Creación de modelos tridimensionales de cáncer colorrectal mediante bioimpresión y evaluación de su eficacia y sensibilidad a los fármacos.

El cáncer colorrectal (CCR) se ha convertido en el tercer tumor maligno más común en todo el mundo y en la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer.^[1] En China, la incidencia y las tasas de mortalidad del CCR han mostrado una tendencia creciente significativa, ocupando el segundo y cuarto lugar, respectivamente, entre todos los tumores malignos.^[2] Aproximadamente el 20% de los pacientes con CCR son diagnosticados en estadio IV, lo que implica que el tumor no es curable mediante resección quirúrgica. Requieren tratamiento sistémico^[3] y su tasa de supervivencia relativa a los 5 años es tan baja como el 14%.^[4] Por lo tanto, formular planes de tratamiento personalizados para los diferentes pacientes con CCR en estadio IV es particularmente importante.^[5] Sin embargo, la alta heterogeneidad y el desarrollo dinámico del CCR, así como los complejos componentes microambientales y el microambiente altamente inmunosupresor dentro de los tumores, plantean grandes desafíos para el tratamiento.^[6,7] Para abordar estos desafíos, el desarrollo de modelos in vitro e in vivo para el diagnóstico y el tratamiento del CCR, y la realización de evaluaciones precisas de la eficacia, son de gran importancia.

Los modelos de investigación preclínica ampliamente utilizados en la actualidad incluyen modelos celulares 2D y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Sin embargo, ambos tienen limitaciones en la simulación del microambiente tumoral del CCR. Debido al tipo único de células cultivadas y a la falta de matriz extracelular (MEC), los modelos celulares 2D generalmente no pueden mantener eficazmente la heterogeneidad de las células tumorales ni reproducir la diversidad y la complejidad de los tejidos tumorales.^[8] Como modelo animal más cercano al microambiente tumoral real, se ha demostrado que el PDX es útil para predecir la sensibilidad o la resistencia a los fármacos del tumor, con el fin de mejorar la orientación del tratamiento del paciente.^[9] No obstante, los defectos de los modelos PDX no pueden ignorarse, como las diferencias individuales, los largos ciclos de cultivo, las bajas tasas de éxito y las diferencias de especie con los humanos. En los últimos años, se han estudiado ampliamente los modelos de organoides derivados del paciente (PDTO).^[10] No solo pueden compensar la incapacidad de los modelos celulares 2D tradicionales para mantener la heterogeneidad celular, sino que también tienen un ciclo de cultivo más corto y una mejor rentabilidad que los modelos PDX. A pesar de ello, el PDTO aún enfrenta problemas como la falta de métodos estandarizados y las grandes diferencias entre las muestras.^[11] En esencia, ninguno de estos modelos puede lograr simultáneamente una alta repetibilidad, una composición controlada de la matriz extracelular (MEC), ciclos de cultivo rápidos y una simulación realista de la heterogeneidad tumoral, a pesar de que cada modelo ha mejorado por separado la investigación del CCR. Por lo tanto, sigue siendo muy necesario un modelo preclínico que combine técnicas de fabricación estandarizadas y clínicamente aplicables con microambientes tumorales biomiméticos.

Además de estos modelos tumorales populares, los modelos bioimpresos en 3D han surgido como una tecnología de biofabricación avanzada en estudios emergentes. Pueden combinar múltiples células y matriz extracelular según estructuras preestablecidas para construir modelos de tejidos bioactivos in vitro complejos.^[12] Esta tecnología ha logrado importantes avances en la investigación del cáncer y la reparación de tejidos. Por ejemplo, Lee et al. reconstruyeron partes del corazón humano utilizando tecnología de bioimpresión 3D basada en colágeno.^[13] Sun et al. construyeron un modelo de carcinoma hepatocelular utilizando tecnología de bioimpresión 3D para la detección de fármacos.^[14] En comparación con los modelos tumorales tradicionales, los modelos bioimpresos en 3D pueden simular la heterogeneidad tumoral controlando diferentes estructuras, componentes celulares y componentes de la matriz extracelular, lo que los hace más controlables y reproducibles. Además, la expresión génica y la sensibilidad a los fármacos de las células tumorales en los modelos bioimpresos en 3D se asemejan más al estado real de los pacientes.^[15]

En la progresión tumoral, además de las células tumorales, la matriz extracelular también desempeña un papel clave. Puede proporcionar soporte mecánico para los tejidos tumorales, regular el microambiente y servir como fuente de moléculas de señalización.^[16] Dada la función central de la MEC en la regulación del comportamiento tumoral, la optimización de la composición de la matriz biomimética puede mejorar aún más la relevancia fisiológica y la capacidad predictiva de los modelos de CCR bioimpresos en 3D. Para mejorar el organoide de CCR bioimpreso en 3D desde la perspectiva de la matriz extracelular, mezclamos metacrilato de gelatina (GelMA) con el complejo laminina/entactina (LEC) como la matriz extracelular del modelo bioimpreso en 3D. El LEC se deriva principalmente de la matriz de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) y es un medio estándar para la construcción de organoides,^[17] que puede proporcionar un entorno de matriz adecuado para el cultivo de organoides. Los organoides de CCR bioimpresos en 3D construidos utilizando esta matriz compuesta pueden simular con precisión las características del microambiente tumoral y los comportamientos biológicos in vivo. Además, se ha verificado la fiabilidad de este modelo en la predicción de la eficacia de la quimioterapia clínica mediante pruebas de sensibilidad a los fármacos. Al obtener tejido tumoral de los pacientes antes del tratamiento, este modelo puede reflejar las diferencias en las respuestas tumorales a los fármacos quimioterapéuticos entre los diferentes pacientes, proporcionando una referencia para la formulación de planes de tratamiento personalizados clínicos. El objetivo de este estudio es proporcionar una nueva base teórica para la precisión del tratamiento del CCR desde la perspectiva única de la matriz extracelular y lograr la optimización del tratamiento del CCR.

RESULTADOS

Efectos de diferentes biomateriales sobre la biocompatibilidad, la proliferación y la invasión de las células tumorales

En primer lugar, se evaluó la biocompatibilidad de diferentes concentraciones de LEC con las células SW620 mediante tinción con calceína-AM (verde para células viables) y yoduro de propidio (rojo para células muertas). Como se muestra en la Fig. 1, todos los biomateriales exhibieron una buena biocompatibilidad en los días 2 y 5 de cultivo. La tasa de supervivencia celular en el grupo GelMA + LE3 disminuyó significativamente, mientras que el grupo GelMA + LE2 mantuvo la tasa de supervivencia celular más alta. Esto indica que la concentración de LEC de 1,0 μg/ml (LE2) optimizó la biocompatibilidad del material. Proporciona una proporción ideal para experimentos posteriores y respalda su aplicabilidad en la construcción de modelos tumorales.

Posteriormente, se cuantificó la proliferación celular mediante observación en campo claro y detección con CellTiter-Glo®. Los resultados mostraron que las células SW620 en el grupo GelMA + LE2 presentaron diferencias significativas a partir del día 5. La intensidad de la fluorescencia fue significativamente mayor que en el grupo de control [Fig. 2(a)-(c)], lo que indica que la concentración de LEC promueve la proliferación de las células tumorales. Para confirmar aún más la ventaja de LE2 en la promoción del crecimiento de las células tumorales, se construyó un modelo de "estructura de sándwich" con capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2 [Fig. 2(e)]. La invasión de las células SW620 se observó mediante microscopía confocal. Los resultados mostraron que en el día 15, la invasión celular más profunda se observó cuando tanto el material interno como el externo eran GelMA + LE2 [Fig. 2(d)]. Esto indica que LE2 mejora significativamente las características de la matriz extracelular. Proporciona un microambiente biomimético para las células tumorales, que puede apoyar y promover de manera más efectiva la proliferación y la invasión de las células tumorales. Para establecer un modelo de cultivo 3D estandarizado, se diseñó y utilizó una estructura circular de sándwich que consta de capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2 en todos los experimentos posteriores [Fig. 2(e)]. La proporción de material GelMA + LE2 se seleccionó para la caracterización y la investigación del mecanismo posteriores.

Caracterización de las propiedades del material

Después de determinar la proporción de material de GelMA + LE2, se realizó la bioimpresión 3D utilizando moldes con diferentes patrones planos. Como se muestra en la Fig. 3(a), GelMA + LE2 exhibió una buena capacidad de impresión plana en moldes de tres patrones. Esto es ventajoso para simular las características estructurales del microambiente tumoral. Posteriormente, se caracterizaron las propiedades reológicas y el módulo de Young del modelo impreso en 3D de GelMA + LE2. Los resultados mostraron que, después del entrecruzamiento con luz ultravioleta, el módulo compuesto del material mejoró significativamente, lo que confirmó la mejora de su estabilidad mecánica [Fig. 3(b)]. Sin embargo, no hubo una diferencia significativa entre GelMA y GelMA + LE2. De manera similar, no se detectó una diferencia estadísticamente significativa en su módulo de Young [Fig. 3(c)]. Esto indica que LE2 no cambia las propiedades reológicas y la dureza del modelo. Por lo tanto, especulamos que la ventaja de LE2 en la promoción del crecimiento de las células tumorales no se debe a cambios mecánicos, sino a la regulación del material.

Detección de marcadores tumorales y vías de señalización en los modelos bioimpresos en 3D

Para aclarar el mecanismo de LE2 en la regulación del crecimiento de las células tumorales, se extrajo ARN total de las células en los modelos impresos con GelMA y GelMA + LE2 para la secuenciación de ARN (RNA-seq). El análisis del transcriptoma mostró diferencias significativas en el transcriptoma entre los dos grupos de muestras. Los resultados del análisis de componentes principales (PCA) separaron el grupo GelMA + LE2 del grupo de control en el primer componente principal (49,58% de varianza) [material suplementario Fig. 1(a)]. Se seleccionaron los genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando DESeq2 (p < 0,05 y |log2FC| > 1) [Fig. 4(a) y 4(b)]. En general, el análisis de enriquecimiento GO de los genes expresados diferencialmente reveló que estos genes están asociados principalmente con la remodelación de la matriz extracelular, las respuestas inmunitarias e inflamatorias y la señalización de los factores de crecimiento [material suplementario Fig. 1(b)]. Entre estos, el enriquecimiento del "proceso catabólico del colágeno" sugiere que LE2 puede promover la migración y la invasión de las células tumorales al regular la degradación del colágeno y la remodelación de la matriz extracelular; el enriquecimiento de la "regulación positiva de la actividad del factor de transcripción NF-κB" y la "regulación positiva de la respuesta inmunitaria innata" indica que se activan las vías de señalización relacionadas con la inflamación, lo que está estrechamente relacionado con la progresión tumoral y la remodelación del microambiente tumoral. Además, el enriquecimiento de la "unión del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos" y la "actividad del factor de crecimiento" sugiere que LE2 puede mejorar la señalización proproliferativa y proinvasiva mediada por los factores de crecimiento, lo que promueve el desarrollo tumoral.

El análisis de enriquecimiento GO de los genes expresados diferencialmente reveló que estos genes se enriquecieron principalmente en vías asociadas con procesos biológicos, como la vía de señalización ERBB. Es una vía de señalización oncogénica importante. Su activación anormal está estrechamente relacionada con casi todas las características del cáncer, como la proliferación celular, la migración, la invasión y la antiapoptosis [Fig. 4(c)]. Además, el análisis KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) reveló que los genes regulados al alza se enriquecieron significativamente en las vías de las proteínas motoras y la queratinización [Fig. 4(d)]. El enriquecimiento en la vía de las proteínas motoras sugiere una mayor dinámica del citoesqueleto y procesos de transporte intracelular estrechamente relacionados con la motilidad celular y la invasión tumoral. El enriquecimiento en la vía de la queratinización sugiere alteraciones en la organización de las proteínas estructurales y los procesos relacionados con las barreras extracelulares, lo que puede reflejar cambios en la organización de la matriz extracelular y la adhesión celular. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los cambios transcriptómicos inducidos por LE2 pueden promover la progresión tumoral facilitando la remodelación del citoesqueleto y la reorganización de las estructuras extracelulares.

Además, un análisis de enriquecimiento GO de los genes expresados diferencialmente que mostraron una regulación a la baja reveló que estos genes estaban principalmente enriquecidos en procesos biológicos como las vías de señalización mediadas por lipopolisacáridos y la degradación del colágeno, al comparar el grupo GelMA + LE2 con el grupo GelMA. En particular, la regulación a la baja de las vías de señalización mediadas por lipopolisacáridos indica una atenuación de las respuestas inflamatorias e inmunitarias, lo que puede ayudar a los tumores a evadir la vigilancia inmunitaria, mientras que la supresión del catabolismo del colágeno implica una disminución de la degradación del colágeno, lo que puede favorecer la remodelación de la matriz extracelular y crear un microambiente más favorable para la adhesión, el crecimiento y la invasión de las células tumorales [material suplementario, Fig. 2(a)]. El análisis KEGG también mostró que los genes regulados a la baja estaban notablemente enriquecidos en las vías de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y el lupus eritematoso sistémico [material suplementario, Fig. 2(b)], lo que indica cambios en los procesos biológicos asociados con la inflamación y la inmunidad. La vía de curación de heridas por quemaduras se enriqueció significativamente según el análisis de WikiPathways [material suplementario, Fig. 2(c)]; por otro lado, las vías relacionadas con la regulación del citoesqueleto de actina y la mejora mediada por FBXL10 de la vía de señalización MAPK/ERK (proteína quinasa activada por mitógenos/quinasa regulada por señal extracelular) en el linfoma no Hodgkin mostraron una tendencia a la regulación a la baja [material suplementario, Fig. 2(d)], lo que indica posibles cambios en la estructura del citoesqueleto, la adhesión celular y las funciones de migración. El análisis de Reactome también mostró un enriquecimiento significativo de la vía de metilación de histidinas argininas por las RMT (arginina metiltransferasas) [material suplementario, Fig. 2(f)] y el enriquecimiento de las vías del sistema neuronal y la transmisión a través de las sinapsis químicas [material suplementario, Fig. 2(e)], lo que indica que LE2 también puede afectar los procesos reguladores epigenéticos y la comunicación intercelular. En conjunto, estos resultados sugieren que los cambios transcriptómicos inducidos por LE2 pueden implicar una regulación coordinada de la remodelación de la matriz extracelular, las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la dinámica del citoesqueleto, la señalización intercelular y la regulación epigenética, todo lo cual puede contribuir a la invasión, la proliferación y la remodelación del microambiente tumoral.

Además, el análisis de enriquecimiento KEGG de todos los genes expresados diferencialmente (DEG) reveló que los DEG estaban significativamente enriquecidos en vías relacionadas con la inflamación y la inmunidad, como la necroptosis, la vía de señalización IL-17 y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), lo que sugiere que LE2 puede participar en la remodelación del microambiente tumoral mediante la regulación de las respuestas inflamatorias y la muerte celular programada [material suplementario, Fig. 1(c)]. El análisis de WikiPathways reveló además un enriquecimiento significativo en vías como la mejora mediada por FBXL10 de la señalización MAPK/ERK, los objetivos de los microARN en la MEC y los receptores de membrana, y el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), lo que sugiere que LE2 puede promover la progresión tumoral al activar la señalización MAPK/ERK, regular las redes de microARN relacionadas con la MEC y modular el fenotipo secretor inflamatorio [material suplementario, Fig. 1(d)]. Además, el análisis de Reactome reveló que los genes expresados diferencialmente estaban significativamente enriquecidos en vías que incluyen la secuestro de metales por proteínas antimicrobianas y la metilación de histidinas argininas por las RMT. Estos hallazgos sugieren que LE2 puede influir en la progresión tumoral a través de la regulación coordinada de las respuestas antimicrobianas y asociadas a la inmunidad, así como de la modificación epigenética [material suplementario, Fig. 1(e)]. El análisis de enriquecimiento de vías multi-base de datos indica que los cambios transcripcionales inducidos por LE2 implican principalmente la remodelación de la matriz extracelular, la regulación de las respuestas inflamatorias e inmunitarias, los cambios dinámicos en el citoesqueleto y la activación de varias vías de señalización oncogénica clásicas, que en conjunto promueven la proliferación, la migración, la invasión de las células tumorales y la remodelación del microambiente tumoral.

Efectos de los biomateriales compuestos en la proliferación de las células primarias de CRC

Para verificar aún más el efecto promotor de los biomateriales compuestos sobre la proliferación de las células tumorales, se extrajeron células primarias de CRC de tejidos de cáncer colorrectal derivados de pacientes para experimentos de proliferación [Fig. 5(a)]. Los resultados mostraron que no hubo una diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia de las células en cada grupo en el día 7. Sin embargo, se observó una mejora significativa en la proliferación celular en el grupo GelMA + LE2 [Figs. 5(b)–5(d)]. Esto es consistente con los resultados de las células SW620, lo que demuestra que el material LE2 tiene un efecto promotor de la proliferación universal en las células derivadas de pacientes. Además, para evaluar aún más el efecto de los materiales compuestos en el cultivo tridimensional de las células de CRC derivadas de pacientes, observamos la formación de organoides en diferentes grupos [Fig. 5(e)]. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo GelMA, el grupo GelMA + LE2 formó un mayor número de organoides (aproximadamente 7 frente a 3) y exhibió un patrón de crecimiento más compacto. Aunque se realizó un análisis estadístico del diámetro de los organoides, debido a la importante heterogeneidad individual y las variaciones morfológicas entre los organoides derivados de pacientes, los cambios en el diámetro no revelaron diferencias intergrupales claras. Por lo tanto, el número de organoides formados y las observaciones de su morfología general reflejan mejor el efecto beneficioso del material LE2 en el sistema de cultivo 3D. Estos resultados respaldan aún más que LE2 puede optimizar el microambiente del cultivo 3D y promover la formación y el mantenimiento de los organoides de células de CRC derivados de pacientes.

Pruebas de fármacos quimioterapéuticos de organoides de CRC basados en la bioimpresión 3D de GelMA + LE2

Para evaluar el valor de transformación clínica de los organoides de CRC primarios impresos en 3D, se utilizaron cuatro regímenes de quimioterapia de primera línea para el CRC para las pruebas de sensibilidad a los fármacos. Como se muestra en la Fig. 6(a), el irinotecán fue el agente único más eficaz y de uso más generalizado entre todos los fármacos probados. Fue el único régimen de tratamiento que mostró sensibilidad en las tres líneas de organoides. Además, la sensibilidad estuvo significativamente asociada con la etapa tumoral T. La línea de organoides P4 (etapa T2N0M0) mostró una sensibilidad significativamente mayor al irinotecán (IC50 = 3,02 μM). En contraste, las líneas de organoides P2 y P10 (ambas etapa T3N0M0) mostraron una sensibilidad moderada (IC50 = 37,83/89,96 μM) [Figs. 6(b) y 6(c)]. Por el contrario, no se detectó sensibilidad al oxaliplatino en ninguna de las tres líneas de organoides. Su valor de IC50 superó el rango de detección, lo que sugiere que este fármaco puede no ser adecuado para tales pacientes. Además, la eficacia del fluorouracilo y el régimen de combinación de oxaliplatino + capecitabina (sustitución de 5-FU) fue significativamente limitada y solo aplicable a organoides específicos. El fluorouracilo mostró una sensibilidad moderada solo en la línea de organoides P10 (IC50 = 89,96 μM) pero no fue sensible en los organoides P2 y P4 (IC50 superó el rango de detección). El régimen de combinación de oxaliplatino + capecitabina (sustitución de 5-FU) mostró una sensibilidad moderada en P2 (oxaliplatino 118,49 μM, 5-FU 128,53 μM) y P10 (oxaliplatino 87,49 μM, 5-FU 94,90 μM) organoides. Sin embargo, no fue sensible en el organoide P4 y no mostró una eficacia sinérgica superior a la monoterapia con irinotecán.

Los resultados del seguimiento clínico indicaron que los tres pacientes recibieron regímenes de quimioterapia clínica formulados en base a los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos de los organoides bioimpresos en 3D, y todos lograron una respuesta completa (CR) después del tratamiento. Esto confirma una buena correspondencia entre los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos del modelo y las respuestas al tratamiento clínico, lo que verifica aún más la fiabilidad del modelo en la predicción de la eficacia de la quimioterapia clínica.

Efectos de diferentes biomateriales en la biocompatibilidad, la proliferación y la invasión de las células tumorales

En primer lugar, se evaluó la biocompatibilidad de diferentes concentraciones de LEC con las células SW620 mediante la tinción con calceína-AM (verde para las células vivas) y yoduro de propidio (rojo para las células muertas). Como se muestra en la Fig. 1, todos los biomateriales exhibieron una buena biocompatibilidad en los días 2 y 5 de cultivo. La tasa de supervivencia celular en el grupo GelMA + LE3 disminuyó significativamente, mientras que el grupo GelMA + LE2 mantuvo la tasa de supervivencia celular más alta. Esto indica que la concentración de LEC de 1,0 μg/ml (LE2) optimizó la biocompatibilidad del material. Proporciona una proporción ideal para experimentos posteriores y respalda su aplicabilidad en la construcción de modelos tumorales.

Posteriormente, se cuantificó la proliferación celular mediante la observación en campo claro y la detección con CellTiter-Glo®. Los resultados mostraron que las células SW620 en el grupo GelMA + LE2 presentaron diferencias significativas a partir del día 5. La intensidad de fluorescencia fue significativamente mayor que en el grupo de control [Figs. 2(a)–2(c)], lo que indica que la concentración de LEC promueve la proliferación de las células tumorales. Para confirmar aún más la ventaja de LE2 en la promoción del crecimiento de las células tumorales, se construyó un modelo de "estructura sándwich" con capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2 [Fig. 2(e)]. La invasión de las células SW620 se observó mediante microscopía confocal. Los resultados mostraron que en el día 15, la invasión celular más profunda se observó cuando tanto el material interno como el externo eran GelMA + LE2 [Fig. 2(d)]. Esto indica que LE2 mejora significativamente las características de la matriz extracelular. Proporciona un microambiente biomimético para las células tumorales, que puede apoyar y promover de manera más efectiva la proliferación y la invasión de las células tumorales. Para establecer un modelo de cultivo 3D estandarizado, se diseñó una estructura circular de sándwich que consta de capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2 y se utilizó en todos los experimentos posteriores [Fig. 2(e)]. La proporción de material GelMA + LE2 se seleccionó para la caracterización y la investigación del mecanismo posteriores.

Caracterización de las propiedades del material

Después de determinar la proporción de material de GelMA + LE2, primero se realizó la bioimpresión 3D utilizando moldes con diferentes patrones planos. Como se muestra en la Fig. 3(a), GelMA + LE2 exhibió una buena capacidad de impresión plana en moldes de tres patrones. Esto es ventajoso para simular las características estructurales del microambiente tumoral. Posteriormente, se caracterizaron las propiedades reológicas y el módulo de Young del modelo impreso de GelMA + LE2. Los resultados mostraron que después del entrecruzamiento con luz ultravioleta, el módulo compuesto del material mejoró significativamente, lo que confirmó la mejora de su estabilidad mecánica [Fig. 3(b)]. Sin embargo, no hubo una diferencia significativa entre GelMA y GelMA + LE2. De manera similar, no se detectó una diferencia estadísticamente significativa en su módulo de Young [Fig. 3(c)]. Esto indica que LE2 no cambia las propiedades reológicas y la dureza del modelo. Por lo tanto, especulamos que la ventaja de LE2 en la promoción del crecimiento de las células tumorales no se debe a cambios mecánicos, sino a la regulación del material.

Detección de marcadores tumorales y vías de señalización en modelos bioimpresos en 3D

Para dilucidar el mecanismo de acción de LE2 en la regulación del crecimiento de las células tumorales, se extrajo ARN total de células en modelos impresos con GelMA y GelMA + LE2 para realizar un análisis de ARN-seq. El análisis del transcriptoma mostró diferencias significativas en el transcriptoma entre los dos grupos de muestras. Los resultados del análisis de componentes principales (PCA) separaron el grupo GelMA + LE2 del grupo de control en el primer componente principal (49,58% de varianza) [material suplementario, Fig. 1(a)]. Se identificaron genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando DESeq2 (p < 0,05 y |log2FC| > 1) [Figs. 4(a) y 4(b)]. El análisis general de enriquecimiento GO de los genes expresados diferencialmente reveló que estos genes están asociados principalmente con la remodelación de la matriz extracelular, las respuestas inflamatorias e inmunitarias y la señalización de factores de crecimiento [material suplementario, Fig. 1(b)]. Entre estos, el enriquecimiento del “proceso catabólico del colágeno” sugiere que LE2 puede promover la migración e invasión de las células tumorales al regular la degradación del colágeno y la remodelación de la matriz extracelular; el enriquecimiento de la “regulación positiva de la actividad del factor de transcripción NF-κB” y la “regulación positiva de la respuesta inmunitaria innata” indica que se activan las vías de señalización relacionadas con la inflamación, lo que está estrechamente relacionado con la progresión tumoral y la remodelación del microambiente tumoral. Además, el enriquecimiento de la “unión del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos” y la “actividad del factor de crecimiento” sugiere que LE2 puede mejorar la señalización pro-proliferativa y pro-invasiva mediada por factores de crecimiento, promoviendo así el desarrollo tumoral.

El análisis de enriquecimiento GO (ontología génica) de los genes expresados diferencialmente reveló que estos genes estaban principalmente enriquecidos en vías asociadas con procesos biológicos, como la vía de señalización ERBB. Esta es una vía de señalización oncogénica importante. Su activación anormal está estrechamente relacionada con casi todas las características del cáncer, como la proliferación, la migración, la invasión y la anti-apoptosis [Fig. 4(c)]. Además, el análisis KEGG (Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto) reveló que los genes regulados al alza estaban significativamente enriquecidos en las vías de proteínas motoras y de queratinización [Fig. 4(d)]. El enriquecimiento en la vía de proteínas motoras sugiere una mayor dinámica del citoesqueleto y procesos de transporte intracelular estrechamente relacionados con la motilidad celular y la invasión tumoral. El enriquecimiento en la vía de queratinización sugiere alteraciones en la organización de las proteínas estructurales y los procesos relacionados con las barreras extracelulares, lo que puede reflejar cambios en la organización de la matriz extracelular y la adhesión celular. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los cambios transcriptómicos inducidos por LE2 pueden promover la progresión tumoral al facilitar la remodelación del citoesqueleto y la reorganización de las estructuras extracelulares.

Además, un análisis de enriquecimiento GO de los genes expresados diferencialmente regulados a la baja reveló que estos genes estaban principalmente enriquecidos en procesos biológicos como las vías de señalización mediadas por lipopolisacáridos y la degradación del colágeno al comparar el grupo GelMA + LE2 con el grupo GelMA. En particular, la regulación a la baja de las vías de señalización mediadas por lipopolisacáridos indica una atenuación de las respuestas inmunitarias y relacionadas con la inflamación, lo que puede ayudar a los tumores a evadir la vigilancia inmunitaria, mientras que la supresión del catabolismo del colágeno implica una disminución de la degradación del colágeno, lo que puede favorecer la remodelación de la matriz extracelular y crear un microambiente más favorable para la adhesión, el crecimiento y la invasión de las células tumorales [material suplementario, Fig. 2(a)]. El análisis KEGG también mostró que los genes regulados a la baja estaban notablemente enriquecidos en las vías de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y el lupus eritematoso sistémico [material suplementario, Fig. 2(b)], lo que indica cambios en los procesos biológicos asociados con la inflamación y la inmunidad. La vía de curación de heridas por quemaduras se enriqueció significativamente según el análisis de WikiPathways [material suplementario, Fig. 2(c)]; por otro lado, las vías relacionadas con la regulación del citoesqueleto de actina y la mejora mediada por FBXL10 de la vía de señalización MAPK/ERK (proteína quinasa activada por mitógenos/quinasa regulada por señal extracelular) en el linfoma no Hodgkin mostraron una tendencia a la regulación a la baja [material suplementario, Fig. 2(d)], lo que indica posibles cambios en la estructura del citoesqueleto, la adhesión celular y las funciones de migración. El análisis de Reactome también mostró un enriquecimiento significativo de la vía de metilación de histidinas argininas por las RMT (arginina metiltransferasas) [material suplementario, Fig. 2(f)] y el enriquecimiento de las vías del sistema neuronal y la transmisión a través de las sinapsis químicas [material suplementario, Fig. 2(e)], lo que indica que LE2 también puede afectar los procesos de regulación epigenética y la comunicación intercelular. En conjunto, estos resultados sugieren que los cambios transcriptómicos inducidos por LE2 pueden implicar una regulación coordinada de la remodelación de la matriz extracelular, las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la dinámica del citoesqueleto, la señalización intercelular y la regulación epigenética, todo lo cual puede contribuir a la invasión, la proliferación y la remodelación del microambiente tumoral.

Además, el análisis de enriquecimiento KEGG de todos los genes expresados diferencialmente (DEG) reveló que los DEG estaban significativamente enriquecidos en vías relacionadas con la inflamación y la inmunidad, como la necroptosis, la vía de señalización IL-17 y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), lo que sugiere que LE2 puede participar en la remodelación del microambiente tumoral al regular las respuestas inflamatorias y la muerte celular programada [material suplementario, Fig. 1(c)]. El análisis de WikiPathways reveló además un enriquecimiento significativo en vías como la mejora mediada por FBXL10 de la señalización MAPK/ERK, los objetivos de los miRNA en la MEC y los receptores de membrana, y el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), lo que sugiere que LE2 puede promover la progresión tumoral al activar la señalización MAPK/ERK, regular las redes de miRNA relacionadas con la MEC y modular el fenotipo secretor inflamatorio [material suplementario, Fig. 1(d)]. Además, el análisis de Reactome reveló que los genes expresados diferencialmente estaban significativamente enriquecidos en vías que incluyen la secuestro de metales por proteínas antimicrobianas y la metilación de histidinas argininas por las RMT. Estos hallazgos sugieren que LE2 puede influir en la progresión tumoral a través de la regulación coordinada de las respuestas antimicrobianas y asociadas a la inmunidad, así como de la modificación epigenética [material suplementario, Fig. 1(e)]. El análisis de enriquecimiento de vías multi-base de datos indica que los cambios transcripcionales inducidos por LE2 implican principalmente la remodelación de la matriz extracelular, la regulación de las respuestas inflamatorias e inmunitarias, los cambios dinámicos en el citoesqueleto y la activación de varias vías de señalización oncogénica clásicas, que en conjunto promueven la proliferación, la migración, la invasión de las células tumorales y la remodelación del microambiente tumoral.

Efectos de los biomateriales compuestos en la proliferación de las células primarias de CRC

Para verificar aún más el efecto promotor de los biomateriales compuestos sobre la proliferación de las células tumorales, se extrajeron células primarias de CRC de tejidos de cáncer colorrectal derivados de pacientes para experimentos de proliferación [Fig. 5(a)]. Los resultados mostraron que no hubo una diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia de las células en cada grupo en el día 7. Sin embargo, se observó una mejora significativa en la proliferación celular en el grupo GelMA + LE2 [Figs. 5(b)–5(d)]. Esto es consistente con los resultados de las células SW620, lo que demuestra que el material LE2 tiene un efecto promotor de la proliferación universal en las células derivadas de pacientes. Además, para evaluar aún más el efecto de los materiales compuestos en el cultivo tridimensional de las células de CRC derivadas de pacientes, observamos la formación de organoides en diferentes grupos [Fig. 5(e)]. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo GelMA, el grupo GelMA + LE2 formó un mayor número de organoides (aproximadamente 7 frente a 3) y exhibió un patrón de crecimiento más compacto. Aunque se realizó un análisis estadístico del diámetro de los organoides, debido a la importante heterogeneidad individual y las variaciones morfológicas entre los organoides derivados de pacientes, los cambios en el diámetro no revelaron diferencias intergrupales claras. Por lo tanto, el número de organoides formados y las observaciones de su morfología general reflejan mejor el efecto beneficioso del material LE2 en el sistema de cultivo 3D. Estos resultados respaldan aún más que LE2 puede optimizar el microambiente del cultivo 3D y promover la formación y el mantenimiento de los organoides de células de CRC derivados de pacientes.

Pruebas de fármacos quimioterapéuticos de organoides de CRC basados en la bioimpresión 3D de GelMA + LE2

Para evaluar el valor de transformación clínica de los organoides de CRC primarios impresos en 3D, se utilizaron cuatro regímenes de quimioterapia de primera línea para el CRC para realizar pruebas de sensibilidad a los fármacos. Como se muestra en la Fig. 6(a), el irinotecán fue el agente único más eficaz y ampliamente utilizado entre todos los fármacos probados. Fue el único régimen de tratamiento que mostró sensibilidad en las tres líneas de organoides. Además, la sensibilidad estuvo significativamente asociada con la etapa tumoral T. La línea de organoides P4 (etapa T2N0M0) mostró una sensibilidad significativamente mayor al irinotecán (IC50 = 3,02 μM). En contraste, las líneas de organoides P2 y P10 (ambas etapa T3N0M0) mostraron una sensibilidad moderada (IC50 = 37,83/89,96 μM) [Figs. 6(b) y 6(c)]. Por el contrario, no se detectó sensibilidad al oxaliplatino en ninguna de las tres líneas de organoides. Su valor de IC50 superó el rango de detección, lo que sugiere que este fármaco puede no ser adecuado para tales pacientes. Además, la eficacia del fluorouracilo y el régimen de combinación de oxaliplatino + capecitabina (sustitución de 5-FU) fue significativamente limitada y solo aplicable a organoides específicos. El fluorouracilo mostró una sensibilidad moderada solo en la línea de organoides P10 (IC50 = 89,96 μM) pero no fue sensible en los organoides P2 y P4 (IC50 superó el rango de detección). El régimen de combinación de oxaliplatino + capecitabina (sustitución de 5-FU) mostró una sensibilidad moderada en P2 (oxaliplatino 118,49 μM, 5-FU 128,53 μM) y P10 (oxaliplatino 87,49 μM, 5-FU 94,90 μM) organoides. Sin embargo, no fue sensible en el organoide P4 y no mostró una eficacia sinérgica superior a la monoterapia con irinotecán.

Los resultados del seguimiento clínico indicaron que los tres pacientes recibieron regímenes de quimioterapia clínica formulados en base a los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos de los organoides bioimpresos en 3D, y todos lograron una respuesta completa (CR) después del tratamiento. Esto confirma una buena correspondencia entre los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos del modelo y las respuestas al tratamiento clínico, lo que verifica aún más la fiabilidad del modelo en la predicción de la eficacia de la quimioterapia clínica.

DISCUSIÓN

La naturaleza biomimética y la capacidad de transformación clínica de los modelos preclínicos de CRC son los principales obstáculos que limitan la investigación del tratamiento de precisión. Los modelos celulares 2D tradicionales no pueden reproducir la heterogeneidad de las células tumorales y los fenotipos invasivos debido a la falta de regulación de la matriz extracelular (MEC) y a los requisitos de un único cultivo.^[18] Aunque los modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) pueden simular el microambiente in vivo, presentan deficiencias como ciclos de cultivo prolongados (que requieren semanas o meses), diferencias significativas entre especies y bajas tasas de éxito.^[19] Los modelos de organoides derivados del paciente (PDTO) han superado algunas limitaciones, pero aún enfrentan problemas como la falta de sistemas de cultivo estandarizados y la dificultad para regular con precisión los componentes de la MEC.^[20] Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un modelo de CRC que combine microambientes tumorales biomiméticos, reproducibilidad estructural y capacidad de cribado de fármacos aplicable clínicamente. Basándose en la tecnología de bioimpresión 3D, este estudio construyó un modelo de organoide de CRC con una MEC biomimética utilizando metacrilato de gelatina (GelMA) y el complejo laminina/entactina (LEC). Las ventajas y limitaciones del modelo GelMA + LE2 en relación con los modelos preclínicos de CRC existentes se resumen en la tabla 2 del material suplementario. Logró avances específicos en el diseño de materiales, la regulación del comportamiento celular y la transformación clínica.

Desde la perspectiva de la ingeniería de materiales, este estudio seleccionó GelMA como material base. Tiene propiedades fotocurables y buena biocompatibilidad, lo que permite controlar con precisión la estabilidad mecánica de la estructura impresa mediante el entrecruzamiento ultravioleta. Como componente natural de la MEC derivado de la matriz del sarcoma EHS, LEC es una de las matrices de referencia para el cultivo de organoides.^[17] La principal ventaja de su combinación es lograr un equilibrio entre la controlabilidad estructural y la naturaleza biomimética. En esencia, el sistema GelMA/LEC replica varias características importantes de la MEC relacionadas con el desarrollo del cáncer colorrectal, aunque no puede recrear completamente la complejidad bioquímica de la MEC colorrectal nativa.^[21,22] El colágeno, las glicoproteínas, los proteoglicanos, los glicosaminoglicanos (GAG) y las proteínas de la membrana basal conforman la red altamente organizada que constituye la MEC colorrectal sana.^[23] Se produce una remodelación extensa de la MEC, que se caracteriza por un aumento de la deposición y el entrecruzamiento del colágeno fibrilar, un aumento de los niveles de GAG, un aumento de la producción de glicoproteínas de la matriz y un endurecimiento progresivo de la matriz, durante la evolución de los tumores colorrectales.^[24,25] En este modelo, los LEC proporcionan elementos relacionados con la membrana basal, como la laminina, el colágeno tipo IV y los proteoglicanos de heparán sulfato, mientras que GelMA proporciona un andamio rico en colágeno que replica parcialmente el aumento de la acumulación de colágeno que se observa en el estroma tumoral. Como resultado, la matriz compuesta de GelMA/LEC conserva la simplicidad y la repetibilidad necesarias para las aplicaciones de bioimpresión 3D, al tiempo que captura varias características estructurales importantes del microambiente tumoral colorrectal.

Los resultados mostraron que cuando la concentración de LEC era de 1,0 μg/ml (grupo GelMA + LE2), las tasas de supervivencia de las células SW620 y las células primarias de CRC eran las más altas. Además, los experimentos de impresión planar confirmaron que este material puede reproducir de forma estable patrones preestablecidos, sentando las bases para simular la heterogeneidad estructural espacial del microambiente tumoral. Cabe destacar que las pruebas reológicas y elásticas no mostraron diferencias significativas en las propiedades mecánicas entre GelMA + LE2 y GelMA puro. Esto sugiere que el efecto promotor de LE2 sobre la proliferación y la invasión de las células tumorales no se debe a cambios en el microambiente mecánico, sino a la regulación de las vías de señalización celular a través de los componentes de la MEC. Este hallazgo excluye la interferencia de los factores mecánicos en los resultados experimentales y aclara el valor regulador biológico de LE2.

Para dilucidar aún más la base biológica que subyace a los fenotipos tumorales mejorados observados en el modelo GelMA + LE2, el secuenciamiento del transcriptoma y el análisis de enriquecimiento de vías utilizando múltiples bases de datos revelaron conjuntamente el mecanismo de LE2. En primer lugar, la vía de señalización ErbB (incluida la familia EGFR/HER) se reguló al alza de forma significativa. Es una de las vías oncogénicas más comunes en el CRC.^[26] Su activación anormal puede promover la proliferación de las células tumorales, la antiapoptosis y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) a través de las señales PI3K-Akt.^[6,27] En segundo lugar, se activó la vía de señalización Wnt. Esta vía desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre cancerosas y en la regulación de la migración celular. Está estrechamente relacionada con la profundidad de invasión y la metástasis en los ganglios linfáticos del CRC.^[7,28] En tercer lugar, se enriqueció la comunicación intercelular mediada por uniones gap. Este proceso puede mejorar la transmisión de señales y la capacidad de migración entre las células tumorales.^[29] Proporciona una explicación molecular del fenómeno de la invasión celular más profunda observada cuando tanto la capa interna como la externa involucran GelMA + LE2 en el modelo. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la matriz GelMA + LE2 puede influir en la proliferación y la invasión de las células de CRC a través de múltiples vías de señalización asociadas con la progresión tumoral. Aunque los datos actuales no establecen relaciones causales directas entre la composición de la MEC, la activación de las vías y los fenotipos tumorales, proporcionan información mecanicista preliminar y una base para futuros estudios de validación funcional.

Más allá de la exploración mecanicista, evaluar la posible aplicabilidad traslacional del modelo es igualmente importante. En este estudio de prueba de concepto, evaluamos preliminarmente si el modelo de organoide de CRC impreso en 3D podía reflejar las diferencias interpacientes en la respuesta a la quimioterapia. Las pruebas de cuatro regímenes de quimioterapia de primera línea para el CRC mostraron que el irinotecán fue el único fármaco que mostró sensibilidad en las tres líneas de organoides primarios. Además, la sensibilidad se asoció significativamente con el estadio tumoral T. La muestra P4 del estadio T2 (invasión en la muscularis propia) tuvo la mayor sensibilidad al irinotecán. En contraste, las muestras P2 y P10 del estadio T3 (invasión a través de la muscularis propia hasta la subserosa) tuvieron una sensibilidad significativamente reducida. Esto es consistente con la observación clínica de que cuanto mayor sea la profundidad de la invasión tumoral, menor puede ser la sensibilidad a la quimioterapia.^[30] Lo que es más importante, se formó una buena correspondencia entre los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos del modelo y las respuestas al tratamiento clínico de los pacientes correspondientes: todos los pacientes lograron una respuesta completa (RC) después del tratamiento basándose en los regímenes sensibles predichos por el modelo. Aunque se basa en un número limitado de organoides derivados de pacientes, la consistencia observada entre la sensibilidad a los fármacos in vitro y las respuestas al tratamiento de los pacientes sugiere la posible utilidad del modelo para el cribado individualizado de la quimioterapia. Sin embargo, estos hallazgos deben validarse en cohortes de pacientes más amplias.

Estos hallazgos preliminares indican que el modelo actual puede tener un potencial traslacional en el tratamiento individualizado del CRC. Basándose en esta correlación, este estudio derivó además importantes ideas para el cribado de fármacos en el cáncer colorrectal. En primer lugar, los organoides impresos en 3D pueden servir como una herramienta preexperimental para la selección clínica de los regímenes de quimioterapia. Pueden permitir una evaluación in vitro rápida de la posible sensibilidad a los fármacos antes del inicio del tratamiento, evitar la ceguera de la medicación de prueba y error en la terapia tradicional y proporcionar referencias directas para la formulación de regímenes de tratamiento individualizados. En segundo lugar, la asociación observada entre la sensibilidad al irinotecán y el estadio tumoral T sugiere además que la profundidad de la invasión tumoral puede influir en la respuesta a la quimioterapia, aunque esta observación debe validarse en estudios más amplios. Para los tumores del estadio T2 con invasión localizada, la monoterapia con irinotecán puede ser suficiente para lograr una eficacia deseable. Para los tumores del estadio T3 con invasión profunda, se puede considerar la combinación con otros fármacos moderadamente sensibles basados en el irinotecán o una dosis de administración ajustada para mejorar la eficacia terapéutica. Además, el modelo confirmó que el oxaliplatino no mostró sensibilidad en la cohorte de pacientes de este estudio. Esto indica que estos pacientes pueden evitar la administración de este fármaco, lo que no solo reduce el desperdicio de recursos médicos causado por un tratamiento ineficaz, sino que también alivia el daño de las reacciones adversas a los fármacos en los pacientes. Cabe destacar que los regímenes de combinación no mostraron una eficacia sinérgica superior a la monoterapia con irinotecán. Esto sugiere que la terapia de combinación no es necesariamente más óptima en el tratamiento individualizado del cáncer colorrectal. Por lo tanto, las estrategias de cribado de fármacos individualizadas basadas en modelos derivados de pacientes pueden ayudar a optimizar la selección del tratamiento y reducir la exposición innecesaria al tratamiento.

A pesar de estos resultados alentadores, se deben reconocer varias limitaciones al interpretar los resultados actuales. En primer lugar, el tamaño de la muestra es pequeño (10 pacientes clínicos, 3 organoides primarios utilizados para las pruebas de fármacos). Los estudios futuros deben ampliar el tamaño de la muestra para verificar la universalidad del modelo. En segundo lugar, el modelo no incluye células inmunitarias (como las células T y los macrófagos) y células endoteliales vasculares. No puede simular el microambiente inmunosupresor del CRC y la angiogénesis tumoral. Estos dos factores son variables clave que afectan a la eficacia de la quimioterapia clínica.^[31,32] Además, la heterogeneidad específica del sitio anatómico también puede provocar diferencias en el comportamiento tumoral del CRC y la respuesta a los fármacos.^[33] Estudios anteriores han demostrado que el CRC proximal y el CRC distal presentan diferencias significativas en términos de infiltración inmunitaria, características mucinosas y remodelación de la matriz/MEC,^[34,35] y estas diferencias pueden influir aún más en el comportamiento celular y la sensibilidad a los fármacos en los modelos de CRC impresos en 3D. Aunque este estudio no realizó un análisis estratificado por ubicación anatómica, este factor puede ser una fuente importante de heterogeneidad del modelo y requiere una validación adicional en cohortes más amplias. Además, las pruebas de fármacos solo evaluaron la eficacia a corto plazo. Carece de un seguimiento a largo plazo de la resistencia a los fármacos y no puede reproducir completamente el fenómeno de la sensibilidad inicial seguida de la resistencia a los fármacos en la práctica clínica. Los estudios futuros pueden mejorar aún más la precisión de la predicción clínica del modelo mediante la construcción de modelos de cocultivo de células tumorales, células inmunitarias y células endoteliales vasculares y la ampliación del período de observación.

CONCLUSIÓN

Este estudio construyó con éxito un modelo de organoide de CRC impreso en 3D basado en GelMA + LE2. El modelo tiene buena biocompatibilidad, capacidad de impresión y características biomiméticas del microambiente. Puede promover eficazmente la proliferación y la invasión de las células tumorales mediante la activación de la vía de señalización ErbB/Wnt y la comunicación de las uniones gap. Las pruebas de fármacos confirmaron que el modelo puede distinguir la sensibilidad a la quimioterapia del CRC con diferentes estadios T. Los resultados se correlacionan con las características patológicas clínicas, lo que proporciona una plataforma fiable para el cribado de fármacos personalizado. En resumen, el modelo impreso en 3D construido en este estudio no solo supera las limitaciones de los modelos tradicionales de CRC, sino que también establece un marco de investigación de "diseño biomimético de la MEC, mecanismo molecular y transformación clínica". Proporciona un nuevo esquema técnico y una base teórica para la investigación preclínica de la medicina de precisión del CRC.

MÉTODOS

Participantes y muestras

Toda la recogida de tejidos humanos y los experimentos han sido aprobados por el Comité de Ética de la Investigación y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico, y cumplen con los requisitos pertinentes de la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes inscritos o sus representantes legales firmaron formularios de consentimiento informado por escrito antes de la recogida de muestras.

Este estudio incluyó a 10 pacientes con CRC que se sometieron a tratamiento quirúrgico en nuestro hospital en 2025. Todos los pacientes fueron diagnosticados con CRC mediante examen patológico postoperatorio. No habían recibido tratamientos antineoplásicos, como radioterapia o quimioterapia, antes de la cirugía, no tenían antecedentes de otros tumores malignos y contaban con registros clínicos completos. Las características basales de los pacientes se muestran en la Tabla I.

Todas las muestras fueron tejidos frescos de cáncer colorrectal resecados de los pacientes. Los métodos quirúrgicos incluyeron la resección radical laparoscópica del cáncer de recto, la resección radical laparoscópica del cáncer de colon derecho y la colectomía subtotal (se formularon planes quirúrgicos específicos individualmente según la condición del paciente). Inmediatamente después de la recolección, las muestras se colocaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría que contenía un 1% de penicilina-estreptomicina y se transportaron al laboratorio en un plazo de 2 horas para el posterior aislamiento de células tumorales y la construcción de un modelo bioimpreso en 3D. El proceso de recolección de muestras siguió estrictamente las especificaciones de operación estéril para evitar la contaminación y la necrosis de los tejidos. Para tener en cuenta la posible heterogeneidad específica del sitio, las muestras de cáncer colorrectal se clasificaron adicionalmente según su origen anatómico. La clasificación anatómica detallada y las características patológicas se proporcionan en el material suplementario, Tabla 1.

Aislamiento y cultivo celular

En una campana de bioseguridad, los tejidos utilizados para el aislamiento y cultivo de células tumorales se lavaron de tres a cinco veces con PBS frío (Servicebio, G4207-500ML) que contenía un 1% de penicilina-estreptomicina (Servicebio, G4016-100ML) para eliminar las manchas de sangre superficiales, los tejidos necróticos y las bacterias. Los tejidos se cortaron en pequeños fragmentos de 1-3 mm³ sobre hielo con un bisturí estéril. Se añadió un medio de digestión de tejidos (DMEM, medio de Eagle modificado de Dulbecco)/medio F12 suplementado con 1,5 mg/ml de colagenasa II, 0,15 mg/ml de hialuronidasa y 1% de penicilina-estreptomicina. La mezcla se incubó en un incubador a 37 °C durante 1-2 horas con agitación manual cada 15 minutos. Posteriormente, se filtró a través de un tamiz celular de 100 μm para eliminar los restos de tejido no digerido. La suspensión celular filtrada se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos. Después del recuento celular, las células se resuspendieron en PBS para la posterior bioimpresión. Además, la línea celular humana de cáncer colorrectal SW620 (BNCC337664) se cultivó en medio DMEM completo (Thermo Fisher, 11965092).

Preparación de materiales de bioimpresión 3D

En este estudio, se utilizaron concentraciones graduadas de LEC combinadas con el hidrogel GelMA fotocurable para preparar biotintas de bioimpresión 3D con propiedades de ECM biomiméticas. El proceso de preparación específico fue el siguiente: se mezclaron 50 μl de GelMA al 10% (Aladdin, M752743) con 5 μl de fotoiniciador de litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato al 2% (LAP, Aladdin, l157759) y se agitaron a 37 °C en la oscuridad durante 10 minutos. Luego, se tomaron tubos EP vacíos y se añadieron volúmenes graduados de PBS/suspensión celular (40,8, 41,6 y 28,2 μl). Después de preenfriar a 4 °C, se añadieron los volúmenes correspondientes de solución de LEC (4,2, 8,4, 16,8 μl y 12 mg/ml). Después de equilibrar a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadieron 55 μl de solución de GelMA + LAP premezclada a cada tubo EP y se mezclaron a fondo. Se obtuvieron biotintas de GelMA con concentraciones de LEC de 0/0,5/1,0/2,0 μg/ml y una concentración celular de 5 × 10⁶ células/ml. En consecuencia, la composición final de las biotintas fue 5% (p/v) de GelMA para el grupo GelMA, 5% de GelMA suplementado con 0,5 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE1, 5% de GelMA suplementado con 1,0 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE2 y 5% de GelMA suplementado con 2,0 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE3. El LEC producido a partir del sarcoma Engelbreit-Holm-Swarm (EHS) contiene componentes de la matriz extracelular asociados con la membrana basal, como la laminina, el colágeno tipo IV y los proteoglicanos de heparán sulfato. GelMA, un derivado de la gelatina, ofrece principalmente un marco estructural similar al colágeno.

Construcción de modelos de cáncer colorrectal bioimpresos en 3D

La biotinta de GelMA preparada se aspiró en una jeringa y se incubó a 4 °C durante 30 minutos hasta que la tinta formó un gel. Luego, la jeringa se instaló en una bioimpresora 3D fotocurable Azure (CYBERIAD). La temperatura de la boquilla y la temperatura de la cámara se ajustaron a 20 y 10 °C, respectivamente. La impresión se realizó a una velocidad de extrusión de 1,5 mm³/s, con entrecruzamiento bajo luz ultravioleta de 405 nm (0,5 W/cm²) durante 50 segundos. Todo el proceso de impresión se completó en 2 horas. Los modelos de bioimpresión 3D impresos se recogieron en placas de 48 pocillos en la plataforma de la cámara. Para los ensayos de biocompatibilidad y proliferación, se dispensaron 2 μl de biotinta cargada con células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se fotocruzaron utilizando una fuente de luz de 405 nm durante 25 segundos. Después del entrecruzamiento, se añadieron 100 μl de medio de cultivo completo a cada pocillo. Para los ensayos de invasión, se imprimieron 5 μl de biotinta cargada con células en el centro de cada pocillo de una placa de 48 pocillos y se rodearon con 20 μl de biotinta sin células que sirvió como matriz de invasión. Las estructuras se fotocruzaron bajo luz de 405 nm durante 20 segundos y se cultivaron en 500 μl de medio completo. Para garantizar la consistencia entre los pocillos y los lotes, todas las biotintas se prepararon utilizando formulaciones y densidades celulares idénticas, y la impresión se realizó utilizando el mismo patrón digital predefinido y los parámetros de exposición. Todas las estructuras dentro del mismo experimento se fabricaron en un solo lote de impresión en condiciones ambientales idénticas.

Evaluación de las propiedades mecánicas del modelo

Se utilizó un reómetro DHR para evaluar las propiedades reológicas de los modelos de bioimpresión 3D. La biotinta de GelMA + LE se inyectó en el accesorio de placa paralela del reómetro para garantizar que la superficie de la muestra estuviera plana y libre de burbujas. Se equilibró a 37 °C durante 5 minutos. Se completó la medición inicial de los parámetros reológicos iniciales en ausencia de luz. Posteriormente, se realizó la irradiación con luz ultravioleta a 405 nm (0,5 W/cm²) para controlar los cambios en los parámetros reológicos durante el entrecruzamiento y analizar la transición sol-gel del material. Se utilizó un MicroSquisher para medir el módulo elástico de los modelos de bioimpresión 3D. Para las pruebas mecánicas, se prepararon estructuras acelulares utilizando la misma formulación de biotinta descrita anteriormente, excepto que la suspensión celular se reemplazó con PBS estéril. Se depositaron 10 μl de biotinta en cada pocillo y se fotocruzaron para formar estructuras de hidrogel cilíndricas (diámetro de 0,6 mm y altura de 0,6 mm). Las pruebas mecánicas se realizaron el día 1 para evaluar la estabilidad de los componentes del modelo. Durante la medición, el modelo se comprimió una vez a través de una viga y una placa de acero inoxidable mediante un desplazamiento del 17% de su altura en 25 ms, y se midió la altura del modelo después de la recuperación de la compresión para calcular el módulo de Young.

Biocompatibilidad, proliferación e invasión

Para evaluar la biocompatibilidad de las diferentes concentraciones de LEC con las células tumorales, se realizaron la tinción con calceína-AM y yoduro de propidio (Beyotime, C2015S) en los días 2 y 5 después de la impresión para distinguir las células vivas (verdes) y las células muertas (rojas). Para la proliferación celular, la evaluación se realizó utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, G7570) en los días 2, 5 y 7 según las instrucciones del fabricante. La intensidad de la fluorescencia se midió mediante un lector de microplacas (CYBERIAD).

Para evaluar el efecto del material compuesto GelMA + LE2 sobre la capacidad de invasión de las células de cáncer colorrectal, se construyeron cuatro modelos estructurales con capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2. Se inyectó una suspensión de células SW620 en la capa interna para el cultivo. La profundidad de invasión de las células se observó mediante microscopía confocal en los días 1, 7 y 15.

Secuenciación de ARN y análisis de vías

Para el análisis de secuenciación de ARN, se extrajo el ARN total de las células del grupo GelMA y del grupo GelMA + LE2 después de 7 días de cultivo impreso en 3D utilizando el método TRIzol. El ARNm se enriqueció mediante la selección de PolyA, y se realizó la secuenciación de ARN en la plataforma de secuenciación de alto rendimiento Illumina NovaSeq 6000. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se seleccionaron utilizando el software DESeq2 con los umbrales de p < 0,05 y |log2FC| > 1. Se identificaron un total de 62 DEG, incluidos 31 genes regulados positivamente y 31 genes regulados negativamente. Después de obtener los DEG, se realizó un análisis de enriquecimiento GO para caracterizar sus funciones. Posteriormente, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías de los DEG utilizando las bases de datos KEGG, Reactome y WikiPathways, con un enfoque en las vías relacionadas con la proliferación y la invasión tumoral.

Pruebas de fármacos

Se utilizaron cuatro regímenes de quimioterapia de primera línea para el CRC para las pruebas de sensibilidad a los fármacos, incluidos los fármacos únicos (irinotecán, oxaliplatino y fluorouracilo) y un régimen combinado [oxaliplatino + capecitabina, con 5-fluorouracilo (5-FU) como sustituto]. Las tres líneas principales de organoides se derivaron de pacientes con adenocarcinoma moderadamente diferenciado confirmado patológicamente (todos N0M0, sin metástasis a distancia). Incluyeron dos muestras de etapa T3 (P2 y P10, invasión tumoral a través de la muscularis propia hasta la subserosa) y una muestra de etapa T2 (P4, invasión tumoral en la muscularis propia), lo que permite una comparación precisa de las diferencias en la respuesta a los fármacos en diferentes profundidades de invasión tumoral.

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 8.0 para el análisis estadístico. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre múltiples grupos se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. El análisis estadístico se realizó utilizando datos de al menos tres experimentos independientes. Se consideró que p < 0,05 era estadísticamente significativo. La selección de genes expresados diferencialmente se realizó utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.30.0) en el entorno R (versión 4.0.3), con p < 0,05 y |log2FC| > 1 como umbrales de significación. El análisis de enriquecimiento de genes se completó utilizando el paquete clusterProfiler (versión 3.18.0), con FDR < 0,05 definido como significativo. La correlación entre los resultados del tratamiento clínico y las respuestas a los fármacos de los modelos de bioimpresión 3D se evaluó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson o el coeficiente de correlación de rango de Spearman. La fuerza de la correlación se expresó como el valor r, y se calculó el intervalo de confianza del 95%.

Participantes y muestras

Toda la recolección de tejidos humanos y los experimentos han sido aprobados por el Comité de Ética de la Investigación y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico, y cumplen con los requisitos pertinentes de la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes inscritos o sus representantes legales firmaron formularios de consentimiento informado por escrito antes de la recolección de muestras.

Este estudio incluyó a 10 pacientes con CRC que se sometieron a tratamiento quirúrgico en nuestro hospital en 2025. Todos los pacientes fueron diagnosticados con CRC mediante examen patológico postoperatorio. No habían recibido tratamientos antineoplásicos, como radioterapia o quimioterapia, antes de la cirugía, no tenían antecedentes de otros tumores malignos y contaban con registros clínicos completos. Las características basales de los pacientes se muestran en la Tabla I.

Todos los especímenes eran tejidos frescos de cáncer colorrectal obtenidos de pacientes mediante resección. Los métodos quirúrgicos incluyeron la resección laparoscópica radical del cáncer de recto, la resección laparoscópica radical del cáncer de colon derecho y la colectomía subtotal (se formularon planes quirúrgicos específicos individualmente según la condición del paciente). Inmediatamente después de la recolección, los especímenes se colocaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría que contenía un 1% de penicilina-estreptomicina y se transportaron al laboratorio en un plazo de 2 horas para el posterior aislamiento de células tumorales y la construcción del modelo bioimpreso en 3D. El proceso de recolección de especímenes siguió estrictamente las especificaciones de operación estéril para evitar la contaminación y la necrosis de los tejidos. Para tener en cuenta la posible heterogeneidad específica del sitio, los especímenes de cáncer colorrectal se clasificaron adicionalmente según su origen anatómico. Se proporciona una clasificación anatómica detallada y las características patológicas en la tabla 1 del material suplementario.

Aislamiento y cultivo celular

En una campana de bioseguridad, los tejidos utilizados para el aislamiento y cultivo de células tumorales se lavaron de tres a cinco veces con PBS frío (Servicebio, G4207-500ML) que contenía un 1% de penicilina-estreptomicina (Servicebio, G4016-100ML) para eliminar las manchas de sangre superficiales, los tejidos necróticos y las bacterias. Los tejidos se cortaron en pequeños fragmentos de 1-3 mm³ sobre hielo con un bisturí estéril. Se añadió un medio de digestión de tejidos (DMEM, medio de Eagle modificado de Dulbecco)/medio F12 suplementado con 1,5 mg/ml de colagenasa II, 0,15 mg/ml de hialuronidasa y 1% de penicilina-estreptomicina. La mezcla se incubó en una incubadora a 37 °C durante 1-2 horas con agitación manual cada 15 minutos. Posteriormente, se filtró a través de un tamiz celular de 100 μm para eliminar los restos de tejido no digerido. La suspensión celular filtrada se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos. Después del recuento celular, las células se resuspendieron en PBS para la posterior bioimpresión. Además, la línea celular humana de cáncer colorrectal SW620 (BNCC337664) se cultivó en medio DMEM completo (Thermo Fisher, 11965092).

Preparación de materiales de bioimpresión 3D

En este estudio, se utilizaron concentraciones graduadas de LEC combinadas con el hidrogel GelMA fotocurable para preparar biotintas de bioimpresión 3D con propiedades de ECM biomiméticas. El proceso de preparación específico fue el siguiente: se mezclaron 50 μl de GelMA al 10% (Aladdin, M752743) con 5 μl de fotoiniciador de litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP, Aladdin, l157759) al 2% y se agitaron a 37 °C en la oscuridad durante 10 minutos. A continuación, se tomaron tubos EP vacíos y se añadieron volúmenes graduados de PBS/suspensión celular (40,8, 41,6 y 28,2 μl). Después de preenfriar a 4 °C, se añadieron los volúmenes correspondientes de solución de LEC (4,2, 8,4, 16,8 μl y 12 mg/ml). Después de equilibrar a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añadieron 55 μl de solución de GelMA + LAP premezclada a cada tubo EP y se mezclaron a fondo. Se obtuvieron biotintas de GelMA con concentraciones de LEC de 0/0,5/1,0/2,0 μg/ml y una concentración celular de 5 × 106 células/ml. En consecuencia, la composición final de las biotintas fue 5% (p/v) de GelMA para el grupo GelMA, 5% de GelMA suplementado con 0,5 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE1, 5% de GelMA suplementado con 1,0 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE2 y 5% de GelMA suplementado con 2,0 mg/ml de LEC para el grupo GelMA + LE3. El LEC producido a partir del sarcoma Engelbreit-Holm-Swarm (EHS) contiene componentes de la matriz extracelular asociados con la membrana basal, como la laminina, el colágeno tipo IV y los proteoglicanos de heparán sulfato. GelMA, un derivado de la gelatina, ofrece principalmente un marco estructural similar al colágeno.

Construcción de modelos de cáncer colorrectal bioimpresos en 3D

La biotinta de GelMA preparada se aspiró en una jeringa y se incubó a 4 °C durante 30 minutos hasta que la tinta formó un gel. A continuación, la jeringa se instaló en una bioimpresora 3D fotocurable Azure (CYBERIAD). La temperatura de la boquilla y la temperatura de la cámara se ajustaron a 20 y 10 °C, respectivamente. La impresión se realizó a una velocidad de extrusión de 1,5 mm³/s, con entrecruzamiento bajo luz ultravioleta de 405 nm (0,5 W/cm²) durante 50 segundos. Todo el proceso de impresión se completó en 2 horas. Los modelos de bioimpresión 3D impresos se recogieron en placas de 48 pocillos en la plataforma de la cámara. Para los ensayos de biocompatibilidad y proliferación, se dispensaron 2 μl de biotinta cargada con células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se fotocruzaron utilizando una fuente de luz de 405 nm durante 25 segundos. Después del entrecruzamiento, se añadieron 100 μl de medio de cultivo completo a cada pocillo. Para los ensayos de invasión, se imprimieron 5 μl de biotinta cargada con células en el centro de cada pocillo de una placa de 48 pocillos y se rodearon con 20 μl de biotinta sin células que sirvió como matriz de invasión. Los constructos se fotocruzaron bajo luz de 405 nm durante 20 segundos y se cultivaron en 500 μl de medio completo. Para garantizar la consistencia entre los pocillos y los lotes, todas las biotintas se prepararon utilizando formulaciones y densidades celulares idénticas, y la impresión se realizó utilizando el mismo patrón digital predefinido y los parámetros de exposición. Todos los constructos dentro del mismo experimento se fabricaron en un único lote de impresión en condiciones ambientales idénticas.

Evaluación de las propiedades mecánicas del modelo

Se utilizó un reómetro DHR para evaluar las propiedades reológicas de los modelos de bioimpresión 3D. La biotinta de GelMA + LE se inyectó en el accesorio de placa paralela del reómetro para garantizar que la superficie de la muestra estuviera plana y libre de burbujas. Se equilibró a 37 °C durante 5 minutos. Se completó la medición inicial de los parámetros reológicos iniciales en ausencia de luz. Posteriormente, se realizó la irradiación con luz ultravioleta a 405 nm (0,5 W/cm²) para controlar los cambios en los parámetros reológicos durante el entrecruzamiento y analizar la transición sol-gel del material. Se utilizó un MicroSquisher para medir el módulo elástico de los modelos de bioimpresión 3D. Para las pruebas mecánicas, se prepararon constructos acelulares utilizando la misma formulación de biotinta descrita anteriormente, excepto que la suspensión celular se reemplazó con PBS estéril. Se depositaron 10 μl de biotinta en cada pocillo y se fotocruzaron para formar constructos de hidrogel cilíndricos (diámetro de 0,6 mm y altura de 0,6 mm). Las pruebas mecánicas se realizaron el día 1 para evaluar la estabilidad de los componentes del modelo. Durante la medición, el modelo se comprimió una vez a través de una viga y una placa de acero inoxidable mediante un desplazamiento del 17% de su altura en 25 ms, y se midió la altura del modelo después de la recuperación de la compresión para calcular el módulo de Young.

Biocompatibilidad, proliferación e invasión

Para evaluar la biocompatibilidad de las diferentes concentraciones de LEC con las células tumorales, se realizaron la tinción con calceína-AM y yoduro de propidio (Beyotime, C2015S) en los días 2 y 5 después de la impresión para distinguir las células vivas (verdes) y las células muertas (rojas). Para la proliferación celular, la evaluación se realizó utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, G7570) en los días 2, 5 y 7 según las instrucciones del fabricante. La intensidad de la fluorescencia se midió mediante un lector de microplacas (CYBERIAD).

Para evaluar el efecto del material compuesto GelMA + LE2 sobre la capacidad de invasión de las células de cáncer colorrectal, se construyeron cuatro modelos estructurales con capas internas y externas de GelMA o GelMA + LE2. Se inyectó una suspensión de células SW620 en la capa interna para el cultivo. La profundidad de invasión de las células se observó mediante microscopía confocal en los días 1, 7 y 15.

Secuenciación de ARN y análisis de vías

Para el análisis de secuenciación de ARN, se extrajo el ARN total de las células del grupo GelMA y del grupo GelMA + LE2 después de 7 días de cultivo impreso en 3D utilizando el método TRIzol. El ARNm se enriqueció mediante la selección de PolyA, y se realizó la secuenciación de ARN en la plataforma de secuenciación de alto rendimiento Illumina NovaSeq 6000. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se seleccionaron utilizando el software DESeq2 con los umbrales de p < 0,05 y |log2FC| > 1. Se identificaron un total de 62 DEG, incluidos 31 genes regulados positivamente y 31 genes regulados negativamente. Después de obtener los DEG, se realizó un análisis de enriquecimiento GO para caracterizar sus funciones. Posteriormente, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías de los DEG utilizando las bases de datos KEGG, Reactome y WikiPathways, con un enfoque en las vías relacionadas con la proliferación y la invasión tumoral.

Pruebas de fármacos

Se utilizaron cuatro regímenes de quimioterapia de primera línea para el CRC para las pruebas de sensibilidad a los fármacos, incluidos los fármacos únicos (irinotecán, oxaliplatino y fluorouracilo) y un régimen combinado [oxaliplatino + capecitabina, con 5-fluorouracilo (5-FU) como sustituto]. Las tres líneas de organoides primarias se derivaron de pacientes con adenocarcinoma moderadamente diferenciado confirmado patológicamente (todos N0M0, sin metástasis a distancia). Incluyeron dos muestras de etapa T3 (P2 y P10, invasión tumoral a través de la muscularis propia hasta la subserosa) y una muestra de etapa T2 (P4, invasión tumoral en la muscularis propia), lo que permite una comparación precisa de las diferencias en la respuesta a los fármacos en diferentes profundidades de invasión tumoral.

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 8.0 para el análisis estadístico. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre múltiples grupos se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. El análisis estadístico se realizó utilizando datos de al menos tres experimentos independientes. Se consideró que p < 0,05 era estadísticamente significativo. La selección de genes expresados diferencialmente se realizó utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.30.0) en el entorno R (versión 4.0.3), con p < 0,05 y |log2FC| > 1 como umbrales de significación. El análisis de enriquecimiento de genes se completó utilizando el paquete clusterProfiler (versión 3.18.0), con FDR < 0,05 definido como significativo. La correlación entre los resultados clínicos del tratamiento y las respuestas a los fármacos de los modelos de bioimpresión 3D se evaluó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson o el coeficiente de correlación de rango de Spearman. La fuerza de la correlación se expresó como el valor r, y se calculó el intervalo de confianza del 95%.

MATERIAL SUPLEMENTARIO

Consulte el material suplementario para lo siguiente: Figura suplementaria 1. Análisis transcriptómico de los modelos GelMA y GelMA + LE2; gráficos de análisis transcriptómico suplementarios que comparan los perfiles de expresión génica de las células cultivadas en los modelos GelMA y GelMA + LE2; Figura suplementaria 2. Análisis de enriquecimiento de vías de los genes expresados diferencialmente entre los grupos GelMA y GelMA + LE2; Tabla de material suplementario I. Clasificación del sitio anatómico y características patológicas de los especímenes de cáncer colorrectal; y Tabla de material suplementario II. Comparación de diferentes modelos preclínicos de CRC.