Comparación del análisis de la curva de fusión de alta resolución basado en PCR y la inmunohistoquímica en la detección de la inestabilidad de microsatélites en el cáncer colorrectal: un estudio de consistencia retrospectivo.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de incidencia y mortalidad relacionadas con el cáncer en el mundo ([Patel et al., 2022]). En la última década, el análisis característico de la inestabilidad de microsatélites (MSI) y los defectos del sistema de reparación de errores de emparejamiento (MMR) ha trascendido su uso tradicional en el cribado del síndrome de Lynch ([Taieb et al., 2022]). Con la aprobación de los inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICIs), como el pembrolizumab y el nivolumab, para el tratamiento de tumores sólidos metastásicos o no resecables con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) o deficiencia del sistema de reparación de errores de emparejamiento (dMMR), el estado de MSI se ha convertido en un biomarcador clave para guiar la toma de decisiones terapéuticas ([Shirav et al., 2022]). Este cambio en el paradigma diagnóstico no solo mejora la precisión, sino que también logra una detección rápida y escalable, satisfaciendo así la creciente demanda de un cribado preciso del CCR.

A pesar de la creciente demanda de detección y la aparición de nuevos métodos, el mejor método para detectar la inestabilidad de microsatélites sigue siendo controvertido. La inmunohistoquímica (IHC) se utiliza ampliamente como método de cribado preliminar por muchos laboratorios de patología debido a su simplicidad y rentabilidad ([Wang et al., 2023]; [Faizee et al., 2024]). Sin embargo, la IHC también tiene limitaciones. Por ejemplo, cuando la sustitución de aminoácidos conserva la antigenicidad de la proteína, pero elimina su actividad catalítica, la IHC a menudo produce resultados pseudo-negativos. Además, los factores preanalíticos, como la isquemia tisular y los artefactos de fijación, también introducirán un cierto grado de subjetividad en la interpretación de los resultados de la IHC ([Rekha et al., 2026]; [El Moutaoukkil et al., 2026]). La reacción en cadena de la polimerasa con electroforesis capilar (PCR-CE) se considera el estándar de oro para confirmar la inestabilidad genómica (MSI) ([Ye et al., 2023]; [Shen et al., 2026]). Sin embargo, la PCR-CE implica un tratamiento post-amplificación complejo y una electroforesis abierta, lo que aumenta el riesgo de contaminación y es un proceso que requiere mucho tiempo y mano de obra. La secuenciación de nueva generación (NGS) puede proporcionar un perfil genómico detallado, pero el alto costo y el análisis de datos complejo limitan su uso rutinario en la mayoría de los entornos clínicos, aunque la accesibilidad y la rentabilidad varían según la región y el sistema de atención médica ([Mandlik, Patil & Singh, 2024]; [Che et al., 2026]).

El análisis de la curva de fusión de alta resolución (HRM) se ha convertido en un método alternativo prometedor ([Nikodem, Cłapa & Narozna, 2021]). La PCR-HRM adopta el método de "tubo cerrado" para combinar la precisión molecular de la PCR con la eficiencia del sistema automatizado ([Luk-In et al., 2026]). Al analizar el comportamiento de fusión del producto de amplificación inmediatamente después de la amplificación, el método reduce el riesgo de contaminación y reduce el costo operativo ([Jember et al., 2026]). Aunque los estudios iniciales han demostrado el potencial de la PCR-HRM para la detección de MSI ([Dietmaier & Hofstädter, 2001]; [Janavicius et al., 2010]), los datos de grandes cohortes clínicas que comparen su rendimiento con la IHC y la PCR-CE, especialmente para resolver casos discrepantes, siguen siendo limitados ([Zhou et al., 2026]; [Ma & Gu, 2026]; [Moustafa, Abdalrahman & Abdelgeleel, 2026]). Este estudio tiene como objetivo evaluar la eficacia diagnóstica de la PCR-HRM en una cohorte de 251 pacientes con CCR. Este estudio evaluará la tasa de concordancia de la PCR-HRM y la IHC, utilizará la PCR-CE como método de verificación para volver a verificar los resultados del cribado y evaluará si la PCR-HRM se puede utilizar como una herramienta de prueba de MSI clínica rutinaria, confiable, rápida y eficaz.

Materiales y Métodos

Diseño del estudio

Este estudio incluyó 251 casos de cáncer colorrectal diagnosticados entre 2022 y 2024. El plan de investigación ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin (Número de aprobación: KY2024-087). Todos los participantes firmaron el formulario de consentimiento informado antes de unirse al grupo.

Análisis de inmunohistoquímica (IHC)

Se realizó tinción IHC de cortes de tejido preparados mediante fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE), con un grosor de corte de 4-5 μm. Después de la desparafinación y rehidratación, se utilizó un tampón de ácido cítrico con un pH de 6,0 para la reparación del antígeno según el antígeno diana. Se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% y luego se lavó con PBS. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra MLH1 (1:200; ab92312; Abcam), PMS2 (1:200; 78576; Cell Signaling Technology), MSH2 (1:200, 2017; Cell Signaling Technology) y MSH6 (1:500, 12988; Cell Signaling Technology). Luego, se realizó una segunda incubación con una etiqueta de peroxidasa de hierro (HRP). Finalmente, se utilizó DAB (3,3'-diaminobifenilamina) para la coloración y se volvió a teñir con hematoxilina. Se deshidrató el corte con una serie de etanol graduado, se hizo transparente con xileno, se selló con tabletas de sellado a base de resina y luego se analizó bajo un microscopio.

Se consideró positiva la tinción nuclear en las células tumorales. La pérdida de la tinción nuclear en las células tumorales con preservación de la tinción en el control interno (células estromales o linfocitos normales) se definió como expresión deficiente de la proteína MMR. La pérdida de cualquiera de las cuatro proteínas MMR se clasificó como dMMR, y la expresión intacta de las cuatro proteínas se clasificó como pMMR.

Ensayo de PCR-CE MSI

Según el kit Maxwell CSC DNA FFPE, se extrajo el ADN de muestras de tejido tumoral y no tumoral adyacente FFPE. El ADN extraído se utilizó luego para el análisis de MSI mediante PCR-CE. Este método utiliza ocho marcadores de microsatélites, incluidos seis marcadores de repetición mononucleótida (BAT-52, BAT-56, NR-21, BAT-25, BAT-26 y MONO-27) y 2 marcadores de repetición pentanucleótida para evaluar la estabilidad de los microsatélites.

Análisis de MSI utilizando la fusión de alta resolución (HRM)

La MSI en el tejido tumoral se evaluó utilizando el kit de análisis de la curva de fusión MSI (Wanfu Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China). Se extrajo el ADN genómico de las muestras tumorales. Se realizó la amplificación por PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se dirige a ocho loci de microsatélites comúnmente utilizados: BAT25, BAT26, NR21, NR24, MONO-27, BAT-52, BAT-56 y CAT-25. Después de la amplificación, se realizó el análisis de HRM en un instrumento de PCR en tiempo real equipado con capacidad de HRM. Las muestras se clasificaron como MSI-H si al menos dos de los ocho loci mostraron picos de fusión anormales que indicaban mutaciones. Las muestras con un locus mutado se clasificaron como inestabilidad de microsatélites baja (MSI-L), y las muestras sin loci mutados se clasificaron como microsatélites estables (MSS). El HRM se realizó en un instrumento de PCR en tiempo real (LightCycler 480; Roche) con una velocidad de rampa de fusión de 0,3 °C por segundo.

Análisis estadístico

Para evaluar el rendimiento del método PCR-HRM en la detección de MSI, comparamos los resultados con los resultados de la IHC como estándar de referencia. Hemos calculado indicadores clave de rendimiento (KPI), como sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (PPV), valor predictivo negativo (NPV) y consistencia general, así como su intervalo de confianza del 95% (IC). Utilizamos la estadística Kappa para evaluar la consistencia entre los métodos IHC y PCR-HRM. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Se utiliza la siguiente fórmula para calcular estos indicadores ([Monaghan et al., 2021]):

Sensibilidad = TP/(TP + FN)

Especificidad = TN/(TN + FP)

Valor predictivo positivo = TP/(TP + FP)

Valor predictivo negativo = TN/(TN + FN)

Precisión general = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)

donde TP representa los verdaderos positivos, FN se refiere a los falsos negativos, TN denota los verdaderos negativos y FP indica los falsos positivos.

Diseño del estudio

Este estudio incluyó 251 casos de cáncer colorrectal diagnosticados entre 2022 y 2024. El plan de investigación ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin (Número de aprobación: KY2024-087). Todos los participantes firmaron el formulario de consentimiento informado antes de unirse al grupo.

Análisis de inmunohistoquímica (IHC)

Se realizó tinción IHC de cortes de tejido preparados mediante fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE), con un grosor de corte de 4-5 μm. Después de la desparafinación y rehidratación, se utilizó un tampón de ácido cítrico con un pH de 6,0 para la reparación del antígeno según el antígeno diana. Se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% y luego se lavó con PBS. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra MLH1 (1:200; ab92312; Abcam), PMS2 (1:200; 78576; Cell Signaling Technology), MSH2 (1:200, 2017; Cell Signaling Technology) y MSH6 (1:500, 12988; Cell Signaling Technology). Luego, se realizó una segunda incubación con una etiqueta de peroxidasa de hierro (HRP). Finalmente, se utilizó DAB (3,3'-diaminobifenilamina) para la coloración y se volvió a teñir con hematoxilina. Se deshidrató el corte con una serie de etanol graduado, se hizo transparente con xileno, se selló con tabletas de sellado a base de resina y luego se analizó bajo un microscopio.

Se consideró positiva la tinción nuclear en las células tumorales. La pérdida de la tinción nuclear en las células tumorales con preservación de la tinción en el control interno (células estromales o linfocitos normales) se definió como expresión deficiente de la proteína MMR. La pérdida de cualquiera de las cuatro proteínas MMR se clasificó como dMMR, y la expresión intacta de las cuatro proteínas se clasificó como pMMR.

Ensayo de PCR-CE MSI

Según el kit Maxwell CSC DNA FFPE, se extrajo el ADN de muestras de tejido tumoral y no tumoral adyacente FFPE. El ADN extraído se utilizó luego para el análisis de MSI mediante PCR-CE. Este método utiliza ocho marcadores de microsatélites, incluidos seis marcadores de repetición mononucleótida (BAT-52, BAT-56, NR-21, BAT-25, BAT-26 y MONO-27) y 2 marcadores de repetición pentanucleótida para evaluar la estabilidad de los microsatélites.

Análisis de MSI utilizando la fusión de alta resolución (HRM)

La MSI en el tejido tumoral se evaluó utilizando el kit de análisis de la curva de fusión MSI (Wanfu Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China). Se extrajo el ADN genómico de las muestras tumorales. Se realizó la amplificación por PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se dirige a ocho loci de microsatélites comúnmente utilizados: BAT25, BAT26, NR21, NR24, MONO-27, BAT-52, BAT-56 y CAT-25. Después de la amplificación, se realizó el análisis de HRM en un instrumento de PCR en tiempo real equipado con capacidad de HRM. Las muestras se clasificaron como MSI-H si al menos dos de los ocho loci mostraron picos de fusión anormales que indicaban mutaciones. Las muestras con un locus mutado se clasificaron como inestabilidad de microsatélites baja (MSI-L), y las muestras sin loci mutados se clasificaron como microsatélites estables (MSS). El HRM se realizó en un instrumento de PCR en tiempo real (LightCycler 480; Roche) con una velocidad de rampa de fusión de 0,3 °C por segundo.

Análisis estadístico

Para evaluar el rendimiento del método PCR-HRM en la detección de MSI, comparamos los resultados con los resultados de la IHC como estándar de referencia. Hemos calculado indicadores clave de rendimiento (KPI), como sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (PPV), valor predictivo negativo (NPV) y consistencia general, así como su intervalo de confianza del 95% (IC). Utilizamos la estadística Kappa para evaluar la consistencia entre los métodos IHC y PCR-HRM. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Se utiliza la siguiente fórmula para calcular estos indicadores ([Monaghan et al., 2021]):

Sensibilidad = TP/(TP + FN)

Especificidad = TN/(TN + FP)

Valor predictivo positivo = TP/(TP + FP)

Valor predictivo negativo = TN/(TN + FN)

Precisión general = (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)

donde TP representa los verdaderos positivos, FN se refiere a los falsos negativos, TN denota los verdaderos negativos y FP indica los falsos positivos.

Resultados

Características de los pacientes

Este estudio incluyó a 251 pacientes con CRC, cuyas características demográficas, clínicas y tumorales se resumen en la Tabla 1. La edad media de los participantes fue de 65 años (rango de 29 a 89 años), de los cuales el 65,3 % (164/251) eran hombres. Los sitios tumorales más comunes fueron el recto (37,8 %, 95/251) y el colon derecho (25,9 %, 65/251). El análisis histopatológico mostró que el adenocarcinoma fue el tipo de tumor más prevalente, representando el 97,2 % (244/251). De estos, el 14,7 % (37/251) fueron poco diferenciados, el 57,8 % (145/251) fueron moderadamente diferenciados y el 27,5 % (69/251) fueron bien diferenciados.

Se utilizó inmunohistoquímica (IHC) para evaluar el estado de MMR, y los resultados mostraron que el 20,3 % (51/251) de los pacientes presentaba dMMR (Figura 1). La distribución de las deficiencias de proteínas MMR entre los 51 casos de dMMR fue la siguiente: pérdida de MLH1 en el 71,1 % (27/51), pérdida de PMS2 en el 86,8 % (33/51), pérdida de MSH2 en el 34,2 % (13/51) y pérdida de MSH6 en el 42,1 % (16/51). Entre los casos de dMMR, el 39,2 % (20/51) mostraron pérdida concurrente de dos o más proteínas MMR. La mayoría de los pacientes (93,2 %, 234/251) no recibieron quimiorradioterapia preoperatoria, mientras que el 6,8 % (17/251) sí la recibieron.

Rendimiento de PCR-HRM en la detección de MSI

Este estudio utilizó el análisis de curvas de PCR-HRM y los métodos de IHC para evaluar el estado de MSI de 251 muestras de CRC (Tabla 2). Según los resultados de IHC, 51 muestras (20,3 %) se clasificaron como dMMR, mientras que 200 muestras (79,7 %) se identificaron como pMMR. Los resultados del análisis de PCR-HRM fueron similares, identificando 51 casos de MSI-H (20,3 %) y 200 casos de MSS/MSI-L (79,7 %). Sin embargo, el análisis estadístico posterior mostró que existían diferencias en los resultados de PCR-HRM e IHC de los dos grupos de muestras. En comparación con los resultados de IHC, PCR-HRM demostró una sensibilidad del 98,04 %, una especificidad del 99,50 %, un VPP del 98,04 % y un VPN del 99,50 % en la detección de MSI-H. La tasa de concordancia general entre los dos métodos fue del 99,20 % (Tabla 3, Figura 2). La Tabla 3 presenta el rendimiento diagnóstico de PCR-HRM utilizando IHC como el estándar de referencia inicial. Los dos casos discrepantes se resolvieron mediante PCR-CE, pero no se utilizaron para revisar el cálculo inicial del rendimiento basado en IHC.

Posteriormente, se utilizó la prueba de Kappa para evaluar la concordancia entre los dos métodos de detección. Los resultados indican que PCR-HRM tuvo una excelente concordancia con IHC en la detección del estado de MMR/MSI del CRC (Kappa = 0,971, P < 0,01). El alto valor de Kappa puede estar influenciado, en parte, por la prevalencia relativamente alta de dMMR (20,3 %) en esta cohorte.

Validación de resultados de prueba inconsistentes en dos muestras

Como se señaló anteriormente, se observaron discrepancias entre los métodos de PCR-HRM e IHC en dos de los 251 pacientes con CRC. En el primer caso, el tumor se identificó como pMMR por IHC, pero se clasificó como MSI-H por PCR-HRM; las pruebas de confirmación con PCR-CE arrojaron resultados consistentes con PCR-HRM (MSI-H). En el segundo caso, el tumor se identificó como dMMR por IHC, pero se clasificó como MSS/MSI-L por PCR-HRM, y PCR-CE confirmó el resultado de PCR-HRM (MSS/MSI-L). Para explicar esta discrepancia, realizamos un análisis de confirmación utilizando PCR-CE. El espectro de PCR-CE mostró cambios de pico significativos y patrones de inestabilidad, completamente consistentes con los resultados de PCR-HRM (Figuras 3 y 4). El primer caso discrepante (IHC pMMR pero MSI-H molecular) se atribuyó a la retención de proteínas con pérdida de función. El segundo caso discrepante (IHC dMMR pero MSS molecular) se atribuyó a factores preanalíticos, como artefactos de fijación de tejidos. Estos resultados de confirmación sugieren que las inconsistencias observadas, en particular los resultados falsos negativos de IHC, pueden deberse a una expresión desigual o débil de las proteínas MMR, o a la presencia de proteínas mutantes inactivadas catalíticamente pero intactas antigénicamente. Por lo tanto, estos resultados muestran que PCR-HRM se puede utilizar como un método de detección de MSI de CRC rápido, confiable y clínicamente significativo. Sin embargo, su eficacia aún debe verificarse más a fondo mediante estudios multicéntricos prospectivos para confirmar su valor y precisión en una aplicación clínica más amplia.

Características de los pacientes

Este estudio incluyó a 251 pacientes con CRC, cuyas características demográficas, clínicas y tumorales se resumen en la Tabla 1. La edad media de los participantes fue de 65 años (rango de 29 a 89 años), de los cuales el 65,3 % (164/251) eran hombres. Los sitios tumorales más comunes fueron el recto (37,8 %, 95/251) y el colon derecho (25,9 %, 65/251). El análisis histopatológico mostró que el adenocarcinoma fue el tipo de tumor más prevalente, representando el 97,2 % (244/251). De estos, el 14,7 % (37/251) fueron poco diferenciados, el 57,8 % (145/251) fueron moderadamente diferenciados y el 27,5 % (69/251) fueron bien diferenciados.

Se utilizó IHC para evaluar el estado de MMR, y los resultados mostraron que el 20,3 % (51/251) de los pacientes presentaba dMMR (Figura 1). La distribución de las deficiencias de proteínas MMR entre los 51 casos de dMMR fue la siguiente: pérdida de MLH1 en el 71,1 % (27/51), pérdida de PMS2 en el 86,8 % (33/51), pérdida de MSH2 en el 34,2 % (13/51) y pérdida de MSH6 en el 42,1 % (16/51). Entre los casos de dMMR, el 39,2 % (20/51) mostraron pérdida concurrente de dos o más proteínas MMR. La mayoría de los pacientes (93,2 %, 234/251) no recibieron quimiorradioterapia preoperatoria, mientras que el 6,8 % (17/251) sí la recibieron.

Rendimiento de PCR-HRM en la detección de MSI

Este estudio utilizó el análisis de curvas de PCR-HRM y los métodos de IHC para evaluar el estado de MSI de 251 muestras de CRC (Tabla 2). Según los resultados de IHC, 51 muestras (20,3 %) se clasificaron como dMMR, mientras que 200 muestras (79,7 %) se identificaron como pMMR. Los resultados del análisis de PCR-HRM fueron similares, identificando 51 casos de MSI-H (20,3 %) y 200 casos de MSS/MSI-L (79,7 %). Sin embargo, el análisis estadístico posterior mostró que existían diferencias en los resultados de PCR-HRM e IHC de los dos grupos de muestras. En comparación con los resultados de IHC, PCR-HRM demostró una sensibilidad del 98,04 %, una especificidad del 99,50 %, un VPP del 98,04 % y un VPN del 99,50 % en la detección de MSI-H. La tasa de concordancia general entre los dos métodos fue del 99,20 % (Tabla 3, Figura 2). La Tabla 3 presenta el rendimiento diagnóstico de PCR-HRM utilizando IHC como el estándar de referencia inicial. Los dos casos discrepantes se resolvieron mediante PCR-CE, pero no se utilizaron para revisar el cálculo inicial del rendimiento basado en IHC.

Posteriormente, se utilizó la prueba de Kappa para evaluar la concordancia entre los dos métodos de detección. Los resultados indican que PCR-HRM tuvo una excelente concordancia con IHC en la detección del estado de MMR/MSI del CRC (Kappa = 0,971, P < 0,01). El alto valor de Kappa puede estar influenciado, en parte, por la prevalencia relativamente alta de dMMR (20,3 %) en esta cohorte.

Validación de resultados de prueba inconsistentes en dos muestras

Como se señaló anteriormente, se observaron discrepancias entre los métodos de PCR-HRM e IHC en dos de los 251 pacientes con CRC. En el primer caso, el tumor se identificó como pMMR por IHC, pero se clasificó como MSI-H por PCR-HRM; las pruebas de confirmación con PCR-CE arrojaron resultados consistentes con PCR-HRM (MSI-H). En el segundo caso, el tumor se identificó como dMMR por IHC, pero se clasificó como MSS/MSI-L por PCR-HRM, y PCR-CE confirmó el resultado de PCR-HRM (MSS/MSI-L). Para explicar esta discrepancia, realizamos un análisis de confirmación utilizando PCR-CE. El espectro de PCR-CE mostró cambios de pico significativos y patrones de inestabilidad, completamente consistentes con los resultados de PCR-HRM (Figuras 3 y 4). El primer caso discrepante (IHC pMMR pero MSI-H molecular) se atribuyó a la retención de proteínas con pérdida de función. El segundo caso discrepante (IHC dMMR pero MSS molecular) se atribuyó a factores preanalíticos, como artefactos de fijación de tejidos. Estos resultados de confirmación sugieren que las inconsistencias observadas, en particular los resultados falsos negativos de IHC, pueden deberse a una expresión desigual o débil de las proteínas MMR, o a la presencia de proteínas mutantes inactivadas catalíticamente pero intactas antigénicamente. Por lo tanto, estos resultados muestran que PCR-HRM se puede utilizar como un método de detección de MSI de CRC rápido, confiable y clínicamente significativo. Sin embargo, su eficacia aún debe verificarse más a fondo mediante estudios multicéntricos prospectivos para confirmar su valor y precisión en una aplicación clínica más amplia.

Discusión

La evaluación de MSI ha superado su función tradicional en el cribado del síndrome de Lynch (SL) y se ha convertido en la piedra angular de la oncología de precisión ([Pussila et al., 2024]; [Yamamoto et al., 2024]). Con la aprobación de los ICIs, como el pembrolizumab, para el tratamiento de tumores sólidos MSI-H/dMMR no resecables o metastásicos, la detección precisa de biomarcadores se ha vuelto crucial ([Shirav et al., 2022]). Aunque las guías actuales de la NCCN y la ESMO recomiendan el cribado universal de todos los pacientes con CRC, todavía existen diferencias en los métodos de diagnóstico elegidos por diferentes instituciones. La IHC tradicional se utiliza ampliamente debido a su facilidad de operación y rentabilidad; sin embargo, su limitación inherente es que no puede detectar la falta de función en presencia de proteínas intactas antigénicamente. Por el contrario, aunque la secuenciación de segunda generación (NGS) tiene una alta sensibilidad, en muchas áreas con recursos limitados, su costo sigue siendo demasiado alto para su uso en el cribado inicial convencional ([Mandlik, Patil & Singh, 2024]). En este contexto, nuestra investigación ha verificado que PCR-HRM es un "esquema de compromiso" estratégico, que combina la precisión genómica de la detección molecular con el tiempo de respuesta y la estructura de costos comparables a la IHC.

En la cohorte de 251 pacientes con CRC que incluimos, encontramos que la prevalencia de dMMR/MSI-H fue del 20,3 %, que es ligeramente superior al 15 % que se informa comúnmente en la población occidental ([Siegel et al., 2023]), pero que es consistente con los datos recientes de la población asiática, lo que sugiere posibles diferencias regionales o raciales ([Zhang & Chen, 2021]; [Xu et al., 2024]). Sin embargo, esta mayor prevalencia debe interpretarse con precaución debido a un posible sesgo de selección, ya que se trató de un estudio retrospectivo unicéntrico en lugar de una cohorte basada en la población. Nuestros datos enfatizan la necesidad de establecer una línea de base específica de la población al evaluar la eficacia del diagnóstico. En términos de rendimiento diagnóstico, la sensibilidad de la detección de PCR-HRM es del 98,04 % y la especificidad es del 99,50 %. La alta consistencia observada en este estudio (Kappa = 0,971) muestra que la optimización del esquema de HRM reduce eficazmente los errores técnicos que limitaban previamente la aplicación de la tecnología.

La contribución clave de este estudio radica en el análisis molecular de dos casos inconsistentes, proporcionando así información importante sobre las limitaciones biológicas de los métodos de detección basados en proteínas. En un paciente, el tumor se identificó como pMMR por IHC, pero se clasificó como MSI-H por PCR-HRM y PCR-CE; las pruebas de confirmación con PCR-CE arrojaron resultados consistentes con PCR-HRM (MSI-H). Esta inconsistencia se denomina a menudo "pérdida de función con retención de proteínas", y representa aproximadamente del 5 al 10 % de los casos de síndrome de Lynch ([Acha-Sagredo et al., 2025]; [Takei et al., 2024]). Esta situación es causada principalmente por mutaciones con cambio de sentido, que reducen la eficiencia catalítica del complejo enzimático MMR, pero no desencadenan la degradación de las proteínas. En este caso, el anticuerpo detecta proteínas inertes, lo que conduce a la clasificación incorrecta de "función normal". Este hallazgo apoya firmemente un algoritmo de diagnóstico en el que se debe realizar una prueba de PCR como prueba de confirmación cuando se sospecha de deficiencia de MMR clínicamente, pero IHC es normal. Por el contrario, en un caso se clasificó como dMMR por IHC, pero se confirmó como MSS por ambos métodos moleculares, probablemente debido a factores preanalíticos, como un retraso en la fijación de los tejidos o la heterogeneidad tumoral, lo que provocó la pérdida de antígenos no relacionados con la mutación genética. En este caso, confiar únicamente en IHC puede conducir a una inmunoterapia inapropiada, lo que hace que el paciente sufra eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico sin los beneficios del tratamiento. Nuestros resultados muestran que PCR-HRM desempeña un papel crucial en la arbitraje en estas situaciones ambiguas.

Proponemos un flujo de trabajo clínico: la inmunohistoquímica (IHC) puede utilizarse para el cribado inicial, y se recomienda la PCR-HRM como prueba de confirmación para los casos IHC-pMMR con alta sospecha clínica de dMMR, así como para la validación de los casos IHC-dMMR. Esta estrategia combinada maximiza la precisión al tiempo que mantiene la eficiencia.

Aunque la PCR-CE se ha considerado durante mucho tiempo el estándar de oro para la biología molecular, requiere un post-procesamiento de la PCR, como la electroforesis en gel o la separación capilar, lo que aumenta el riesgo de contaminación cruzada y prolonga el ciclo de diagnóstico ([Nikodem, Cłapa & Narozna, 2021]). Nuestra investigación confirma que la PCR-HRM, como método de tubo cerrado, no requiere amplificación ni post-tratamiento. Esta característica no solo minimiza el riesgo de contaminación, sino que también simplifica significativamente el flujo de trabajo del laboratorio. Los estudios comparativos muestran que, en comparación con la PCR-CE, la PCR-HRM puede reducir el coste de los reactivos en aproximadamente un 30-50% y ahorrar horas de tiempo de trabajo del técnico ([Nikodem, Cłapa & Narozna, 2021]). Estas ventajas logísticas hacen de la PCR-HRM una opción ideal para los laboratorios clínicos de alto rendimiento.

Admitimos que existen algunas limitaciones en el diseño de este estudio. Aunque 251 muestras son suficientes para proporcionar eficacia estadística para evaluar la consistencia general, el número de casos de inconsistencia (n = 2) es demasiado pequeño para dilucidar completamente todos los posibles mecanismos subyacentes a los resultados inconsistentes entre la IHC y la PCR-HRM. En particular, la PCR-CE solo se realizó para los casos discrepantes en lugar de para todas las muestras, lo que puede dar lugar a una ligera sobreestimación del rendimiento diagnóstico. Se necesitan cohortes multicéntricas más amplias para captar variantes raras de MMR. Utilizamos una combinación estándar de marcadores de un solo nucleótido. Aunque la especificidad de los marcadores de un solo nucleótido suele ser mejor que la de los marcadores de dinucleótido ([Kim et al., 2025]), la aparición de combinaciones extendidas (como Pentaplex) merece una comparación adicional para determinar si la sensibilidad puede mejorarse ligeramente. Como todos los métodos basados en PCR, la sensibilidad de la HRM se ve afectada por la pureza del tumor. Las muestras con bajo contenido de células tumorales (