Prevalencia y cronología de los procesos mutacionales asociados a la colibactina y sus espectros de microbioma en el cáncer colorrectal japonés.

La incidencia del cáncer colorrectal (CCR) ha aumentado en las últimas décadas, y se ha observado un aumento desproporcionado entre los jóvenes en Japón y otros países. Se reconoce la contribución etiológica de la microbiota intestinal a la patogénesis del CCR, pero los mecanismos implicados aún no se han aclarado por completo. Aquí, integramos la secuenciación del genoma completo (WGS) y el perfilado del transcriptoma del CCR con la secuenciación metagenómica del genoma completo de muestras fecales para analizar las interacciones huésped-microbiota con alta resolución. La aplicación de inteligencia artificial interpretable permitió la estratificación del CCR en cuatro subtipos distintos basados en la microbiota. El análisis de WGS identificó las firmas de mutación SBS88 e ID18, relacionadas con la exposición a la colibactina, como eventos clonales tempranos detectados en el 44,8 % de los pacientes no hipermutados. Cabe destacar que estas firmas fueron significativamente más frecuentes entre los pacientes nacidos después de 1960. La subclasificación basada en la microbiota reveló características clínicas y moleculares específicas de cada subtipo. En conjunto, nuestros hallazgos indican que la exposición a la colibactina constituye un factor de riesgo prevalente y potencialmente modificable para el CCR en la población japonesa.

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Temas
Cáncer colorrectal La incidencia mundial del CCRC ha mostrado una preocupante tendencia al alza, particularmente en Japón y en varias otras regiones1,2. Aunque este aumento se atribuye comúnmente a la adopción de un estilo de vida occidentalizado, la prevalencia en Japón supera la de los países occidentales, lo que sugiere la contribución de factores adicionales específicos de la región. En particular, la incidencia del CCRC de inicio temprano, definido como el diagnóstico antes de los 50 años, ha ido aumentando constantemente en todo el mundo desde la década de 19903,4.

Existe un creciente conjunto de evidencias que implican a la microbiota intestinal como un determinante crítico de la patogénesis del CCRC5. Ciertas especies bacterianas, entre ellas Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus stomatis y Parvimonas micra, se detectan con frecuencia en las heces y los tejidos tumorales de los pacientes con CCRC y pueden servir como posibles marcadores diagnósticos6,7,8. Entre los metabolitos microbianos, la colibactina ha atraído una atención particular. Esta genotoxina, sintetizada por Escherichia coli y otras bacterias entéricas que albergan la isla genómica pks9,10,11, induce enlaces cruzados entre hebras de ADN y roturas de doble hebra9,10. El daño al ADN asociado a la colibactina imprime firmas mutacionales tumorales distintas, notablemente la sustitución de una sola base (SBS)88 y la inserción y deleción cortas (ID)18, que reflejan los procesos mutacionales acumulativos que operan durante la tumorigénesis colorrectal12,13,14.

Un estudio reciente a gran escala de secuenciación del genoma completo (WGS) que abarca aproximadamente 1000 casos de CCRC de múltiples continentes reveló una variación geográfica sustancial en los procesos mutacionales15. Aunque solo se incluyeron 28 casos japoneses, Japón exhibió la mayor prevalencia de SBS88 e ID18 entre los 11 países participantes, lo que sugiere posibles interacciones huésped-microbioma-ambientales únicas de esta población.

En este estudio, integramos una nueva cohorte (cohorte 1) con nuestro conjunto de datos previamente informado (cohorte 2)8, lo que nos proporcionó un total de 600 participantes (454 pacientes con CCRC y 146 controles sanos (HC)) (Figura de datos extendida 1a). Se realizó la secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación del transcriptoma completo en casos de CCRC japoneses de la cohorte 1 (n = 200) para delinear su paisaje genómico de manera integral. En paralelo, se realizó la secuenciación metagenómica del genoma completo (WGMS) en muestras fecales de 395 casos y 146 HC para caracterizar los perfiles microbianos intestinales. Un marco de inteligencia artificial interpretable estratificó los casos de CCRC en subgrupos distintos según la composición microbiana. Este análisis integrativo tuvo como objetivo dilucidar la relación entre los subtipos metagenómicos fecales y la arquitectura genómica del CCRC, con especial énfasis en los procesos mutacionales subyacentes a la tumorigénesis.

Resultados

Participantes y métodos de análisis

En la cohorte 1, se inscribieron en este estudio un total de 255 pacientes con CCRC confirmados histológicamente que no habían recibido tratamiento (Tabla suplementaria 1 y Figura de datos extendida 1a). Se excluyeron los casos con síndromes hereditarios de CCRC. Se recolectaron muestras de tumores resecados congelados, ADN derivado de linfocitos y muestras fecales de cada participante. Se realizó la secuenciación del genoma completo (WGS) en el ADN tumoral y de linfocitos (n = 200), y se realizó la secuenciación metagenómica del genoma completo (WGMS) en muestras fecales (n = 196).

Los HC se definieron como individuos que se sometieron a una colonoscopia por indicaciones como una prueba de sangre oculta en heces positiva, pero que no presentaban hallazgos neoplásicos u otros hallazgos clínicamente significativos. Los datos de control (146 individuos) se obtuvieron de la cohorte 2 (Tabla suplementaria 2)8,16. El índice de Brinkman fue significativamente mayor en los pacientes con CCRC que en los HC (P = 3,2 × 10−4), y la cohorte de CCRC también fue significativamente mayor (P = 0,0010) (Tabla suplementaria 3).

Construcción de un clasificador de CCRC basado en el microbioma intestinal

Se entrenó un clasificador de bosque aleatorio en cuatro cohortes independientes7,17,18,19 utilizando el paquete R curatedMetagenomicData20, aplicando umbrales de abundancia y prevalencia establecidos en 1,0 × 10−5 y 0,95, respectivamente. La validación cruzada de diez pliegues arrojó un área bajo la curva de características operativas del receptor (AUC) de 0,84. Posteriormente, el modelo entrenado se aplicó al conjunto de datos WGMS de la cohorte 28, que comprende perfiles de abundancia relativa a nivel de especie generados por MetaPhlAn3, para estimar la probabilidad de que ocurra el CCRC, lo que refleja los rasgos microbianos asociados al CCRC predichos. El modelo alcanzó un AUC de 0,68 (Figura de datos extendida 1b). A continuación, la aplicación del clasificador a la cohorte actual de 196 casos de CCRC (cohorte 1), junto con el mismo grupo de HC8, arrojó un AUC de 0,74, lo que apoya aún más la reproducibilidad y la solidez del modelo. Finalmente, cuando se aplicó a la cohorte combinada de CCRC (n = 395; HC, n = 146) que abarca la cohorte 1 y la cohorte 2, el clasificador alcanzó un AUC de 0,71.

Identificación de subtipos de CCRC basados en la composición del microbioma intestinal

El clasificador descrito anteriormente se sometió a un análisis de inteligencia artificial interpretable utilizando el marco de explicaciones aditivas de Shapley (SHAP), como se informó previamente16. P. stomatis, F. nucleatum, P. micra y Dialister pneumosintes se identificaron como las principales especies bacterianas que distinguen a los pacientes con CCRC de los HC (Figura 1a y Tabla suplementaria 4). En la Figura 1b, los puntos de datos individuales en el diagrama de dispersión se colorean según los rasgos microbianos asociados al CCRC predichos a partir de los resultados del clasificador. El agrupamiento de k-medias de los valores SHAP resultantes identificó cuatro subtipos distintos de CCRC, con la solución óptima determinada minimizando la suma de cuadrados dentro del clúster (Figura 1c y Figura de datos extendida 2a). Estos se designaron como subtipos 1 a 4, y se compararon las puntuaciones de los rasgos microbianos del CCRC entre los subtipos. El subtipo 2 exhibió las puntuaciones más altas de los rasgos microbianos asociados al CCRC, mientras que el subtipo 1 mostró las puntuaciones más bajas. F. nucleatum y P. stomatis fueron los contribuyentes más influyentes al subtipo 2, con valores SHAP medios de 0,039 y 0,029, respectivamente (Figura 1d y Tabla suplementaria 4). Por el contrario, el subtipo 1 se caracterizó por la ausencia de impulsores bacterianos dominantes, ya que ninguna especie exhibió un valor SHAP medio superior a 0,01. P. stomatis y F. nucleatum fueron los taxones definitorios en los subtipos 3 y 4, respectivamente. E. coli se detectó en los datos metagenómicos, pero no se encontraba entre los taxones más abundantes que contribuyen a la clasificación de subtipos (Tabla suplementaria 4). Cuando el clasificador se aplicó por separado a la cohorte 1 (Figura de datos extendida 2b) y a la cohorte 2 (Figura de datos extendida 2c), ambos conjuntos de datos se segregaron de forma independiente en cuatro subtipos similares definidos por el microbioma, lo que confirmó la solidez del esquema de clasificación y justificó la integración de las dos cohortes para los análisis posteriores.

Figura 1: Subclasificación del CCRC basada en el microbioma intestinal.

Figura completa

a, La importancia de las características globales del microbioma en el clasificador de CCRC. Cada punto de datos corresponde a un individuo (muestra) dentro de la cohorte (izquierda). El diagrama muestra las muestras de casos de la cohorte 1 y la cohorte 2 (n = 395) y las muestras de HC de nuestro informe anterior8 (n = 146). Los valores SHAP, representados en el eje x, proporcionan una medida cuantitativa de la influencia de una especie bacteriana en la predicción del clasificador para una muestra determinada. Los colores indican la abundancia relativa de la especie, con azul y rojo que indican baja y alta abundancia, respectivamente. Entre las especies que tienen la mayor influencia en el clasificador de CCRC, que incluyen P. stomatis, F. nucleatum, P. micra y D. pneumosintes, la mayoría de las muestras con alta abundancia relativa (indicadas en rojo) se encuentran en el lado positivo del eje x. Esto indica que una mayor prevalencia de estas bacterias se asocia con una mayor probabilidad de CCRC. Los diez rasgos microbianos más importantes se determinaron calculando la media de los valores absolutos de SHAP (derecha). b, La integración del PCA con los valores SHAP, con la puntuación del rasgo microbiano del CCRC superpuesta. Las figuras trazadas representan muestras de casos de la cohorte 1, la cohorte 2 y los HC de nuestro estudio anterior8. c, Se realizó un PCA en los valores SHAP etiquetados según cuatro subtipos diferentes. Las muestras de casos de las cohortes 1 y 2 se agruparon eficazmente en cuatro subtipos utilizando el agrupamiento de k-medias (izquierda). Las puntuaciones estimadas del rasgo microbiano del CCRC por cada subtipo se calcularon utilizando el microbioma como característica (derecha). El subtipo 2 se identificó como el más preciso en el diagnóstico del CCRC. Los cuadros representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los valores máximo y mínimo dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico. d, Los diez rasgos microbianos más importantes en cada uno de los cuatro subtipos. En particular, el panel derecho en a destaca cuatro especies globalmente significativas. El eje x indica la media de los valores absolutos de SHAP. e, La supervivencia general a los 5 años por subtipo microbiano. La prueba de log-rank indicó diferencias significativas en la supervivencia entre los subtipos; sin embargo, el modelado de riesgos proporcionales de Cox no reveló ningún efecto específico del subtipo después del ajuste por estadio, lo que identificó al estadio como un factor de confusión. f, La supervivencia libre de progresión por subtipo microbiano. Al igual que con la supervivencia general, la prueba de log-rank demostró diferencias significativas en la supervivencia libre de progresión entre los subtipos. Sin embargo, después del ajuste por el estadio de la enfermedad en el modelo de riesgos proporcionales de Cox, no se observaron efectos específicos del subtipo, lo que indica que el estadio actuó como un factor de confusión.

El análisis de Kaplan-Meier demostró diferencias significativas en la supervivencia general entre los cuatro subtipos microbianos (P de log-rank = 0,040) (Figura 1e). El análisis univariado de las variables pronósticas establecidas (es decir, el sitio tumoral y el estadio) reveló que solo la proporción de casos en estadio IV difería significativamente entre los subtipos, lo que indica un desequilibrio en la distribución del estadio. En el modelado multivariado de Cox que incluye el subtipo y el estadio como covariables, el estadio, pero no el subtipo, siguió estando significativamente asociado con el pronóstico (Tabla suplementaria 5). Estos resultados sugieren que las diferencias observadas en la supervivencia se deben en gran medida a las disparidades en la composición del estadio, en particular la sobrerrepresentación de la enfermedad en estadio IV en el subtipo 2, en lugar de diferencias biológicas intrínsecas.

Para la supervivencia libre de progresión (SLP), el análisis reveló también divergencias entre los cuatro subtipos microbianos, con las curvas de Kaplan-Meier que muestran una variación significativa en los resultados (P de log-rank = 0,0070) (Figura 1f). El examen de las covariables clínicas indicó que solo la frecuencia de la enfermedad en estadio IV difería significativamente entre los subtipos, lo que sugiere una heterogeneidad en la carga de la enfermedad de base (Tabla suplementaria 5). En el modelo de riesgos proporcionales de Cox ajustado por el estadio, el estadio siguió siendo un fuerte determinante de la SLP, mientras que el subtipo no mostró ningún efecto independiente (Tabla suplementaria 6).

Diferenciación de las características clínicas y las anomalías genómicas por los subtipos basados en el microbioma

Analizamos las características clínicas y las anomalías genómicas utilizando la secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación del transcriptoma (secuenciación de ARN (RNA-seq)). El análisis de RNA-seq mostró que el subtipo 2 tenía significativamente más lecturas bacterianas no humanas que los otros subtipos, lo que indica un mayor nivel de microbiota en el subtipo 2 (Figura suplementaria 1). La Figura 2a presenta las características clínicas y patológicas detalladas, junto con las alteraciones genómicas, de los pacientes que se sometieron tanto a WGS como a WGMS (n = 141) (Tabla suplementaria 7). Comparamos las características clínicas y patológicas de 395 pacientes con CCRC que se sometieron a WGMS, estratificados por los subtipos definidos por el microbioma intestinal (Tabla suplementaria 8). Los pacientes con CCRC del subtipo 3 eran significativamente más jóvenes que los de todos los demás subtipos (vs subtipo 1, P = 0,016, q = 0,033; vs subtipo 2, P = 0,010, q = 0,030; vs subtipo 4, P = 0,0073, q = 0,030) (Figura 2b). Evaluamos las diferencias intergrupales entre los subtipos microbianos (P = 9,4 × 10−4, prueba de chi-cuadrado de Pearson) y aplicamos correcciones para las comparaciones múltiples. Se observaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución de los estadios entre el subtipo 1 y el subtipo 2 (P = 2,4 × 10−4, q = 0,0014), así como entre el subtipo 1 y el subtipo 3 (P = 0,018, q = 0,054) (Fig. 2c). Estas disparidades en la distribución de los estadios probablemente contribuyen a las diferencias observadas en la supervivencia global y la SLP (Fig. 1e, f). En relación con el fenotipo hipermutado (más de 500 variantes de un solo nucleótido no sinónimas (VSNN); 15 VSNN por Mb) o 100 inserciones o deleciones codificantes (indels; tres indels por Mb), no se detectaron casos en el subtipo 3, mientras que el subtipo 2 demostró una frecuencia significativamente mayor de tumores hipermutados que el subtipo 3 (P = 0,014, q = 0,086) (Fig. 2d y Tabla suplementaria 7). Analizamos la distribución de los subtipos microbianos por año de nacimiento. En particular, se observó una diferencia estadísticamente significativa en las proporciones de subtipos para los individuos nacidos después de 1980 (P = 0,018, prueba exacta de Fisher), caracterizada por un marcado aumento en la prevalencia del subtipo 3 (Fig. 2e). No se observaron diferencias significativas en la pureza tumoral o los perfiles de variación del número de copias entre los subgrupos (Fig. suplementaria 2). Fig. 2: Antecedentes clínicos y genómicos de los subtipos de CCRC basados en la microbiota intestinal. Imagen de tamaño completo. a, Características clínicas y moleculares de la CCRC estratificada por subtipo microbiano. La fila superior muestra los antecedentes clínicos de los pacientes diagnosticados con CCRC. La fila siguiente muestra las mutaciones en los genes significativamente mutados (GMS). Las filas siguientes muestran la abundancia relativa de las cuatro especies bacterianas que contribuyen con mayor fuerza a los rasgos microbianos asociados a la CCRC, según lo determinado por los valores de SHAP. La fila inferior presenta la distribución de las abundancias relativas de los diez géneros bacterianos más prevalentes. b, Subtipos de CCRC basados en la microbiota, relacionados con la edad del paciente. Los pacientes clasificados como subtipo 3 eran significativamente más jóvenes que los de todos los demás subtipos en las comparaciones por pares ajustadas para múltiples pruebas. c, Distribución del estadio patológico por subtipo microbiano. Los pacientes clasificados como subtipo 2 o subtipo 3 fueron diagnosticados en estadios significativamente más avanzados en comparación con los del subtipo 1. d, Proporción de CCRC hipermutada por subtipo microbiano. Los casos hipermutados estaban ausentes en el subtipo 3, lo que muestra una diferencia significativa en comparación con el subtipo 2. Los valores de P se calcularon utilizando pruebas de dos colas, y los valores de q se ajustaron para múltiples pruebas utilizando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg. Los cuadros representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los valores máximo y mínimo dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico (b-d). e, Distribución cronológica de los subtipos de CCRC por cohorte de nacimiento. La frecuencia relativa del subtipo 3 exhibió un marcado aumento entre los pacientes nacidos después de 1980 (el año 1980 está indicado por una línea discontinua negra). Los valores de P se calcularon utilizando pruebas de dos colas.

Análisis de las firmas mutacionales y su correlación con la microbiota intestinal. Los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) de 200 casos de CCRC se sometieron a un análisis de firmas mutacionales. Dado que los perfiles mutacionales diferían notablemente entre los tumores no hipermutados y los tumores hipermutados, estos grupos se analizaron por separado. Los genes significativamente mutados en esta cohorte se identificaron en base a las llamadas de mutación informadas previamente21,22, que comprenden 19 genes en las CCRC no hipermutadas y 14 genes en los casos hipermutados (Tablas suplementarias 9 y 10). Para mejorar la resolución y la solidez de la descomposición de las firmas, se integraron los datos de mutación somática de 953 casos adicionales de CCRC del proyecto Mutographs15, lo que resultó en una cohorte combinada de 1153 casos para un análisis exhaustivo. La descomposición de los espectros SBS e ID cortos identificó 21 SBS (Fig. 3a, b extendida) y siete firmas ID (Fig. 4a, b extendida) en 183 casos no hipermutados, y 11 firmas SBS y dos firmas ID en 17 casos hipermutados (Fig. 5 extendida). Observamos un enriquecimiento significativo de las firmas mutacionales asociadas con la reparación defectuosa del emparejamiento de bases del ADN, específicamente SBS44 y SBS26, en el subtipo 2 en comparación con el subtipo 3 (P = 0,015, q = 0,086 para SBS44; P = 0,014, q = 0,086 para SBS26). En particular, estas firmas (SBS88 y/o ID18) ejercieron un impacto pronunciado en el panorama mutacional de la CCRC en esta cohorte japonesa, y se detectaron en 82 de 183 casos no hipermutados (44,8%) (Fig. 3a y Fig. 3c y 4c extendidas). Observamos una correlación significativa entre las firmas mutacionales asociadas con la reparación defectuosa del emparejamiento de bases del ADN, específicamente SBS44 y SBS26, en el subtipo 2 en comparación con el subtipo 3 (P = 0,015, q = 0,086 para SBS44; P = 0,014, q = 0,086 para SBS26). Fig. 3: Validación de las firmas mutacionales asociadas con la colibactina y los motivos de secuencia en el cáncer colorrectal. Imagen de tamaño completo. a, Proporciones de las firmas mutacionales asociadas con la colibactina. El panel superior muestra las proporciones de SBS88 (firma SBS asociada con la colibactina) e ID18 (firma indel asociada con la colibactina). Entre 183 casos de CCRC no hipermutados, 82 (44,8%) exhibieron una contribución de SBS88 o ID18 de ≥5%. Los paneles del medio y del inferior muestran las contribuciones relativas de las firmas ID y SBS individuales, respectivamente. b, Correlación entre la actividad de la firma mutacional SBS88 y el motivo SBS asociado con la colibactina. El motivo SBS asociado con la colibactina se caracteriza por dos adeninas ubicadas en las posiciones −3 y −4 aguas arriba del sitio de sustitución T > N. Para cada caso, las proporciones de adeninas en las posiciones −3 y −4 se calcularon por separado, y el promedio de estos dos valores se utilizó como la puntuación de enriquecimiento del motivo (eje y)12,13. Se evaluó la significación estadística utilizando una prueba de correlación de Pearson de dos colas. c, Correlación entre la actividad de la firma mutacional ID18 y el motivo ID asociado con la colibactina. El motivo ID asociado con la colibactina se define por la presencia de una adenina ubicada de uno a cuatro bases aguas arriba de una deleción de una sola timina dentro de una región de homopolímero de timina de 1 a 5 pares de bases. Las proporciones de adeninas en las posiciones −4 a −1 relativas al sitio de deleción se calcularon, y el promedio de estas proporciones se utilizó como la puntuación de enriquecimiento del motivo (eje y)12,23. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson, y se evaluó la significación estadística utilizando una prueba de correlación de Pearson de dos colas. Tanto la firma SBS88 como el motivo SBS específico de la colibactina correspondiente (b), así como la firma ID18 y el motivo ID específico de la colibactina correspondiente (c), mostraron correlaciones positivas significativas. Fig. 4: Asociaciones clinicopatológicas y de la microbiota de las firmas mutacionales asociadas con la colibactina en el cáncer colorrectal. Imagen de tamaño completo. a, Prevalencia de los casos positivos para SBS88 (panel superior) y positivos para ID18 (panel inferior) según la edad al diagnóstico. La prevalencia de ambas firmas fue mayor en los pacientes más jóvenes, lo que es consistente con las mayores contribuciones de estas firmas que se muestran en b. Los valores de P para la tendencia en los grupos de edad se calcularon utilizando la prueba de tendencia de Cochran-Armitage. b, Asociación entre las firmas asociadas con la colibactina (ID18 y SBS88) y la edad al diagnóstico (panel superior) o el año de nacimiento (panel inferior). "Ratio" indica el aumento medio de la razón entre dos grupos separados por una línea discontinua negra. Para las comparaciones de grupos estratificadas por los años indicados por las líneas discontinuas negras, la razón más alta y el valor de P correspondiente se muestran en rojo. Los valores de P se calcularon utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas. Los aumentos medios en las contribuciones relativas de SBS88 e ID18 fueron mayores en los pacientes más jóvenes (≤40 años) y en los individuos nacidos después de 1965. El número de pacientes en los grupos de edad al diagnóstico de ≤40, 41-50, 51-60, 61-70 y ≥71 años fueron 10, 24, 36, 60 y 53, respectivamente. El número de pacientes en los grupos de año de nacimiento de ≤1944, 1945-1954, 1955-1964, 1965-1974 y ≥1975 fueron 44, 65, 37, 24 y 12, respectivamente. c, Asociación entre las firmas mutacionales asociadas con la colibactina y los subtipos basados en la microbiota. Los pacientes clasificados como subtipo 3 exhibieron un aumento de las firmas ID18 asociadas con la colibactina en comparación con otros subtipos, particularmente el subtipo 1 (izquierda). Asociación entre la firma SBS88 asociada con la colibactina y los subtipos de CCRC definidos por la microbiota (derecha). Los pacientes clasificados como subtipo 3 mostraron mayores contribuciones de SBS88 en comparación con el subtipo 1. Los valores de P se calcularon utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas, y los valores de q se ajustaron para múltiples pruebas utilizando el método de la FDR de Benjamini-Hochberg. El número de pacientes asignados a los subtipos 1, 2, 3 y 4 fueron 75, 23, 28 y 15, respectivamente. Los cuadros representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los valores máximo y mínimo dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico. d, Asociación entre las firmas mutacionales asociadas con la colibactina y la ubicación del tumor. La razón indica el cambio de razón (razón mediana) entre los grupos separados por una línea discontinua negra. Para SBS88 e ID18, se observaron diferencias significativas en los tumores que se originan en el colon sigmoide y el recto, lo que indica una mayor prevalencia de las firmas asociadas con la colibactina en el colorrecto distal. Los valores de P se calcularon utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas. Para las comparaciones de grupos estratificadas por las ubicaciones anatómicas indicadas por las líneas sólidas, la razón más alta y el valor de P correspondiente se muestran en rojo. El número de tumores ubicados en el ciego, el colon ascendente, el colon transverso, el colon sigmoide, la unión rectosigmoidea y el recto fueron 10, 26, 10, 36, 30 y 61, respectivamente. e, Relación entre las firmas mutacionales que ocurren en conjunto y la edad al diagnóstico. La razón denota el cambio de razón medio entre los dos grupos separados por una línea discontinua negra. Para las comparaciones estratificadas por la edad al diagnóstico, la razón y el valor de P correspondiente para la comparación que muestra la razón más alta se resaltan en rojo. Los valores de P se calcularon utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se observó una coocurrencia significativa entre las firmas asociadas con la colibactina (SBS88 e ID18) y entre SBS93 e ID14. Aunque todas las cuatro firmas tendieron a ser más frecuentes en la CCRC de inicio temprano, SBS88 e ID18 se enriquecieron más en los pacientes de ≤40 años, mientras que SBS93 e ID14 fueron más frecuentes entre los de ≤60 años. SBS30 se observó en la mayoría de los casos de esta cohorte (Fig. 3a y Fig. 3c extendida). Aunque históricamente se ha propuesto que las mutaciones germinales en NTHL1 son la causa subyacente de SBS30, la evidencia reciente sugiere que esta firma refleja más comúnmente el daño en el ADN causado por agentes alquilantes en el CCRC25,26. No se identificaron mutaciones germinales o somáticas en el gen NTHL1 en este conjunto de datos. En consonancia con esta interpretación, SBS30 fue significativamente menos frecuente en pacientes más jóvenes en el momento del diagnóstico (Tabla suplementaria 12). Nuestros análisis identificaron además una coocurrencia significativa entre las firmas mutacionales asociadas a la colibactina SBS88 e ID18, así como entre SBS93 e ID14 (P = 2,5 × 10−12 y 6,6 × 10−6, respectivamente) (Tabla suplementaria 17). Estos procesos mutacionales se observaron con mayor frecuencia en el CRC de inicio temprano en general14. Específicamente, SBS88 e ID18 estuvieron significativamente enriquecidos en pacientes de ≤40 años, mientras que SBS93 e ID14 fueron más prevalentes en pacientes de ≤60 años (Fig. 4e, Figura de datos extendidos 6b y Tabla suplementaria 12). Para evaluar la contribución de los procesos mutacionales asociados a la colibactina a las alteraciones recurrentes en los genes impulsores en esta cohorte, estimamos la probabilidad esperada de cada firma mutacional para mutaciones individuales en función de su contexto de trinucleótidos, siguiendo un método publicado previamente27 (ver Métodos). Entre los CRCs no hipermutados, el 15,3% de los pacientes (28 de 183) presentaban mutaciones con una alta probabilidad predicha y/o un patrón mutacional consistente con la firma de colibactina en los genes impulsores comunes, de los cuales el 78,6% (22 de 28) afectaban a APC (Tabla suplementaria 18). Cabe destacar que las mutaciones en el sitio de empalme de APC, BRAF D594G y tres variantes de TP53 exhibieron altas probabilidades predichas para SBS88 y contextos de trinucleótidos característicos enriquecidos para motivos de secuencia asociados a la colibactina (Tabla suplementaria 18). La mutación en el sitio de empalme de APC, ubicada en el intrón 8, genera un nuevo sitio de aceptación AG, lo que resulta en una inserción de 7 pb y un cambio de marco de lectura (Fig. 5a). Esta alteración recurrente, informada previamente13, se identificó en ocho de 183 CRCs no hipermutados (4,4%), siete de los cuales también presentaban una segunda alteración inactivadora o pérdida de heterocigosidad (LOH) de APC (Tabla suplementaria 19). Estos pacientes exhibieron una contribución significativamente mayor de SBS88 en comparación con otros casos (P = 0,0082) (Fig. 5b), lo que apoya un papel causal de la colibactina en la generación de este sitio de mutación.

Fig. 5: Mutaciones en el sitio de mutación de genes impulsores asociadas a la colibactina en el cáncer colorrectal.
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a, Mutación en el sitio de mutación de APC asociada con la firma SBS88. Esta mutación en el sitio de empalme de APC exhibió el patrón de sustitución AAT > AGT (ATT > ACT) característico de SBS88 junto con el motivo de secuencia específico de colibactina TT(AA) ubicado en las posiciones −3 y −4 aguas arriba del sitio de mutación. El sitio de mutación se encuentra dentro del intrón 8 de APC, creando un nuevo sitio de empalme AG que introduce una inserción de siete bases en la secuencia codificante, lo que resulta en un cambio de marco de lectura. b, Correlación entre las mutaciones en el sitio de mutación de APC y la firma SBS88 asociada a la colibactina. Los pacientes que presentaban mutaciones en el sitio de mutación en el intrón 8 de APC exhibieron contribuciones de SBS88 significativamente mayores que otros pacientes (P = 0,0082, prueba de rango-suma de Wilcoxon de dos colas). Los cuadros representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico. c, Mutaciones en el sitio de mutación ID18 de APC. Entre las 16 deleciones de cambio de marco de lectura de APC que exhiben el patrón mutacional ID18, siete representaron deleciones recurrentes en el sitio de mutación. La deleción somática representativa que se muestra se identificó en tres casos independientes de CCRC. Esta mutación recurrente de cambio de marco de lectura de APC (TTTT > TTT), que representa una sola deleción de timina (−1 T) dentro de una región de homopolímero de timina de 1 a 5 pb, es una característica definitoria de la firma de inserción y deleción (indel) mutacional ID18 asociada a la colibactina. d, Mutación en el sitio de mutación de BRAF. La mutación en el sitio de mutación D594G exhibió tanto el patrón de sustitución de trinucleótidos característico de SBS88 como el motivo de secuencia específico de colibactina.

Además, 14 pacientes exhibieron 16 deleciones de cambio de marco de lectura de APC atribuibles a ID18 (Tabla suplementaria 18), siete de las cuales contenían el motivo ID18 canónico asociado a la colibactina, y siete representaron deleciones recurrentes en el sitio de mutación (Fig. 5c). Dos casos presentaban la mutación en el sitio de mutación BRAF D594G (Fig. 5d), que se ha asociado previamente con una edad más joven, una localización izquierda o rectal y un CCRC no hipermutado28, lo que es consistente con las características clínicas y mutacionales observadas en estos pacientes. En general, la probabilidad esperada de SBS88 se enriqueció significativamente entre las sustituciones no sinónimas en los genes impulsores del cáncer dentro de la cohorte japonesa (P = 4,3 × 10−7). Aunque ID18 no se enriqueció globalmente en todos los eventos de los genes impulsores, estuvo específicamente sobre representado en APC (P = 0,014, razón de probabilidades 2,2, IC del 95% 1,1–3,9).

Utilizando la secuenciación del genoma completo (WGS), detectamos la presencia del gen clbP, que codifica la peptidasa atípica ClbP esencial para la biosíntesis de colibactina29, en 16 (11,9%) de las muestras fecales (Figura de datos extendidos 7a). La PCR cuantitativa (qPCR) confirmó una fuerte correlación entre el número de copias de clbP en las heces y el estimado por WGS (Figura de datos extendidos 7b). Por el contrario, no se observó correlación entre la abundancia de clbP en las heces y la contribución de las firmas mutacionales asociadas a la colibactina (Figura de datos extendidos 7c). La presencia de clbP se examinó además en los tejidos de CCRC utilizando qPCR30,31,32, lo que reveló la detección de clbP en todas las muestras tumorales, así como en todas las 12 muestras de mucosa colónica no cancerosa emparejadas obtenidas de regiones distantes de la lesión primaria de CCRC (Tabla suplementaria 20). Sin embargo, el número de copias de clbP en las heces no mostró correlación con el de los tejidos tumorales emparejados (Figura de datos extendidos 8a, b). Entre los tumores, los tres casos con la mayor abundancia de clbP exhibieron una contribución marcada de las firmas asociadas a la colibactina (Figura de datos extendidos 8c). Sin embargo, la mayoría de los tumores con firmas de colibactina prominentes mostraron un bajo número de copias de clbP (Figura de datos extendidos 8d), lo que indica que la prevalencia de los genes productores de colibactina en una sola muestra no necesariamente refleja la carga mutacional acumulada inducida por la colibactina.

Tiempo de las firmas de colibactina y su asociación con el CCRC de inicio temprano
Analizamos la distribución de las mutaciones clonales y sub clonales tempranas y tardías asociadas con firmas mutacionales específicas utilizando una metodología descrita previamente33. Al comparar las contribuciones de las mutaciones clonales tempranas y tardías, así como las mutaciones clonales y sub clonales en diferentes firmas mutacionales, el análisis reveló que las firmas mutacionales relacionadas con la colibactina demuestran una mayor prevalencia de mutaciones clonales tempranas que las mutaciones clonales y sub clonales tardías (Fig. 6a y Figura de datos extendidos 9a). Entre los 149 casos con mayor SBS88 en la fase clonal temprana que en la fase clonal tardía, los casos más jóvenes adquirieron una contribución significativamente mayor de SBS88 en la fase clonal temprana (coeficiente de correlación = −0,41, P = 2,6 × 10−7) (Fig. 6a). Los 30 pacientes con la mayor carga de mutaciones clonales tempranas de SBS88 fueron significativamente más jóvenes que el resto de la cohorte (P = 1,1 × 10−6) (Fig. 6c). Esta observación es consistente con informes previos que indican que los individuos expuestos a la colibactina desarrollan CCRC a una edad más temprana15,34.

Fig. 6: Una comparación del tiempo de la aberración del número de copias en el CCRC en función de la firma mutacional y el subtipo basado en el microbioma intestinal.
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a, Proporción de firmas SBS en las mutaciones clonales tempranas y tardías. Se evaluó la distribución de las firmas SBS tanto en las mutaciones clonales tempranas como en las tardías. El panel superior muestra los casos de CCRC con una alta contribución de SBS88 entre las mutaciones clonales tempranas, dispuestos de izquierda a derecha en orden descendente de la proporción de SBS88. El panel inferior muestra el mismo conjunto de pacientes en el mismo orden de izquierda a derecha para permitir una comparación directa entre las fases clonales tempranas y tardías. Los pacientes con menos de 50 SNV en cualquiera de las fases se excluyeron del análisis. b, La relación entre la edad y la proporción de SBS88. Se observó una asociación positiva significativa entre una edad más joven y una mayor proporción de SBS88. El valor de P se calculó utilizando una prueba de correlación de Pearson de dos colas. c, Comparación de la edad del paciente entre los casos con alta y baja contribución de SBS88. Este diagrama de caja compara las edades de los 30 casos de CCRC con la mayor contribución de SBS88 con las del resto de la cohorte. Los pacientes con las mayores contribuciones de SBS88 fueron significativamente más jóvenes que los demás casos (P = 1,1 × 10−6, prueba de rango-suma de Wilcoxon de una cola). Diagramas de caja: línea central, mediana; límites de la caja, cuartiles superior e inferior; líneas verticales, 1,5 veces el rango intercuartílico; puntos, casos individuales. d, Correlación entre los subtipos de CCRC basados en el microbioma intestinal y la adquisición secuencial de ganancias del número de copias. Se comparó el orden temporal de tres clases de eventos de ganancia del número de copias entre los subtipos de CCRC definidos por el microbioma intestinal: (1) pérdida de heterocigosidad del número de copias neutro (CNN-LOH) o pérdida seguida de ganancia (N:0); (2) ganancias monoalélicas (N:1); y (3) ganancias bialélicas (N:M). Entre estas categorías, el subtipo 3 exhibió una aparición más temprana de los eventos CNN-LOH/pérdida + ganancia en comparación con el subtipo 2. Diagramas de caja: línea central, mediana; límites de la caja, cuartiles superior e inferior; líneas verticales, 1,5 veces el rango intercuartílico; puntos, casos individuales. La significación estadística se determinó utilizando una prueba de rango-suma de Wilcoxon de dos colas, con el valor de P ajustado para múltiples pruebas utilizando el método FDR de Benjamini-Hochberg. e, Cronología de la evolución somática en un caso representativo de CCRC en el subtipo 3 que destaca la importante participación de la firma de colibactina SBS88 (aproximadamente el 10%) en la progresión de la enfermedad del paciente. La figura 6e muestra los hallazgos de CM099, una mujer de 54 años con CCRC de etapa II en el lado izquierdo, no fumadora, con un fenotipo no hipermutado. Este paciente mostró una mutación en el sitio de empalme de APC que coincidió con la firma SBS88 y el motivo específico de colibactina anotado como clonal temprano. Se ha informado previamente35 que los casos con una alta contribución de SBS88 exhibieron actividad mutacional antes de los 10 años. En este caso, también se supuso que la mutación de APC asociada con la firma SBS88 ocurrió durante la primera década de vida. Se requerirán análisis de alta resolución adicionales, como la secuenciación de células individuales, para delinear con precisión el inicio temporal de este evento mutacional36. Casi simultáneamente, el caso experimentó TP53 (sin sentido), NOTCH1 (con sentido) y la pérdida de chr17p, seguida de la duplicación del genoma completo con un tiempo relativo medio de 0,76 (IC del 95% 0,75-0,76) (alrededor de los 41 años).

Utilizando las mutaciones somáticas y las variaciones del número de copias, pudimos estimar el tiempo relativo de tres tipos de ganancias del número de copias: (1) pérdida de heterocigosidad del número de copias neutro (CNN-LOH)/pérdida + ganancia (N:0); (2) ganancias monoalélicas (N:1); y (3) ganancias bialélicas (N:M)33. El subtipo 3 demostró una aparición más temprana de CNN-LOH/pérdida + ganancia que el subtipo 2 (P = 0,018, q = 0,11) independientemente de la edad del paciente (Fig. 6d). Las ganancias monoalélicas no mostraron una asociación significativa, y aunque las ganancias bialélicas fueron nominalmente significativas entre el subtipo 2 y el subtipo 3 (P = 0,044), estas asociaciones no siguieron siendo significativas después de la corrección para múltiples pruebas (Figura de datos extendidos 9b, c).

Un estudio de caso en profundidad de un paciente con CCRC en el subtipo 3 destacó la importante participación de la firma de colibactina SBS88 (aproximadamente el 10%) en la progresión de la enfermedad del paciente. La figura 6e muestra los hallazgos de CM099, una mujer de 54 años con CCRC de etapa II en el lado izquierdo, no fumadora, con un fenotipo no hipermutado. Este paciente mostró una mutación en el sitio de empalme de APC que coincidió con la firma SBS88 y el motivo específico de colibactina anotado como clonal temprano. Se ha informado previamente35 que los casos con una alta contribución de SBS88 exhibieron actividad mutacional antes de los 10 años. En este caso, también se supuso que la mutación de APC asociada con la firma SBS88 ocurrió durante la primera década de vida. Se requerirán análisis de alta resolución adicionales, como la secuenciación de células individuales, para delinear con precisión el inicio temporal de este evento mutacional36. Casi simultáneamente, el caso experimentó TP53 (sin sentido), NOTCH1 (con sentido) y la pérdida de chr17p, seguida de la duplicación del genoma completo con un tiempo relativo medio de 0,76 (IC del 95% 0,75-0,76) (alrededor de los 41 años). Además, el caso presentó diversas ganancias y pérdidas cromosómicas (Tablas suplementarias 21 y 22). Entorno inmunitario en el CRC asociado a colibactina. La microbiota intestinal tiene un impacto tanto en el entorno inmunitario local del intestino como en el sistema inmunitario sistémico más amplio. Investigamos la correlación entre los subtipos basados en el microbioma y la composición de las células inmunitarias, según lo determinado por CIBERSORTx (Fig. 7a y Fig. 10a, b de los datos ampliados). El análisis de la composición de las células inmunitarias demostró que las células plasmáticas estaban significativamente enriquecidas en el subtipo 3 en relación con el subtipo 1 (P = 0,011, q = 0,032), el subtipo 2 (P = 0,0012, q = 0,0073) y el subtipo 4 (P = 0,029, q = 0,057). También se observó que las células cebadas en reposo eran significativamente más abundantes en el subtipo 3 que en el subtipo 2 (P = 0,012, q = 0,074). Por el contrario, las células asesinas naturales en reposo estaban significativamente disminuidas en el subtipo 3 en relación con el subtipo 2 (P = 0,016, q = 0,095) (Fig. 7a y Tabla suplementaria 23).

Fig. 7: Entorno inmunitario en los CRCs basados en la firma mutacional y el subtipo basado en la microbiota intestinal. Imagen de tamaño completo.

a, Composición de las células inmunitarias inferida por CIBERSORTx en los subtipos de CRC (izquierda). Se utilizó CIBERSORTx para estimar las proporciones relativas de las poblaciones de células inmunitarias en todos los casos de CRC con datos de ARN-seq disponibles. El análisis reveló que no había diferencias significativas en la composición general de las células inmunitarias entre los subtipos de CRC. Los análisis comparativos de las fracciones de células inflamatorias por subtipo se muestran en la Fig. 10a, b de los datos ampliados. Tipos de células inmunitarias que muestran diferencias significativas entre los subtipos de CRC (derecha). De las 22 fracciones de células inmunitarias e inflamatorias inferidas por CIBERSORTx, las células plasmáticas, las células cebadas en reposo y las células asesinas naturales (NK) en reposo mostraron diferencias significativas entre los subtipos, según lo evaluado mediante una prueba unilateral de Wilcoxon. Las cajas representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los valores máximo y mínimo dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico. b, Correlación entre las firmas mutacionales asociadas a la colibactina (SBS88 e ID18) y la proporción de células Treg en los subtipos de CRC definidos por el microbioma. Entre los cuatro subtipos, se observó una correlación positiva exclusivamente en el subtipo 3, según lo evaluado mediante la prueba de correlación de Spearman. c, Comparación de las proporciones de células Treg en el subtipo 3, estratificada por las contribuciones medianas de SBS88 e ID18. Dentro del subtipo 3, los casos se dividieron en dos grupos según si sus contribuciones de la firma mutacional SBS88 e ID18 estaban por encima o por debajo de las medianas respectivas. Los diagramas de caja muestran la distribución de las proporciones de células Treg en cada grupo. Aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística mediante una prueba unilateral de Wilcoxon, los casos con mayores contribuciones de SBS88 e ID18 mostraron una tendencia hacia proporciones más altas de células Treg. Las cajas representan los percentiles 25-75, las líneas horizontales indican las medianas y las líneas verticales se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico. d, Tinción inmunohistoquímica representativa para FOXP3, un marcador de factor de transcripción de las células Treg. Se muestran imágenes representativas de dos casos de CRC: CM040, que presenta firmas mutacionales SBS88 e ID18 pronunciadas (izquierda), y CM053, que muestra firmas asociadas a la colibactina mínimas (derecha). El caso CM040 demuestra una mayor densidad de linfocitos FOXP3-positivos. e, Análisis cuantitativo inmunohistoquímico de la expresión de FOXP3 en 28 casos de CRC clasificados como subtipo 3. Para cada caso, se seleccionaron aleatoriamente cinco regiones representativas que contenían linfocitos infiltrantes tumorales y se obtuvieron imágenes con un aumento de ×200. Los linfocitos FOXP3-positivos se enumeraron manualmente dentro de cada campo de visión. La evaluación cuantitativa reveló una correlación positiva significativa entre el número de células FOXP3-positivas y la proporción de células Treg estimada por CIBERSORTx, tanto para la firma mutacional SBS88 (R = 0,73, IC del 95% 0,59-0,87, P = 1,1 × 10−5; prueba de correlación de Pearson de dos colas) como para la firma mutacional ID18 (R = 0,55, IC del 95% 0,22-0,77, P = 2,4 × 10−3; prueba de correlación de Pearson de dos colas). f, Correlación entre los subtipos definidos por el microbioma, la carga mutacional tumoral (TMB) y las firmas del perfil de expresión génica (GEP) asociadas a las células T. Los tumores clasificados como TMBaltoGEPalto (indicativo de un fenotipo inmunorreactivo) fueron significativamente menos frecuentes en el subtipo 3 que en los subtipos 1 y 2 (subtipo 3 frente a subtipo 1: P = 0,0040, q = 0,024, razón de probabilidades (OR) 0,18, IC del 95% 0,031-0,67; subtipo 3 frente a subtipo 2: P = 0,042, q = 0,13, OR 0,22, IC del 95% 0,032-1,09). Los valores de P se calcularon utilizando una prueba exacta de Fisher de dos colas, y los valores de q se ajustaron para la corrección por múltiples pruebas utilizando el método FDR de Benjamini-Hochberg. Estos resultados también sugieren que el subtipo 3, caracterizado por una alta contribución de la firma SBS88, representa un fenotipo tumoral "frío" inmunológico. g, Correlación entre las firmas mutacionales asociadas a la colibactina, la TMB y las firmas GEP. Después de excluir los casos de CRC hipermutados, los pacientes con un alto recuento de mutaciones SBS88 (≥675; valor medio) mostraron una proporción significativamente mayor de tumores TMBaltoGEPbajo en comparación con los pacientes con un bajo recuento de mutaciones SBS88 (P = 0,033; prueba exacta de Fisher unilateral). Después del ajuste para la corrección por múltiples pruebas utilizando el método FDR de Benjamini-Hochberg, la asociación siguió siendo sugestiva (q = 0,13, OR 2,04, IC del 95% 1,07-no estimable). No se observó una asociación significativa para las mutaciones ID18 cuando se aplicó un umbral de 51 (valor medio) (P = 0,20, OR 1,42, IC del 95% 0,76-no estimable) (Fig. 10c de los datos ampliados).

Investigamos a continuación la relación entre los subtipos microbianos y las células T reguladoras (células Treg). Se observó una correlación positiva entre la proporción de células Treg y las contribuciones de las firmas mutacionales SBS88 e ID18 solo en el subtipo 3 (Fig. 7b). Además, dentro del subtipo 3, la estratificación por los valores medianos de SBS88 e ID18 reveló que los tumores con mayores contribuciones de estas firmas tendían a tener una proporción mayor de células Treg (Fig. 7c). Se realizó una tinción inmunohistoquímica para FOXP3 en 28 casos de CRC clasificados como subtipo 3. Para cada caso, se seleccionaron aleatoriamente cinco regiones representativas que contenían linfocitos infiltrantes tumorales y se obtuvieron imágenes con un aumento de ×400 (Fig. 7d). Los linfocitos FOXP3-positivos se enumeraron dentro de estos campos. La evaluación cuantitativa demostró que la densidad de células FOXP3-positivas exhibió una asociación positiva significativa con la firma mutacional SBS88 (R = 0,73, IC del 95% 0,59-0,87, P = 1,1 × 10−5) y la firma de indeles ID18 (R = 0,55, IC del 95% 0,22-0,77, P = 2,4 × 10−5) (Fig. 7e).

La integración de la carga mutacional tumoral y la puntuación del perfil de expresión génica (GEP) de las células T inflamadas37 es útil para clasificar los entornos inmunitarios tumorales. En la categoría TMBaltoGEPalto (inmuno-caliente), la proporción de pacientes del subtipo 3 fue significativamente menor que la del subtipo 1 después del ajuste para la corrección por múltiples pruebas (P = 0,0040, q = 0,024, razón de probabilidades 0,18, IC del 95% 0,031-0,67) (Fig. 7f). Después de excluir los casos de CRC hipermutados, los pacientes con un alto recuento de mutaciones SBS88 (≥675, valor medio) mostraron una proporción significativamente mayor de tumores TMBaltoGEPbajo en comparación con los pacientes con un bajo recuento de mutaciones SBS88 (P = 0,033) (Fig. 7g). Después del ajuste para la corrección por múltiples pruebas, la asociación siguió siendo sugestiva (q = 0,13, razón de probabilidades 2,04, IC del 95% 1,07-no estimable). No se observó una asociación significativa para las mutaciones ID18 cuando se aplicó un umbral medio de 51 (P = 0,20, razón de probabilidades 1,42, IC del 95% 0,76-no estimable) (Fig. 10c de los datos ampliados).

Discusión

Hasta donde sabemos, este estudio representa el primer análisis integrativo que combina la elaboración de perfiles metagenómicos derivados de las heces con la secuenciación del genoma completo (WGS) de los tejidos de CRC. A través de este enfoque, los pacientes se estratificaron en cuatro subtipos basados en el microbioma. El subtipo 3, caracterizado por una baja contribución de F. nucleatum en las heces, según lo determinado por WGMS, se asoció paradójicamente con una edad más joven y una mayor prevalencia de firmas mutacionales relacionadas con la colibactina. Por el contrario, el subtipo 2, caracterizado por una alta abundancia relativa de F. nucleatum y P. stomatis, se asoció con etapas avanzadas de CRC. Estos hallazgos destacan que diferentes consorcios microbianos dan forma a la patogénesis del CRC a través de mecanismos heterogéneos, y que las alteraciones genómicas subyacentes a la carcinogénesis y la progresión del CRC varían entre los subtipos (Tabla 1).

Tabla 1. Datos clínicos y anomalías genómicas en los subtipos de cáncer colorrectal categorizados en función de la microbiota intestinal.

La firma mutacional asociada a la colibactina se observó en aproximadamente el 45% de los CRCs no hipermutados en Japón, con una prevalencia particularmente alta entre los pacientes más jóvenes. La frecuencia de esta firma superó la notificada en otros países12,14,15, y los análisis de cohortes de nacimiento demostraron un aumento sorprendente entre los individuos nacidos después de 1965 (Fig. 4b y Fig. 6a de los datos ampliados). Además de validar las mutaciones APC previamente notificadas que contienen el motivo de la colibactina13, este estudio identificó nuevas mutaciones de BRAF con la impronta exacta.

Nuestro análisis reveló una coocurrencia significativa entre SBS88 e ID18, así como entre SBS93 e ID14. Aunque estudios anteriores han demostrado que SBS93 e ID14 ocurren con mayor frecuencia en el CRC de inicio temprano14, nuestros hallazgos demuestran que SBS88 e ID18 están significativamente enriquecidos en pacientes menores de 40 años, mientras que SBS93 e ID14 se observan con mayor frecuencia en aquellos menores de 60 años. En conjunto, estos resultados sugieren que los mecanismos etiológicos que impulsan los CRCs asociados a SBS93/ID14 son probablemente distintos de los que subyacen a los casos asociados a SBS88/ID18.

La carga desproporcionadamente alta de mutaciones asociadas a la colibactina en los CRCs japoneses, particularmente entre aquellos nacidos después de 1965, sigue sin explicación. La colonización temprana de la microbiota postnatal es fundamental para el desarrollo inmunológico, y las alteraciones durante este período pueden tener efectos duraderos38. En los Estados Unidos, el transporte de E. coli pks+ entre los lactantes amamantados a término alcanzó un máximo del 38% entre los 6 y los 12 meses, pero disminuyó a partir de entonces39. Por el contrario, los recién nacidos prematuros expuestos a cuidados intensivos neonatales y antibióticos mostraron un transporte más alto y persistente. El uso de antibióticos pediátricos en Japón ha sido históricamente extenso, a menudo para infecciones menores. Desde finales de la década de 1970, las cefalosporinas de segunda generación y los macrólidos se han recetado ampliamente a una frecuencia superior a la de muchos países occidentales40. Aunque es especulativo, estas exposiciones tempranas en la vida pueden haber promovido tanto la persistencia de E. coli pks+ como la acumulación de mutaciones asociadas a la colibactina, contribuyendo así al aumento de la incidencia de CRC de inicio temprano en Japón. El aumento temporal de SBS88 surgió después de 1965, mientras que el aumento del subtipo 3 se hizo evidente después de 1985, lo que indica un retraso aproximado de 20 años. Aunque esta discrepancia cronológica no puede atribuirse a un único factor causal, la marcada escalada en el consumo de antibióticos en Japón a partir de finales de la década de 1970 puede haber alterado aún más el entorno intestinal expuesto a las bacterias productoras de colibactina, lo que podría amplificar los procesos carcinogénicos mediados por la colibactina. No obstante, otros factores ambientales, incluidos los cambios en la dieta y el estilo de vida, pueden actuar en conjunto para impulsar esta tendencia epidemiológica.

Curiosamente, el subtipo 3 mostró una infiltración significativa de células Treg, lo que sugiere un entorno tumoral inmunosupresor distinto de otros subtipos microbianos. La predominancia de las células Treg puede reflejar la modulación inmunitaria impulsada por E. coli pks+, que produce la genotoxina colibactina que induce daños por alquilación del ADN y señalización inflamatoria asociada a la senescencia, promoviendo así la diferenciación de las células Treg a través de las vías de IL-6, IL-10 y TGF-β12,41,42. La expansión de las células Treg mediada por la microbiota podría suprimir la actividad citotóxica de las células T y contribuir al fenotipo inmunitario "frío" característico de este subtipo. Sin embargo, la mayor parte de la evidencia de respaldo proviene de análisis correlativos y modelos murinos, y las conexiones causales directas entre la exposición microbiana, la acumulación de células Treg y los fenotipos inmunitarios "fríos" en tumores humanos siguen siendo limitadas43. Se requerirán estudios integrativos adicionales que combinen la genómica microbiana y la elaboración de perfiles inmunitarios espaciales para aclarar estos mecanismos en el CCRC. No se observó una correlación significativa entre la expresión de clbP en los tejidos tumorales y las firmas mutacionales asociadas a la colibactina SBS88 e ID18. Esto probablemente refleja una discordancia temporal entre las dos mediciones: las firmas mutacionales capturan la exposición acumulada e histórica, mientras que la abundancia de clbP representa la carga bacteriana en el momento del muestreo15. Aunque las firmas mutacionales proporcionan un registro duradero de la exposición pasada a bacterias productoras de colibactina, la microbiota intestinal es inherentemente dinámica y está sujeta a fluctuaciones temporales impulsadas por factores del huésped y ambientales. En consonancia con esta interpretación, una publicación anterior44 informó que no existen diferencias significativas en la prevalencia de clbB entre pacientes con CCRC, aquellos con adenomas y individuos sanos.

Este estudio tiene limitaciones. En primer lugar, la profundidad media de secuenciación para las muestras tumorales (56×) fue modesta en comparación con las profundidades de >100× que se utilizan cada vez más en estudios recientes14. En segundo lugar, se observaron diferencias en las células plasmáticas, las células cebadas en reposo y las células asesinas naturales en reposo entre los subtipos basados en la microbiota intestinal utilizando la inferencia de la composición de las células inmunitarias basada en CIBERSORTx. Sin embargo, estos hallazgos deben interpretarse con cautela y requerirán validación utilizando enfoques ortogonales, como análisis transcriptómicos de célula única o espaciales.

En resumen, este estudio identifica un posible mecanismo subyacente a la elevada incidencia de CCRC en Japón y su creciente frecuencia entre los individuos más jóvenes. Estos hallazgos sugieren que las estrategias preventivas dirigidas a limitar la colonización por bacterias pks+ y suprimir la producción de colibactina45 pueden representar enfoques viables para reducir la carga global de CCRC.

Métodos
Pacientes y muestras
Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Investigación del Centro Nacional del Cáncer, la Universidad de Osaka y el Instituto de Ciencia de Tokio, ya que cumplía con las directrices éticas para la investigación médica y sanitaria que involucra a seres humanos (Consejo de Revisión Institucional del Centro Nacional del Cáncer, 2013-244; Comité de Ética de la Investigación, la Universidad de Osaka, 20064-2; Comité de Ética de la Investigación, el Instituto de Ciencia de Tokio, 2014018). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión. Todos los datos se anonimizaron antes del análisis y se aplicó un procedimiento de doble anonimización a todos los identificadores de los participantes.

Este estudio incluyó un total de 600 individuos, que comprendían 454 pacientes con CCRC confirmado histológicamente y 146 controles sanos (CS), que fueron reclutados en el Hospital del Centro Nacional del Cáncer (Tokio, Japón) y el Hospital de la Universidad de Osaka (Osaka, Japón) entre 2014 y 2025. De estos, la cohorte 1 consistió en casos recogidos prospectivamente específicamente para el presente estudio, mientras que la cohorte 2 comprendió casos descritos previamente en nuestro trabajo publicado8 (Figura de Datos Complementarios 1a).

Estos estudios fueron diseñados para ser observacionales e incluyeron participantes para los que estaban disponibles los especímenes biológicos necesarios para los análisis exhaustivos, como muestras de heces, tejidos tumorales y ADN normal correspondiente, entre 2014 y 2025. Se excluyeron de los análisis los individuos con síndromes de CCRC hereditarios, incluido el pólipo adenomatoso familiar y el CCRC hereditario no polipósico, o con enfermedad inflamatoria intestinal.

Los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) se obtuvieron de los tejidos primarios de CCRC en 200 casos de la cohorte 1. Los datos de secuenciación del genoma del microbioma (WGMS) derivados de muestras de heces estuvieron disponibles para un total de 395 pacientes con CCRC y 146 CS en ambas cohortes. Se recopiló información detallada sobre el estilo de vida y los hábitos alimenticios de los participantes mediante un cuestionario completo autoadministrado que comprendía 475 preguntas en 25 páginas. El cuestionario se desarrolló basándose en el marco del Estudio de Próxima Generación basado en el Centro de Salud Pública de Japón (JPHC-NEXT)46.

Recogida y procesamiento de muestras de heces
Se clasificó como CS a aquellos individuos que presentaban un resultado positivo en la prueba de sangre oculta en heces durante una visita al hospital y que posteriormente se sometieron a una colonoscopia para un cribado secundario, sin hallazgos clínicamente significativos. Se obtuvieron muestras de heces de los CS y los pacientes con CCRC antes del inicio de cualquier tratamiento, incluida la resección quirúrgica o la quimioterapia. Se recogió para el análisis la primera muestra de heces emitida en el hospital el día de la colonoscopia47,48. En la mayoría de los casos, las muestras de heces recogidas el día de la colonoscopia eran sólidas. En consonancia con nuestras observaciones previas47, la composición taxonómica microbiana mostró un alto grado de concordancia con la de las muestras de heces congeladas estándar obtenidas sin preparación intestinal (coeficiente de correlación de Pearson = 0,91, P < 0,01). Todas las muestras de heces se congelaron inmediatamente en hielo seco y posteriormente se almacenaron a −80 °C hasta la extracción de ADN. Se indicó a los participantes que consumieran una dieta baja en residuos el día anterior a la colonoscopia. El día del examen, todos los participantes recibieron un agente de limpieza intestinal seguido de una evaluación colonoscópica.

Recogida de muestras de tumor y de tejido normal correspondiente
Los tejidos tumorales se obtuvieron de especímenes resecados quirúrgicamente de pacientes con CCRC. El ADN no tumoral correspondiente se extrajo principalmente de linfocitos sanguíneos periféricos; en casos seleccionados, también se utilizó la mucosa colónica no neoplásica recogida de regiones anatómicamente distantes del tumor primario como control normal.

Definiciones de los criterios de valoración clínicos
La supervivencia global se definió como el intervalo desde el inicio del tratamiento hasta la muerte por cualquier causa, con censura en la fecha del último seguimiento confirmado para los pacientes supervivientes (Tabla Suplementaria 1). La supervivencia libre de progresión (SLP) se definió como el intervalo entre el inicio del tratamiento y la primera evidencia documentada de progresión de la enfermedad, según lo determinado por exámenes radiológicos seriados (por ejemplo, tomografía computarizada o resonancia magnética) o por la confirmación clínica de la recurrencia o metástasis del tumor.

Clasificación de subtipos microbianos y evaluación de la reproducibilidad
Para el conjunto de datos de prueba combinado (cohortes 1 + 2), que comprendía 199 casos de CCRC de nuestra publicación anterior8 y 196 casos de CCRC recogidos recientemente del Hospital del Centro Nacional del Cáncer y el Hospital de la Universidad de Osaka, aplicamos un algoritmo de clasificación de subtipos microbianos publicado previamente16. Los casos se clasificaron en cuatro subtipos microbianos y se compararon sus composiciones de la comunidad bacteriana para evaluar la reproducibilidad.

Se resumieron las características clinicopatológicas basales en los subtipos y se analizó la supervivencia global utilizando el método de Kaplan-Meier, con comparaciones realizadas con la prueba de rango logarítmico. Estas comparaciones univariadas evaluaron las diferencias en la supervivencia que podrían reflejar tanto las variaciones relacionadas con el subtipo como las variaciones clínicas de fondo. Para determinar si los subtipos microbianos influyen de forma independiente en el pronóstico, aplicamos además modelos de riesgos proporcionales de Cox multivariados ajustados por covariables pronósticas establecidas.

WGMS de muestras de heces
El ADN genómico se extrajo de las muestras de heces congeladas utilizando un protocolo de trituración con cuentas49 en combinación con el kit de aislamiento de ADN GNOME (MP Biomedicals). Se evaluó la integridad y la concentración del ADN utilizando el sistema Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies). Tras la precipitación con etanol, el ADN purificado se resuspendió en tampón TE y se almacenó a −80 °C hasta la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas de secuenciación se construyeron a partir del ADN de heces utilizando el kit de preparación de muestras de ADN Nextera XT (Illumina) según las instrucciones del fabricante. Se realizó WGMS en la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina) con lecturas apareadas (PE) (2 × 150 pb), con el objetivo de una profundidad de secuenciación media de 5,0 Gb por muestra.

Control de calidad de la secuenciación metagenómica y elaboración de perfiles taxonómicos
En total, se generaron 9.875.823.911 lecturas PE (46.899.434 de media) de la cohorte 1 y 10.156.584.408 lecturas PE (44.708.121 de media) de la cohorte 2 a partir de la secuenciación de 150 pb y se sometieron a un control de calidad estricto. Se eliminaron las lecturas sin procesar que contenían bases indeterminadas ('N'). Se identificaron y filtraron las lecturas que contenían secuencias de bacteriófago phiX mediante la alineación con el genoma de referencia utilizando Bowtie2 (v.2.2.9) con la opción '-fast-local'. Se recortaron las secuencias de los adaptadores y los cebadores utilizando Cutadapt (v.1.9.1) con los siguientes parámetros: para las lecturas directas, -a CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC -O 33 -q 17; para las lecturas inversas, -a CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA -O 32 -q 17. Dentro de Cutadapt, las lecturas con puntuaciones de calidad consecutivas de ≤17 se recortaron en el extremo 3', y las lecturas más cortas de 50 pb después del recorte se descartaron. También se excluyeron las lecturas con una puntuación de calidad media de ≤25. Las lecturas de alta calidad se alinearon con el genoma de referencia humano (GRCh38; gi 568336000-568336023) utilizando Bowtie2 (v.2.2.9), y se eliminaron todas las lecturas que se asignaron al genoma humano. Posteriormente, se descartaron las lecturas no emparejadas. Tras estos pasos de filtrado, se retuvieron un total de 8.777.929.480 lecturas PE (46.899.434 de media) de la cohorte 1 y 8.896.915.982 lecturas PE (44.708.121 de media) de la cohorte 2 para los análisis posteriores (en adelante, denominadas lecturas de alta calidad). Las lecturas controladas por calidad se procesaron utilizando MetaPhlAn3 con los parámetros predeterminados para generar perfiles taxonómicos a nivel de especie y género50.

Identificación de subtipos de CCRC basados en los valores SHAP derivados del metagenoma
Construcción de un clasificador de CCRC utilizando un modelo de bosque aleatorio
Se construyó un modelo de bosque aleatorio para estimar la probabilidad de CCRC, denominado en lo sucesivo "puntuación del rasgo microbiano de CCRC", que se calculó para cada muestra. El modelo se entrenó en cuatro cohortes metagenómicas independientes7,17,18,19 seleccionadas a través del paquete R curatedMetagenomicData20, aplicando umbrales de filtrado de 1 × 10−5 para la abundancia taxonómica y 0,95 para la prevalencia. El entrenamiento y la evaluación del modelo se realizaron utilizando la biblioteca scikit-learn (v.1.2.2). El rendimiento del modelo se evaluó mediante una validación cruzada de diez pliegues, lo que arrojó un AUC de 0,84. El clasificador entrenado se aplicó posteriormente a los perfiles de abundancia relativa a nivel de especie derivados de MetaPhlAn3 de 196 muestras de CCRC (cohorte 1) y 146 CS informados previamente8. Esta evaluación arrojó un AUC de 0,74, lo que confirmó un rendimiento discriminatorio constante en un conjunto de datos independiente (Figura de Datos Complementarios 1b).

Análisis SHAP e identificación de subtipos
Se han desarrollado marcos de inteligencia artificial interpretables, como SHAP y LIME (explicaciones locales interpretable de modelos agnósticos), para dilucidar los mecanismos internos de toma de decisiones de los modelos predictivos complejos51. Entre estos, SHAP proporciona un marco matemáticamente riguroso y reproducible para la atribución de características, que cuantifica la contribución de cada variable de entrada a la salida del modelo. El análisis SHAP se basa en la teoría cooperativa de juegos, en la que los valores de Shapley representan la distribución justa de las contribuciones entre todos los predictores. En este estudio, se utilizó SHAP para interpretar el proceso de decisión interno del modelo de bosque aleatorio y para identificar características microbianas distintas asociadas con el CCRC. Para caracterizar aún más la heterogeneidad del CCRC, se realizó una agrupación no supervisada de los valores SHAP utilizando el algoritmo k-means. El número óptimo de subtipos de CCRC se determinó minimizando la suma de cuadrados dentro del grupo (Figura de Datos Complementarios 2a). Dado que SHAP no tiene en cuenta inherentemente los posibles factores de confusión, como la edad, el estadio tumoral o el sitio del tumor primario, examinamos sistemáticamente estas variables en los grupos derivados de SHAP para evaluar las posibles influencias de confusión. La reproducibilidad de la clasificación de subtipos basada en SHAP se validó en una cohorte independiente de 199 casos de CRC (cohorte 2) (Figura 2b y 2c en los datos suplementarios). Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete Python shapmat (https://github.com/ryzary/shapmat). Se realizó un análisis de WGS del ADN genómico de CRC extraído de tejidos tumorales primarios y muestras de sangre periférica correspondientes. Se prepararon bibliotecas de WGS con un tamaño de inserción promedio de 550 pb a partir de 2 µg de ADN genómico utilizando el kit de preparación de bibliotecas TruSeq DNA PCR-Free (Illumina). La secuenciación se realizó en la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina) con lecturas PE de 150 pb. La profundidad de secuenciación mediana fue de 52× (media, 56×) para las muestras tumorales y de 32× (media, 34×) para las muestras normales correspondientes. La pureza tumoral estimada mediana fue de 0,52 (rango, 0,11–0,97), y todos los casos cumplieron con el criterio de inclusión de ≥10% de pureza tumoral.

Detección de mutaciones
Las lecturas PE se alinearon al genoma de referencia humano (GRCh37) utilizando BWA-MEM52. Los duplicados de PCR se eliminaron eliminando las lecturas emparejadas que se asignaron a las mismas coordenadas genómicas, y posteriormente se generaron archivos de acumulación utilizando SAMtools53. Las mutaciones puntuales somáticas, incluidas las SNV y las pequeñas inserciones y deleciones, se identificaron según los siguientes ocho criterios: (1) calidad de mapeo de ≥20 y (2) calidad de la base de ≥10. Las mutaciones somáticas candidatas se filtraron aún más aplicando las siguientes condiciones: (3) en cada muestra tumoral, se requirió que las variantes estuvieran respaldadas por al menos cuatro lecturas cuando la frecuencia alélica de la variante tumoral (TVAF) fuera ≥0,15, o por al menos ocho lecturas cuando 0,15 > TVAF ≥ 0,05, con al menos una lectura de respaldo que tuviera una calidad de base ≥30; (4) la frecuencia alélica de la variante (VAF) de la muestra no tumoral correspondiente tuvo que ser TVAF ≥ 0,05, y (6) la relación de TVAF a NVAF fue ≥20. Para excluir los polimorfismos de un solo nucleótido de la línea germinal, (7) se requirió que la proporción de muestras no tumorales con una VAF ≥ 0,1 fuera 95% de las lecturas derivadas de una sola cadena).

Análisis del número de copias
Las relaciones del número de copias, la pureza tumoral y la ploidía se estimaron utilizando Battenberg (v.2.2.10)54 con parámetros predeterminados. Las relaciones del número de copias inferidas se ajustaron posteriormente según la pureza tumoral estimada de cada muestra para obtener perfiles del número de copias corregidos por la pureza.

Análisis de genes significativamente mutados
Los genes significativamente mutados se identificaron utilizando tres enfoques complementarios: el método de sesgo de inactivación22, el método de sesgo de activación y dNdScv55. Para la prueba de sesgo de inactivación, se comparó el número de muestras que contenían mutaciones inactivadoras (mutaciones sin sentido, de lectura continua, de sitio de empalme o de cambio de marco) con el número que contenía mutaciones alternativas utilizando la prueba exacta de Fisher. Por el contrario, para la prueba de sesgo de activación, se comparó el número de mutaciones activadoras (mutaciones de aminoácidos en sitios críticos) con el número de otras mutaciones utilizando la prueba exacta de Fisher. Se definieron como puntos calientes mutacionales las posiciones genómicas que exhibían al menos dos mutaciones idénticas. Las mutaciones que ocurrían dentro de los 5 pb de un punto caliente también se clasificaron como mutaciones de punto caliente. Dado que las mutaciones de aminoácidos en sitios críticos son generalmente activadoras, pero a veces pueden ser inactivadoras o funcionalmente ambiguas, los genes con P < 0,05 mediante el método de sesgo de inactivación se designaron como posibles genes supresores tumorales, y sus valores de P de sesgo de activación se fijaron en 1. Se corrigió la prueba de hipótesis múltiple utilizando el procedimiento de tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg, y los valores de P ajustados se informan como valores q. Se consideraron genes significativamente mutados si alguno de los tres análisis arrojó un valor q de