Desarrollo de la tecnología de inmunoensayo digital integrado CRISPR/Cas12a para la detección de CD44.

El inmunoensayo digital permite la detección de proteínas a niveles de fg/mL aprovechando los principios de la distribución de Poisson. No obstante, el ruido de Poisson inherente restringe la sensibilidad digital a objetivos que superan las 100 moléculas, lo que impide que los ensayos digitales estándar detecten objetivos por debajo de este umbral. Para superar esta limitación, introducimos una tecnología integrada de inmunoensayo digital CRISPR/Cas12a. En este sistema, la maquinaria CRISPR/Cas12a actúa primero como un amplificador molecular, convirtiendo cada proteína objetivo en múltiples reporteros enzimáticos.

Estas moléculas enzimáticas se cuantifican individualmente mediante un sistema de lectura digitalizado, lo que permite una detección de proteínas ultrasensible. Al aprovechar la amplificación catalítica de CRISPR/Cas12a, el método logra la detección de proteínas con un número de copias inferior a 100, superando eficazmente la barrera de sensibilidad convencional de los inmunoensayos digitales. Validamos este enfoque mediante la detección altamente selectiva y precisa de la proteína CD44. Se observó una respuesta lineal en un rango de concentración de 0,05 a 5 fg/mL, que se ajusta al modelo de calibración: P(X > 0) = 0,1191c + 0,0036.

El límite de detección se determinó en 0,018 fg/mL, equivalente a aproximadamente 36 moléculas de CD44. El método se aplicó además para cuantificar la CD44 en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal, lo que demuestra su gran potencial para su uso clínico en el diagnóstico precoz del cáncer y el seguimiento del tratamiento.