB452) y anti-CCL3 (AB-450-NA, R&D Systems) a 50 μg por ratón.
Para los experimentos con CM, el medio agotado de EVPs (después de la centrifugación a 100.000 g, 70 min) se concentró utilizando filtros Amicon Ultra-15 (corte de 10 kDa, Millipore) a 4.000 g, 4 °C, hasta 100 μl por inyección.
Muestras humanas y procesamiento
Las muestras de tumores de colon se procesaron como se describió previamente66. Se obtuvieron tejidos tumorales frescos de participantes con cáncer colorrectal sometidos a resección curativa en el YCC. Las muestras se colocaron en PBS helado inmediatamente después de la recolección y se procesaron rápidamente.
Los tejidos se picaron y se cultivaron durante 24 h en RPMI sin suero suplementado con penicilina (100 U por ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Se recolectó CM para el aislamiento de EVPs. El tamaño y la concentración de los EVPs se midieron utilizando el sistema NanoSight NS500 (Malvern Instruments) con un láser de 405 nm. Todas las muestras de EVPs descritas en esta sección se utilizaron por completo durante los procedimientos experimentales y ya no están disponibles.
Ensayos de permeabilidad
Para los ensayos in vitro, se sembraron HPAECs en transwells recubiertos de colágeno (3 μm) y se dejaron crecer hasta la confluencia. Las células se trataron con EVPs o CM en presencia de dextrano-rodamina (25 μg/ml, 70 kDa) durante 60 min. Se midió la fluorescencia en la cámara inferior (excitación: 555 nm, emisión: 580 nm) y se normalizó con los controles.
Para los ensayos in vivo, se inyectaron EVPs (10 μg) por vía retro-orbital en los ratones, seguidos 1 h después de dextrano-rodamina (0,5 mg, 70 kDa). Después de 1 h adicional, se perfundieron los ratones, se aislaron los pulmones y se fijaron, y se cuantificó la fluorescencia del dextrano mediante microscopía confocal (Zeiss LSM 880) y se normalizó con DAPI.
Tratamientos farmacológicos
Los EVPs se incubaron con el inhibidor de ITGα5 derivado de AV3 (rYYraTY, 20 μM) durante 1 h antes de su uso. Para la inhibición de NF-κB, los macrófagos humanos se pretrataron con TPCA-1 (10 μM) durante 30 min antes de la estimulación con EVPs. Se utilizó IL-6 recombinante (PeproTech) a 40 nM para los ensayos in vitro o se administró por vía intraperitoneal (500 nM) 1 h antes de la inyección de dextrano in vivo. Las muestras tratadas con DMSO se utilizaron como controles cuando fue aplicable. Para la histamina, se inyectaron 1 mg de histamina por vía retro-orbital en los ratones, 10 minutos antes de la inyección de EVPs/células/dextrano.
Ensayo de adhesión de EVPs
Se recubrió fibronectina (Sigma) a una concentración final de 10 μg/ml en placas de 48 pocillos a 37 °C durante la noche. Se eliminó la fibronectina no unida mediante lavado con PBS. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon con 1% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente. Los EVPs de B16F10 y K7M2 se etiquetaron con el tinte lipofílico PKH67 como se describió anteriormente. Después del teñido, los EVPs se incubaron con 20 μM de AV3 o DMSO durante 1 h. Después de 1 h, se añadieron 10 μg de EVPs a los pocillos y se dejaron adherir a las placas recubiertas con fibronectina durante 30 min. Los EVPs no adheridos se eliminaron mediante lavado con PBS. Se midió la fluorescencia con una excitación de 480 nm y una emisión de 535 nm. Se comparó la fluorescencia relativa calculada con las condiciones de control.
Ensayo de imagenología ex vivo de todo el pulmón
Las células B16F10 se etiquetaron con el tinte CellTracker green CMFDA (Invitrogen, C2925) según las instrucciones del fabricante. Las células etiquetadas (5 × 105) se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena caudal 1 h después de la administración de EVPs o PBS.
Después de 4 días, se recolectaron los pulmones y se colocaron en una cámara de imagen personalizada con una base de portaobjetos (grosor: 0,16-0,19 mm). Para visualizar el endotelio, se administró por vía retro-orbital el anticuerpo anti-CD31-PE (50 μg/kg; BioLegend, 102408) 5 min antes del sacrificio. Se inflaron los pulmones con 0,5 ml de aire y se mantuvieron inflados durante la imagen36,67,68.
La extravasación de células tumorales se evaluó mediante microscopía confocal y se cuantificó directamente a partir de los campos de visión o mediante la reconstrucción 3D de las células tumorales y los vasos sanguíneos utilizando el software Imaris.
Generación de ITGα5 y NCAM1 KO en las líneas celulares B16F10 y K7M2
La eliminación génica en las células B16F10 y K7M2 se generó mediante transducción lentiviral con lentiCas9-Blast (Addgene, 52962) para establecer líneas estables que expresan Cas9. Después de 2 semanas, las células se transducieron con lentiGuide-Puro (Addgene, 52963) que codifica sgRNAs dirigidos a integrinas de ratón (secuencias en la Tabla suplementaria 11), diseñados utilizando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Las células de control se transducieron con lentivirus sgRNA no dirigido.
El lentivirus se produjo en células 293T mediante cotransfección de vectores de expresión con plásmidos de empaquetamiento pMDLg/pRRE (12251), pMD2.G (12259) y pRSV-Rev (12253) de Addgene utilizando TransIT-X2 (Mirus).
Se realizó la supresión de CDH2 utilizando ON-TARGETplus Mouse CDH2 siRNA (Horizon, L-040206-00-0005) con TransIT-X2 (Mirus). Se recolectó CM 48 h después de la transfección. ON-TARGETplus nontargeting siRNA (Horizon, D-001810-10-05) se utilizó como control.
MS y proteómica
Las muestras de EVPs se analizaron mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS como se describió previamente61. Las muestras se secaron mediante centrifugación al vacío y se redisolvieron en 30-50 μl de 8 M de urea, 50 mM de bicarbonato de amonio y 10 mM de DTT. Después de la lisis y la reducción, las proteínas se alquilaron utilizando 20 o 30 mM de yodoacetamida (Sigma). Las proteínas se digirieron con endopeptidasa Lys C (Wako) en
¡Aún no hay comentarios. Sé el primero en comentar!