La obtención de imágenes metabólicas con deuterio de alta resolución espacio-temporal permite la fenotipificación in vivo de la heterogeneidad intratumoral e intertumoral.

La heterogeneidad intratumoral, es decir, la coexistencia de distintos subtipos de tejido dentro de un tumor, es una característica definitoria del cáncer, estrechamente relacionada con la progresión de la enfermedad, la resistencia terapéutica y la recurrencia (^[1]–^[3]). Unos diagnósticos intra- e intertumorales precisos son esenciales para estratificar el riesgo y personalizar el tratamiento, en particular para identificar subclones agresivos que puedan evadir la terapia o promover la metástasis (^[4]–^[7]). Si bien las biopsias de tejido permiten la elaboración de perfiles moleculares, sus limitaciones espaciales y las restricciones procedimentales restringen la exhaustividad, la evaluación y el seguimiento longitudinal (^[8], ^[9]). Solo las imágenes in vivo mínimamente invasivas que se dirijan a todo el tumor pueden proporcionar las evaluaciones y las mediciones repetidas necesarias para una caracterización completa y una comprensión de la enfermedad y su desarrollo (^[10], ^[11]). Sin embargo, las modalidades de imagen de rutina proporcionan principalmente descriptores morfológicos que carecen de la información metabólica espacialmente resuelta suficiente, lo que subraya la necesidad de descubrir biomarcadores funcionales y moleculares previamente no reconocidos (^[12], ^[13]). El presente estudio analiza las oportunidades que ofrecen las nuevas formas de imagen metabólica con deuterio (DMI) con alta sensibilidad y una mejor resolución espacio-temporal en este ámbito.

Una de las principales fuentes de información sobre la reprogramación metabólica es el efecto de Warburg, un sello distintivo del cáncer y un objetivo común de la imagenología (^[14], ^[15]). La tomografía por emisión de positrones con [18F]fluorodesoxiglucosa (FDG-PET), aprobada clínicamente, se basa en este efecto para cuantificar el enriquecimiento de glucosa (^[16]), revelando, dentro de los límites de su resolución espacial, variaciones en el metabolismo tumoral, aunque carece de la especificidad necesaria para discernir las vías posteriores (^[17], ^[18]). La resonancia magnética (RM) convencional de 1H proporciona, principalmente, contrastes anatómicos y fisiológicos que no informan directamente sobre el metabolismo específico de las vías (^[19], ^[20]). Por el contrario, la RM de difusión y perfusión ha demostrado pronunciadas heterogeneidades intratumorales, relacionadas con la celularidad y el suministro vascular (^[3]). Se puede introducir especificidad metabólica mediante la espectroscopia de resonancia magnética (MRSI) de 1H y técnicas relacionadas, como la transferencia de saturación por intercambio químico y la MRSI hiperpolarizada de 13C (^[21]–^[27]). Sin embargo, el mapeo robusto de la heterogeneidad metabólica mediante estos métodos suele estar limitado en la práctica por la resolución espacial, la cobertura, el muestreo temporal, la sensibilidad y las limitaciones de cuantificación.

Recientemente, la DMI ha surgido como una técnica prometedora para evaluar de forma no invasiva la cinética metabólica de los tejidos sin algunas de estas limitaciones (^[18]–^[20], ^[28]). La DMI sigue el destino de sustratos deuterados no radiactivos (^[29]). Los metabolitos marcados con 2H perturban mínimamente las vías metabólicas endógenas, lo que permite el seguimiento continuo del enriquecimiento del sustrato y las conversiones metabólicas posteriores en condiciones fisiológicas (^[30]–^[32]). Además, el tiempo de relajación T1 relativamente corto de 2H en comparación con 13C facilita el promedio de señales en múltiples adquisiciones, mejorando la relación señal-ruido (SNR) dentro de los tiempos de escaneo clínicamente factibles (^[33], ^[34]). Numerosos estudios han demostrado el potencial de la DMI en aplicaciones oncológicas, incluida la detección de tumores, la clasificación de subtipos moleculares y la evaluación temprana de la respuesta terapéutica (^[20], ^[31], ^[32], ^[35]–^[40]). Por ejemplo, la DMI se ha utilizado para diferenciar los fenotipos tumorales en función de sus vías metabólicas de la glucosa y para identificar las reducciones inducidas por el tratamiento en la acumulación de lactato tras la quimioterapia o la terapia dirigida (^[19], ^[38]–^[40]). Las tecnologías DMI in vivo también podrían proporcionar información valiosa sobre la heterogeneidad metabólica intratumoral, siempre que se pueda superar su resolución espacio-temporal relativamente baja (^[18], ^[19]). Esto se ve limitado por la sensibilidad limitada de 2H y por las bajas concentraciones metabólicas, lo que dificulta la capacidad de la DMI para resolver espacialmente las heterogeneidades intratumorales y los flujos metabólicos a nivel de microlitros. Poder acceder a estas cinéticas metabólicas localizadas podría ser esencial para un diagnóstico preciso, la estratificación de subtipos y la planificación de tratamientos personalizados, así como para una mejor comprensión del cáncer.

Este estudio presenta una estrategia DMI de alta resolución que, cuando se integra con la agrupación no supervisada, permite dicho mapeo de la heterogeneidad metabólica intratumoral in vivo (fig. 1). También permite la discriminación entre diferentes subtipos de tumores. Para lograr estos objetivos, nos basamos en una versión multifrecuencia de la secuencia de pulsos DMI de precesión de estado estacionario equilibrada (bSSFP) que aprovecha las distintas respuestas espectrales de los diferentes metabolitos. A 9,4 T, esto proporcionó una separación espectral robusta de las múltiples especies deuteradas que surgen tras la administración de [6,6′-2H2]glucosa, al tiempo que se logró una resolución en el plano submilimétrica (0,9 mm × 0,9 mm) a ∼2 min por fotograma dinámico. Los datos de heterogeneidad metabólica que proporcionaron estos experimentos DMI rápidos y de alta resolución se analizaron mediante dos canales de agrupación no supervisados complementarios: uno que involucra la agrupación k-medias de los datos del área bajo la curva (AUC), el otro que involucra un análisis de componentes principales (PCA) seguido de un modelado de mezcla gaussiana (GMM). Este marco integrado nos proporcionó tres capacidades que creemos que son clave para la comprensión y el diagnóstico del cáncer: (i) la detección no invasiva de la apoptosis tumoral temprana a través de un flujo glucolítico reducido y alteraciones en la distribución de los metabolitos, lo que ofrece un biomarcador de RM sensible para detectar las áreas tumorales necróticas inducidas por una proliferación excesiva o por la terapia; (ii) una imagen clara de las heterogeneidades metabólicas intratumorales dentro de los tumores viables en crecimiento, que delimitan subregiones asociadas con distintos estados, como un alto enriquecimiento de glucosa y una alta acumulación de lactato; y (iii) huellas metabólicas derivadas de diferentes subregiones tumorales, lo que permite la diferenciación entre dos modelos de tumores de colon (heterogeneidad intertumoral) de forma sin etiquetas y puramente basada en datos. El significado de este mapeo de la heterogeneidad in vivo se examinó aún más mediante estudios inmunohistoquímicos centrados en ocho marcadores clave relacionados con el metabolismo, lo que confirmó y proporcionó información adicional sobre el significado funcional de la información metabólica de la DMI. En conjunto, estos resultados establecen la DMI de alta resolución con agrupación no supervisada como una plataforma robusta para la fenotipificación metabólica, dotada de un fuerte potencial de traslación para el diagnóstico, la evaluación de la respuesta al tratamiento y la estratificación terapéutica.

RESULTADOS

DMI de alta resolución habilitada por bSSFP multifrecuencia

Para mejorar suficientemente la resolución espacio-temporal de la DMI para caracterizar las heterogeneidades metabólicas del tumor, es necesario aumentar su sensibilidad por unidad de tiempo. Con este fin, nos basamos en experimentos bSSFP que han demostrado proporcionar una sensibilidad DMI superior y los modificamos en una versión bSSFP multifrecuencia (MF) (fig. 2A) capaz de separar las tres señales 2H principales que surgen en este experimento: agua, glucosa y lactato. Al igual que sus contrapartes de imagen de desplazamiento químico (CSI) o bSSFP de múltiples ecos (ME), MF-bSSFP aprovecha las favorables relaciones T2/T1 de los metabolitos deuterados y la escasez espectral intrínseca de la DMI para mejorar la SNR. Sin embargo, MF-bSSFP reemplaza la evolución espectral explotada por bSSFP ME y CSI con adquisiciones orientadas a la imagen que se llevan a cabo en una serie de desplazamientos predefinidos optimizados (fig. 2A, izquierda). Dado que la imagen bSSFP de cada metabolito tendrá una fase diferente para cada desplazamiento, las combinaciones lineales adecuadas de estas adquisiciones de frecuencia variable pueden separar sus imágenes individuales. Para maximizar la SNR y la separabilidad espectral, es necesario optimizar los parámetros de adquisición experimental, principalmente el tiempo de repetición (TR), el ángulo de inclinación y los desplazamientos de frecuencia que definen la fase general de las imágenes de cada metabolito; esto se hizo en función de los desplazamientos químicos a priori conocidos de los metabolitos (fig. S1). La búsqueda resultante produjo parámetros de adquisición para cinco desplazamientos con características de magnitud y fase (fig. 2A, centro), a partir de los cuales una reconstrucción iterativa basada en combinaciones lineales pudo resolver con éxito las distribuciones espaciales de cada metabolito, al tiempo que se tenían en cuenta las heterogeneidades del campo B0 y los efectos T2.

Los resultados experimentales obtenidos con un esquema de este tipo se validaron aún más con un fantasma tridimensional (3D) impreso que contenía tres letras con forma de “A”, “P” y “M”, rellenas con 2H2O (40 mM), [6,6′-2H2]glucosa (20 mM) y [3,3,3-2H3]lactato (20 mM) respectivamente (fig. 2B). Las imágenes de magnitud y fase 2H representativas adquiridas en cinco desplazamientos de frecuencia optimizados (±190, ±110 y 0 Hz; fig. S2) exhibieron intensidades de señal de magnitud uniformes pero contrastes dependientes de la frecuencia distintos. Estas firmas de fase únicas permitieron una clara diferenciación de los metabolitos y proporcionaron la base para la separación espectral en el canal de reconstrucción (fig. 2A). Para comparar el rendimiento de MF-bSSFP con CSI convencional, comparamos los mapas de metabolitos resueltos espacialmente a varias resoluciones (fig. 2B). CSI a una resolución de matriz de 16 × 16 no logró capturar los detalles finos del fantasma, y aunque el aumento de la resolución a 32 × 32 mejoró marginalmente la claridad espacial, esto condujo a una degradación sustancial de la SNR, especialmente para el lactato. Por el contrario, MF-bSSFP a 32 × 32 y 40 × 40 de resolución logró tanto una alta fidelidad espacial como una clara separación de metabolitos, manteniendo una fuerte SNR incluso para el lactato de baja concentración para tiempos de escaneo y condiciones de resolución espacial idénticos. Los análisis cuantitativos de la SNR en cinco mediciones repetidas se muestran en la fig. 2C. MF-bSSFP logró 2,8 veces, 4,1 veces y 3,7 veces de mejora sobre CSI para agua (CSI: 20,2 ± 1,1; MF-bSSFP: 56,3 ± 1,2), glucosa (CSI: 8,0 ± 0,9; MF-bSSFP: 32,4 ± 0,8) y lactato (CSI: 8,2 ± 1,0; MF-bSSFP: 30,2 ± 0,7), respectivamente. Además, la SNR de las imágenes de metabolitos reconstruidas coincidió estrechamente con el máximo teórico obtenido mediante el promedio de señales directo (√5 × media para las imágenes bSSFP), lo que confirma la alta eficiencia del algoritmo de reconstrucción iterativa utilizado para procesar los datos MF-bSSFP. La robustez del MF-bSSFP resultante en diferentes niveles de ruido e inhomogeneidad B0 se demuestra además en la fig. S3; las comparaciones con otros métodos se dan en la fig. S4.

La DMI de alta resolución delimita los compartimentos tumorales necróticos y viables mediante la agrupación metabólica no supervisada.

Distinguir las áreas necróticas del tejido tumoral viable es esencial para comprender la progresión tumoral y evaluar la respuesta terapéutica. Con este fin, aplicamos el enfoque DMI optimizado descrito anteriormente en ratones con un modelo de cáncer de colon subcutáneo y cuantificamos la distribución dinámica de los metabolitos utilizando mapas de AUC para agua deuterada, glucosa y lactato. Los patrones espaciales resultantes revelaron marcadas heterogeneidades metabólicas intratumorales (fig. 3). A continuación, se pudieron establecer compartimentos metabólicos espacialmente distintos mediante análisis no supervisados de los mapas de AUC de glucosa y lactato, utilizando el agrupamiento k-medias. Las áreas metabólicamente activas mostraron una acumulación dependiente del tiempo de la glucosa y la lactato, lo que indica una glicólisis activa. Por el contrario, las áreas metabólicamente inactivas mostraron una reducción marcada del enriquecimiento de metabolitos, lo que refleja una actividad metabólica suprimida. Para validar aún más estos hallazgos, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) en los mapas de metabolitos dinámicos, reduciendo las series temporales de glucosa y lactato a 10 dimensiones, seguido de su agrupación utilizando un modelo de mezcla gaussiana (GMM). La segmentación basada en GMM coincidió estrechamente con los resultados del agrupamiento k-medias, y ambos mostraron una fuerte correspondencia con las características histopatológicas (fig. S5). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) confirmó que el área metabólicamente inactiva definida por DMI correspondía al tejido necrótico, caracterizado por una desintegración celular generalizada y piocnosis nuclear. Por el contrario, el área metabólicamente activa identificada por DMI correspondía al tejido viable que mostraba células tumorales densamente compactadas y mitóticamente activas (fig. 3). Se realizó la correspondencia histológica utilizando secciones (grosor de 4 μm) obtenidas cerca del plano central de DMI (6 mm).

El DMI de alta resolución revela heterogeneidades metabólicas mesoscópicas dentro de los tumores viables

La combinación del DMI de alta resolución con un algoritmo de agrupamiento no supervisado también nos permitió discernir heterogeneidades en la actividad metabólica dentro de los compartimentos tumorales viables. La figura 4 ilustra esto con datos de DMI de alta resolución y los resultados del agrupamiento no supervisado, para un modelo de tumor subcutáneo en ratones. A diferencia de los experimentos de la figura 3, este tumor no mostró una necrosis extensa, como lo confirmó la tinción con H&E (fig. S6). A pesar de la ausencia de grandes áreas necróticas, la alta resolución espacio-temporal del DMI reveló claramente una pronunciada heterogeneidad intratumoral, especialmente en el enriquecimiento de glucosa y la acumulación de lactato (fig. 4A). En contraste con la glucosa y el lactato, el agua deuterada no se incluyó en el presente análisis de agrupamiento, ya que se encontró que reflejaba una mezcla de acumulación de etiquetas en todo el cuerpo, contenido de agua perfusión/vascular y procesos de intercambio, en lugar de una lectura espacialmente específica del flujo glucolítico tumoral local a escala de vóxeles. Por lo tanto, se añadió poca información al comparar los resultados con o sin la inclusión de la información de AUC (agua) (fig. S7). En consecuencia, el agrupamiento k-medias aplicado a los mapas de AUC de glucosa y lactato identificó cuatro fenotipos metabólicos distintos, y el número óptimo de grupos (K = 4) se determinó utilizando el método del codo (fig. 4B). La distribución a nivel de vóxel de los valores normalizados de glucosa y lactato (fig. 4C) asoció los datos agrupados por k-medias a uno de los cuatro posibles fenotipos: HG + HL: alto enriquecimiento de glucosa, alta acumulación de lactato; HG + LL: alto enriquecimiento de glucosa, baja acumulación de lactato; LG + HL: bajo enriquecimiento de glucosa, alta acumulación de lactato; y LG + LL: bajo enriquecimiento de glucosa, baja acumulación de lactato. Estos grupos parecen estar espacialmente localizados dentro del tumor (fig. 4D).

Las curvas de concentración de glucosa y lactato resueltas en el tiempo para 12 ratones portadores de tumores C26 (fig. 4, E y F) también demuestran claras distinciones cinéticas entre estos grupos. La cuantificación de los valores de AUC reveló un enriquecimiento de glucosa significativamente mayor en las áreas HG + HL y HG + LL en relación con LG + HL y LG + LL (fig. 4G), y una acumulación de lactato elevada en HG + HL y LG + HL en comparación con HG + LL y LG + LL (fig. 4H). El agrupamiento k-medias y los análisis cuantitativos realizados en una cohorte diferente de ratones portadores de cáncer de colon (10 animales con tumores CT26) utilizando los mismos métodos arrojaron resultados similares a los de la cepa C26 (fig. S8).

Para explorar si la dinámica metabólica podría analizarse más allá de las características estáticas de AUC, se aplicó un marco de trabajo PCA-GMM a los datos de DMI. Los primeros cuatro componentes principales extraídos de las series temporales de glucosa y lactato revelaron patrones de varianza temporal dominantes (fig. 4I). El agrupamiento basado en GMM en el espacio de componentes reducido identificó agrupaciones de fenotipos consistentes (fig. 4J), y los mapas de probabilidad resultantes (fig. 4K) produjeron una clasificación suave de los vóxeles tumorales, lo que refleja una heterogeneidad continua. Las evaluaciones cuantitativas de los dos métodos de agrupamiento k-medias y PCA-GMM (tablas S1 y S2) muestran características espaciales en común y demuestran la capacidad del DMI de alta resolución para resolver de forma no invasiva fenotipos metabólicos dinámicos y espacialmente distintos en tumores viables en vivo, independientemente de las estadísticas utilizadas en el análisis.

Las subregiones metabólicas definidas por DMI se corresponden estrechamente con la expresión de marcadores relacionados con el metabolismo

Para validar la heterogeneidad intratumoral revelada por el DMI de alta resolución, se realizó inmunohistoquímica (IHC) en las secciones de tumor C26 después de la imagen in vivo. Las imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 se coregistraron con las secciones histológicas correspondientes para permitir la correlación espacial. La fiabilidad del coregistro se evaluó calculando el coeficiente de similitud de Dice (DSC); solo se incluyeron para el análisis posterior los tumores con un buen coregistro (DSC ≥ 0,80), y se descartaron los tumores con un coregistro deficiente (fig. S9). La figura 5 muestra los resultados de un ejemplo de buen coregistro. Las áreas definidas por resonancia magnética ponderada en T2 (contornos rojos) mostraron una fuerte concordancia espacial con las áreas anotadas histológicamente (contornos azules), lo que proporciona una validación bioquímica específica de la región (fig. 5C). Se realizó la tinción IHC para ocho marcadores relacionados con el metabolismo (^[41], ^[42])—GLUT1, DLAT, LDHA, MCT4, PKM2, HIF-1α, MCT1 y AKT—para evaluar sus patrones de expresión espacial en las subregiones tumorales definidas por DMI. Se incluyó DLAT como el componente E2 del complejo de deshidrogenasa del piruvato (PDHC), que representa un marcador accesible por histología de la maquinaria de oxidación del piruvato mitocondrial. Los roles funcionales y las vías metabólicas asociadas de estos marcadores relacionados con el metabolismo se resumen en la tabla S3. Con base en la agrupación de vóxeles in vivo del enriquecimiento de glucosa y la acumulación de lactato, el tumor post mortem se segmentó espacialmente en las cuatro subregiones metabólicas HG + HL, HG + LL, LG + HL y LG + LL (fig. 5C).

Cuatro marcadores clave relacionados con el metabolismo (GLUT1, DLAT, MCT4 y LDHA) revelaron patrones de expresión distintos en estas subregiones definidas por DMI (fig. 5D). La cuantificación de la densidad óptica integrada (IOD) reveló diferencias significativas en la expresión de GLUT1, DLAT, LDHA y MCT4 en las subregiones metabólicas definidas por DMI (fig. 5, E a H). La expresión de GLUT1 y DLAT fue significativamente mayor en las áreas HG que en las áreas LG, independientemente del estado del lactato. Este hallazgo apoya una asociación espacial entre el enriquecimiento de glucosa definido por DMI y la manipulación de glucosa/maquinaria de oxidación del piruvato mitocondrial, en lugar de probar directamente un aumento de la captación intracelular de glucosa o el flujo oxidativo. Por el contrario, la expresión de LDHA y MCT4 fue significativamente mayor en las áreas HL, lo que apoya una asociación espacial entre las señales de lactato definidas por DMI y los programas de producción/manipulación de lactato. Aún así, estas señales de lactato locales de DMI deben interpretarse como un reflejo de un conjunto de lactato etiquetado neto determinado por una interacción entre la producción, la retención, la exportación, la eliminación y la posible reutilización (tabla S4). Los análisis de correlación espacial (fig. 5, I a L) respaldaron aún más estos hallazgos: la AUC de glucosa se correlacionó positivamente con GLUT1 (r = 0,7250, P < 0,001) y DLAT (r = 0,7092, P < 0,001), mientras que la AUC de lactato se correlacionó con LDHA (r = 0,7692, P < 0,001) y MCT4 (r = 0,7497, P < 0,001). En conjunto, estos resultados establecen una fuerte correspondencia espacial y funcional entre los fenotipos metabólicos definidos por DMI y la expresión de los marcadores clave relacionados con el metabolismo, lo que valida la capacidad del DMI para resolver de forma no invasiva subregiones tumorales bioquímicamente distintas in vivo.

Se examinaron cuatro marcadores adicionales relacionados con el metabolismo (PKM2, HIF-1α, MCT1 y AKT), pero no mostraron diferencias y/o correlaciones significativas para las cuatro subregiones (fig. S10). Además de estos resultados enzimáticos, los resultados de IHC basados en IOD se analizaron aún más en todos los tumores C26 incluidos con un registro de resonancia magnética-histología aceptable (n = 8), y se realizó un análisis de correlación con los resultados cuantitativos de agrupamiento (AUC) obtenidos por DMI. Los resultados generales fueron similares a los de los tumores individuales mencionados anteriormente (fig. S11), mostrando también correlaciones estadísticamente significativas.

El DMI de alta resolución revela heterogeneidades metabólicas intertumorales con diferentes subtipos de tumores

La identificación precisa de los subtipos de tumores es esencial para el diagnóstico, el pronóstico y la selección del tratamiento personalizados del cáncer. Los enfoques convencionales, como la biopsia seguida de IHC o la secuenciación de nueva generación, aunque potentes, son invasivos y están sujetos a sesgos de muestreo. Por lo tanto, decidimos explorar si los descriptores cuantitativos de la heterogeneidad metabólica intratumoral también podrían discriminar los subtipos de tumores, extendiendo así el análisis de la heterogeneidad intratumoral a la intertumoral. Con este fin, se seleccionaron y exploraron dos subtipos de tumores de cáncer de colon, C26 y CT26, mediante un análisis de la curva característica del receptor (ROC) (^[43]). La figura 6A ilustra las imágenes ponderadas en T2; los mapas de señales de agua, glucosa y lactato derivados del DMI; y los resultados de la partición metabólica obtenidos mediante el agrupamiento k-medias para ambos modelos de tumores. Los análisis cuantitativos de los valores medios de AUC de glucosa y lactato (fig. 6, B y C) muestran que los valores medios de AUC de glucosa y lactato en los tumores C26 fueron estadísticamente más altos que en los tumores CT26 (glucosa: C26, 163,2 ± 14,8; CT26, 86,21 ± 10,1; lactato: C26, 155,9 ± 9,8; CT26, 106,9 ± 13,5. P < 0,01, ***P < 0,001). Los análisis ROC (fig. 6, D y E) también demuestran que los valores medios de AUC tienen una clara capacidad de clasificación de tumores (glucosa: AUCROC = 0,91; lactato: AUCROC = 0,83). Como en el párrafo anterior, la naturaleza de alta resolución de los datos de DMI también se combinó aquí con el agrupamiento no supervisado, para cuantificar la heterogeneidad intratumoral utilizando las métricas de AUC de glucosa y lactato que separan las distintas áreas metabólicas. La figura 6 (F y G) presenta una comparación cuantitativa de la AUC de glucosa y lactato (concentraciones integradas) en las distintas áreas metabólicas. Los resultados revelan que la concentración de glucosa en el área HG + HL fue significativamente mayor en los tumores C26 que en los tumores CT26 (P < 0,0001), mientras que las concentraciones de lactato no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las áreas. La figura 6H compara aún más las fracciones volumétricas de las distintas particiones metabólicas dentro de toda la masa tumoral. Esto muestra que la región LG + LL representa una proporción significativamente mayor de los tumores CT26 que de los tumores C26 (P < 0,01), lo que apoya aún más la menor actividad metabólica general característica de CT26.

Para evaluar la capacidad predictiva de estas distintas características metabólicas para diferenciar los subtipos de tumores, también se realizaron análisis ROC en las subregiones agrupadas. La figura 6 (de la I a la M) muestra las curvas ROC con valores AUC (AUCROC) mayores de 0,8, incluyendo la concentración de glucosa en la región HG + HL (AUCROC = 0,92), la concentración de glucosa en el área LG + HL (AUCROC = 0,82), el tamaño fraccional de la región HG + HL dentro del tumor (AUCROC = 0,83), el tamaño fraccional de HG + LL dentro del tumor (AUCROC = 0,81) y el tamaño fraccional de LG + LL dentro del tumor (AUCROC = 0,94; las curvas ROC de todas las características se muestran en la fig. S12). De todas estas, el tamaño fraccional de la región LG + LL evidenció el mayor poder discriminatorio, seguido de la concentración de glucosa en la región HG + HL; esto destaca nuevamente que el máximo enriquecimiento de glucosa y la extensión de las áreas de bajo metabolismo son determinantes clave que distinguen los tumores C26 de los tumores CT26. Se proporcionan más diferencias en las distribuciones de AUC entre los dos tipos de tumores en la fig. S13.

Por último, también se realizaron experimentos de apoyo en las líneas celulares individuales (fig. S14), que, como mostró el DMI, indicaron que las células C26 tenían una mayor glucólisis (glucólisis basal: C26, 605,1 ± 24,0; CT26, 364,7 ± 40,0; glucólisis compensatoria: C26, 1716,0 ± 44,1; CT26, 1674,0 ± 168,3; tasa de eflujo de protones de la glucólisis: C26, 65,78 ± 1,06; CT26, 51,57 ± 1,46. ns, no significativo, *P < 0,001, **P < 0,0001) y una respiración mitocondrial más débil (respiración basal: C26, 268,1 ± 17,52, CT26, 363,8 ± 29,11; respiración máxima: C26, 386,5 ± 23,37; CT26, 584,3 ± 66,52; capacidad respiratoria de reserva: C26, 118,4 ± 8,93; CT26, 220,5 ± 38,71, *P < 0,05) que las células CT26, lo que indica notables diferencias en la actividad metabólica.

DMI de alta resolución habilitado por bSSFP multifrecuencia

Para mejorar suficientemente la resolución espacio-temporal del DMI y caracterizar las heterogeneidades metabólicas del tumor, es necesario aumentar su sensibilidad por unidad de tiempo. Para este fin, recurrimos a experimentos de bSSFP que han demostrado proporcionar una sensibilidad superior del DMI y los modificamos en una versión de bSSFP multifrecuencia (MF) (fig. 2A), capaz de separar las tres señales 2H principales que surgen en este experimento: agua, glucosa y lactato. Al igual que sus contrapartes de imagen de desplazamiento químico (CSI) o bSSFP de múltiples ecos (ME), el bSSFP-MF aprovecha las favorables relaciones T2/T1 de los metabolitos deuterados y la escasez espectral intrínseca del DMI para mejorar la relación señal/ruido (SNR). Sin embargo, el bSSFP-MF reemplaza la evolución espectral explotada por el bSSFP-ME y el bSSFP-CSI con adquisiciones orientadas a la imagen que se llevan a cabo en una serie de desplazamientos predefinidos y optimizados (fig. 2A, izquierda). Dado que la imagen de bSSFP de cada metabolito tendrá una fase diferente para cada desplazamiento, las combinaciones lineales adecuadas de estas adquisiciones de frecuencia variable pueden separar sus imágenes individuales. Para maximizar la SNR y la separabilidad espectral, es necesario optimizar los parámetros de adquisición experimental, principalmente el tiempo de repetición (TR), el ángulo de inversión y los desplazamientos de frecuencia que definen la fase general de las imágenes de cada metabolito; esto se hizo basándose en los desplazamientos químicos conocidos a priori de los metabolitos (fig. S1). La búsqueda resultante produjo parámetros de adquisición para cinco desplazamientos con perfiles de magnitud y fase característicos (fig. 2A, centro), a partir de los cuales una reconstrucción iterativa basada en combinaciones lineales pudo resolver con éxito las distribuciones espaciales de cada metabolito, al tiempo que se tienen en cuenta las heterogeneidades del campo B0 y los efectos T2.

Los resultados experimentales obtenidos con un esquema de este tipo se validaron aún más con un fantasma tridimensional (3D) impreso que contenía tres letras con forma de "A", "P" y "M", rellenas con 2H2O (40 mM), [6,6'-2H2]glucosa (20 mM) y [3,3,3-2H3]-lactato (20 mM), respectivamente (fig. 2B). Las imágenes de magnitud y fase 2H representativas adquiridas en cinco desplazamientos de frecuencia optimizados (±190, ±110 y 0 Hz; fig. S2) exhibieron intensidades de señal de magnitud uniformes, pero contrastes dependientes de la frecuencia distintos. Estas firmas de fase únicas permitieron una clara diferenciación de los metabolitos y proporcionaron la base para la separación espectral en la canalización de reconstrucción (fig. 2A). Para comparar el rendimiento del bSSFP-MF con el CSI convencional, comparamos los mapas de metabolitos resueltos espacialmente a varias resoluciones (fig. 2B). El CSI a una resolución de matriz de 16 × 16 no logró capturar los detalles finos del fantasma, y aunque el aumento de la resolución a 32 × 32 mejoró marginalmente la claridad espacial, esto condujo a una degradación sustancial de la SNR, especialmente para el lactato. Por el contrario, el bSSFP-MF a resoluciones de 32 × 32 y 40 × 40 logró tanto una alta fidelidad espacial como una clara separación de los metabolitos, manteniendo una fuerte SNR incluso para el lactato de baja concentración para tiempos de escaneo y condiciones de resolución espacial idénticos. Los análisis cuantitativos de la SNR en cinco mediciones repetidas se muestran en la fig. 2C. El bSSFP-MF logró mejoras de 2,8 veces, 4,1 veces y 3,7 veces sobre el CSI para el agua (CSI: 20,2 ± 1,1; bSSFP-MF: 56,3 ± 1,2), la glucosa (CSI: 8,0 ± 0,9; bSSFP-MF: 32,4 ± 0,8) y el lactato (CSI: 8,2 ± 1,0; bSSFP-MF: 30,2 ± 0,7), respectivamente. Además, la SNR de las imágenes de metabolitos reconstruidas coincidió estrechamente con el máximo teórico obtenido mediante el promedio directo de la señal (√5 × media para las imágenes de bSSFP), lo que confirma la alta eficiencia del algoritmo de reconstrucción iterativa utilizado para procesar los datos de bSSFP-MF. La robustez del bSSFP-MF resultante en diferentes niveles de ruido e inhomogeneidad de B0 se demuestra aún más en la fig. S3; las comparaciones con otros métodos se dan en la fig. S4.

El DMI de alta resolución define los compartimentos tumorales necróticos y viables mediante el agrupamiento metabólico no supervisado

Distinguir las áreas necróticas del tejido tumoral viable es esencial para comprender la progresión del tumor y evaluar la respuesta terapéutica. Con este fin, aplicamos el enfoque DMI optimizado descrito anteriormente en ratones con un modelo de cáncer de colon subcutáneo y cuantificamos la distribución dinámica de los metabolitos utilizando mapas de AUC para el agua deuterada, la glucosa y el lactato. Los patrones espaciales resultantes revelaron marcadas heterogeneidades metabólicas intratumorales (fig. 3). Los compartimentos metabólicos espacialmente distintos se pudieron establecer mediante análisis no supervisados de los mapas de AUC de glucosa y lactato, utilizando el agrupamiento k-medias. Las áreas metabólicamente activas exhibieron una acumulación dependiente del tiempo sustancial de las señales de glucosa y lactato, lo que es consistente con una glucólisis activa. Por el contrario, las áreas metabólicamente inactivas mostraron una reducción marcada del enriquecimiento de metabolitos, lo que refleja una actividad metabólica suprimida. Para validar aún más estos hallazgos, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) en los mapas de metabolitos dinámicos, reduciendo las series temporales de glucosa y lactato a 10 dimensiones, seguido de su agrupamiento utilizando un modelo de mezcla gaussiana (GMM). La segmentación basada en GMM coincidió estrechamente con los resultados de k-medias, y ambos exhibieron una fuerte correspondencia con las características histopatológicas (fig. S5). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) confirmó que el área metabólicamente inactiva definida por el DMI correspondía al tejido necrótico, caracterizado por una desintegración celular generalizada y la picnosis nuclear. Por el contrario, el área metabólicamente activa identificada por el DMI correspondía al tejido viable que mostraba células tumorales densamente empaquetadas y mitóticamente activas (fig. 3). Se realizó la correspondencia histológica utilizando secciones (grosor de 4 μm) obtenidas cerca del plano central del DMI (6 mm).

El DMI de alta resolución revela heterogeneidades metabólicas mesoscópicas dentro de los compartimentos tumorales viables

La combinación del DMI de alta resolución con un algoritmo de agrupamiento no supervisado también nos permitió discernir las heterogeneidades en la actividad metabólica dentro de los compartimentos tumorales viables. La figura 4 ilustra esto con datos de DMI de alta resolución y los resultados del agrupamiento no supervisado, para un modelo de tumor subcutáneo en ratones. A diferencia de los experimentos en la fig. 3, este tumor no exhibió una necrosis extensa, como lo confirmó la tinción con H&E (fig. S6). A pesar de la ausencia de grandes áreas necróticas, la alta resolución espacio-temporal del DMI reveló claramente una pronunciada heterogeneidad intratumoral, especialmente en el enriquecimiento de glucosa y la acumulación de lactato (fig. 4A). En contraste con la glucosa y el lactato, el agua deuterada no se incluyó en el presente análisis de agrupamiento, ya que se encontró que reflejaba una mezcla de acumulación de etiquetas en todo el cuerpo, contenido de agua perfusión/vascular y procesos de intercambio, en lugar de una lectura espacialmente específica del flujo glucolítico local a la escala del vóxel. Por lo tanto, no se agregó mucha información al comparar los resultados con o sin la inclusión de la información de AUC (agua). (fig. S7). Por lo tanto, el agrupamiento k-medias aplicado a los mapas de AUC de glucosa y lactato identificó cuatro fenotipos metabólicos distintos, con el número óptimo de grupos (K = 4) determinado utilizando el método del codo (fig. 4B). La distribución de vóxeles de los valores normalizados de glucosa y lactato (fig. 4C) asoció estos datos agrupados por k-medias a uno de cuatro posibles fenotipos: HG + HL: alto enriquecimiento de glucosa, alta acumulación de lactato; HG + LL: alto enriquecimiento de glucosa, baja acumulación de lactato; LG + HL: bajo enriquecimiento de glucosa, alta acumulación de lactato; y LG + LL: bajo enriquecimiento de glucosa, baja acumulación de lactato. Estos grupos parecen estar localizados espacialmente dentro del tumor (fig. 4D).

Las curvas de concentración de glucosa y lactato resueltas en el tiempo para 12 ratones con tumores implantados con C26 (fig. 4, E y F) también demuestran claras distinciones cinéticas entre estos grupos. La cuantificación de los valores de AUC reveló un enriquecimiento de glucosa significativamente mayor en las áreas HG + HL y HG + LL en relación con LG + HL y LG + LL (fig. 4G), y una acumulación de lactato elevada en HG + HL y LG + HL en comparación con HG + LL y LG + LL (fig. 4H). El agrupamiento k-medias y los análisis cuantitativos realizados en una cohorte diferente de ratones con cáncer, 10 animales con tumores implantados con CT26, utilizando los mismos métodos, produjeron resultados similares a los de la cepa C26 (fig. S8).

Para explorar si la dinámica metabólica podría analizarse más allá de las características estáticas de AUC, se aplicó un marco de PCA-GMM a los datos de DMI. Los primeros cuatro componentes principales extraídos de las series temporales de glucosa y lactato revelaron patrones de varianza temporal dominantes (fig. 4I). El agrupamiento basado en GMM en el espacio de componentes reducido identificó agrupaciones de fenotipos consistentes (fig. 4J), y los mapas de probabilidad resultantes (fig. 4K) produjeron una clasificación suave de los vóxeles tumorales, lo que refleja una heterogeneidad continua. Las evaluaciones cuantitativas de los dos métodos de agrupamiento, k-medias y PCA-GMM (tablas S1 y S2), muestran características espaciales en común y demuestran la capacidad del DMI de alta resolución para resolver de forma no invasiva fenotipos metabólicos dinámicos y espacialmente distintos en tumores viables, independientemente de las estadísticas utilizadas en el análisis.

Los subregiones metabólicas definidas por DMI se corresponden estrechamente con la expresión de marcadores relacionados con el metabolismo

Para validar la heterogeneidad intratumoral revelada por la DMI de alta resolución, se realizó inmunohistoquímica (IHC) en las secciones del tumor C26 después de la imagenología in vivo. Las imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 se coregistraron con las secciones histológicas correspondientes para permitir la correlación espacial. La fiabilidad del coregistro se evaluó calculando el coeficiente de similitud de Dice (DSC); solo se incluyeron para el análisis posterior los tumores con un buen coregistro (DSC ≥ 0,80), y se descartaron los tumores con un coregistro deficiente (fig. S9). La figura 5 muestra los resultados de un ejemplo con un buen coregistro. Las áreas definidas por la resonancia magnética ponderada en T2 (contornos rojos) mostraron una fuerte concordancia espacial con las áreas anotadas histológicamente (contornos azules), proporcionando una validación bioquímica específica de la región (fig. 5C). Se realizó tinción IHC para ocho marcadores relacionados con el metabolismo (^[41], ^[42])—GLUT1, DLAT, LDHA, MCT4, PKM2, HIF-1α, MCT1 y AKT—para evaluar sus patrones de expresión espacial en las subregiones tumorales definidas por la DMI. DLAT se incluyó como el componente E2 del complejo piruvato deshidrogenasa (PDHC), representando un marcador accesible por histología de la maquinaria de oxidación del piruvato mitocondrial. Los roles funcionales y las vías metabólicas asociadas de estos marcadores relacionados con el metabolismo se resumen en la tabla S3. Basándose en la agrupación voxel a voxel in vivo del enriquecimiento de glucosa y la acumulación de lactato, el tumor post mortem se segmentó espacialmente en las cuatro subregiones metabólicas HG + HL, HG + LL, LG + HL y LG + LL (fig. 5C).

Cuatro marcadores clave relacionados con el metabolismo (GLUT1, DLAT, MCT4 y LDHA) revelaron patrones de expresión distintos en estas subregiones definidas por la DMI (fig. 5D). La cuantificación de la densidad óptica integrada (IOD) reveló diferencias significativas en la expresión de GLUT1, DLAT, LDHA y MCT4 en las subregiones metabólicas definidas por la DMI (fig. 5, de la E a la H). La expresión de GLUT1 y DLAT fue significativamente mayor en las áreas HG que en las áreas LG, independientemente del estado del lactato. Este hallazgo apoya una asociación espacial entre el enriquecimiento de glucosa definido por la DMI y la maquinaria de manejo de la glucosa/oxidación del piruvato mitocondrial, en lugar de demostrar directamente un aumento de la captación intracelular de glucosa o del flujo oxidativo. Por el contrario, la expresión de LDHA y MCT4 se elevó significativamente en las áreas HL, lo que apoya una asociación espacial entre las señales de lactato definidas por la DMI y los programas de producción/manejo de lactato. Aún así, estas señales locales de lactato de la DMI deben interpretarse como un reflejo de un conjunto neto de lactato marcado determinado por la interacción entre la producción, la retención, la exportación, la eliminación y la posible reutilización (tabla S4). Los análisis de correlación espacial (fig. 5, de la I a la L) respaldaron aún más estos hallazgos: el AUC de glucosa se correlacionó positivamente con GLUT1 (r = 0,7250, P < 0,001) y DLAT (r = 0,7092, P < 0,001), mientras que el AUC de lactato se correlacionó con LDHA (r = 0,7692, P < 0,001) y MCT4 (r = 0,7497, P < 0,001). En conjunto, estos resultados establecen una fuerte correspondencia espacial y funcional entre los fenotipos metabólicos definidos por la DMI y la expresión de los marcadores clave relacionados con el metabolismo, lo que valida la capacidad de la DMI para resolver de forma no invasiva subregiones tumorales bioquímicamente distintas in vivo.

Se examinaron cuatro marcadores adicionales relacionados con el metabolismo (PKM2, HIF-1α, MCT1 y AKT), pero no mostraron diferencias y/o correlaciones significativas para las cuatro subregiones (fig. S10). Además de estos resultados enzimáticos, los resultados de la IHC basados en la IOD se analizaron aún más en todos los tumores C26 incluidos con un registro de resonancia magnética-histología aceptable (n = 8), y se realizó un análisis de correlación con los resultados cuantitativos de la agrupación (AUC) obtenidos por la DMI. Los resultados generales fueron similares a los obtenidos de los tumores individuales mencionados anteriormente (fig. S11), mostrando también correlaciones estadísticamente significativas.

La DMI de alta resolución revela heterogeneidades metabólicas intertumorales con diferentes subtipos de tumores

La identificación precisa de los subtipos de tumores es esencial para el diagnóstico, el pronóstico y la selección del tratamiento personalizados del cáncer. Los enfoques convencionales, como la biopsia seguida de la IHC o la secuenciación de nueva generación, aunque potentes, son invasivos y están sujetos a sesgos de muestreo. Por lo tanto, decidimos explorar si los descriptores cuantitativos de la heterogeneidad metabólica intratumoral también podrían discriminar los subtipos de tumores, extendiendo así el análisis de la heterogeneidad intratumoral a la heterogeneidad intertumoral. Con este fin, se seleccionaron y exploraron dos subtipos de tumores de cáncer de colon, C26 y CT26, mediante el análisis de la curva característica del receptor (ROC) (^[43]). La figura 6A ilustra las imágenes ponderadas en T2; los mapas de señales de agua, glucosa y lactato derivados de la DMI; y los resultados de la partición metabólica obtenidos mediante la agrupación k-medias para ambos modelos de tumores. Los análisis cuantitativos de los valores medios de AUC de glucosa y lactato (fig. 6, B y C) muestran que los valores medios de AUC de glucosa y lactato en los tumores C26 fueron estadísticamente más altos que en los tumores CT26 (glucosa: C26, 163,2 ± 14,8; CT26, 86,21 ± 10,1; lactato: C26, 155,9 ± 9,8; CT26, 106,9 ± 13,5. P < 0,01, ***P < 0,001). Los análisis ROC (fig. 6, D y E) también demuestran que los valores medios de AUC tienen una clara capacidad de clasificación de tumores (glucosa: AUCROC = 0,91; lactato: AUCROC = 0,83). Como en el párrafo anterior, la naturaleza de alta resolución de los datos de la DMI también se combinó aquí con la agrupación no supervisada, para cuantificar la heterogeneidad intratumoral utilizando las métricas de AUC de glucosa y lactato que separan las distintas áreas metabólicas. La figura 6 (F y G) presenta una comparación cuantitativa de la AUC de glucosa y lactato (concentraciones integradas) en las distintas áreas metabólicas. Los resultados revelan que la concentración de glucosa en el área HG + HL fue significativamente mayor en los tumores C26 que en los tumores CT26 (P < 0,0001), mientras que las concentraciones de lactato no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las áreas. La figura 6H compara aún más las fracciones volumétricas de las distintas particiones metabólicas dentro de toda la masa tumoral. Esto muestra que la región LG + LL representa una proporción significativamente mayor de los tumores CT26 que de los tumores C26 (P < 0,01), lo que apoya aún más la menor actividad metabólica general característica de los tumores CT26.

Para evaluar la capacidad predictiva de estas distintas características metabólicas para diferenciar los subtipos de tumores, también se realizaron análisis ROC en las subregiones agrupadas. La figura 6 (de la I a la M) muestra las curvas ROC con valores de AUC (AUCROC) mayores que 0,8, incluyendo la concentración de glucosa en la región HG + HL (AUCROC = 0,92), la concentración de glucosa en el área LG + HL (AUCROC = 0,82), el tamaño fraccional de la región HG + HL dentro del tumor (AUCROC = 0,83), el tamaño fraccional de HG + LL dentro del tumor (AUCROC = 0,81) y el tamaño fraccional de LG + LL dentro del tumor (AUCROC = 0,94; las curvas ROC de todas las características se proporcionan en la fig. S12). Entre todas estas, el tamaño fraccional de la región LG + LL evidenció el mayor poder discriminatorio, seguido de la concentración de glucosa en la región HG + HL, lo que destaca nuevamente que el máximo enriquecimiento de glucosa y la extensión de las áreas de bajo metabolismo son determinantes clave que distinguen los tumores C26 de los tumores CT26. Se proporcionan más diferencias en las distribuciones de AUC entre los dos tipos de tumores en la fig. S13.

Por último, también se realizaron experimentos de apoyo en las líneas celulares individuales (fig. S14), que, como mostró la DMI, indicaron que las células C26 tenían una mayor glucólisis (glucólisis basal: C26, 605,1 ± 24,0; CT26, 364,7 ± 40,0; glucólisis compensatoria: C26, 1716,0 ± 44,1; CT26, 1674,0 ± 168,3; tasa de eflujo de protones de la glucólisis: C26, 65,78 ± 1,06; CT26, 51,57 ± 1,46. ns, no significativo, *P < 0,001, **P < 0,0001) y una respiración mitocondrial más débil (respiración basal: C26, 268,1 ± 17,52, CT26, 363,8 ± 29,11; respiración máxima: C26, 386,5 ± 23,37; CT26, 584,3 ± 66,52; capacidad respiratoria de reserva: C26, 118,4 ± 8,93; CT26, 220,5 ± 38,71, *P < 0,05) que las células CT26, lo que indica notables diferencias en la actividad metabólica.

DISCUSIÓN

La heterogeneidad metabólica es una característica definitoria de la biología del cáncer, que refleja la variabilidad espacial de la administración de nutrientes, la actividad de las vías, la composición celular y la adaptación microambiental en las regiones tumorales. En este estudio, demostramos que la DMI de alta resolución espacio-temporal basada en MF-bSSFP puede proporcionar mapas dinámicos in vivo del enriquecimiento de glucosa marcada y la generación de lactato en modelos de tumores de colon subcutáneos. Cuando se combinan con la agrupación voxel a voxel no supervisada, estos mapas delinearon compartimentos metabólicamente activos e inactivos, resolvieron distintos fenotipos de glucosa/lactato dentro de los tumores viables y produjeron características cuantitativas que diferían entre los tumores C26 y CT26. Estos hallazgos sugieren que los mapas metabólicos derivados de la DMI pueden servir como características de imagen candidatas para caracterizar la heterogeneidad intratumoral y las diferencias metabólicas intertumorales dependientes del modelo. La correspondencia espacial entre los fenotipos definidos por la DMI y las características histológicas/de IHC apoya aún más la relevancia biológica de estas subregiones definidas por la imagen, al tiempo que enfatiza la necesidad de una interpretación cautelosa de los mecanismos subyacentes.

La capacidad de resolver estos fenotipos metabólicos se logró mediante la adquisición de DMI MF-bSSFP. Similar a otros enfoques de DMI basados en bSSFP (^[34], ^[44]), MF-bSSFP explota la alta eficiencia de señal de las adquisiciones de estado estacionario equilibrado y la relativa escasez del espectro de 2H. Sin embargo, en lugar de depender de la codificación espectroscópica completa o de largos tiempos de lectura de decaimiento de inducción libre, MF-bSSFP adquiere imágenes en desplazamientos de frecuencia optimizados y utiliza respuestas de magnitud/fase específicas del metabolito para la reconstrucción multicomponente. Este diseño permite una separación robusta de agua, glucosa y lactato al tiempo que se mantiene una alta resolución espacial en el plano. Al mantener un TR corto y utilizar la codificación multi-desplazamiento con la corrección iterativa de la resonancia fuera de fase, MF-bSSFP también reduce la vulnerabilidad a los artefactos de bandas y a la interferencia entre metabolitos que pueden volverse más pronunciados en las implementaciones de CSI-bSSFP o ME-bSSFP de TR más largo (figs. S15 y S16). Estas características hacen que MF-bSSFP sea particularmente adecuado para la DMI de alta resolución de sistemas de metabolitos escasos, como el experimento de etiquetado de glucosa a lactato estudiado aquí.

Dado que las señales de glucosa y lactato informan sobre diferentes etapas del proceso metabólico de la glucosa marcada, requieren diferentes interpretaciones biológicas. El eje HG/LG representa el enriquecimiento aparente de 2H-glucosa dentro de cada voxel. Tras la administración en bolo de [6,6′-2H2]glucosa, la señal que se observa refleja un conjunto mixto de glucosa que incluye componentes vasculares, extracelulares e intracelulares. Por lo tanto, el alto enriquecimiento de glucosa no debe interpretarse como una medida compartimental específica de la captación intracelular de glucosa; también puede reflejar la administración de sustrato, el volumen vascular, la distribución intersticial o los efectos relacionados con la perfusión. Por el contrario, el 2H-lactato surge de una conversión enzimática de la glucosa marcada y, por lo tanto, está estrechamente relacionado con el procesamiento glicolítico aguas abajo. Aún así, la señal local de lactato también debe considerarse como un conjunto neto de lactato marcado influenciado por la producción, la retención, la eliminación y/o la posible reutilización del metabolito deuterado. Esta distinción motivó nuestro marco de dos ejes, en el que HG/LG describe el enriquecimiento y la disponibilidad del sustrato, mientras que HL/LL describe la acumulación de lactato marcado. El óxido de deuterio de hidrógeno (HDO) no se utilizó como característica de agrupación primaria porque refleja una mezcla de acumulación sistémica de etiquetas, contenido de agua vascular, intercambio tisular y metabolismo local; en consonancia con esta interpretación, la inclusión del AUC de HDO no alteró sustancialmente los resultados de la agrupación.

Esta distinción entre el enriquecimiento de glucosa y la acumulación de lactato es importante para interpretar las asociaciones observadas en la inmunohistoquímica (IHC). Estas asociaciones deben considerarse como correlaciones fenotípicas espaciales, en lugar de pruebas mecanísticas directas. Una mayor expresión de GLUT1 en las regiones HG apoya la relevancia biológica del fenotipo enriquecido en glucosa, pero es poco probable que GLUT1 sea el único determinante de la señal de glucosa medida, ya que la administración vascular y los depósitos extracelulares de glucosa también pueden contribuir. DLAT, el componente E2 de la PDHC, se interpreta aquí como un marcador accesible por histología de la maquinaria de oxidación del piruvato mitocondrial, en lugar de como una medida directa del flujo oxidativo, particularmente porque no se logró un mapeo fiable de Glx. De manera similar, el enriquecimiento de LDHA y MCT4 en las regiones asociadas con el lactato apoya una relación espacial entre los fenotipos de lactato definidos por DMI y los programas de producción/manejo de lactato, pero no establece una relación causal uno a uno con la concentración local de lactato. LDHA refleja la capacidad de producción de lactato, mientras que MCT4 media la exportación de lactato y, en algunas condiciones, podría reducir la retención intracelular de lactato. Por lo tanto, los hallazgos de la IHC respaldan la plausibilidad biológica de las subregiones definidas por DMI, al tiempo que indican que los mecanismos subyacentes son probablemente multifactoriales.

Las diferencias dependientes del modelo entre los tumores C26 y CT26 deben interpretarse como fenotipos metabólicos a nivel tisular, en lugar de asignaciones directas de subtipos moleculares. Las características de glucosa y lactato derivadas de DMI, incluidos tanto los valores medios de AUC metabólicos como los descriptores de heterogeneidad basados en clústeres, difirieron entre estos dos modelos de tumores de colon, lo que es consistente con el concepto más amplio de que los cánceres de colon pueden exhibir fenotipos metabólicos, inmunitarios y estromales distintos. Sin embargo, el DMI de alta resolución proporciona una lectura espacial del enriquecimiento de glucosa y el etiquetado de lactato, no una clasificación molecular directa. Por lo tanto, estos fenotipos de DMI deben considerarse como estados metabólicos integrados del tumor y el microambiente, que involucran células cancerosas, células inmunitarias, componentes estromales, administración vascular y depósitos de metabolitos extracelulares. Esto es particularmente relevante porque estudios previos de perfilamiento inmunitario informaron que los tumores CT26 están más infiltrados por células inmunitarias que los tumores Colon 26/C26, incluido un mayor porcentaje de células inmunitarias CD45+, y exhiben una sensibilidad diferente a la terapia dirigida a la proteína de muerte celular programada 1 (^[45]). Las células inmunitarias pueden consumir glucosa y participar en el metabolismo del lactato, mientras que el lactato derivado del tumor y la acidificación extracelular pueden modular la función de las células inmunitarias y contribuir a los nichos inmunosupresores. Los estudios futuros que combinen DMI con el perfilamiento inmunitario espacial serán importantes para determinar cómo los fenotipos de glucosa y lactato definidos por DMI se relacionan con la infiltración inmunitaria y la respuesta a la inmunoterapia.

Todavía existen varias limitaciones. En primer lugar, aunque MF-bSSFP logró una resolución en el plano de 0,9 mm × 0,9 mm, la adquisición actual utilizó un grosor de corte de 6 mm. Se obtuvieron secciones histológicas e IHC de 4 μm de espesor cerca del plano de imagen central y se utilizaron para la validación espacial del plano central, en lugar de una validación volumétrica completa. Las secciones seriadas representativas de H&E a través del corte de DMI mostraron patrones de tejido viable y necrótico a gran escala ampliamente consistentes (fig. S17), pero cada sección histológica aún representa solo una pequeña fracción del volumen total del corte de DMI. El DMI 3D MF-bSSFP futuro con una resolución mejorada en el plano será importante para una evaluación volumétrica más completa. En segundo lugar, la validación de IHC se realizó solo en el modelo C26 y se diseñó como una validación espacial dentro del tumor, en lugar de una comparación molecular exhaustiva entre los tumores C26 y CT26. Será necesario extender el IHC, el perfilamiento inmunitario y los análisis moleculares espaciales a ambos modelos para aclarar los mecanismos biológicos subyacentes a los fenotipos de DMI dependientes del modelo. En tercer lugar, no se detectó ninguna resonancia de Glx fiable en las condiciones de los espectros de alta resolución actuales (fig. S18). Por lo tanto, el metabolismo oxidativo no se cuantificó directamente mediante las señales de Glx derivadas de DMI, y DLAT se utilizó solo como un sustituto histológico de la maquinaria de oxidación del piruvato mitocondrial. Por último, MF-bSSFP es más adecuado para espectros relativamente escasos con resonancias conocidas y separables. Las aplicaciones que involucran espectros más densos, campos magnéticos más bajos o sustratos deuterados adicionales pueden requerir un modelado espectral, una corrección de B0 y restricciones de reconstrucción más sofisticadas.

En conjunto, estos hallazgos establecen el DMI MF-bSSFP de alta resolución como un enfoque prometedor para resolver de forma no invasiva la heterogeneidad metabólica espacial in vivo. Al combinar el mapeo dinámico de glucosa/lactato con el análisis de fenotipos no supervisado, este marco proporciona información metabólica a nivel tisular que complementa la histología, la IHC y el perfilamiento molecular. La integración futura con la resonancia magnética con contraste dinámico (DCE-MRI), la resonancia magnética de difusión, los protocolos de DMI sensibles a Glx y el perfilamiento inmunitario o molecular espacial deberían mejorar aún más la interpretabilidad biológica de los fenotipos derivados de DMI y respaldar su aplicación en la evaluación de la respuesta al tratamiento y la oncología de precisión.

MÉTODOS

Teoría

Para cada metabolito, la señal bSSFP se puede derivar de las ecuaciones de Bloch y presentarse como (^[46], ^[47]) donde , , , y . Aquí, y dependen del TR y los tiempos de relajación T1 y T2, es el ángulo de inclinación de RF, es el desplazamiento de frecuencia causado por las inhomogeneidades del campo magnético, y es el desplazamiento químico (en unidades de frecuencia). Basándose en este modelo, la señal bSSFP es la suma del perfil de magnitud y fase para cada componente espectral del metabolito, determinado como donde es la intensidad de señal inicial del metabolito, y es el desplazamiento de frecuencia de pulso definido por el usuario. La fórmula muestra que el vector de magnetización en estado estacionario del metabolito se modula no solo por su propio desplazamiento químico, sino también por la frecuencia del pulso; esto definirá una característica respuesta de frecuencia que presenta nulos y bandas de paso periódicos, según lo determinado por el TR, el ángulo de inclinación y los valores de T1 y T2 del tejido presente. Utilizamos esto para separar diferentes imágenes metabólicas, adquiriendo datos bSSFP a varios desplazamientos de frecuencia n = 1, 2, …, N. Las señales resultantes se pueden representar mediante la ecuación 3 donde , , y la matriz de coeficientes con N filas y M columnas se puede calcular utilizando la ecuación 2. Utilizando un enfoque de ajuste de mínimos cuadrados para sistemas de ecuaciones lineales, las señales metabólicas se pueden encontrar mediante el cálculo de la pseudo inversa.

Aunque la distribución del metabolito se puede resolver teóricamente utilizando el método de mínimos cuadrados, la presencia de la inhomogeneidad del campo magnético desconocida en la matriz plantea un desafío. En este trabajo, utilizamos dos técnicas para superar las dificultades asociadas con el método de mínimos cuadrados: (i) medir el mapa del campo B0 utilizando la secuencia 1H-ME_GRE, y (ii) adoptar un enfoque de reconstrucción iterativa. Para obtener más detalles, consulte la sección S1.

Experimentos con fantomas

Se prepararon tres fantomas de metabolitos (2H2O: ∼40 mM, glucosa deuterada: ∼20 mM; y lactato deuterado: ∼20 mM) para evaluar la mejora de la relación señal/ruido (SNR) de MF-bSSFP. Todos los experimentos se adquirieron en un escáner de resonancia magnética de 9,4 T de Bruker BioSpin, y las bobinas 2H fueron bobinas de superficie hechas en casa anidadas dentro de una bobina de volumen 1H de 72 mm. Antes de los experimentos 2H, se adquirieron imágenes estructurales 1H de los fantomas utilizando la secuencia de adquisición rápida con mejora de la relajación (RARE) con los siguientes parámetros: TR = 2500 ms, TE efectivo = 24 ms, ángulo de inclinación = 90°, número de medias = 4, campo de visión (FOV) = 30 × 30 mm2, matriz = 160 × 160, número de cortes = 9 y grosor de corte = 2 mm. Posteriormente, se adquirieron imágenes 2H utilizando MF-bSSFP con los siguientes parámetros: TR = 3,4 ms, ángulo de inclinación = 40°, número de medias = 512, FOV = 30 × 30 mm2, matriz = 32 × 32, número de cortes = 1 y grosor de corte = 4 mm; cinco desplazamientos de frecuencia: -190, -110, 0, 110 y 190 Hz; tiempo de escaneo: 4 min 39 s. Para comparar con otros métodos, también adquirimos imágenes de CSI convencional y CSI-bSSFP con los siguientes parámetros: FOV = 30 × 30 mm2, matriz = 32 × 32, número de cortes = 1 y grosor de corte = 4 mm; ancho de banda espectral/puntos: CSI, 2000 Hz/128 puntos y CSI-bSSFP, 4065 Hz/64 puntos; tiempo de escaneo: CSI, 4 min 24 s y CSI-bSSFP, 4 min 32 s.

Protocolo y procedimientos animales

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Innovación para la Ciencia y la Tecnología de Medición de Precisión, Academia de Ciencias de China (APM23022T) y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado de animales de los Institutos Nacionales de Salud. Se compraron ratones BALB/c (macho, de 5 a 6 semanas) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekín, China), y se estableció un modelo de ratón de cáncer de colon utilizando células C26 y CT26 obtenidas de Wuhan Servicebio Technology Co. Ltd. (Wuhan, China). Los ratones se alojaron en una sala de animales libre de patógenos específicos con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y temperatura y humedad controladas automáticamente.

El flujo de trabajo experimental general se muestra en la fig. S19. Se utilizaron un total de 30 ratones con tumores para establecer dos modelos de tumores de colon subcutáneos: C26 (n = 15) y CT26 (n = 15). Durante el crecimiento del tumor, un ratón con tumor C26 y dos ratones con tumor CT26 murieron antes o durante la imagen. Todos los ratones restantes se sometieron a un escaneo de DMI y a una tinción de H&E. Entre estos animales, se excluyeron dos tumores C26 y tres tumores CT26 de los análisis posteriores debido a la extensa necrosis. Los tumores restantes sin extensa necrosis, incluidos 12 tumores C26 y 10 tumores CT26, se utilizaron para el agrupamiento de fenotipos metabólicos y el análisis ROC para evaluar la heterogeneidad metabólica intratumoral y las diferencias entre modelos. El análisis de IHC se realizó solo en el modelo C26. Entre los 12 tumores C26 utilizados para la tinción de IHC, se excluyeron 4 del análisis de correlación cuantitativa de resonancia magnética-histología porque no se pudo lograr un registro espacial fiable debido a la deformación de la sección, la falta de coincidencia del plano de corte o la mala correspondencia de los límites. Los ocho tumores C26 restantes con una alineación aceptable de resonancia magnética-histología se incluyeron en el análisis de correlación final entre las subregiones metabólicas definidas por DMI y la expresión de marcadores relacionados con el metabolismo.

Imagen in vivo

Los ratones se preanestesaron con isoflurano antes del escaneo. Después de inyectar una aguja de indwelling en su vena de la cola, se colocaron los ratones en posición supina en la cama de escaneo de resonancia magnética de 9,4 T. La temperatura corporal se estabilizó a 38 °C con circulación de agua. Después de fijar los ratones y la bobina, se inició el escaneo de resonancia magnética. Durante el proceso de escaneo, el caudalímetro de oxígeno para el control de la anestesia se ajustó a 0,5 litros/min, y la concentración de gas anestésico isoflurano se mantuvo en aproximadamente el 1,5%. A lo largo del proceso de escaneo, se controló continuamente la frecuencia respiratoria de los ratones y se mantuvo en aproximadamente 45 respiraciones/min.

Para el DMI, la [6,6′-2H2]glucosa (Cambridge Isotopes Laboratories Inc., EE. UU.) se disolvió en solución salina estéril y se administró por vía intravenosa a través de un catéter en la vena de la cola a una dosis de 2 g/kg de peso corporal. La solución se administró como una inyección en bolo controlada durante aproximadamente 60 segundos. La adquisición dinámica de 2H-MRSI se inició inmediatamente antes de la inyección y continuó durante 100 minutos.

Se adquirieron datos 2H utilizando una bobina de superficie 2H dedicada y sintonizada (diámetro, 18 mm) colocada sobre el tumor. Para la localización anatómica y el ajuste de campo, se utilizó una bobina de volumen 1H separada (ortogonal, de dos canales) con un diámetro interno de 72 mm. Las imágenes estructurales se adquirieron utilizando secuencias RARE con los siguientes parámetros: TR = 2500 ms, TE efectivo = 24 ms, ángulo de inversión = 90°, número de promedios = 4, FOV = 30 × 30 mm², matriz = 160 × 160, número de cortes = 9 y grosor de corte = 2 mm. A continuación, se realizó un ajuste de campo local, manteniendo el ancho de banda a la mitad del máximo del pico de agua en el espectro 1H entre 30 y 50 Hz para cada experimento. Después del ajuste de campo, se adquirieron mapas de campo B0 para el posterior procesamiento de datos. Posteriormente, antes de la inyección, se adquirieron datos de espectroscopia no localizada (NSPECT) y de imágenes MF-bSSFP como línea de base. Los parámetros de escaneo de NSPECT fueron los siguientes: TR = 66 ms, ángulo de inversión = 30°, número de promedios = 512, ancho de banda espectral/número de puntos = 2000 Hz/128 puntos, grosor de corte = 6 mm y tiempo de escaneo = 33 s. Los parámetros de escaneo de MF-bSSFP fueron los siguientes: TR = 3,4 ms, ángulo de inversión = 40°, número de promedios = 1100, FOV = 30 × 30 mm², matriz = 32 × 32, número de cortes = 1, grosor de corte = 6 mm; cinco desplazamientos de frecuencia: −190, −110, 0, 110 y 190 Hz; tiempo de escaneo para cada desplazamiento de frecuencia = 2 min.

Agrupamiento no supervisado basado en vóxeles

Los análisis de agrupamiento se implementaron utilizando MATLAB (R2014a, MathWorks, Natick, MA). Primero, se utilizó DMI para obtener las imágenes metabólicas de glucosa deuterada y lactato deuterado en los tejidos tumorales. Para el agrupamiento k-medias, se calculó el AUC de las curvas metabólicas de glucosa y lactato deuterados; luego, se realizó un agrupamiento k-medias sobre el valor de AUC de cada píxel, y el número óptimo de grupos (K value) en el agrupamiento k-medias se determinó utilizando el método del "codo" (^[48]). Las áreas tumorales podrían entonces dividirse en cuatro subregiones metabólicas utilizando el valor K óptimo. Para el análisis PCA + GMM, las 56 imágenes dinámicas de glucosa deuterada y ácido láctico deuterado se redujeron respectivamente a 10 imágenes de componentes principales mediante PCA. Posteriormente, se realizó un agrupamiento GMM sobre las 10 imágenes de componentes principales y, por último, se obtuvieron los mapas de distribución de densidad de probabilidad de las cuatro subregiones metabólicas.

Análisis inmunohistoquímico

Se recolectaron tejidos tumorales de todos los animales después de completar los escaneos de RM/RMI 2H y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, los tejidos tumorales se incluyeron en parafina y, posteriormente, se cortaron en secciones de 4 μm de espesor para la tinción. Después de la desparafinación, las secciones se tiñeron con solución de H&E. La tinción de H&E se realizó en todos los tumores. La tinción IHC para marcadores relacionados con el metabolismo se realizó en la cohorte C26, y solo se incluyeron en el análisis de correlación espacial final los tumores con una buena alineación espacial entre la RM y la histología. Para la evaluación IHC, se utilizaron anticuerpos primarios (Proteintech, Rosemont, IL) contra LDHA, HIF-1α, PKM2, DLAT, GLUT1, AKT, MCT1 y MCT4 para la detección. Las imágenes de HE e IHC se adquirieron utilizando un microscopio Olympus FSX100 (Olympus, Tokio, Japón), se escanearon con un escáner Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Budapest, Hungría) y se analizaron utilizando el software Image-Pro Plus (versión 6.0, Media Cybernetics, Rockville, MD, EE. UU.; U12388-02, HAMAMATSU, Hamamatsu City, Japón).

Procesamiento y análisis de datos

Los espectros de resonancia magnética adquiridos por NSPECT se rellenaron con ceros y se ajustaron utilizando la caja de herramientas AMARES en MATLAB (R2014a, MathWorks, Natick, MA), con el ajuste restringido en función de la información conocida sobre los desplazamientos químicos y anchos de línea relativos. Los picos de metabolitos obtenidos del ajuste se convirtieron en concentraciones basándose en la concentración de agua deuterada de abundancia natural de 10,12 mM y los valores T1/T2 correspondientes. Los datos para las imágenes CSI se obtuvieron aplicando relleno con ceros, filtros de ponderación coincidente (apodización de 3 Hz) en el dominio espectral y una transformada de Fourier 3D. Para los datos experimentales obtenidos de los fantasmas y modelos animales adquiridos mediante bSSFP, se extrajeron las imágenes de magnitud y fase, y se reconstruyeron las imágenes de agua, glucosa y lactato utilizando el algoritmo propuesto en la sección S1, implementado en MATLAB.

Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando Prism v9.0 (GraphPad). Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando análisis de varianza (ANOVA) de una y dos vías. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para analizar la correlación entre la imagen y la patología. La significación estadística se estableció en P < 0,05 después de la corrección para comparaciones múltiples.

Teoría

Para cada metabolito, la señal bSSFP se puede derivar de las ecuaciones de Bloch y presentarse como (^[46], ^[47]) donde , , , y . Aquí, y dependen del TR y los tiempos de relajación T1 y T2, es el ángulo de inversión de RF, es los desplazamientos de frecuencia causados por las inhomogeneidades del campo magnético, y es el desplazamiento químico (en unidades de frecuencia). Basándose en este modelo, la señal bSSFP es la suma del perfil de magnitud y fase para cada componente espectral del metabolito, determinado como donde es la intensidad de señal inicial del metabolito, y es los desplazamientos de frecuencia definidos por el usuario. La fórmula muestra que el vector de magnetización en estado estacionario del metabolito se modula no solo por su propio desplazamiento químico, sino también por la frecuencia del pulso; esto definirá una característica respuesta de frecuencia que presenta nulos y bandas de paso periódicos, según lo determinado por el TR, el ángulo de inversión y los valores T1 y T2 del tejido presente. Utilizamos esto para separar diferentes imágenes metabólicas, adquiriendo datos bSSFP a varios desplazamientos de frecuencia n = 1, 2, …, N. Las señales resultantes se pueden representar mediante la ecuación 3 donde , , y la matriz de coeficientes con N filas y M columnas se puede calcular utilizando la ecuación 2. Utilizando un enfoque de ajuste de mínimos cuadrados para sistemas de ecuaciones lineales, las señales metabólicas se pueden encontrar mediante el cálculo de la pseudo inversa.

Aunque la distribución de los metabolitos se puede resolver teóricamente utilizando el método de mínimos cuadrados, la presencia de la inhomogeneidad del campo magnético desconocida en la matriz plantea un desafío. En este trabajo, utilizamos dos técnicas para superar las dificultades asociadas con el método de mínimos cuadrados: (i) medir el mapa de campo B0 utilizando la secuencia 1H-ME_GRE, y (ii) adoptar un enfoque de reconstrucción iterativa. Para obtener más detalles, consulte la sección S1.

Experimentos con fantasmas

Se prepararon tres fantasmas de metabolitos (2H2O: ∼40 mM, glucosa deuterada: ∼20 mM; y lactato deuterado: ∼20 mM) para evaluar la mejora de la relación señal/ruido (SNR) de MF-bSSFP. Todos los experimentos se adquirieron en un escáner de RM Bruker BioSpin de 9,4 T, y las bobinas 2H fueron bobinas de superficie hechas en casa anidadas dentro de una bobina de volumen 1H de 72 mm. Antes de los experimentos 2H, se adquirieron imágenes estructurales 1H de los fantasmas utilizando la secuencia de adquisición rápida con mejora de la relajación (RARE) con los siguientes parámetros: TR = 2500 ms, TE efectivo = 24 ms, ángulo de inversión = 90°, número de promedios = 4, campo de visión (FOV) = 30 × 30 mm², matriz = 160 × 160, número de cortes = 9 y grosor de corte = 2 mm. Posteriormente, se adquirieron imágenes 2H utilizando MF-bSSFP con los siguientes parámetros: TR = 3,4 ms, ángulo de inversión = 40°, número de promedios = 512, FOV = 30 × 30 mm², matriz = 32 × 32, número de cortes = 1 y grosor de corte = 4 mm; cinco desplazamientos de frecuencia: −190, −110, 0, 110 y 190 Hz; tiempo de escaneo: 4 min 39 s. Para comparar con otros métodos, también adquirimos imágenes de CSI convencional y CSI-bSSFP con los siguientes parámetros: FOV = 30 × 30 mm², matriz = 32 × 32, número de cortes = 1 y grosor de corte = 4 mm; ancho de banda espectral/puntos: CSI, 2000 Hz/128 puntos y CSI-bSSFP, 4065 Hz/64 puntos; tiempo de escaneo: CSI, 4 min 24 s y CSI-bSSFP, 4 min 32 s.

Protocolo y procedimientos en animales

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Innovación para la Ciencia y la Tecnología de Medición de Precisión, Academia de Ciencias de China (APM23022T) y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado de animales de los Institutos Nacionales de Salud. Se compraron ratones BALB/c (macho, de 5 a 6 semanas) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekín, China), y se estableció un modelo de ratón con cáncer de colon utilizando células C26 y CT26 obtenidas de Wuhan Servicebio Technology Co. Ltd. (Wuhan, China). Los ratones se alojaron en una sala de animales libre de patógenos específicos con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y temperatura y humedad controladas automáticamente.

El flujo de trabajo experimental general se muestra en la fig. S19. Se utilizaron un total de 30 ratones con tumores para establecer dos modelos subcutáneos de tumores de cáncer colorrectal: C26 (n = 15) y CT26 (n = 15). Durante el crecimiento del tumor, un ratón con tumor C26 y dos ratones con tumor CT26 murieron antes o durante la imagen. Todos los ratones restantes se sometieron a un escaneo DMI y a una tinción con H&E. Entre estos animales, dos tumores C26 y tres tumores CT26 mostraron una necrosis extensa y se utilizaron para el análisis del compartimento viable/necrótico. Los tumores restantes sin necrosis extensa, incluidos 12 tumores C26 y 10 tumores CT26, se utilizaron para el agrupamiento fenotípico metabólico y el análisis ROC para evaluar la heterogeneidad metabólica intratumoral y las diferencias entre modelos. El análisis IHC se realizó solo en el modelo C26. Entre los 12 tumores C26 utilizados para la tinción IHC, 4 se excluyeron del análisis de correlación cuantitativa de RM-histología porque no se pudo lograr un registro espacial confiable debido a la deformación de la sección, la falta de coincidencia del plano de corte o la mala correspondencia de los límites. Los ocho tumores C26 restantes con una alineación aceptable de RM-histología se incluyeron en el análisis de correlación final entre las subregiones metabólicas definidas por DMI y la expresión de marcadores relacionados con el metabolismo.

Imagen in vivo

Los ratones se preanestesaron con isoflurano antes del escaneo. Después de inyectar una aguja de indwelling en su vena de la cola, los ratones se colocaron en decúbito supino en la cama de escaneo de RM de 9,4 T. La temperatura corporal se estabilizó a 38 °C con circulación de agua. Después de fijar los ratones y la bobina, se inició el escaneo de RM. Durante el proceso de escaneo, el caudalímetro de oxígeno para el control de la anestesia se ajustó a 0,5 litros/min, y la concentración de gas anestésico isoflurano se mantuvo en aproximadamente el 1,5%. Durante todo el proceso de escaneo, se monitoreó continuamente la frecuencia respiratoria de los ratones y se mantuvo en aproximadamente 45 respiraciones/min.

Para el DMI, la [6,6′-2H2]glucosa (Cambridge Isotopes Laboratories Inc., EE. UU.) se disolvió en solución salina estéril y se administró por vía intravenosa a través de un catéter en la vena de la cola a una dosis de 2 g/kg de peso corporal. La solución se administró como una inyección en bolo controlada durante aproximadamente 60 s. La adquisición dinámica de RMI 2H se inició inmediatamente antes de la inyección y continuó durante 100 min.

Se adquirieron datos 2H utilizando una bobina de superficie dedicada de 2H sintonizada (diámetro, 18 mm) colocada sobre el tumor. Para la localización anatómica y el ajuste de campo, se utilizó una bobina de volumen 1H separada (ortogonal, de dos canales) con un diámetro interno de 72 mm. Las imágenes estructurales se adquirieron utilizando secuencias RARE con los siguientes parámetros: TR = 2500 ms, TE efectivo = 24 ms, ángulo de inversión = 90°, número de promedios = 4, FOV = 30 × 30 mm², matriz = 160 × 160, número de cortes = 9 y grosor de corte = 2 mm. A continuación, se realizó un ajuste de campo local, manteniendo el ancho de banda a la mitad del máximo del pico de agua en el espectro 1H entre 30 y 50 Hz para cada experimento. Después del ajuste de campo, se adquirieron mapas de campo B0 para el posterior procesamiento de datos. Posteriormente, antes de la inyección, se adquirieron datos de espectroscopia no localizada (NSPECT) y de imágenes MF-bSSFP como línea de base. Los parámetros de escaneo de NSPECT fueron los siguientes: TR = 66 ms, ángulo de inversión = 30°, número de promedios = 512, ancho de banda espectral/número de puntos = 2000 Hz/128 puntos, grosor de corte = 6 mm y tiempo de escaneo = 33 s. Los parámetros de escaneo de MF-bSSFP fueron los siguientes: TR = 3,4 ms, ángulo de inversión = 40°, número de promedios = 1100, FOV = 30 × 30 mm², matriz = 32 × 32, número de cortes = 1, grosor de corte = 6 mm; cinco desplazamientos de frecuencia: −190, −110, 0, 110 y 190 Hz; tiempo de escaneo para cada desplazamiento de frecuencia = 2 min.

Agrupamiento no supervisado de vóxeles

Los análisis de agrupamiento se implementaron utilizando MATLAB (R2014a, MathWorks, Natick, MA). Primero, se utilizó DMI para obtener las imágenes metabólicas de glucosa deuterada y lactato deuterado en los tejidos tumorales. Para el agrupamiento k-medias, se calculó el AUC de las curvas metabólicas de glucosa deuterada y lactato; luego, se realizó un agrupamiento k-medias sobre el valor de AUC de cada píxel, y el número óptimo de grupos (K value) en el agrupamiento k-medias se determinó utilizando el método del "codo" (^[48]). Las áreas tumorales podrían entonces dividirse en cuatro subregiones metabólicas utilizando el valor K óptimo. Para el análisis PCA + GMM, las imágenes dinámicas de 56 dimensiones de glucosa deuterada y ácido láctico deuterado se redujeron respectivamente a imágenes de componentes principales de 10 dimensiones mediante PCA. Posteriormente, se realizó un agrupamiento GMM sobre las imágenes de componentes principales de 10 dimensiones y, por último, se obtuvieron los mapas de distribución de densidad de probabilidad de las cuatro subregiones metabólicas.

Análisis inmunohistoquímico

Los tejidos tumorales de todos los animales se recolectaron después de completar los escaneos de RM y RMI 2H y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, los tejidos tumorales se incluyeron en parafina y, posteriormente, se cortaron en cortes de 4 μm de espesor para la tinción. Después de la desparafinación, los cortes se tiñeron con solución de H&E. La tinción de H&E se realizó en todos los tumores. La tinción IHC para marcadores relacionados con el metabolismo se realizó en la cohorte C26, y solo se incluyeron en el análisis de correlación espacial final los tumores con una buena alineación espacial entre la RM y la histología. Para la evaluación IHC, se utilizaron anticuerpos primarios (Proteintech, Rosemont, IL) contra LDHA, HIF-1α, PKM2, DLAT, GLUT1, AKT, MCT1 y MCT4 para la detección. Las imágenes de HE e IHC se adquirieron utilizando un microscopio Olympus FSX100 (Olympus, Tokio, Japón), se escanearon con un escáner Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Budapest, Hungría) y se analizaron utilizando el software Image-Pro Plus (versión 6.0, Media Cybernetics, Rockville, MD, EE. UU.; U12388-02, HAMAMATSU, Hamamatsu City, Japón).

Procesamiento y análisis de datos

Los espectros de resonancia magnética adquiridos por NSPECT se rellenaron con ceros y se ajustaron utilizando el conjunto de herramientas AMARES en MATLAB (R2014a, MathWorks, Natick, MA), con el ajuste restringido en función de la información conocida sobre los desplazamientos químicos y los anchos de línea relativos. Los picos de metabolitos obtenidos del ajuste se convirtieron en concentraciones en función de la concentración de agua 2H marcada con abundancia natural de 10,12 mM y los valores T1/T2 correspondientes. Los datos para las imágenes CSI se obtuvieron aplicando relleno con ceros, filtros de ponderación coincidente (apodización de 3 Hz) en el dominio espectral y una transformada de Fourier 3D. Para los datos experimentales obtenidos de fantasmas y modelos animales adquiridos mediante bSSFP, se extrajeron imágenes de magnitud y fase, y se reconstruyeron imágenes de agua, glucosa y lactato utilizando el algoritmo propuesto en la sección S1, implementado en MATLAB.

Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando Prism v9.0 (GraphPad). Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando análisis de varianza (ANOVA) de una y dos vías. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para analizar la correlación entre las imágenes y la patología. La significación estadística se estableció en P < 0,05 después de la corrección para comparaciones múltiples.