Volver a Noticias Científicas

Investigación Científica

Detalles del Artículo

El anticuerpo bispecífico FAP × CD3, OMTX305, induce efectos antitumorales mediados por las células T en modelos ex vivo de tumores sólidos derivados de pacientes.

Science Advances

11 de Septiembre de 2026

PMID: 42726846

Preclínico

¿Qué significa esto para los pacientes?

Inicia sesión o regístrate para generar explicaciones con IA

En los tumores sólidos, las barreras estromales y la exclusión inmune limitan el éxito de las inmunoterapias.

Por lo tanto, se requieren nuevos enfoques terapéuticos para remodelar el microambiente tumoral y mejorar las respuestas terapéuticas. Desarrollamos un activador de células T bispecífico, trivalente Fab-eIg (OMTX305) que se dirige a la proteína de activación de fibroblastos (FAP), un marcador de los fibroblastos asociados al cáncer que promueven el crecimiento tumoral. Se investigó el potencial traslacional de OMTX305 en modelos preclínicos 2D y 3D derivados de pacientes, con especial atención en las secciones de tumores de precisión (PCTS) de cáncer de pulmón y ovario cocultivadas con PBMC autólogas. Al combinar la biología espacial con el análisis de citocinas y transcriptómica, demostramos que el tratamiento con OMTX305 eliminó los fibroblastos que expresan FAP, indujo respuestas de interferón y remodelación de la matriz extracelular, lo que finalmente desencadenó la muerte por efecto bystander de las células tumorales adyacentes.

Fenotipos inmunitarios distintos y patrones de expresión de PD-L1 parecen estar asociados con diferentes respuestas al tratamiento, lo que sugiere su potencial como biomarcadores para la estratificación de pacientes. Nuestros hallazgos destacan el potencial clínico de dirigir los elementos estromales como terapia contra el cáncer y establecen las PCTS como una potente plataforma preclínica para la evaluación de la inmunoterapia personalizada.

PubMed Central ~20,535 palabras · 103 min de lectura

Los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) son componentes clave del microambiente tumoral (MET) de los tumores sólidos y ejercen una influencia activa sobre el crecimiento tumoral, la invasión y la resistencia a la terapia. Lejos de ser simples elementos estructurales pasivos, los FAC secretan citocinas, factores de crecimiento y proteínas de la matriz extracelular que promueven la angiogénesis, modulan la infiltración de células inmunitarias y facilitan la supervivencia de las células tumorales. A través de una señalización recíproca con las células malignas y las células inmunitarias, ayudan a establecer un nicho inmunosupresor y protumorogénico. La heterogeneidad y la plasticidad de las poblaciones de FAC subrayan aún más sus múltiples funciones en la progresión del cáncer. En consecuencia, el direccionamiento de los FAC y sus interacciones dentro del MET se ha convertido en una estrategia terapéutica emergente destinada a interrumpir la red estromal de soporte que sustenta el desarrollo tumoral (^[1]).

Se ha observado una expresión elevada de la proteína de activación de fibroblastos (FAP) en el 90% de los carcinomas y se asocia con un mal pronóstico en diferentes neoplasias malignas, incluido el cáncer de ovario seroso de alto grado (COSAG) y el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) (^[2]–^[4]). Dado que la serina proteasa de la superficie celular se expresa predominantemente en los FAC (^[4], ^[5]), el direccionamiento terapéutico de la FAP es un enfoque prometedor para remodelar el estroma tumoral y restablecer la inmunidad tumoral.

Las moléculas bispecíficas, en particular los activadores de células T (ACT), son una clase prometedora de inmunoterapias, con más de 100 ACT investigados en estudios clínicos (^[6]). Los ACT están diseñados para unirse tanto a CD3 en las células T como a un antígeno específico del objetivo en las células cancerosas o en el MET, redirigiendo así las células T hacia un objetivo maligno (^[6]). Solo cuando se produce la unión simultánea de los dos antígenos, se forma una sinapsis inmunológica, lo que conduce a la activación de las células T y a la lisis de las células diana mediante la liberación de gránulos citolíticos y citocinas proinflamatorias (^[7]–^[9]). Si bien los ACT tienen un gran éxito en las neoplasias hematológicas, su éxito clínico en los tumores sólidos sigue siendo limitado (^[10]). Entre las principales barreras se encuentra el MET inmunosupresor de los tumores sólidos, que restringe la infiltración y la función citotóxica de las células T (^[10], ^[11]). Aquí, desarrollamos una nueva molécula bispecífica, un fragmento de unión a antígenos (Fab) de inmunoglobulina diseñada con tres valencias (Fab-eIg) que dirige la FAP y CD3 (OMTX305), con el objetivo de modular el MET y restaurar la funcionalidad de las células T. Evaluamos sistemáticamente esta estrategia, comenzando con cultivos bidimensionales (2D) de FAC y fibroblastos normales (FN) derivados del paciente, pasando a esferoides de FAC 3D más complejos y esferoides heterotípicos de FAC y células tumorales, y finalmente centrándonos en rebanadas de tumores de precisión (RTP) derivadas de pacientes con cáncer de ovario y cáncer de pulmón como modelos avanzados. Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con OMTX305 puede activar las células T para inducir la muerte de las células diana en las regiones estromales positivas para FAP y la muerte de las células tumorales adyacentes. En particular, los resultados de las RTP sugieren que se debe estudiar más a fondo los fenotipos inmunitarios en el COSAG y los perfiles de los puntos de control inmunitario en el CPNM como predictores de la respuesta a la terapia con OMTX305 y para la estratificación de pacientes. En conjunto, nuestros hallazgos subrayan el potencial terapéutico de las estrategias de direccionamiento del estroma en el cáncer. Este estudio destaca aún más las RTP como una plataforma ex vivo traslacional para perfilar las respuestas al tratamiento específicas del tipo de célula dentro del MET nativo, lo que ofrece una vía prometedora hacia la inmunoterapia personalizada.

RESULTADOS

OMTX305 induce citotoxicidad dependiente de FAP en los FAC derivados del paciente a través de la activación de las células T

Primero, generamos inmunoglobulinas G-like bispecíficas que dirigen la FAP × CD3 utilizando la plataforma tecnológica eIg previamente establecida (^[12]), caracterizadas ya sea por una estequiometría de 1 + 1 (eIg) o de 2 + 1 (Fab-eIg) (Fig. 1A y fig. S1A). Las moléculas purificadas mostraron las bandas esperadas de las cadenas pesadas y ligeras en el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y un único pico en la cromatografía de exclusión por tamaño analítica (fig. S1, B y C). En particular, la presencia de dos sitios de unión a FAP en la Fab-eIg 2 + 1 se tradujo en una unión significativamente mayor a las células HT1080-FAP que expresan FAP en comparación con la eIg 1 + 1 [valores de CE50 (concentración efectiva mediana) de 0,03 nM para la Fab-eIg y 14 nM para la eIg] (fig. S1D). No se observó unión con las células HT1080 negativas para FAP, lo que confirmó la especificidad (fig. S1E). Ambas moléculas fueron capaces de unirse a las células Jurkat CD3+, aunque aquí la Fab-eIg 2 + 1 mostró una unión aproximadamente 26 veces más débil en comparación con la eIg 1 + 1 (valores de CE50 de 46 nM para la Fab-eIg y 1,3 nM para la eIg) (fig. S1H). No obstante, en comparación con la eIg, la Fab-eIg medió una mayor muerte de las células diana HT1080-FAP, 20 veces mayor, en presencia de células mononucleares de sangre periférica (CMP) de donantes sanos (valores de CE50 de 0,15 nM para la Fab-eIg y 3,1 nM para la eIg en la fig. S1F). No se observó citotoxicidad con las células HT1080 de tipo salvaje (WT), lo que demostró la muerte selectiva de las células con expresión ectópica de FAP (fig. S1G). La Fab-eIg estimuló aún más la proliferación de las células T CD4+ y CD8+ y la activación de las células T, según lo midió la liberación de interferón-γ (IFN-γ) (fig. S1, I a K). En conclusión, la molécula Fab-eIg 2 + 1 (designada OMTX305) mostró una actividad de activación de células T superior y, por lo tanto, se utilizó para estudios posteriores. Para excluir la unión de OMTX305 a tejidos que expresan niveles basales de FAP, se realizaron estudios de reactividad cruzada de tejidos con la misma secuencia de scFv anti-FAP. No se observó tinción específica en los tejidos humanos no diana (fig. S1, L a N y tabla S3), lo que sugiere la ausencia de unión detectable de OMTX305 a los tejidos humanos sanos.

A continuación, evaluamos la eficacia de OMTX305 en los fibroblastos primarios que expresan endógenamente diferentes niveles de FAP, ya que estas células representan el objetivo previsto del ACT. Por lo tanto, se aislaron FAC y FN del tumor y del tejido normal adyacente de un paciente con CPNM, generando un par de líneas celulares inmortalizadas, denominadas IKP-CAF-001 e IKP-NF-001, según se describió anteriormente (^[13]). El análisis de inmunohistoquímica (IHQ) del tejido original del paciente confirmó la expresión de FAP en el estroma tumoral, mientras que el tejido normal adyacente carecía de expresión detectable de FAP (Fig. 1B). En consecuencia, IKP-CAF-001 expresó niveles más altos de proteína FAP y ARNm que IKP-NF-001, mientras que la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico A549 no mostró expresión detectable de ARNm o proteína FAP (Fig. 1B y fig. S2D).

Para probar la sensibilidad de las células a OMTX305, establecimos una cocultivo de FAC con CMP alogénicas de donantes sanos (Fig. 1C). El cocultivo indujo una citotoxicidad alorreactiva de base (fig. S2, A a C). De manera similar a las células HT1080-FAP (fig. S1D), la exposición a OMTX305 disminuyó la viabilidad de IKP-CAF-001 FAP+ de forma dependiente de la dosis, pero solo en presencia de CMP (Fig. 1D). En contraste, la viabilidad de A549 FAP− e IKP-NF-001 no se vio afectada por el tratamiento con OMTX305 (Fig. 1E), lo que confirmó la citotoxicidad específica del objetivo, probablemente mediada por la activación de las células T.

Luego, analizamos un par adicional de FAC/FN inmortalizadas derivadas del paciente (fig. S2, D a G) y tres pares de FAC/FN primarias (fig. S2, H a P). Se observó una expresión variable de FAP en estos pares de FAC/FN aislados, así como en sus tejidos originales (figs. S2 y S3). En los FN, los niveles de FAP se regularon al alza mediante el cultivo ex vivo, en línea con el cambio fenotípico inducido por el cultivo de los fibroblastos informado previamente (^[14], ^[15]). La citotoxicidad mediada por el ACT se correlacionó estrechamente con la diferencia relativa en la expresión de la proteína FAP dentro de cada par de FAC/FN (Fig. 1F). En resumen, encontramos que el tratamiento con OMTX305 reduce la viabilidad de los FAC en una forma dependiente de FAP y de las células inmunitarias.

Los esferoides de FAC que expresan FAP son infiltrados y destruidos por las células T en respuesta a OMTX305

A continuación, investigamos si el tratamiento con OMTX305 destruye los FAC y promueve la infiltración de células T en las estructuras celulares 3D. Por lo tanto, generamos esferoides de IKP-CAF-001 con etiqueta de proteína verde fluorescente (GFP), que mantuvieron su expresión de proteína FAP en el cultivo 3D (Fig. 2A). Los esferoides se cocultivaron con CMP alogénicas de donantes sanos y se trataron con OMTX305 (Fig. 2B). En presencia de CMP, el tratamiento con OMTX305 indujo una citotoxicidad dependiente de la dosis, caracterizada por la destrucción de la estructura general, la pérdida de células GFP+ y el aumento de la liberación de LDH (Fig. 2, C y D). Para evaluar la infiltración y la activación de las células T en los esferoides de IKP-CAF-001, realizamos tinciones de inmunofluorescencia múltiple (IFM) (Fig. 2E). Después de 24 horas de cocultivo, las células T CD3+ penetraron en los esferoides de FAC, con una infiltración significativamente mayor después del tratamiento con OMTX305 (densidad de células T: 593 células/mm2 antes del tratamiento y 1409 células/mm2 después del tratamiento) (Fig. 2F). En base a la expresión de la granzima B (GrB), las células T infiltrantes se activaron significativamente con el tratamiento (Fig. 2G) e indujeron la apoptosis en las células IKP-CAF-001, como se reveló mediante la tinción de caspasa 3 escindida (CC3) (Fig. 2H). Para confirmar la dependencia de FAP de estos efectos, repetimos los ensayos de esferoides con la línea celular de CPNM H1437, que carece de expresión de FAP (fig. S4A). Aquí, el tratamiento con OMTX305 no indujo la infiltración, la activación ni la citotoxicidad de las células T (fig. S4, B a G). En resumen, demostramos que OMTX305 promueve la infiltración, la activación y la apoptosis de las células diana en las estructuras celulares 3D que expresan FAP.

En los esferoides heterotípicos, OMTX305 induce la muerte celular en los FAC y las células tumorales

Para imitar más de cerca la complejidad tumoral in vivo, generamos esferoides heterotípicos que comprenden fibroblastos FAP+ y células tumorales FAP−, lo que nos permite rastrear la respuesta de ambos tipos de células al tratamiento con OMTX305. Los esferoides heterotípicos se establecieron mediante la siembra conjunta de IKP-CAF-001 con etiqueta GFP y células tumorales de CPNM H1437 en una proporción de 3:1. En estos esferoides, el núcleo consistió en fibroblastos FAP+ (IKP-CAF-001), que estaban rodeados de células tumorales EpCAM+ H1437. En condiciones de referencia, los esferoides heterotípicos eran viables y no mostraban signos de apoptosis, lo que indicaba la ausencia de CC3 (Fig. 3A). Tras el cocultivo con CMP y el tratamiento con OMTX305 (Fig. 3B), los esferoides mostraron una desintegración estructural dependiente del tiempo y de la dosis, pérdida de la señal GFP (Fig. 3C) y aumento de la citotoxicidad (Fig. 3D). Para evaluar la dinámica espacial de la infiltración, la activación y la apoptosis de las células T, realizamos tinciones de IFM (Fig. 3E). El área tumoral se definió mediante una tinción de pancitoqueratina (pan-CK) de las células tumorales H1437, mientras que la expresión de GFP marcaba el compartimento de los fibroblastos. Independientemente del tratamiento, las células T alogénicas se infiltraron desde el cocultivo de CMP circundante hacia el núcleo de los fibroblastos (Fig. 3, E y F). En ausencia de OMTX305, las células T infiltradas no se activaron (Fig. 3, E y G). El tratamiento con OMTX305 mejoró significativamente la acumulación y la activación de las células T, con un aumento de la densidad de CD3 y la expresión de GrB en el núcleo de los fibroblastos, junto con una tendencia no significativa hacia un aumento de la inducción de la apoptosis (CC3) (Fig. 3, F a H). La apoptosis de las células tumorales aumentó significativamente tras el tratamiento. Esto indica que el direccionamiento de los fibroblastos FAP+ con OMTX305 no solo mejora la infiltración y la citotoxicidad inmunitarias dentro del compartimento de los fibroblastos, sino que también promueve la apoptosis en las células tumorales vecinas, lo que sugiere un efecto antitumoral de bystander.

Las células T son activadas por OMTX305 en las RTP

A continuación, investigamos si el tratamiento con OMTX305 activa las células T en las RTP.

A continuación, evaluamos el potencial terapéutico de OMTX305 en PCTS, que reproducen de manera más precisa la complejidad estructural y celular de los tumores in vivo. Se investigaron las respuestas al tratamiento con OMTX305 en PCTS derivadas de 15 tumores humanos primarios, que comprendían 5 NSCLC y 10 muestras de HGSOC (fig. 4). Con este fin, las PCTS se trataron con OMTX305, con o sin cocultivo de PBMC, durante un máximo de 3 días. Las respuestas al tratamiento se evaluaron mediante ensayos de viabilidad basados en el trifosfato de adenosina (ATP), perfiles de citoquinas en sobrenadantes de cultivo y tinciones mIF, que permiten el seguimiento de las respuestas al tratamiento dentro de diferentes tipos de células (fig. S5, A y B). Las respuestas de los subconjuntos de CAF se controlaron además mediante secuenciación de ARN de una sola célula (single-cell RNA-seq). La capacidad de las células T autólogas en cocultivo para infiltrarse en las PCTS se verificó mediante imágenes 3D utilizando microscopía confocal (fig. S5C). En ausencia de OMTX305, el cocultivo con PBMC autólogas no indujo la activación o citotoxicidad de las células T en las PCTS (fig. S5, D a G).

Para determinar primero si el tratamiento con OMTX305 promueve la infiltración de células T de las PBMC autólogas en cocultivo en los fragmentos tumorales, cuantificamos las densidades de células T CD3+ a partir de las tinciones mIF. Si bien la densidad de células T CD3+ no se vio afectada por el cocultivo de PBMC (Ctrl: 294 células T/mm2, PBMC: 300 células T/mm2), la densidad de células T se redujo significativamente a 175 células/mm2 después de 3 días de tratamiento con OMTX305 (fig. 5A). En un caso (HGSOC-paciente 1), ni el tejido tumoral basal (d0) ni las PCTS de control no tratadas mostraron infiltración de células T, lo que indica que el tratamiento con OMTX305 no indujo una captación detectable de células T en este paciente (fig. 5B). Sin embargo, en los casos con infiltración de células T, las tinciones mIF revelaron un aumento significativo de las células T GrB+ dentro del área estromal FAP+ después de 1 día de tratamiento (fig. 5, C y D). La activación de las células T se demostró además mediante el perfilado de citoquinas del sobrenadante del cultivo de PCTS después de 3 días de tratamiento, lo que mostró un aumento significativo, inducido por el tratamiento, en la producción de GrB y perforina (fig. 5, E y F). También se observó un aumento dependiente de OMTX305 en las citoquinas citolíticas en ausencia de cocultivo de PBMC, lo que indica una activación localizada de las células T residentes en el tejido preexistentes (fig. 5E y fig. S6, A y B). Si bien no se observó una diferencia significativa en la activación de las células T entre el tratamiento con OMTX305 de las PCTS en función de la presencia de PBMC en cocultivo, la actividad citotóxica, reflejada por los niveles de GrB en el sobrenadante, se elevó en cuatro de las seis PCTS de pacientes cuando se cocultivaron con PBMC (fig. 5E). En particular, el tratamiento con OMTX305 condujo además a un aumento significativo en otras proteínas citolíticas, incluidas la granzima A y la granulina, así como la citoquina proinflamatoria IFN-γ y el miembro de la familia de factores de necrosis tumoral, el ligando de Fas (FasL) (fig. 5F y fig. S6, C a F). En resumen, demostramos que OMTX305 puede activar las células T residentes en el tejido dentro de las PCTS derivadas de pacientes, lo que resulta en la liberación de mediadores citolíticos e inmunostimulantes.

La muerte celular se induce en los fibroblastos que expresan FAP y en las células tumorales adyacentes en las PCTS

Dado que se observó una activación significativa de las células T residentes en el tejido en las PCTS después del tratamiento con OMTX305, evaluamos a continuación si la activación inmune se tradujo en la muerte de las células diana. La viabilidad de las PCTS se evaluó mediante un ensayo basado en ATP y análisis mIF. El tratamiento con OMTX305 redujo significativamente los niveles de ATP al 69,6% en comparación con los controles solo con PBMC (fig. 6A). En consonancia con esto, observamos una disminución significativa en la proporción del área FAP+ del 38,2% al 24,2% después del tratamiento (fig. 6B). La tinción CC3+ reveló la inducción de apoptosis en respuesta al tratamiento con OMTX305 durante 3 días (fig. 6C), lo que se correlacionó fuertemente con la activación de las células T, según lo medido por los niveles de GrB en los sobrenadantes del cultivo de PCTS (fig. 6D).

Para determinar qué tipos de células se vieron afectados por la apoptosis inducida por OMTX305, analizamos la colocalización de CC3 con marcadores de linaje utilizando mIF. Se detectó un aumento significativo de la apoptosis en los fibroblastos αSMA+ en el área FAP+. En contraste, hubo menos fibroblastos αSMA+ que eran CC3+ en las áreas FAP− (fig. 6E), lo que respalda la dependencia del objetivo del efecto citotóxico. En algunos pacientes, esto se acompañó de un aumento de las células T CC3+ (fig. 6F). Además, un subconjunto de muestras de pacientes mostró una densidad elevada de células tumorales pan-CK+ apoptóticas después del tratamiento con OMTX305 (fig. 6G).

La magnitud de la inducción de la muerte celular dependiente de OMTX305 en los fibroblastos αSMA+, las células T CD3+ y las células tumorales pan-CK+ fue comparable entre las PCTS con o sin cocultivo de PBMC, lo que sugiere que la citotoxicidad fue mediada principalmente por las células T residentes en el tejido (fig. S7). De manera similar a los efectos observados en la activación de las células T, el cocultivo con PBMC aumentó la densidad de fibroblastos CC3+ en dos de los seis pacientes (un NSCLC y un HGSOC), así como la densidad de células tumorales CC3+ en dos pacientes con HGSOC (fig. S7, A y C).

Para investigar si la apoptosis de las células tumorales estaba relacionada espacialmente con las regiones FAP+, realizamos un análisis de distancia de las células tumorales CC3+ frente a las células tumorales CC3− en relación con las áreas FAP+. A las células tumorales dentro del área FAP+ se les asignó una distancia de cero. La visualización de este análisis se muestra en (fig. 6H). Descubrimos que las células tumorales CC3+ estaban ubicadas significativamente más cerca de las áreas FAP+ que las células tumorales CC3−, lo que sugiere un posible efecto citotóxico secundario (fig. 6I). En promedio, las células tumorales apoptóticas estaban ubicadas entre 10 y 100 μm del área FAP+ (tabla S4). En conclusión, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con OMTX305 induce la apoptosis en los fibroblastos que expresan FAP dentro de las PCTS derivadas de pacientes y, en una fracción de los casos, provoca una muerte secundaria de las células tumorales en las regiones adyacentes al estroma FAP+.

El análisis de las PCTS individuales derivadas de pacientes reveló una variabilidad interpaciente en la respuesta al tratamiento con OMTX305 (fig. S8). En particular, un tumor que carecía de infiltración de células T (HGSOC-paciente 1) no mostró una respuesta significativa de GrB o CC3 después de la exposición a OMTX305. En contraste, los tumores con infiltración preexistente de células T CD3+ generalmente mostraron activación de las células T, como lo demuestra un aumento de la expresión de GrB (por ejemplo, HGSOC-pacientes 3 y 7). Sin embargo, la magnitud de los efectos citotóxicos posteriores varió. Se observó una heterogeneidad similar en las muestras de NSCLC (fig. S8).

Posible impacto de los fenotipos inmunes y el agotamiento inmune en la respuesta a OMTX305

Sobre la base de nuestras observaciones con respecto a la influencia de la distribución de las células T en la eficacia del tratamiento con OMTX305, hipotetizamos que, de manera similar a otras inmunoterapias (^[16], ^[17]), el fenotipo inmune basal de un tumor puede predecir su respuesta a la terapia con OMTX305. Para investigar esto, estratificamos a los pacientes en tres fenotipos inmunes en función de la localización de las células T CD3+ en el tejido tumoral original (d0): tumores "inmunes-desérticos" con una presencia mínima de células T, tumores "inmunes-excluidos" con infiltración de células T restringida al estroma y tumores "inmunes-inflamados" con células T que se infiltran tanto en el tumor como en el estroma (fig. 7A). Los puntos de corte para cada fenotipo se establecieron en 100 células/mm2 en función de nuestra cohorte de pacientes (^[18], ^[19]).

Entre la cohorte de HGSOC, los tres fenotipos inmunes estuvieron representados: un paciente "inmune-desértico", cinco pacientes "inmunes-excluidos" y cuatro pacientes "inmunes-inflamados" (fig. 7B). El paciente "inmune-desértico" (HGSOC-paciente 1, azul) carecía de células T y, en consecuencia, no mostró producción de GrB ni inducción de apoptosis en respuesta al tratamiento con OMTX305 (fig. 7, C a E). En contraste, los tumores "inmunes-inflamados" (HGSOC-pacientes 7 a 10, rosa) mostraron en su mayoría los niveles más altos de activación de células T e inducción de apoptosis. Los tumores "inmunes-excluidos" (HGSOC-pacientes 2 a 6) mostraron respuestas variables, con un espectro de liberación de GrB e inducción de apoptosis. En particular, las muestras de HGSOC "inmunes-excluidas" e "inmunes-inflamadas" respondieron al tratamiento con OMTX305 con inducción de muerte celular tanto en fibroblastos como en células tumorales en la región FAP+.

En la cohorte de NSCLC, aunque los tumores expresaron diferentes proporciones de infiltración de células T en el área del tumor y el estroma, todas las muestras se clasificaron como "inmunes-inflamadas" y tenían una densidad general de células T más alta que los pacientes con HGSOC (fig. 7F). Además, las respuestas al tratamiento variaron, lo que sugiere que pueden influir factores adicionales en la sensibilidad a OMTX305. En la práctica clínica, la elegibilidad para la inmunoterapia en pacientes con NSCLC se guía mediante la puntuación de la proporción tumoral, que indica el porcentaje de células tumorales PD-L1+ (^[20]). Estratificamos a los pacientes con NSCLC por expresión de PD-L1 en función de la evaluación histológica de los diagnósticos clínicos realizados por el departamento de patología de nuestro hospital (tabla S2). Si bien un tumor (NSCLC-paciente 1, verde) no expresó PD-L1 (0 a 1% de células tumorales PD-L1+), la mayoría de los tumores mostraron una expresión intermedia (2 a 49% de células tumorales PD-L1+, púrpura) y un paciente (NSCLC-paciente 5, rojo) tuvo una alta expresión de PD-L1 (100% de células tumorales PD-L1+).

A pesar de estar clasificados como "inmunes-inflamados", el NSCLC-paciente 5 (naranja) con alta expresión de PD-L1 no mostró inducción de GrB y CC3 después del tratamiento con OMTX305 (fig. 7, G a I), lo que sugiere agotamiento inmune o resistencia. En contraste, las células T se activaron en respuesta a OMTX305 en todas las demás muestras de NSCLC, y la respuesta apoptótica más fuerte se observó en el NSCLC-paciente 1 (verde), que no tenía expresión detectable de PD-L1. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la alta densidad de CC3 en esta muestra en particular puede haber estado influenciada por un área FAP+ pequeña.

En resumen, estos hallazgos sugieren que tanto los pacientes con NSCLC como los de HGSOC pueden responder a la terapia con OMTX305. Si bien el tamaño limitado de la cohorte no permite una comparación estadística de los subgrupos, los resultados exploratorios indican que, en HGSOC, el fenotipo inmune basal puede servir como un predictor útil de la eficacia del tratamiento. En NSCLC, donde la infiltración inmune fue mayor, la expresión de PD-L1 puede considerarse como un factor adicional. Esta observación debe confirmarse en cohortes de pacientes más grandes.

OMTX305 activa las células T y modula la expresión génica específica del subconjunto en los fenotipos inmunes de HGSOC

Para evaluar el efecto del tratamiento con OMTX305 en las subpoblaciones de células T y CAF de los pacientes con HGSOC en los diferentes fenotipos inmunes, analizamos los transcriptomas de una sola célula de las PCTS de control y tratadas con OMTX305 con cocultivo de PBMC de cuatro pacientes con HGSOC (pacientes 1 [inmune-desértico], 2 y 3 [inmunes-excluidos] y 9 [inmune-inflamado]) utilizando la plataforma de secuenciación de ARN de una sola célula 10x Genomics.

El agrupamiento no supervisado identificó tres subconjuntos de células T (clústeres 0 a 2) que se conservaron en los cuatro pacientes (fig. 8, A a C). En consonancia con su infiltración basal mínima (fig. 5B), el HGSOC-paciente 1 "inmune-desértico" contribuyó con el menor número de células T (fig. 8C) a la cohorte de ARN de una sola célula. Después del tratamiento con OMTX305, el número total de células T se mantuvo en gran medida en los pacientes con HGSOC (fig. 8D). Todos los subconjuntos de células T se redujeron con el tratamiento en el paciente 3, lo que es consistente con el aumento de CC3 en las células T observadas en las tinciones mIF (fig. 6F, HGSOC-paciente 3 representado por un círculo negro).

El subconjunto de células T más grande, el clúster 0, correspondía a las células T reguladoras CD4+, definidas por la coexpresión de FOXP3, IL2RA y CTLA4, junto con marcadores de activación como ICOS, TNFRSF4 y IL12RB2. El clúster 1 consistió en células T efectoras CD8+, caracterizadas por CD8A, KLRD y EOMES, y un enriquecimiento de moléculas efectoras citotóxicas que incluyen GZMA, GZMK y PRF1 (fig. 8E). El clúster 2 comprendió una pequeña población de células T altamente proliferativas, que se caracterizó por una mayor expresión de MKI67, FOS y DNAJB1 (fig. 8, A y E).

OMTX305 indujo un programa de activación coordinada en las células T CD4+ (Fig. 8F), como lo demuestra la regulación al alza de las citocinas asociadas a las células T colaboradoras 1 (IFNG y TNF) y los receptores costimuladores (ICOS, TNFRSF4 y TNFRSF9). En paralelo, el tratamiento mejoró las vías de señalización de MYC, E2F e interleucina-2, lo que favoreció la expansión de las células T CD4+ (fig. S9). Esta activación se acompañó de la inducción de puntos de control inmunitarios y moléculas de retroalimentación reguladora, incluidos CTLA4, ENTPD1 y NR4A1, lo que indica la activación de vías inhibitorias compensatorias. Cabe destacar que estos cambios no se asociaron con un cambio proapoptótico, ya que FAS, FASLG, FADD y CASP8 permanecieron sin cambios o disminuyeron tras el tratamiento con OMTX305 (Fig. 8E).

En las células T CD8+, OMTX305 promovió la diferenciación hacia un fenotipo de efector citotóxico, como lo indica la mayor expresión de IFNG, PERF1 y GZMB, junto con factores de transcripción asociados a la activación, como NFATC1. Además, se regularon al alza los receptores inhibitorios (TIGIT y LAG3) y las moléculas proapoptóticas FADD y CASP8. Por el contrario, FAS y FASLG permanecieron sin cambios, y el marcador de agotamiento terminal TOX se redujo, lo que puede sugerir la preservación del potencial efector a pesar de la inducción de puntos de control (Fig. 8E).

OMTX305 induce el remodelado de la MEC y las respuestas de los interferones en los CAF

La agrupación no supervisada de las células estromales reveló 5 subgrupos distintos de CAF (grupos del 0 al 4), presentes tanto en las muestras no tratadas como en las tratadas con OMTX305, cada uno de los cuales mostró una expresión diferencial de FAP y una distribución variable entre los pacientes (Fig. 9, A a D, y fig. S10A). El grupo 0 exhibió la mayor expresión de FAP, seguido de los grupos 1 y 2 con niveles intermedios, mientras que los grupos 3 y 4 expresaron bajos niveles de FAP. El paciente con HGSOC con "desierto inmunitario", paciente 1, contribuyó con el menor número de células estromales a la cohorte de ARN de una sola célula (fig. S10B).

El tratamiento con OMTX305 condujo a una reducción del número total de células estromales en todos los pacientes. Este efecto fue ligeramente más fuerte en las subpoblaciones FAP-alto (Fig. 9, D y E).

Entre las subpoblaciones identificadas, identificamos un grupo de miofibroblastos FAP-alto (grupo 0) con una expresión elevada de genes de la matriz extracelular (MEC), un grupo de CAF inflamatorio y metabólicamente activo IL-6-alto (grupo 1, FAP-intermedio), un grupo de respuesta a los interferones (grupo 2, FAP-intermedio), un grupo con alta expresión de proteínas de choque térmico (grupo 3, FAP-bajo) y un grupo de pericitos (grupo 4, FAP-bajo), similar a las subpoblaciones de CAF descritas en otros estudios (Fig. 9F) (^[21]–^[24]).

En respuesta al tratamiento con OMTX305, especialmente el subgrupo de miofibroblastos del grupo 0, se observaron cambios en los genes relacionados con la MEC, como una reducción de la producción de colágeno (COL1A1, COL1A2, COL6A3 y COL11A1) y un aumento de la expresión de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) (MMP1, MMP3 y MMP11). En los diferentes subgrupos, los genes de respuesta a los interferones (IRF1, IRF7, RSAD2 y CXCL9) y los genes de respuesta al estrés (ATF3 y PMAIP1) fueron inducidos por el tratamiento con OMTX305, junto con los genes implicados en la presentación de antígenos (TAPBP, TAP1 y TAP2) (Fig. 9G y fig. S10C).

En resumen, el análisis de ARN de una sola célula de PCTS reveló una reducción del número de CAF inducida por el tratamiento con OMTX305 en diferentes fenotipos inmunitarios. Si bien los miofibroblastos FAP-alto indicaron que el tratamiento con OMTX305 indujo el remodelado de la MEC, se desencadenó una respuesta de los interferones en los diferentes grupos de CAF.

OMTX305 induce la citotoxicidad dependiente de FAP en los CAF derivados de pacientes a través de la interacción con las células T

Primero, generamos inmunoglobulinas G-similares bispecíficas FAP × CD3 que se dirigen a las células T efectoras (TCE) utilizando la plataforma tecnológica eIg previamente establecida (^[12]), caracterizadas por una estequiometría de 1 + 1 (eIg) o 2 + 1 (Fab-eIg) (Fig. 1A y fig. S1A). Las moléculas purificadas mostraron las bandas esperadas de las cadenas pesadas y ligeras en el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y un pico único en la cromatografía de exclusión por tamaño analítica (fig. S1, B y C). Cabe destacar que la presencia de dos sitios de unión a FAP en la Fab-eIg 2 + 1 se tradujo en un aumento significativo de la unión a las células HT1080-FAP que expresan FAP en comparación con la eIg 1 + 1 [valores de CE50 (concentración efectiva mediana) de 0,03 nM para la Fab-eIg y 14 nM para la eIg] (fig. S1D). No se observó unión con las células HT1080 negativas para FAP, lo que confirmó la especificidad (fig. S1E). Ambas moléculas fueron capaces de unirse a las células Jurkat CD3+, aunque aquí la Fab-eIg 2 + 1 mostró una unión aproximadamente 26 veces más débil en comparación con la eIg 1 + 1 (valores de CE50 de 46 nM para la Fab-eIg y 1,3 nM para la eIg) (fig. S1H). No obstante, en comparación con la eIg, la Fab-eIg medió una mayor actividad de unión a las células T, con una mayor proliferación y activación de las células T CD4+ y CD8+, medida por la liberación de interferón-γ (IFN-γ) (fig. S1, I a K). En conclusión, la molécula trivalente Fab-eIg 2 + 1 (designada OMTX305) mostró una actividad de unión a las células T superior y, por lo tanto, se utilizó para estudios posteriores. Para excluir la unión de OMTX305 a tejidos que expresan niveles basales de FAP, se realizaron estudios de reactividad cruzada de tejidos con la misma secuencia de scFv anti-FAP. No se observó tinción específica en los tejidos humanos no diana (fig. S1, L a N, y tabla S3), lo que sugiere la ausencia de unión detectable de OMTX305 a los tejidos humanos sanos.

A continuación, evaluamos la eficacia de OMTX305 en fibroblastos primarios que expresan endógenamente diferentes niveles de FAP, ya que estas células representan el objetivo previsto de la TCE. Por lo tanto, se aislaron CAF y NF del tumor y el tejido normal adyacente de un paciente con CPN, generando un par de líneas celulares inmortalizadas, denominadas IKP-CAF-001 e IKP-NF-001, según se describió anteriormente (^[13]). El análisis de inmunohistoquímica (IHQ) del tejido original del paciente confirmó la expresión de FAP en el estroma tumoral, mientras que el tejido normal adyacente carecía de expresión detectable de FAP (Fig. 1B). En consecuencia, IKP-CAF-001 expresó niveles más altos de proteína y ARNm de FAP que IKP-NF-001, mientras que la línea celular de tumor de CPN A549 no mostró expresión detectable de ARNm o proteína de FAP (Fig. 1B y fig. S2D).

Para probar la sensibilidad de las células a OMTX305, establecimos una cocultivo de CAF con PBMCs alogénicas de donantes sanos (Fig. 1C). El cocultivo indujo una citotoxicidad alorreactiva de base (fig. S2, A a C). De manera similar a las células HT1080-FAP (fig. S1D), la exposición a OMTX305 disminuyó la viabilidad de IKP-CAF-001 FAP+ de forma dependiente de la dosis, pero solo en presencia de PBMCs (Fig. 1D). Por el contrario, la viabilidad de A549 FAP− e IKP-NF-001 no se vio afectada por el tratamiento con OMTX305 (Fig. 1E), lo que confirmó la citotoxicidad específica del objetivo, probablemente mediada por la interacción con las células T.

Luego, analizamos un par adicional de CAF/NF inmortalizados (fig. S2, D a G) y tres pares de CAF/NF primarios (fig. S2, H a P). Se observó una expresión variable de FAP en estos pares de CAF/NF aislados, así como en sus tejidos originales (figs. S2 y S3). En NF, los niveles de FAP se regularon al alza mediante el cultivo ex vivo, en línea con la desviación fenotípica de los fibroblastos inducida por el cultivo informada previamente (^[14], ^[15]). La citotoxicidad mediada por la TCE se correlacionó estrechamente con la diferencia relativa en la expresión de la proteína FAP dentro de cada par de CAF/NF (Fig. 1F). En resumen, encontramos que el tratamiento con OMTX305 reduce la viabilidad de los fibroblastos de los CAF de forma dependiente de FAP y de las células inmunitarias.

Los esferoides de CAF que expresan FAP son infiltrados y destruidos por las células T en respuesta a OMTX305

A continuación, investigamos si el tratamiento con OMTX305 destruye los CAF y promueve la infiltración de células T en estructuras celulares tridimensionales. Por lo tanto, generamos esferoides de IKP-CAF-001 con etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), que mantuvieron su expresión de proteína FAP en el cultivo 3D (Fig. 2A). Los esferoides se cocultivaron con PBMCs alogénicas de donantes sanos y se trataron con OMTX305 (Fig. 2B). En presencia de PBMCs, el tratamiento con OMTX305 indujo una citotoxicidad dependiente de la dosis, caracterizada por la destrucción de la estructura general, la pérdida de células GFP+ y el aumento de la liberación de LDH (Fig. 2, C y D). Para evaluar la infiltración y activación de las células T en los esferoides de IKP-CAF-001, realizamos tinciones de inmunofluorescencia múltiple (mIF) (Fig. 2E). Después de 24 horas de cocultivo, las células T CD3+ penetraron en los esferoides de CAF, con una infiltración significativamente mayor tras el tratamiento con OMTX305 (densidad de células T: 593 células/mm2 antes del tratamiento y 1409 células/mm2 después del tratamiento) (Fig. 2F). En función de la expresión de la granzima B (GrB), las células T infiltrantes se activaron significativamente con el tratamiento (Fig. 2G) e indujeron la apoptosis en las células IKP-CAF-001, como se reveló mediante la tinción de caspasa-3 escindida (CC3) (Fig. 2H). Para confirmar la dependencia de FAP de estos efectos, repetimos los ensayos de esferoides con la línea celular de tumor de CPN H1437, que carece de expresión de FAP (fig. S4A). Aquí, el tratamiento con OMTX305 no indujo la infiltración, la activación o la citotoxicidad de las células T (fig. S4, B a G). En resumen, demostramos que OMTX305 promueve la infiltración, la activación y la apoptosis de las células diana en estructuras celulares 3D que expresan FAP.

En los esferoides heterotípicos, OMTX305 induce la muerte celular en los CAF y las células tumorales

Para imitar más de cerca la complejidad del tumor in vivo, generamos esferoides heterotípicos que comprenden fibroblastos FAP+ y células tumorales FAP−, lo que nos permite rastrear la respuesta de ambos tipos de células al tratamiento con OMTX305. Los esferoides heterotípicos se establecieron mediante la siembra conjunta de IKP-CAF-001 con etiqueta GFP y células tumorales de CPN H1437 en una proporción de 3:1. En estos esferoides, el núcleo consistió en fibroblastos FAP+ (IKP-CAF-001), que estaban rodeados de células tumorales EpCAM+ H1437. En condiciones basales, los esferoides heterotípicos eran viables y no mostraban signos de apoptosis, lo que indicaba la ausencia de CC3 (Fig. 3A). Tras el cocultivo con PBMCs y el tratamiento con OMTX305 (Fig. 3B), los esferoides mostraron una desintegración estructural dependiente del tiempo y de la dosis, pérdida de la señal GFP (Fig. 3C) y aumento de la citotoxicidad (Fig. 3D). Para evaluar la dinámica espacial de la infiltración, la activación y la apoptosis de las células T, realizamos tinciones de mIF (Fig. 3E). El área tumoral se definió mediante una tinción de pancitoqueratina (pan-CK) de las células tumorales H1437, mientras que la expresión de GFP marcaba el compartimento de los fibroblastos. Independientemente del tratamiento, las células T alogénicas se infiltraron desde el cocultivo de PBMCs circundante hacia el núcleo de los fibroblastos (Fig. 3, E y F). En ausencia de OMTX305, las células T infiltradas no se activaron (Fig. 3, E y G). El tratamiento con OMTX305 mejoró significativamente la acumulación y la activación de las células T, con un aumento de la densidad de CD3 y la expresión de GrB en el núcleo de los fibroblastos, junto con una tendencia no significativa hacia un aumento de la inducción de la apoptosis (CC3) (Fig. 3, F a H). La apoptosis de las células tumorales aumentó significativamente tras el tratamiento. Esto indica que la focalización de los fibroblastos FAP+ con OMTX305 no solo mejora la infiltración y la citotoxicidad inmunitarias dentro del compartimento de los fibroblastos, sino que también promueve la apoptosis en las células tumorales vecinas, lo que sugiere un efecto antitumoral de espectador.

Las células T se activan con OMTX305 en PCTS

A continuación, evaluamos el potencial terapéutico de OMTX305 en PCTS, que reproducen de manera más precisa la complejidad estructural y celular de los tumores in vivo. Se investigaron las respuestas al tratamiento con OMTX305 en PCTS derivadas de 15 tumores humanos primarios, que comprendían 5 NSCLC y 10 muestras de HGSOC (fig. 4). Con este fin, las PCTS se trataron con OMTX305, con o sin cocultivo de PBMC, durante un máximo de 3 días. Las respuestas al tratamiento se evaluaron mediante ensayos de viabilidad basados en el trifosfato de adenosina (ATP), perfiles de citoquinas en sobrenadantes de cultivo y tinciones mIF, que permiten el seguimiento de las respuestas al tratamiento dentro de diferentes tipos de células (fig. S5, A y B). Las respuestas de los subconjuntos de CAF se monitorearon además mediante secuenciación de ARN de una sola célula (single-cell RNA-seq). Se verificó la capacidad de las células T autólogas en cocultivo para infiltrarse en las PCTS mediante imágenes 3D utilizando microscopía confocal (fig. S5C). En ausencia de OMTX305, el cocultivo con PBMC autólogas no indujo la activación o citotoxicidad de las células T en las PCTS (fig. S5, D a G).

Para determinar primero si el tratamiento con OMTX305 promueve la infiltración de células T de PBMC autólogas en cocultivo en los fragmentos tumorales, cuantificamos las densidades de células T CD3+ a partir de las tinciones mIF. Si bien la densidad de células T CD3+ no se vio afectada por el cocultivo de PBMC (Ctrl: 294 células T/mm2, PBMC: 300 células T/mm2), la densidad de células T se redujo significativamente a 175 células/mm2 después de 3 días de tratamiento con OMTX305 (fig. 5A). En un caso (HGSOC, paciente 1), ni el tejido tumoral basal (d0) ni las PCTS de control no tratadas mostraron infiltración de células T, lo que indica que el tratamiento con OMTX305 no indujo una captación detectable de células T en este paciente (fig. 5B). Sin embargo, en los casos con infiltración de células T, las tinciones mIF revelaron un aumento significativo de las células T GrB+ dentro del área estromal FAP+ después de 1 día de tratamiento (fig. 5, C y D). La activación de las células T se demostró además mediante el perfilado de citoquinas del sobrenadante del cultivo de PCTS después de 3 días de tratamiento, lo que mostró un aumento significativo, inducido por el tratamiento, en la producción de GrB y perforina (fig. 5, E y F). También se observó un aumento dependiente de OMTX305 en las citoquinas citolíticas en ausencia de cocultivo de PBMC, lo que indica una activación localizada de las células T residentes en el tejido preexistentes (fig. 5E y fig. S6, A y B). Si bien no se observó una diferencia significativa en la activación de las células T entre el tratamiento con OMTX305 de las PCTS en función de la presencia de PBMC en cocultivo, la actividad citotóxica, reflejada por los niveles de GrB en el sobrenadante, se elevó en cuatro de las seis PCTS de pacientes cuando se cocultivaron con PBMC (fig. 5E). En particular, el tratamiento con OMTX305 condujo además a un aumento significativo en otras proteínas citolíticas, incluidas la granzima A y la granulina, así como la citoquina proinflamatoria IFN-γ y el miembro de la familia de factores de necrosis tumoral, el ligando Fas (FasL) (fig. 5F y fig. S6, C a F). En resumen, demostramos que OMTX305 puede activar las células T residentes en el tejido dentro de las PCTS derivadas de pacientes, lo que resulta en la liberación de mediadores citolíticos e inmunostimulantes.

La muerte celular se induce en fibroblastos que expresan FAP y en las células tumorales adyacentes en las PCTS

Dado que se observó una activación significativa de las células T residentes en el tejido en las PCTS después del tratamiento con OMTX305, evaluamos a continuación si la activación inmune se tradujo en la muerte de las células diana. La viabilidad de las PCTS se evaluó mediante un ensayo basado en ATP y análisis mIF. El tratamiento con OMTX305 redujo significativamente los niveles de ATP al 69,6% en comparación con los controles solo con PBMC (fig. 6A). En consonancia con esto, observamos una disminución significativa en la proporción del área FAP+ del 38,2% al 24,2% después del tratamiento (fig. 6B). La tinción CC3+ reveló la inducción de apoptosis en respuesta al tratamiento con OMTX305 durante 3 días (fig. 6C), lo que se correlacionó fuertemente con la activación de las células T, según lo midieron los niveles de GrB en los sobrenadantes del cultivo de PCTS (fig. 6D).

Para determinar qué tipos de células se vieron afectadas por la apoptosis inducida por OMTX305, analizamos la colocalización de CC3 con marcadores de linaje utilizando mIF. Se detectó un aumento significativo de la apoptosis en los fibroblastos αSMA+ en el área FAP+. En contraste, hubo menos fibroblastos αSMA+ que eran CC3+ en las áreas FAP− (fig. 6E), lo que apoya la dependencia del objetivo del efecto citotóxico. En algunos pacientes, esto se acompañó de un aumento de las células T CC3+ (fig. 6F). Además, un subconjunto de muestras de pacientes mostró una densidad elevada de células tumorales pan-CK+ apoptóticas después del tratamiento con OMTX305 (fig. 6G).

Para investigar si la apoptosis de las células tumorales estaba relacionada espacialmente con las regiones FAP+, realizamos un análisis de distancia de las células tumorales CC3+ frente a las células tumorales CC3− en relación con las áreas FAP+. A las células tumorales dentro del área FAP+ se les asignó una distancia de cero. La visualización de este análisis se muestra en (fig. 6H). Descubrimos que las células tumorales CC3+ estaban ubicadas significativamente más cerca de las áreas FAP+ que las células tumorales CC3−, lo que sugiere un posible efecto de eliminación de células vecinas (fig. 6I). En promedio, las células tumorales apoptóticas estaban ubicadas entre 10 y 100 μm del área FAP+ (tabla S4). En conclusión, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con OMTX305 induce la apoptosis en los fibroblastos que expresan FAP dentro de las PCTS derivadas de pacientes y, en una fracción de los casos, provoca una muerte secundaria de las células tumorales en las regiones adyacentes al estroma FAP+.

El análisis de las PCTS individuales derivadas de pacientes reveló una variabilidad interpaciente en la respuesta al tratamiento con OMTX305 (fig. S8). En particular, un tumor que carecía de infiltración de células T (HGSOC, paciente 1) no mostró una respuesta significativa de GrB o CC3 después de la exposición a OMTX305. En contraste, los tumores con infiltración preexistente de células T CD3+ generalmente mostraron activación de las células T, como lo demuestra un aumento en la expresión de GrB (por ejemplo, HGSOC, pacientes 3 y 7). Sin embargo, la extensión de los efectos citotóxicos posteriores varió. Se observó una heterogeneidad similar en las muestras de NSCLC (fig. S8).

Posible impacto de los fenotipos inmunes y el agotamiento inmune en la respuesta a OMTX305

Entre la cohorte de HGSOC, los tres fenotipos inmunes estuvieron representados: un tumor inmune-desértico, cinco tumores inmunes-excluidos y cuatro tumores inmunes-inflamados (fig. 7B). El paciente con tumor inmune-desértico (HGSOC, paciente 1, azul) carecía de células T y, en consecuencia, no mostró producción de GrB ni inducción de apoptosis en respuesta al tratamiento con OMTX305 (fig. 7, C a E). En contraste, los tumores inmunes-inflamados (HGSOC, pacientes 7 a 10, rosa) mostraron en su mayoría los niveles más altos de activación de células T e inducción de apoptosis. Los tumores inmunes-excluidos (HGSOC, pacientes 2 a 6) mostraron respuestas variables, con un espectro de liberación de GrB e inducción de apoptosis. En particular, las muestras de HGSOC inmunes-excluidas e inmunes-inflamadas respondieron al tratamiento con OMTX305 con inducción de muerte celular tanto en los fibroblastos como en las células tumorales en la región FAP+.

En la cohorte de NSCLC, aunque los tumores expresaron diferentes proporciones de infiltración de células T en el área del tumor y el estroma, todas las muestras se clasificaron como inmunes-inflamadas y tenían una densidad general de células T más alta que los pacientes con HGSOC (fig. 7F). Además, las respuestas al tratamiento variaron, lo que sugiere que pueden influir factores adicionales en la sensibilidad a OMTX305. En la práctica clínica, la elegibilidad para la inmunoterapia en pacientes con NSCLC se guía mediante la puntuación de la proporción tumoral, que indica el porcentaje de células tumorales PD-L1+ (^[20]). Estratificamos a los pacientes con NSCLC por expresión de PD-L1 en función de la evaluación histológica de los diagnósticos clínicos realizados por el departamento de patología de nuestro hospital (tabla S2). Si bien un tumor (NSCLC, paciente 1, verde) no expresó PD-L1 (0 a 1% de células tumorales PD-L1+), la mayoría de los tumores mostraron una expresión intermedia (2 a 49% de células tumorales PD-L1+, púrpura) y un paciente (NSCLC, paciente 5, rojo) tuvo una alta expresión de PD-L1 (100% de células tumorales PD-L1+).

A pesar de estar clasificados como inmunes-inflamados, el NSCLC, paciente 5 (naranja) con alta expresión de PD-L1 no mostró inducción de GrB ni CC3 después del tratamiento con OMTX305 (fig. 7, G a I), lo que sugiere agotamiento inmune o resistencia. En contraste, las células T se activaron en respuesta a OMTX305 en todas las demás muestras de NSCLC, y la respuesta apoptótica más fuerte se observó en el NSCLC, paciente 1 (verde), que no tenía expresión detectable de PD-L1. Sin embargo, debe considerarse que la alta densidad de CC3 en esta muestra en particular puede haber estado influenciada por un área FAP+ pequeña.

En resumen, estos hallazgos sugieren que tanto los pacientes con NSCLC como los de HGSOC pueden responder a la terapia con OMTX305. Si bien el tamaño limitado de la cohorte no permite una comparación estadística de subgrupos, los resultados exploratorios indican que, en HGSOC, el fenotipo inmune basal puede servir como un predictor útil de la eficacia del tratamiento. En NSCLC, donde la infiltración inmune fue mayor, la expresión de PD-L1 puede considerarse como un factor adicional. Esta observación debe confirmarse en cohortes de pacientes más grandes.

OMTX305 activa las células T y modula la expresión génica específica del subconjunto en los fenotipos inmunes de HGSOC

Para evaluar el efecto del tratamiento con OMTX305 en los subconjuntos de células T y CAF de pacientes con HGSOC en diferentes fenotipos inmunes, analizamos los transcriptomas de una sola célula de PCTS control y con cocultivo de PBMC tratadas con OMTX305 de cuatro pacientes con HGSOC (pacientes 1 (inmune-desértico), 2 y 3 (inmunes-excluidos) y 9 (inmune-inflamado) utilizando la plataforma de secuenciación de ARN de una sola célula 10x Genomics.

El agrupamiento no supervisado identificó tres subconjuntos de células T (clústeres 0 a 2) que se conservaron en los cuatro pacientes (fig. 8, A a C). En consonancia con su infiltración basal mínima (fig. 5B), el HGSOC, paciente 1, con tumor inmune-desértico, contribuyó con el menor número de células T (fig. 8C) a la cohorte de ARN de una sola célula. Después del tratamiento con OMTX305, el número total de células T se mantuvo en gran medida en los pacientes con HGSOC (fig. 8D). Todos los subconjuntos de células T se redujeron con el tratamiento en el paciente 3, lo que es consistente con el aumento de CC3 en las células T observadas en las tinciones mIF (fig. 6F, HGSOC, paciente 3 representado por un círculo negro).

OMTX305 indujo un programa de activación coordinada en las células T CD4+ (fig. 8F), como lo demuestra la regulación al alza de las citocinas asociadas a las células T colaboradoras 1 (IFNG y TNF) y los receptores costimuladores (ICOS, TNFRSF4 y TNFRSF9). En paralelo, el tratamiento mejoró las vías de señalización de MYC, E2F e interleucina-2, lo que favoreció la expansión de las células T CD4+ (fig. S9). Esta activación se acompañó de la inducción de puntos de control inmunitario y moléculas de retroalimentación reguladora, incluidos CTLA4, ENTPD1 y NR4A1, lo que indica la activación de vías inhibitorias compensatorias. Cabe destacar que estos cambios no se asociaron con un cambio proapoptótico, ya que FAS, FASLG, FADD y CASP8 permanecieron sin cambios o disminuyeron tras el tratamiento con OMTX305 (fig. 8E).

OMTX305 induce el remodelado de la MEC y las respuestas de los interferones en los CAF

La agrupación no supervisada de las células estromales reveló 5 subgrupos distintos de CAF (grupos del 0 al 4), presentes tanto en las muestras no tratadas como en las tratadas con OMTX305, cada uno de los cuales presenta una expresión diferencial de FAP y una distribución variable entre los pacientes (fig. 9, A a D, y fig. S10A). El grupo 0 exhibió la mayor expresión de FAP, seguido de los grupos 1 y 2 con niveles intermedios, mientras que los grupos 3 y 4 expresaron niveles bajos de FAP. El paciente 1 con HGSOC con un microambiente inmunitario "desértico" contribuyó con el menor número de células estromales a la cohorte de ARN de una sola célula (fig. S10B).

Entre las subpoblaciones identificadas, identificamos un grupo de miofibroblastos FAP-alto (grupo 0) con una expresión elevada de genes de la matriz extracelular (MEC), un grupo de CAF inflamatorio y metabólicamente activo IL-6-alto (grupo 1, FAP intermedio), un grupo de respuesta a los interferones (grupo 2, FAP intermedio), un grupo de proteínas de choque térmico alto (grupo 3, FAP bajo) y un grupo de pericitos (grupo 4, FAP bajo), similar a las subpoblaciones de CAF descritas en otros estudios (fig. 9F) (^[21]–^[24]).

En respuesta al tratamiento con OMTX305, especialmente el subgrupo de miofibroblastos del grupo 0 exhibió cambios en los genes relacionados con la MEC, como una reducción de la producción de colágeno (COL1A1, COL1A2, COL6A3 y COL11A1) y un aumento de la expresión de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) (MMP1, MMP3 y MMP11). En los diferentes subgrupos, los genes de respuesta a los interferones (IRF1, IRF7, RSAD2 y CXCL9) y los genes de respuesta al estrés (ATF3 y PMAIP1) fueron inducidos por el tratamiento con OMTX305, junto con los genes implicados en la presentación de antígenos (TAPBP, TAP1 y TAP2) (fig. 9G y fig. S10C).

DISCUSIÓN

Debido a su amplia expresión en diferentes entidades tumorales, el direccionamiento de los CAF que expresan FAP es un enfoque terapéutico prometedor para modular el estroma tumoral inmunosupresor y activar las células T dentro del microambiente tumoral (TME) (^[4], ^[25], ^[26]). En este estudio, desarrollamos un activador de células T bispecífico, trivalente, FAP × CD3, y demostramos efectos citotóxicos significativos sobre los CAF FAP+, modulando la actividad de las células T y la viabilidad de las células tumorales en modelos derivados de pacientes de tumores sólidos, todos ellos procedentes de material primario del paciente.

En los tumores primarios, los CAF son una población celular heterogénea y la mayoría, pero no todos, de los subgrupos son protumorogénicos (^[26]). En modelos de ratón de cáncer de páncreas, el agotamiento sistémico de los CAF que expresan αSMA resultó en una mayor invasividad tumoral (^[27], ^[28]), mientras que el agotamiento de los CAF que expresan FAP en un contexto similar redujo la malignidad tumoral (^[28]). En el cáncer de pulmón en etapa tardía, se demostró que un subgrupo de CAF que expresa FAP y αSMA impulsa la exclusión inmune tumoral al contribuir a una MEC densa (^[21]). Si bien el direccionamiento terapéutico de los CAF requiere una cuidadosa selección de subgrupos para evitar resultados adversos, se indica que FAP es un objetivo prometedor. En este estudio, los efectos inducidos por OMTX305 demostraron la dependencia de FAP en todos los modelos tumorales investigados. Tanto en cultivos 2D como en 3D, se indujo la muerte celular en los CAF FAP+, pero no en las células tumorales FAP−. Aunque la expresión de FAP se indujo en los fibroblastos normales en cultivo, probablemente debido a una deriva fenotípica (^[14], ^[15]), la expresión relativa de FAP se correlacionó con la magnitud de la inducción de la muerte celular dentro de los pares primarios de CAF y fibroblastos normales. En PCTS, solo un subconjunto de CAF expresó FAP, en concordancia con la heterogeneidad de los CAF en los tumores primarios. En las tinciones mIF, el tratamiento con OMTX305 se dirigió selectivamente a las áreas FAP+, al tiempo que preservaba las áreas αSMA+FAP−. La ausencia de unión específica de la secuencia scFv anti-FAP de OMTX305 en los tejidos humanos no tumorales apoya un bajo riesgo de toxicidades "on-target, off-tumor", lo que minimiza el potencial de eventos adversos relacionados con el tratamiento in vivo.

Para elicitar la citotoxicidad, el tratamiento con OMTX305 requiere la presencia de células T CD3+. Tanto en los esferoides de CAF como en los esferoides heterotípicos cocultivados con PBMCs alogénicas, el tratamiento con OMTX305 mejoró la infiltración de células T. En PCTS, el cocultivo con PBMCs autólogas no indujo cambios en la densidad de células T. Sin embargo, la densidad de células T disminuyó significativamente tras el tratamiento con OMTX305 después de 3 días. La infiltración de células T puede haberse visto obstaculizada por el TME denso e inmunosupresor. Esto podría mejorarse con un período de tratamiento más prolongado, ya que el análisis de los subgrupos de CAF mediante ARN de una sola célula indicó cambios en la expresión de colágenos y MMP que podrían contribuir al remodelado del TME. Alternativamente, la pérdida de células T en respuesta a una fuerte activación de las células T puede haber enmascarado una acumulación de células T inducida por OMTX305 en PCTS. Ni las tinciones mIF ni el ARN de una sola célula indicaron una inducción generalizada de la apoptosis en las células T después de 2 días de tratamiento, sino más bien efectos específicos del paciente. No obstante, la inducción de la muerte celular inducida por la activación en las células T después de 3 días podría estar asociada con el aumento observado de la expresión de IFN-γ o FasL en el sistema PCTS o la falta de señalización costimuladora (^[29], ^[30]). Los beneficios de proporcionar señales costimuladoras a las células T se han demostrado en modelos de ratón de TCE (bispecífico) tratados con tumores sólidos, así como en un estudio clínico de una proteína de fusión bispecífica costimuladora de células T que se dirige a FAP (4-1-BB) (^[31], ^[32]), lo que indujo la activación y proliferación de las células T y aumentó la infiltración de células T CD8+ en los tumores. En consecuencia, el análisis de los subgrupos de CAF mediante ARN de una sola célula indicó cambios en la expresión de colágenos y MMP, lo que puede remodelar el TME y permitir la infiltración de células T tras un período de tratamiento más prolongado.

En presencia tanto de FAP como de células T, OMTX305 activó significativamente las células T, lo que condujo a la muerte de las células diana en los esferoides basados en CAF primarios. Además, tanto en PCTS de HGSOC como de NSCLC, el tratamiento con OMTX305 indujo una respuesta profunda, evidenciada por la inducción de GrB, perforina, granulina, IFN-γ y FasL. También se observaron concentraciones elevadas de citocinas en ausencia de PBMCs cocultivadas, lo que indica que la activación de las células T impulsada por OMTX305 está mediada predominantemente por las células T residentes en los tejidos en PCTS. En particular, el cocultivo con PBMCs mejoró aún más la activación de las células T en cuatro pacientes, lo que indica una posible contribución de las células T derivadas de PBMCs. Sin embargo, esta observación requiere validación en una cohorte más amplia. A pesar de la reducción de la densidad de células T observada en PCTS en respuesta al tratamiento con OMTX305, los niveles de GrB aumentaron dentro de los cortes tumorales durante el período de cultivo de 3 días. No obstante, las respuestas de OMTX305 variaron entre los PCTS de diferentes pacientes y se correlacionaron al menos parcialmente con el estado funcional de las células T. A nivel transcripcional, OMTX305 indujo un programa de activación coordinado en las células T CD4+ y promovió la diferenciación citotóxica en las células T CD8+, acompañado de la regulación al alza de las vías costimuladoras y efectoras en todos los fenotipos inmunitarios de HGSOC. Si bien las muestras de HGSOC mostraron una variedad de fenotipos inmunitarios, todas las muestras de NSCLC fueron inmuno-inflamadas. Aunque los puntos de corte para la exclusión inmune pueden variar entre las entidades, nuestra cohorte refleja así los perfiles inmunogénicos de ambas entidades estudiadas, siendo HGSOC generalmente considerado menos inmunogénico que NSCLC, con un menor número de infiltrados inmunitarios y una respuesta reducida a la inmunoterapia (^[18], ^[33]–^[35]).

En el cáncer de ovario, la fenotipificación inmunitaria basada en células T es pronóstica y se ha propuesto repetidamente como un biomarcador (^[33], ^[36]). En consecuencia, a pesar de la cohorte limitada de pacientes, dentro de nuestro estudio, los tumores de HGSOC con infiltración inmunitaria mostraron entre las respuestas más fuertes al tratamiento con OMTX305. En contraste, el tumor con microambiente inmunitario "desértico", aunque representado solo por un único caso, mantuvo su fenotipo "frío". Es interesante destacar que la activación de las células T y la inducción de la muerte celular en los CAF FAP+ y las células tumorales se observaron en pacientes con exclusión inmune, lo que destaca que este subgrupo de pacientes, en el que otras inmunoterapias, como el bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICB), no logran inducir una respuesta (^[16], ^[17], ^[33]), pueden beneficiarse del tratamiento con OMTX305.

Además de la falta de células T dentro del TME, el agotamiento de las células T representa un desafío en la eficacia de las inmunoterapias basadas en células T (^[37], ^[38]). Especialmente en NSCLC, la expresión de PD-L1 como medida del agotamiento de las células T apoya la estratificación de pacientes para predecir los resultados clínicos (^[39], ^[40]). Los estudios preclínicos han demostrado que la combinación de TCE con el bloqueo de PD-1 puede mejorar la actividad antitumoral (^[41], ^[42]). En consonancia con esto, en los experimentos de PCTS, el paciente con NSCLC con la mayor expresión de PD-L1 en las células tumorales no respondió al tratamiento con OMTX305 (fig. 7). Si bien estos resultados ex vivo deben verificarse en cohortes más amplias, respaldan la justificación de combinar los TCE que se dirigen a FAP con el bloqueo de ICB, una estrategia que se está investigando actualmente en ensayos clínicos (^[31], ^[43]).

Tanto en los esferoides heterotípicos como en PCTS, OMTX305 indujo la apoptosis en las células tumorales adyacentes a las áreas FAP+. Estos efectos de muerte celular por "bystander" en respuesta a las terapias CAR-T y BsAb se han atribuido previamente a la señalización de Fas-FasL (^[44]–^[46]) y a los factores proinflamatorios solubles (^[47], ^[48]). En consecuencia, el tratamiento con OMTX305 indujo la expresión de FasL e IFN-γ, lo que sugiere su contribución a la muerte celular tumoral por "bystander" observada. Se ha observado que los efectos por "bystander" mediados por IFN-γ abarcan distancias de hasta 250 a 800 μm (^[48], ^[49]). En línea con esto, las células tumorales apoptóticas se ubicaron entre 10 y 100 μm del área FAP+ en nuestros experimentos. En particular, se han informado efectos similares de muerte celular por "bystander" de las estrategias de direccionamiento a FAP en modelos de ratón de cáncer de páncreas y glioblastoma tratados con células T CAR específicas de FAP (^[47], ^[50]). En general, el potencial del direccionamiento a FAP en tumores sólidos se ha demostrado en múltiples modalidades, incluido el asesinato secundario mediado por citolisina inducido por el ADC anti-FAP OMTX705 (^[51], ^[52]), la administración de radionúclidos dirigidos a FAP (LNC1004) (^[53]) y la activación inmune localizada dependiente de FAP (RO7122290; BI 754091) (^[43], ^[54]). Estos enfoques se están evaluando en ensayos clínicos en múltiples entidades de tumores sólidos, incluido el NSCLC, el adenocarcinoma de páncreas y el cáncer colorrectal.

En este estudio, demostramos la capacidad del OMTX305, dirigido contra FAP, para actuar sobre el microambiente tumoral (TME) en modelos de tumores de pacientes (PCTS), destacando el versátil potencial de los PCTS como plataforma para la investigación traslacional en inmunoterapia. Los PCTS ofrecen un enfoque de bajo riesgo y bajo costo para investigar las respuestas a tratamientos experimentales no aprobados. Además, permiten el muestreo repetido para rastrear las respuestas al tratamiento a lo largo del tiempo, así como comparaciones directas de tejidos tumorales no tratados y tratados con diversos fármacos, obtenidos de la misma muestra del paciente. Utilizando los PCTS, se pueden obtener resultados iniciales que predicen la respuesta de un tumor al tratamiento dentro de su TME natural en una semana, en contraste con los modelos basados en organoides o células, que requieren más tiempo para su establecimiento (^[55]). Sin embargo, también existen algunas limitaciones en nuestro estudio. En primer lugar, el período de cultivo de los PCTS está restringido. Por lo tanto, no se pueden estudiar los cambios a largo plazo en la composición de la matriz extracelular (ECM) inducidos por una reducción en el número de fibroblastos FAP+ y los efectos posteriores sobre el tumor. En el futuro, el potencial de los PCTS para guiar la selección de pacientes deberá validarse en cohortes de pacientes más amplias.

En conclusión, nuestros hallazgos respaldan la continuación del desarrollo clínico del OMTX305. Además, se debe considerar la investigación de estrategias combinadas, ya sea con ICB para atacar el agotamiento inmunitario o con moléculas estimulantes de las células T para expandir el conjunto de células T asociadas al tumor disponibles.

MATERIALES Y MÉTODOS

TCEs FAP × CD3

La construcción, producción y las pruebas in vitro de los TCEs bispecíficos dirigidos contra FAP y CD3 se realizaron utilizando protocolos establecidos (^[12], ^[56]). Los TCEs eIg y Fab-eIg FAP × CD3 se construyeron utilizando una versión humanizada (hu36) del anticuerpo anti-FAP MO36 (^[57]) y una versión humanizada del anticuerpo anti-CD3 UCHT1. Ambos TCEs comprendían además una Fcγ1 heterodimerizante de tipo "knobs-into-holes" y se desactivaron para las funciones efectoras mediadas por Fc mediante la introducción de mutaciones en el dominio de la bisagra inferior y el dominio CH2 (^[12]).

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio fue rastrear la respuesta de modelos complejos derivados de pacientes de tumores sólidos al tratamiento con OMTX305. El tamaño de la muestra para los experimentos de CAF 2D y 3D (n = 3) se eligió para proporcionar un nivel razonable de potencia estadística para detectar diferencias significativas. En las leyendas de las figuras, los replicados biológicos se indican con n, junto con el análisis estadístico aplicado. El objetivo de los experimentos de CAF fue medir la infiltración de células T, la activación de las células T y la inducción de la citotoxicidad mediante ensayos de viabilidad, microscopía de fluorescencia en vivo y tinciones mediante inmunohistoquímica (IHQ) e inmunofluorescencia (mIF). La elección de los puntos de tiempo y las concentraciones de fármaco para estos análisis se basó en experimentos iniciales de curso temporal y de respuesta a la dosis. Las muestras de tumor y sangre humanos para los experimentos de PCTS se obtuvieron de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) o cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que se sometieron a cirugía de reducción de masa tumoral. El tamaño de la muestra para los experimentos de PCTS (n = 15) se basó en la experiencia previa con la plataforma PCTS (^[58]). En estos experimentos de PCTS, el resultado primario fueron las tinciones de mIF para determinar la infiltración y la activación de las células T, así como la inducción de la muerte celular en diferentes regiones de la sección tumoral y en diferentes tipos de células en respuesta al tratamiento con OMTX305. Los datos se complementaron con análisis de viabilidad, determinación de citocinas, secuenciación de ARN de una sola célula e imagenología de inmunofluorescencia. La elección de los puntos de tiempo analizados se basó en experimentos previos con líneas celulares. El formato BsAb y la concentración del fármaco se eligieron en función de los estudios in vitro con células HT1080-FAP. Para tener en cuenta la heterogeneidad intratumoral, las secciones se numeraron durante el proceso de corte y se distribuyeron uniformemente entre las diferentes condiciones. Los tumores que no eran adecuados para el corte de PCTS debido a su tamaño o estructura se excluyeron de los experimentos. Los estudios no fueron aleatorizados ni cegados. Para el análisis de imágenes de mIF, se analizaron secciones transversales completas de los PCTS, excluyendo las áreas necróticas. Para la determinación del tipo de célula y la expresión de biomarcadores, se utilizó el mismo algoritmo para todas las secciones de un mismo paciente. Todos los estudios que incluyeron muestras humanas fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Universitario de Tubinga, Alemania (810/2023BO2, 397/2016BO1 y 15-/2011BO2). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos cuyos materiales biológicos se utilizaron en este estudio.

Células

La línea celular de fibrosarcoma HT1080 WT y su derivado HT1080-FAP, que expresan de forma estable el FAP humano, fueron proporcionadas por W. Rettig (Boehringer Ingelheim Pharma) (^[59]). Las líneas celulares de NSCLC H1437 (#CRL-5872) y A549 (#CCL-185) se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, EE. UU.). Los fibroblastos utilizados en este estudio se aislaron de tejidos pulmonares de pacientes con NSCLC no tratados previamente, obtenidos después de la resección quirúrgica en el Hospital Robert Bosch (Stuttgart, Alemania). Se aislaron CAF y NF coincidentes del tejido tumoral y del tejido no canceroso adyacente. Para este estudio, se utilizaron tres pares primarios de CAF y NF (CAF primario-001, CAF primario-002, CAF primario-003 y sus correspondientes NF, NF primario-001, NF primario-002, NF primario-003). Además, se incluyeron dos pares inmortalizados de CAF y NF (IKP-CAF-001 y IKP-NF-001 derivados del tejido de un paciente con adenocarcinoma de NSCLC; IKP-CAF-002 y IKP-NF-002 derivados del tejido de un paciente con carcinoma adenoescamoso de NSCLC). El proceso de aislamiento se describe en (^[60]). Brevemente, el tejido de NSCLC se picó y se digirió enzimáticamente. La solución celular resultante se pasó a través de un filtro de 70 μm antes de separar la suspensión celular en células tumorales CD326+ y fibroblastos CD326− mediante clasificación celular activada por campos magnéticos. Las células CD326− se cultivaron como CAF de NSCLC primarios. Para los pares inmortalizados de CAF/NF, la inmortalización se realizó utilizando un lentivirus que coexpresaba la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT) y la GFP (Lenti-hTERT-eGFP; número de catálogo LG508, BioGenova), como se describe en (^[13]).

Para los experimentos de cocultivo in vitro, se obtuvieron PBMCs alogénicas de sangre de donantes sanos del DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen. Los experimentos con PBMCs alogénicas se repitieron tres veces, cada vez con PBMCs de un donante sano diferente. Las PBMCs autólogas para el cocultivo de PCTS se obtuvieron de la sangre del paciente. Las PBMCs se aislaron de la sangre mediante centrifugación de gradiente de densidad siguiendo protocolos estándar. Si se conservaron criopreservadas, las PBMCs se descongelaron el día anterior al inicio del experimento y se cultivaron durante la noche a 37 °C en suspensión en un medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S).

Cultivo celular

Ambas líneas celulares de NSCLC (H1437 y A549) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX (número de catálogo 61870036, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), 10% de SFB (#S0615, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.) y 1% de P/S (#15140163, Gibco). Los fibroblastos se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de SFB, 1% de P/S y 0,6× aminoácidos no esenciales (NEAA, #P08-32100, PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania).

Preparación de placas de ultra baja adherencia

Las placas de ultra baja adherencia se prepararon recubriendo placas de pocillos de 96 pocillos de fondo en U con poli-2-hidroxietil metacrilato (poli-HEMA; #P3932, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.). Se añadieron 150 μl de poli-HEMA (20 mg/ml) en 95% de etanol a cada pocillo. Las placas se incubaron agitando a 350 rpm durante 4 horas. A continuación, se eliminaron 75 μl de poli-HEMA y las placas se dejaron secar en una campana de flujo laminar durante la noche para completar la evaporación del etanol. Una vez secas, las placas se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Cultivo de esferoides

Se sembraron suspensiones celulares de IKP-CAF-001 o H1437 a 3000 células por pocillo en 50 μl de medio en placas de ultra baja adherencia recubiertas con poli-HEMA. Para generar esferoides heterotípicos, se mezclaron las células IKP-CAF-001 y H1437 en una proporción de 3:1, para un número total de células de 3000 células por pocillo. Los esferoides se cultivaron en medio de fibroblastos (ver cultivo celular). Las placas se centrifugaron a 300g durante 3 minutos y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada durante la noche.

Tratamiento de células y esferoides con fármacos

Después de una incubación durante la noche, las células o los esferoides se cocultivaron con PBMCs alogénicas a una proporción de 10:1 (efector:objetivo) y se trataron con diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305).

Ensayo MTT

Para el ensayo de viabilidad celular MTT, se sembraron 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de una unión durante la noche, se añadieron PBMCs alogénicas a una proporción de 10:1 (efector:objetivo) y las células se expusieron a diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Cada condición experimental se evaluó en triplicado técnico. Después de una incubación de 72 horas, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 μl de una solución de MTT (0,5 mg/ml) en dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo. Después de un período de incubación de 2 horas, se descartó la solución de MTT y los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 μl de DMSO. Se midió la densidad óptica a 562 nm utilizando el lector de placas VICTOR Nivo (Revvity, Waltham, Massachusetts, EE. UU.).

Ensayo LDH

Para el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), los esferoides se cocultivaron con PBMCs y se trataron con concentraciones crecientes de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Se incluyó un control de medio completo sin células para determinar la actividad de fondo de LDH en el suero. Para evaluar la citotoxicidad, se incluyeron controles de actividad máxima de LDH (obtenidos mediante lisis celular completa) y controles de actividad de LDH espontánea no tratada en el ensayo.

Después de la formación de esferoides durante la noche, se añadieron PBMCs a una proporción de células objetivo:efector de 1:10, junto con diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Cada condición experimental se midió en triplicado técnico. Después de una incubación de 72 horas, se realizó el ensayo de liberación de LDH utilizando el ensayo de citotoxicidad CyQUANT LDH (#C20300, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm y 680 nm. La citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula:

qPCR en tiempo real

El ARN se aisló utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini Kit (#74104, QIAGEN, Venlo, Países Bajos) y se transcribió a cDNA utilizando M-MLV RT (M1701, Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.). Se realizaron ensayos TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para FAP (ID del ensayo: Hs00990791m1) y proteína de unión a la caja TATA (TBP, ID del ensayo: Hs00427620m1) con el sistema de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) QuantStudio 5 (ABI Applied Biosystems Waltham, MA, EE. UU.).

Tumores humanos primarios

Se obtuvo tejido tumoral fresco de NSCLC o HGSOC de la cirugía de reducción de masa tumoral en el Hospital Robert Bosch (Stuttgart, Alemania). La clasificación tumoral se confirmó mediante el examen histopatológico por parte de patólogos experimentados. Se proporciona información detallada del paciente en las tablas S1 y S2.

Preparación de secciones tumorales

Los PCTS se prepararon siguiendo protocolos establecidos (^[61]). El tejido tumoral se seccionó en cubos de 1 a 1,5 cm3 y se fijó en un soporte de muestras magnético de un micrótomo vibratorio automatizado Leica VT1200S (VT1200S, Leica, Wetzlar, Alemania) utilizando adhesivo de cianoacrilato. Se prepararon los PCTS de 250 μm de espesor. Dependiendo de la consistencia y el estado del tejido tumoral, se obtuvieron de 15 a 25 PCTS de cada cubo tumoral. El tejido tumoral cosechado para el análisis el día del corte se definió como d0.

Cocultivo y tratamiento de secciones tumorales

Los PCTS se cultivaron en una interfase aire-líquido sobre un soporte filtrante (insertos de cultivo celular Millicell, PTFE, tamaño de poro de 0,4 μm, PIGM0RG50, Merck Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) en placas de seis pocillos. Se añadió un total de 1,5 ml de medio por debajo del filtro. Se añadió una gota de medio en la parte superior de cada PCTS para evitar que se sequen. Los fragmentos se cultivaron en RPMI 1640 con GlutaMAX (61870036, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), suplementado con 5% de FBS (Superior, S0615, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Para el tratamiento con OMTX305, se añadieron 100 nM de OMTX305 al medio de cultivo. Para los experimentos de cocultivo, se resuspendieron 8 × 105 PBMCs en 250 μl de medio, con o sin 100 nM de OMTX305, y se añadieron sobre los fragmentos. Los PCTS se cocultivaron y se trataron durante un máximo de 3 días y, a continuación, se recogieron para el ensayo de ATP o para la fijación con formalina y el procesamiento para inclusión en parafina (FFPE) para los posteriores análisis de tinción. Dependiendo de la disponibilidad de tejido, se recogieron PCTS adicionales en los días 1 y 2. Para la secuenciación de ARN de una sola célula, los PCTS se recogieron en el día 2. El medio se cambió diariamente, recogiendo la mitad del medio y reemplazándolo con medio fresco. El medio recogido se congeló rápidamente y se almacenó a −80 °C para el posterior análisis de citocinas.

Ensayo de ATP

Para determinar los niveles de ATP del tejido tumoral (d0) o de los fragmentos tumorales, se congelaron rápidamente tres fragmentos tumorales por condición en tubos Lysing Matrix D (#9554.1, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) y se almacenaron a −80 °C hasta su procesamiento. A continuación, cada muestra se homogeneizó añadiendo 1000 μl de 2 mM de EDTA en 70% de etanol (pH 10,9). Las muestras se lisaron a 4 °C utilizando un homogeneizador (FastPrep-24, MP Biomedicals) durante 30 s a 6 m/s, repitiéndose dos veces, y luego se centrifugaron durante 10 min a 9300 rcf. El sobrenadante resultante se diluyó 1:10 en 100 mM de tris y 4 mM de EDTA (pH 7,75) y se utilizó para la cuantificación de ATP mediante el kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP CLS II (#11699695001, Roche, Basilea, Suiza) siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de ATP se midieron en triplicado técnico. El precipitado se utilizó para medir los niveles de proteína para la normalización. Después de secar a 37 °C durante la noche, el precipitado se resuspendió en 200 μl de 5 N de NaOH y se incubó a 37 °C con agitación a 1000 rpm durante 30 min. A continuación, el NaOH se diluyó a 1 N con agua Milli-Q. Las muestras se lisaron en un homogeneizador durante 30 s a 6 m/s. La concentración de proteína se determinó utilizando el kit de ensayo de proteína Pierce BCA (#23227, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Tanto el estándar de BSA como las muestras se midieron en triplicado técnico. Los niveles de ATP se normalizaron al contenido de proteína.

Fijación con formalina e inclusión en parafina

Para FFPE, las células o los esferoides se recogieron y se resuspendieron en HistoGel (número de catálogo HG-4000-012, Epredia, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). A continuación, las gotas de HistoGel se fijaron en formaldehído al 4%. Los PCTS se incluyeron en parafina en orientación vertical, como se describe en Davies et al. (^[55]). La deshidratación y la inclusión en parafina se realizaron en el departamento de patología del Hospital Robert Bosch (Stuttgart, Alemania).

Inmunohistoquímica

Las muestras de FFPE se cortaron en secciones de 3 μm de espesor utilizando un micrótomo rotatorio (RM2255, Leica, Wetzlar, Alemania) y se dejaron secar durante la noche a 56 °C. La tinción inmunohistoquímica (IHC) se realizó como se describió anteriormente utilizando protocolos estándar. Brevemente, las secciones se desparafinaron en Neoclear (número de catálogo 109843, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.), se rehidrataron en una serie de etanol graduado y se tiñeron utilizando el kit Dako Envision (#K5007, Agilent Technologies, Glostrup, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante. La recuperación del epítopo inducida por calor se realizó en un baño de vapor durante 30 min utilizando un tampón de ácido cítrico a pH 6 o un tampón de tris/EDTA a pH 9 (S2367, Agilent Technologies). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: caspasa-3 clivada (Asp175, 1:75; #9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), EpCAM (Ber-EP4, 1:100; M0804, Agilent Technologies, Glostrup, Dinamarca) y FAP (EPR20021, 1:100; ab207178, Abcam, Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo Dako REAL Envision/HRP Rabbit/Mouse proporcionado dentro del kit Dako Envision se aplicó como anticuerpo secundario. Los anticuerpos se detectaron con 3,3'-diaminobencidina y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las secciones teñidas se visualizaron utilizando un escáner de portaobjetos Olympus VS120 (Olympus Life Science, Waltham, MA, EE. UU.).

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

La tinción mIF de siete colores se realizó utilizando el método de amplificación de la señal basada en tiramida OPAL, que permite la detección simultánea de seis anticuerpos más 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los tejidos de FFPE se cortaron en secciones de 3 μm utilizando un micrótomo rotatorio (Leica R2255, Leica Biosystems, Nussloch, Alemania). Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación del epítopo inducida por calor antes de la incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos se visualizaron con tiramidas fluorescentes del kit de detección manual Opal 6-Plex (NEL861001KT, Akoya Biosciences, Marlborough, MA, EE. UU.). Los procedimientos de recuperación del epítopo y tinción se repitieron secuencialmente para diferentes combinaciones de anticuerpos primarios y tiramidas fluorescentes. Se optimizaron los paneles que consistían en los siguientes anticuerpos: αSMA (1A4, 1:100; ab7817, Abcam, Cambridge, Reino Unido), caspasa-3 clivada (Asp175, 1:75; #9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), CD3 (MRQ-39, 1:100; #103R, Cell Marque, Rocklin, CA, EE. UU.), FAP (EPR20021, 1:100; ab207178, Abcam, Cambridge, Reino Unido), GFP (D5.1, 1:100; #2956P, Cell Signaling Technology), Granzima B (D6E9W, 1:100; #46890, Cell Signaling Technology) y pan-queratina (AE1/AE3, #67306, Cell Signaling Technology). El anticuerpo Opal Polymer HRP Ms+Rb proporcionado dentro del kit de detección manual Opal 6-Plex se aplicó como anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las secciones teñidas se montaron con ProLong Diamond Antifade Mountant (P36961, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se visualizaron utilizando el escáner de portaobjetos PhenoImager Fusion (Akoya Biosciences).

Análisis de la tinción de inmunofluorescencia multiplex

Tras la tinción mIF, se realizó la separación espectral de secciones transversales de todo el esferoide o de los PCTS en inForm 3.1.0 (Akoya Biosciences, Marlborough, MA, EE. UU.) utilizando controles de autofluorescencia específicos del tejido. Las imágenes separadas se analizaron utilizando QuPath versión 4.4.0 (^[62]). Se anotaron todas las secciones de tejido, excluyendo las áreas necróticas. Los núcleos se detectaron con la extensión StarDist. Las áreas FAP+ y FAP− se determinaron utilizando un clasificador de píxeles para el canal FAP. Las regiones de tumor y estroma se determinaron utilizando un clasificador de píxeles para el canal de pan-CK. Se entrenaron clasificadores de objetos para detectar tipos de células o marcadores funcionales. Se utilizó el mismo algoritmo para todos los esferoides de un experimento o para todas las secciones de tejido de un paciente. Los fenotipos inmunitarios se determinaron a partir del tejido d0 utilizando un clasificador de píxeles para el tumor y el estroma. Se calculó el porcentaje o la densidad de células (células por mm2) positivas para un marcador o una combinación de marcadores. Las imágenes se revisaron visualmente para garantizar una fenotipificación fiable.

Análisis espacial

Las distancias entre las células tumorales apoptóticas (CC3+) o no apoptóticas (CC3−) (pan-CK+) y la región FAP+ se determinaron con la función "Distancia a las anotaciones 2D" en QuPath. Se calcularon las distancias medias. Se determinó un cociente de la distancia de las células tumorales CC3+ y CC3−, lo que indica la distancia relativa de las células tumorales apoptóticas a la región FAP+.

Análisis de citocinas

Los niveles de citocinas de Granzima B, Perforina, Granulisina, Granzima A, FasL e IFN-γ se analizaron en el medio de cultivo de los PCTS mediante citometría de flujo utilizando el panel LegendPlex Human CD8/NK (13-plex) (#741187, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Seguimiento de las células T

Las células T autólogas se aislaron de las PBMCs del paciente utilizando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (#17951, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá) según las instrucciones del fabricante y se tiñeron con 15 μM de CellTracker Orange CMRA (C34551, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante 30 min a 37 °C. Para el cocultivo, se añadieron 4 × 105 células T sobre los PCTS como se describe para las PBMCs. Tras el cocultivo y el tratamiento, los núcleos de los PCTS se tiñeron con DRAQ5 (DR50050, Biostatus Ltd., Leicestershire, Reino Unido) 1:1000 en medio durante 30 min antes de la fijación en formaldehído al 4% durante la noche. Al día siguiente, las secciones de tejido se deshidrataron y se rehidrataron en una serie de etanol graduado y, a continuación, se aclararon en Rapiclear 1.49 (#RC149001, Sunjin Lab Co., Hsinchu City, Taiwán) en cámaras de portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche. Los PCTS aclarados se visualizaron capturando pilas Z con un microscopio confocal láser de barrido Leica TCS SP8 (Leica, Wetzlar, Alemania) y se visualizaron con el Leica Application Suite X 3.5.7.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Tras el cultivo y el tratamiento durante 2 días, los PCTS se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C hasta su procesamiento para la secuenciación de ARN de una sola célula. El tejido recogido en d0 o los PCTS se fijaron y se disociaron utilizando el kit de preparación de muestras de ARN fijas de una sola célula Chromium Next GEM (1000414, 10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.). La secuenciación de ARN de una sola célula se realizó utilizando el flujo de trabajo de ARN fijas de 10x Genomics según las instrucciones del fabricante (Guía del usuario CG000527 Rev. D). En resumen, las células o los núcleos fijados y permeabilizados se incubaron con sondas de hibridación de ARN. Tras la hibridación de la sonda, las muestras se cargaron en un chip 10x Genomics Chromium Next GEM Q, donde se particionaron formando emulsiones de cuentas en gel (GEM). Dentro de las GEM, las células o los núcleos individuales se lisaron, seguido de la transcripción inversa, generando cDNA con código de barras mediante la incorporación de códigos de barras celulares únicos e identificadores moleculares únicos (UMI). A continuación, el cDNA con código de barras se recuperó de las GEM y se sometió a una preamplificación. Posteriormente, se construyeron bibliotecas mediante la fragmentación enzimática, la reparación de extremos, la ligación de adaptadores y un paso final de PCR para añadir índices específicos de la muestra para la secuenciación. Las bibliotecas completadas se sometieron a un control de calidad mediante Bioanalyzer y qPCR, antes de ser agrupadas y cargadas en un Illumina NovaSeq X plus. Los datos de secuenciación brutos se procesaron a continuación utilizando el canal de procesamiento de datos Cell Ranger de 10x Genomics (versión 9) para la alineación, la corrección de códigos de barras y UMI y la cuantificación de la expresión génica. Los datos se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38 utilizando STAR dentro del software Cell Ranger. El procesamiento de los datos se realizó utilizando el paquete R Seurat (v4.4.0) (^[63]). Las matrices de recuento resultantes de Cell Ranger se normalizaron mediante el método LogNormalize implementado en Seurat. Para garantizar la calidad de los datos, se identificaron y excluyeron los dobletes transcripómicos utilizando DoubletFinder (^[64]). La corrección del efecto de lote se implementó mediante el análisis de correlación canónica, seguido de la reducción de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales. A continuación, se definieron las poblaciones celulares mediante un método de agrupamiento no supervisado utilizando el algoritmo Louvain original mediante la función "FindClusters" dentro del paquete Seurat. Las identidades iniciales de los tipos de células se asignaron utilizando SingleR y se refinaron posteriormente mediante la referencia cruzada de los marcadores canónicos con la base de datos PanglaoDB (^[65]). Para el análisis posterior, la población de fibroblastos y la población de células T se aislaron para el análisis de la expresión génica diferencial, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y el análisis de variación de conjuntos de genes. Las visualizaciones se generaron utilizando ggplot2, pheatmap y EnhancedVolcano.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis estadístico utilizando GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, Boston, MA, EE. UU.). Para los experimentos con esferoides, se compararon dos condiciones a partir de tres réplicas biológicas con diferentes donantes alogénicos de CPMB. La significación estadística entre los dos grupos se calculó utilizando pruebas t pareadas de dos colas. Para los experimentos PCTS, se analizó la respuesta de los PCTS derivados de diferentes pacientes. Solo se compararon dos condiciones a la vez utilizando una prueba de rangos con signo de Wilcoxon para pares emparejados de dos colas. Cada prueba específica se menciona en la leyenda correspondiente de la figura. Para todas las pruebas estadísticas, la significación se definió como P < 0,05, con *P ≤ 0,05, P ≤ 0,01 y *P ≤ 0,001. Los datos se presentan como medias ± DE.

FAP × CD3 TCE

La construcción, producción y pruebas in vitro de los TCE bispecíficos dirigidos a FAP y CD3 se realizaron utilizando protocolos establecidos (^[12], ^[56]). Los TCE eIg y Fab-eIg FAP × CD3 se construyeron utilizando una versión humanizada (hu36) del anticuerpo anti-FAP MO36 (^[57]) y una versión humanizada del anticuerpo anti-CD3 UCHT1. Ambos TCE también comprendían una Fcγ1 heterodimérica de tipo "knobs-into-holes" y se desactivaron para las funciones efectoras mediadas por Fc mediante la introducción de mutaciones en la bisagra inferior y el dominio CH2 (^[12]).

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio fue rastrear la respuesta de modelos complejos derivados de pacientes de tumores sólidos al tratamiento con OMTX305. El tamaño de la muestra para los experimentos 2D y 3D de CAF (n = 3) se eligió para proporcionar un nivel razonable de potencia estadística para detectar diferencias significativas. En las leyendas de las figuras, las réplicas biológicas se indican con n, junto con el análisis estadístico aplicado. El objetivo de los experimentos con CAF fue medir la infiltración de células T, la activación de las células T y la inducción de la citotoxicidad mediante ensayos de viabilidad, microscopía de fluorescencia en vivo y tinciones mediante inmunohistoquímica (IHQ) e inmunofluorescencia múltiple (IFM). La elección de los puntos de tiempo y las concentraciones de fármaco para estos análisis se basó en experimentos iniciales de curso temporal y de respuesta a la dosis. Las muestras de tumor y sangre humanos para los experimentos PCTS se obtuvieron de pacientes con HGSOC o NSCLC que se sometieron a cirugía de reducción de masa tumoral. El tamaño de la muestra para los experimentos PCTS (n = 15) se basó en la experiencia previa con la plataforma PCTS (^[58]). En estos experimentos PCTS, el resultado primario fueron las tinciones de IFM para determinar la infiltración y la activación de las células T, así como la inducción de la muerte celular en diferentes regiones del tejido tumoral y en diferentes tipos de células en respuesta al tratamiento con OMTX305. Los datos se complementaron con análisis de viabilidad, determinación de citocinas, secuenciación de ARN de una sola célula e imagenología de inmunofluorescencia. La elección de los puntos de tiempo analizados se basó en experimentos previos con líneas celulares. El formato BsAb y la concentración del fármaco se eligieron en función de los estudios in vitro con células HT1080-FAP. Para tener en cuenta la heterogeneidad intratumoral, las secciones se numeraron durante el proceso de corte y se distribuyeron uniformemente entre las diferentes condiciones. Los tumores que no eran adecuados para el corte PCTS debido a su tamaño o estructura se excluyeron de los experimentos. Los estudios no fueron aleatorizados. Para el análisis de imágenes de IFM, se analizaron secciones transversales completas de los PCTS, excluyendo las áreas necróticas. Para la determinación del tipo de célula y la expresión de biomarcadores, se utilizó el mismo algoritmo para todas las secciones de un mismo paciente. Todos los estudios que incluyeron muestras humanas fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Universitario de Tübingen, Alemania (810/2023BO2, 397/2016BO1 y 15-/2011BO2). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos cuyos materiales biológicos se utilizaron en este estudio.

Células

La línea celular de fibrosarcoma HT1080 WT y su derivado HT1080-FAP, que expresan de forma estable FAP humano, fueron proporcionadas por W. Rettig (Boehringer Ingelheim Pharma) (^[59]). Las líneas celulares de NSCLC H1437 (#CRL-5872) y A549 (#CCL-185) se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, EE. UU.). Los fibroblastos utilizados en este estudio se aislaron de tejidos pulmonares de pacientes con NSCLC no tratados, obtenidos después de la resección quirúrgica en el Hospital Robert Bosch (Stuttgart, Alemania). Se aislaron CAF y fibroblastos normales (FN) emparejados del tejido tumoral y del tejido no canceroso adyacente. Para este estudio, se utilizaron tres pares primarios de CAF y FN (CAF primario-001, CAF primario-002, CAF primario-003 y sus respectivos FN, FN primario-001, FN primario-002, FN primario-003). Además, se incluyeron dos pares inmortalizados de CAF y FN (IKP-CAF-001 y IKP-NF-001 derivados de tejido de pacientes con adenocarcinoma de NSCLC; IKP-CAF-002 y IKP-NF-002 derivados de tejido de pacientes con carcinoma adenoescamoso de NSCLC). El proceso de aislamiento se describe en (^[60]). En resumen, el tejido de NSCLC se picó y se digirió enzimáticamente. La solución celular resultante se pasó a través de un filtro de 70 μm antes de separar la suspensión celular en células tumorales CD326+ y fibroblastos CD326− mediante clasificación celular activada por campos magnéticos. Las células CD326− se cultivaron como CAF de NSCLC primarios. Para los pares inmortalizados de CAF/FN, la inmortalización se realizó utilizando un lentivirus que coexpresaba la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT) y la GFP (Lenti-hTERT-eGFP; número de catálogo LG508, BioGenova), como se describe en (^[13]).

Para los experimentos de cocultivo in vitro, se obtuvieron CPMB alogénicos de sangre de donantes sanos del DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen. Los experimentos con CPMB alogénicos se repitieron tres veces, cada vez con CPMB de un donante sano diferente. Los CPMB autólogos para el cocultivo PCTS se derivaron de sangre de pacientes. Los CPMB se aislaron de la sangre mediante centrifugación de gradiente de densidad siguiendo protocolos estándar. Si se conservaron criopreservados, los CPMB se descongelaron el día anterior al inicio del experimento y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una suspensión en un medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de suero bovino fetal (SFB) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S).

Cultivo celular

Ambas líneas celulares de NSCLC (H1437 y A549) se cultivaron en un medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX (número de catálogo 61870036, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), 10% de SFB (#S0615, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.) y 1% de P/S (#15140163, Gibco). Los fibroblastos se cultivaron en un medio RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de SFB, 1% de P/S y 0,6× aminoácidos no esenciales (NEAA, #P08-32100, PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania).

Preparación de placas de ultra baja adherencia

Cultivo de esferoides

Se sembraron suspensiones celulares de IKP-CAF-001 o H1437 a 3000 células por pocillo en 50 μl de medio en placas de ultra baja adherencia recubiertas con poli-HEMA. Para generar esferoides heterotípicos, se mezclaron las células IKP-CAF-001 y H1437 en una proporción de 3:1, para un número total de células de 3000 células por pocillo. Los esferoides se cultivaron en un medio para fibroblastos (ver cultivo celular). Las placas se centrifugaron a 300g durante 3 min y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada durante la noche.

Tratamiento de células y esferoides con fármacos

Después de una incubación durante la noche, las células o los esferoides se cocultivaron con CPMB alogénicos en una proporción de 10:1 (efector:objetivo) y se trataron con diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305).

Ensayo MTT

Para el ensayo de viabilidad celular MTT, se sembraron 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de una adhesión durante la noche, se añadieron CPMB alogénicos en una proporción de 10:1 (efector:objetivo) y las células se expusieron a diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Cada condición experimental se evaluó en triplicado técnico. Después de una incubación de 72 horas, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 μl de una solución de MTT (0,5 mg/ml) en dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo. Después de un período de incubación de 2 horas, se descartó la solución de MTT y los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 μl de DMSO. Se midió la densidad óptica a 562 nm utilizando el lector de placas VICTOR Nivo (Revvity, Waltham, Massachusetts, EE. UU.).

Ensayo LDH

Para el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), los esferoides se cocultivaron con CPMB y se trataron con concentraciones crecientes de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Se incluyó un control de medio completo sin células para determinar la actividad de fondo de LDH en el suero. Para evaluar la citotoxicidad, se incluyeron controles de actividad máxima de LDH (obtenidos mediante lisis celular completa) y controles de actividad de LDH espontánea no tratada en el ensayo.

Después de la formación de esferoides durante la noche, se añadieron CPMB a una proporción de células objetivo:efector de 1:10, junto con diferentes concentraciones de BsAb FAP × CD3 (OMTX305). Cada condición experimental se midió en triplicado técnico. Después de una incubación de 72 horas, se realizó el ensayo de liberación de LDH utilizando el ensayo de citotoxicidad LDH CyQUANT (#C20300, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm y 680 nm. La citotoxicidad se calculó utilizando la siguiente fórmula:

qPCR en tiempo real

Se aisló el ARN utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini Kit (#74104, QIAGEN, Venlo, Países Bajos) y se transcribió a ADNc utilizando M-MLV RT (M1701, Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.). Se realizaron ensayos TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para FAP (ID del ensayo: Hs00990791m1) y proteína de unión a la caja TATA (TBP, ID del ensayo: Hs00427620m1) con el sistema de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) QuantStudio 5 (ABI Applied Biosystems Waltham, MA, EE. UU.).

Tumores humanos primarios

Preparación de secciones de tumor

Los PCTS se prepararon siguiendo protocolos establecidos (^[61]). El tejido tumoral se seccionó en cubos de 1 a 1,5 cm3 y se fijó en un soporte de muestras magnético de un micrótomo vibratorio automatizado Leica VT1200S (VT1200S, Leica, Wetzlar, Alemania) utilizando adhesivo de cianoacrilato. Se prepararon los PCTS de 250 μm de espesor. Dependiendo de la consistencia y la condición del tejido tumoral, se obtuvieron de 15 a 25 PCTS de cada cubo de tumor. El tejido tumoral cosechado para el análisis el día del corte se definió como d0.

Cocultivo y tratamiento de secciones de tumor

Los PCTS se cultivaron en una interfase aire-líquido sobre un soporte de filtro (insertos de cultivo celular Millicell, PTFE, tamaño de poro de 0,4 μm, PIGM0RG50, Merck Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) en placas de seis pocillos. Se añadieron un total de 1,5 ml de medio debajo del filtro. Se añadió una gota de medio en la parte superior de cada PCTS para evitar que se secaran. Las secciones se cultivaron en RPMI 1640 con GlutaMAX (61870036, Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), suplementado con 5% de SFB (Superior, S0615, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 μg/ml). Para el tratamiento con OMTX305, se añadieron 100 nM de OMTX305 al medio de cultivo. Para los experimentos de cocultivo, se resuspendieron 8 × 105 CPMB en 250 μl de medio, con o sin 100 nM de OMTX305, y se añadieron sobre las secciones. Los PCTS se cocultivaron y se trataron durante un máximo de 3 días y luego se cosecharon para el ensayo de ATP o la fijación con formalina y el procesamiento para su inclusión en parafina (FFPE) para tinciones posteriores. Dependiendo de la disponibilidad del tejido, se cosecharon secciones adicionales en los días 1 y 2. Para la secuenciación de ARN de una sola célula, los PCTS se cosecharon en el día 2. El medio se cambió diariamente, y la mitad del medio se recogió y se reemplazó con medio fresco. El medio recogido se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C para el análisis posterior de citocinas.

Ensayo de ATP

Para determinar los niveles de ATP del tejido tumoral (d0) o de las secciones de tumor, se congelaron rápidamente tres secciones de tumor por condición en tubos Lysing Matrix D (#9554.1, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) y se almacenaron a −80 °C hasta su procesamiento. Luego, cada muestra se homogeneizó añadiendo 1000 μl de 2 mM de EDTA en 70 % de etanol (pH 10,9). Las muestras se lisaron a 4 °C utilizando un homogeneizador (FastPrep-24, MP Biomedicals) durante 30 s a 6 m/s, repitiéndose dos veces, y luego se centrifugaron durante 10 min a 9300 rcf. El sobrenadante resultante se diluyó 1:10 en 100 mM de Tris y 4 mM de EDTA (pH 7,75) y se utilizó para la cuantificación de ATP mediante el kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP CLS II (#11699695001, Roche, Basilea, Suiza) siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de ATP se midieron en triplicado técnico. El precipitado se utilizó para medir los niveles de proteína para la normalización. Después de secarse a 37 °C durante la noche, el precipitado se resuspendió en 200 μl de 5 N de NaOH y se incubó a 37 °C con agitación a 1000 rpm durante 30 min. A continuación, el NaOH se diluyó a 1 N con agua Millipore. Las muestras se lisaron en un homogeneizador durante 30 s a 6 m/s. La concentración de proteína se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (#23227, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Tanto el estándar de BSA como las muestras se midieron en triplicado técnico. Los niveles de ATP se normalizaron al contenido de proteínas.

Fijación con formalina e inclusión en parafina

Para FFPE, las células o esferoides se recogieron y se resuspendieron en HistoGel (número de catálogo HG-4000-012, Epredia, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las gotas de HistoGel se fijaron luego en formaldehído al 4 %. Los PCTS se incluyeron en parafina en orientación vertical según lo descrito por Davies et al. (^[55]). La deshidratación y la inclusión en parafina se realizaron en el departamento de patología del Hospital Robert Bosch (Stuttgart, Alemania).

Inmunohistoquímica

Las muestras de FFPE se cortaron en secciones de 3 μm de espesor utilizando un micrótomo rotatorio (RM2255, Leica, Wetzlar, Alemania) y se dejaron secar durante la noche a 56 °C. La tinción inmunohistoquímica (IHC) se realizó como se describió anteriormente utilizando protocolos estándar. Brevemente, las secciones se desparafinaron en Neoclear (número de catálogo 109843, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.), se rehidrataron a través de una serie de etanol graduado y se tiñeron utilizando el kit Dako Envision (#K5007, Agilent Technologies, Glostrup, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante. La recuperación del epítopo inducida por calor se realizó en un calentador de vapor durante 30 min utilizando un tampón de ácido cítrico a pH 6 o un tampón de Tris/EDTA a pH 9 (S2367, Agilent Technologies). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: caspasa-3 clivada (Asp175, 1:75; #9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), EpCAM (Ber-EP4, 1:100; M0804, Agilent Technologies, Glostrup, Dinamarca) y FAP (EPR20021, 1:100; ab207178, Abcam, Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo Dako REAL Envision/HRP Rabbit/Mouse proporcionado dentro del kit Dako Envision se aplicó como anticuerpo secundario. Los anticuerpos se detectaron con 3,3'-diaminobencidina y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las secciones teñidas se visualizaron utilizando un escáner de portaobjetos Olympus VS120 (Olympus Life Science, Waltham, MA, EE. UU.).

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

La tinción mIF de siete colores se realizó utilizando el método de amplificación de señal basado en tiramida OPAL, que permite la detección simultánea de seis anticuerpos más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los tejidos FFPE se cortaron en secciones de 3 μm utilizando un micrótomo rotatorio (Leica R2255, Leica Biosystems, Nussloch, Alemania). Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación del epítopo inducida por calor antes de la incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Los anticuerpos se visualizaron con tiramidas fluorescentes del kit de detección manual Opal 6-Plex (NEL861001KT, Akoya Biosciences, Marlborough, MA, EE. UU.). Los procedimientos de recuperación del epítopo y tinción se repitieron secuencialmente para diferentes combinaciones de anticuerpos primarios y tiramidas fluorescentes. Se optimizaron los paneles que consisten en los siguientes anticuerpos: αSMA (1A4, 1:100; ab7817, Abcam, Cambridge, Reino Unido), caspasa-3 clivada (Asp175, 1:75; #9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), CD3 (MRQ-39, 1:100; #103R, Cell Marque, Rocklin, CA, EE. UU.), FAP (EPR20021, 1:100; ab207178, Abcam, Cambridge, Reino Unido), GFP (D5.1, 1:100; #2956P, Cell Signaling Technology), Granzima B (D6E9W, 1:100; #46890, Cell Signaling Technology) y pan-queratina (AE1/AE3, #67306, Cell Signaling Technology). El anticuerpo Opal Polymer HRP Ms+Rb proporcionado dentro del kit de detección manual Opal 6-Plex se aplicó como anticuerpo secundario. Los anticuerpos se detectaron con 3,3'-diaminobencidina y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las secciones teñidas se montaron con ProLong Diamond Antifade Mountant (P36961, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se visualizaron utilizando el escáner de portaobjetos PhenoImager Fusion (Akoya Biosciences).

Análisis de la tinción de inmunofluorescencia multiplex

Tras la tinción mIF, se realizó la separación espectral de las secciones transversales del esferoide completo o de los PCTS en inForm 3.1.0 (Akoya Biosciences, Marlborough, MA, EE. UU.) utilizando controles de autofluorescencia específicos del tejido. Las imágenes separadas se analizaron utilizando QuPath versión 4.4.0 (^[62]). Se anotaron las secciones completas del tejido, excluyendo las áreas necróticas. Los núcleos se detectaron con la extensión StarDist. Las áreas FAP+ y FAP− se determinaron utilizando un clasificador de píxeles para el canal FAP. Las regiones de tumor y estroma se determinaron utilizando un clasificador de píxeles para el canal pan-CK. Se entrenaron clasificadores de objetos para detectar tipos de células o marcadores funcionales. Se utilizó el mismo algoritmo para todos los esferoides de un experimento o para todas las secciones de tejido de un paciente. Los fenotipos inmunitarios se determinaron a partir del tejido d0 utilizando un clasificador de píxeles para el tumor y el estroma. Se calculó el porcentaje o la densidad de células (células por mm2) positivas para un marcador o una combinación de marcadores. Las imágenes se revisaron visualmente para garantizar una fenotipificación fiable.

Análisis espacial

Análisis de citocinas

Los niveles de citocinas para Granzima B, Perforina, Granulisina, Granzima A, FasL e IFN-γ se analizaron en el medio de cultivo de los PCTS mediante citometría de flujo utilizando el panel LegendPlex Human CD8/NK (13-plex) (#741187, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Seguimiento de las células T

Las células T autólogas se aislaron de las CPM de los pacientes utilizando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (#17951, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá) según las instrucciones del fabricante y se tiñeron con 15 μM de CellTracker Orange CMRA (C34551, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante 30 min a 37 °C. Para el cocultivo, se añadieron 4 × 105 células T sobre los PCTS según se describe para las CPM. Después del cocultivo y el tratamiento, los núcleos de los PCTS se tiñeron con DRAQ5 (DR50050, Biostatus Ltd., Leicestershire, Reino Unido) 1:1000 en medio durante 30 min antes de la fijación en formaldehído al 4 % durante la noche. Al día siguiente, las secciones de tejido se deshidrataron y se rehidrataron en una serie de etanol graduado y luego se aclararon en Rapiclear 1.49 (#RC149001, Sunjin Lab Co., Hsinchu City, Taiwán) en portaobjetos con cámara a temperatura ambiente durante la noche. Los PCTS aclarados se visualizaron capturando pilas Z con un microscopio confocal láser de barrido Leica TCS SP8 (Leica, Wetzlar, Alemania) y se visualizaron con el Leica Application Suite X 3.5.7.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Después del cultivo y el tratamiento durante 2 días, los PCTS se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C hasta su procesamiento para la secuenciación de ARN de una sola célula. El tejido recogido en d0 o los PCTS se fijaron y se disociaron utilizando el kit de preparación de muestras de ARN fijas de una sola célula Chromium Next GEM (1000414, 10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.). La secuenciación de ARN de una sola célula se realizó utilizando el flujo de trabajo de ARN fijas de 10x Genomics según las instrucciones del fabricante (Guía del usuario CG000527 Rev. D). En resumen, las células o los núcleos fijos y permeabilizados se incubaron con sondas de hibridación de ARN. Tras la hibridación de la sonda, las muestras se cargaron en un chip 10x Genomics Chromium Next GEM Q, donde se particionaron formando emulsiones de cuentas en gel (GEM). Dentro de las GEM, las células o los núcleos individuales se sometieron a lisis, seguida de la transcripción inversa, generando cDNA con código de barras mediante la incorporación de códigos de barras celulares únicos e identificadores moleculares únicos (UMI). El cDNA con código de barras se recuperó luego de las GEM y se sometió a una preamplificación. Posteriormente, se construyeron bibliotecas mediante la fragmentación enzimática, la reparación de extremos, la ligación de adaptadores y un paso final de PCR para añadir índices específicos de la muestra para la secuenciación. Las bibliotecas completadas se sometieron a control de calidad mediante Bioanalyzer y qPCR, antes de ser agrupadas y cargadas en un Illumina NovaSeq X plus. Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron luego utilizando el canal de procesamiento de células de 10x Genomics Cell Ranger (versión 9) para la alineación, la corrección de códigos de barras y UMI y la cuantificación de la expresión génica. Los datos se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38 utilizando STAR dentro del software Cell Ranger. El procesamiento de datos se realizó utilizando el paquete R Seurat (v4.4.0) (^[63]). Las matrices de recuento resultantes de Cell Ranger se normalizaron mediante el método LogNormalize implementado en Seurat. Para garantizar la calidad de los datos, se identificaron y excluyeron los dobletes transcripómicos utilizando DoubletFinder (^[64]). La corrección del efecto de lote se implementó mediante el análisis de correlación canónica, seguida de la reducción de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales. Las poblaciones celulares se definieron a continuación mediante un método de agrupamiento no supervisado utilizando el algoritmo Louvain original mediante la función "FindClusters" dentro del paquete Seurat. Las identidades iniciales de los tipos de células se asignaron utilizando SingleR y luego se refinaron mediante la referencia cruzada de marcadores canónicos con la base de datos PanglaoDB (^[65]). Para el análisis posterior, la población de fibroblastos y la población de células T se aislaron para el análisis de expresión génica diferencial, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y el análisis de variación de conjuntos de genes. Las visualizaciones se produjeron utilizando ggplot2, pheatmap y EnhancedVolcano.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, Boston, MA, EE. UU.). Para los experimentos con esferoides, se compararon dos condiciones de tres réplicas biológicas con diferentes donantes de CPM alogénicas. La significación estadística entre los dos grupos se calculó utilizando pruebas t pareadas de dos colas. Para los experimentos con PCTS, se analizó la respuesta de los PCTS derivados de diferentes pacientes. Solo se compararon dos condiciones a la vez utilizando una prueba de rango de Wilcoxon pareada de dos colas. Cada prueba específica se menciona en la leyenda de la figura correspondiente. Para todas las pruebas estadísticas, la significación se definió como P < 0,05 con *P ≤ 0,05, P ≤ 0,01 y *P ≤ 0,001. Los datos se presentan como medias ± DE.

Guardar

PubMed Ver Artículo Original

Se abre en una nueva pestaña en la publicación original

Compartir y Discutir

Comentarios

Inicia sesión para comentar

¡Aún no hay comentarios. Sé el primero en comentar!

Recibe las últimas investigaciones sobre cáncer colorrectal en tu correo.

Semanal

Diario

Inicia sesión para gestionar en Configuración

Detalles del Artículo

El anticuerpo bispecífico FAP × CD3, OMTX305, induce efectos antitumorales mediados por las células T en modelos ex vivo de tumores sólidos derivados de pacientes.

¿Qué significa esto para los pacientes?

Ensayos Clínicos Relacionados

RESULTADOS

OMTX305 induce citotoxicidad dependiente de FAP en los FAC derivados del paciente a través de la activación de las células T

Los esferoides de FAC que expresan FAP son infiltrados y destruidos por las células T en respuesta a OMTX305

En los esferoides heterotípicos, OMTX305 induce la muerte celular en los FAC y las células tumorales

Las células T son activadas por OMTX305 en las RTP

La muerte celular se induce en los fibroblastos que expresan FAP y en las células tumorales adyacentes en las PCTS

Posible impacto de los fenotipos inmunes y el agotamiento inmune en la respuesta a OMTX305

OMTX305 activa las células T y modula la expresión génica específica del subconjunto en los fenotipos inmunes de HGSOC

OMTX305 induce el remodelado de la MEC y las respuestas de los interferones en los CAF

OMTX305 induce la citotoxicidad dependiente de FAP en los CAF derivados de pacientes a través de la interacción con las células T

Los esferoides de CAF que expresan FAP son infiltrados y destruidos por las células T en respuesta a OMTX305

En los esferoides heterotípicos, OMTX305 induce la muerte celular en los CAF y las células tumorales

Las células T se activan con OMTX305 en PCTS

La muerte celular se induce en fibroblastos que expresan FAP y en las células tumorales adyacentes en las PCTS

Posible impacto de los fenotipos inmunes y el agotamiento inmune en la respuesta a OMTX305

OMTX305 activa las células T y modula la expresión génica específica del subconjunto en los fenotipos inmunes de HGSOC

OMTX305 induce el remodelado de la MEC y las respuestas de los interferones en los CAF

DISCUSIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

TCEs FAP × CD3

Diseño del estudio

Células

Cultivo celular

Preparación de placas de ultra baja adherencia

Cultivo de esferoides

Tratamiento de células y esferoides con fármacos

Ensayo MTT

Ensayo LDH

qPCR en tiempo real

Tumores humanos primarios

Preparación de secciones tumorales

Cocultivo y tratamiento de secciones tumorales

Ensayo de ATP

Fijación con formalina e inclusión en parafina

Inmunohistoquímica

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

Análisis de la tinción de inmunofluorescencia multiplex

Análisis espacial

Análisis de citocinas

Seguimiento de las células T

Secuenciación de ARN de una sola célula

Análisis estadístico

FAP × CD3 TCE

Diseño del estudio

Células

Cultivo celular

Preparación de placas de ultra baja adherencia

Cultivo de esferoides

Tratamiento de células y esferoides con fármacos

Ensayo MTT

Ensayo LDH

qPCR en tiempo real

Tumores humanos primarios

Preparación de secciones de tumor

Cocultivo y tratamiento de secciones de tumor

Ensayo de ATP

Fijación con formalina e inclusión en parafina

Inmunohistoquímica

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

Análisis de la tinción de inmunofluorescencia multiplex

Análisis espacial

Análisis de citocinas

Seguimiento de las células T

Secuenciación de ARN de una sola célula

Análisis estadístico

Compartir y Discutir

Comentarios

Mantente Informado

Autores

Genes Mencionados

Tratamientos Mencionados

Sobre Este Artículo

Aviso Legal

Notas del Artículo

Enviar a mi oncólogo

¡Email enviado!