Las células CAR-NK dirigidas contra el CEA, derivadas de células madre embrionarias, muestran una potente actividad antitumoral contra el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores malignos más comunes en todo el mundo, con tasas de morbilidad y mortalidad persistentemente elevadas (^[1], ^[2]). A pesar de las continuas actualizaciones y avances en las modalidades de tratamiento tradicionales, como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia (^[3]), la tasa de supervivencia a cinco años para los pacientes con cáncer colorrectal sigue siendo insatisfactoria, situándose en torno al 15% (^[4]). Aunque en los últimos años se han introducido nuevos fármacos quimioterapéuticos y dirigidos, la población de pacientes que se beneficia de estos innovadores agentes sigue siendo limitada (^[5], ^[6]). Una proporción limitada de pacientes con CCR que presentan subtipos moleculares con deficiencia en la reparación del desajuste o con alta inestabilidad de microsatélites probablemente se beneficiarán de las terapias emergentes con inhibidores de puntos de control inmunitario (^[7], ^[8]). La comunidad científica está investigando activamente los mecanismos subyacentes a la resistencia a la inmunoterapia y buscando ampliar su aplicabilidad en el CCR. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar nuevas y eficaces estrategias terapéuticas para abordar las demandas clínicas.

El desarrollo de inmunoterapias basadas en células representa una vía prometedora que merece una mayor investigación. La terapia celular adoptiva ha revolucionado el tratamiento de las neoplasias hematológicas, con las células T con receptor quimérico de antígeno (CAR) que logran una eficacia notable en las leucemias y linfomas de células B recurrentes o refractarios (^[9], ^[10]). Sin embargo, las células T CAR han demostrado una eficacia limitada en los tumores sólidos, incluido el CCR, debido a varias barreras, como la mala migración al microambiente tumoral inmunosupresor (MTI) y los importantes efectos adversos, como el síndrome de liberación de citoquinas y la neurotoxicidad (^[11]). En contraste, la terapia con células CAR-asesinas naturales (NK) ha surgido como una opción de vanguardia para la inmunoterapia celular del CCR debido a su inherente mecanismo multimodal de destrucción y a sus ventajas para superar la inmunosupresión (^[12]–^[15]). En los tejidos de CCR primarios y metastásicos, el antígeno carcinoembrionario (CEA) se localiza predominantemente en la membrana apical de las células epiteliales colónicas malignas, con una expresión de alto nivel observada en más del 90% de los casos de CCR (^[16], ^[17]). Las células NK no reconocen inherentemente el CEA, sino que toman decisiones funcionales integrando una serie de señales de activación e inhibición. La regulación a la baja de la expresión de la molécula de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células de CCR, junto con el aumento de la expresión de los ligandos de NKG2D, permite conjuntamente el reconocimiento y la destrucción de las células de CCR por las células NK (^[18], ^[19]). Los estudios preclínicos han demostrado que los constructos CAR dirigidos al CEA pueden mejorar eficazmente la capacidad de destrucción de las células NK contra las células de CCR. Por ejemplo, las células NK CAR-CEA se infiltran eficazmente en los sitios tumorales del CCR, persisten durante períodos prolongados cuando se diseñan con IL-15 unida a la membrana y ejercen una acción sinérgica con el bloqueo de los puntos de control inmunitario para superar las barreras del MTI inmunosupresor (^[20]–^[22]).

Las células NK ofrecen la ventaja de servir como productos alogénicos "listos para usar", lo que elimina la necesidad de una preparación específica del paciente (^[23], ^[24]). En la investigación actual, las fuentes de células NK incluyen las células NK primarias de la sangre periférica (PB-NK), las líneas celulares NK92 y las células NK de la sangre del cordón umbilical (SCU). Sin embargo, las células PB-NK presentan desafíos relacionados con el alto costo de la recolección a gran escala y los procesos de separación de grado GMP, así como con las fuentes inestables de diferentes donantes (^[25]). La línea celular NK92 tiene un origen tumoral y requiere un tratamiento con irradiación antes de la inyección para eliminar el impacto de su capacidad proliferativa en los efectos antitumorales sostenidos (^[26]). Las células NK de la SCU requieren procesos de inducción complejos y presentan limitaciones funcionales inherentes (^[27], ^[28]). El uso de células madre pluripotentes humanas como células semilla para generar células NK puede potenciar aún más la ventaja de la disponibilidad "lista para usar" (^[24]). Los dos tipos de células madre pluripotentes humanas que se están explorando actualmente para su uso clínico son las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (^[29]). El uso de hESC para obtener células NK representa un enfoque técnico de vanguardia emergente en los últimos años. Su mayor ventaja radica en la capacidad de realizar la modificación CAR en la etapa inicial de las células semilla, induciendo posteriormente la diferenciación para obtener un gran número de células CAR-NK uniformemente caracterizadas para la inmunoterapia tumoral, lo que tiene amplias perspectivas de aplicación (^[30]).

Por lo tanto, en este estudio, construimos un CAR específico para el CEA y lo transfectamos en hESC, que luego se indujeron a diferenciarse en células CAR hESC-NK. Estas células demostraron una actividad antitumoral significativa y una seguridad favorable contra el cáncer colorrectal, proporcionando evidencia preclínica eficaz para la terapia con células CAR hESC-NK en el tratamiento del CCR.

Materiales y métodos

Células experimentales y cultivo

Las líneas celulares humanas 293T (núm. de catálogo CL-0005), Caco-2 (núm. de catálogo CL-0050), SW1116 (núm. de catálogo CL-0307), SW837 (núm. de catálogo CL-0485B) y NK92 (núm. de catálogo CL-0530) se adquirieron de Wuhan Procell Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China). Las células 293T y Caco-2 se cultivaron en DMEM (D6429, Sigma-Aldrich) suplementado con 10% FBS (16000-044, Gibco). Las células SW1116 y SW837 se mantuvieron en medio L-15 de Leibovitz (11415064, Gibco) suplementado con 10% FBS. Las células NK92 se cultivaron en α-MEM (M4526, Sigma-Aldrich) preparado de la siguiente manera (por cada 100 mL): 2 mM glutamina (G103979, aladdin), 0,15 g NaHCO3 (S432108, aladdin), 0,2 mM inositol (I656931, aladdin), 0,1 mM β-mercaptoetanol (M3148, Sigma-Aldrich), 0,02 mM ácido fólico (S4605, Selleck), 200 U/mL de IL-2 recombinante (130-097-743, Miltenyi Biotec), 20 mL de suero de caballo (26050070, Gibco) y 20 mL de FBS. Las hESC se mantuvieron en medio DMEM/F12 (C11330500BT, Gibco) (preparado como un sistema de 200 mL) suplementado con 40 mL de KSR (10828028, Gibco), 2 mL de NEAA (M7145, Sigma-Aldrich), 2 mM de glutamina, 0,1 mM de β-mercaptoetanol y 10 ng/mL de bFGF (130-093-838, Miltenyi Biotec) y 2 mL de PS (15140122, Gibco).

Construcción del vector CAR-CEA

El CEA se seleccionó como antígeno diana. El fragmento de cadena variable única (scFv) se derivó del anticuerpo monoclonal anti-CEA MEF23 (ab197070, Abcam, EE. UU.) mediante la síntesis basada en la interacción ligando-receptor. El constructo CAR-CEA se diseñó para codificar secuencialmente un péptido señal (SP), el scFv anti-CEA, una región de bisagra CD8α, un dominio transmembrana CD28, un dominio coestimulador intracelular CD28 y un dominio de señalización CD3ζ. El casete CAR completo se clonó en el vector lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1α-GFP utilizando los sitios de restricción XbaI y BamHI. El vector de expresión viral fue sintetizado por Nanjing Jingbai Biotechnology Co., Ltd.

Generación de la línea celular CAR-CEA hESC

Antes de la transfección, las hESC se cultivaron a una densidad de 2 × 105 células/mL y se pasaron cada 2-3 días. Se añadió el sobrenadante viral a los cultivos de hESC, seguido de la adición de polibreno. La mezcla se agitó suavemente y se incubó a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2. La expresión de GFP fue detectable después de aproximadamente 12 horas. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con medio fresco para el cultivo de hESC. A las 48 horas después de la transducción, las células se pasaron y se expandieron, y las células positivas para GFP se aislaron mediante citometría de flujo para obtener células CAR-CEA hESC. Este primer paso de clasificación sirve para enriquecer las células hESC CAR-positivas de la población celular transducida. Después de 1-2 semanas adicionales de cultivo, se realizó una segunda ronda de clasificación mediante citometría de flujo para enriquecer las células CAR-CEA hESC que expresan GFP de forma estable. Esta segunda clasificación produce una población clonalmente homogénea con una expresión uniforme de CAR/GFP, lo que garantiza una eficiencia de diferenciación de NK consistente.

Método de inducción de CAR-CEA hESC en células NK

La derivación de células NK a partir de ESC y ESC transfectadas con CAR comprendió tres fases en 30 días. Todos los pasos de inducción se basaron en el protocolo establecido por (^[31]). Brevemente, las ESC se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos (placa 650101, tapa 656161, greiner bio-one) a una densidad de 4000 células por pocillo en 100 µL de medio BPEL que contenía 40 ng/mL de SCF (130-096-692, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de VEGF (130-093-825, Miltenyi biotec) y 20 ng/mL de BMP-4 (130-111-168, Miltenyi biotec). Después del día 6 de la diferenciación hematopoyética, los cuerpos embrionarios giratorios (EBs) se transfirieron directamente a placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina, alcanzando una densidad de 8-12 EBs por pocillo. El volumen final en cada pocillo se ajustó a aproximadamente 1 mL con medio BEL que contenía 50 ng/mL de SCF, 40 ng/mL de VEGF, 30 ng/mL de IL-3 (130-093-909, Miltenyi biotec), 30 ng/mL de IL-6 (130-093-929, Miltenyi biotec), 30 ng/mL de TPO (130-095-745, Miltenyi biotec) y 30 ng/mL de EPO (130-095-745, Miltenyi biotec) durante 8 días. Las líneas celulares OP9-DL1 (YS1763C) se adquirieron de Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd. Posteriormente, las células cosechadas de las placas de 24 pocillos se sembraron a una densidad de 2 × 106 células/mL sobre la capa de soporte presembrada de OP9-DL1 en placas de 6 pocillos. La mitad del medio se cambió dos veces por semana, y se reponieron células de soporte OP9-DL1 semanalmente. Las células se diferenciaron posteriormente en células NK utilizando 5 ng/mL de IL-3 (solo durante la primera semana), 10 ng/mL de IL-15 (130-095-760, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de IL-7 (130-095-367, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de SCF y 10 ng/mL de Flt3L (130-096-474, Miltenyi biotec) durante 21 días.

Método de inducción de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical en células NK

La SCU utilizada en este estudio se obtuvo del Banco de Sangre del Cordón Umbilical de Pekín. Todos los procedimientos que involucran a sujetos humanos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Academia de Ciencias Médicas Militares (AMMS; número de aprobación AF/SC-08/02.160). La sangre fresca se mezcló con un tercio de volumen de solución de sedimentación de eritrocitos y se dejó reposar durante 30 minutos. El sobrenadante se colocó en capas sobre un medio de separación de linfocitos y se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos para obtener células mononucleares. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos de baja adherencia a 2 × 106 células/mL en medio de inducción de NK y se dejaron sin perturbar durante los primeros 3 días. A partir del día 4, se realizaron cambios de medio cada dos días hasta el día 14 para obtener células NK maduras.

Ensayo de citotoxicidad LDH

La citotoxicidad se evaluó mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) según el protocolo del fabricante (ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96®, Promega). Brevemente, las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad optimizada y se cocultivaron con células efectoras a las proporciones efector:diána (E:D) indicadas. Después de la incubación durante 4-6 horas a 37 °C, las placas se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos y se transfirieron 50 µL del sobrenadante de cada pocillo a una placa de fondo plano nueva de 96 pocillos. Se añadió un volumen igual de mezcla de sustrato LDH a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La liberación espontánea de LDH (células diana solas) y la liberación máxima de LDH (células diana lisadas con 1% de Triton X-100) se incluyeron como controles. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron en al menos tres experimentos independientes.

Ensayo de liberación de IFN-γ

Se evaluó la función efectora de las células NK mediante la medición de la secreción de interferón-gamma (IFN-γ). Brevemente, las células NK (efectoras) se cocultivaron con células diana a una relación efector:diana (E:D) de 5:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos utilizando medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 50 UI/mL de IL-2 humana recombinante. Para la estimulación del control positivo, las células NK se trataron con 25 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Selleck) y 1 µg/mL de ionomicina (S1672, Beyotime). Después de 4 a 6 horas de incubación a 37 °C en 5% de CO2, se añadió 1 µg/mL de brefeldina A (S1536, Beyotime) o 2 µM de monensina (S1753, Beyotime) para la retención de proteínas intracelulares, seguido de 12 a 16 horas adicionales de cultivo. Alternativamente, se recogieron sobrenadantes libres de células después de 24 horas de cocultivo sin agentes de retención para la detección extracelular. Las concentraciones de IFN-γ en los sobrenadantes se cuantificaron utilizando un kit ELISA de IFN-γ humana (P1521, Beyotime) según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm y las concentraciones de citocinas se interpolaron a partir de una curva estándar. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron de forma independiente al menos tres veces.

Preparación de animales

Se obtuvieron ratones NOD SCID de grado SPF macho (de 8 a 12 semanas de edad) de Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. (Pekín, China). Los animales se alojaron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad con acceso libre a alimentos y agua y se les permitió aclimatarse durante una semana antes de los procedimientos experimentales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Ciencias Médicas Militares (Número de aprobación: IACUC-DWZX-2022-557) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales.

Experimentos in vivo en animales

Se seleccionaron ratones NOD SCID de 8 a 12 semanas de edad como modelo de xenoinjerto tumoral, y se inyectaron células SW1116 en el lado derecho de las nalgas y la espalda de los ratones (1 × 106 células), 60 µl cada vez, para establecer un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de colon. En el tercer día de la presencia del tumor, se dividieron aleatoriamente 25 ratones con tumor en un grupo de control en blanco (no tratado), un grupo de tratamiento con NK92, un grupo de tratamiento con células NK de cordón umbilical (UCB-NK), un grupo de tratamiento con células hESC-NK y un grupo de tratamiento con células CAR hESC-NK, con 5 ratones por grupo. Las células NK se inyectaron en la vena de la cola (1,5 × 107 células/100 µl), y todas las células NK se resuspendieron en 100 µl de PBS. Se inyectó a todos los ratones una vez por semana durante 4 semanas consecutivas. En la primera semana, se inyectó IL-15 (10 ng/ratón) en la vena de la cola todos los días; desde el día 1 hasta el día 21, se inyectó interleucina IL-2 (10 000 U/ratón) en la vena de la cola cada 2 a 3 días. Se recogieron 50 µl de sangre periférica de los ratones con tumor a través de una punción en la vena de la cola utilizando una aguja estéril desechable para la toma de muestras de sangre a intervalos de 7 días. Tras la lisis de los eritrocitos (tampón de lisis BD Pharm Lyse™, 555899), los leucocitos recogidos se tiñeron con anticuerpo anti-humano CD56 (555518, BD) para el análisis citométrico de flujo. Las proporciones de células NK se calcularon como el porcentaje de células humanas CD56+ dentro de la puerta total de células individuales vivas después de la exclusión de restos celulares. Antes de la recolección de tejido al finalizar el período de observación de 42 días, primero se anestesiaron los ratones mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg, seguida de una eutanasia humana mediante dislocación cervical. No se observaron eventos adversos durante los procedimientos experimentales, y todas las operaciones se realizaron para minimizar el sufrimiento animal en la mayor medida posible. Todas las operaciones con animales y los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas institucionales aprobadas y cumplieron con los estándares internacionales de bienestar animal.

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± DE. Las diferencias entre los grupos se analizaron utilizando ANOVA de una vía, con el software estadístico SPSS 17.0. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001, ns no significativo.

Células y cultivo experimentales

Las líneas celulares humanas 293T (núm. de catálogo CL-0005), Caco-2 (núm. de catálogo CL-0050), SW1116 (núm. de catálogo CL-0307), SW837 (núm. de catálogo CL-0485B) y NK92 (núm. de catálogo CL-0530) se compraron a Wuhan Procell Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China). Las células 293T y Caco-2 se cultivaron en DMEM (D6429, Sigma-Aldrich) suplementado con 10% de FBS (16000-044, Gibco). Las células SW1116 y SW837 se mantuvieron en medio de Leibovitz L-15 (11415064, Gibco) suplementado con 10% de FBS. Las células NK92 se cultivaron en α-MEM (M4526, Sigma-Aldrich) preparado de la siguiente manera (por 100 mL): 2 mM de glutamina (G103979, aladdin), 0,15 g de NaHCO3 (S432108, aladdin), 0,2 mM de inositol (I656931, aladdin), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (M3148, Sigma-Aldrich), 0,02 mM de ácido fólico (S4605, Selleck), 200 U/mL de IL-2 humana recombinante (130-097-743, Miltenyi Biotec), 20 mL de suero de caballo (26050070, Gibco) y 20 mL de FBS. Las células hESC se mantuvieron en medio DMEM/F12 (C11330500BT, Gibco) (preparado como un sistema de 200 mL) suplementado con 40 mL de KSR (10828028, Gibco), 2 mL de NEAA (M7145, Sigma-Aldrich), 2 mM de glutamina, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 10 ng/mL de bFGF (130-093-838, Miltenyi Biotec) y 2 mL de PS (15140122, Gibco).

Construcción del vector CAR-CEA

Se seleccionó CEA como el antígeno diana. El fragmento de cadena variable única (scFv) se derivó del anticuerpo monoclonal anti-CEA MEF23 (ab197070, Abcam, EE. UU.) mediante la síntesis basada en la interacción receptor-ligando. El constructo CAR-CEA se diseñó para codificar secuencialmente un péptido de señal (SP), el scFv anti-CEA, una región de bisagra CD8α, un dominio transmembrana CD28, un dominio coestimulador intracelular CD28 y un dominio de señalización CD3ζ. El casete CAR completo se clonó en el vector lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1α-GFP utilizando los sitios de restricción XbaI y BamHI. El vector de expresión viral fue sintetizado por Nanjing Jingbai Biotechnology Co., Ltd.

Generación de la línea celular hESC-CAR-CEA

Antes de la transfección, las células hESC se cultivaron a una densidad de 2 × 105 células/mL y se pasaron cada 2 a 3 días. Se añadió sobrenadante viral a los cultivos de hESC, seguido de la adición de polibreno. La mezcla se agitó suavemente y se incubó a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2. La expresión de GFP fue detectable después de aproximadamente 12 horas. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con medio fresco de cultivo de hESC. A las 48 horas posteriores a la transducción, las células se pasaron y se expandieron, y las células positivas para GFP se aislaron mediante citometría de flujo para obtener células hESC-CAR-CEA. Este primer paso de clasificación sirve para enriquecer las células hESC CAR-positivas de la población celular transducida en masa. Después de 1 a 2 semanas adicionales de cultivo, se realizó una segunda ronda de clasificación mediante citometría de flujo para enriquecer las células hESC-CAR que expresan GFP de forma estable. Esta segunda clasificación produce una población clonalmente homogénea con una expresión uniforme de CAR/GFP, lo que garantiza una eficiencia de diferenciación de NK constante.

Método de inducción de hESC-CAR-CEA en células NK

La derivación de células NK a partir de células ESC y células ESC transfectadas con CAR comprendió tres fases durante 30 días. Todos los pasos de inducción se basaron en el protocolo establecido por (^[31]). Brevemente, las células ESC se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos (placa 650101, tapa 656161, greiner bio-one) a una densidad de 4000 células por pocillo en 100 µL de medio BPEL que contiene 40 ng/mL de SCF (130-096-692, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de VEGF (130-093-825, Miltenyi biotec) y 20 ng/mL de BMP-4 (130-111-168, Miltenyi biotec). Después del día 6 de la diferenciación hematopoyética, los cuerpos embrionarios giratorios (EBs) se transfirieron directamente a placas de 24 pocillos recubiertas con gelatina, alcanzando una densidad de 8 a 12 EBs por pocillo. El volumen final en cada pocillo se ajustó a aproximadamente 1 mL con medio BEL que contiene 50 ng/mL de SCF, 40 ng/mL de VEGF, 30 ng/mL de IL-3 (130-093-909, Miltenyi biotec), 30 ng/mL de IL-6 (130-093-929, Miltenyi biotec), 30 ng/mL de TPO (130-095-745, Miltenyi biotec) y 30 ng/mL de EPO (130-095-745, Miltenyi biotec) durante 8 días. Las líneas celulares OP9-DL1 (YS1763C) se compraron a Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd. Posteriormente, las células cosechadas de las placas de 24 pocillos se sembraron a una densidad de 2 × 106 células/mL sobre la capa de soporte OP9-DL1 presembrada en placas de 6 pocillos. La mitad del medio se cambió dos veces por semana, y se rellenaron las células de soporte OP9-DL1 semanalmente. Luego, las células se diferenciaron aún más en células NK utilizando 5 ng/mL de IL-3 (solo la primera semana), 10 ng/mL de IL-15 (130-095-760, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de IL-7 (130-095-367, Miltenyi biotec), 20 ng/mL de SCF y 10 ng/mL de Flt3L (130-096-474, Miltenyi biotec) durante 21 días.

Método de inducción de células mononucleares de cordón umbilical en células NK

El cordón umbilical utilizado en este estudio se obtuvo del Banco de Cordón Umbilical de Pekín. Todos los procedimientos que involucran a sujetos humanos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de la Academia de Ciencias Médicas Militares (AMMS; Número de aprobación: AF/SC-08/02.160). La sangre fresca se mezcló con un tercio de volumen de solución de sedimentación de eritrocitos y se dejó reposar durante 30 minutos. Luego, el sobrenadante se colocó en capas sobre un medio de separación de linfocitos y se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos para obtener células mononucleares. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos de baja adherencia a 2 × 106 células/mL en medio de inducción de NK y se dejaron sin perturbar durante los primeros 3 días. A partir del día 4, se realizaron cambios de medio cada dos días hasta el día 14 para obtener células NK maduras.

Ensayo de citotoxicidad LDH

La citotoxicidad se evaluó mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) según el protocolo del fabricante (ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96®, Promega). Brevemente, las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad optimizada y se cocultivaron con células efectoras a las relaciones efector:diana (E:D) indicadas. Después de la incubación durante 4 a 6 horas a 37 °C, las placas se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos y se transfirieron 50 µL del sobrenadante de cada pocillo a una placa de fondo plano nueva de 96 pocillos. Se añadió un volumen igual de mezcla de sustrato LDH a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de microplacas. La liberación espontánea de LDH (células diana solas) y la liberación máxima de LDH (células diana lisadas con 1% de Triton X-100) se incluyeron como controles. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron en al menos tres experimentos independientes.

Ensayo de liberación de IFN-γ

La función efectora de las células NK se evaluó mediante la medición de la secreción de interferón-gamma (IFN-γ). Brevemente, las células NK (efectoras) se cocultivaron con células diana a una relación efector:diana (E:D) de 5:1 en placas de fondo plano de 96 pocillos utilizando medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y 50 UI/mL de IL-2 humana recombinante. Para la estimulación del control positivo, las células NK se trataron con 25 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Selleck) y 1 µg/mL de ionomicina (S1672, Beyotime). Después de 4 a 6 horas de incubación a 37 °C en 5% de CO2, se añadió 1 µg/mL de brefeldina A (S1536, Beyotime) o 2 µM de monensina (S1753, Beyotime) para la retención de proteínas intracelulares, seguido de 12 a 16 horas adicionales de cultivo. Alternativamente, se recogieron sobrenadantes libres de células después de 24 horas de cocultivo sin agentes de retención para la detección extracelular. Las concentraciones de IFN-γ en los sobrenadantes se cuantificaron utilizando un kit ELISA de IFN-γ humana (P1521, Beyotime) según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm y las concentraciones de citocinas se interpolaron a partir de una curva estándar. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron de forma independiente al menos tres veces.

Preparación de animales

Se obtuvieron ratones NOD SCID de grado SPF macho (de 8 a 12 semanas de edad) de Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. (Pekín, China). Los animales se alojaron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad con acceso libre a alimentos y agua y se les permitió aclimatarse durante una semana antes de los procedimientos experimentales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Ciencias Médicas Militares (Número de aprobación: IACUC-DWZX-2022-557) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales.

Experimentos in vivo en animales

Se seleccionaron ratones NOD SCID de 8 a 12 semanas de edad como modelo de xenoinjerto tumoral, e se inyectaron células SW1116 en el lado derecho de las nalgas y en la espalda de los ratones (1 × 10^6 células), 60 μl cada vez, para establecer un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de colon. En el tercer día después de la implantación del tumor, 25 ratones portadores de tumor se dividieron aleatoriamente en un grupo de control (no tratado), un grupo tratado con NK92, un grupo tratado con células UCB-NK, un grupo tratado con células hESC-NK y un grupo tratado con células CAR hESC-NK, con 5 ratones por grupo. Las células NK se inyectaron en la vena de la cola (1,5 × 10^7 células/100 μl); todas las células NK se resuspendieron en 100 μl de PBS. A todos los ratones se les inyectó una vez por semana durante 4 semanas consecutivas. En la primera semana, se inyectó IL-15 (10 ng/ratón) en la vena de la cola todos los días; desde el día 1 hasta el día 21, se inyectó la interleucina IL-2 (10000 U/ratón) en la vena de la cola cada 2 a 3 días. Se recolectaron 50 μl de sangre periférica de los ratones portadores de tumor mediante punción de la vena de la cola con una aguja estéril desechable para la toma de muestras de sangre a intervalos de 7 días. Tras la lisis de los eritrocitos (tampón de lisis BD Pharm Lyse™, 555899), las células leucocitarias obtenidas se tiñeron con el anticuerpo anti-humano CD56 (555518, BD) para el análisis citométrico de flujo. Las proporciones de células NK se calcularon como el porcentaje de células humanas CD56+ dentro de la puerta total de células individuales vivas después de la exclusión de restos celulares. Antes de la recolección de tejido al finalizar el período de observación de 42 días, primero se anestesiaron los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 50 mg/kg, seguida de una eutanasia humana mediante dislocación cervical. No se observaron eventos adversos durante los procedimientos experimentales, y todas las operaciones se realizaron para minimizar el sufrimiento animal en la mayor medida posible. Todas las operaciones con animales y los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas institucionales aprobadas para animales y cumplieron con los estándares internacionales de bienestar animal.

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± DE. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante ANOVA de una vía, utilizando el software estadístico SPSS 17.0. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001, ns no significativo.

Resultados

Establecimiento de CAR-hESC dirigidas a CEA con características normales de hESC

Para obtener una población homogénea de células CAR-NK dirigidas a CEA, modificamos genéticamente las hESC para que expresaran una CAR específica para CEA mediante infección viral. Se construyó una CAR dirigida a CEA utilizando el scFv MEF23, enlazado a los dominios de señalización CD28 y CD3ζ y un reportero GFP (Figura 1A; Figura suplementaria S1). Las hESC transducidas con este constructo expresaron de forma estable GFP, con el 91% de las células siendo GFP-positivas mediante citometría de flujo en las hESC-CAR no diferenciadas, antes del inicio de la diferenciación (Figuras 1B, C). El Western blot confirmó la expresión de la cadena CD3ζ asociada a la CAR en estas células (Figura 1D). Las CAR-hESC mantuvieron la pluripotencia, como lo demuestra la alta expresión de los marcadores de superficie SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 mediante citometría de flujo (Figura 1E), y no mostraron diferencias significativas en los niveles de ARNm de los genes de pluripotencia principales (SOX2, NANOG, OCT4) en comparación con las hESC de tipo salvaje (Figura 1F). Estos datos confirman que la línea CAR-hESC generada conserva su identidad pluripotente.

Diferenciación de células madre/progenitoras hematopoyéticas a partir de CAR-hESC

Para lograr la inducción in vitro de la diferenciación y maduración de células CAR-NK dirigidas a CEA, se utilizó un método de inducción de tres etapas (Figura 2A). La primera etapa se indujo mediante el método Spin EB en placas de 96 pocillos para generar EBs. Esta etapa duró 6 días, durante los cuales se añadieron las citocinas SCF, VEGF y BMP4. A medida que aumenta el tiempo de inducción, los EBs de Spin aumentan gradualmente de tamaño, acompañado de un aumento progresivo en el número de células madre/progenitoras hematopoyéticas que crecen en suspensión (Figuras 2B, C). En la segunda etapa, las esferoides EB se transfirieron a placas de 24 pocillos y se cultivaron con las citocinas SCF, VEGF, TPO, EPO, IL-3 e IL-6 durante 8 días. Esta etapa promueve la diferenciación de las células madre/progenitoras hematopoyéticas en la línea celular linfoide, dando lugar a células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD45+ (Figuras 2D, E).

Generación eficiente de células CAR ESC-NK maduras a partir de CAR-hESC

En la etapa final, se realizó la inducción de células NK en placas de 6 pocillos. Se obtuvieron células NK maduras tras una exposición de 3 semanas a las citocinas SCF, Flt3L, IL-7, IL-15 e IL-3 (Figura 3A). A medida que se prolonga el tiempo de inducción, el rendimiento de las células inducidas aumenta progresivamente (Figura 3B). Los niveles de expresión de los principales marcadores moleculares en las células NK se evaluaron mediante citometría de flujo. Coherente con las referencias de células NK ampliamente utilizadas y bien caracterizadas, incluidas las células NK derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC-NK), las células NK derivadas de sangre del cordón umbilical (UCB-NK) y la línea celular NK92, que sirven como puntos de referencia fiables para los ensayos fenotípicos y funcionales, las células CAR-CEA NK exhibieron un fenotipo CD56+CD16+, junto con una alta expresión superficial de NKp44, NKp46 y NKG2D. En contraste, la expresión de KIR se mantuvo baja, lo que indica una función normal de las células NK (Figura 3C; Figura suplementaria 2). Además, la tinción de Giemsa demostró que las células NK inducidas presentaban características morfológicas típicas de las células NK normales (Figura 3D). Estos resultados demostraron que las CAR-hESC pueden diferenciarse de forma eficiente en células CAR-CEA NK maduras.

La modificación con CAR mejora la citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer colorrectal positivas para CEA

Para la evaluación in vitro de la citotoxicidad mediada por las células CAR hESC-NK, se seleccionaron tres líneas celulares de cáncer colorrectal (SW1116, SW837 y Caco-2). La expresión de CEA se evaluó mediante citometría de flujo, Western blot e inmunofluorescencia, lo que reveló una alta expresión en SW1116 y SW837, pero no en Caco-2 (Figuras 4A-C). Además, se evaluó la función de eliminación de tumores de las células NK mediante ensayos de liberación de IFN-γ y LDH. Las células NK92, las células UCB-NK y las células hESC-NK exhibieron todos efectos citotóxicos contra las líneas celulares de cáncer colorrectal, sin diferencias significativas entre las diferentes fuentes de células NK. En contraste, las células CAR hESC-NK exhibieron una actividad de eliminación significativamente mejorada específicamente contra las líneas celulares positivas para CEA (SW1116 y SW837, pero no Caco-2) en comparación con las células hESC-NK (Figuras 4D, E). Las células NK92 y las células UCB-NK también se incluyeron en los ensayos como poblaciones de referencia para proporcionar un punto de referencia para la actividad tumoricida basal de las células NK contra los tumores de cáncer colorrectal. Estos resultados sugieren que la modificación con CAR mejora la citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer colorrectal positivas para CEA.

Las células CAR-hESC NK exhiben una potente actividad antitumoral contra el cáncer colorrectal

Como se describe en el diagrama de flujo que se presenta en la Figura 5A, se realizó una evaluación funcional a nivel animal. Se inyectaron células SW1116 en el flanco derecho y en la espalda de los ratones para establecer un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de colon. La proporción de células NK que se infiltran en el tejido tumoral se analizó mediante citometría de flujo, lo que reveló que el grupo tratado con CAR hESC-NK exhibió un grado significativamente mayor de infiltración de células NK en comparación con los otros grupos (Figura 5B). Además, se evaluó la expresión de la proteína CEA en los tejidos de cáncer de colon mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia (Figura 5C; Figura suplementaria 3A). Los resultados demostraron que la expresión de CEA en el grupo tratado con CAR hESC-NK era notablemente menor que la observada en los cuatro grupos de control. Se realizó un seguimiento semanal mediante imágenes dinámicas in vivo para rastrear los cambios en el volumen tumoral. Los resultados demostraron que los tumores de los grupos tratados con células NK92, células UCB-NK y células hESC-NK exhibieron una tendencia a la regresión. En particular, en el grupo tratado con CAR hESC-NK, los volúmenes tumorales comenzaron a disminuir a partir de la segunda semana, con una reducción significativa observada (Figura 5D, E; Figura suplementaria 3B). Además, el análisis de la curva de supervivencia reveló que los ratones que recibieron terapia con CAR hESC-NK tuvieron la duración mediana de supervivencia más larga (Figura 5F). En conjunto, estos hallazgos indican que las células CAR hESC-NK ejercen un efecto terapéutico mediante la eliminación dirigida de las células de cáncer de colon positivas para CEA.

Las células CAR-hESC NK exhiben un perfil de bioseguridad favorable sin acumulación ni toxicidad orgánica

Para evaluar la seguridad del tratamiento con células CAR hESC-NK, evaluamos tanto la biodistribución de las células CAR hESC-NK en la sangre periférica, así como los marcadores de la función hepática y renal en los ratones tratados. El análisis de la sangre periférica reveló que la proporción de células NK de diferentes fuentes se mantuvo en aproximadamente el 10% durante el tratamiento. A las seis semanas, los niveles de células NK en la sangre periférica se acercaron a cero. Y no se observaron diferencias significativas en las proporciones de células NK en la sangre periférica entre los grupos de tratamiento con NK92, UCB-NK, hESC-NK y CAR hESC-NK en ningún momento (Figura 6A). Además, no se detectaron anomalías evidentes en la función hepática y renal en los grupos de tratamiento (Figuras 6B-E). Estos resultados demuestran una vida útil in vivo limitada sin acumulación, junto con la ausencia de toxicidad orgánica, lo que respalda un perfil de bioseguridad favorable.

Establecimiento de CAR-hESC dirigidas a CEA con características normales de hESC

Para obtener una población homogénea de células CAR-NK dirigidas a CEA, modificamos genéticamente las hESC para que expresaran una CAR específica para CEA mediante infección viral. Se construyó una CAR dirigida a CEA utilizando el scFv MEF23, enlazado a los dominios de señalización CD28 y CD3ζ y un reportero GFP (Figura 1A; Figura suplementaria S1). Las hESC transducidas con este constructo expresaron de forma estable GFP, con el 91% de las células siendo GFP-positivas mediante citometría de flujo en las hESC-CAR no diferenciadas, antes del inicio de la diferenciación (Figuras 1B, C). El Western blot confirmó la expresión de la cadena CD3ζ asociada a la CAR en estas células (Figura 1D). Las CAR-hESC mantuvieron la pluripotencia, como lo demuestra la alta expresión de los marcadores de superficie SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 mediante citometría de flujo (Figura 1E), y no mostraron diferencias significativas en los niveles de ARNm de los genes de pluripotencia principales (SOX2, NANOG, OCT4) en comparación con las hESC de tipo salvaje (Figura 1F). Estos datos confirman que la línea CAR-hESC generada conserva su identidad pluripotente.

Diferenciación de células madre/progenitoras hematopoyéticas a partir de CAR-hESC

Para lograr la inducción in vitro de la diferenciación y maduración de células CAR-NK dirigidas a CEA, se utilizó un método de inducción de tres etapas (Figura 2A). La primera etapa se indujo mediante el método Spin EB en placas de 96 pocillos para generar EBs. Esta etapa duró 6 días, durante los cuales se añadieron las citocinas SCF, VEGF y BMP4. A medida que aumenta el tiempo de inducción, los EBs de Spin aumentan gradualmente de tamaño, acompañado de un aumento progresivo en el número de células madre/progenitoras hematopoyéticas que crecen en suspensión (Figuras 2B, C). En la segunda etapa, las esferoides EB se transfirieron a placas de 24 pocillos y se cultivaron con las citocinas SCF, VEGF, TPO, EPO, IL-3 e IL-6 durante 8 días. Esta etapa promueve la diferenciación de las células madre/progenitoras hematopoyéticas en la línea celular linfoide, dando lugar a células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD45+ (Figuras 2D, E).

En la etapa final, se realizó la inducción de células NK en placas de 6 pocillos. Se obtuvieron células NK maduras tras una exposición de 3 semanas a las citocinas SCF, Flt3L, IL-7, IL-15 e IL-3 (Figura 3A). A medida que se prolongaba el tiempo de inducción, el rendimiento de las células inducidas aumentaba progresivamente (Figura 3B). Se evaluaron los niveles de expresión de los principales marcadores moleculares en las células NK mediante citometría de flujo. En consonancia con las referencias de células NK ampliamente utilizadas y bien caracterizadas, incluidas las células NK derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC-NK), las células NK derivadas de sangre del cordón umbilical (UCB-NK) y la línea celular NK92, que sirven como puntos de referencia fiables para los ensayos fenotípicos y funcionales, las células NK CAR-CEA exhibieron un fenotipo CD56+CD16+, junto con una alta expresión superficial de NKp44, NKp46 y NKG2D. En contraste, la expresión de KIR se mantuvo baja, lo que indica una funcionalidad normal de las células NK (Figura 3C; Figura suplementaria 2). Además, la tinción de Giemsa demostró que las células NK inducidas presentaban características morfológicas típicas de las células NK normales (Figura 3D). Estos resultados demostraron que las células hESC-CAR pueden diferenciarse eficazmente en células NK CAR-CEA maduras.

La modificación CAR mejora la citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer colorrectal CEA-positivas

Para la evaluación in vitro de la citotoxicidad mediada por células hESC-NK CAR, se seleccionaron tres líneas celulares de cáncer colorrectal (SW1116, SW837 y Caco-2). Se evaluó la expresión de CEA mediante citometría de flujo, inmunotransferencia y inmunofluorescencia, lo que reveló una alta expresión en SW1116 y SW837, pero no en Caco-2 (Figuras 4A-C). Además, se evaluó la función de eliminación tumoral de las células NK mediante la liberación de IFN-γ y los ensayos de LDH. Las células NK92, las células UCB-NK y las células hESC-NK exhibieron efectos citotóxicos contra las líneas celulares de cáncer colorrectal, sin diferencias significativas entre las diferentes fuentes de células NK. En contraste, las células hESC-NK CAR exhibieron una actividad de eliminación significativamente mejorada específicamente contra las líneas celulares CEA-positivas (SW1116 y SW837, pero no Caco-2) en comparación con las células hESC-NK (Figuras 4D, E). Las células NK92 y las células UCB-NK se incluyeron adicionalmente en los ensayos como poblaciones de referencia para proporcionar un punto de referencia de la actividad tumoricida basal de las células NK contra los tumores de cáncer colorrectal. Estos resultados sugieren que la modificación CAR mejora la citotoxicidad de las células NK contra las células de cáncer colorrectal CEA-positivas.

Las células NK hESC-CAR exhiben una potente actividad antitumoral contra el cáncer colorrectal

Como se describe en el diagrama de flujo presentado en la Figura 5A, se realizó una evaluación funcional a nivel animal. Se inyectaron células SW1116 en el flanco derecho y la espalda de los ratones para establecer un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon en ratones. La proporción de células NK que infiltran el tejido tumoral se analizó mediante citometría de flujo, lo que reveló que el grupo tratado con células hESC-NK CAR exhibió un grado significativamente mayor de infiltración de células NK en comparación con los otros grupos (Figura 5B). Además, se evaluó la expresión de la proteína CEA en los tejidos de cáncer de colon utilizando citometría de flujo e inmunofluorescencia (Figura 5C; Figura suplementaria 3A). Los resultados demostraron que la expresión de CEA en el grupo tratado con células hESC-NK CAR fue notablemente menor que la observada en los cuatro grupos de control. Se realizó una imagen dinámica in vivo semanal para rastrear los cambios en el volumen tumoral. Los resultados demostraron que los tumores en los grupos tratados con células NK92, células UCB-NK y células hESC-NK exhibieron una tendencia a la regresión. En particular, en el grupo tratado con células hESC-NK CAR, los volúmenes tumorales comenzaron a disminuir a partir de la segunda semana, con una reducción significativa observada (Figura 5D, E; Figura suplementaria 3B). Además, el análisis de la curva de supervivencia reveló que los ratones que recibieron terapia con células hESC-NK CAR tuvieron la duración mediana de supervivencia más larga (Figura 5F). En conjunto, estos hallazgos indican que las células NK hESC-CAR ejercen un efecto terapéutico a través de la eliminación dirigida de las células de cáncer de colon CEA-positivas.

Las células NK hESC-CAR exhiben un perfil de bioseguridad favorable sin acumulación ni toxicidad orgánica

Para evaluar la seguridad del tratamiento con células NK hESC-CAR, evaluamos tanto la biodistribución de las células NK hESC-CAR en la sangre periférica, así como los marcadores de la función hepática y renal en los ratones tratados. El análisis de la sangre periférica reveló que la proporción de células NK de diferentes fuentes se mantuvo en aproximadamente el 10% durante el tratamiento. A las seis semanas, los niveles de células NK en la sangre periférica se acercaron a cero. Y no se observaron diferencias significativas en las proporciones de células NK en la sangre periférica entre los grupos de tratamiento con NK92, UCB-NK, hESC-NK y hESC-NK CAR en ningún momento (Figura 6A). Además, no se detectaron anomalías evidentes en la función hepática y renal en los grupos de tratamiento (Figuras 6B-E). Estos resultados demuestran una vida útil in vivo limitada sin acumulación, junto con la ausencia de toxicidad orgánica, lo que respalda un perfil de bioseguridad favorable.

Discusión

Este estudio investiga el potencial terapéutico de las células NK modificadas con CAR derivadas de hESC que se dirigen a CEA, un marcador tumoral bien establecido en el CRC (^[16]). En relación con la quimioterapia convencional y los agentes dirigidos (por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR o anti-VEGF), nuestro enfoque ofrece la ventaja del reconocimiento tumoral específico de antígenos, lo que puede preservar los tejidos normales y reducir los efectos adversos sistémicos (^[32], ^[33]). En comparación con las células CAR-T autólogas dirigidas a CEA, la plataforma CAR-NK derivada de hESC presenta varias ventajas teóricas en términos de seguridad y logística (^[34], ^[35]). Las células NK son intrínsecamente menos propensas a desencadenar un síndrome de liberación de citoquinas grave y neurotoxicidad, y no causan GvHD, lo que las hace adecuadas para el uso alogénico. Además, en contraste con las células CAR-NK92, que requieren irradiación antes de la infusión debido a su origen tumoral, las células NK derivadas de hESC generadas en este estudio constituyen un producto "listo para usar", renovable, altamente escalable y estandarizado (^[20], ^[21]). Esta plataforma evita eficazmente los desafíos de la variabilidad del donante y los complejos procesos de fabricación que normalmente se encuentran con las células NK primarias (^[36]). La estructura CEA-CAR específica empleada aquí, diseñada para una activación óptima de las células NK, media una citotoxicidad potente y específica contra las células de cáncer colorrectal CEA-positivas, un resultado consistente con la eficacia observada en otras inmunoterapias dirigidas a CEA (^[37], ^[38]). En conjunto, estos hallazgos respaldan el creciente consenso de que las células CAR-NK representan una alternativa prometedora para los tumores sólidos, particularmente en su capacidad para superar el microambiente tumoral inmunosupresor (TME).

El protocolo de diferenciación de tres etapas utilizado en este estudio ha demostrado ser fundamental para generar una población estable de células NK hESC-CAR con una actividad antitumoral robusta. Este enfoque sistemático no solo garantiza el mantenimiento de los marcadores de pluripotencia durante todo el proceso de diferenciación, sino que también promueve la maduración de las células NK que exhiben una mayor proliferación y funcionalidad. Estos avances podrían conducir potencialmente a una mejora de las terapias con células NK que aprovechen todo el potencial terapéutico de estos efectores inmunitarios en el tratamiento de las neoplasias. Además, la capacidad de producir una población uniforme y potente de células NK a partir de hESC también puede abordar las limitaciones que plantean las fuentes tradicionales de células NK, lo que aumenta la accesibilidad y la viabilidad de las terapias basadas en células NK en entornos clínicos. Además, los mecanismos inmunitarios dilucidados en este estudio resaltan la importancia de la especificidad de las células NK en el contexto del tratamiento del cáncer colorrectal. Los ensayos clínicos en fase inicial han demostrado una seguridad alentadora y una actividad antitumoral preliminar de las células CAR-NK dirigidas a varios antígenos en el CRC avanzado, particularmente en pacientes refractarios a las terapias estándar (^[39], ^[40]). La citotoxicidad demostrada de las células NK hESC-CAR contra las líneas celulares de cáncer colorrectal CEA-positivas, junto con su perfil de seguridad favorable, subraya el potencial de estas células diseñadas para inducir respuestas antitumorales robustas.

En particular, el scFv MEF23 incorporado en el constructo CAR no exhibe reactividad cruzada con los miembros de la familia CEACAM murina. Dada la ausencia de expresión humana de CEA en los tejidos normales de los ratones con xenoinjertos tumorales, este modelo in vivo no puede replicar completamente los efectos de "on-target, off-tumor" clínicamente relevantes asociados con la inmunoterapia celular dirigida a CEA. Se justifican investigaciones futuras que utilicen modelos de ratones transgénicos que expresen CEA humano para evaluar rigurosamente los efectos de "on-target, off-tumor" y avanzar en la evaluación de seguridad traslacional de esta estrategia terapéutica. Si bien la fluorescencia de GFP sirvió como un sustituto fiable para rastrear la expresión del transgen en este estudio, reconocemos que proporciona una lectura indirecta de la expresión de CAR. Aunque la correlación entre GFP y la transcripción de CAR es generalmente fiable, persisten posibles discrepancias a nivel de la proteína. En consecuencia, nuestras conclusiones basadas en el rastreo de GFP deben considerarse con esta salvedad en mente, y la cuantificación directa de la proteína CAR superficial debe ser una prioridad en los estudios futuros para verificar inequívocamente la persistencia de CAR.

En cuanto a la resistencia, los tumores pueden evadir las células NK CAR dirigidas a CEA mediante la pérdida o la disminución de antígenos bajo presión selectiva, un fenómeno bien documentado en los ensayos de CAR-T (^[15], ^[41]). También podría surgir una resistencia adicional del microambiente tumoral de cáncer colorrectal altamente inmunosupresor, enriquecido con TGF-β, adenosina y células supresoras derivadas del mieloide, que se sabe que disminuyen la citotoxicidad de las células NK. Los enfoques de combinación racionales, como la coadministración con inhibidores de TGF-β, bloqueadores de puntos de control inmunitarios o agentes que remodelan la matriz extracelular, podrían superar potencialmente estos obstáculos y representar una dirección importante para una mayor investigación. Esta especificidad es particularmente crucial dada los desafíos que plantea el TME, que a menudo perjudica la eficacia de las inmunoterapias convencionales. Los hallazgos sugieren que la modulación de vías inmunitarias específicas puede mejorar la actividad antitumoral de las células NK, proporcionando así una base para el desarrollo de nuevas intervenciones inmunoterapéuticas que puedan combatir eficazmente el cáncer colorrectal y otras neoplasias caracterizadas por perfiles antigénicos similares (^[42]). Este estudio no solo contribuye al creciente cuerpo de literatura sobre las terapias con células CAR-NK, sino que también enfatiza la necesidad de una mayor investigación para optimizar estos enfoques para la aplicación clínica.

Basándose en la evidencia preclínica presentada, se requieren varias vías para una mayor investigación para la traducción clínica. En primer lugar, a pesar de la robusta actividad antitumoral de la arquitectura CAR actual, los estudios futuros deberían incorporar elementos funcionales para mejorar la persistencia y superar el TME inmunosupresor (^[43]). La inclusión de un blindaje de citocinas, como la IL-15 unida a la membrana, puede promover la supervivencia y la expansión de las células CAR-NK después de la transferencia adoptiva sin soporte de citocinas exógenas (^[44]), mientras que la coexpresión de receptores de quimiocinas dirigidos a ligandos sobreexpresados en el cáncer colorrectal puede mejorar la infiltración tumoral y la eficacia de la enfermedad metastásica (^[45], ^[46]). Además, la consistencia de lote a lote es fundamental para las células CAR-NK derivadas de hESC como productos "listos para usar" (^[47]). Si bien un banco de células maestro bien caracterizado minimiza la variabilidad del material de partida, una validación rigurosa de los parámetros de diferenciación es esencial para la robustez del proceso (^[48]). Los criterios de liberación integrales deben garantizar que cada lote cumpla con los estándares de potencia y seguridad (^[49]). La producción estandarizada y escalable compatible con GMP, junto con los sistemas de control de calidad, posiciona a la plataforma CAR-NK derivada de hESC para proporcionar inmunoterapias clínicas consistentes y de fácil acceso.

Conclusiones

En resumen, este estudio establece con éxito una fuente renovable y escalable de células CAR-NK listas para usar, mediante la modificación de células madre embrionarias humanas (hESC) para que expresen un receptor quimérico de antígeno específico para el CEA. Las células CAR hESC-NK resultantes exhiben una potente y selectiva citotoxicidad contra células de cáncer colorrectal con alta expresión de CEA, una robusta liberación de citocinas y una supresión tumoral in vivo significativa sin toxicidad detectable fuera del objetivo (Figura 6F). Al proporcionar un producto celular estable y homogéneo, esta plataforma supera las limitaciones clave de las inmunoterapias actuales, como la eficacia limitada y la disponibilidad de la fuente celular. Nuestros hallazgos respaldan el uso de células CAR hESC-NK como una prometedora estrategia terapéutica lista para usar, no solo para el cáncer colorrectal CEA-positivo, sino también para otras neoplasias que expresan CEA, lo que justifica una mayor traslación clínica.