La inhibición de CDK9 sensibiliza a las células de cáncer colorrectal con mutación BRAF (V600E) que son intrínsecamente resistentes a los inhibidores de BRAF.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo^[1]. En los Estados Unidos, se estima que en 2025 se producirán 154.270 nuevos casos y 52.900 muertes^[2]. Aproximadamente el 10% de los pacientes con CCR presentan una mutación en el gen BRAF, y este tipo de CCR es más agresivo y tiene un peor pronóstico que otros tipos^[3]. Cabe destacar que la mutación en el gen BRAF conlleva una falta de beneficio con la quimioterapia estándar^[4],^[5]. La mutación V600E representa el 95% de todas las mutaciones en el gen BRAF en el CCR y se asocia con el sexo femenino, tumor primario en el lado derecho, tumores mucinosos y mayor metástasis^[6], ^[7], ^[8]. A nivel molecular, la mutación BRAF
V600E provoca la activación de la cascada de señalización de BRAF a través del monómero de BRAF y de forma independiente a RAS^[9]. La activación de sus efectores posteriores, incluyendo MEK y ERK, es particularmente fuerte^[10]. La desregulación incontrolada de la señalización posterior forma una alta capacidad de activación de la vía MAPK, lo que aumenta aún más la transcripción de oncogenes y promueve la diferenciación celular tumoral, la proliferación, la supervivencia y la resistencia a la apoptosis^[11].

Actualmente, Encorafenib, Vemurafenib y Dabrafenib son los inhibidores de BRAF aprobados por la FDA para los melanomas metastásicos^[12]; las expectativas eran altas cuando se investigó la monoterapia con inhibidores de BRAF en el CCR metastásico mutado en el gen BRAF
V600E. Desafortunadamente, no hubo beneficio y la respuesta a la monoterapia con inhibidores de BRAF fue pobre en pacientes con CCR mutado en el gen BRAF
V600E^[13]. A nivel molecular, la activación de p-EGFR es responsable de la resistencia a la monoterapia con inhibidores de BRAF en el CCR metastásico^[14]. Esto condujo a la investigación y aprobación de la combinación de Encorafenib (inhibidor de BRAF) y Cetuximab (inhibidor de EGFR) para el CCR metastásico mutado en el gen BRAF
V600E resistente a la quimioterapia^[15]. Si bien la combinación triple de Encorafenib, Cetuximab y Binimetinib (inhibidor de MEK) mostró una supervivencia global (OS) y una supervivencia libre de progresión (PFS) similares a la combinación doble de Encorafenib y Cetuximab, la combinación triple condujo a tasas ligeramente más altas de eventos adversos, lo que llevó a la aprobación de la combinación doble^[16],^[17]. Más recientemente, la FDA aprobó el inhibidor de BRAF (Encorafenib) en combinación con Cetuximab y mFOLFOX6 (Fluorouracilo, Leucovorina y Oxaliplatino) para el tratamiento de pacientes con CCR metastásico mutado en el gen BRAF
V600E diagnosticado recientemente^[18],^[19]. Sin embargo, una proporción de pacientes con CCR metastásico sigue siendo intrínsecamente resistente a los inhibidores de BRAF, y algunos pacientes que inicialmente responden posteriormente adquieren resistencia a los inhibidores de BRAF durante el tratamiento. En el estudio BREAKWATER, casi el 50% de los pacientes progresaron con Encorafenib más Cetuximab y quimioterapia en un plazo de un año^[20]. Debido a la resistencia intrínseca a los inhibidores de BRAF, otros inhibidores de BRAF, como Dabrafenib en combinación con Trametinib, no son beneficiosos para el CCR metastásico refractario^[21].

Debido a la prevalencia de la resistencia a los fármacos, es urgente descubrir nuevos agentes para sensibilizar a los inhibidores de BRAF en el CCR metastásico. Por lo tanto, realizamos un cribado de alto rendimiento de una biblioteca de quinasas para determinar los mejores compuestos para sinergizar con los inhibidores de BRAF. CDK9 se identificó como un prometedor objetivo candidato. CDK9, un regulador global de la transcripción, afecta a múltiples redes transcripcionales oncogénicas y es un objetivo prometedor en los tumores impulsados por MYC, como el CCR^[22]. El grupo de Hsu^[23] identificó que la co-inhibición de CDK2 y CDK9 puede servir como una nueva terapia combinatoria para el tratamiento del CCR. En el trabajo en curso en nuestro laboratorio, descubrimos que los inhibidores de CDK9 suprimieron la transcripción de varias moléculas de señalización de la vía MAP quinasa. Dada la prometedora actividad terapéutica de los inhibidores de CDK9 y su mecanismo de acción, es concebible que la combinación de un inhibidor de CDK9 con un inhibidor de BRAF pueda conducir a una actividad antitumoral sinérgica contra el CCR metastásico mutado en el gen BRAF. Por lo tanto, se investigó el efecto combinatorio de los inhibidores de BRAF (Encorafenib y Dabrafenib) y 3 inhibidores de CDK9 clínicamente prometedores (AZD4573, NVP2, BAY1251152) en modelos de CCR in vitro e in vivo con mutación pV600E.

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Los inhibidores de BRAF (Encorafenib y Dabrafenib), 3 inhibidores de CDK9 bien caracterizados (AZD4573, NVP2, BAY-1251152), los inhibidores de MEK (Binimetinib, Trametinib), los inhibidores de ERK (ASN007, Ravoxertinib) y la biblioteca de quinasas (Tabla S1 en la información complementaria) se compraron a MedChemExpress LLC. El siRNA de CDK9 (h) (sc-29268) se compró a Santa Cruz (Dallas, TX). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

Cultivo celular y líneas celulares

Las líneas celulares HCT116, RKO, LS513, SW1463, HT-29, Colo205 y CCD-841 CoN se compraron al American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Las células HCT116 BRAF pV600E se obtuvieron de GeneCopoeia, Inc., (Rockville, MD, USA). Las células RKO-5FUR10 fueron un regalo de los Dres. Schmitz y Liu del UPMC Hillman Cancer Center^[24]. Todas las células se mantuvieron en RPMI-1640 (ATCC, Manassas, VA) con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) (Gemini Bio-Products; Sacramento, CA, USA) a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2. Las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR humano realizado por el Núcleo de Genómica del Albert Einstein College of Medicine. Las células se controlaron cada 2 meses para detectar micoplasma con Myco-Sniff-Valid (MP Biomedicals, MP093050301; Lote ID: U1124283604).

Cribado de alto rendimiento (HTS)

Las células RKO se sembraron en placas de pocillos negros CELLSTAR® uCLEAR® de 384 pocillos (Greiner, Monroe, NC, USA) a una densidad de 1000 células/pocillo. Los inhibidores de quinasas se resuspendieron como soluciones madre de 20 μmol/L, y se dispensaron 0,1 μL en las placas de 384 pocillos utilizando un manipulador de líquidos BRAVO (Agilent, Santa Clara, CA, USA) en un diseño de placa aleatorio para controlar los efectos de la placa. Todos los inhibidores de quinasas se probaron a 50 nmol/L con y sin Encorafenib (300 nmol/L). Después de 72 h, se añadieron 20 μL de reactivo CellTiter-Glo (Promega #G9241) a cada pocillo. La placa de 384 pocillos se colocó en un BioTek Cytation 5 (Agilent, Santa Clara, CA, USA), seguida de una suave agitación durante 2 minutos, y se midió la luminiscencia utilizando unidades de luminiscencia relativa (RLU).

Ensayo de crecimiento celular

La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo MTS (Promega #G5430). Las células de CCR se sembraron en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con varias concentraciones de inhibidores de BRAF (Enco o Dabr) durante 72 h. El valor de IC50 de cada compuesto se calculó mediante el software GraphPad Prism 9.0. Según el IC50 de un solo fármaco, las células se trataron con inhibidores de CDK9 en combinación con inhibidores de BRAF, MEK y ERK durante 72 h, y el software CalcuSyn (versión 2.0, Biosoft, Cambridge, Reino Unido) se utilizó para calcular el índice de combinación (CI).

Ensayo de tinción con cristal violeta: las células humanas de CCR se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1,25 × 105 y luego se trataron con inhibidores de BRAF y/o inhibidores de CDK9 durante 48 h, y las células vivas se tiñeron con cristal violeta. Ensayo de formación de colonias: las células humanas de CCR se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 400 células/pocillo. Al día siguiente, las células se trataron con varias concentraciones de inhibidores de BRAF durante 24 h, y el medio de cultivo se reemplazó cada 3-4 días. Después de 10-14 días, las colonias se fijaron con cristal violeta durante 30 minutos, se lavaron y se dejaron secar al aire antes de contar las colonias de >50 células.

Ensayo de apoptosis

Como se describió anteriormente^[25], las células RKO se trataron con Encorafenib/Dabrafenib (300 nmol/L) y/o NVP2 (30 nmol/L) durante 24 h. Las células apoptóticas se determinaron mediante el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V (BD Biosciences; San Jose, CA, USA) y se analizaron en el citómetro de flujo (citómetro de flujo analítico Cytek Aurora) en el Núcleo de Citometría de Flujo del Albert Einstein College of Medicine.

Análisis inmunoblot

El análisis inmunoblot se realizó como se describió anteriormente^[26]. Se enumeró la información detallada de los anticuerpos primarios en la Tabla S2 en la información complementaria. Las intensidades de la señal se cuantificaron utilizando el software Image J. La expresión proteica relativa se normalizó mediante la expresión de β-actina o GAPDH.

Cultivo de organoides de cáncer colorrectal humano

Los organoides de cáncer de colon humano (BRAF
V600E: #CK9677-ID-624824-186-R; #CK7719-ID-282377-053-R; #CK8485-ID-857933-349-R; #CK8911-ID-616215-338-R) se obtuvieron del NCI, y otro organoide de CCR (#CRC-22-007, BRAF WT; #CRC-22-008, BRAF WT) se generó en nuestro laboratorio (Einstein IRB# 2021-13730). Se enumeró la información detallada para el cultivo de organoides de CCR en la Tabla S3 y la información complementaria (métodos).

Ensayo de viabilidad celular 3D Cell Titer-Glo

Según nuestro protocolo anterior^[26], la viabilidad de los PDO se determinó mediante el reactivo CellTiter-Glo® 3D (Promega G9683). La luminiscencia se detectó mediante el lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech).

Secuenciación de ARN

Las células RKO se trataron con el inhibidor de CDK9 (NVP2 30 nmol/L), y el ARN total se extrajo utilizando el kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Cat #R2071). La concentración y la pureza del ARN se evaluaron utilizando un NanoDrop 2000 (ThermoFisher). La secuenciación de ARN se realizó por Novogene (Sacramento, CA, USA) para el análisis.

Análisis de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA)

Como se describió anteriormente^[25], las células RKO se trataron con NVP2 (30 nmol/L) y/o Encorafenib (300 nmol/L) durante 24 h, las células se recolectaron y se prepararon los lisados proteicos. El RPPA se realizó en el Núcleo de Proteómica Funcional RPPA del MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, USA) para el análisis.

Modelo de xenoinjerto de RKO en ratones

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Albert Einstein College of Medicine (protocolo #00001618, aprobado el 5/1/2023). Las células RKO (5 × 106) se contaron utilizando azul de tripan para determinar la viabilidad, se prepararon como una suspensión de células individuales en 0,2 mL de PBS y se implantaron subcutáneamente en el flanco de ratones hembra nude atímicos (6-8 semanas). Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos (5 ratones/grupo): (1) Control (10% de DMSO + 90% de (20% de SBE-β-CD en solución salina)); (2) Encorafenib (10 mg/kg); (3) NVP2 (8 mg/kg); (4) Grupo de combinación. El volumen del tumor se calculó según la ecuación (1): donde L y W representan la longitud y el ancho del tumor del ratón. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron 3 veces por semana. Los animales se sacrificaron el día 20, 2 horas después del último tratamiento con el fármaco. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La tinción con inmunohistoquímica para TUNEL, Ki-67 y p-ERK se realizó en el Núcleo de Histología y Patología Comparada del Albert Einstein, y el porcentaje de Ki-67 positivo se calculó mediante Image J.

Xenoinjerto derivado de pacientes

El tejido PDX (#MA1119-ID-624824-186-R, BRAF
V600E; #CM0050-ID-234829-215-T, BRAF WT) se obtuvo del Repositorio de Modelos Derivados de Pacientes del NCI (PDMR). Según el protocolo del NCI, los tejidos tumorales se implantaron en ratones NOD-SCID (6-8 semanas). Utilizando el pasaje 3, los tejidos tumorales PDX se recolectaron y se expandieron. Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 200-300 mm3, los ratones se dividieron en 4 grupos, incluyendo (1) grupo de control; (2) NVP2 (8 mg/kg); (3) Encorafenib (10 mg/kg); (4) NVP2+Encorafenib. Los volúmenes tumorales y el peso corporal se controlaron 3 veces por semana. Los ratones que portaban el tumor #MA1119 del grupo de control se sacrificaron el día 13, y los demás ratones se sacrificaron el día 20, 2 horas después del último tratamiento con el fármaco. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La tinción con inmunohistoquímica para TUNEL, Ki-67 y p-S6 se realizó en el Núcleo de Histología y Patología Comparada del Albert Einstein. Los tejidos tumorales se utilizaron para el análisis inmunoblot. Los ratones que portaban tumores BRAF WT (CM0050) se trataron con NVP2 y/o Encorafenib durante 30 días. El tamaño del tumor y el peso corporal se controlaron cada dos días.

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS (versión 16.0). La prueba t de Student (de dos colas) se utilizó para las comparaciones entre dos grupos. La prueba ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey HSD se utilizó para las comparaciones entre grupos de más de dos valores no pareados. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo.

Productos químicos y reactivos

Inhibidores de BRAF (Encorafenib y Dabrafenib), 3 inhibidores de CDK9 bien caracterizados (AZD4573, NVP2, BAY-1251152), inhibidores de MEK (Binimetinib, Trametinib), inhibidores de ERK (ASN007, Ravoxertinib) y la biblioteca de quinasas (Tabla S1 en la información complementaria) se adquirieron de MedChemExpress LLC. siRNA (h) de CDK9 (sc-29268) se adquirió de Santa Cruz (Dallas, TX). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.).

Cultivo celular y líneas celulares

HCT116, RKO, LS513, SW1463, HT-29, Colo205 y CCD-841 CoN se adquirieron del American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Las células HCT116 BRAF pV600E se obtuvieron de GeneCopoeia, Inc., (Rockville, MD, EE. UU.). Las células RKO-5FUR10 fueron un regalo de los Dres. Schmitz y Liu del UPMC Hillman Cancer Center^[24]. Todas las células se mantuvieron en RPMI-1640 (ATCC, Manassas, VA) con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) (Gemini Bio-Products; Sacramento, CA, EE. UU.) a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2. Las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR humano realizado por el Genomics Core del Albert Einstein College of Medicine. Las células se controlaron cada 2 meses para detectar la presencia de micoplasma con Myco-Sniff-Valid (MP Biomedicals, MP093050301; número de lote: U1124283604).

Cribado de alto rendimiento (HTS)

Las células RKO se sembraron en placas negras CELLSTAR® uCLEAR® de 384 pocillos (Greiner, Monroe, NC, EE. UU.) a una densidad de 1000 células/pocillo. Los inhibidores de quinasas se resuspendieron como soluciones madre de 20 μmol/L y se dispensaron 0,1 μL en las placas de 384 pocillos utilizando un dispensador de líquidos BRAVO (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) en un diseño de placa aleatorio para controlar los efectos de la placa. Todos los inhibidores de quinasas se probaron a 50 nmol/L con y sin Encorafenib (300 nmol/L). Después de 72 h, se añadieron 20 μL de reactivo CellTiter-Glo (Promega #G9241) a cada pocillo. La placa de 384 pocillos se colocó en un BioTek Cytation 5 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.), seguida de una suave agitación durante 2 minutos, y se midió la luminiscencia utilizando unidades de luminiscencia relativa (RLU).

Ensayo de crecimiento celular

La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo MTS (Promega #G5430). Las células CRC se sembraron en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con varias concentraciones de BRAFi (Enco o Dabr) durante 72 h. El valor de IC50 de cada compuesto se calculó mediante el software GraphPad Prism 9.0. Según el IC50 de un solo fármaco, las células se trataron con CDK9i en combinación con BRAFi, MEKi y ERKi durante 72 h, y el software CalcuSyn (versión 2.0, Biosoft, Cambridge, Reino Unido) se utilizó para calcular el índice de combinación (CI).

Ensayo de tinción con cristal violeta: las células humanas CRC se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1,25 × 105 y luego se trataron con BRAFi y/o CDK9i durante 48 h, y las células vivas se tiñeron con cristal violeta. Ensayo de formación de colonias: las células humanas CRC se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 400 células/pocillo. Al día siguiente, las células se trataron con varias concentraciones de BRAFi durante 24 h, y el medio de cultivo se reemplazó cada 3-4 días. Después de 10-14 días, las colonias se fijaron con cristal violeta durante 30 minutos, se lavaron y se dejaron secar al aire antes de contar las colonias >50 células.

Ensayo de apoptosis

Como se describió anteriormente^[25], las células RKO se trataron con Encorafenib/Dabrafenib (300 nmol/L) y/o NVP2 (30 nmol/L) durante 24 h. Las células apoptóticas se determinaron mediante el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V (BD Biosciences; San Jose, CA, EE. UU.) y se analizaron en el citómetro de flujo (citómetro de flujo analítico Cytek Aurora) en el Flow Cytometry Core Facility del Albert Einstein College of Medicine.

Análisis inmunoblot

El análisis inmunoblot se realizó como se describió anteriormente^[26]. La información detallada de los anticuerpos primarios se enumeró en la Tabla S2 en la información complementaria. Las intensidades de la señal se cuantificaron utilizando el software Image J. La expresión proteica relativa se normalizó mediante la expresión de β-actina o GAPDH.

Cultivo de organoides de cáncer colorrectal humano

Los organoides de cáncer de colon humano (BRAF
V600E: #CK9677-ID-624824-186-R; #CK7719-ID-282377-053-R; #CK8485-ID-857933-349-R; #CK8911-ID-616215-338-R) se obtuvieron del NCI, y otro organoide de CRC (#CRC-22-007, BRAF WT; #CRC-22-008, BRAF WT) se generó en nuestro laboratorio (Einstein IRB# 2021-13730). La información detallada para el cultivo de organoides de CRC se enumeró en la Tabla S3 en la información complementaria y en la información complementaria (métodos).

Ensayo de viabilidad celular Cell Titer-Glo 3D

Según nuestro protocolo anterior^[26], la viabilidad de los PDO se determinó mediante el reactivo CellTiter-Glo® 3D (Promega G9683). La luminiscencia se detectó mediante el lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech).

Secuenciación de ARN

Las células RKO se trataron con CDK9i (NVP2 30 nmol/L), y el ARN total se extrajo utilizando el kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Cat #R2071). La concentración y la pureza del ARN se evaluaron utilizando un NanoDrop 2000 (ThermoFisher). La secuenciación de ARN se realizó en Novogene (Sacramento, CA, EE. UU.) para su análisis.

Análisis de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA)

Como se describió anteriormente^[25], las células RKO se trataron con NVP2 (30 nmol/L) y/o Encorafenib (300 nmol/L) durante 24 h, las células se recolectaron y se prepararon los lisados proteicos. El RPPA se realizó en el Functional Proteomics RPPA Core Facility en el MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, EE. UU.) para su análisis.

Modelo de xenoinjerto de RKO en ratones

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Albert Einstein College of Medicine (protocolo #00001618, aprobado el 5/1/2023). Las células RKO (5 × 106) se contaron utilizando azul de tripan para determinar la viabilidad, se prepararon como una suspensión de células individuales en 0,2 mL de PBS y se implantaron subcutáneamente en el flanco de ratones hembra desnudos atímicos (6-8 semanas). Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos (5 ratones/grupo): (1) Control (10% de DMSO + 90% de (20% de SBE-β-CD en solución salina)); (2) Encorafenib (10 mg/kg); (3) NVP2 (8 mg/kg); (4) Grupo de combinación. El volumen del tumor se calculó según la ecuación (1): donde L y W representan la longitud y el ancho del tumor del ratón. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron 3 veces por semana. Los animales se sacrificaron el día 20, 2 h después del último tratamiento con el fármaco. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C. Se realizó la tinción con inmunohistoquímica para TUNEL, Ki-67 y p-ERK en el Albert Einstein Histology and Comparative Pathology core, y el porcentaje positivo de Ki-67 se calculó mediante Image J.

Xenoinjerto derivado de pacientes

El tejido PDX (#MA1119-ID-624824-186-R, BRAF
V600E; #CM0050-ID-234829-215-T, BRAF WT) se obtuvo del NCI Patient-Derived Models Repository (PDMR). Según el protocolo del NCI, los tejidos tumorales se implantaron en ratones NOD-SCID (6-8 semanas). Utilizando el pasaje 3, los tejidos tumorales PDX se recolectaron y se expandieron. Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 200-300 mm3, los ratones se dividieron en 4 grupos, que incluyeron (1) grupo de control; (2) NVP2 (8 mg/kg); (3) Encorafenib (10 mg/kg); (4) NVP2+Encorafenib. Los volúmenes tumorales y el peso corporal se controlaron 3 veces por semana. Los ratones que portaban el tumor #MA1119 del grupo de control se sacrificaron el día 13, y los demás ratones se sacrificaron el día 20, 2 h después del último tratamiento con el fármaco. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C. Se realizó la tinción con inmunohistoquímica para TUNEL, Ki-67 y p-S6 en el Albert Einstein Histology and Comparative Pathology core. Los tejidos tumorales se utilizaron para el análisis inmunoblot. Los ratones que portaban tumores BRAF WT (CM0050) se trataron con NVP2 y/o Encorafenib durante 30 días. El tamaño del tumor y el peso corporal se controlaron cada dos días.

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS (versión 16.0). Se utilizó la prueba t de Student (de dos colas) para las comparaciones de dos grupos. Se utilizó ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey para las comparaciones entre grupos de más de dos valores no pareados. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.

Resultados

Las células RKO y HT-29 exhiben resistencia intrínseca a la monoterapia con BRAFi

Para comparar la sensibilidad y la selectividad de BRAFi frente a las células humanas CRC, se utilizaron 3 células CRC con BRAF
V600E (Colo205, RKO, HT-29) y 3 células CRC con BRAF de tipo salvaje (LS513, HCT116 y SW1463) para determinar la citotoxicidad de Encorafenib y Dabrafenib. Como se muestra en la Fig. 1A y en la Tabla S4 en la información complementaria, las células Colo205 son más sensibles a BRAFi que las células RKO y HT-29. El IC50 de BRAFi solo en las células Colo205 es de aproximadamente 1 nmol/L; mientras que el IC50 de BRAFi en las células RKO y HT-29 es 300-400 veces mayor que en las células Colo205 (RKO = 309,8 ± 12,4 nmol/L; HT-29 = 398,1 ± 9,8 nmol/L); este resultado sugiere que las células RKO y HT-29 albergan una resistencia intrínseca a BRAFi. Mientras tanto, el valor de IC50 de las células CRC BRAF de tipo salvaje es superior a 10 000 nmol/L, lo que demuestra que los BRAFi son selectivos frente a las células CRC mutantes BRAF
V600E. Confirmamos además la sensibilidad de BRAFi en Colo205, RKO y HT-29 mediante el ensayo de cristal violeta. Como se muestra en la Fig. 1B, 1-3 nmol/L de BRAFi suprimieron significativamente el crecimiento de las células Colo205. Cabe destacar que 10 000 nmol/L de BRAFi no pudieron suprimir por completo el crecimiento de las células RKO y HT-29. Además del ensayo MTS y del ensayo de cristal violeta, se realizó un ensayo de formación de colonias para validar la sensibilidad de BRAFi en estas células CRC. Como se ve en la Fig. 1C, la formación de colonias de Colo205 se redujo significativamente en comparación con las células RKO y HT-29, lo que es consistente con sus valores de IC50 y los resultados de supervivencia celular. Dado que p-ERK es el principal efector aguas abajo de BRAFi, la capacidad de BRAFi para inhibir p-ERK en las células CRC puede estar relacionada con su sensibilidad. De manera consistente, BRAFi solo suprimió de manera potente y continua la activación de ERK en las células Colo205. 10 nmol/L de BRAFi bloquearon casi por completo la señal de p-ERK (Fig. 1D y E). En contraste, aproximadamente el 50% de p-ERK se suprimió con 1000 nmol/L de BRAFi en las células RKO y HT-29. Mientras tanto, se observó una reactivación de la señal de p-ERK en las células RKO después de 6 h de exposición a BRAFi. Por lo tanto, BRAFi solo no pudo desactivar o mantener desactivado p-ERK de manera efectiva en las células RKO y HT-29. La restauración de la señal de p-ERK durante la exposición prolongada a BRAFi podría ser responsable de la resistencia intrínseca a BRAFi.

Se descubrió que CDK9 era un objetivo candidato mediante el cribado de alto rendimiento

La estrategia de combinación racional es un enfoque prometedor para mejorar la eficacia de BRAFi y superar la resistencia a los fármacos. Por lo tanto, se utilizó un cribado de alto rendimiento (HTS) de la biblioteca de inhibidores de quinasas para descubrir agentes candidatos que superen la resistencia intrínseca a BRAFi. En total, se analizaron más de 300 inhibidores de quinasas solos o en combinación con BRAFi (Encorafenib) (Fig. 2A). Además del hallazgo esperado de EGFRi, FGFR2i y ERKi, CDK9i exhibió el efecto sinérgico más fuerte en combinación con BRAFi (Fig. 2B). La tasa de inhibición de esta combinación sobre el crecimiento celular alcanzó aproximadamente el 98% (Fig. 2C). CDK9 es un regulador global de la elongación transcripcional y un nodo clave en múltiples redes transcripcionales oncogénicas, lo que lo convierte en un objetivo prometedor en una variedad de cánceres con adicción transcripcional, especialmente en tumores impulsados por MYC, como el CCRC. CDK9, una serina/treonina quinasa, pertenece a la familia de las CDKs (Fig. S1 en la información complementaria). Los datos de secuenciación de ARN sugieren que CDK9i suprimió la vía MAPK (P = 0,00129), incluyendo BRAF, MAPK3, MAP2K1, MAPK1, KRAS y EGFR (Fig. 2D y E). En las células de CCRC humanas, el nivel de expresión de ARNm de CDK9 está ampliamente expresado (Fig. S2 en la información complementaria). El nivel de expresión de la proteína CDK9 y la fosforilación (serina 2) de la ARN polimerasa II en las células de CCRC es mucho mayor que en las células epiteliales del colon humano normales (Fig. 2F). Además, el efecto de perturbación de CDK9 conduce a la supresión del crecimiento de las células de CCRC (la puntuación < -1; Fig. 2G). En particular, 3 CDK9i bien caracterizados redujeron significativamente el número de colonias de células RKO (Fig. 2H). Además de la supresión de la formación de colonias, el ensayo de crecimiento celular MTS mostró que CDK9i tenía una potente citotoxicidad a niveles bajos de nmol/L (AZD (~10 nmol/L) > NVP2 (~30 nmol/L) > BAY (~100 nmol/L), en la Fig. 2I). En general, CDK9i parecen ser terapias prometedoras para el CCRC mutado en BRAF
V600E.### El efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi en las células de CCRC con resistencia intrínseca

Nuestro cribado de alto rendimiento de inhibidores de quinasas y los datos de secuenciación de ARN sugirieron que CDK9i podría sensibilizar a las células de CCRC intrínsecamente resistentes a BRAFi. Para probar el potencial de sinergia entre CDK9i y BRAFi, se incubaron células RKO o HT-29 con CDK9i y/o BRAFi durante 48 horas, y las células vivas se tiñeron con cristal violeta. Como se muestra en la Fig. 3A, CDK9i en combinación con BRAFi condujo a un efecto citotóxico más fuerte que cualquier agente solo. Esto sugiere que existe un potente efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi. Para confirmar que la sinergia de esta combinación está asociada con el estado mutado de BRAF, las células HCT116 BRAF WT parentales se editaron genéticamente utilizando CRISPR-Cas9 para insertar el BRAF
V600E mutado (Fig. S3 en la información complementaria). El efecto sinérgico de esta combinación solo se observó en las células HCT116 BRAF V600E, pero no en las células parentales (Fig. 3B). Además del ensayo de supervivencia celular, el efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi sobre el crecimiento de las células RKO o HT-29 se determinó mediante el ensayo de crecimiento celular MTS y se calculó el índice de combinación (CI) mediante el método de Chou-Talalay. Como se puede ver en la Fig. 3C y D, Fig. S4–S6 en la información complementaria, CDK9i (AZD4573, NVP2 y BAY) sensibilizó significativamente la eficacia de BRAFi (Encorafenib y Dabrafenib) y tuvo un fuerte valor de CI de sinergia (< 0,5) ^[27]. Para cuantificar aún más el efecto citotóxico de esta combinación, se determinó la inducción de células apoptóticas tempranas y tardías mediante el tratamiento con CDK9i (NVP2) y BRAFi (Encorafenib y Dabrafenib) mediante citometría de flujo. CDK9i mejoró notablemente la eficacia de BRAFi en la inducción de células apoptóticas (Fig. 3E y F, Fig. S7 en la información complementaria). PARP escindida es un marcador temprano de las células que sufren apoptosis. De manera consistente, el co-tratamiento con CDK9i y BRAFi produce un mayor efecto en la elevación de PARP escindida en las células RKO y HT-29 (Fig. 3G y Fig. S8 en la información complementaria). Para validar genéticamente la inhibición de CDK9 como un sensibilizador de BRAFi, el silenciamiento de CDK9 mediante siRNA mejoró significativamente el efecto de BRAFi en la inducción de PARP escindida (Fig. 3H). Por el contrario, también comparamos el efecto de CDK9i más BRAFi en la inducción de apoptosis en las células HCT116 BRAF
V600E versus las células HCT116 BRAF WT parentales. Coherente con nuestro ensayo de supervivencia celular, el aumento sinérgico de PARP escindida solo se mostró en las células HCT116 mutadas en BRAF y no en las células BRAF WT (Fig. 3I). Dado el mayor efecto citotóxico de esta combinación en las células de CCRC, se investigó el efecto tóxico de CDK9i y/o BRAFi sobre el crecimiento de las células epiteliales del colon humano normales. Como se muestra en la Fig. 3J, después de 7 días de tratamiento, CDK9i y BRAFi solos o en combinación no afectaron el crecimiento de las células CCD-841. Las quinasas MEK y ERK son efectores clave aguas abajo de la quinasa BRAF, y es posible que CDK9i también pueda mejorar la eficacia de MEKi/ERKi. Teniendo esto en cuenta, investigamos la combinación de CDK9i con Binimetinib, Trametinib (MEKi); ASN007 o Ravo (ERKi) en las células RKO BRAF pV600E. Como se muestra en la Fig. 3K y L, CDK9i mejoró significativamente el efecto citotóxico de MEKi y ERKi, y sensibilizó la capacidad de MEKi/ERKi para inducir PARP escindida. Mientras tanto, BRAFi en combinación con MEKi se utilizó como control positivo, y se mostró un fuerte efecto sinérgico de esta combinación de fármacos sobre el crecimiento de las células RKO (Fig. S9 en la información complementaria). Estos resultados sugieren que CDK9i mejoró sinérgicamente la eficacia terapéutica de BRAFi, MEKi y ERKi en los modelos de CCRC.### CDK9i bloqueó sinérgicamente múltiples vías de señalización del cáncer y mejoró la respuesta terapéutica a BRAFi

Para aclarar los mecanismos sinérgicos de CDK9i y BRAFi, se analizaron aproximadamente 500 proteínas diana relacionadas con el cáncer mediante RPPA. Como se muestra en la Fig. 4A y B, 56 proteínas diana se alteraron significativamente (se estableció un valor de corte de aproximadamente el 30%), incluidas 26 proteínas diana que se regularon a la baja y 30 proteínas diana que se regularon al alza. Estas dianas alteradas están involucradas en múltiples procesos biológicos celulares, como la iniciación de la traducción y la regulación negativa de la expresión génica (Fig. 4C). Además, CDK9i bloqueó sinérgicamente múltiples vías de supervivencia del cáncer y mejoró las vías de apoptosis mediada por mitocondrias. En particular, MEK/ERK/S6; PI3K/AKT/mTOR/4E-BP1; miembros de la familia BCL2 y Caspasa-3/7 se suprimieron significativamente mediante el co-tratamiento. Para validar el efecto sinérgico de esta combinación en la vía RAF/MEK/ERK/S6, se trataron las células RKO con CDK9i y BRAFi durante 24 horas, y se determinaron los cambios en las proteínas diana mediante análisis de inmunoblot. La activación de BRAF, MEK, ERK y S6 se suprimió sinérgicamente mediante esta combinación de fármacos, lo que validó nuestros datos de RPPA (Fig. 4D). Además, CDK9i mejoró eficazmente la capacidad de BRAFi para bloquear p-ERK e inducir PARP escindida (Fig. 4E-G). Además de la vía BRAF/MEK/ERK/S6, la vía PI3K/AKT/mTOR/4E-BP1 también se suprimió sinérgicamente, como se muestra mediante la disminución de p-AKT, p-mTOR y p-4E-BP1 (Fig. 4H). Finalmente, esta combinación de fármacos tuvo un mayor efecto en la inducción de apoptosis, lo que condujo a reducciones en las proteínas antiapoptóticas MCL1, BCL-2, Bcl-xL y survivin, mientras que las proteínas proapoptóticas BAX y la caspasa 3 activa se elevaron (Fig. 4I y Fig. S10 en la información complementaria). En conjunto, CDK9i mejoró significativamente la eficacia de BRAFi mediante la inhibición de las vías RAF/MEK/ERK/S6 y AKT/mTOR/4E-BP1 en el CCRC mutado en BRAF
V600E (Fig. 4J).### CDK9i mejora la eficacia de BRAFi en el CCRC PDO con mutación BRAFV600E, pero no en el PDO BRAF WT

Para acelerar la investigación traslacional de la combinación de CDK9i y BRAFi, y para validar la eficacia terapéutica sinérgica en modelos de CCRC clínicamente relevantes, se trataron los organoides derivados de pacientes con CCRC (PDO) con CDK9i y/o BRAFi, incluidos 4 PDOs mutados en BRAF
V600E (CK9677; CK7719; CK8485; CK8911) y 3 PDOs de tipo salvaje BRAF (CRC-22-008; CRC-22-007; CK10278). Utilizando CK9677, un PDO mutado en BRAF
V600E, se midieron Ki-67 (marcador de proliferación celular), caspasa 3 activa (biomarcador de apoptosis) y p-ERK (efector aguas abajo clave para BRAFi) mediante tinción IHC. Como se muestra en la Fig. 5A, CDK9i en combinación con BRAFi resultó en una disminución de la tinción positiva de Ki-67 y p-ERK, junto con un aumento de la tinción de caspasa 3 activa. La tinción positiva de Ki-67 en la combinación de fármacos se redujo al 15,5%, en comparación con el control (50,8%). La señal de p-ERK se redujo notablemente (49,5% en el control vs. 3,7% en la combinación). Además, la tinción positiva de caspasa 3 activa se indujo sinérgicamente mediante NVP2 en combinación con Encorafenib (NVP2 = 27,1% vs. Encorafenib = 10,2% vs. Combinación = 55,7%). El tamaño de los PDOs en el grupo de combinación es menor que el de CDK9i o BRAFi solos. Para cuantificar la sinergia entre CDK9i y BRAFi, se determinó la viabilidad de los PDO mediante CellTiter Glo 3D. CDK9i (NVP2) o BRAFi (Encorafenib) solos ejercen un efecto citotóxico moderado sobre el crecimiento del PDO CK9677, mientras que el co-tratamiento con CDK9i y BRAFi produjo una mayor citotoxicidad que cualquier tratamiento único (Fig. 5B). Según el método de Chou-Talalay, la combinación de CDK9i (30, 60 nmol/L) y BRAFi (300, 600 nmol/L) tuvo una fuerte sinergia (CI < 0,5, Fig. 5C). Para investigar aún más esta combinación en la alteración de las redes de señalización del cáncer, se determinaron la expresión de PARP escindida, p-ERK, CDK9, c-MYC y Bcl-xL mediante análisis de inmunoblot (Fig. 5D). Coherente con nuestro resultado de RPPA, CDK9i en combinación con BRAFi inhibió sinérgicamente p-ERK, c-MYC, Bcl-xL y mejoró la expresión de la escisión de PARP. Para aumentar el rigor de nuestros hallazgos en modelos adicionales derivados de pacientes, se utilizaron 3 PDOs mutados en BRAFV600E más (CK7719; CK8485; CK8911) así como 3 PDOs de tipo salvaje BRAF (CRC-22-008; CRC-22-007; CK10278). Como se muestra en la Fig. 5E y Fig. S11 en la información complementaria, se observó el efecto sinérgico entre CDK9i y BRAFi en los PDOs mutados en BRAFV600E, mientras que no hay sinergia de esta combinación de fármacos en los PDOs de tipo salvaje BRAF. En conjunto, nuestros resultados demostraron que CDK9i suprimió sinérgicamente la señalización de BRAF/MEK/ERK e indujo la apoptosis en los PDOs de CCRC mutados en BRAF
V600E.### CDK9i sensibiliza la eficacia terapéutica in vivo de BRAFi en el xenoinjerto RKO y el PDX con BRAFV600E

Dado el potente efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi en las células de CCRC y los PDOs, se investigó aún más la eficacia de CDK9i y/o BRAFi en el xenoinjerto RKO y los modelos de PDX mutados en BRAFV600E en ratones. Como se muestra en la Fig. 6A y B, el tratamiento con monoterapia con BRAFi (Encorafenib 10 mg/kg) no suprimió significativamente el crecimiento tumoral (P = 0,13), mientras que la monoterapia con CDK9i (8 mg/kg) solo condujo a una débil actividad antitumoral en comparación con el grupo de control. En particular, la co-administración de CDK9i y BRAFi resultó en una reducción significativa del volumen tumoral (78%, P < 0,001) y el peso tumoral (Fig. 6C). No se observó un cambio significativo en el peso corporal de los ratones, incluso en el grupo de combinación (Fig. 6D). Ki-67 y TUNEL se utilizaron como biomarcadores de proliferación y apoptosis, respectivamente. El co-tratamiento con CDK9i y BRAFi resultó en una mayor reducción de la expresión de Ki-67 que cualquier tratamiento único (Fig. 6E y F). Mientras tanto, CDK9i en combinación con BRAFi resultó en un aumento significativo de la tinción positiva de TUNEL. Además, se midieron los niveles de expresión de p-ERK. Observamos una mayor inhibición de la expresión de p-ERK en el grupo de combinación, lo que se correlacionó con nuestros resultados in vitro.

Para evaluar la actividad antitumoral en un modelo clínicamente relevante in vivo, se utilizó un modelo PDX mutante de BRAF
V600E para investigar la eficacia terapéutica de esta combinación. El día 13, el volumen tumoral del grupo control alcanzó aproximadamente 2000 mm3, y el volumen tumoral de los grupos CDK9i (NVP2, 8 mg/kg) y BRAFi (Encorafenib, 10 mg/kg) disminuyó en un 40,4% y un 28,0%, respectivamente, en comparación con el control. Además, el volumen tumoral del grupo de combinación se redujo notablemente en un 73,9% (P < 0,001). Los ratones de los grupos CDK9i, BRAFi y de combinación recibieron tratamiento continuo durante una semana más, durante la cual el cotratamiento con CDK9i y BRAFi ejerció una actividad antitumoral sinérgica mayor en comparación con los tratamientos con un solo agente (Fig. 6G). Al igual que con el xenoinjerto RKO, no hubo cambios significativos en el peso corporal en todos los grupos de tratamiento (Fig. 6H). También se midió la respuesta terapéutica al tratamiento farmacológico dentro de los tumores PDX. Como se muestra en la Fig. 6I y J, la combinación de CDK9i y BRAFi bloqueó sinérgicamente la señal de p-ERK, lo que es consistente con nuestros resultados in vitro y de PDO. MCL-1 y c-MYC se suprimieron significativamente con el cotratamiento de CDK9i y BRAFi. Además, se examinaron los tumores PDX en busca de biomarcadores de crecimiento y apoptosis, incluidos Ki-67, TUNEL y p-S6. La combinación de CDK9i y BRAFi resultó en una reducción significativa de la expresión de Ki-67 y p-S6 y un aumento del tinte positivo para TUNEL (Fig. 6K y L). Estos resultados son consistentes con los datos de nuestros modelos CDX y PDO. En general, nuestro estudio mostró una sinergia entre BRAFi y CDK9i en múltiples modelos in vivo de CRC, incluido un PDX clínicamente relevante, lo que es consistente con nuestros resultados in vitro. Además, se evaluó la eficacia de CDK9i y BRAFi sobre el crecimiento de un PDX BRAF WT. Aunque CDK9i exhibió una modesta actividad antitumoral (tamaño tumoral reducido en un 36,0%), no hubo un efecto antitumoral adicional al combinarlo con BRAFi (Fig. 6M y N, CDK9i vs. CDK9i + BRAFi, P > 0,05).### CDK9i en combinación con BRAFi ejerce un efecto sinérgico y mejora la respuesta terapéutica en el CRC resistente a la quimioterapia

Más recientemente, BRAFi (Encorafenib) en combinación con Cetuximab y mFOLFOX6 ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con mCRC BRAF
V600E en primera línea, basándose en los resultados del ensayo BREAKWATER (NCT04607421)^[28]. Desafortunadamente, la resistencia a la quimioterapia sigue siendo un obstáculo para el tratamiento del mCRC. Para abordar esto, examinamos la eficacia terapéutica de BRAFi en combinación con CDK9i en un modelo de CRC resistente a la quimioterapia (RKO-5FUR10). Como se muestra en la Fig. 7A y B, las células RKO-5FUR10 exhibieron un fenotipo resistente al 5-FU, en comparación con las células parentales. Además, se investigó la eficacia de la quimioterapia (FOLFOX) en combinación con BRAFi en las células RKO y RKO-5FUR10. El efecto sinérgico de FOLFOX y BRAFi solo se observó en las células RKO, pero no en las células RKO-5FUR10 (Fig. 7C). Nuestros resultados sugieren que las células RKO-5FUR10 son resistentes a la combinación de quimioterapia y BRAFi. Cabe destacar que CDK9i en combinación con BRAFi resultó en un fuerte efecto sinérgico (CI < 0,5) sobre el crecimiento de las células de CRC resistentes a la quimioterapia (Fig. 7D–F). Observamos un efecto similar en las vías de señalización del cáncer después del tratamiento con CDK9i y BRAFi en las células de CRC resistentes a la quimioterapia en comparación con las células sensibles a la quimioterapia. Esta combinación de fármacos suprimió significativamente las vías BRAF/MEK/ERK/S6 y AKT/mTOR/4E-BP1, inhibió los efectores posteriores (c-MYC, MCL-1) de CDK9 y los miembros proapoptóticos de BCL2, y mejoró la escisión de PARP, la caspasa-3 escindida y BAX en las células RKO-5FUR10 (Fig. 7G y H). Además de las células de CRC resistentes a la quimioterapia, se utilizó un PDO de CRC resistente al 5-FU (CK7719, Fig. 7I) para evaluar la combinación de CDK9i y BRAFi. Como se muestra en la Fig. 7J, CDK9i mejoró significativamente el efecto de BRAFi en la supresión de p-ERK. En general, nuestros resultados sugieren que el efecto sinérgico entre CDK9i y BRAFi podría funcionar incluso en pacientes con CRC resistentes a la quimioterapia.

Las células RKO y HT-29 exhiben resistencia intrínseca a la monoterapia con BRAFi

Para comparar la sensibilidad y la selectividad de BRAFi contra las células de CRC humanas, se utilizaron 3 células de CRC con BRAF
V600E (Colo205, RKO, células HT-29) y 3 células de CRC con BRAF de tipo salvaje (LS513, HCT116 y células SW1463) para determinar la citotoxicidad de Encorafenib y Dabrafenib. Como se muestra en la Fig. 1A y la Información complementaria Tabla S4, las células Colo205 son más sensibles a BRAFi que las células RKO y HT-29. El CI50 de BRAFi solo en las células Colo205 es de aproximadamente 1 nmol/L; mientras que el CI50 de BRAFi en las células RKO y HT-29 es de 300 a 400 veces mayor que en las células Colo205 (RKO = 309,8 ± 12,4 nmol/L; HT-29 = 398,1 ± 9,8 nmol/L); este resultado sugiere que las células RKO y HT-29 albergan una resistencia intrínseca a BRAFi. Mientras tanto, el valor de CI50 de las células de CRC con BRAF de tipo salvaje es superior a 10 000 nmol/L, lo que demuestra que BRAFi es selectivo contra las células de CRC mutantes de BRAF
V600E. Confirmamos además la sensibilidad de BRAFi en Colo205, RKO y HT-29 utilizando el ensayo de cristal violeta. Como se muestra en la Fig. 1B, 1-3 nmol/L de BRAFi suprimieron significativamente el crecimiento de las células Colo205. Cabe destacar que 10 000 nmol/L de BRAFi no pudieron suprimir completamente el crecimiento de las células RKO y HT-29. Además del ensayo MTS y del cristal violeta, se realizó un ensayo de formación de colonias para validar la sensibilidad de BRAFi en estas células de CRC. Como se muestra en la Fig. 1C, la formación de colonias de Colo205 se redujo significativamente en comparación con las células RKO y HT-29, lo que es consistente con sus valores de CI50 y los resultados de supervivencia celular. Dado que p-ERK es el principal efector posterior de BRAFi, la capacidad de BRAFi para inhibir p-ERK en las células de CRC puede estar relacionada con su sensibilidad. De manera consistente, BRAFi solo suprimió de manera potente y continua la activación de ERK en las células Colo205. 10 nmol/L de BRAFi bloquearon casi por completo la señal de p-ERK (Fig. 1D y E). En contraste, aproximadamente el 50% de p-ERK se suprimió con 1000 nmol/L de BRAFi en las células RKO y HT-29. Mientras tanto, se observó una activación de retroalimentación de ERK en las células RKO después de 6 horas de exposición a BRAFi. Por lo tanto, BRAFi solo no pudo apagar de manera efectiva o duradera p-ERK en las células RKO y HT-29. La restauración de la señal de p-ERK durante la exposición prolongada a BRAFi podría ser responsable de la resistencia intrínseca a BRAFi.

Se descubrió que CDK9 era un objetivo candidato mediante el uso de un cribado de alto rendimiento

La estrategia de combinación racional es un enfoque prometedor para mejorar la eficacia de BRAFi y superar la resistencia a los fármacos. Por lo tanto, se utilizó un cribado de alto rendimiento (HTS) de la biblioteca de inhibidores de quinasas para el descubrimiento de agentes candidatos que superen la resistencia intrínseca a BRAFi. En total, se cribaron más de 300 inhibidores de quinasas solos o en combinación con BRAFi (Encorafenib) (Fig. 2A). Además del hallazgo esperado de EGFRi, FGFR2i y ERKi, CDK9i exhibió el efecto sinérgico más fuerte en combinación con BRAFi (Fig. 2B). La tasa de inhibición de esta combinación sobre el crecimiento celular alcanzó aproximadamente el 98% (Fig. 2C). CDK9 es un regulador global de la elongación transcripcional y un nodo clave en múltiples redes transcripcionales oncogénicas, lo que lo convierte en un objetivo prometedor en una variedad de cánceres con adicción transcripcional, especialmente en tumores impulsados por MYC, como el CRC. CDK9, una serina/treonina quinasa, pertenece a la familia de miembros de las CDK (Información complementaria Fig. S1). Los datos de secuenciación de ARN sugieren que CDK9i suprimió la vía MAPK (P = 0,00129), incluidos BRAF, MAPK3, MAP2K1, MAPK1, KRAS y EGFR (Fig. 2D y E). En las células de CRC humanas, el nivel de mRNA de CDK9 se expresa ampliamente (Información complementaria Fig. S2). El nivel de expresión de la proteína CDK9 y la fosforilación (serina 2) de la ARN polimerasa II en las células de CRC son mucho más altos que en las células epiteliales normales del colon humano (Fig. 2F). Además, el efecto de perturbación de CDK9 conduce a la supresión del crecimiento de las células de CRC (la puntuación < -1; Fig. 2G). En particular, 3 inhibidores de CDK9 bien caracterizados redujeron significativamente el número de colonias de las células RKO (Fig. 2H). Además de la supresión de la formación de colonias, el ensayo de crecimiento celular MTS mostró que los inhibidores de CDK9 tenían una potente citotoxicidad a niveles bajos de nmol/L (AZD [~10 nmol/L] > NVP2 [~30 nmol/L] > BAY [~100 nmol/L], en la Fig. 2I). En general, los inhibidores de CDK9 parecen ser terapias prometedoras para el CRC mutante de BRAF
V600E.

El efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi en las células de CRC con resistencia intrínseca

Nuestros datos de cribado de alto rendimiento de inhibidores de quinasas y de secuenciación de ARN sugirieron que CDK9i podría sensibilizar a las células de CRC con resistencia intrínseca a BRAFi. Para probar el potencial de sinergia entre CDK9i y BRAFi, las células RKO o HT-29 se incubaron con CDK9i y/o BRAFi durante 48 horas, y las células vivas se tiñeron con cristal violeta. Como se muestra en la Fig. 3A, CDK9i en combinación con BRAFi condujo a un efecto citotóxico más fuerte que un solo agente. Esto sugiere que existe un potente efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi. Para confirmar que la sinergia de esta combinación está asociada con el estado mutante de BRAF, las células HCT116 de tipo salvaje se editaron genéticamente utilizando CRISPR-Cas9 para insertar BRAF
V600E mutante (Información complementaria Fig. S3). El efecto sinérgico de esta combinación solo se observó en las células HCT116 BRAF V600E, pero no en las células parentales (Fig. 3B). Además del ensayo de supervivencia celular, el efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi sobre el crecimiento de las células RKO o HT-29 se determinó mediante el ensayo MTS y se calculó el índice de combinación (CI) mediante el método de Chou-Talalay. Como se muestra en la Fig. 3C y D, Figuras complementarias S4-S6, CDK9i (AZD4573, NVP2 y BAY) sensibilizó significativamente la eficacia de BRAFi (Encorafenib y Dabrafenib) y tuvo un fuerte valor de CI sinérgico (< 0,5)^[27]. Para cuantificar aún más el efecto citotóxico de esta combinación, se determinó la inducción de células apoptóticas tempranas y tardías mediante el tratamiento con CDK9i (NVP2) y BRAFi (Encorafenib y Dabrafenib) mediante citometría de flujo. CDK9i mejoró notablemente la eficacia de BRAFi en la inducción de células apoptóticas (Fig. 3E y F, Información complementaria Fig. S7). La PARP escindida es un marcador temprano de las células que se someten a apoptosis. De manera consistente, el cotratamiento de CDK9i y BRAFi produjo un mayor efecto en la elevación de la PARP escindida en las células RKO y HT-29 (Fig. 3G e Información complementaria Fig. S8). Para validar genéticamente la inhibición de CDK9 como un sensibilizador de BRAFi, el silenciamiento de CDK9 mediante siRNA mejoró significativamente el efecto de BRAFi en la inducción de PARP escindida (Fig. 3H). Por el contrario, también comparamos el efecto de CDK9i más BRAFi en la inducción de apoptosis en las células HCT116 BRAF
V600E versus las células HCT116 de tipo salvaje. Coherente con nuestro ensayo de supervivencia celular, el aumento sinérgico de la PARP escindida solo se mostró en las células HCT116 mutantes de BRAF y no en las células de tipo salvaje (Fig. 3I). Dado el mayor efecto citotóxico de esta combinación en las células de CRC, se investigó el efecto tóxico de CDK9i y/o BRAFi sobre el crecimiento de las células epiteliales normales del colon humano. Como se muestra en la Fig. 3J, después de 7 días de tratamiento, CDK9i y BRAFi solos o en combinación no afectaron el crecimiento de las células CCD-841. Las quinasas MEK y ERK son los principales efectores posteriores de la quinasa BRAF, y es posible que CDK9i también pueda mejorar la eficacia de MEKi/ERKi. Con esto en mente, investigamos la combinación de CDK9i con Binimetinib, Trametinib (MEKi); ASN007 o Ravo (ERKi) en las células RKO BRAF pV600E. Como se muestra en la Fig. 3K y L, CDK9i mejoró significativamente el efecto citotóxico de MEKi y ERKi, y sensibilizó la capacidad de MEKi/ERKi para inducir la PARP escindida. Mientras tanto, BRAFi en combinación con MEKi se utilizó como un control positivo, y se mostró un fuerte efecto sinérgico de esta combinación de fármacos sobre el crecimiento de las células RKO (Información complementaria Fig. S9). Estos resultados sugieren que CDK9i mejoró sinérgicamente la eficacia terapéutica de BRAFi, MEKi y ERKi en los modelos de CRC.

CDK9i bloqueó sinérgicamente múltiples vías de señalización del cáncer y mejoró la respuesta terapéutica a BRAFi

Para dilucidar los mecanismos sinérgicos del CDK9i y el BRAFi, se analizaron aproximadamente 500 proteínas diana relacionadas con el cáncer mediante RPPA. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, se observó que 56 proteínas diana presentaban alteraciones significativas (se estableció un valor límite en aproximadamente el 30%), incluidas 26 proteínas diana con expresión reducida y 30 proteínas diana con expresión aumentada. Estas dianas alteradas participan en múltiples procesos biológicos celulares, como la iniciación de la traducción y la regulación negativa de la expresión génica (Figura 4C). Además, el CDK9i bloqueó sinérgicamente múltiples vías de señalización de supervivencia del cáncer y mejoró las vías de apoptosis mediadas por las mitocondrias. Cabe destacar que MEK/ERK/S6; PI3K/AKT/mTOR/4E-BP1; los miembros de la familia BCL2 y la Caspasa-3/7 se suprimieron significativamente con el tratamiento combinado. Para validar el efecto sinérgico de esta combinación en la vía RAF/MEK/ERK/S6, se trataron células RKO con CDK9i y BRAFi durante 24 horas, y se determinaron los cambios en las proteínas diana mediante análisis de inmunoblot. La activación de BRAF, MEK, ERK y S6 se suprimió sinérgicamente con esta combinación de fármacos, lo que validó nuestros datos de RPPA (Figura 4D). Además, el CDK9i mejora eficazmente la capacidad del BRAFi para bloquear p-ERK e inducir la escisión de PARP (Figuras 4E-4G). Además de la vía BRAF/MEK/ERK/S6, la vía PI3K/AKT/mTOR/4E-BP1 también se suprimió de forma sinérgica, como se demostró mediante la disminución de p-AKT, p-mTOR y p-4E-BP1 (Figura 4H). Por último, esta combinación de fármacos tuvo un mayor efecto en la inducción de la apoptosis, lo que provocó una reducción de las proteínas antiapoptóticas MCL1, BCL-2, Bcl-xL y survivin, mientras que las proteínas proapoptóticas BAX y la caspasa 3 activa aumentaron (Figura 4I y Figura S10 del material suplementario). En resumen, el CDK9i mejora significativamente la eficacia del BRAFi mediante la inhibición de las vías RAF/MEK/ERK/S6 y AKT/mTOR/4E-BP1 en el CRC con mutación BRAF
V600E (Figura 4J).

El CDK9i mejora la eficacia del BRAFi en los organoides derivados del paciente con CRC con mutación BRAFV600E, pero no en los organoides de tipo salvaje BRAF.

Para acelerar la investigación traslacional de la combinación de CDK9i y BRAFi, y para validar la eficacia terapéutica sinérgica en modelos de CRC clínicamente relevantes, se trataron los organoides derivados del paciente con CRC (PDO) con CDK9i y/o BRAFi, incluidos 4 PDO con mutación BRAF
V600E (CK9677; CK7719; CK8485; CK8911) y 3 PDO de tipo salvaje BRAF (CRC-22-008; CRC-22-007; CK10278). Utilizando CK9677, un PDO con mutación BRAF
V600E, se midieron Ki-67 (marcador de proliferación celular), la caspasa 3 activa (biomarcador de apoptosis) y p-ERK (efector clave aguas abajo del BRAFi) mediante tinción por inmunohistoquímica (IHQ). Como se muestra en la Figura 5A, la combinación de CDK9i con BRAFi produjo una disminución de la tinción positiva de Ki-67 y p-ERK, junto con un aumento de la tinción de la caspasa 3 activa. La tinción positiva de Ki-67 en la combinación de fármacos se redujo al 15,5%, en comparación con el control (50,8%). La señal de p-ERK disminuyó notablemente (49,5% en el control frente al 3,7% en la combinación). Además, la tinción positiva de la caspasa 3 activa se indujo de forma sinérgica con el NVP2 en combinación con Encorafenib (NVP2 = 27,1% frente a Encorafenib = 10,2% frente a la combinación = 55,7%). El tamaño de los PDO en el grupo de combinación es menor que el de CDK9i o BRAFi solos. Para cuantificar la sinergia entre CDK9i y BRAFi, se determinó la viabilidad de los PDO mediante CellTiter Glo 3D. El CDK9i (NVP2) o el BRAFi (Encorafenib) solos ejercen un efecto citotóxico moderado sobre el crecimiento del PDO CK9677, mientras que el cotratamiento con CDK9i y BRAFi produjo una mayor citotoxicidad que cualquier tratamiento individual (Figura 5B). Según el método de Chou-Talalay, la combinación de CDK9i (30, 60 nmol/L) y BRAFi (300, 600 nmol/L) tuvo una fuerte sinergia (CI < 0,5, Figura 5C). Para investigar más a fondo esta combinación en la alteración de las redes de señalización del cáncer, se determinó la expresión de PARP escindida, p-ERK, CDK9, c-MYC y Bcl-xL mediante análisis de inmunoblot (Figura 5D). Coherente con nuestro resultado de RPPA, el CDK9i en combinación con BRAFi inhibió sinérgicamente p-ERK, c-MYC, Bcl-xL y mejoró la expresión de la escisión de PARP. Para reforzar la solidez de nuestros hallazgos en modelos adicionales derivados del paciente, se utilizaron 3 PDO más con mutación BRAFV600E (CK7719; CK8485; CK8911) y 3 PDO de tipo salvaje BRAF (CRC-22-008; CRC-22-007; CK10278). Como se observa en la Figura 5E y en la Figura S11 del material suplementario, se observó el efecto sinérgico entre CDK9i y BRAFi en los PDO con mutación BRAFV600E, mientras que no hay sinergia de esta combinación de fármacos en los PDO de tipo salvaje BRAF. En resumen, nuestros resultados demostraron que el CDK9i suprimió sinérgicamente la señalización de BRAF/MEK/ERK e indujo la apoptosis en los PDO de CRC con mutación BRAF
V600E.

El CDK9i sensibiliza la eficacia terapéutica in vivo del BRAFi en el xenoinjerto RKO y en el PDX con BRAFV600E.

Dado el potente efecto sinérgico del CDK9i y el BRAFi en las células de CRC y los PDO, se investigó además la eficacia del CDK9i y/o BRAFi en el xenoinjerto RKO y en los modelos de PDX con mutación BRAFV600E en ratones. Como se observa en las Figuras 6A y 6B, el tratamiento con BRAFi (Encorafenib 10 mg/kg) en monoterapia no suprimió significativamente el crecimiento tumoral (P = 0,13), mientras que la monoterapia con CDK9i (8 mg/kg) solo produjo una débil actividad antitumoral en comparación con el grupo de control. Cabe destacar que la coadministración de CDK9i y BRAFi produjo una reducción significativa del volumen tumoral (78%, P < 0,001) y del peso tumoral (Figura 6C). No se observó ningún cambio significativo en el peso corporal de los ratones, incluso en el grupo de combinación (Figura 6D). Se utilizaron Ki-67 y TUNEL como biomarcadores de proliferación y apoptosis, respectivamente. El cotratamiento con CDK9i y BRAFi produjo una mayor reducción de la expresión de Ki-67 que cualquier tratamiento individual (Figuras 6E y 6F). Además, el CDK9i en combinación con BRAFi produjo un aumento significativo de la tinción positiva de TUNEL. Además, se midieron los niveles de expresión de p-ERK. Observamos una mayor inhibición de la expresión de p-ERK en el grupo de combinación, lo que se correlacionó con nuestros resultados in vitro.

Para evaluar la actividad antitumoral en un modelo clínicamente relevante in vivo, se utilizó un PDX con mutación BRAF
V600E para investigar la eficacia terapéutica de esta combinación. El día 13, el volumen tumoral del grupo de control alcanzó aproximadamente los 2000 mm3, y el volumen tumoral de los grupos de CDK9i (NVP2 8 mg/kg) y BRAFi (Encorafenib 10 mg/kg) disminuyó en un 40,4% y un 28,0%, respectivamente, en comparación con el control. Además, el volumen tumoral del grupo de combinación se redujo notablemente en un 73,9% (P < 0,001). Los ratones de los grupos de CDK9i, BRAFi y combinación se trataron continuamente durante una semana más, durante la cual el cotratamiento con CDK9i y BRAFi ejerció una actividad antitumoral más sinérgica en comparación con los tratamientos individuales (Figura 6G). Al igual que en el xenoinjerto RKO, no se observaron cambios significativos en el peso corporal en todos los grupos de tratamiento (Figura 6H). La respuesta terapéutica al tratamiento con fármacos dentro de los tumores de PDX también se midió. Como se observa en las Figuras 6I y 6J, la combinación de CDK9i y BRAFi bloqueó sinérgicamente la señal de p-ERK, lo que es consistente con nuestros resultados in vitro y en PDO. MCL-1 y c-MYC se suprimieron significativamente con el cotratamiento de CDK9i y BRAFi. Además, se examinaron los tumores de PDX en busca de biomarcadores de crecimiento y apoptosis, incluidos Ki-67, TUNEL y p-S6. La combinación de CDK9i y BRAFi produjo una reducción significativa de la expresión de Ki-67 y p-S6 y un aumento de la tinción positiva de TUNEL (Figuras 6K y 6L). Estos resultados son coherentes con los datos de nuestros modelos CDX y PDO. En general, nuestro estudio mostró una sinergia entre BRAFi y CDK9i en múltiples modelos in vivo de CRC, incluido un PDX clínicamente relevante, lo que es consistente con nuestros resultados in vitro. Además, se evaluó la eficacia del CDK9i y el BRAFi sobre el crecimiento de un PDX de tipo salvaje BRAF. Aunque el CDK9i exhibió una modesta actividad antitumoral (el tamaño del tumor se redujo en un 36,0%), no hubo un efecto antitumoral adicional al combinarlo con BRAFi (Figuras 6M y 6N, CDK9i frente a CDK9i + BRAFi, P > 0,05).

El CDK9i en combinación con BRAFi ejerce un efecto sinérgico y mejora la respuesta terapéutica en el CRC resistente a la quimioterapia.

Recientemente, se ha aprobado BRAFi (Encorafenib) en combinación con Cetuximab y mFOLFOX6 para el tratamiento de pacientes con mCRC con BRAFV600E en primera línea, basándose en los resultados del ensayo BREAKWATER (NCT04607421)^[28]. Desafortunadamente, la resistencia a la quimioterapia sigue siendo un obstáculo para el tratamiento del mCRC. Para abordar esto, examinamos la eficacia terapéutica de BRAFi en combinación con CDK9i en un modelo de CRC resistente a la quimioterapia (RKO-5FUR10). Como se observa en las Figuras 7A y 7B, las células RKO-5FUR10 exhibieron un fenotipo resistente al 5-FU, en comparación con las células parentales. Además, se investigó la eficacia de la quimioterapia (FOLFOX) en combinación con BRAFi en las células RKO y RKO-5FUR10. El efecto sinérgico de FOLFOX y BRAFi solo se observó en las células RKO, pero no en las células RKO-5FUR10 (Figura 7C). Nuestros resultados sugieren que las células RKO-5FUR10 son resistentes a la combinación de quimioterapia y BRAFi. Cabe destacar que el CDK9i en combinación con BRAFi produjo un fuerte efecto sinérgico (CI < 0,5) sobre el crecimiento de las células de CRC resistentes a la quimioterapia (Figuras 7D-7F). Observamos un efecto similar en las vías de señalización del cáncer después del tratamiento con CDK9i y BRAFi en las células de CRC resistentes a la quimioterapia en comparación con las células sensibles a la quimioterapia. Esta combinación de fármacos suprimió significativamente las vías BRAF/MEK/ERK/S6 y AKT/mTOR/4E-BP1, inhibió los efectores aguas abajo (c-MYC, MCL-1) de CDK9 y mejoró la escisión de PARP, la caspasa 3 escindida y BAX en las células RKO-5FUR10 (Figuras 7G y 7H). Además de las células de CRC resistentes a la quimioterapia, se utilizó un PDO de CRC resistente al 5-FU (CK7719, Figura 7I) para evaluar la combinación de CDK9i y BRAFi. Como se observa en la Figura 7J, el CDK9i mejoró significativamente el efecto del BRAFi en la supresión de p-ERK. En general, nuestros resultados sugieren que el efecto sinérgico entre CDK9i y BRAFi podría funcionar incluso en pacientes con CRC resistentes a la quimioterapia.

Discusión

Debido a la resistencia intrínseca, la eficacia terapéutica de BRAFi en pacientes con mCRC y BRAF mutado V600E suele ser limitada, y la respuesta clínica a la monoterapia con BRAFi es de solo aproximadamente el 5 % ^[29]. Cabe destacar que el mecanismo molecular del mCRC mutado en BRAF V600E es más complejo que el del melanoma. En el CRC, BRAFi provoca una supresión inicial de la señalización de MAPK, lo que conduce a una reducción de la retroalimentación negativa mediada por ERK ^[30]. Estos eventos biológicos afectan a varias vías ascendentes, incluida la activación de RAS mediada por RTK y el reclutamiento de otras quinasas RAF (CRAF), todo lo cual contribuye a la activación paradójica de las vías de MAPK en el mCRC ^[31], ^[32], ^[33]. En particular, BRAFi da como resultado una rápida activación de retroalimentación de EGFR, un RTK dominante en el cáncer de colon. Se ha comprobado que la reactivación de ERK a través de la activación de RAS y CRAF mediada por EGFR mantiene el crecimiento tumoral en presencia de BRAFi ^[14], ^[34]. También se ha identificado que CDC25C desempeña un papel clave en la activación de EGFR ^[34]. Dado que la señalización de EGFR mejorada es responsable de la resistencia a la monoterapia con BRAFi, el bloqueo de EGFR mostró una fuerte sinergia en combinación con BRAFi en modelos de CRC mutado en BRAF. Basándose en este mecanismo de resistencia, la FDA aprobó Encorafenib (BRAFi) en combinación con Cetuximab (EGFRi) para el mCRC con mutación BRAF V600E ^[5]. Más recientemente, el 20 de diciembre de 2024, la FDA concedió la aprobación acelerada a Encorafenib más Cetuximab y mFOLFOX6 para el tratamiento de primera línea de pacientes con mCRC mutado en BRAF V600E ^[28]. Si bien estas aprobaciones recientes son prometedoras para ofrecer terapias dirigidas a pacientes en líneas de tratamiento más tempranas, también resaltan el hecho de que la durabilidad y la resistencia a los fármacos siguen siendo un problema importante para el CRC mutado en BRAF V600E. Por ejemplo, la mediana de PFS para los pacientes que recibieron Encorafenib más Cetuximab y mFOLFOX6 en el estudio BREAKWATER fue de 12,8 meses ^[20]. Si bien esta PFS representa una mejora significativa con respecto al tratamiento estándar previo (7,1 meses), el hallazgo también sugiere que casi la mitad de los pacientes con mCRC mutado en BRAF V600E que reciben el régimen más actualizado serán resistentes tanto a BRAFi como a la quimioterapia dentro de un año después de comenzar el tratamiento. Por lo tanto, existe una gran necesidad insatisfecha de nuevas terapias que puedan superar la resistencia terapéutica de novo o adquirida.

En este estudio, nuestro objetivo fue descubrir nuevos agentes/dianas que puedan sensibilizar la respuesta terapéutica de BRAFi en el mCRC intrínsecamente resistente. Utilizamos las líneas celulares HT-29 y RKO debido a su resistencia intrínseca a la terapia con BRAFi (Fig. 1A-C). Los mecanismos de resistencia clínica a las terapias con BRAFi en el CRC han sido heterogéneos, pero generalmente implican cambios genómicos o proteómicos que mantienen activa la señalización de MAPK ^[35]. Nuestros resultados indican que HT-29 y RKO reproducen bastante bien este mecanismo general de resistencia, ya que la señalización de p-ERK se inhibió poco con BRAFi en estas dos líneas celulares en comparación con Colo205 (Fig. 2D y E). Los inhibidores de CDK9 se identificaron como los principales agentes candidatos mediante la detección fenotípica de alto rendimiento (HTS) de una biblioteca de inhibidores de quinasas. CDK9 está surgiendo como una posible diana terapéutica para el cáncer ^[36], con aproximadamente 20 inhibidores de CDK9 que entran en varias etapas de ensayos clínicos, como AZD4573, NVP2, BAY1251152, KB-0742, Zotiraciclib, etc. ^[37], ^[38], ^[39], ^[40], ^[41]. Además, se ha comprobado que una alta expresión de CDK9 se correlaciona con la tumorigénesis y los malos resultados clínicos ^[22], incluido el mCRC. De manera consistente, el nivel de expresión de la proteína CDK9 en las células de CRC humanas es mucho mayor que en las células epiteliales del colon humano normales (Fig. 2F). Utilizando la base de datos TCGA de los CRC humanos, no existe una diferencia significativa en la expresión del ARNm de CDK9 en los pacientes con CRC con BRAF de tipo salvaje y BRAF mutado (P = 0,4808). Cabe destacar que el análisis de CPTAC (Consorcio de análisis proteómico tumoral clínico) demostró que la expresión de la proteína CDK9 en el CRC mutado en BRAF V600E es mayor que en los pacientes con CRC con BRAF de tipo salvaje (P = 0,0003, Figura S12 en la información complementaria). Estudios previos mostraron que la interacción CDK9/Src quinasa contribuye a la fosforilación de ERK. Mientras tanto, nuestros datos de secuenciación de ARN sugieren que CDK9i redujo la señalización de MAPK. Se sabe que la activación de retroalimentación de ERK conduce a una mala respuesta a Vemurafenib ^[14]. CDK9, una subunidad central de P-TEFb (factor de elongación de la transcripción b positivo), regula la elongación de la transcripción al liberar la ARN polimerasa II de la pausa proximal al promotor, con diversas dianas posteriores, lo que significa que CDK9i puede ser capaz de suprimir de forma única múltiples vías importantes que impulsan el cáncer. Teniendo esto en cuenta, examinamos el efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi sobre la señal de p-ERK ^[42]. CDK9i puede mejorar significativamente la eficacia de BRAFi en la supresión a largo plazo de p-ERK en las células de CRC, los PDO y los PDX con mutación BRAF V600E. Además, se ha comprobado que las alteraciones genéticas en PI3K/AKT están asociadas con la resistencia intrínseca al cáncer. PI3K/AKT suele estar mucho más activado en el mCRC, en comparación con el melanoma ^[43]. En un ensayo de fase II realizado con BRAFi (Dabrafenib) y MEKi (Trametinib), un caso logró una respuesta completa entre cinco pacientes con mutaciones en PI3KCA. La combinación de Encorafenib, Cetuximab y Alpelisib ha demostrado beneficios clínicos en el mCRC mutado en BRAF ^[44]. Nuestros datos de RPPA mostraron que la combinación de CDK9i y BRAFi también suprimió la vía AKT/mTOR/4E-BP1. Por lo tanto, CDK9i en combinación con BRAFi suprimió sinérgicamente dos vías críticas que impulsan el cáncer, y la posible activación de retroalimentación de ERK se bloqueó significativamente. CDK9, como promotor de la elongación de la transcripción, también regula la expresión de los miembros antiapoptóticos de BCL-2 (BCL-2, MCL-1 y BCL-XL) ^[45]. En respuesta a la apoptosis, CDK9 también promueve la expresión y/o la actividad de los factores de transcripción oncogénicos, como c-MYC ^[46]. Aquí, la combinación de CDK9i y BRAFi produjo una mayor reducción de MCL-1, BCL-2, BCL-XL y c-MYC en comparación con la monoterapia. En general, nuestros hallazgos sugieren que la inhibición de CDK9 en el CRC provoca una supresión transcripcional generalizada que afecta a múltiples vías oncogénicas, lo que es consistente con los estudios en otros tumores ^[47], ^[48], ^[49]. Sin embargo, aquí caracterizamos una relación sinérgica única entre la inhibición de CDK9 y la inhibición de la vía de MAPK en el CRC, lo que sugiere un nuevo enfoque de tratamiento combinado. Esto podría deberse a la dependencia general del CRC de la señalización de MAPK para impulsar el metabolismo y el crecimiento del cáncer, incluida la activación de la transcripción. En consecuencia, los CDK9i también pueden mejorar la actividad de los inhibidores de KRAS en el CRC mutado en KRAS, que es el tema de nuestro estudio independiente. Se planean estudios funcionales genéticos adicionales para probar el papel de las múltiples posibles dianas posteriores de CDK9i en el CRC.

En principio, la terapia combinada tiene varias ventajas sobre la monoterapia. En primer lugar, nuestro estudio ha demostrado los efectos antitumores sinérgicos de la combinación de BRAFi y CDK9i. En segundo lugar, al combinar múltiples agentes con efectos sinérgicos contra el tumor, esperamos que dosis más bajas de cada agente individual sean suficientes para inducir un potente efecto terapéutico. La disminución de las dosis también puede permitir el uso de un fármaco a una dosis más tolerable o segura. En nuestro estudio, no observamos cambios significativos en el peso corporal en los ratones tratados con CDK9i y BRAFi, lo que sugiere que debería haber un índice terapéutico razonable para dicha combinación. En el estudio de fase I, el primero en humanos, del CDK9i, VIP152/BAY1251152, el análisis farmacocinético (PK) mostró que los niveles de fármaco en plasma superaron los 200 nmol/L durante más de 12 horas en los pacientes que tomaron la Dosis máxima tolerada (DMT) ^[39]. En nuestro estudio, dicha concentración de BAY1251152 fue suficiente para inducir una potente supresión tumoral sinérgica. Este análisis sugiere que la exposición al fármaco CDK9i necesaria para la sinergia con BRAFi se puede lograr en humanos. La toxicidad limitante de la dosis de la monoterapia con BAY1251152 fue la neutropenia. Las toxicidades más importantes de Encorafenib son la fatiga, las náuseas y la artralgia. En este estudio, una dosis más baja de CDK9i y Encorafenib exhibió una actividad antitumoral sinérgica en los modelos CDX y PDX, y no se observó toxicidad evidente. Es posible que los perfiles de toxicidad de CDK9i y BRAFi no se superpongan, lo que sugiere que el índice terapéutico de CDK9i más BRAFi debería ser tolerable para los pacientes con CRC.

Históricamente, el mCRC mutado en BRAF V600E ha tenido una respuesta deficiente a las terapias estándar, como la quimioterapia basada en 5-FU. Para probar el efecto de CDK9i en combinación con BRAFi en los modelos de CRC mutado en BRAF resistentes al 5-FU, se adquirieron las células RKO-5FUR10. La CI50 de 5-FU en las células resistentes fue de aproximadamente 30 μmol/L, y 6 veces mayor que en las células RKO parentales. Además, se confirmó el beneficio sinérgico de CDK9i y BRAFi en las células RKO-5FUR10. Estos hallazgos sugieren que CDK9i en combinación con BRAFi podría ser eficaz contra el mCRC resistente a la quimioterapia (Fig. 7D-F). En mayor apoyo a este hallazgo, demostramos que incluso un PDO resistente a la quimioterapia (CK7719) fue susceptible al tratamiento con BRAFi y CDK9i (Fig. 5E y 7I y J). Además de la sensibilización de los modelos de CRC intrínsecamente resistentes y adquiridos resistentes, CDK9i también puede mejorar la eficacia de las dosis bajas de BRAFi (1 nmol/L) contra Colo205 (una línea celular sensible a BRAFi, Figura S13 en la información complementaria). Estudios recientes mostraron que la expresión de CDK9 se induce al inhibir la actividad de P-TEFb, un proceso dependiente de BRD4 ^[50]. Dado que CDK9i puede sensibilizar la eficacia de BRAFi, es posible que el inhibidor de BRD4 (JQ-1) en combinación con BRAFi también produzca un efecto sinérgico. Como se muestra en la Figura S14 en la información complementaria, JQ-1 combinado con BRAFi (Encorafenib) suprimió sinérgicamente el crecimiento de las células RKO. Por lo tanto, BRD4i también podría ser una posible diana para la sensibilización del CRC resistente a BRAFi. Dada la capacidad de CDK9i + BRAFi para tratar sinérgicamente los modelos de CRC que son resistentes a BRAFi y a la quimioterapia, esta combinación promete ser un posible tratamiento de rescate para los pacientes que han progresado con el FOLFOX + Encorafenib + Cetuximab de primera línea. El trabajo futuro se centrará en probar la eficacia de las combinaciones de CDK9i en modelos adicionales derivados de pacientes que son resistentes tanto a la quimioterapia como a las terapias dirigidas.

En el CRC, se han estudiado los PDO y los PDX como posibles modelos para la oncología de precisión. Los PDO son capaces de predecir las respuestas a las terapias estándar en los pacientes con mCRC con una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 93 % ^[51]. Los PDO, como un modelo preclínico superior, tienen una heterogeneidad inherente y una estabilidad a largo plazo, en comparación con las líneas celulares cancerosas. Se ha demostrado que los PDO predicen los resultados clínicos mejor que los paneles de biomarcadores por sí solos ^[52]. En nuestro estudio, validamos el efecto sinérgico de CDK9i y BRAFi en 4 PDO únicos mutados en BRAF V600E y un modelo PDX. Además, determinamos la falta de sinergia en 3 PDO únicos de BRAF de tipo salvaje y un PDX de BRAF de tipo salvaje. Utilizamos xenoinjertos de tumores en el flanco subcutáneo en nuestro estudio. Un método que podría mejorar nuestros hallazgos es utilizar modelos ortotópicos. Los modelos ortotópicos permiten que los tumores crezcan dentro de su órgano de origen, replicando mejor el complejo microentorno tumoral (MET) específico del órgano observado en los pacientes humanos. Los modelos ortotópicos representan un enfoque preclínico más relevante para la enfermedad en comparación con sus contrapartes subcutáneas, ya que preservan de manera más confiable la estructura tisular intrínseca y las complejidades de los tumores de los pacientes in situ. Los modelos de tumores ortotópicos pueden generar perfiles farmacodinámicos más relevantes para los pacientes de las terapias dirigidas y los agentes inmunoterapéuticos, lo que proporciona perfiles de eficacia y resistencia a los fármacos más relevantes.

Encorafenib, un inhibidor de BRAF altamente selectivo que compite con el ATP, demostró actividad antitumoral contra cánceres con la mutación BRAFV600E y tuvo una actividad farmacodinámica más prolongada que otros inhibidores de BRAF. Para determinar la especificidad de nuestras combinaciones de BRAFi + CDK9i contra tumores con la mutación BRAFV600E, también estudiamos su eficacia contra modelos BRAF WT. Como se esperaba, debido a la ausencia de la mutación BRAFV600E, Encorafenib por sí solo no afectó el crecimiento tumoral del PDX BRAF WT. Además, NVP2 y Encorafenib tuvieron un efecto no sinérgico contra el PDX BRAF WT, lo que es consistente con la ausencia de la mutación BRAF V600E. En conjunto, nuestros resultados sugieren firmemente que las combinaciones de CDK9i y BRAFi son un enfoque terapéutico prometedor para el CRC con mutación BRAFV600E resistente a BRAFi y a la quimioterapia.

En resumen, CDK9i en combinación con BRAFi condujo a respuestas terapéuticas sinérgicas en células de CRC, PDO y PDX con la mutación BRAFV600E, a través del bloqueo de BRAF/MEK/ERK/S6 y AKT/mTOR/4E-BP1. El direccionamiento de la elongación transcripcional mediada por CDK9 parece ser una estrategia de combinación prometedora para el tratamiento basado en BRAFi en el mCRC, incluso en el mCRC resistente a la quimioterapia. Estos hallazgos proporcionan la base para las pruebas clínicas de CDK9i más BRAFi en el CRC, al tiempo que facilitan posibles nuevas hipótesis sobre cómo utilizar los inhibidores de CDK9 en combinaciones terapéuticas.

Contribuciones de los autores

Ning Wei: Conceptualización, curación de datos, supervisión, investigación, metodología, redacción del borrador original y edición. Natalie Thielen: Metodología, curación de datos, software, investigación, validación, redacción del borrador original. Mahshid Mohammadi: Recursos, metodología. Muzaffer Ahmed Bhat: Investigación, metodología. Terence Li: Metodología. Yan Sun: Curación de datos, investigación. Seiya Kitamura: Metodología. Chaoyuan Kuang: Conceptualización, obtención de financiación, supervisión, redacción-revisión y edición. Edward Chu: Conceptualización, supervisión, obtención de financiación, redacción-revisión y edición.

Conflictos de intereses

CK tiene las siguientes divulgaciones: Teiko (consultor), Seattle Genetics (consejo asesor), Loki (colaboración/financiación), BMS (consejo asesor), Guardant Health (consejo asesor). Los autores restantes declaran que no tienen ningún interés financiero o relación personal conocido que pueda haber influido en el trabajo presentado en este artículo.