La mapeo espacial de células individuales revela la alteración del microentorno tisular durante los primeros estadios del cáncer colorrectal

La oncogénesis implica una serie compleja de eventos, pero los eventos iniciales que ocurren durante la formación del estado premaligno y la conversión en tumores malignos^[1],^[2] no han sido bien descritos. En particular, los tipos de células y la organización espacial de las células inmunitarias, las células cancerosas, las células del estroma y los componentes de la matriz celular se comprenden de forma deficiente, especialmente en las etapas iniciales de la oncogénesis^[3],^[4]. Esta información es importante, ya que se considera que las células con mutaciones precancerosas están ampliamente distribuidas y el microambiente celular es crucial para comprender la conversión a la oncogénesis y los mecanismos de resistencia a los fármacos.

El adenocarcinoma colorrectal (CRC) es la tercera causa principal de mortalidad por cáncer en los EE. UU.^[7] y un sistema ideal para estudiar los eventos iniciales en la carcinogénesis. Más del 90% de todos los pacientes con CRC presentan mutaciones que afectan la vía de señalización de Wnt, y más del 80% de estos tienen mutaciones en el gen Wnt-antagonista Adenomatous polyposis colitis (APC), que se considera que a menudo es el evento iniciador de la carcinogénesis colorrectal. La proteína APC actúa como un andamio en el complejo de destrucción de la beta ( )-catenina, regulando así la vía de señalización de Wnt, que de otro modo conduciría a la hiperplasia intestinal^[8]–^[10]. En consonancia con el papel central de APC en la formación de pólipos, los individuos con mutaciones inactivadoras germinales en APC presentan el síndrome de cáncer colorrectal hereditario conocido como poliposis adenomatosa familiar (FAP), en el que los pacientes suelen desarrollar 100 o más pólipos en la edad adulta temprana^[11],^[12]. Por lo tanto, un solo paciente puede presentar múltiples pólipos de diferentes tamaños y etapas de desarrollo, todos derivados de una línea germinal común^[13]–^[15]. Como tal, este es un modelo útil para estudiar diferentes etapas de la carcinogénesis temprana en el mismo fondo genético original.

Estudios previos han cartografiado los tipos de células en los pólipos esporádicos y los de los pacientes con FAP utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) y el ensayo para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación (ATAC-seq) y han detectado los tipos de células y los programas de regulación transcripcional dentro de estos pólipos^[16],^[17]. Sin embargo, las diferencias con respecto a la organización espacial celular, la composición de los barrios funcionales, así como los cambios moleculares dentro del microambiente tumoral (TME) de este continuo de la enfermedad, desde el colon sano hasta el adenocarcinoma invasivo, no están bien caracterizadas. En particular, no se ha cartografiado la ubicación de las células inmunitarias, las células madre cancerosas y las células del estroma.

Con el fin de comprender las diferencias dentro de los TME durante el CRC, y como parte de la Red del Atlas Tumoral Humano (HTAN)^[18], hemos realizado un extenso mapeo espacial de células individuales de pólipos premalignos, CRC y mucosa normal (controles sanos no FAP) utilizando la plataforma de imagen multiplexada de células individuales Co-Detection by indEXing (CODEX)^[19],^[20]. A través del perfilado espacial, investigamos la composición y la organización de los tipos de células en la mucosa normal y los pólipos de diferentes etapas, incluidos los adenocarcinomas.

Observamos un aumento de las células similares a las madre, las células endoteliales, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células T reguladoras (Treg) y los macrófagos M2 en los pólipos en etapa temprana en comparación con la mucosa normal sana, lo que sugiere un microambiente precanceroso adecuado para la proliferación de las células tumorales. En contraste, los enterocitos, las células caliciformes, las células de tránsito amplificador (TA) en ciclo y las células asesinas naturales (NK) disminuyen a lo largo del continuo de la enfermedad. En comparación con sus contrapartes en la mucosa FAP y la mucosa normal, los pólipos y los CRC exhiben un mayor número de eventos de neoangiogénesis y una fuerte expresión nuclear de ?-catenina. Dentro de las criptas glandulares de los pólipos FAP, encontramos un aumento de las células madre cancerosas (CSC), así como de las Treg, los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células endoteliales vasculares que potencialmente promueven la supervivencia y la proliferación de las CSC. En el "nido" tumoral de las muestras de adenocarcinoma FAP, encontramos un microambiente inmunosupresor donde las células tumorales están espacialmente separadas de las células inmunitarias. Además, también observamos que los TAM penetran en la región tumoral, promoviendo la angiogénesis y el crecimiento tumoral. Encontramos que los CAF desempeñan una serie de funciones en el apoyo al crecimiento tumoral y se encuentran típicamente cerca de la región inflamatoria dentro de los pólipos y los CRC. En general, nuestros resultados proporcionan información sobre la compleja serie de eventos que ocurren durante las etapas iniciales de la formación neoplásica, lo que puede ser útil en última instancia para la intervención terapéutica y la prevención del cáncer.

Resultados

CODEX genera mapas espaciales de células individuales a partir de muestras de tejido de donantes con FAP y sin FAP

Generamos datos espaciales de células individuales CODEX a partir de 52 muestras (12 mucosa normal (de pacientes no FAP), 16 mucosa FAP, 18 pólipos FAP, 2 adenocarcinomas colorrectales FAP y 4 cánceres colorrectales esporádicos (CRC)) recogidas de 12 individuos afectados por FAP y 8 individuos no FAP (Figura 1a). De 20 donantes, 12 eran hombres y 8 mujeres, y la cohorte consistió en 9 hispanos, 10 europeos y 1 participante negro (Tabla S1). Los rangos de edad fueron de 12 a 78 años. Las muestras se recogieron mediante colectomías. Para la comparación, las muestras de mucosa normal se recogieron de donantes fallecidos. Las muestras se recogieron de las regiones ascendente, transversa, descendente y sigmoide de los colones de pacientes con FAP y sin FAP (Tabla S2).

Los tejidos se analizaron utilizando CODEX con hasta 42 anticuerpos oligo-conjugados que se validaron frente a diferentes proteínas diana (Figura S1a, S1b). La mayoría de los marcadores de tipo celular seleccionados para la imagen CODEX se basaron en datos de ARN de un solo núcleo (snRNA) que identificaron información de expresión génica específica de la célula^[17]. Los anticuerpos se validaron para la especificidad utilizando protocolos optimizados para muestras congeladas frescas (ver métodos; Figura S2). El panel de marcadores de anticuerpos (Tabla S3) se utilizó para teñir muestras de mucosa normal, mucosa FAP, pólipo FAP y pacientes con adenocarcinoma/CRC (Figura 1b). Las imágenes multiplexadas procesadas se segmentaron con la segmentación de células StarDist (integrada dentro del software de análisis de tejidos Qupath) y se implementaron redes neuronales artificiales (ANN) supervisadas y no supervisadas (Figura 1c, 1d). Se identificaron hasta 25 tipos de células en todo el continuo de la enfermedad FAP utilizando las sondas de anticuerpos oligo-conjugados (Figura 1e).

La imagen CODEX muestra cambios en la composición de los tipos de células a lo largo de la transformación maligna

El conjunto de datos resultante de los 52 mapas espaciales se utilizó para cuantificar la composición de los tipos de células en la mucosa normal y los estados de la enfermedad FAP. En general, en los diferentes estados de la enfermedad (mucosa FAP, pólipos FAP, adenocarcinoma FAP y CRC) y incluyendo la mucosa normal como control, observamos un aumento de las células similares a las madre, las células endoteliales, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células B, las células T CD8+, las células T reguladoras (Treg), las células T agotadas (presentes solo en adenocarcinoma/CRC esporádico) y los macrófagos M2. Observamos una disminución de los enterocitos, los enterocitos inmaduros, las células caliciformes, las células de tránsito amplificador (TA), las células TA en ciclo, los fibroblastos y los macrófagos M1 (Figura 1f). Los pólipos recogidos de un paciente con FAP de 26 y 54 años muestran una composición similar de los tipos de células inmunitarias dentro de los folículos linfoides intestinales submucosos (sm-ILF). En ambos casos, observamos células dendríticas (DC), células T CD4+ y CD8+ dobles positivas, expresión del marcador PD1 dentro de los centros germinales y células vasculares en la periferia folicular (Figura S1c). También encontramos que el porcentaje de poblaciones de células similares a las madre dentro de las criptas de la mucosa normal disminuye con el aumento de la edad de los donantes no FAP (coeficiente de Pearson r = 0,9). Sin embargo, incluso en la mucosa FAP, observamos tanto un aumento de las células similares a las madre en comparación con la mucosa sana no FAP, como una disminución de la correlación entre la fracción de células similares a las madre y la edad de los pacientes con FAP (coeficiente de Pearson r = 0,2) (Figura S3). Por ejemplo, un paciente con FAP de 62 años tenía una fracción similar de células similares a las madre que un paciente con FAP de 38 años.

Una mayor función inmunitaria está fuertemente correlacionada con una mayor relación de células T CD4+/CD8+^[24],^[25] y una relación más baja se asocia con un mal pronóstico del cáncer colorrectal^[22],^[23]. Observamos que la relación general de células T CD4+/CD8+ era significativamente mayor en la mucosa normal (Figura S4a). También observamos un mayor número de células T CD4+ que se localizan en el compartimento del estroma dentro de la mucosa FAP en comparación con los pólipos FAP. En contraste, los pólipos FAP exhiben un número relativamente mayor de células T CD8+ que de células T CD4+ y las células T CD8+ tienden a localizarse como linfocitos intraepiteliales (IEL) (Figura S4b).

El macrófago M2 está asociado con la progresión de la enfermedad FAP

Los macrófagos desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis, la erradicación de las células dañadas y la regeneración de los tejidos vasculares^[30]–^[33]. Los dos tipos de macrófagos, M1 y M2, existen en niveles variables dependiendo de las señales del microambiente, y estas células tienden a tener diferentes funciones. Por ejemplo, los macrófagos M1 pueden ser resistentes al tumor, mientras que los macrófagos M2 promueven el crecimiento tumoral^[34],^[35] (Figura 2a). Observamos una mayor proporción de macrófagos M1 dentro de la mucosa normal y FAP. Por el contrario, la proporción de macrófagos M2 aumentó en los pólipos FAP y las muestras de adenocarcinoma/CRC (Figura 2b). La relación macrófago M1:M2 es un determinante importante del pronóstico del cáncer colorrectal y otros trastornos intestinales inflamatorios (IBD)^[36],^[37]. Observamos una mayor relación macrófago M1:M2 en la mucosa normal y FAP y una relación más baja en los pólipos FAP y el adenocarcinoma/CRC esporádico (Figura 2c). También observamos que los macrófagos M1 se colocalizan principalmente con las células T CD4+ activadas. El cálculo del coeficiente de Pearson para la colocalización entre las células T CD4+ activadas y los macrófagos M1 en todas las muestras reveló una correlación significativa (R = 0,719) dentro de la mucosa normal y FAP en comparación con los pólipos FAP y las muestras de adenocarcinoma (P = 0,034; Figura 2d, e). Esta observación se alinea con estudios previos, donde se ha demostrado que los macrófagos M1 regulan la activación de las células T proporcionando las citocinas y otras señales costimuladoras necesarias^[38]–^[40].

La beta-catenina está involucrada tanto en la transcripción génica como en la coordinación de la adhesión célula-célula^[41],^[42]. Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de ?-catenina se asocia con varios cánceres, como el adenocarcinoma colorrectal, el cáncer de pulmón, los tumores mamarios malignos y el cáncer de ovario^[43]–^[45]. Además, las alteraciones en la localización y los niveles de expresión nuclear de ?-catenina (es decir, la acumulación nuclear) se han asociado con la transformación maligna mediante la activación de varios genes diana aguas abajo, como TCF y LEF1^[46]–^[48]. A diferencia de los macrófagos M1, la polarización de los macrófagos M2 promueve la expresión de ?-catenina en las células de tipo macrófago RAW264.7 murino y los macrófagos alveolares^[49]. Observamos expresión membranosa de ?-catenina en la mucosa normal y FAP, donde la población de macrófagos M1 es mayor que la de M2 (Figura 2f). En contraste, observamos una mayor expresión nuclear de ?-catenina en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico FAP que muestran una mayor población de macrófagos M2 (Figura 2g).

Las células cancerosas, que requieren un suministro adecuado de sangre y nutrientes, liberan factores angiogénicos que favorecen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a través de un proceso denominado neoangiogénesis. Este proceso también involucra a la vimentina, una proteína filamentosa de tipo III, que ayuda en la migración, el crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales que recubren los nuevos vasos sanguíneos ^[50], ^[51]. Además, los macrófagos M2 inducidos por IL-4, así como los neutrófilos, expresan el nivel más alto de pro-MMP9, lo que estimula la angiogénesis in vitro ^[52]. En consonancia con estas observaciones, observamos un aumento significativo en la densidad de los vasos sanguíneos en los tejidos afectados por FAP en comparación con la mucosa normal (Figura 2h, i) y también observamos la expresión de la proteína vimentina a lo largo del revestimiento endotelial de los nuevos vasos sanguíneos y microcapilares (que se muestra como formación de ramificaciones), pero no a lo largo de los vasos sanguíneos maduros (Figura 2j, k). ### Las células T reguladoras tienden a localizarse cerca de las células madre cancerosas, que son necesarias para la supervivencia y la proliferación.

El nicho de células madre del colon normal en la base de la cripta glandular es responsable de la homeostasis y la reparación de la capa epitelial intestinal ^[53]–^[55]. Las células madre del CRC (CSCs) tienen características similares a las de las células madre normales del colon; sin embargo, estas células se diferencian de forma aberrante, lo que contribuye al suministro de células tumorales en masa, dependiendo de varias señales del microambiente ^[56]–^[58]. En consonancia con este mecanismo, observamos células de tipo madre dentro de las criptas glandulares tanto en la mucosa de FAP como en las muestras de pólipos de FAP. Además, detectamos un aumento significativo en el porcentaje de células de tipo madre que expresan un marcador de CSC, SOX2, en los pólipos de FAP en comparación con las muestras de mucosa de FAP (Figura 3a).

Las células T reguladoras (Treg) que expresan el factor de transcripción Foxp3 desempeñan un papel fundamental en la promoción de la "stemness" de las células cancerosas gástricas a través de la vía IL13/STAT3 ^[59], ^[60] y también ayudan a reducir las respuestas inmunitarias hiperactivas dentro del microambiente tumoral ^[61], ^[62]. Dentro de los pólipos de FAP, observamos un aumento significativo en el porcentaje de células T de memoria que expresan Foxp3, lo que indica un aumento general de la población de Treg (Figura 3b). De acuerdo con los hallazgos previos de que las Treg proporcionan citocinas e interleucinas (es decir, señales del microambiente) para la supervivencia y la proliferación de las CSC ^[63], ^[64], también observamos una localización similar de las Treg en los pólipos de FAP cerca de la misma región que las CSC (Figura 3c). ### Se encuentra un microambiente inmunosupresor dentro del "nido" tumoral de adenocarcinoma de FAP.

La proliferación de células CSC transformadas permite finalmente que las células malignas se expandan desde la región de la cripta intestinal e invadan otras regiones de tejido circundante. Utilizando un marcador tumoral, el antígeno carcinoembrionario (CEA), observamos una expresión creciente del marcador CEA a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP (Figura 3d), que luego se cuantificó en todas las muestras (Figura 3e). También analizamos un "nido" tumoral incrustado dentro del compartimento estromal de una muestra de un paciente con adenocarcinoma de FAP. Estudios previos han demostrado que las células dentro del "nido" tumoral secretan factores angiogénicos para la angiogénesis tumoral, lo que es necesario para la proliferación ^[65], ^[66]. Detectamos macrófagos asociados al tumor (TAM) ubicados en el frente invasor del tumor, lo que coincide con las observaciones de que los TAM secretan varias citocinas que contribuyen al proceso de angiogénesis tumoral ^[67]–^[69]. Además, nuestros datos de imagen muestran que el "nido" tumoral de la muestra de adenocarcinoma de FAP crea un microambiente inmunosupresor al excluir a la mayoría de las células inmunitarias, como las células T CD8+, las células T CD4+, las células B y las células NK. Sin embargo, se han detectado estas células inmunitarias fuera de la periferia del "nido" tumoral. Además, se han generado mapas de contorno de densidad (un tipo particular de mapa de densidad bidimensional, que representa la densidad de los puntos de datos (que representan células) utilizando líneas de contorno) tanto de las células tumorales CEA+ dentro del "nido" (Figura 3f, panel superior) como de las células inmunitarias ubicadas fuera del "nido" (Figura 3f, panel inferior). También observamos la expresión del ligando de muerte programada 1 (PD-L1) en las células tumorales (Figura 3g) y se ha encontrado que la expresión de esta proteína solo está presente en la mucosa normal y en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico de FAP, y no en la mucosa de FAP y en los pólipos precancerosos (Figura 3h). Los estudios han demostrado que los macrófagos M1 expresan la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), presumiblemente como parte de la respuesta inflamatoria de los macrófagos ^[70]–^[72]. En nuestros datos de imagen CODEX, también observamos macrófagos M1 (que rodean el "nido" tumoral) que expresan la proteína iNOS dentro de los núcleos (Figura 3i) y hay un aumento en la expresión de iNOS en el estroma a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP (Figura 3j). ### Los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) desempeñan un papel esencial en la progresión de la enfermedad de FAP.

El compartimento estromal, que comprende la membrana basal, los fibroblastos, la matriz extracelular, las células inmunitarias y la vasculatura, mantiene tanto los tejidos epiteliales normales como sus contrapartes malignas. Se ha demostrado que los cambios dentro del microambiente estromal en el frente de invasión tumoral conducen a la transdiferenciación de los fibroblastos en fibroblastos asociados al cáncer (CAFs). Se cree que varios citocinas derivadas del tumor, como el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y los factores de crecimiento epidérmicos, son responsables de esta transformación. Los CAF activados dentro del microambiente del pólipo y del tumor también tienen un efecto positivo en la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) y en la polarización de los macrófagos M2, y pueden ayudar en la remodelación de la matriz extracelular ^[75] (Figura 4a). Detectamos fibroblastos inflamatorios (que participan en la respuesta inflamatoria en general; teñidos con podoplanina (PDPN)) y CAFs (específicamente asociados con el desarrollo y la progresión del cáncer; teñidos con versicana (VCAN)) dentro del estroma precanceroso y tumoral, a lo largo de la enfermedad de FAP (Figura 4b). En particular, la expresión de PDPN y VCAN es mayor en los adenocarcinomas/CRC esporádicos (Figura 4c). Investigamos más a fondo si los CAFs están presentes cerca del sitio inflamatorio y son potencialmente responsables de la inflamación en las muestras de tejido colorrectal afectadas por FAP. Tanto los pólipos de FAP como las muestras de tumor se tiñeron con VCAN (marcador de CAF; verde) y PDPN (marcador inflamatorio; rojo), que se analizaron por imagen (Figura 4d). Para cuantificar la superposición (píxeles rojos + píxeles verdes = píxeles amarillos), se generó un gráfico de superficie de la intensidad del marcador para cada uno de estos marcadores, seguido de la computación del coeficiente de correlación cruzada de Vansteelsen (CCF) ^[80], que mide cómo cambia el coeficiente de Pearson después de desplazar el vóxel de la imagen roja sobre el vóxel de la imagen verde en diferentes distancias. Descubrimos que la superposición CCF entre el marcador de CAF (VCAN) y el marcador de fibroblasto inflamatorio (PDPN) aumenta, mientras que la superposición CCF entre el marcador de CAF (VCAN) y el marcador de fibroblasto normal (COL6A2) disminuye en las muestras de adenocarcinoma/CRC de FAP (Figura 4e). Esto indica que los CAFs están presentes en estrecha proximidad a la región inflamatoria dentro de los adenocarcinomas/CRC afectados por FAP.

La imagen CODEX también reveló cómo los CAFs estromales invaden la capa epitelial en las muestras de tumor de FAP, lo que lleva a una mayor propagación de los tumores. Observamos un revestimiento continuo de la membrana basal en la mucosa normal, mientras que las muestras de tumor de FAP tienen una capa de membrana basal interrumpida o mínima (Figura 4f, panel izquierdo). Los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) secretan factores solubles que convierten los proto-miofibroblastos en miofibroblastos. Estos miofibroblastos, en condiciones de estrés, expresan la proteína alfa-actina de músculo liso (α-SMA), lo que resulta en la contracción/remodelación de la matriz extracelular ^[81]. Observamos expresiones similares de la proteína α-SMA de los miofibroblastos (Figura 4f, panel derecho). Además, se ha observado en nuestros datos de imagen que los CAFs también afectan la expresión de la E-caderina (ECAD), que es una proteína de membrana que ayuda a mantener la barrera epitelial al unir las células vecinas para formar tejidos ^[82]. Observamos menos expresión de E-caderina en las células epiteliales glandulares a lo largo de la vía de migración de los CAFs en comparación con las células glandulares más alejadas de la vía de migración de los CAFs, que continúan expresando niveles más altos de esta proteína de adhesión célula-célula (Figura 4g), que se cuantificaron (Figura 4h).

Los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) son una parte integral del sistema inmunitario del cuerpo, identificando y eliminando las células anormales, incluidas las células cancerosas ^[83], ^[84]. En nuestro estudio, observamos una mayor población de CAFs dentro de una muestra de adenocarcinoma de FAP. Sin embargo, el área estromal correspondiente dentro de la misma muestra de tumor con una mayor densidad de CAFs se detectó con un menor número de población de TIL (Figura 4i). En contraste, vemos una correlación inversa entre el número de CAFs y la presencia de TIL porque las muestras de CRC esporádico con menor densidad de CAFs muestran un mayor número de población de TIL (Figura 4i). En general, el porcentaje de TIL que comprende las células T CD4+, las células T CD8+ y las células B plasmáticas disminuyó con el aumento de la población de CAFs. Curiosamente, la alta densidad de CAFs parece no tener ningún efecto sobre la migración o la presencia de las células T reguladoras (Treg) dentro del estroma tumoral tanto de alta como de baja densidad de CAFs (Figura 4j). ### Los análisis de vecindad multicelular de la mucosa de FAP y el pólipo de FAP adyacente muestran diferencias en la composición de la vecindad.

Para comprender cómo cambian las interacciones intercelulares, las densidades celulares y las estructuras multicelulares a lo largo del continuo de la enfermedad, realizamos análisis de vecindad celular ^[88] (Figura 5a). El mapa de calor que refleja el enriquecimiento de los tipos de células que se co-localizan preferentemente reveló 16 estructuras multicelulares significativas, que se clasificaron ampliamente como vecindades epiteliales, estromales e inmunitarias. Seis vecindades que comprenden el epitelio glandular, el epitelio enriquecido con células CEA+, el epitelio enriquecido con neutrófilos, el epitelio secretor, el epitelio maduro y las regiones intraepiteliales CD8+ se clasificaron como vecindades epiteliales. Siete vecindades comprendían células endoteliales, un grupo de mucina estromal, una población de células inmunitarias innatas, miofibroblastos enriquecidos con MYH11, CAFs, microestructuras (vasos sanguíneos) y macroestructuras (células endoteliales linfáticas) se clasificaron como vecindades estromales. El resto de las vecindades, compuestas por folículo interno, folículo externo y un centro de células inmunitarias innatas, se clasificaron como vecindades inmunitarias (Figura 5b).

Para comprender la coasociación espacial de las células en el microambiente precanceroso y su transformación durante la progresión de la enfermedad de FAP, realizamos análisis de vecindad multicelular en pares de muestras de mucosa de FAP y pólipos de FAP adyacentes. Se muestran mapas espaciales representativos de un par de muestras de mucosa de FAP y pólipos de FAP adyacentes del mismo paciente (Figura 5c). Las vecindades de estas secciones de tejido se agruparon (Figura 5d), lo que reveló composiciones de vecindad similares durante la progresión de la enfermedad de la mucosa de FAP al pólipo de FAP, la mucosa de FAP. Sin embargo, observamos una nueva vecindad epitelial enriquecida con neutrófilos, una vecindad epitelial secretora y un folículo interno compuesto principalmente por células B. Nuestra observación de vecindades epiteliales enriquecidas con neutrófilos en la mucosa de FAP (Figura 5e) se ha informado en otros trastornos intestinales (IBD) y se ha asociado con la gravedad de los síntomas de la enfermedad y la alteración de la función de barrera crítica y la interacción neutrófilo-epitelial ^[89]. ### Los cambios en el microambiente tisular a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP.

Los análisis del vecindario multicelular revelaron diferencias en la composición estructural a lo largo del continuo de la enfermedad de poliposis adenomatosa familiar (FAP), así como en la composición de estos vecindarios. En el compartimento epitelial, no observamos cambios en el vecindario epitelial glandular a lo largo de los diferentes estados de la enfermedad de FAP en comparación con la mucosa normal. Sin embargo, los porcentajes de vecindarios enriquecidos en células CEA+, vecindarios enriquecidos en neutrófilos aumentaron, mientras que los vecindarios epiteliales secretores y maduros disminuyeron dentro del compartimento epitelial a lo largo del continuo de malignidad de la FAP. Anteriormente, se ha informado que los linfocitos CD8+ intraepiteliales (LIE) se encuentran en los espacios entre las células epiteliales intestinales y son los primeros en interactuar con los patógenos que atraviesan la barrera epitelial^[91]. Los LIE son esenciales para la regulación de la homeostasis inmune y el mantenimiento de la integridad del epitelio^[92],^[93]. En consonancia con los hallazgos previos^[94],^[95], observamos un aumento de los vecindarios intraepiteliales de células T CD8+ en los estados precancerosos en comparación con los tejidos normales. Curiosamente, este vecindario de LIE disminuyó en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico de FAP (Figura 5f).

Se produce más estroma durante la malignidad, lo que promueve activamente el desarrollo, la invasión y la metástasis del tumor^[96],^[97]. En nuestros datos espaciales, observamos aumentos significativos en el vecindario del estroma, el vecindario de miofibroblastos enriquecido en MYH11+, el vecindario enriquecido en CAF, junto con los vecindarios de microvasculatura y macrovasculatura dentro del microambiente tumoral y precanceroso de la FAP en comparación con las muestras de tejido de mucosa normal (Figura 5g).

Al menos dos vecindarios multicelulares diferentes exhibieron cambios en la prevalencia y la localización de las células T CD4+. La pertenencia de las células T CD4+, las células B y las células dendríticas definió dos estructuras distintas basadas en folículos. Las células T CD4+ fueron más abundantes en la primera de estas estructuras, que se encuentran en las regiones externas del folículo, mientras que las células B fueron más abundantes en las regiones internas del folículo. Se requirió un folículo linfoide completamente desarrollado para el vecindario interno del folículo, también conocido como centro germinal (Figura S1c). Observamos una disminución general de las estructuras del folículo interno en los diferentes estados de la enfermedad de FAP, mientras que las estructuras del folículo externo disminuyeron solo en las muestras de adenocarcinoma (Figura 5h). Un vecindario inmune adaptativo que consiste en células T CD8+ también disminuyó a lo largo del continuo de la enfermedad. Esto puede deberse a una pérdida progresiva del infiltrado inmune adaptativo y al establecimiento de un microambiente progresivamente "frío" desde el punto de vista inmunitario^[98],^[99].

CODEX genera mapas espaciales de una sola célula a partir de muestras de tejido de donantes con y sin FAP

Generamos datos espaciales de una sola célula con CODEX a partir de 52 muestras (12 mucosa normal (de pacientes sin FAP), 16 mucosa de FAP, 18 pólipos de FAP, 2 adenocarcinomas colorrectales de FAP y 4 cánceres colorrectales esporádicos (CRC)) recolectadas de 12 individuos afectados por FAP y 8 individuos no afectados por FAP (Figura 1a). De los 20 donantes, 12 eran hombres y 8 eran mujeres, y la cohorte consistió en 9 hispanos, 10 europeos y 1 participante negro (Tabla S1). Los rangos de edad fueron de 12 a 78 años. Las muestras se recolectaron mediante colectomías. Para la comparación, las muestras de mucosa normal se recolectaron de donantes fallecidos. Las muestras se recolectaron de las regiones ascendente, transversa, descendente y sigmoide de los colones de pacientes con y sin FAP (Tabla S2).

Los tejidos se analizaron utilizando CODEX con hasta 42 anticuerpos conjugados con oligonucleótidos que se validaron frente a diferentes proteínas diana (Figura S1a, S1b). La mayoría de los marcadores de tipo celular seleccionados para la imagen de CODEX se basaron en datos de ARN de un solo núcleo (snRNA) que identificaron información de expresión génica específica de la célula^[17]. Los anticuerpos se validaron para la especificidad utilizando protocolos optimizados para muestras congeladas frescas (ver métodos; Figura S2). El panel de marcadores de anticuerpos (Tabla S3) se utilizó para teñir muestras de mucosa normal, mucosa de FAP, pólipos de FAP y pacientes con adenocarcinoma/CRC (Figura 1b). Las imágenes multiplexadas procesadas se segmentaron con la herramienta de segmentación de células StarDist (integrada dentro del software de análisis de tejidos Qupath) y se implementaron redes neuronales artificiales (RNA) supervisadas y no supervisadas (Figura 1d). Se identificaron hasta 25 tipos de células a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP utilizando las sondas de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos (Figura 1e).

La imagen de CODEX muestra cambios en la composición del tipo celular a lo largo de la transformación maligna

El conjunto de datos resultante de los 52 mapas espaciales se utilizó para cuantificar la composición del tipo celular en la mucosa normal y los estados de la enfermedad de FAP. En general, en los diferentes estados de la enfermedad (mucosa de FAP, pólipos de FAP, adenocarcinoma de FAP y CRC) e incluyendo la mucosa normal como control, observamos un aumento de las células similares a las células madre, los miofibroblastos, las células endoteliales linfáticas, las células endoteliales, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células B, las células T CD8+, las células T reguladoras (Treg), las células T agotadas (presentes solo en adenocarcinoma/CRC esporádico) y los macrófagos M2. Observamos una disminución en los enterocitos, los enterocitos inmaduros, las células caliciformes, las células de tránsito-amplificación (TA), las células TA en ciclo, los fibroblastos y los macrófagos M1 (Figura 1f). Los pólipos recolectados de un paciente de FAP de 26 años y de 54 años muestran una composición similar del tipo celular inmune dentro de los folículos linfoides intestinales submucosos (sm-ILF). Para ambos casos, observamos células dendríticas (DC), células T CD4+ y CD8+ dobles positivas, expresión del marcador PD1 dentro de los centros germinales y células vasculares en la periferia folicular (Figura S1c). También encontramos que el porcentaje de poblaciones de células similares a las células madre dentro de las criptas de la mucosa normal disminuye con el aumento de la edad de los donantes no afectados por FAP (coeficiente de Pearson r = 0,9). Sin embargo, incluso en la mucosa de FAP, observamos tanto un aumento de las células similares a las células madre en comparación con la mucosa sana no afectada por FAP, como una disminución de la correlación entre la fracción de células similares a las células madre y la edad de los pacientes con FAP (coeficiente de Pearson r = 0,2) (Figura S3). Por ejemplo, un paciente de FAP de 62 años tenía una fracción similar de células similares a las células madre en comparación con un paciente de FAP de 38 años.

Una mayor función inmune está fuertemente correlacionada con una mayor relación de células T CD4+/CD8+^[24],^[25] y una relación más baja se asocia con un mal pronóstico del cáncer colorrectal^[22],^[23]. Observamos que la relación general de células T CD4+/CD8+ fue significativamente mayor en la mucosa normal (Figura S4a). También observamos un aumento del número de células T CD4+ que se localizan en el compartimento del estroma dentro de la mucosa de FAP en comparación con los pólipos de FAP. En contraste, los pólipos de FAP exhiben un número relativamente mayor de células T CD8+ que de células T CD4+ y las células T CD8+ tienden a localizarse como linfocitos intraepiteliales (LIE) (Figura S4b).

El macrófago M2 está asociado con la progresión de la enfermedad de FAP

Los macrófagos desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis, la erradicación de las células dañadas y la regeneración del tejido vascular^[30]–^[33]. Los dos tipos de macrófagos, M1 y M2, existen en niveles variables dependiendo de las señales del microambiente, y estas células tienden a tener diferentes funciones. Por ejemplo, los macrófagos M1 pueden ser resistentes al tumor, mientras que los macrófagos M2 promueven el crecimiento tumoral^[34],^[35] (Figura 2a). Observamos una mayor proporción de macrófagos M1 dentro de la mucosa normal y de FAP. Por el contrario, la proporción de macrófagos M2 aumentó en los pólipos de FAP y las muestras de adenocarcinoma/CRC (Figura 2b). La relación macrófago M1:M2 es un determinante importante del pronóstico del cáncer colorrectal y otros trastornos intestinales inflamatorios (TII)^[36],^[37]. Observamos una mayor relación macrófago M1:M2 en la mucosa normal y de FAP y una relación más baja en los pólipos de FAP y el adenocarcinoma/CRC esporádico (Figura 2c). También observamos que los macrófagos M1 se colocalizan principalmente con las células T CD4+ activadas. El cálculo del coeficiente de Pearson para la colocalización entre las células T CD4+ activadas y los macrófagos M1 en todas las muestras reveló una correlación significativa (R = 0,719) dentro de la mucosa normal y de FAP en comparación con los pólipos de FAP y las muestras de adenocarcinoma (P = 0,034; Figura 2d, e). Esta observación se alinea con estudios previos, donde se ha demostrado que los macrófagos M1 regulan la activación de las células T proporcionando las citocinas y otras señales costimuladoras necesarias^[38]–^[40].

La beta-catenina está involucrada tanto en la transcripción de genes como en la coordinación de la adhesión célula-célula^[41],^[42]. Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de la β-catenina está asociada con varios cánceres, como el adenocarcinoma colorrectal, el cáncer de pulmón, los tumores mamarios malignos y el cáncer de ovario^[43]–^[45]. Además, las alteraciones en la localización y los niveles de expresión nuclear de la β-catenina (es decir, la acumulación nuclear) se han asociado con la transformación maligna mediante la activación de varios genes diana posteriores, como TCF y LEF1^[46]–^[48]. A diferencia de los macrófagos M1, la polarización de los macrófagos M2 promueve la expresión de la β-catenina en las células RAW264.7 similares a los macrófagos murinos y los macrófagos alveolares^[49]. Observamos una expresión membranosa de la β-catenina en la mucosa normal y de FAP, donde la población de macrófagos M1 es mayor que la de macrófagos M2 (Figura 2f). En contraste, observamos una mayor expresión nuclear de la β-catenina en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico de FAP que muestran una mayor población de macrófagos M2 (Figura 2g).

Las células cancerosas, que requieren un suministro adecuado de sangre y nutrientes, liberan factores angiogénicos que fomentan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a través de un proceso llamado neoangiogénesis. Este proceso también involucra a la vimentina, una proteína filamentosa de tipo III, que ayuda en la migración, el crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales que recubren los nuevos vasos sanguíneos^[50],^[51]. Además, los macrófagos M2 inducidos por IL-4, así como los neutrófilos, expresan el nivel más alto de pro-MMP9, lo que estimula la angiogénesis in vitro^[52]. En consonancia con estas observaciones, observamos un aumento significativo de la densidad de los vasos sanguíneos en los tejidos afectados por FAP en comparación con la mucosa normal (Figura 2h, i) y también observamos la expresión de la proteína vimentina a lo largo del revestimiento endotelial de los nuevos vasos sanguíneos y microcapilares (que se muestra como formación de ramificaciones), pero no a lo largo de los vasos sanguíneos maduros (Figura 2j, k).

Las células T reguladoras tienden a localizarse cerca de las células madre cancerosas necesarias para la supervivencia y la proliferación

El nicho normal de las células madre del colon en la base de las criptas glandulares es responsable de la homeostasis y la reparación de la capa epitelial intestinal^[53]–^[55]. Las células madre del CRC (CSCs) tienen características similares a las de las células madre normales del colon; sin embargo, estas células se diferencian de manera aberrante, lo que contribuye al suministro de células tumorales a granel dependiendo de varias señales del microambiente^[56]–^[58]. En consonancia con este mecanismo, observamos células similares a las células madre dentro de las criptas glandulares tanto en las muestras de mucosa de FAP como en las de pólipos de FAP. Además, detectamos un aumento significativo del porcentaje de células similares a las células madre que expresan un marcador de CSC, SOX2, en los pólipos de FAP en comparación con las muestras de mucosa de FAP (Figura 3a).

Las células T reguladoras (Treg) que expresan el factor de transcripción Foxp3 desempeñan un papel fundamental en la promoción de la capacidad de las células cancerosas gástricas a través de la vía IL13/STAT3^[59],^[60] y también ayudan a reducir las respuestas inmunitarias hiperactivas dentro del microambiente tumoral^[61],^[62]. Dentro de los pólipos de FAP, observamos un aumento significativo del porcentaje de células T de memoria que expresan Foxp3, lo que indica un aumento general de la población de Treg (Figura 3b). En consonancia con los hallazgos previos de que las Treg proporcionan citocinas e interleucinas (es decir, señales del microambiente) para la supervivencia y la proliferación de las CSC^[63],^[64], también observamos una localización similar de las Treg en los pólipos de FAP cerca de la misma región que las CSC (Figura 3c).

Se encuentra un microambiente inmunosupresor dentro del "nido" tumoral del adenocarcinoma de FAP

SPANISH TRANSLATION:

La proliferación de células transformadas con características similares a las células madre cancerosas (CSC) permite, en última instancia, que las células malignas se expandan desde la región de las criptas intestinales e invadan otras regiones de tejido circundante. Utilizando un marcador tumoral, el antígeno carcinoembrionario (CEA), observamos un aumento en la expresión del marcador CEA a lo largo del continuo de la enfermedad de poliposis adenomatosa familiar (FAP) (Figura 3d), lo cual se cuantificó posteriormente en todas las muestras (Figura 3e). También analizamos un "nido" tumoral incrustado dentro del compartimento estromal de una muestra de adenocarcinoma de FAP. Estudios previos han demostrado que las células dentro del "nido" tumoral secretan factores angiogénicos para la angiogénesis tumoral, lo cual es necesario para la proliferación^[65],^[66]. Detectamos macrófagos asociados al tumor (MAT) ubicados en el frente invasor del tumor, lo cual coincide con las observaciones de que los MAT secretan diversas citocinas que contribuyen al proceso de angiogénesis tumoral^[67]–^[69]. Además, nuestros datos de imagen muestran que el "nido" tumoral de la muestra de adenocarcinoma de FAP crea un microambiente inmunosupresor al excluir a la mayoría de las células inmunitarias, como las células T CD8+, las células T CD4+, las células B y las células NK. Sin embargo, estas células inmunitarias se han detectado fuera de la periferia del "nido" tumoral. Además, se han generado mapas de contorno de densidad (un tipo particular de mapa de densidad bidimensional, que representa la densidad de los puntos de datos (que representan células) utilizando líneas de contorno)) tanto de las células tumorales CEA+ dentro del "nido" (Figura 3f, panel superior) como de las células inmunitarias ubicadas fuera del "nido" (Figura 3f, panel inferior). También observamos la expresión del ligando de muerte programada 1 (PD-L1) en las células tumorales (Figura 3g) y se ha encontrado que la expresión de esta proteína solo está presente en la mucosa normal y en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico de FAP, y no en la mucosa de FAP y en los pólipos precancerosos (Figura 3h). Los estudios han demostrado que los macrófagos M1 expresan óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), presumiblemente como parte de la respuesta inflamatoria de los macrófagos^[70]–^[72]. En nuestros datos de imagen CODEX, también observamos macrófagos M1 (que rodean el "nido" tumoral) que expresan la proteína iNOS dentro de los núcleos (Figura 3i) y existe un aumento en la expresión estromal de iNOS a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP (Figura 3j).

Los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) desempeñan un papel esencial en la progresión de la enfermedad de FAP

El compartimento estromal, que comprende la membrana basal, los fibroblastos, la matriz extracelular, las células inmunitarias y los vasos sanguíneos, mantiene tanto los tejidos epiteliales normales como sus contrapartes malignas. Se ha demostrado que los cambios dentro del microambiente estromal en el frente de invasión tumoral conducen a la transdiferenciación de los fibroblastos en fibroblastos asociados al cáncer (FAC). Se cree que varios citocinas derivadas del tumor, como el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y los factores de crecimiento epidérmicos, son responsables de esta transformación. Los FAC activados dentro del microambiente del pólipo y del tumor también tienen un efecto positivo en la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) y en la polarización de los macrófagos M2, y pueden ayudar en la remodelación de la matriz extracelular^[75] (Figura 4a). Detectamos fibroblastos inflamatorios (que participan en la respuesta inflamatoria en general; teñidos con podoplanina (PDPN)) y FAC (específicamente asociados con el desarrollo y la progresión del cáncer; teñidos con versicana (VCAN)) dentro del estroma precanceroso y tumoral, a lo largo de la enfermedad de FAP (Figura 4b). En particular, la expresión de PDPN y VCAN es mayor en los adenocarcinomas/CRC esporádicos (Figura 4c). Investigamos además si los FAC están presentes cerca del sitio inflamatorio y son potencialmente responsables de la inflamación en las muestras de tejido colorrectal afectadas por FAP. Tanto los pólipos de FAP como las muestras de tumor se tiñeron con VCAN (marcador de FAC; verde) y PDPN (marcador inflamatorio; rojo), y se analizaron por imagen (Figura 4d). Para cuantificar la superposición (píxeles rojos + píxeles verdes = píxeles amarillos), se generó un gráfico de superficie de la intensidad del marcador para cada uno de estos marcadores, seguido de la computación del coeficiente de correlación cruzada de Vansteelsen (CCF)^[80], que mide cómo cambia el coeficiente de Pearson después de desplazar el vóxel de la imagen roja sobre el vóxel de la imagen verde en diferentes distancias. Descubrimos que la superposición CCF entre el marcador de FAC (VCAN) y el marcador de fibroblastos inflamatorios (PDPN) aumenta, mientras que la superposición CCF entre el marcador de FAC (VCAN) y el marcador de fibroblastos normales (COL6A2) disminuye en las muestras de adenocarcinoma/CRC de FAP (Figura 4e). Esto indica que los FAC están presentes en estrecha proximidad a la región inflamatoria dentro de los adenocarcinomas/CRC esporádicos de FAP afectados.

La imagen CODEX también reveló cómo los FAC estromales invaden la capa epitelial en las muestras de tumor de FAP, lo que conduce a una mayor propagación de los tumores. Observamos un revestimiento continuo de la membrana basal en la mucosa normal, mientras que las muestras de tumor de FAP tienen una capa de membrana basal interrumpida o mínima (Figura 4f, panel izquierdo). Los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) secretan factores solubles que convierten los proto-miofibroblastos en miofibroblastos. Estos miofibroblastos, en condiciones de estrés, expresan la proteína alfa-actina de músculo liso (α-SMA), lo que resulta en la contracción/remodelación de la matriz extracelular^[81]. Observamos expresiones similares de la proteína α-SMA de los miofibroblastos (Figura 4f, panel derecho). Además, se ha observado en nuestros datos de imagen que los FAC también afectan la expresión de la cadherina E (ECAD), que es una proteína de membrana que ayuda a mantener la barrera epitelial al unir las células vecinas para formar tejidos^[82]. Observamos una menor expresión de la cadherina E en las células epiteliales glandulares a lo largo de la vía de migración de los FAC en comparación con las células glandulares que están más alejadas de la vía de migración de los FAC, que continúan expresando niveles más altos de esta proteína de adhesión célula-célula (Figura 4g), lo cual se cuantificó (Figura 4h).

Los linfocitos infiltrantes tumorales (LIT) son una parte integral del sistema inmunitario del cuerpo, identificando y eliminando las células anormales, incluidas las células cancerosas^[83],^[84]. En nuestro estudio, observamos una mayor población de FAC dentro de una muestra de adenocarcinoma de FAP. Sin embargo, el área estromal correspondiente dentro de la misma muestra de tumor con una mayor densidad de FAC se detectó con un menor número de población de LIT (Figura 4i). En contraste, vemos una correlación inversa entre el número de FAC y la presencia de LIT porque las muestras de CRC esporádico con una menor densidad de FAC muestran un mayor número de población de LIT (Figura 4i). En general, el porcentaje de LIT que comprende las células T CD4+, las células T CD8+ y las células B plasmáticas disminuyó con el aumento de la población de FAC. Curiosamente, una alta densidad de FAC parece no tener ningún efecto sobre la migración o la presencia de las células T reguladoras (Treg) dentro del estroma tumoral con alta y baja densidad de FAC (Figura 4j).

Los análisis del vecindario multicelular de la mucosa de FAP y el pólipo adyacente de FAP muestran diferencias en la composición del vecindario

Para comprender cómo las interacciones intercelulares, las densidades celulares y las estructuras multicelulares cambian a lo largo del continuo de la enfermedad, realizamos análisis de vecindario celular^[88] (Figura 5a). El mapa de calor que refleja el enriquecimiento de los tipos de células que se co-localizan preferentemente reveló 16 estructuras multicelulares significativas, que se clasificaron ampliamente como vecindarios basados en el epitelio, el estroma y el sistema inmunitario. Seis vecindarios que comprenden el epitelio glandular, el epitelio enriquecido con células CEA+, el epitelio enriquecido con neutrófilos, el epitelio secretor, el epitelio maduro y las regiones intraepiteliales CD8+ se clasificaron como vecindarios epiteliales. Siete vecindarios comprendidos por células endoteliales, el grupo de mucina estromal, la población de células inmunitarias innatas, el miofibroblasto enriquecido con MYH11, el vecindario enriquecido con FAC, las microestructuras (vasos sanguíneos) y las macroestructuras (células endoteliales linfáticas) se clasificaron como vecindarios estromales. El resto de los vecindarios, compuestos por el folículo interno, el folículo externo y el centro de células inmunitarias innatas, se clasificaron como vecindarios inmunitarios (Figura 5b).

Para comprender la co-asociación espacial de las células en el microambiente precanceroso y su transformación durante la progresión de la enfermedad de FAP, realizamos análisis de vecindario multicelular en pares de muestras adyacentes de mucosa de FAP y pólipo de FAP. Se muestran mapas espaciales representativos de un par de mucosa de FAP y pólipos de FAP adyacentes del mismo paciente (Figura 5c). Los vecindarios de estas secciones de tejido se agruparon (Figura 5d), lo que reveló composiciones de vecindario similares durante la progresión de la enfermedad desde la mucosa de FAP hasta el pólipo de FAP, la mucosa de FAP. Sin embargo, observamos un nuevo vecindario epitelial enriquecido con neutrófilos, un vecindario epitelial secretor y un folículo interno compuesto principalmente por células B. Nuestra observación de vecindarios epiteliales enriquecidos con neutrófilos en la mucosa de FAP (Figura 5e) se ha informado en otros trastornos intestinales (EII) y se ha asociado con la gravedad de los síntomas de la enfermedad y la alteración de la función de barrera crítica y la interacción neutrófilo-epitelial^[89].

Cambios en el microambiente tisular a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP

Los análisis de vecindario multicelular revelaron diferencias en la composición estructural a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP, así como en la composición de estos vecindarios. En el compartimento epitelial, no observamos cambios en el vecindario epitelial glandular en los estados de enfermedad de FAP en comparación con la mucosa normal. Sin embargo, los porcentajes de vecindarios enriquecidos con células CEA+, vecindarios enriquecidos con neutrófilos aumentaron, mientras que los vecindarios epiteliales secretores y maduros disminuyeron dentro del compartimento epitelial, a lo largo del continuo de malignidad de FAP. Anteriormente, se ha informado que los linfocitos CD8+ intraepiteliales (LCI) se encuentran en los espacios entre las células epiteliales intestinales y son los primeros en interactuar con los patógenos que cruzan la barrera epitelial^[91]. Los LCI son esenciales para la regulación de la homeostasis inmunitaria y el mantenimiento de la integridad del epitelio^[92],^[93]. Coherente con los hallazgos previos^[94],^[95], observamos un aumento de los vecindarios de células T CD8+ intraepiteliales en los estados precancerosos en comparación con sus contrapartes normales. Curiosamente, este vecindario de LCI disminuyó en las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico de FAP (Figura 5f).

Se produce más estroma durante la malignidad, lo que promueve activamente el desarrollo, la invasión y la metástasis del tumor^[96],^[97]. En nuestros datos espaciales, observamos aumentos significativos en el vecindario estromal, el vecindario de miofibroblastos enriquecido con MYH11, el vecindario enriquecido con FAC junto con los vecindarios de microvasculatura y macrovasculatura dentro del microambiente precanceroso y tumoral de FAP en comparación con las muestras de tejido de mucosa normal (Figura 5g).

Al menos dos vecindarios multicelulares diferentes exhibieron cambios en la prevalencia y la localización de las células T CD4+. La membresía de las células T CD4+, las células B y las células dendríticas definió dos estructuras basadas en folículos distintas. Las células T CD4+ fueron más abundantes en la primera de estas estructuras, que se encuentran en las regiones externas del folículo, mientras que las células B fueron más abundantes en las regiones internas del folículo. Un folículo linfoide completamente desarrollado fue necesario para el vecindario del folículo interno, también conocido como centro germinal (Figura S1c). Observamos una disminución general de las estructuras del folículo interno en los estados de enfermedad de FAP, mientras que las estructuras del folículo externo disminuyeron solo en las muestras de adenocarcinoma (Figura 5h). Un vecindario inmunitario adaptativo que comprende las células T CD8+ también disminuyó a lo largo del continuo de la enfermedad. Esto puede deberse a una pérdida progresiva del infiltrado inmunitario adaptativo y al establecimiento de un microambiente inmunológico progresivamente "frío"^[98],^[99].

Discusión

Los eventos premalignos conducen a cambios anormales que desencadenan los precursores del cáncer y favorecen la iniciación de un tumor^[100],^[101]. Por lo tanto, el estudio del microambiente precanceroso es crucial para un diagnóstico más temprano, nuevas intervenciones y la estratificación del riesgo, lo que mejora la gestión del riesgo tumoral y conduce a posibles estrategias de prevención. Las investigaciones previas sobre la biología del cáncer colorrectal se centraron principalmente en tumores en etapas avanzadas^[102]–^[105] y, en gran medida, han ignorado los eventos precancerosos. Aunque el secuenciamiento de snRNA y ATAC ayuda a comprender las diferencias entre las células individuales, la heterogeneidad celular y los complejos sistemas biológicos, ambas técnicas aíslan las células, lo que resulta en la pérdida de información espacial y contextual importante. Nuestra técnica de imagen multiplexada CODEX llena este vacío al mapear espacialmente las células individuales a lo largo del continuo de la enfermedad de poliposis adenomatosa familiar (FAP), proporcionando así información sobre cómo las células se organizan e interactúan en el microambiente precanceroso e identificando los cambios clave durante la progresión de la enfermedad. Se ha presentado un resumen de los principales hallazgos (Figura 6).

El análisis de la composición de los tipos de células revela un aumento de las células similares a células madre, los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs), los Tregs, los macrófagos M2 y una disminución de las células NK, los macrófagos M1 y las células caliciformes a lo largo del continuo de la enfermedad. Un microambiente precanceroso que favorece el crecimiento de las células cancerosas probablemente se vea favorecido por los cambios observados en la composición de los tipos de células a lo largo del continuo de la enfermedad. Por ejemplo, la disminución de las células caliciformes en las criptas intestinales y el aumento de los CAFs, los Tregs y las células T exhaustas en el estroma favorecen en general un entorno inmunosupresor dentro de los pólipos premalignos y el adenocarcinoma. La identificación de los tipos de células similares dentro de la mucosa normal y la mucosa de FAP muestra una composición diferente de los tipos de células, que es desfavorable para el crecimiento tumoral. La relación CD4+/CD8+ es un indicador importante de la fortaleza general del sistema inmunitario dentro del cuerpo de un paciente. Un mayor número de células T CD4+ en relación con las células T CD8+ contribuye a un sistema inmunitario relativamente más fuerte, mientras que lo contrario indica una respuesta inmunitaria alterada, lo que podría dificultar que el cuerpo combata eficazmente la progresión del tumor^[24],^[25]. Dentro de la población de células inmunitarias, observamos una disminución de la relación de células T CD4+/CD8+ durante la progresión de la enfermedad de FAP. Las células T CD8+ ubicadas en la interfaz del lumen intestinal del colon y el entorno externo no solo ayudan a equilibrar la tolerancia inmunitaria, sino que también protegen la frágil barrera intestinal de la invasión^[26]. También es posible que los pacientes con una relación CD4+/CD8+ más alta (como se observa en la mucosa de FAP en comparación con el pólipo de FAP y el adenocarcinoma/CRC de FAP) tengan un mejor curso clínico, con una supervivencia significativamente mayor a los 5 años^[24],^[25].

También encontramos que el aumento de la población de células similares a células madre dentro de los pólipos precancerosos no se correlaciona con la edad del donante. Esto es de esperar porque las capacidades de autorrenovación de las células similares a células madre se dividen para crear más células madre en los pólipos avanzados, lo cual es esencial para mantener la capacidad de las células madre y la formación de tumores. Sin embargo, las señales de otros tipos de células en las proximidades también determinan si las células madre se autorrenuevan, se diferencian o permanecen quiescentes. En nuestro estudio, encontramos que los Tregs se localizan cerca de las células similares a células madre dentro de los pólipos de FAP y los CRC, lo que desempeña un papel fundamental en la promoción de la capacidad de las células madre, posiblemente proporcionando citocinas e interleucinas para la supervivencia y la proliferación de las CSC. También se han observado células endoteliales vasculares y macrófagos asociados al tumor (TAM) cerca de las CSC, lo que crea aún más un entorno favorable para la proliferación de las células madre. Estudios recientes que involucran el secuenciamiento de ARN de una sola célula del cáncer gástrico y los tejidos adyacentes encontraron que los Tregs se reclutaron en los tejidos del cáncer gástrico y demostraron además que los Tregs promueven la capacidad de las células madre de las células cancerosas gástricas a través de la vía IL13/STAT3^[59],^[60]. Como resultado, encontramos un aumento en la fracción de células similares a células madre que expresan el marcador de cáncer, SOX2, dentro de los pólipos en comparación con la mucosa de FAP. Por lo tanto, sería interesante ver si bloquear la interacción entre los Tregs y las CSC dentro del microambiente precanceroso podría ser un enfoque potencial en el tratamiento del CRC. Dentro del microambiente inmunitario, tanto los macrófagos residentes como los reclutados son moduladores clave durante la progresión del tumor y tienen varias funciones inmunorreguladoras. De manera similar a la relación de células T CD4+:CD8+, la relación de macrófagos M1:M2 también disminuye a lo largo del continuo de la enfermedad de FAP. Encontramos que se produce una mayor polarización M2 en los pólipos avanzados que en la mucosa normal y la mucosa de FAP. Esto es de esperar, ya que M1 es antitumoral y M2 es pro-tumoral^[34]. Además, observamos una mayor población de macrófagos polarizados M2 que tiende a favorecer la expresión nuclear de β-catenina, que normalmente se encuentra en la membrana de las células epiteliales, donde ayuda con la adhesión célula a célula. En el núcleo, la β-catenina se asocia con factores de transcripción de la familia TCF/LEF y dirige la transcripción de los genes diana de Wnt/β-catenina, lo que conduce a la malignidad^[41]. Anteriormente, se ha demostrado que los niveles de ARNm/proteína de β-catenina, Axin2 y c-Myc aumentaron significativamente en los macrófagos M2 en comparación con los macrófagos M0 o M1^[97]. Por lo tanto, interferir con la polarización de los macrófagos durante la etapa precancerosa podría ser un paso decisivo para prevenir la localización nuclear de la β-catenina, lo que a su vez limitaría la transcripción de los genes relacionados con la malignidad.

Los tumores sólidos requieren un suministro sanguíneo suficiente para crecer más allá de unos pocos milímetros de tamaño. Se ha demostrado que las células normales cercanas también son estimuladas por los tumores para producir moléculas de señalización de angiogénesis^[65],^[66]. Encontramos un aumento de la vascularización y los microcapilares dentro de los pólipos de FAP y los tumores en comparación con la mucosa normal y la mucosa de FAP. La mayoría de los estudios han informado de la angiogénesis una vez que se ha establecido el adenocarcinoma invasor^[98]–^[101]. Sin embargo, encontramos que incluso en las etapas premalignas, como la mucosa de FAP y los pólipos de FAP, las células epiteliales tienen una mayor proliferación y, por lo tanto, se esperaría que requieran un mayor suministro de sangre. Por lo tanto, dirigir los vasos sanguíneos en la etapa premaligna con inhibidores de la angiogénesis, como axitinib (Inlyta®), bevacizumab (Avastin®) y cabozantinib (Cometriq®), que reconocen y se unen específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), podría ser una vía eficaz para interrumpir la formación y la progresión de los pólipos precancerosos.

Entre los otros fibroblastos que hemos detectado dentro del compartimento del estroma de los pólipos y tumores precancerosos, los CAFs han sido un componente central del microambiente tumoral, ya que no solo interfieren con la adhesión célula a célula, sino que también interactúan con las células cancerosas a través de moléculas secretadas, influyen en las células cancerosas a través del remodelado de la matriz extracelular (MEC) y la infiltración de células inmunitarias^[102]. Hemos demostrado que los CAFs están presentes cerca de las regiones inflamatorias e inhiben la expresión de la proteína E-caderina, lo que interrumpe la característica de adhesión célula a célula. Además, se ha demostrado que los CAFs influyen en la infiltración inmunitaria. Nuestros datos de imagen muestran que las poblaciones más altas de CAFs en las regiones del estroma solo pueden limitar la entrada de células T CD4+, células T CD8+ y células B plasmáticas en el microambiente tumoral, lo que da como resultado la creación de un entorno inmunosupresor. Por lo general, un estroma alto se asocia con un mal pronóstico de la enfermedad^[96]. Por lo tanto, tanto los CAFs como el alto contenido de estroma podrían haber restringido la infiltración de células inmunitarias. A pesar de que se ha pensado durante mucho tiempo que los CAFs son un factor clave en el desarrollo del cáncer y, por lo tanto, constituyen un atractivo objetivo terapéutico, la mayoría de los ensayos clínicos que intentan dirigirse a los CAFs han fracasado^[103],^[104]. Si bien la investigación actual se centra en encontrar nuevos subconjuntos de CAFs que promueven los tumores y formas de dirigirse específicamente a ellos, es importante tener en cuenta que encontrar poblaciones de CAFs supresoras de tumores y cómo mantienen su equilibrio homeostático también será valioso como futuras terapias dirigidas al estroma. En consecuencia, los enfoques terapéuticos con el potencial de mejorar la supervivencia de los pacientes incluyen normalizar o reestructurar el estroma tumoral en un estado quiescente o incluso en fenotipos supresores de tumores, lo que sería beneficioso.

Dado que se puede utilizar para comprender la composición celular del tejido y encontrar perspectivas para una investigación más profunda, el análisis de la vecindad celular es un buen punto de partida para una variedad de análisis posteriores. Una vez que se han anotado los tipos o estados de células del conjunto de datos, podemos determinar si estas anotaciones están enriquecidas espacialmente. Por lo tanto, podemos encontrar grupos que son vecinos en el tejido de interés calculando un enriquecimiento de la vecindad. En pocas palabras, es una puntuación de enriquecimiento basada en la proximidad espacial de los grupos: los datos de un grupo parecerán estar enriquecidos y tendrán una puntuación alta si son adyacentes con frecuencia a las observaciones de otro grupo. Sin embargo, la puntuación será baja si son vecinos poco frecuentes debido a su distancia entre sí^[88],^[105]. Mediante el análisis de la vecindad celular, hemos encontrado 16 vecindades celulares diferentes en los estados de la enfermedad de FAP. Dentro del compartimento epitelial de la mucosa de FAP, observamos un aumento de la vecindad enriquecida en neutrófilos. Comprender la base molecular y las implicaciones funcionales de las interacciones neutrófilo-epiteliales ha sido durante mucho tiempo de interés porque la migración de neutrófilos a través del epitelio de la mucosa se relaciona con los síntomas de la enfermedad y la interrupción de la función de la barrera crítica en afecciones como la enfermedad inflamatoria intestinal^[106]–^[108]. Observamos un aumento de la vecindad de linfocitos CD8+ intraepiteliales (IEL) dentro del microambiente precanceroso. Debido a que proporcionan vigilancia inmunitaria contra los patógenos, las células T CD8+ dentro del epitelio intestinal (IEL) son esenciales para preservar la integridad de la mucosa intestinal. Sin embargo, su desregulación puede provocar una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y otros trastornos intestinales, lo que hace que sus implicaciones clínicas sean importantes para comprender y tratar estas afecciones^[109],^[110]. En la EII, particularmente en la enfermedad de Crohn, se puede observar un mayor número de IEL CD8+ activados dentro de la mucosa intestinal inflamada, lo que contribuye al daño tisular y la inflamación^[111]. Las muestras de adenocarcinoma/CRC esporádico han mostrado una disminución de la vecindad de IEL CD8+. Esto podría deberse al hecho de que las células tumorales crean un microambiente inmunosupresor y también limitan la migración o infiltración de las células T CD8+. La población de IEL CD8+ no es uniforme y, según sus características fenotípicas y su ubicación tisular, varios subconjuntos pueden tener funciones únicas^[112]. Una mejor comprensión de los distintos subconjuntos y las vías de señalización involucradas en la función de IEL CD8+ puede conducir a nuevos tratamientos que modifiquen la actividad de IEL CD8+ para reducir la inflamación o mejorar la protección inmunitaria^[113].

En general, nuestros datos de imagen espacial de una sola célula demuestran los cambios en la composición de los tipos de células a lo largo de la iniciación de la formación de pólipos a partir de la mucosa y la transición maligna de los pólipos a CRC, ofreciendo información sobre la organización y las interacciones de las células dentro del microambiente precanceroso e impulsando modificaciones importantes durante el curso de la enfermedad. También discutimos algunas posibles intervenciones basadas en estos conocimientos que podrían implementarse dentro del microambiente precanceroso para frenar la iniciación y la progresión del tumor. Se espera que esta investigación tenga un impacto significativo en la comprensión del microambiente precanceroso de FAP, así como de las etapas tempranas de los CRC esporádicos y otras neoplasias gastrointestinales, lo que facilitará la implementación de un tratamiento temprano y posibles intervenciones preventivas.

Detalles del método

Recolección y procesamiento de tejidos

El Comité de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Stanford y el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Washington (que utilizan tejido de mucosa normal de donantes de órganos fallecidos) han aprobado este estudio, el cual cumple con todas las regulaciones éticas aplicables. Para cada participante donante, los familiares más cercanos proporcionaron el consentimiento informado por escrito. Todos los tejidos de pacientes con FAP utilizados en este estudio se obtuvieron de colones resecados quirúrgicamente mediante colectomía total. Los colones de los pacientes se trasladaron directamente desde la sala de operaciones al laboratorio de anatomía patológica del Hospital de Stanford, donde se enjuagaron rápidamente y se bisecaron con tijeras quirúrgicas longitudinalmente sobre una tabla de corte a temperatura ambiente, que es el tipo que se utiliza habitualmente en un laboratorio de anatomía patológica. La mucosa normal adyacente a los pólipos (sin pólipos visibles) y los tejidos de los pólipos se disecaron cuidadosamente del colon, se midieron, se almacenaron en tubos de crioviales y se congelaron rápidamente colocándose las muestras en criotubos directamente en nitrógeno líquido. Los pólipos que tenían un diámetro máximo en cualquier dirección mayor de 10 mm se consideraron "grandes", los que medían entre 10 mm y 5 mm se consideraron "medianos" y los que medían menos de 5 mm se consideraron "pequeños". Todos los pólipos con un diámetro mayor de 10 mm se cortaron en frío, se tiñeron con H&E, se examinaron histopatológicamente por los patólogos del proyecto para evaluar el porcentaje de tejido normal frente a tejido displásico y la presencia de displasia por grado (displasia de bajo grado frente a displasia de alto grado). Los pólipos de menos de 10 mm de tamaño no se sometieron de forma sistemática a este análisis histopatológico, debido a la baja probabilidad de displasia de alto grado en pólipos de este tamaño y a la necesidad de preservar la cantidad muy limitada de tejido disponible para el análisis multi-ómico posterior. Para registrar la ubicación exacta en el colon de donde se obtuvieron las diferentes muestras de tejido de los pacientes A001, A002, A014 y A015, marcamos la ubicación de cada muestra de tejido con una chincheta numerada y tomamos fotografías del lumen colónico bisecado y sujeto con las chinchetas. Utilizando un mortero y una maza de cerámica, pulverizamos las muestras congeladas rápidamente en nitrógeno líquido para crear un polvo fino o pequeños trozos como entrada para cada ensayo multi-ómico. Para un subconjunto de muestras de tejido, los pólipos congelados rápidamente y la mucosa colorrectal se incluyeron en un medio OCT congelado y se cortaron en serie para análisis estructurales 2D. Una vez congeladas rápidamente o incluidas en un medio OCT congelado, el tejido se conservó a -80 grados C hasta que se utilizó para la criosección y los experimentos de imagen CODEX.### Conjugación de anticuerpos CODEX y creación del panel de anticuerpos

La imagen multiplexada CODEX se llevó a cabo utilizando el protocolo de tinción e imagen descrito en el manual del usuario del fabricante. Se ha compartido un protocolo detallado paso a paso para la conjugación personalizada de anticuerpos en protocols.io https://www.protocols.io/edit/protocol-for-custom-conjugation-of-oligo-barcodes-g3k4bykyx. Los paneles de anticuerpos se diseñaron para incluir objetivos que distinguen los subtipos de células epiteliales y estromales intestinales, así como las células del sistema inmunitario innato y adaptativo y las células cancerosas. Se proporciona información detallada del panel en la Tabla S3. Cada anticuerpo se conjugó con un código de barras de oligonucleótido único, y los tejidos se tiñeron con los conjugados de anticuerpo-oligonucleótido siguiendo el protocolo del fabricante. Verificamos que los patrones de tinción en los tejidos de control positivo de amígdala o intestino coincidieran con los establecidos previamente para la inmunohistoquímica. Antes de ser evaluados colectivamente en un solo ciclo múltiple CODEX, los conjugados de anticuerpo-oligonucleótido se evaluaron primero con ensayos de inmunofluorescencia, donde se evaluó la relación señal-ruido, la dilución del anticuerpo y otros aspectos técnicos, como la microfluídica automatizada y el microscopio.### Preparación de las muestras de tejido para la imagen CODEX

Los datos de imagen se obtuvieron de veinte donantes humanos, cada uno de los cuales representó un conjunto de datos. Cada conjunto de datos contiene muestras de tejido de pólipos precancerosos y adenocarcinoma/CRC recolectadas de diferentes secciones del colon (sigmoide, descendente, transverso y ascendente). Los tejidos se congelaron individualmente en moldes de temperatura de corte óptima (OCT) y luego se cortaron en secciones de 5 a 8 m de ancho utilizando un criostato, se ensamblaron en portaobjetos adhesivos Leica Superfrost y se realizó la tinción histológica y/o se almacenaron a -80 °C, hasta que se necesitaran. La tinción histológica se realizó siguiendo el protocolo, que se ha compartido en protocols.io https://www.protocols.io/edit/hematoxylin-and-eosin-staining-h-amp-e-protocol-fo-g3ktbykwp. Los portaobjetos de tejido se procesaron según el protocolo del fabricante. El protocolo detallado se puede encontrar en protocols.io https://www.protocols.io/edit/protocol-for-staining-fresh-frozen-tissue-sections-g3k2bykyf. En resumen, los portaobjetos se obtuvieron del congelador el día del experimento CODEX y se colocaron sobre 1-2 cm de cuentas de Drierite durante 2 minutos, seguido de una incubación de 10 minutos en acetona. La acetona se secó colocando los portaobjetos boca arriba en una cámara húmeda durante 2 minutos. Las secciones de tejido se incubaron en 5 ml de tampón de hidratación durante 2 minutos (dos veces) y se fijaron utilizando 1,6 % de paraformaldehído (PFA) durante 10 minutos, después de lo cual el fijador se eliminó a fondo enjuagando en el mismo tampón de hidratación. Los portaobjetos se incubaron en 5 ml de tampón de tinción durante 20 minutos. Mientras tanto, se preparó una solución de reserva del tampón de bloqueo CODEX mezclando 362 µl de tampón de tinción y 9,5 µl de cada uno de los tampones patentados de la empresa, a saber, N, G, J y S (por 2 muestras). Se calculó el volumen de anticuerpo por portaobjetos de muestra y se restó del tampón de bloqueo CODEX. Se preparó una solución de cóctel de anticuerpos pipeteando cada anticuerpo en el tampón de bloqueo CODEX. Los portaobjetos de muestra se colocaron en la cámara de humedad y se dispensó la solución de tinción del cóctel de anticuerpos (200 µl por muestra de tejido) sobre el portaobjetos y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se eliminaron los anticuerpos no unidos enjuagando los portaobjetos en 5 ml de tampón de tinción durante 2 minutos (dos veces). Las muestras se colocaron en una solución de fijación posterior (1 ml de 16 % de PFA + 9 ml de tampón de almacenamiento) durante 10 minutos y se lavaron a fondo con tampón fosfato salino (PBS) 1x para eliminar el fijador. Posteriormente, las secciones de tejido se fijaron con metanol frío a 5 minutos a 4 °C y se lavaron con PBS 1x. Las muestras se incubaron en un reactivo de fijación final (20 µl de reactivo de fijación CODEX + 1 ml de PBS 1x) durante 20 minutos, se lavaron a fondo con PBS 1x antes de colocarlas en el tampón de almacenamiento (hasta 2 semanas a 4 °C). Mientras tanto, se preparó una placa de reportero para interrogar los anticuerpos de código de barras correspondientes añadiendo agua libre de nucleasas, tampón CODEX 10x, reactivo de ensayo y tinte nuclear. Se dispensaron dos cuarenta microlitros de la solución de reserva en pozos individuales, seguidos de 5 µl de los tintes de reportero correspondientes. Las soluciones de reportero se mezclaron y se pipetaron en pozos individuales de una placa de 96 pozos, se cubrieron con un sello de aluminio y se almacenaron a 4 °C para la imagen. El procedimiento para preparar las placas de reportero se ha compartido en protocols.io https://www.protocols.io/edit/preparing-the-phenocycler-reporter-plate-g3k5byky7### Imagen multiplexada CODEX

Se utilizó un instrumento de microfluídica CODEX, también conocido como PhenoCycler Fusion (Akoya Biosciences Inc., CA, EE. UU.), integrado con un microscopio de fluorescencia invertido a través de un inserto de etapa personalizado para automatizar el intercambio de tampones CODEX y la adquisición de imágenes. Los portaobjetos de tejido se colocaron en el inserto de la etapa y se obtuvieron imágenes con múltiples ciclos de imagen CODEX. Los primeros y los últimos ciclos fueron básicamente ciclos en blanco y también se utilizaron para el registro de imágenes y la alineación de imágenes. Las secciones de tejido se obtuvieron imágenes en una adquisición de mosaico de 5×7 a una resolución de 377 nm/píxel y 9 planos z por mosaico. El solapamiento de los mosaicos se preestableció en un 30 %.### Procesamiento y visualización de datos CODEX

Los datos de imagen y los archivos experiment.json se transfirieron a CODEX Analysis Manager (CAM) para un procesamiento adicional de las imágenes sin procesar, que luego se sometieron a la sustracción del fondo, la corrección del sombreado y la deconvolución para eliminar la luz desenfocada utilizando un software Microvolution disponible en http://www.microvolution.com/. Después de la compensación de la deriva y el empalme, se eligió el mejor plano focal de las pilas de imágenes verticales recopiladas en cada adquisición para la segmentación celular utilizando un algoritmo de cuencas hidrográficas de trazado de gradiente (software integrado de Akoya) en la tinción nuclear (radio establecido en 6 píxeles). Las imágenes procesadas se visualizaron y analizaron utilizando CODEX Multiplex Analysis Viewer (MAV) instalado como una extensión dentro del software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). MAV permite la visualización, la anotación y el análisis de poblaciones celulares a partir de los datos de imagen CODEX. Para cada célula en el tejido imagen, MAV genera coordenadas espaciales y mide la intensidad de la señal integrada para cada anticuerpo. Ocasionalmente, al utilizar la segmentación manual, se revelaron algunos ruidos de segmentación celular que podrían afectar a la identificación del tipo celular, pero al utilizar la agrupación no supervisada basada en Leiden, seguida de una sobreagrupación y la superposición manual de los grupos de tipos celulares resultantes en la imagen, se obtuvo una identificación mucho más precisa de los tipos celulares. Tanto el CODEX MAV como el software Qupath se pueden descargar de https://help.codex.bio/codex/mav/installation/download-and-install y https://qupath.github.io/. Alternativamente, también se utilizó la plataforma Qupath para la visualización de datos de imagen y la realización de mediciones celulares, seguida de una canalización multidimensional de análisis histocitométrico (CytoMAP) para analizar las imágenes procesadas (https://gitlab.com/gernerlab/cytomap). Una vez que se guardaron los archivos .csv emparejados en Qupath, las células anotadas para cada conjunto de datos se importaron a CytoMAP. Todos estos incluyen las ubicaciones espaciales, las definiciones de puerta y las estadísticas celulares para cada objeto celular. Esta técnica de análisis espacial extrae y cuantifica información sobre las asociaciones preferenciales célula-célula, la estructura tisular global y el posicionamiento espacial celular utilizando una variedad de técnicas estadísticas.### Análisis del tipo celular

La identificación de los tipos celulares se llevó a cabo utilizando métodos descritos previamente^[20],^[105]. En resumen, las células DAPI+ se seleccionaron para seleccionar las células nucleadas, y luego los marcadores de proteínas utilizados para la agrupación se normalizaron utilizando la normalización z. Luego, los datos se sobreagruparon con la función de agrupación X-shift dentro del programa CODEX MAV o la agrupación basada en Leiden integrada dentro del paquete Seurat (versión 5.1.0.). Seurat realiza la aproximación y la proyección uniforme del colector (UMAP), calcula los grupos de células y escala los datos para observar las variaciones en la expresión de antígenos en las células. Los pasos anteriores se realizaron basándose en un análisis en profundidad de la intensidad del marcador asociada con los tipos celulares y su localización dentro del tejido y se consultaron las imágenes publicadas para ese anticuerpo específico. Basándose en la ubicación dentro de la imagen y la expresión promedio de proteínas del grupo, se asignó un tipo celular a cada grupo.### Análisis de la vecindad celular

Utilizando el análisis de vecindad de barrido de raster, CytoMAP determina la composición celular local dentro de un área o volumen esférico (datos 3D) o circular (datos 2D) en el tejido. Esta función tratará los datos como 2D y utilizará una ventana de vecindad cilíndrica si la dimensionalidad z de los datos no es cero, pero el grosor z es menor que el radio de la vecindad. Esta función determina el número total de células en cada vecindad, así como la intensidad de fluorescencia máxima (IFM) de cada canal. Con la mitad del radio definido por el usuario separando los centros de la vecindad, las vecindades se espacian uniformemente en un patrón de cuadrícula a través del tejido. Luego, se puede realizar un análisis adicional (por ejemplo, densidades celulares locales, asociaciones célula-célula) utilizando los datos de la vecindad.### Clasificar las vecindades en regiones

Los vecindarios celulares se agruparon aún más en regiones. Se utilizan múltiples tipos de información de vecindario para definir las regiones tisulares mediante la función region de CytoMAP. Esto incluye la composición (número de células dividido por el número total de células en cada vecindario), el número bruto de células por vecindario y el número estandarizado de células de cada fenotipo en cada vecindario (número de células menos el número medio de células, dividido por la desviación estándar del número de células en cada vecindario en todo el conjunto de datos). El número de regiones y la agrupación de vecindarios se determinaron automáticamente de forma predeterminada utilizando la función de Davies-Bouldin. Una vez que se determinaron los parámetros de la red, la red se entrenó con los datos del vecindario utilizando la función train de MATLAB. Esto asigna un número de clúster a cada vecindario. Al comienzo del algoritmo selforgmap, NR "neuronas" se dispersan por los datos. Luego, para que coincida con el "paisaje" de los datos, desplaza iterativamente las posiciones de las neuronas, acercándolas a los datos. En este caso, la posición es topológica dentro de los datos de composición celular en lugar de espacial. A continuación, se localiza la neurona más cercana de cada vecindario, lo que conduce a la agrupación de los vecindarios. Utilizando la función "Edit Region Colors" de CytoMAP, se modificaron las designaciones de color arbitrarias de las regiones individuales para facilitar la visualización. Con la función de visualización de mapas de calor de CytoMAP, se trazó la composición de los vecindarios codificados por colores. Al crear una nueva figura en CytoMAP, trazar las posiciones de los vecindarios y elegir las regiones para el eje 'c' para codificar por colores los vecindarios según el tipo de región, se hizo visible la distribución espacial de las regiones.

Análisis de correlación célula-célula

Ciertas poblaciones celulares se asocian preferentemente entre sí, o, por el contrario, se evitan entre sí, en función de la densidad celular local dentro de los vecindarios individuales, lo que se puede utilizar para correlacionar la ubicación de diferentes tipos de células. El número de tipos de células u objetos dentro de los vecindarios escaneados se calculó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson mediante la función de correlación, o corr, dentro de CytoMAP. Esta información se grafica luego en un diagrama de mapa de calor. Este análisis de correlación se puede realizar en un número de muestras, que abarque tejidos completos o solo áreas específicas de los tejidos. Esto es significativo porque diferentes compartimentos tisulares pueden tener diferentes asociaciones entre células.

Recolección y procesamiento de tejidos

La Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Stanford y la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington (muestras de mucosa normal de donantes de órganos fallecidos) han aprobado este estudio, que cumple con todas las regulaciones éticas aplicables. Para cada participante donante, el familiar más cercano proporcionó el consentimiento informado por escrito. Todos los tejidos de pacientes con FAP utilizados en este estudio se obtuvieron de colones resecados quirúrgicamente mediante colectomía total. Los colones de los pacientes se tomaron directamente de la sala de operaciones al laboratorio de patología del Hospital de Stanford, donde se enjuagaron rápidamente y se bisecaron con tijeras quirúrgicas longitudinalmente sobre una tabla de corte a temperatura ambiente que se utiliza habitualmente en un laboratorio de patología. La mucosa normal adyacente a los pólipos (sin pólipos visibles) y los tejidos de los pólipos se disecaron cuidadosamente del colon, se midieron, se almacenaron en tubos de crioviales y se congelaron rápidamente colocando las muestras en tubos de crioviales directamente en nitrógeno líquido. Los pólipos que tenían un diámetro máximo en cualquier dirección mayor de 10 mm se consideraron "grandes", entre 10 mm y 5 mm se consideraron "medianos" y menos de 5 mm se consideraron "pequeños". Todos los pólipos mayores de 10 mm de diámetro se seccionaron por congelación, se tiñeron con H&E, se examinaron histopatológicamente por los patólogos del proyecto para evaluar el porcentaje de tejido normal frente a tejido displásico y la presencia de displasia por grado (displasia de bajo grado frente a displasia de alto grado). Los pólipos de menos de 10 mm de tamaño no se sometieron uniformemente a este análisis histopatológico, debido a la baja probabilidad de displasia de alto grado en este tamaño de pólipo y la necesidad de preservar la cantidad muy limitada de tejido disponible para el análisis multi-ómico posterior. Para registrar la ubicación exacta en el colon de donde se obtuvieron las diferentes muestras de tejido para los pacientes A001, A002, A014, A015, marcamos la ubicación de cada muestra de tejido con un alfiler numerado y tomamos fotografías del lumen colónico bisecado y sujeto con alfileres. Utilizando un mortero y una maza de cerámica, pulverizamos las muestras congeladas rápidamente en nitrógeno líquido para crear un polvo fino o pequeños trozos como entrada para cada ensayo multi-ómico. Para un subconjunto de muestras de tejido, los pólipos congelados rápidamente y la mucosa colorrectal se incluyeron en un medio OCT congelado y se seccionaron en serie para análisis estructurales 2D. Una vez congelados rápidamente o incluidos en un medio OCT congelado, el tejido se conservó a -80 grados C hasta que se utilizó para la criosección y los experimentos de imagen CODEX.

Conjugación de anticuerpos CODEX y creación del panel de anticuerpos

La imagen multiplexada CODEX se llevó a cabo utilizando el protocolo de tinción e imagen descrito en el manual del usuario del fabricante. Se ha compartido un protocolo detallado paso a paso para la conjugación personalizada de anticuerpos en protocols.io https://www.protocols.io/edit/protocol-for-custom-conjugation-of-oligo-barcodes-g3k4bykyx. Los paneles de anticuerpos se diseñaron para incluir objetivos que distinguen los subtipos de células epiteliales y estromales intestinales, así como las células del sistema inmunitario innato y adaptativo y las células cancerosas. Se proporciona información detallada del panel en la Tabla S3. Cada anticuerpo se conjugó con una cadena de oligonucleótidos única, y los tejidos se tiñeron con los conjugados de anticuerpos-oligonucleótidos siguiendo el protocolo del fabricante. Verificamos que los patrones de tinción en los tejidos de control positivo de amígdalas o intestinos coincidieran con los establecidos previamente para la inmunohistoquímica. Antes de ser evaluados colectivamente en un solo ciclo CODEX, los conjugados de anticuerpos-oligonucleótidos se evaluaron primero con ensayos de inmunofluorescencia, donde se evaluó la relación señal-ruido, la dilución del anticuerpo y otros aspectos técnicos, como la microfluídica automatizada y el microscopio.

Preparación de muestras de tejido para la imagen CODEX

Los datos de imagen se recopilaron de veinte donantes humanos, cada uno de los cuales representó un conjunto de datos. Cada conjunto de datos contiene muestras de tejido de pólipos precancerosos y adenocarcinoma/CRC recolectadas de diferentes secciones del colon (sigmoide, descendente, transverso y ascendente). Los tejidos se congelaron individualmente en moldes de temperatura de corte óptima (OCT) y luego se seccionaron a un ancho de 5 a 8 m utilizando un criostato, se ensamblaron en portaobjetos adhesivos Leica Superfrost y se realizó la tinción histológica y/o se almacenaron a -80 °C, hasta que se necesitaran. La tinción histológica se realizó siguiendo el protocolo, que se ha compartido en protocols.io https://www.protocols.io/edit/hematoxylin-and-eosin-staining-h-amp-e-protocol-fo-g3ktbykwp. Los portaobjetos de tejido se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El protocolo detallado se puede encontrar en protocols.io https://www.protocols.io/edit/protocol-for-staining-fresh-frozen-tissue-sections-g3k2bykyf. En resumen, los portaobjetos se obtuvieron del congelador el día del experimento CODEX y se colocaron sobre cuentas de Drierite de 1 a 2 cm durante 2 minutos, seguido de una incubación de 10 minutos en acetona. La acetona se secó colocando los portaobjetos boca arriba en una cámara húmeda durante 2 minutos. Las secciones de tejido se incubaron en 5 ml de tampón de hidratación durante 2 minutos (dos veces) y se fijaron utilizando 1,6 % de paraformaldehído (PFA) durante 10 minutos, después de lo cual el fijador se eliminó a fondo en el mismo tampón de hidratación. Los portaobjetos se incubaron en 5 ml de tampón de tinción durante 20 minutos. Mientras tanto, se preparó una solución de reserva del tampón de bloqueo CODEX mezclando 362 μl de tampón de tinción y 9,5 μl de cada uno de los tampones patentados de la empresa, a saber, N, G, J, S (por 2 muestras). Se calculó el volumen de anticuerpo por portaobjetos de muestra y se restó del tampón de bloqueo CODEX. Se preparó una solución de cóctel de anticuerpos pipeteando cada anticuerpo en el tampón de bloqueo CODEX. Los portaobjetos de muestra se colocaron en la cámara de humedad y se dispensó la solución de tinción del cóctel de anticuerpos (200 μl por muestra de tejido) sobre el portaobjetos y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se eliminaron los anticuerpos no unidos lavando los portaobjetos en 5 ml de tampón de tinción durante 2 minutos (dos veces). Las muestras se colocaron en una solución de fijación posterior (1 ml de 16 % de PFA + 9 ml de tampón de almacenamiento) durante 10 minutos y se lavaron a fondo con tampón fosfato salino (PBS) 1x para eliminar el fijador. Posteriormente, las secciones de tejido se fijaron con metanol frío a 5 minutos a 4 °C y se lavaron con PBS 1x. Las muestras se incubaron en un reactivo de fijación final (20 μl de reactivo de fijación CODEX + 1 ml de PBS 1x) durante 20 minutos, se lavaron a fondo con PBS 1x antes de colocarlas en el tampón de almacenamiento (hasta 2 semanas a 4 °C). Mientras tanto, se preparó una placa de reportero para interrogar los anticuerpos codificados con barras correspondientes agregando agua libre de nucleasas, tampón CODEX 10x, reactivo de ensayo y tinte nuclear. Dos cuarenta microlitros de la solución de reserva se dispensaron en pozos individuales seguidos de 5 μl de los tintes de reportero correspondientes. Las soluciones de reportero se mezclaron y se pipetearon en pozos individuales de una placa de 96 pocillos, se cubrieron con un sello de aluminio y se almacenaron a 4 °C para la imagen. El procedimiento para preparar las placas de reportero se ha compartido en protocols.io https://www.protocols.io/edit/preparing-the-phenocycler-reporter-plate-g3k5byky7

Imagen multiplexada CODEX

Se utilizó un instrumento de microfluídica CODEX, también conocido como PhenoCycler Fusion (Akoya Biosciences Inc., CA, EE. UU.), integrado con un microscopio de fluorescencia invertido a través de un inserto de etapa personalizado para automatizar el intercambio de tampones CODEX y la adquisición de imágenes. Los portaobjetos de tejido se colocaron en el inserto de la etapa y se obtuvieron imágenes con múltiples ciclos de imagen CODEX. Los primeros y los últimos ciclos fueron básicamente ciclos en blanco y también se utilizaron para el registro de imágenes y la alineación de imágenes. Las secciones de tejido se obtuvieron imágenes en una adquisición de mosaico de 5 × 7 a una resolución de 377 nm/píxel y 9 planos z por mosaico. El solapamiento de los mosaicos se preestableció en un 30 %.

Procesamiento y visualización de datos CODEX

Los datos de imagen y los archivos experiment.json se transfirieron al CODEX Analysis Manager (CAM) para el procesamiento adicional de las imágenes originales, que luego se sometieron a la sustracción del fondo, la corrección del sombreado y la deconvolución para eliminar la luz desenfocada utilizando un software Microvolution disponible en http://www.microvolution.com/. Después de la compensación de la deriva y el empalme, se seleccionó el mejor plano focal de las pilas de imágenes verticales recopiladas en cada adquisición para la segmentación celular utilizando un algoritmo de cuencas hidrográficas basado en el seguimiento de gradientes (software integrado de Akoya) sobre la tinción nuclear (radio establecido en 6 píxeles). Las imágenes procesadas se visualizaron y analizaron utilizando CODEX Multiplex Analysis Viewer (MAV) instalado como una extensión dentro del software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). MAV permite la visualización, la anotación y el análisis de poblaciones celulares a partir de los datos de imagen CODEX. Para cada célula en el tejido analizado, MAV genera coordenadas espaciales y mide la intensidad integrada de la señal para cada anticuerpo. Ocasionalmente, al utilizar la selección manual, se reveló cierto ruido en la segmentación celular que podría afectar la identificación del tipo celular, pero el uso de un agrupamiento no supervisado basado en Leiden, seguido de un sobreagrupamiento y la superposición manual de los grupos de tipos celulares resultantes en la imagen, resultó en una identificación mucho más precisa de los tipos celulares. Tanto CODEX MAV como el software Qupath se pueden descargar de https://help.codex.bio/codex/mav/installation/download-and-install y https://qupath.github.io/. Alternativamente, también se utilizó la plataforma Qupath para la visualización de datos de imagen y la realización de mediciones celulares, seguida de una canalización de análisis multidimensional histocitométrico (CytoMAP) para analizar las imágenes procesadas (https://gitlab.com/gernerlab/cytomap). Una vez que se guardaron los archivos paired.csv en Qupath, las células anotadas para cada conjunto de datos se importaron a CytoMAP. Todos estos incluyen las ubicaciones espaciales, las definiciones de selección y las estadísticas de cada objeto celular. Esta técnica de análisis espacial extrae y cuantifica información sobre las asociaciones preferenciales entre células, la estructura general del tejido y el posicionamiento espacial celular utilizando una variedad de técnicas estadísticas.

Análisis del tipo celular

La identificación de los tipos celulares se llevó a cabo utilizando métodos descritos previamente^[20],^[105]. Brevemente, las células DAPI+ se seleccionaron para seleccionar las células nucleadas, y luego los marcadores proteicos utilizados para el agrupamiento se normalizaron utilizando la normalización z. Luego, los datos se sobreagruparon con la función de agrupamiento X-shift dentro del programa CODEX MAV o con el agrupamiento basado en Leiden integrado dentro del paquete Seurat (versión 5.1.0). Seurat realiza la aproximación y proyección uniforme del espacio (UMAP), calcula los grupos de células y escala los datos para observar las variaciones en la expresión de antígenos en las células. Los pasos anteriores se realizaron basándose en un análisis en profundidad de la intensidad del marcador asociado con los tipos celulares y su localización dentro del tejido, y se consultaron las imágenes publicadas para ese anticuerpo específico. Basándose en la ubicación dentro de la imagen y la expresión proteica promedio del grupo, se asignó un tipo celular a cada grupo.

Análisis de la vecindad celular

Utilizando el análisis de vecindad de barrido de raster, CytoMAP determina la composición celular local dentro de un área/volumen esférico (datos 3D) o circular (datos 2D) en el tejido. Esta función tratará los datos como 2D y utilizará una ventana de vecindad cilíndrica si la dimensionalidad z de los datos no es cero, pero el grosor z es menor que el radio de la vecindad. Esta función determina el número total de células en cada vecindad, así como la intensidad máxima de fluorescencia (IMF) de cada canal. Con la mitad del radio definido por el usuario separando los centros de la vecindad, las vecindades se espacian uniformemente en un patrón de cuadrícula en todo el tejido. Luego, se puede realizar un análisis adicional (por ejemplo, densidades celulares locales, asociaciones célula-célula) utilizando los datos de la vecindad.

Clasificar las vecindades en regiones

Las vecindades celulares se han agrupado aún más en regiones. Se utilizan múltiples tipos de información de vecindad para definir las regiones del tejido utilizando la función region de CytoMAP. Esto incluye la composición (número de células dividido por el número total de células en cada vecindad), el número bruto de células por vecindad y el número estandarizado de células de cada fenotipo en cada vecindad (número de células menos el número medio de células, dividido por la desviación estándar del número de células en cada vecindad en todo el conjunto de datos). El número de regiones y el agrupamiento de vecindades se determinaron automáticamente de forma predeterminada utilizando la función de Davies-Bouldin. Una vez que se determinaron los parámetros de la red, la red se entrenó con los datos de la vecindad utilizando la función train de MATLAB. Esto asigna un número de grupo a cada vecindad. Al principio del algoritmo selforgmap, NR “neuronas” se dispersan por los datos. Luego, para que coincida con el paisaje de los datos, desplaza iterativamente las posiciones de las neuronas más cerca de los datos. En este caso, la posición es topológica dentro de los datos de composición celular en lugar de espacial. A continuación, se localiza la neurona más cercana de cada vecindad, lo que conduce al agrupamiento de las vecindades. Utilizando la función Edit Region Colors de CytoMAP, se modificaron las designaciones de color arbitrarias de las regiones individuales para facilitar la visualización. Con la función de visualización de mapas de calor de CytoMAP, se trazó la composición de las vecindades codificadas por colores. Al crear una nueva figura en CytoMAP, trazar las posiciones de la vecindad y elegir las regiones para el eje 'c' para codificar por colores las vecindades según el tipo de región, se hizo visible la distribución espacial de las regiones.

Análisis de correlación célula-célula

Ciertas poblaciones celulares se asocian preferentemente entre sí, o, por el contrario, se evitan entre sí, basándose en la densidad celular local dentro de las vecindades individuales, lo que se puede utilizar para correlacionar la ubicación de los diferentes tipos celulares. El número de tipos de células u objetos dentro de las vecindades escaneadas se calculó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson mediante la función de correlación, o corr, dentro de CytoMAP. Esta información se grafica luego en un diagrama de mapa de calor. Este análisis de correlación se puede realizar en un número de muestras, que abarca tejidos enteros o solo áreas específicas de los tejidos. Esto es significativo porque los diferentes compartimentos del tejido pueden tener diferentes asociaciones entre células.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, diríjase al contacto principal, el profesor Michael P. Snyder (mpsnyder@stanford.edu), quien atenderá y cumplirá las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse al profesor Michael P. Snyder. Todos los materiales biológicos se pueden obtener de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Disponibilidad de datos y código

Los datos de imagen CODEX procesados y sin procesar generados en este estudio se han depositado en Synapse (www.synapse.org) y se indexan en el Human Tumor Atlas Network (HTAN) Data Portal. La lista de archivos del estudio se puede obtener accediendo al HTAN Data Portal (https://data.humantumoratlas.org/explore) y filtrando por Atlas: “HTAN Stanford” Y Ensayo: “CODEX”. Los códigos para procesar los datos de imagen CODEX de una sola célula utilizando la canalización de Akoya, como CODEX MAV y Qupath, se pueden descargar de https://help.codex.bio/codex/mav/installation/download-and-install y https://qupath.github.io/, respectivamente. Los scripts de CytoMAP para analizar las imágenes procesadas y el análisis de vecindad se pueden encontrar en https://gitlab.com/gernerlab/cytomap. La canalización de Seurat para analizar los datos de imagen de una sola célula se puede encontrar en https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html.

Contacto principal

Para obtener información adicional y solicitar recursos y reactivos, diríjase al contacto principal, el profesor Michael P. Snyder (mpsnyder@stanford.edu), quien atenderá y cumplirá las solicitudes.

Disponibilidad de materiales

La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse al profesor Michael P. Snyder. Todos los materiales biológicos se pueden obtener de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Disponibilidad de datos y código

Los datos de imagen CODEX procesados y sin procesar generados en este estudio se han depositado en Synapse (www.synapse.org) y se indexan en el Human Tumor Atlas Network (HTAN) Data Portal. La lista de archivos del estudio se puede obtener accediendo al HTAN Data Portal (https://data.humantumoratlas.org/explore) y filtrando por Atlas: “HTAN Stanford” Y Ensayo: “CODEX”. Los códigos para procesar los datos de imagen CODEX de una sola célula utilizando la canalización de Akoya, como CODEX MAV y Qupath, se pueden descargar de https://help.codex.bio/codex/mav/installation/download-and-install y https://qupath.github.io/, respectivamente. Los scripts de CytoMAP para analizar las imágenes procesadas y el análisis de vecindad se pueden encontrar en https://gitlab.com/gernerlab/cytomap. La canalización de Seurat para analizar los datos de imagen de una sola célula se puede encontrar en https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html.