CPS1 favorece la progresión del cáncer colorrectal al inducir la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y activar la vía de señalización TGF-β/Smad.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común a nivel mundial, representando aproximadamente el 10% de todos los casos de cáncer y las muertes relacionadas, lo que constituye una importante carga para la salud pública.^[1] El manejo clínico actual del CCR sigue siendo un desafío, ya que aproximadamente el 90% de los pacientes desarrolla resistencia adquirida a los regímenes de quimioterapia estándar.^[2] La aplicación de inhibidores de puntos de control inmunitario se aplica actualmente principalmente a pacientes con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR)/alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), lo que representa solo alrededor del 15% de todos los casos de CCR.^[3],^[4] La metástasis a distancia es el factor clave que contribuye al mal pronóstico en el CCR, y los pacientes con metástasis suelen tener una supervivencia global (OS) mediana que no supera los 25-30 meses.^[5],^[6] Además, los estudios epidemiológicos indican que la incidencia de CCR en personas menores de 50 años está aumentando a una tasa anual del 1-4%. Este grupo es propenso a un diagnóstico tardío debido a síntomas atípicos, y la mayoría de ellos presentan enfermedad en etapas avanzadas al momento del diagnóstico.^[7] Por lo tanto, es particularmente urgente aclarar el mecanismo molecular de la aparición y el desarrollo del CCR.

La carbamoil-fosfato sintasa 1 (CPS1) cataliza la conversión de amoníaco en carbamoil fosfato,^[8] actuando como la enzima limitante de la velocidad en el ciclo de la urea. Como producto intermedio del ciclo de la urea, las poliaminas desempeñan un papel crucial en la proliferación de las células tumorales.^[9],^[10] Se ha informado que la expresión de CPS1 se reduce mediante la represión transcripcional mediada por p53, lo que reduce la síntesis de poliaminas e inhibe el crecimiento tumoral.^[11] Además, CPS1 participa en la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina, proporcionando precursores esenciales de ácidos nucleicos para la proliferación de las células tumorales.^[12] AT067-H09, un inhibidor de CPS1, ha demostrado su actividad antitumoral en el cáncer de pulmón no microcítico.^[13] Múltiples estudios han demostrado que CPS1 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de recto,^[14] el colangiocarcinoma intrahepático,^[15] el glioblastoma,^[16] y el cáncer de vejiga.^[17] Esta sobreexpresión se asocia con un mal pronóstico del paciente y puede promover la proliferación tumoral. Sin embargo, el papel específico y los mecanismos de CPS1 en el desarrollo del CCR, particularmente durante la metástasis, aún deben ser investigados más a fondo.

En este estudio, se evaluó exhaustivamente el perfil de expresión de CPS1 en el CCR mediante la integración de datos multiómicos, y se examinó su asociación con las características clinicopatológicas y el pronóstico. A través del análisis de enriquecimiento funcional combinado con experimentos in vivo e in vitro, se exploró más a fondo el papel regulador de CPS1 en los fenotipos malignos del CCR y sus posibles mecanismos de señalización.

Resultados

Características de expresión del ARNm de CPS1 en el CCR y sus correlaciones clinicopatológicas en bases de datos públicas

Mediante el análisis de las bases de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), International Cancer Genome Consortium (ICGC) y Gene Expression Omnibus (GEO), se encontró que CPS1 se sobreexpresaba significativamente en el CCR (Figuras 1A-1D). El análisis de la curva ROC (Receiver Operating Characteristic) indicó que el ARNm de CPS1 tiene valor diagnóstico para el CCR, con valores de área bajo la curva (AUC) de 0,626, 0,633, 0,820 y 0,801 en cuatro cohortes independientes (Figuras S1A-S1D). El análisis de supervivencia basado en GSE72970 sugirió que la alta expresión de CPS1 se asoció con un mal pronóstico del paciente (Figura 1E). Además, la expresión de CPS1 fue mayor en los cánceres de colon derecho que en los de colon izquierdo, en los subtipos MSI-H en comparación con los subtipos MSI-L/MSS (microsatélite estable), en los adenocarcinomas mucinosos de colon en comparación con los adenocarcinomas, y en los pacientes con invasión venosa en comparación con aquellos sin ella (Figuras 1F-1I).

La relación entre la expresión de la proteína CPS1 y la progresión maligna y el pronóstico del CCR

El análisis de inmunohistoquímica (IHC) demostró que la expresión de la proteína CPS1 se sobreexpresaba significativamente en los tejidos del CCR, exhibiendo un valor diagnóstico moderado (Figuras 2A y 2B; Figura S1E). El grupo de alta expresión de CPS1 exhibió proporciones aumentadas de invasión nerviosa, brotamiento tumoral moderado a alto, metástasis en ganglios linfáticos (N1/N2) y enfermedad avanzada (etapa III/IV), lo que sugiere que CPS1 puede servir como un posible marcador para la progresión maligna del CCR (Figuras 2C-2F). El análisis de supervivencia reveló una OS más corta en los pacientes con alta expresión de CPS1 (Figura 3A). El análisis de subgrupos demostró además que CPS1 mantuvo un valor predictivo de pronóstico consistente en pacientes con diversas características clinicopatológicas (Figuras 3B-3U).

Construcción y evaluación de un modelo de pronóstico del CCR

El análisis de Cox univariado reveló que la expresión de CPS1, la edad, la estadificación tumoral-nodal-metástasis (TNM), la etapa y el brotamiento tumoral se asociaron con el pronóstico en los pacientes con CCR (Figura 4A). El análisis multivariado confirmó que CPS1 es un predictor independiente de la OS (Figura 4B). En el modelo de nomograma construido en base a estas variables, CPS1 contribuyó de manera más significativa a la predicción (Figura 4C). Las curvas de análisis de la curva de decisión (DCA) sugirieron un posible beneficio clínico neto para este modelo. El análisis ROC dependiente del tiempo indicó un rendimiento discriminatorio estable (valores de AUC de 0,896, 0,901 y 0,900 a los 1, 3 y 5 años, respectivamente) (Figuras 4D-4G); sin embargo, estos resultados deben interpretarse con precaución debido al tamaño de muestra relativamente limitado y la falta de validación externa, lo que puede introducir un riesgo de sobreajuste. Aunque las curvas de calibración indican que hay margen de mejora en la consistencia entre los resultados predichos y observados, el modelo cuantifica eficazmente las contribuciones relativas de varios factores al pronóstico (Figuras 4H-4J).

CPS1 regula el crecimiento y la proliferación de las células del CCR

En las líneas celulares DLD1, LoVo, HCT116 y SW480, los niveles de expresión de CPS1 fueron más altos que en la línea celular NCM460 (Figura 5A). Seleccionamos las líneas celulares LoVo y SW480 para los ensayos funcionales. Se validaron las eficiencias de la supresión y la sobreexpresión de CPS1 a nivel de proteína y ARNm mediante Western blot (Figuras 5B y 5C; Figura S3A) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (Figuras S4C, S4D, S5A y S5B). Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron que la supresión de CPS1 redujo significativamente el número relativo de células en comparación con el grupo de control negativo (NC) en las líneas celulares LoVo y SW480 (Figuras 5D y 5E). Los ensayos de formación de colonias confirmaron además que la supresión de CPS1 disminuyó notablemente el número de colonias en las células del CCR (Figuras 5F-5H). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 promovió significativamente la proliferación de las células del CCR, como se demostró en los ensayos CCK-8 (Figura S3B). Inoculamos células LoVo en ratones desnudos, y el monitoreo durante 4 semanas reveló que los pesos de los tumores en el grupo de supresión de CPS1 fueron significativamente menores que en el grupo NC (Figuras 5I y 5J). Nuestros hallazgos indicaron que CPS1 desempeñó un papel crucial en el mantenimiento de la capacidad proliferativa de las células del CCR.

CPS1 promueve la migración y la invasión de las células del CCR mediante la modulación de la transición epitelio-mesenquimal

Los resultados del ensayo de curación de heridas y el ensayo de translocación demostraron que la supresión de CPS1 redujo la capacidad de migración e invasión de las células LoVo y SW480 (Figuras 6A-6F). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 mejoró significativamente las capacidades de migración e invasión de las células LoVo y SW480, como se evidenció en el ensayo de curación de heridas (Figuras S3C y S3D) y el ensayo de translocación (Figuras S3E y S3F). El análisis de Western blot de los marcadores relacionados con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) reveló una reducción de ZEB1, slug, N-caderina, vimentina y MMP2, junto con un aumento de la expresión de E-caderina después de la supresión de CPS1, lo que sugiere que CPS1 puede promover la migración y la invasión de las células del CCR al regular el proceso de EMT (Figuras 6G y 6H). El análisis de qPCR en tiempo real mostró cambios consistentes a nivel de ARNm (Figuras S5A y S5B). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 exhibió los efectos opuestos tanto en la expresión de proteínas como en la expresión de ARNm de estos marcadores relacionados con la EMT (Figuras S4A-S4D).

CPS1 puede contribuir a la progresión del CCR a través de la vía de señalización de TGF-β

El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) reveló que los genes expresados diferencialmente asociados con CPS1 estuvieron involucrados principalmente en procesos biológicos, como la homeostasis del colesterol, la homeostasis del esterol y la remodelación del complejo proteína-lípido. Se localizaron en estructuras, incluyendo la membrana del borde en cepillo, la capa de moco y el lumen del retículo endoplásmico, y estuvieron involucrados en funciones moleculares, como la actividad de transporte transmembrana de iones de sodio y la actividad de transporte transmembrana de compuestos orgánicos hidroxilados (Figuras 7A y 7B). El análisis de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) indicó un enriquecimiento de estos genes en vías oncogénicas comunes, incluyendo las vías de señalización de PPAR, Wnt y TGF-β (Figura 7C). El análisis de correlación de Spearman utilizando GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn) reveló correlaciones positivas entre la expresión de CPS1 y las moléculas clave en la vía de señalización de TGF-β, incluyendo TGFB1, SMAD2 y SMAD3 (Figuras 7D-7F). Dado que la vía de señalización de TGF-β es una vía importante en el CCR,^[18] validamos aún más este hallazgo mediante Western blot. Los datos experimentales mostraron que, en comparación con el grupo de control, los niveles de expresión de las proteínas p-SMAD2 y p-SMAD3 se redujeron significativamente en el grupo de supresión de CPS1 (Figuras 7G y 7H). Estos hallazgos sugieren una posible asociación entre la expresión de CPS1 y el estado de activación de la vía de señalización de TGF-β.

El posible papel de CPS1 en la regulación de las respuestas inmunitarias antitumorales

La expresión de CPS1 se sobreexpresó en el CCR MSI-H, lo que sugiere que los pacientes con alta expresión de CPS1 pueden estar asociados con una posible respuesta a la inmunoterapia. Investigamos más a fondo el papel regulador de CPS1 en el microambiente inmunitario tumoral. Los resultados revelaron un aumento de la infiltración de células B y macrófagos activados en el grupo de alta expresión de CPS1, que se correlacionó positivamente con los niveles de infiltración de la mayoría de los tipos de células inmunitarias (Figuras 8A-8C). En particular, las células B y los macrófagos, como las células presentadoras de antígenos, son factores clave en el desencadenamiento de las respuestas inmunitarias.^[19] Además, el grupo de alta expresión de CPS1 exhibió una mayor carga de mutación tumoral (TMB), un aumento de las mutaciones somáticas y una mayor expresión de múltiples moléculas relacionadas con la inmunidad, lo que sugiere que CPS1 puede estar asociado con la inmunogenicidad tumoral y la capacidad de presentación de antígenos, lo que influye en las respuestas inmunitarias antitumorales (Figuras 8D-8F; Figura S2). Por lo tanto, CPS1 puede representar un posible objetivo para la inmunoterapia.

El análisis por inmunohistoquímica (IHQ) demostró que la expresión de la proteína CPS1 estaba significativamente aumentada en los tejidos de CCRC, exhibiendo un valor diagnóstico moderado (Figuras 2A y 2B; Figura S1E). El grupo con alta expresión de CPS1 presentó proporciones aumentadas de invasión nerviosa, diferenciación tumoral moderada a alta y metástasis en ganglios linfáticos (N1/N2), así como enfermedad avanzada (estadio III/IV), lo que sugiere que CPS1 podría servir como un posible marcador de la progresión maligna del CCRC (Figuras 2C–2F). El análisis de supervivencia reveló una menor supervivencia global (SG) en pacientes con alta expresión de CPS1 (Figura 3A). El análisis de subgrupos demostró además que CPS1 mantuvo un valor predictivo pronóstico consistente en pacientes con diversas características clinicopatológicas (Figuras 3B–3U).

Construcción y evaluación de un modelo pronóstico para CCRC

El análisis univariado de Cox reveló que la expresión de CPS1, la edad, la estadificación tumoral (TNM), el estadio y la diferenciación tumoral se asociaron con el pronóstico en pacientes con CCRC (Figura 4A). El análisis multivariado confirmó que CPS1 es un predictor independiente de la SG (Figura 4B). En el modelo de nomograma construido basándose en estas variables, CPS1 contribuyó de manera más significativa a la predicción (Figura 4C). Las curvas del análisis de la curva de decisión (ACD) sugirieron un posible beneficio clínico neto para este modelo. El análisis ROC dependiente del tiempo indicó un rendimiento discriminatorio estable (valores AUC de 0,896, 0,901 y 0,900 a los 1, 3 y 5 años, respectivamente) (Figuras 4D–4G); sin embargo, estos resultados deben interpretarse con cautela debido al tamaño de la muestra relativamente limitado y la falta de validación externa, lo que puede introducir un riesgo de sobreajuste. Aunque las curvas de calibración indican que hay margen de mejora en la consistencia entre los resultados predichos y observados, el modelo cuantifica eficazmente las contribuciones relativas de varios factores al pronóstico (Figuras 4H–4J).

CPS1 regula el crecimiento y la proliferación de las células de CCRC

En las líneas celulares DLD1, LoVo, HCT116 y SW480, los niveles de expresión de CPS1 fueron más altos que en la línea celular NCM460 (Figura 5A). Seleccionamos las líneas celulares LoVo y SW480 para los ensayos funcionales. La eficiencia de la inhibición y la sobreexpresión de CPS1 se validó tanto a nivel de proteína como de ARNm mediante Western blot (Figuras 5B y 5C; Figura S3A) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR en tiempo real) (Figuras S4C, S4D, S5A y S5B). Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron que la inhibición de CPS1 redujo significativamente el número relativo de células en comparación con el grupo de control negativo (NC) en las líneas celulares LoVo y SW480 (Figuras 5D y 5E). Los ensayos de formación de colonias confirmaron además que la inhibición de CPS1 disminuyó notablemente el número de colonias en las células de CCRC (Figuras 5F–5H). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 promovió significativamente la proliferación de las células de CCRC, como se demostró en los ensayos CCK-8 (Figura S3B). Inoculamos células LoVo en ratones desnudos, y el seguimiento durante 4 semanas reveló que los pesos tumorales en el grupo con inhibición de CPS1 fueron significativamente menores que en el grupo NC (Figuras 5I y 5J). Nuestros hallazgos indicaron que CPS1 desempeñó un papel crucial en el mantenimiento de la capacidad proliferativa de las células de CCRC.

CPS1 promueve la migración y la invasión de las células de CCRC mediante la modulación de la transición epitelio-mesenquimal

Los resultados del ensayo de curación de heridas y el ensayo de Transwell demostraron que la inhibición de CPS1 redujo la capacidad de migración e invasión de las células LoVo y SW480 (Figuras 6A–6F). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 mejoró significativamente las capacidades de migración e invasión de las células LoVo y SW480, como se evidenció en el ensayo de curación de heridas (Figuras S3C y S3D) y el ensayo de Transwell (Figuras S3E y S3F). El análisis de Western blot de los marcadores relacionados con la transición epitelio-mesenquimal (TEM) reveló una disminución de ZEB1, slug, N-caderina, vimentina y MMP2, junto con un aumento de la expresión de E-caderina después de la inhibición de CPS1, lo que sugiere que CPS1 puede promover la migración y la invasión de las células de CCRC al regular el proceso de TEM (Figuras 6G y 6H). El análisis de qPCR en tiempo real mostró cambios consistentes a nivel de ARNm (Figuras S5A y S5B). Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 exhibió los efectos opuestos sobre la expresión de proteínas y ARNm de estos marcadores relacionados con la TEM (Figuras S4A–S4D).

CPS1 puede contribuir a la progresión del CCRC a través de la vía de señalización TGF-β

El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) reveló que los genes expresados diferencialmente asociados con CPS1 estaban implicados principalmente en procesos biológicos, como la homeostasis del colesterol, la homeostasis de los esteroles y la remodelación de los complejos proteína-lípido. Se localizaron en estructuras, incluidas la membrana del borde en cepillo, la capa de moco y el lumen del retículo endoplásmico, y participaron en funciones moleculares, como la actividad de transporte transmembrana de iones de sodio y la actividad de transporte transmembrana de compuestos orgánicos hidroxilados (Figuras 7A y 7B). El análisis de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) indicó el enriquecimiento de estos genes en vías oncogénicas comunes, incluidas las vías de señalización PPAR, Wnt y TGF-β (Figura 7C). El análisis de correlación de Spearman utilizando GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn) reveló correlaciones positivas entre la expresión de CPS1 y las moléculas clave de la vía de señalización TGF-β, incluidos TGFB1, SMAD2 y SMAD3 (Figuras 7D–7F). Dado que la vía de señalización TGF-β es una vía importante en el CCRC,^[18] validamos aún más este hallazgo mediante Western blot. Los datos experimentales mostraron que, en comparación con el grupo de control, los niveles de expresión de las proteínas p-SMAD2 y p-SMAD3 se redujeron significativamente en el grupo con inhibición de CPS1 (Figuras 7G y 7H). Estos hallazgos sugieren una posible asociación entre la expresión de CPS1 y el estado de activación de la vía de señalización TGF-β.

El posible papel de CPS1 en la regulación de las respuestas inmunitarias antitumorales

La expresión de CPS1 se incrementó en el CCRC MSI-H, lo que sugiere que los pacientes con alta expresión de CPS1 pueden estar asociados con una posible respuesta a la inmunoterapia. Investigamos más a fondo el papel regulador de CPS1 en el microambiente inmunitario tumoral. Los resultados revelaron un aumento de la infiltración de células B y macrófagos activados en el grupo con alta expresión de CPS1, que se correlacionó positivamente con los niveles de infiltración de la mayoría de los tipos de células inmunitarias (Figuras 8A–8C). En particular, las células B y los macrófagos, como células presentadoras de antígenos, son factores clave en el desencadenamiento de las respuestas inmunitarias.^[19] Además, el grupo con alta expresión de CPS1 exhibió una mayor carga de mutación tumoral (CMT), un aumento de las mutaciones somáticas y una mayor expresión de múltiples moléculas relacionadas con la inmunidad, lo que sugiere que CPS1 puede estar asociado con la inmunogenicidad tumoral y la capacidad de presentación de antígenos, lo que influye en las respuestas inmunitarias antitumorales (Figuras 8D–8F; Figura S2). Por lo tanto, CPS1 puede representar un posible objetivo para la inmunoterapia.

Discusión

CPS1 es una enzima mitocondrial implicada en la biosíntesis de pirimidinas y también regula el ciclo de la urea. En los últimos años, el papel de CPS1 en varios cánceres se ha revelado gradualmente. Además de promover la proliferación tumoral, CPS1 también puede estar implicado en la metástasis tumoral, la resistencia a la quimioterapia y la radiosensibilidad.^[20],^[21],^[22],^[23] Torang et al. informaron que CPS1 era un marcador metabólico clave y un objetivo terapéutico en el subtipo molecular consenso 3 del CCRC, y que su inhibición promovió la diferenciación de tipo enterocitario.^[24] Además, la progresión de la colitis ulcerosa a cáncer se acompañó con frecuencia de cambios en la expresión de CPS1.^[25] Interesantemente, la metformina puede reducir la expresión de las enzimas del ciclo de la urea, como CPS1, al activar AMPK/p53, lo que en última instancia inhibe el crecimiento de las células de CCRC.^[26] Estos estudios sugirieron que CPS1 probablemente desempeñó un papel importante en la iniciación y la progresión del CCRC, aunque su función y mecanismos precisos siguen sin estar claros.

Al analizar los datos de transcriptómica de las bases de datos públicas, encontramos la desregulación de CPS1 a nivel de ARNm. Validamos además los cambios en los niveles de proteína de CPS1 mediante IHQ. Nuestros hallazgos se alinean con informes previos de sobreexpresión de CPS1 en el cáncer de colon y la mayoría de las demás neoplasias.^[14],^[15],^[16],^[17],^[27] Sin embargo, en el carcinoma hepatocelular, se informó que la expresión de CPS1 se redujo en comparación con el tejido hepático normal adyacente y se asoció con la metástasis tumoral y la resistencia a la quimioterapia,^[20],^[21], lo que puede reflejar su papel específico del hígado como enzima clave en el ciclo de la urea. Además, en nuestro estudio, la expresión de CPS1 fue significativamente mayor en los cánceres de colon derecho en comparación con los cánceres de colon izquierdo y también se enriqueció en los tumores MSI-H. Estos hallazgos son consistentes con la conocida heterogeneidad biológica entre los cánceres de colon derecho e izquierdo. Estudios previos han demostrado que los cánceres de colon derecho e izquierdo difieren en sus perfiles moleculares, alteraciones genéticas y características metabólicas.^[28],^[29],^[30],^[31] En particular, los cánceres de colon derecho están más frecuentemente asociados con el estado MSI-H y el enriquecimiento del subtipo metabólico. Dado que CPS1 es una enzima clave implicada en el metabolismo del amoníaco y la biosíntesis de pirimidinas, el aumento de la expresión de CPS1 observado en los cánceres de colon derecho puede reflejar la heterogeneidad metabólica entre los tumores que surgen en diferentes ubicaciones anatómicas del colon. En particular, estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de CPS1 en el CCRC puede reflejar un papel biológico dependiente del contexto, moldeado por las características metabólicas y moleculares específicas del tumor, lo que distingue su relevancia funcional en el CCRC de los patrones heterogéneos observados en otras neoplasias.

El análisis de supervivencia reveló que la alta expresión de CPS1 se asoció con una peor SG y se correlacionó significativamente con los fenotipos malignos, como la invasión venosa, la invasión nerviosa, la diferenciación tumoral de alto grado, la etapa N avanzada y la clasificación del estadio. Estos hallazgos sugirieron que CPS1 puede participar en la progresión maligna del CCRC. Para investigar exhaustivamente las funciones biológicas de CPS1 en el CCRC, realizamos experimentos de pérdida de función y ganancia de función en las células LoVo y SW480. Los ensayos CCK-8 y la formación de colonias demostraron que la inhibición de CPS1 suprimió la proliferación, mientras que la sobreexpresión de CPS1 exhibió el efecto opuesto, mejorando significativamente la proliferación celular. Los experimentos de tumorigénesis in vivo validaron aún más el papel de CPS1 en el mantenimiento de la proliferación de las células de CCRC. Los ensayos de curación de heridas y Transwell revelaron que su inhibición debilitó las capacidades de migración e invasión, mientras que la sobreexpresión de CPS1 mejoró significativamente estas capacidades. Estos resultados bidireccionales proporcionan evidencia que respalda un posible papel pro-tumorigénico de CPS1 en el CCRC, destacando su participación no solo en la proliferación tumoral, sino también en la migración, la invasión y los procesos relacionados con la TEM, lo que extiende su papel funcional más allá de la proliferación en comparación con lo que se informó en otras neoplasias.

Los estudios existentes se han centrado principalmente en cómo CPS1 promueve la proliferación tumoral mediante la regulación de la síntesis de poliaminas y pirimidinas,^[11],^[24], pero su mecanismo de acción en la migración e invasión del CRC aún no está claro. Dado que la EMT es un paso clave para que las células cancerosas adquieran la capacidad de migrar e invadir,^[32], especulamos que el efecto de CPS1 en el CRC está asociado con la regulación del proceso de EMT. Los resultados de Western blot revelaron que la inhibición de CPS1 aumentó la expresión del marcador epitelial E-caderina, al tiempo que disminuyó la expresión de los marcadores mesenquimales (N-caderina y vimentina) y los principales factores de transcripción de la EMT (ZEB1 y slug). Concurrentemente, la expresión de MMP2 disminuyó, lo que sugiere una alteración en la progresión de la EMT. Por el contrario, la sobreexpresión de CPS1 aumentó la expresión de los marcadores mesenquimales (ZEB1, slug, N-caderina, vimentina y MMP2) y redujo la de E-caderina, lo que confirma aún más que CPS1 puede regular la EMT en las células de CRC. La EMT es un proceso biológico crucial que permite a las células epiteliales adquirir capacidad migratoria.^[33] La E-caderina mantiene las uniones celulares, y su pérdida a menudo está mediada por factores de transcripción como ZEB1/slug.^[34],^[35] La regulación al alza de los marcadores mesenquimales y el aumento de la expresión de MMP2 facilitan la degradación de la matriz extracelular y promueven la metástasis.^[36],^[37] Este estudio sugirió que CPS1 puede influir en los niveles de los marcadores relacionados con la EMT y MMP2 mediante la regulación de ZEB1 y slug, alterando así las capacidades de migración e invasión celular.

Nuestro estudio actual indicó que CPS1 puede estar involucrado en la iniciación y progresión del CRC, posiblemente a través de la regulación de la vía de señalización TGF-β, proporcionando información mecanicista sobre su papel en la regulación de la EMT y la progresión tumoral específica del CRC más allá de sus funciones generales reportadas en otros cánceres. De hecho, la vía de señalización TGF-β ejerce efectos reguladores multifacéticos sobre el crecimiento y la diferenciación celular, y se ha relacionado con el desarrollo del CRC.^[18] Esta vía se inicia principalmente por el ligando TGF-β, siendo TGF-β1 la forma más estudiada hasta la fecha.^[38] TGF-β1 existe en una forma latente y requiere activación para unirse a su receptor, iniciando así la señalización descendente.^[39] En la vía de señalización TGF-β canónica, la unión de TGF-β1 al complejo del receptor TGF-β recluta y fosforila el receptor TGF-β tipo I (TβRI).^[40] SMAD2 y SMAD3 son fosforilados en los residuos de serina C-terminales por TβRI, formando p-SMAD2 y p-SMAD3. Posteriormente, p-SMAD2 y p-SMAD3 se unen a SMAD4 para formar un complejo, que se transloca al núcleo para regular la transcripción de una serie de genes diana.^[41],^[42],^[43] En las etapas tempranas del tumor, la vía TGF-β ejerce efectos supresores de tumores al inducir la detención del ciclo celular y promover la apoptosis. Sin embargo, en los tumores avanzados, esta vía sufre una reprogramación funcional, promoviendo la invasión tumoral y la metástasis mediante la regulación de la EMT.^[44],^[45],^[46] TGF-β promueve principalmente la EMT al activar TβRI y promueve la transcripción de los factores de transcripción de la EMT, como Snail1, slug y ZEB1 a través de Smad3/4. Estos factores de transcripción, a su vez, cooperan con el complejo Smad3/4 para inhibir la transcripción de los genes epiteliales y activar la transcripción de los genes mesenquimales,^[47] mejorando así la capacidad de migración e invasión de las células tumorales.

En resumen, nuestro estudio actual mostró que la expresión de CPS1 estaba significativamente aumentada en el CRC. CPS1 puede estar involucrado en la regulación de la vía de señalización TGF-β y el proceso de EMT, contribuyendo así a la progresión del CRC (Figura 9).

Limitaciones del estudio

Aunque los datos multiómicos y la validación experimental han revelado preliminarmente el efecto carcinogénico de CPS1 en el CRC, este estudio tiene ciertas limitaciones. El CRC es biológicamente heterogéneo, incluyendo cánceres de colon y recto, así como tumores de lados izquierdo y derecho. Si bien observamos asociaciones significativas entre la expresión de CPS1 y la progresión del CRC, no se realizaron análisis estratificados entre estos subtipos, lo que deja poco claras las posibles funciones diferenciales de CPS1. Además, aunque la expresión de CPS1 fue mayor en los tumores MSI-H según los conjuntos de datos públicos, no se observaron diferencias notables relacionadas con el subtipo en nuestros experimentos in vitro, lo que puede deberse al número limitado de modelos celulares. El número limitado de muestras clínicas limitó la potencia estadística para el análisis de subgrupos (por ejemplo, edad, estadio TNM y estado de MMR). Debido a la información incompleta sobre el tratamiento postoperatorio, no se pudo excluir por completo la posible influencia de los factores relacionados con el tratamiento en el pronóstico. Además, no se realizó el emparejamiento del puntaje de propensión (PSM) debido al tamaño de muestra limitado y a las variables clínicas incompletas. En cuanto a los mecanismos, si bien se encontró que CPS1 estaba asociado con la vía TGF-β y la EMT, las relaciones causales aún no se han validado directamente a través de experimentos específicos de la vía. Además, aunque el inhibidor de CPS1 AT067-H09 ha demostrado actividad antitumoral en otros tipos de cáncer, su potencial terapéutico en el CRC aún no está claro. Se necesitan estudios futuros para investigar más a fondo el papel mecanicista y el valor terapéutico de CPS1 en el CRC.

Limitaciones del estudio

Aunque los datos multiómicos y la validación experimental han revelado preliminarmente el efecto carcinogénico de CPS1 en el CRC, este estudio tiene ciertas limitaciones. El CRC es biológicamente heterogéneo, incluyendo cánceres de colon y recto, así como tumores de lados izquierdo y derecho. Si bien observamos asociaciones significativas entre la expresión de CPS1 y la progresión del CRC, no se realizaron análisis estratificados entre estos subtipos, lo que deja poco claras las posibles funciones diferenciales de CPS1. Además, aunque la expresión de CPS1 fue mayor en los tumores MSI-H según los conjuntos de datos públicos, no se observaron diferencias notables relacionadas con el subtipo en nuestros experimentos in vitro, lo que puede deberse al número limitado de modelos celulares. El número limitado de muestras clínicas limitó la potencia estadística para el análisis de subgrupos (por ejemplo, edad, estadio TNM y estado de MMR). Debido a la información incompleta sobre el tratamiento postoperatorio, no se pudo excluir por completo la posible influencia de los factores relacionados con el tratamiento en el pronóstico. Además, no se realizó el emparejamiento del puntaje de propensión (PSM) debido al tamaño de muestra limitado y a las variables clínicas incompletas. En cuanto a los mecanismos, si bien se encontró que CPS1 estaba asociado con la vía TGF-β y la EMT, las relaciones causales aún no se han validado directamente a través de experimentos específicos de la vía. Además, aunque el inhibidor de CPS1 AT067-H09 ha demostrado actividad antitumoral en otros tipos de cáncer, su potencial terapéutico en el CRC aún no está claro. Se necesitan estudios futuros para investigar más a fondo el papel mecanicista y el valor terapéutico de CPS1 en el CRC.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, se debe contactar al investigador principal, Qi Zeng (zengqi@sr.gxmu.edu.cn), quien se encargará de satisfacer dichas solicitudes.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Todos los datos presentados en este artículo se compartirán con el investigador principal a solicitud.
•Todos los conjuntos de datos disponibles públicamente analizados en este estudio, incluidos TCGA-COAD, ICGC-CRC y los conjuntos de datos GEO (GSE24551-GPL5175, GSE71187 y GSE72970), se describen en la sección de Métodos STAR y se pueden acceder desde sus respectivos repositorios de origen según se indica allí.
•El código original generado para este estudio se ha depositado en Zenodo y está disponible públicamente bajo la licencia MIT (https://doi.org/10.5281/zenodo.17305334).
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible a través del investigador principal a solicitud.

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, se debe contactar al investigador principal, Qi Zeng (zengqi@sr.gxmu.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Todos los datos presentados en este artículo se compartirán con el investigador principal a solicitud.
•Todos los conjuntos de datos disponibles públicamente analizados en este estudio, incluidos TCGA-COAD, ICGC-CRC y los conjuntos de datos GEO (GSE24551-GPL5175, GSE71187 y GSE72970), se describen en la sección de Métodos STAR y se pueden acceder desde sus respectivos repositorios de origen según se indica allí.
•El código original generado para este estudio se ha depositado en Zenodo y está disponible públicamente bajo la licencia MIT (https://doi.org/10.5281/zenodo.17305334).
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible a través del investigador principal a solicitud.

Agradecimientos

La financiación para esta investigación fue proporcionada por el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Guangxi (AB23026079), el Proyecto Conjunto sobre la Investigación de Enfermedades Regionales de Alta Incidencia de la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (2024GXNSFBA010303), así como el Programa de Capacitación en Innovación para Estudiantes de Pregrado (S20241057).

Contribuciones de los autores

Conceptualización, Y.C., T.L., W.L. y Q.Z.; metodología, J.C., Y.C., Y.W., J.W. y Y.Y.; investigación, N.Q., J.C., Y.C., Y.W., J.W. y Y.L.; curación de datos, N.Q., J.C., S.Z., S.L., T.L. y Q.Z.; análisis formal, N.Q. y S.L.; software, S.Z. y Y.L.; validación, J.C., S.Z., J.W. y Y.Y.; visualización, Y.W., S.L. y Y.Y.; recursos, Y.L.; redacción del borrador original, N.Q., J.C. y Y.C.; revisión y edición, W.L. y Q.Z.; supervisión, T.L. y Q.Z.; adquisición de financiación, W.L.; administración del proyecto, W.L.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Animales

Se utilizaron ratones hembra BALB/c de cuatro a seis semanas de edad, obtenidos del Centro de Investigación Animal de la Universidad Médica de Guangxi, como sujetos experimentales. Los ratones se alojaron en condiciones ambientales controladas a 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y tuvieron acceso libre a alimentos y agua. El modelo se realizó mediante inyección subcutánea de células de CRC transfectadas de forma estable (2 × 106/100 μL de PBS). Los animales fueron sacrificados después de 4 semanas, y los tumores fueron extirpados y pesados. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (Número de aprobación: KY20251003).

Participantes humanos

Nuestro estudio siguió estrictamente los principios de la Declaración de Helsinki. Se recolectaron prospectivamente tejidos tumorales de 165 pacientes adultos con CRC confirmados por patología y 81 tejidos normales emparejados adyacentes al cáncer del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi. Todos los pacientes incluidos en este estudio no habían recibido quimioterapia ni radioterapia antes de la resección quirúrgica. Las siguientes características clinicopatológicas se extrajeron del sistema de registros médicos electrónicos del hospital: sexo (101 hombres y 64 mujeres), edad, tamaño del tumor, émbolos cancerosos, invasión nerviosa, estadificación TNM (8ª edición de la AJCC), estadio, estado de MMR y grado de brotamiento tumoral. Los datos de supervivencia de todos los pacientes se obtuvieron mediante revisión ambulatoria y seguimiento telefónico. La aprobación del protocolo de investigación por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (Número de aprobación: KY2025997). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. No se observó una asociación significativa entre el sexo y los resultados del estudio.

Líneas celulares

Nuestro estudio utilizó cuatro líneas celulares representativas de CRC humano (DLD1, LoVo, HCT116 y SW480) y la línea celular epitelial colónica normal NCM460 como modelos experimentales. DLD1 (N.º de catálogo CCL-221), LoVo (N.º de catálogo CCL-229), HCT116 (N.º de catálogo CCL-247) y SW480 (N.º de catálogo CCL-228) se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares Estadounidense (ATCC). Las células NCM460 se obtuvieron de INCELL Corporation. En este estudio se utilizaron líneas celulares masculinas. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) en condiciones de humedad, a 37 °C y con un 5% de CO2, y los cultivos se realizaron cada 2-3 días. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se recogieron para los experimentos posteriores. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasma antes de su uso en este estudio.

Los lentivirus de silenciamiento (N.º P68970 y P69136) y de sobreexpresión (N.º P86794) de CPS1 (plásmido Miaoling) se transfectaron en las células de CRC correspondientes según las instrucciones del fabricante, utilizando un vector vacío como control negativo (NC). La eficiencia de la transfección se verificó mediante qRT-PCR y Western blot.

Detalles del método

Tinción por inmunohistoquímica (IHQ)

La IHQ se utilizó para detectar la expresión de la proteína CPS1 en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina. Las secciones de tejido (3 μm) se desparafinaron y se rehidrataron, se bloquearon a temperatura ambiente y luego se incubaron con el anticuerpo primario contra CPS1 (1:200; A24810, ABclonal) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS durante 3 veces (5 minutos cada vez), las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (RK50015, ABclonal) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la tinción con DAB y la contratinción de hematoxilina de los núcleos. La tinción por IHQ fue evaluada de forma independiente por dos patólogos sénior en un estudio doble ciego. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (negativa), 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (fuerte). La proporción de células positivas se clasificó como 0 (80%). Se calculó una puntuación general multiplicando las puntuaciones de intensidad y proporción. Para cada caso, se evaluaron diez campos representativos, y la puntuación final se definió como el valor medio. Las discrepancias se resolvieron por consenso.

Western blot

Para extraer la proteína total, las células se lisaron utilizando el tampón de lisis NP-40 (P0013F, Beyotime). Se determinó la concentración de proteína y se cargaron cantidades iguales de proteína (50 μg por carril) y se separaron mediante SDS-PAGE al 7,5%. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF utilizando un sistema de transferencia en húmedo (300 mA, 90 min). Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía un 5% de leche descremada durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos incluyeron: CPS1 (1:200; A24810, ABclonal), ZEB1 (1:1000; A5600, ABclonal), Slug (1:1000; A13352, ABclonal), E-caderina (1:1000; A20798, ABclonal), N-caderina (1:1000; A3045, ABclonal), Vimentina (1:1000; A19607, ABclonal), MMP2 (1:1000; A19080, ABclonal), TGFB1 (1:1000; A25313, ABclonal), SMAD2 (1:1000; A19114, ABclonal), p-SMAD2 (1:1000; AP1342, ABclonal), SMAD3 (1:1000; A16913, ABclonal), p-SMAD3 (1:1000; AP0727, ABclonal) y GAPDH (1:10000; A19056, ABclonal). Después del lavado, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario anti-IgG de cabra conjugado con HRP (H + L) (AS014, ABclonal) a temperatura ambiente durante 2 horas. La detección se realizó utilizando un kit ECL (BMU102, Abbkine), y GAPDH se utilizó como control interno.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células cultivadas utilizando el reactivo TRIzol (15596018CN, Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó midiendo la relación OD260/OD230 con un espectrofotómetro de microvolumen y evaluando la integridad de las bandas de ARNr 28 S y 18 S mediante electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de ARN que cumplieron con los requisitos de calidad se transcribieron a ADNc utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT con gDNA Eraser (RK20433, ABclonal). Se realizó RT-qPCR utilizando el kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (RK21204, ABclonal) para medir los niveles de expresión de ARNm. GAPDH se utilizó como control interno. Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla de recursos clave.

Ensayo CCK-8

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103/pocillo y se cultivaron durante la noche. Se añadieron 10 μL del reactivo CCK-8 a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Para evaluar el número relativo de células, se midió el valor de absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas cada 24 horas. Se eligió el intervalo de 24 horas para capturar cambios estables en el crecimiento celular a lo largo del tiempo, al tiempo que se minimiza la variabilidad asociada con mediciones más frecuentes.

Ensayo de formación de colonias

Las placas de 6 pocillos se sembraron con 800 células/pocillo y se incubaron hasta que las células alcanzaron la densidad adecuada. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído (G1101, Servicebio) durante 20 minutos y se tiñeron con un 0,1% de cristal violeta durante 30 minutos. Finalmente, se contaron y analizaron las colonias que contenían más de 50 células.

Ensayo de curación de heridas

Se inocularon 1 × 106 células en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante la noche para permitir que las células se adhirieran completamente a la pared. Después de que las células formaron una monocapa, se realizó un rasguño recto en la superficie de la capa celular con una punta de pipeta estéril de 10 μL. El área del rasguño se fotografió a las 0 h y a las 24 h, y se calculó la tasa de migración celular.

Ensayo Transwell

Para detectar el potencial de invasión de las células de CRC, se utilizó la cámara Transwell recubierta con Matrigel. Después de la recolección, la suspensión celular se resuspendió en 200 μL de medio libre de FBS y se sembró en la cámara superior del Transwell. A continuación, la cámara inferior se llenó con 700 μL de medio completo que contenía un 10% de FBS. Después de la incubación en una incubadora a 37 °C durante 24 horas, las células no invasivas en la cámara superior se eliminaron cuidadosamente. Las células invasivas fijadas con metanol que atravesaron la membrana basal se tiñeron con un 0,1% de cristal violeta. A continuación, se contaron las células invasivas en campos microscópicos seleccionados al azar.

Cuantificación y análisis estadístico

Recopilación y procesamiento de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq)

En este estudio, se integraron múltiples conjuntos de datos de secuenciación de ARN de CRC y datos clínicos correspondientes para analizar de forma integral el patrón de expresión de CPS1. Para garantizar la calidad de los datos, utilizamos el análisis de componentes principales para identificar y eliminar las muestras atípicas, y se filtraron los genes con niveles de expresión inferiores a 10 en más del 75% de las muestras. Finalmente, se obtuvieron 475 muestras de CRC y 41 muestras normales de la base de datos TCGA (https://www.cancer.gov/tcga) y 586 muestras de CRC y 44 muestras normales de la base de datos ICGC (https://dcc.icgc.org/). Además, se complementaron dos conjuntos de datos de validación independientes (GSE24551-GPL5175 y GSE71187) de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Todos los datos de secuenciación de ARN se transformaron en log2 para el análisis posterior.

Análisis de supervivencia y modelado pronóstico

La cohorte GSE72970 se dividió en grupos de alta y baja expresión según la mediana de la expresión de ARNm de CPS1. Se dibujó la curva de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando el paquete R "survival" (v3.7.0), y se utilizó la prueba de rango logarítmico para evaluar la diferencia entre los grupos. Los pacientes de nuestra cohorte se agruparon en función de la puntuación de IHQ (>4 se consideró alta expresión) y se comparó la supervivencia global (OS). Para evaluar de forma integral el valor pronóstico de CPS1, se realizó un análisis de subgrupos. Se utilizó la regresión de Cox univariante para identificar las variables asociadas significativamente con el pronóstico, y luego se utilizó la regresión de Cox multivariante para verificar el valor de CPS1 como un factor pronóstico independiente, y se construyó un nomograma utilizando el paquete R "rms" (v6.9.0).

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

Las muestras de TCGA-CRC se agruparon en función de los niveles de expresión de CPS1 medianos. Los recuentos brutos se normalizaron y se identificaron los genes expresados diferencialmente utilizando el paquete R "DESeq2" (v1.46.0). Se seleccionaron los genes como expresados diferencialmente si |log2FoldChange| > 1 y p < 0,05. Se realizó un análisis de GO y de la vía KEGG utilizando el paquete R "clusterProfiler" (v4.14.6) para revelar las posibles funciones biológicas y las redes reguladoras de CPS1 en CRC.

Análisis de infiltración inmune

Se utilizó el paquete R "GSVA" (v2.0.5) para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) con el fin de comparar la diferencia en las puntuaciones de infiltración de células inmunitarias entre los grupos de alta y baja expresión de CPS1. Las firmas genéticas de 28 linfocitos infiltrantes tumorales se obtuvieron de la base de datos TISIDB (http://cis.hku.hk/TISIDB).^[48] Se utilizó el paquete R "linkET" (v0.0.7.4) para analizar la correlación entre CPS1 y las células inmunitarias. Además, se utilizaron siete algoritmos, incluidos xCell, TIMER, quanTIseq, EPIC, Consensus TME, CIBERSORT y ABIS, para verificar la correlación. Dado que la carga mutacional tumoral (TMB) y la tasa de mutación somática están estrechamente relacionadas con la respuesta inmune antitumoral,^[49] utilizamos el paquete R "TCGAmutations" (v0.4.0) para calcular la TMB y el espectro de mutaciones somáticas.

Análisis estadístico

En nuestro estudio, se utilizó la prueba de rango de Wilcoxon, la prueba t de Student no pareada, el análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías para comparar las diferencias entre los grupos. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para analizar la correlación entre el nivel de expresión de CPS1 y las características clinicopatológicas. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó mediante la prueba de rango logarítmico para evaluar las diferencias entre los grupos. Se utilizó el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para calcular la razón de riesgos (HR) y su intervalo de confianza del 95%. La correlación entre las variables se cuantificó mediante el análisis de correlación de Spearman. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente, y los datos cuantitativos se presentaron como media ± DE. El análisis estadístico se realizó utilizando el software R (v4.4.2) y GraphPad Prism (v8.0.2), y se consideró que p < 0,05 era significativo. Los umbrales de significación estadística se establecieron en ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001; ns, no significativo. Los métodos estadísticos utilizados para cada análisis se describen en las leyendas de las figuras correspondientes.

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Animales

Se utilizaron ratones nudosos hembra BALB/c de cuatro a seis semanas de edad obtenidos del Centro de Investigación Animal de la Universidad Médica de Guangxi como sujetos experimentales. Los ratones se alojaron en condiciones ambientales controladas a 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y tenían acceso libre a alimentos y agua. Se realizó la modelización mediante la inyección subcutánea de células de CRC transfectadas de forma estable (2 × 106/100 μL de PBS). Los animales fueron sacrificados después de 4 semanas, y los tumores fueron extirpados y pesados. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (N.º de aprobación KY20251003).

Participantes humanos

Nuestro estudio siguió estrictamente los principios de la Declaración de Helsinki. Se recogieron prospectivamente tejidos tumorales de 165 pacientes adultos con CRC confirmados por patología y 81 tejidos normales adyacentes al cáncer del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi. Todos los pacientes incluidos en este estudio no habían recibido quimioterapia ni radioterapia antes de la resección quirúrgica. Se extrajeron las siguientes características clinicopatológicas del sistema de registros médicos electrónicos del hospital: sexo (101 hombres y 64 mujeres), edad, tamaño del tumor, émbolos cancerosos, invasión nerviosa, estadificación TNM (8.ª edición de la AJCC), etapa, estado de MMR y grado de brotamiento tumoral. Los datos de supervivencia de todos los pacientes se obtuvieron mediante revisiones ambulatorias y seguimientos telefónicos. La aprobación del protocolo de investigación por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (N.º de aprobación KY2025997). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. No se observó una asociación significativa entre el sexo y los resultados del estudio.

Líneas celulares

Nuestro estudio utilizó cuatro líneas celulares humanas representativas de CCRC (DLD1, LoVo, HCT116 y SW480) y la línea celular normal de epitelio colónico NCM460 como modelos experimentales. DLD1 (Cat# CCL-221), LoVo (Cat# CCL-229), HCT116 (Cat# CCL-247) y SW480 (Cat# CCL-228) se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Las células NCM460 se obtuvieron de INCELL Corporation. En este estudio se utilizaron líneas celulares masculinas. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) en condiciones de humedad a 37 °C y 5% de CO2, y los cultivos se realizaron cada 2-3 días. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se recogieron para los experimentos posteriores. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasma antes de su uso en este estudio.

Los lentivirus de silenciamiento (No. P68970 y P69136) y sobreexpresión (No. P86794) de CPS1 (plásmido Miaoling) se transfectaron en las células de CCRC correspondientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un vector vacío como control negativo (NC). La eficiencia de la transfección se verificó mediante qRT-PCR y Western blot.

Animales

Se utilizaron ratones BALB/c nudosos hembra de entre cuatro y seis semanas de edad, obtenidos del Centro de Investigación Animal de la Universidad Médica de Guangxi, como sujetos experimentales. Los ratones se alojaron en condiciones ambientales controladas a 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y tuvieron acceso libre a alimentos y agua. La formación del modelo se realizó mediante inyección subcutánea de células de CCRC transfectadas de forma estable (2 × 106/100 μL de PBS). Los animales fueron sacrificados después de 4 semanas, y los tumores se extirparon y se pesaron. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (Número de aprobación: KY20251003).

Participantes humanos

Nuestro estudio siguió estrictamente los principios de la Declaración de Helsinki. Se recogieron de forma prospectiva tejidos tumorales de 165 pacientes adultos con CCRC confirmados por patología y 81 tejidos normales emparejados adyacentes al cáncer del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi. Todos los pacientes incluidos en este estudio no habían recibido quimioterapia ni radioterapia antes de la resección quirúrgica. Las siguientes características clinicopatológicas se extrajeron del sistema de registros médicos electrónicos del hospital: sexo (101 hombres y 64 mujeres), edad, tamaño del tumor, émbolos cancerosos, invasión nerviosa, estadificación TNM (AJCC 8ª edición), estadio, estado de MMR y grado de brotación tumoral. Los datos de supervivencia de todos los pacientes se obtuvieron mediante revisiones ambulatorias y seguimiento telefónico. La aprobación del protocolo de investigación por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (Número de aprobación: KY2025997). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. No se observó una asociación significativa entre el sexo y los resultados del estudio.

Líneas celulares

Nuestro estudio utilizó cuatro líneas celulares humanas representativas de CCRC (DLD1, LoVo, HCT116 y SW480) y la línea celular normal de epitelio colónico NCM460 como modelos experimentales. DLD1 (Cat# CCL-221), LoVo (Cat# CCL-229), HCT116 (Cat# CCL-247) y SW480 (Cat# CCL-228) se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Las células NCM460 se obtuvieron de INCELL Corporation. En este estudio se utilizaron líneas celulares masculinas. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) en condiciones de humedad a 37 °C y 5% de CO2, y los cultivos se realizaron cada 2-3 días. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se recogieron para los experimentos posteriores. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado STR y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasma antes de su uso en este estudio.

Los lentivirus de silenciamiento (No. P68970 y P69136) y sobreexpresión (No. P86794) de CPS1 (plásmido Miaoling) se transfectaron en las células de CCRC correspondientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un vector vacío como control negativo (NC). La eficiencia de la transfección se verificó mediante qRT-PCR y Western blot.

Detalles del método

Tinción con inmunohistoquímica (IHC)

La IHC se utilizó para detectar la expresión de la proteína CPS1 en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. Las secciones de tejido (3 μm) se desparafinaron y se rehidrataron, se bloquearon a temperatura ambiente y luego se incubaron con el anticuerpo primario contra CPS1 (1:200; A24810, ABclonal) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS durante 3 veces (5 minutos cada vez), las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (RK50015, ABclonal) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la tinción con DAB y la contratinción de hematoxilina de los núcleos. La tinción con IHC fue evaluada de forma independiente por dos patólogos sénior en un estudio doble ciego. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (negativa), 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (fuerte). La proporción de células positivas se clasificó como 0 (80%). Se calculó una puntuación general multiplicando las puntuaciones de intensidad y proporción. Para cada caso, se evaluaron diez campos representativos, y la puntuación final se definió como el valor medio. Las discrepancias se resolvieron por consenso.

Western blot

Para extraer la proteína total, las células se lisaron utilizando un tampón de lisis NP-40 (P0013F, Beyotime). Se determinó la concentración de proteína y se cargaron cantidades iguales de proteína (50 μg por carril) y se separaron mediante SDS-PAGE al 7,5%. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de PVDF utilizando un sistema de transferencia húmeda (300 mA, 90 min). Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía un 5% de leche descremada durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos incluyeron: CPS1 (1:200; A24810, ABclonal), ZEB1 (1:1000; A5600, ABclonal), Slug (1:1000; A13352, ABclonal), E-caderina (1:1000; A20798, ABclonal), N-caderina (1:1000; A3045, ABclonal), Vimentina (1:1000; A19607, ABclonal), MMP2 (1:1000; A19080, ABclonal), TGFB1 (1:1000; A25313, ABclonal), SMAD2 (1:1000; A19114, ABclonal), p-SMAD2 (1:1000; AP1342, ABclonal), SMAD3 (1:1000; A16913, ABclonal), p-SMAD3 (1:1000; AP0727, ABclonal) y GAPDH (1:10000; A19056, ABclonal). Después del lavado, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H + L) (AS014, ABclonal) a temperatura ambiente durante 2 horas. La detección se realizó utilizando un kit ECL (BMU102, Abbkine), con GAPDH como control interno.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células cultivadas utilizando el reactivo TRIzol (15596018CN, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó midiendo la relación OD260/OD230 con un espectrofotómetro de microvolumen y evaluando la integridad de las bandas de ARNr 28 S y 18 S mediante electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de ARN que cumplieron con los requisitos de calidad se transcribieron a la inversa en ADNc utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT con gDNA Eraser (RK20433, ABclonal). Se realizó RT-qPCR utilizando el kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (RK21204, ABclonal) para medir los niveles de expresión de ARNm. Se utilizó GAPDH como control interno. Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla de recursos clave.

Ensayo CCK-8

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Se añadieron 10 μL del reactivo CCK-8 a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Para evaluar el número relativo de células, se midió el valor de absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas cada 24 horas. Se eligió el intervalo de 24 horas para capturar cambios estables en el crecimiento celular a lo largo del tiempo, al tiempo que se minimiza la variabilidad asociada con mediciones más frecuentes.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron 800 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron hasta que las células alcanzaron la densidad adecuada. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído (G1101, Servicebio) durante 20 minutos y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% durante 30 minutos. Finalmente, se contaron y analizaron las colonias que contenían más de 50 células.

Ensayo de curación de heridas

Se inocularon 1 × 106 células en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y se cultivaron en un incubador a 37 °C durante la noche para permitir que las células se adhirieran completamente a la pared. Después de que las células formaron una monocapa, se realizó un rasguño recto en la superficie de la capa celular con la punta de una pipeta estéril de 10 μL. El área del rasguño se fotografió a las 0 horas y a las 24 horas, y se calculó la tasa de migración celular.

Ensayo Transwell

Para detectar el potencial de invasión de las células de CCRC, se utilizó la cámara Transwell recubierta con Matrigel. Después de la recolección, la suspensión celular se resuspendió en 200 μL de medio libre de FBS y se sembró en la cámara superior de Transwell. Luego, la cámara inferior se llenó con 700 μL de medio completo que contenía un 10% de FBS. Después de la incubación en un incubador a 37 °C durante 24 horas, las células no invasivas en la cámara superior se eliminaron cuidadosamente. Las células invasivas que atravesaron la membrana basal se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta al 0,1%. Luego, se contaron las células invasivas en campos microscópicos seleccionados al azar.

Tinción con inmunohistoquímica (IHC)

La IHC se utilizó para detectar la expresión de la proteína CPS1 en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. Las secciones de tejido (3 μm) se desparafinaron y se rehidrataron, se bloquearon a temperatura ambiente y luego se incubaron con el anticuerpo primario contra CPS1 (1:200; A24810, ABclonal) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS durante 3 veces (5 minutos cada vez), las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (RK50015, ABclonal) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la tinción con DAB y la contratinción de hematoxilina de los núcleos. La tinción con IHC fue evaluada de forma independiente por dos patólogos sénior en un estudio doble ciego. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 (negativa), 1 (débil), 2 (moderada) o 3 (fuerte). La proporción de células positivas se clasificó como 0 (80%). Se calculó una puntuación general multiplicando las puntuaciones de intensidad y proporción. Para cada caso, se evaluaron diez campos representativos, y la puntuación final se definió como el valor medio. Las discrepancias se resolvieron por consenso.

Western blot

Para extraer la proteína total, las células se lisaron utilizando un tampón de lisis NP-40 (P0013F, Beyotime). Se determinó la concentración de proteína y se cargaron cantidades iguales de proteína (50 μg por carril) y se separaron mediante SDS-PAGE al 7,5%. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de PVDF utilizando un sistema de transferencia húmeda (300 mA, 90 min). Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía un 5% de leche descremada durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos incluyeron: CPS1 (1:200; A24810, ABclonal), ZEB1 (1:1000; A5600, ABclonal), Slug (1:1000; A13352, ABclonal), E-caderina (1:1000; A20798, ABclonal), N-caderina (1:1000; A3045, ABclonal), Vimentina (1:1000; A19607, ABclonal), MMP2 (1:1000; A19080, ABclonal), TGFB1 (1:1000; A25313, ABclonal), SMAD2 (1:1000; A19114, ABclonal), p-SMAD2 (1:1000; AP1342, ABclonal), SMAD3 (1:1000; A16913, ABclonal), p-SMAD3 (1:1000; AP0727, ABclonal) y GAPDH (1:10000; A19056, ABclonal). Después del lavado, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H + L) (AS014, ABclonal) a temperatura ambiente durante 2 horas. La detección se realizó utilizando un kit ECL (BMU102, Abbkine), con GAPDH como control interno.

Extracción de ARN y RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células cultivadas utilizando el reactivo TRIzol (15596018CN, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó midiendo la relación OD260/OD230 con un espectrofotómetro de microvolumen y evaluando la integridad de las bandas de ARNr 28 S y 18 S mediante electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de ARN que cumplieron con los requisitos de calidad se transcribieron a la inversa en ADNc utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT con gDNA Eraser (RK20433, ABclonal). Se realizó RT-qPCR utilizando el kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (RK21204, ABclonal) para medir los niveles de expresión de ARNm. Se utilizó GAPDH como control interno. Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla de recursos clave.

Se sembraron células en placas de 96 pocillos a una densidad de 5×103 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo y se incubó durante 2 horas. Para evaluar el número relativo de células, se midió el valor de absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas cada 24 horas. Se eligió un intervalo de 24 horas para capturar cambios estables en el crecimiento celular a lo largo del tiempo, minimizando al mismo tiempo la variabilidad asociada con mediciones más frecuentes.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron 800 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron hasta que las células alcanzaron la densidad adecuada. Las células se fijaron con 4% de paraformaldehído (G1101, Servicebio) durante 20 minutos y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 30 minutos. Finalmente, se contaron y analizaron las colonias que contenían más de 50 células.

Ensayo de curación de heridas

Se inocularon 1×106 células en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y se cultivaron en una incubadora a 37°C durante la noche para permitir que las células se adhirieran completamente a la pared. Después de que las células formaron una monocapa, se realizó un rasguño lineal en la superficie de la capa celular con la punta de una pipeta estéril de 10 μL. Se fotografió el área del rasguño a las 0 horas y a las 24 horas, y se calculó la tasa de migración celular.

Ensayo de Transwell

Para detectar el potencial de invasión de las células de CRC, se utilizó la cámara de Transwell recubierta con Matrigel. Después de la recolección, la suspensión celular se resuspendió en 200 μL de medio libre de FBS y se sembró en la cámara superior del Transwell. Luego, la cámara inferior se llenó con 700 μL de medio completo que contenía 10% de FBS. Después de la incubación en una incubadora a 37°C durante 24 horas, las células no invasivas en la cámara superior se eliminaron cuidadosamente. Las células invasivas fijadas con metanol que atravesaron la membrana basal se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Luego, se contaron las células invasivas en campos microscópicos seleccionados aleatoriamente.

Cuantificación y análisis estadístico

Recopilación y procesamiento de datos de RNA-seq

En este estudio, se integraron múltiples conjuntos de datos de RNA-seq de CRC y datos clínicos correspondientes para analizar de manera integral el patrón de expresión de CPS1. Para garantizar la calidad de los datos, empleamos el análisis de componentes principales para identificar y eliminar muestras atípicas, y se filtraron los genes con niveles de expresión inferiores a 10 en más del 75% de las muestras. Finalmente, se obtuvieron 475 muestras de CRC y 41 muestras normales de la base de datos TCGA (https://www.cancer.gov/tcga), y 586 muestras de CRC y 44 muestras normales se obtuvieron de la base de datos ICGC (https://dcc.icgc.org/). Además, se complementaron dos conjuntos de datos de validación independientes (GSE24551-GPL5175 y GSE71187) de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Todos los datos de RNA-seq se transformaron log2 para el análisis posterior.

Análisis de supervivencia y modelado pronóstico

La cohorte GSE72970 se dividió en grupos de alta y baja expresión según la mediana de la expresión de ARNm de CPS1. La curva de supervivencia de Kaplan-Meier se dibujó utilizando el paquete “survival” de R (v3.7.0), y se utilizó la prueba de rango logarítmico para evaluar la diferencia entre los grupos. Los pacientes de nuestra cohorte se agruparon según la puntuación de IHC (>4 se consideró alta expresión) y se comparó la OS. Para evaluar de manera integral el valor pronóstico de CPS1, se realizó un análisis de subgrupos. Se utilizó la regresión de Cox univariada para identificar las variables significativamente asociadas con el pronóstico, y luego se utilizó la regresión de Cox multivariada para verificar el valor de CPS1 como un factor pronóstico independiente, y se construyó un nomograma utilizando el paquete “rms” de R (v6.9.0).

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

Las muestras de TCGA-CRC se agruparon según los niveles de expresión mediana de CPS1. Los recuentos brutos se normalizaron y se identificaron los genes expresados diferencialmente utilizando el paquete “DESeq2” de R (v1.46.0). Se seleccionaron los genes como expresados diferencialmente si |log2FoldChange| > 1 y p < 0,05. Se realizó un análisis de GO y la vía KEGG utilizando el paquete “clusterProfiler” de R (v4.14.6) para revelar las posibles funciones biológicas y las redes regulatorias de CPS1 en CRC.

Análisis de infiltración inmune

Se utilizó el paquete “GSVA” de R (v2.0.5) para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) para comparar la diferencia en las puntuaciones de infiltración de células inmunitarias entre los grupos de alta y baja expresión de CPS1. Las firmas de genes para 28 linfocitos infiltrantes tumorales se obtuvieron de la base de datos TISIDB (http://cis.hku.hk/TISIDB/).^[48] Se utilizó el paquete “linkET” de R (v0.0.7.4) para analizar la correlación entre CPS1 y las células inmunitarias. Además, se utilizaron siete algoritmos, incluidos xCell, TIMER, quanTIseq, EPIC, Consensus TME, CIBERSORT y ABIS, para verificar la correlación. Dado que la TMB y la tasa de mutación somática están estrechamente relacionadas con la respuesta inmune antitumoral,^[49] utilizamos el paquete “TCGAmutations” de R (v0.4.0) para calcular la TMB y el espectro de mutaciones somáticas.

Análisis estadístico

En nuestro estudio, se utilizó la prueba de rango de Wilcoxon, la prueba t de Student no pareada, el análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías para comparar las diferencias entre los grupos. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para analizar la correlación entre el nivel de expresión de CPS1 y las características clinicopatológicas. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó mediante la prueba de rango logarítmico para evaluar las diferencias entre los grupos. Se utilizó el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para calcular la razón de riesgos (HR) y su intervalo de confianza del 95%. La correlación entre las variables se cuantificó mediante el análisis de correlación de Spearman. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente, y los datos cuantitativos se presentaron como media ± DE. El análisis estadístico se realizó utilizando el software R (v4.4.2) y GraphPad Prism (v8.0.2), y p < 0,05 se consideró significativo. Los umbrales de significación estadística se establecieron en ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001; ns, no significativo. Los métodos estadísticos utilizados para cada análisis se describen en las leyendas de las figuras correspondientes.