El kaempferol presenta una prometedora actividad antitumoral en el cáncer colorrectal (CRC), pero su exposición intracelular y eficacia están fuertemente influenciadas por el metabolismo de fase II y el transporte de eflujo. Aquí, demostramos que UGT1A1 y UGT1A9 regulan de forma diferente la acumulación de kaempferol y la actividad antitumoral en el CRC, y que ABCG2/BCRP y Mdr1/P-gP desempeñan funciones distintas en su retención intracelular y sus efectos farmacológicos. La actividad antitumoral en el CRC se evaluó utilizando sulforodamina B, formación de colonias, ensayo de curación de heridas, Transwell, apoptosis y ensayos de xenoinjerto. Se combinaron modelos de silenciamiento de UGT1A1/UGT1A9 y BCRP/P-gP con microscopía confocal de barrido láser y LC/MS para caracterizar la exposición intracelular, la distribución de metabolitos y las consecuencias funcionales.
Se utilizaron proteómica basada en SIP, análisis bioinformáticos, acoplamiento molecular y ensayos de validación ortogonal para priorizar y validar un objetivo nuclear del kaempferol. El kaempferol suprimió significativamente el crecimiento tumoral e inhibió la proliferación y la migración de las células de CRC. El silenciamiento de UGT1A1 aumentó la acumulación intracelular de kaempferol, incluida la exposición nuclear, pero redujo la citotoxicidad, mientras que el silenciamiento de UGT1A9 mejoró la sensibilidad celular. De manera similar, el silenciamiento de BCRP aumentó la acumulación intracelular y la eficacia antitumoral en el CRC, mientras que el silenciamiento de Mdr1 atenuó el efecto antitumoral a pesar de aumentar la acumulación intracelular total.
Mecánicamente, estos efectos diferenciales se asociaron con una composición alterada de los metabolitos, en particular el equilibrio entre el metabolito activo K-7-G y el metabolito poco activo K-3-G. BRG1 se identificó como un objetivo nuclear funcionalmente relevante del kaempferol, y el kaempferol promovió su degradación proteasómica dependiente de la ubiquitinación. En conjunto, estos hallazgos muestran que la eficacia del kaempferol no está determinada simplemente por la acumulación intracelular, sino por la interacción coordinada entre el metabolismo de fase II, el transporte de eflujo, la distribución de metabolitos y la interacción con el objetivo nuclear.
Este estudio proporciona una base mecanicista para mejorar la terapia del CRC basada en el kaempferol.
Suma de la actividad en Facebook, Twitter, Reddit y Wikipedia.
Contribuyeron por igual a este trabajo:
Chishun Zhou,
Qing Ning
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Análisis formal,
Metodología,
Software,
Redacción – borrador original,
Redacción – revisión y edición
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Contribuyeron por igual a este trabajo:
Chishun Zhou,
Qing Ning
Roles
Conceptualización,
Investigación,
Metodología,
Recursos,
Supervisión,
Redacción – borrador original
Afiliación
Hospital Afiliado de Medicina Tradicional China e Integrada Occidental, Universidad de Medicina China de Nanjing, Nanjing, China
Roles
Curación de datos,
Adquisición de financiación,
Recursos,
Supervisión,
Conceptualización
Afiliación
Departamento de Cirugía Colorrectal, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou, Academia Clínica de Investigación de Medicina China de Guangdong, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Metodología,
Software,
Validación,
Visualización
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Análisis formal,
Investigación,
Metodología,
Software
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Curación de datos,
Investigación,
Metodología
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Análisis formal,
Investigación,
Metodología
Dirección actual: Escuela de Ingeniería de Alimentos y Farmacéutica, Universidad de Zhaoqing, Zhaoqing, Provincia de Guangdong, China
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Investigación,
Metodología
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Adquisición de financiación,
Investigación,
Metodología,
Recursos
* Correo electrónico: lllu@gzucm.edu.cn (LL); liuzq@gzucm.edu.cn (ZL); wangwei16400@163.com (WW)
Afiliación
Departamento de Cirugía Gastrointestinal, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guangzhou, Academia Clínica de Investigación de Medicina China de Guangdong, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Curación de datos,
Adquisición de financiación,
Metodología,
Recursos,
Supervisión,
Visualización
* Correo electrónico: lllu@gzucm.edu.cn (LL); liuzq@gzucm.edu.cn (ZL); wangwei16400@163.com (WW)
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Roles
Conceptualización,
Análisis formal,
Adquisición de financiación,
Metodología,
Recursos,
Supervisión,
Redacción – revisión y edición
* Correo electrónico: lllu@gzucm.edu.cn (LL); liuzq@gzucm.edu.cn (ZL); wangwei16400@163.com (WW)
Afiliación
Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Laboratorio de Hengqin), Guangdong Hengqin, China; y Laboratorio Provincial Clave de Guangdong de Medicina China Traslacional, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación Traslacional del Cáncer de Medicinas Chinas, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional, Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China, Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China
Kaempferol exhibe una prometedora actividad antitumoral en el cáncer colorrectal (CCR), pero su exposición intracelular y eficacia están fuertemente influenciadas por el metabolismo de fase II y el transporte de eflujo. Aquí, mostramos que UGT1A1 y UGT1A9 regulan diferencialmente la acumulación de kaempferol y la actividad antitumoral, y que ABCG2/BCRP y Mdr1/P-gP desempeñan distintos papeles en su retención intracelular y efectos farmacológicos. La actividad antitumoral se evaluó utilizando sulforodamina B, formación de colonias, curación de heridas, Transwell, apoptosis y ensayos de xenoinjerto. Los modelos de silenciamiento de UGT1A1/UGT1A9 y BCRP/P-gP se combinaron con microscopía confocal de barrido láser y LC/MS para caracterizar la exposición intracelular, la disposición de los metabolitos y las consecuencias funcionales. La proteómica basada en SIP, los análisis bioinformáticos, el acoplamiento molecular y los ensayos de validación ortogonal se utilizaron para priorizar y validar un objetivo nuclear de kaempferol. Kaempferol suprimió significativamente el crecimiento tumoral e inhibió la proliferación y migración de las células de CCR. El silenciamiento de UGT1A1 aumentó la acumulación intracelular de kaempferol, incluida la exposición nuclear, pero redujo la citotoxicidad, mientras que el silenciamiento de UGT1A9 mejoró la sensibilidad celular. De manera similar, el silenciamiento de BCRP aumentó la acumulación intracelular y la eficacia antitumoral, mientras que el silenciamiento de Mdr1 atenuó el efecto antitumoral a pesar de aumentar la acumulación intracelular total. Mecánicamente, estos efectos diferenciales se asociaron con una composición alterada de los metabolitos, particularmente el equilibrio entre el metabolito activo K-7-G y el metabolito poco activo K-3-G. BRG1 se priorizó como un objetivo nuclear funcionalmente relevante de kaempferol, y kaempferol promovió su degradación proteasómica dependiente de la ubiquitinación. En conjunto, estos hallazgos muestran que la eficacia de kaempferol no está determinada simplemente por la acumulación intracelular, sino por la interacción coordinada entre el metabolismo de fase II, el transporte de eflujo, la disposición de los metabolitos y la unión al objetivo nuclear. Este estudio proporciona una base mecanicista para mejorar la terapia del CCR basada en kaempferol.
Citación: Zhou C, Ning Q, Jin X, Li Y, Lin Y, Lin J, et al. (2026) Orquestación de la translocación nuclear de kaempferol por enzimas metabólicas de fase II y transportadores de eflujo suprime el cáncer colorrectal. PLoS One 21(9):
e0355962.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0355962
Editor: Lalit Samant, Bai Jerbai Wadia Hospital for Children, INDIA
Recibido: 19 de febrero de 2026; Aceptado: 28 de julio de 2026; Publicado: 15 de septiembre de 2026
Derechos de autor: © 2026 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor y la fuente originales.
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el manuscrito y en los archivos de información complementaria.
Financiación: Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (Número de subvención 2023YFC3502800), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Números de subvención 82274196 y U22A20368), el Programa de Incubación del Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Humedad de la Medicina China (Número de subvención SZ2022KF09), el Laboratorio Estatal Clave de Síndrome de Medicina China Tradicional (Número de subvención SKLKY2025C0006), el Programa de Incubación para el Desarrollo Científico y Tecnológico del Laboratorio de Medicina China de Guangdong (Número de subvención HQL2024PZ040), el Proyecto de Apoyo de Talento de la Provincia de Guangdong (Número de subvención 2021JC050230) y el Proyecto Nacional de Herencia e Innovación de la Medicina Tradicional China (Número de subvención 2022QN13). Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.
Abreviaturas:
CCR,
cáncer colorrectal; LC-MS/MS,
cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem; LSCM,
microscopía confocal de barrido láser; SRB,
sulforodamina B; SIP,
precipitación inducida por solventes; KEGG,
Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; GO,
Ontología de genes; QPCR,
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; BSA,
albúmina sérica bovina; K-7-G,
kaempferol-7-glucurónido; K-3-G,
kaempferol-3-glucurónido; CETSA,
ensayo de desplazamiento térmico celular; UGT1A1,
UDP-glucuronosiltransferasa familia 1 miembro A1; UGT1A9,
UDP-glucuronosiltransferasa familia 1 miembro A9; BCRP,
proteína de resistencia al cáncer de mama; P-gP,
proteína P-glucoproteína; Mdr1,
proteína de resistencia a múltiples fármacos 1; BRG1,
gen relacionado con Brahma 1; CHX,
cicloheximida; PPI,
interacción proteína-proteína; TCGA,
El Proyecto del Genoma del Cáncer; CPTAC,
Consorcio de Proteómica Tumoral Clínica; DMSO,
dimetilsulfóxido; PBS,
tampón fosfato salino
La absorción, el metabolismo y la disposición intracelular de las moléculas pequeñas son determinantes importantes de la eficacia y la seguridad terapéuticas. Los flavonoides son una amplia clase de polifenoles dietéticos con diversas actividades farmacológicas, incluidos los efectos anticancerígenos [1]. Sin embargo, su traslación clínica a menudo se ve limitada por su baja biodisponibilidad. Tras la absorción intestinal, los flavonoides sufren un extenso metabolismo de fase II, principalmente mediado por las UDP-glucuronosiltransferasas (UGT), las sulfotransferasas (SULT) y las glutatión S-transferasas (GST), que los convierten en conjugados más hidrofílicos y, por lo tanto, alteran la permeabilidad de la membrana, la distribución tisular y la actividad farmacológica [2,3]. En paralelo, los transportadores de eflujo, como la P-glucoproteína (P-gP), la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y las proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos (MRP), regulan la exportación de los compuestos parentales y sus conjugados, lo que modifica aún más la exposición intracelular [4,5]. Por lo tanto, las acciones coordinadas de las enzimas metabólicas de fase II y los transportadores de eflujo son determinantes centrales de la disposición de los flavonoides.
El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo uno de los cánceres gastrointestinales más comunes en todo el mundo. Las estrategias de tratamiento actuales, que incluyen la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia y la terapia dirigida, se ven limitadas por la resistencia a los fármacos, los efectos adversos y la marcada variabilidad interpaciente [6]. Los flavonoides han demostrado ser prometedores en la prevención y el tratamiento del CCR [7,8], pero su baja biodisponibilidad sigue siendo un obstáculo importante para su aplicación clínica. Estudios previos han demostrado que la deficiencia de transportadores puede alterar significativamente la exposición a los flavonoides; por ejemplo, la biodisponibilidad oral de la daidzeína y sus conjugados aumenta sustancialmente en ratones deficientes en Bcrp1 [9]. Estas observaciones resaltan la importancia de la interacción entre el metabolismo y el transporte de eflujo en la determinación de la eficacia de los flavonoides.
El kaempferol es un flavonol que se encuentra de forma natural y es uno de los principales componentes activos de la Kaempferia galanga Linn. Cada vez hay más evidencia de que el kaempferol ejerce efectos inhibitorios contra el CCR [10,11]. Sin embargo, su biodisponibilidad sistémica es baja [12,13], mientras que su actividad antitumoral sigue siendo evidente, lo que sugiere que la exposición a nivel tisular y subcelular puede ser más relevante que la concentración plasmática por sí sola. El kaempferol se metaboliza predominantemente por UGT1A1 y UGT1A9 para formar kaempferol-7-glucurónido y kaempferol-3-glucurónido, respectivamente [12,14]. Su eflujo celular está regulado principalmente por BCRP y P-gP. A pesar de estos avances, aún no está claro cómo las enzimas metabólicas específicas de fase II y los transportadores de eflujo influyen conjuntamente en la acumulación de kaempferol, la interacción con el objetivo nuclear y la eficacia antitumoral en el CCR.
En el presente estudio, investigamos la actividad antitumoral del kaempferol contra el CCR y los mecanismos que rigen su disposición intracelular utilizando enfoques in vivo e in vitro integrados. Evaluamos los papeles respectivos de UGT1A1 frente a UGT1A9 y BCRP frente a P-gP en la regulación de la acumulación y la actividad del kaempferol, e identificamos además BRG1 como un objetivo nuclear funcional relevante que es degradado por el kaempferol. Estos hallazgos aclaran cómo el metabolismo de fase II y el transporte de eflujo determinan conjuntamente los efectos farmacológicos del kaempferol y proporcionan una base mecanicista para mejorar las estrategias basadas en el kaempferol para el tratamiento del CCR.
Células: Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (CCR), HCT116 (C1125), Caco-2 (C1115), HCT15 (C1096), RKO (C1226), DLD-1 (C1073), SW480 (C1128), LoVo (C1019), SW620 (C1160) y HT-29 (C1007), se obtuvieron de Shanghai Whelab Bioscience Limited y se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR). Las células epiteliales normales del colon humano NCM460 (C1227) se obtuvieron del mismo proveedor y se autenticaron de manera similar. Las células se cultivaron en medio DMEM (núm. de catálogo 11965092) o medio RPMI-1640 (núm. de catálogo 11875093) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS; núm. de catálogo 10099141C) y un 1% de penicilina-estreptomicina (núm. de catálogo 15140122) (todos de Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C en una incubadora humidificada que contiene un 5% de CO2. Para el diseño experimental, se utilizaron diferentes líneas celulares de CCR según sus características biológicas.
Animales y declaración ética: Se obtuvieron ratones nudosos BALB/c machos (de 3 a 4 semanas de edad, de 16 a 18 g) del Centro de Animales de Laboratorio Provincial de Guangdong. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.) y fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina China de Guangzhou (núm. de permiso SYXK(Yue) 2024-0144). Los ratones se alojaron en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) en condiciones ambientales controladas (22 ± 1 °C, 55 ± 5% de humedad, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso libre a alimentos y agua esterilizados. Todo el personal involucrado en los experimentos con animales recibió la capacitación adecuada en el cuidado y manejo de animales de acuerdo con las pautas institucionales, y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales durante el estudio.
Se estableció un modelo de xenoinjerto subcutáneo inyectando 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 5 × 105 células de cáncer colorrectal humano HCT116 en el flanco derecho de 32 ratones nudosos BALB/c machos de cuatro semanas de edad. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, calculado como V = diámetro más largo × diámetro más corto2 × 0,52, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (n = 8 por grupo) utilizando una tabla de números aleatorios. El grupo de control recibió un volumen equivalente de vehículo mediante gavage oral diario, mientras que los grupos de dosis baja, media y alta recibieron kaempferol (MeilunBio, MB2171; pureza > 98%) a 50, 100 y 150 mg/kg, respectivamente, mediante gavage oral diario.
Se aplicaron puntos finales humanitarios durante todo el experimento para minimizar el sufrimiento de los animales. Se controlaron diariamente los ratones para evaluar su estado general de salud, comportamiento, crecimiento tumoral y peso corporal. El tamaño del tumor se midió con un calibre de vernier. Los criterios de eutanasia predefinidos incluyeron: (1) volumen tumoral superior a 1000 mm3; (2) ulceración o necrosis tumoral; (3) pérdida de peso corporal superior al 20% del peso corporal basal; o (4) signos de angustia grave, que incluyen postura encorvada, letargo, movilidad reducida, pelaje erizado o incapacidad para acceder a alimentos o agua. Los ratones que cumplieran cualquiera de estos criterios fueron sometidos a eutanasia inmediatamente bajo anestesia con isoflurano seguida de dislocación cervical.
El experimento se finalizó el día 19, cuando el volumen tumoral promedio en el grupo de control superó los 1000 mm3 y, por lo tanto, se alcanzó el punto final ético predefinido. Después de la eutanasia, se recolectaron muestras de sangre mediante punción cardíaca y se separó el suero por centrifugación. Se recolectaron tumores y órganos principales, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones. Se fijaron porciones de tejido tumoral en formaldehído al 4% para análisis histológicos e inmunohistoquímicos, mientras que el tejido restante se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para análisis de Western blot y PCR cuantitativa (QPCR). Ningún animal murió antes de alcanzar los puntos finales humanitarios predefinidos durante el período de estudio.
Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído al 4% (Beyotime, P0099-100 mL), se deshidrataron mediante una serie de etanol graduado, se aclararon en xileno, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 7 μm de espesor. Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones de tejido se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación de antígenos basada en microondas. Después del bloqueo, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Ki67 (Abcam, ab16667; dilución 1:200) o PCNA (Abcam, ab92552; dilución 1:500). Después del lavado, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (Abcam, ab6721; dilución 1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. La inmunorreactividad se visualizó utilizando un kit de reactivo SABC (Beyotime Biotechnology) con 3,3'-diaminobencidina (DAB) como sustrato cromogénico, seguido de contratinción con hematoxilina (Beyotime, C0107-100 mL). Las secciones teñidas se deshidrataron, se aclararon, se montaron y se examinaron bajo un microscopio óptico vertical (DM500, Leica Microsystems, Alemania). Se analizaron tres réplicas biológicas para cada grupo experimental.
Las células en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía un 5% de CO2. Luego, las células se trataron con concentraciones graduadas de kaempferol (0-100 μM) durante 24, 48 o 72 horas. A menos que se indique lo contrario, la viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo de sulforodamina B (SRB). Al final del tratamiento, se retiró el medio de cultivo y las células se fijaron con ácido tricloroacético (TCA) al 10% en hielo durante 1 hora a 4 °C. Luego, las placas se lavaron cinco veces con agua desionizada para eliminar el TCA residual y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se tiñeron con una solución de SRB al 0,4% (p/p) en ácido acético al 1% (Sigma-Aldrich, núm. de catálogo 341738) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El tinte no unido se eliminó lavando las placas cuatro veces con ácido acético al 1%, seguido de secado al aire. La SRB unida a la proteína se disolvió en un tampón de Tris-base al 10 mM (pH 10,5) con agitación orbital a 200 rpm durante 15 minutos. La absorbancia se midió a 540 nm con sustracción de fondo a 690 nm utilizando un lector de microplacas multimodales (Synergy H1, BioTek Instruments). La viabilidad celular se expresó como un porcentaje en relación con el grupo de control no tratado. Los valores de IC50 se calcularon a partir de las curvas de dosis-respuesta de SRB mediante análisis de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism. Se incluyeron seis réplicas técnicas para cada grupo, y cada experimento se realizó en tres réplicas biológicas independientes.
La migración celular se evaluó utilizando cámaras de Transwell. Las células HCT116 se sembraron en las cámaras superiores y se dejaron adherir durante la noche. Luego, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contenía diferentes concentraciones de kaempferol, y las células se incubaron posteriormente durante 48 horas. Al final del período de incubación, las células que permanecieron en la superficie superior de la membrana se eliminaron suavemente. Las células que habían migrado a la superficie inferior se fijaron con formaldehído al 4%, se lavaron con PBS y se tiñeron con cristal violeta. Después de eliminar el exceso de tinte, las células migradas se observaron y se fotografiaron bajo un microscopio óptico vertical (DM500, Leica Microsystems, Alemania). Las imágenes celulares se analizaron y el número de células migradas se cuantificó utilizando el software ImageJ. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada grupo.
Las células HCT116 se sembraron en placas de seis pocillos y se cultivaron hasta que alcanzaron una confluencia del 70-80%. Se generó una herida lineal en el monocapa celular utilizando la punta de una pipeta estéril. Las células desprendidas se eliminaron lavando dos veces con PBS, y luego se añadió medio de cultivo fresco que contenía las concentraciones indicadas de kaempferol. El cierre de la herida se controló tomando imágenes a 0, 12, 24 y 48 horas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (DM IL LED, Leica Microsystems, Alemania). Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada grupo.
Las células HCT116 se sembraron en placas de seis pocillos y se cultivaron durante 14 días, reemplazando el medio de cultivo cada 2 días. Al final del período de incubación, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído al 4% y se dejaron secar al aire. Las colonias se tiñeron con cristal violeta y se eliminó el exceso de tinte lavando suavemente. Después de secar, las colonias se fotografiaron y se contaron. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada grupo.
Las células HCT116 se sembraron en placas de seis pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Después del tratamiento con las concentraciones indicadas de kaempferol durante 48 horas, se recogieron tanto las células en suspensión como las adheridas, se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en 1 × tampón de unión. La apoptosis se evaluó utilizando un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se incubaron con Annexin V-FITC e yoduro de propidio (PI) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. El análisis por citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo BD FACSAria Fusion (BD Biosciences, EE. UU.) y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (versión 7.6.1; FlowJo LLC, EE. UU.). Las células en fase temprana de apoptosis se definieron como Annexin V-positivas/PI-negativas, las células en fase tardía de apoptosis como Annexin V-positivas/PI-positivas, y la fracción total de apoptosis se calculó como la suma de las células en fase temprana y tardía de apoptosis.
Se extrajo el ARN total de las líneas celulares de cáncer colorrectal utilizando el reactivo TRIzol (Accurate Biology, AG21101) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se lisaron en TRIzol, seguido de la extracción con cloroformo y centrifugación. Luego, el ARN se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 75%, se disolvió en agua tratada con DEPC y se cuantificó. El ADN complementario de la primera cadena se sintetizó utilizando el kit Evo M-MLV RT (Accurate Biology, AG11601) en las siguientes condiciones: 25 °C durante 10 minutos, 42 °C durante 15 minutos, 85 °C durante 5 minutos y mantenimiento a 4 °C. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR) en un sistema ABI QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.; versión del software 1.5.1). Las mezclas de reacción se prepararon según las instrucciones del fabricante, se transfirieron a placas de 384 pocillos, se sellaron, se centrifugaron y se amplificaron bajo las siguientes condiciones de ciclaje: 95 °C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 30 segundos. A continuación, se realizó un análisis de la curva de fusión a 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 95 °C durante 15 segundos con adquisición continua de la señal. Todas las reacciones se realizaron en triplicado técnico y se incluyeron controles sin plantilla para garantizar la especificidad. La eficiencia de amplificación para cada conjunto de cebadores se validó utilizando curvas estándar. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada grupo. Los niveles relativos de expresión de ARNm se calcularon utilizando el método 2(-ΔΔCt) con GAPDH como gen de referencia endógeno. En este análisis, ΔCt se definió como la diferencia entre los valores de Ct del gen diana y GAPDH, y ΔΔCt se definió como la diferencia entre los valores de ΔCt de los grupos experimentales y de control. El análisis estadístico y la presentación gráfica se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0 (GraphPad Software Inc., EE. UU.) y las comparaciones de grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student o ANOVA de una vía, según corresponda. (Tabla S1).
Las células HT-29 y Caco-2 se sembraron en placas de seis pocillos y se cultivaron hasta que alcanzaron aproximadamente un 30% de confluencia. Luego, las células se transfectaron con vectores lentivirales que contenían shRNAs dirigidos a los genes de interés en un medio de cultivo fresco suplementado con polibreno. Después de 24 horas, se reemplazó el medio y las células se cultivaron durante 72 horas adicionales. La eficiencia de la transducción se evaluó preliminarmente observando la fluorescencia de GFP bajo un microscopio de fluorescencia. Posteriormente, las células transfectadas de forma estable se seleccionaron utilizando puromicina. La eficiencia del silenciamiento se confirmó mediante QPCR y análisis de Western blot. Luego, se realizó una expansión monoclonal para establecer líneas celulares de silenciamiento estable.
Las células se lisaron en tampón RIPA (Thermo Scientific™, 89901) suplementado con inhibidores de proteasas. Después de la centrifugación para eliminar los restos celulares, se recogieron los sobrenadantes para la cuantificación de proteínas. Las concentraciones totales de proteínas se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinquinónico (BCA) (Pierce™, Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 23225) según las instrucciones del fabricante, utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. La absorbancia se midió a 562 nm utilizando un lector de microplacas multimodal. Las muestras de proteínas se ajustaron a concentraciones iguales y se mezclaron con 5 × tampón de carga. Cantidades iguales de proteína total (30 μg por carril) se separaron en geles de poliacrilamida SDS al 10% y luego se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con BSA al 5%, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra UGT1A1 (Abcam, ab170858), UGT1A9 (Abcam, ab180707), BCRP (Abcam, ab207732), P-gP (Abcam, ab261736), BRG1 o GAPDH. Después del lavado, las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiados diluidos en TBST que contenía 5% de leche descremada. Para los anticuerpos primarios derivados de conejo, se utilizó HRP-conjugado de cabra anti-conejo IgG (Invitrogen, n.º de catálogo A27036) a una dilución de 1:5000. Para los anticuerpos primarios derivados de ratón, se utilizó HRP-conjugado de cabra anti-ratón IgG (Invitrogen, n.º de catálogo A27012) a una dilución de 1:5000. GAPDH se utilizó como control de carga para la normalización. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 34580) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada grupo.
Las células Caco-2 y HT-29, incluidas sus variantes con silenciamiento de UGT1A1 y UGT1A9, se trataron con kaempferol en las condiciones indicadas. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con PBS helado y se recogieron para la extracción de metabolitos. Los metabolitos intracelulares se extrajeron con metanol al 80% helado que contenía el estándar interno rutina. Las muestras se agitaron en un vórtice, se sonicaron en hielo y se centrifugaron a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron, se secaron bajo una corriente suave de nitrógeno a 40 °C y se resuspendieron en acetonitrilo al 50% que contenía 0,1% de ácido fórmico antes del análisis por LC-MS. Para la normalización, se lisaron muestras celulares paralelas con tampón RIPA y se determinaron las concentraciones totales de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Para el análisis de metabolitos subcelulares, se prepararon las fracciones citoplasmáticas y nucleares según el protocolo de fraccionamiento correspondiente y se procesaron utilizando el mismo procedimiento de extracción. Los niveles de metabolitos se normalizaron a la concentración de proteínas. Kaempferol, kaempferol-7-O-glucurónido (K-7-G) y kaempferol-3-O-glucurónido (K-3-G) se analizaron utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplado a un espectrómetro de masas Xevo G2-XS Q-TOF. La separación cromatográfica se realizó en una columna ACQUITY UPLC BEH C18 utilizando ácido fórmico al 0,1% en agua como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo como fase móvil B. El caudal fue de 0,3 mL/min. La detección por espectrometría de masas se realizó en modo de electrospray negativo. Kaempferol se detectó como [M-H]- a m/z 285,040, mientras que K-3-G y K-7-G se detectaron como [M-H]- a m/z 461,073, con un ion fragmento característico a m/z 285,040. La identificación de K-3-G y K-7-G se basó en la masa exacta, la fragmentación MS/MS, el tiempo de retención y la comparación con estándares auténticos.
SIP se utilizó para identificar proteínas candidatas que interactúan directamente con kaempferol. El principio de este ensayo es que la unión de un ligando de molécula pequeña puede alterar la conformación de la proteína y, por lo tanto, cambiar la susceptibilidad de la proteína unida a la precipitación en presencia de una mezcla de disolventes orgánicos. En las condiciones del ensayo utilizadas en este estudio, las proteínas asociadas con la unión a kaempferol tenían más probabilidades de permanecer enriquecidas en el sobrenadante después del tratamiento con disolventes. Brevemente, la concentración de proteínas de los lisados celulares se ajustó a 5 mg/mL y los lisados se dividieron en dos alícuotas. Una alícuota se incubó con 100 μM de kaempferol, mientras que la otra se incubó con un volumen igual de DMSO como control de disolvente, durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se añadió un sistema de disolventes orgánicos mixtos (etanol:acetona:ácido acético = 50:50:1) hasta una concentración final del 12%, seguido de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos (para CETSA, se calienta a una temperatura de gradiente de °C a 65 °C durante 5 minutos). Las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 15 minutos y se recogieron los sobrenadantes resultantes. Los sobrenadantes se mezclaron con tampón de carga, se calentaron a 100 °C durante 5 minutos y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un kit de tinción rápida con plata e imágenes para el análisis. Las bandas de proteínas enriquecidas en el sobrenadante del grupo tratado con kaempferol en relación con el grupo de control de DMSO se excindieron y se sometieron a identificación por espectrometría de masas. En este estudio, la lectura de SIP se definió como el enriquecimiento relativo de proteínas en el sobrenadante después del tratamiento con kaempferol en comparación con el control de DMSO. En consecuencia, estas proteínas se trataron como proteínas candidatas que interactúan con kaempferol en lugar de proteínas con niveles de expresión alterados.
Las muestras de proteínas del sobrenadante derivadas de SIP se sometieron a análisis proteómico basado en espectrometría de masas por Hangzhou Jingjie Biotechnology Co., Ltd. Las proteínas enriquecidas en el sobrenadante del grupo tratado con kaempferol en relación con el grupo de control de DMSO se definieron como proteínas candidatas que interactúan con kaempferol. En total, se identificaron 62 proteínas como proteínas candidatas enriquecidas, mientras que 248 proteínas se enriquecieron menos en el sobrenadante tratado con kaempferol y no se interpretaron como proteínas con expresión diferencial. Se realizó un análisis de localización subcelular de las 62 proteínas candidatas utilizando la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/). Se realizó la anotación del dominio de proteínas utilizando PfamScan versión 1.6 basada en la base de datos Pfam (https://pfam.xfam.org/). Se realizaron análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) para las 62 proteínas candidatas utilizando la base de datos GO (http://geneontology.org/) y la base de datos KEGG (https://www.genome.jp/kegg/), respectivamente. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la significación estadística de los resultados del enriquecimiento. Estos datos de enriquecimiento se muestran en la Fig. 4E y se resumen en las tablas suplementarias correspondientes. Se construyeron redes de interacción proteína-proteína (PPI) utilizando la base de datos STRING versión 11.5 (https://string-db.org/) y se visualizaron utilizando Cytoscape versión 3.8.2. Basándose en el análisis de la localización subcelular, se identificaron 37 de las 62 proteínas candidatas como proteínas localizadas en el núcleo. Estas 37 proteínas nucleares se sometieron a un análisis adicional de la red de PPI, del cual se identificaron 15 proteínas de nodo central utilizando un umbral de puntuación de confianza ≥ 0,7. Para el análisis de acoplamiento molecular, la estructura de kaempferol se obtuvo de la plataforma NIH NLM y la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), mientras que las estructuras de las proteínas se obtuvieron de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold (https://alphafold.ebi.ac.uk/). Se realizó el preprocesamiento de la estructura utilizando scripts de Julia y BioStructures. El acoplamiento molecular se realizó utilizando AutoDock Vina versión 1.1.2, LeDock versión 1.0 y XDock versión 2019. Se calcularon e integraron las energías de unión para la priorización de objetivos. Las 10 proteínas de mayor rango en el acoplamiento se cruzaron con las 15 proteínas centrales de PPI para identificar BRG1 (SMARCA4) como el principal objetivo candidato. Para el análisis de la relevancia clínica, se utilizaron The Cancer Genome Atlas (TCGA) y las bases de datos del Consorcio de Proteómica Clínica del Tumor (CPTAC) para analizar la expresión y la validación proteómica de BRG1 en el cáncer colorrectal. La información de autenticación de la línea celular se obtuvo de la base de datos Cellosaurus (https://www.cellosaurus.org/).
Para evaluar la estabilidad de la proteína BRG1, las células se trataron con cicloheximida (CHX; 100 μM) en un medio de cultivo fresco para bloquear la síntesis de proteínas de novo. En los puntos temporales indicados (0, 3, 6, 9, 12, 24, 36 y 48 horas), se recogieron las células y se lisaron para la extracción de proteínas. Los niveles de proteína BRG1 en cada punto temporal se analizaron mediante Western blot, utilizando GAPDH como control de carga. Se cuantificaron las intensidades de las bandas, se normalizaron con GAPDH y se ajustaron utilizando un modelo de decaimiento exponencial de una fase para estimar la vida media y la constante de velocidad de degradación de BRG1.
Las células se sembraron en placas de microscopía confocal (NEST, 801002) y se cultivaron durante la noche. Tras el tratamiento con el fármaco, se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton X-100 y se bloquearon con BSA al 2,5%. Posteriormente, las células se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C, seguido de la incubación con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente durante 1 hora a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) en condiciones protegidas de la luz. Finalmente, los núcleos se contrateñeron con un agente de extinción de fluorescencia que contiene DAPI (Beyotime Biotechnology, P0131-25 mL), y las muestras se observaron bajo un microscopio confocal láser (Microscopio confocal láser: Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Alemania)).
Para evaluar la ubiquitilación de BRG1, las células se pretrataron con MG132 (10 μM) durante 4 horas para bloquear la degradación proteasómica de las proteínas ubiquitinadas y luego se trataron con kaempferol (50 μM) durante 24 horas. Se prepararon lisados celulares totales en un tampón de lisis no desnaturalizante suplementado con inhibidores de proteasas. BRG1 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo anti-BRG1 y se incubó con cuentas de agarosa de proteína A/G durante la noche a 4 °C. Después de un lavado exhaustivo, los complejos inmunoprecipitados se sometieron a SDS-PAGE y se inmunotintaron con un anticuerpo anti-ubiquitina (FK2) para detectar BRG1 ubiquitinado. Se detectó la cantidad total de BRG1 en los inmunoprecipitados en paralelo y se utilizó para la normalización.
Para evaluar la asociación entre BRG1 y TRIM21, las células se trataron con kaempferol (50 μM) durante 24 horas y se lisaron en un tampón de lisis no desnaturalizante. Se incubaron cantidades iguales de proteína total (500 μg) durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-BRG1 o anticuerpo anti-TRIM21 en presencia de cuentas de agarosa de proteína A/G. Después del lavado, los complejos inmunoprecipitados se analizaron mediante Western blot para detectar la asociación entre BRG1 y TRIM21. Se realizó una inmunoprecipitación recíproca para validar aún más la interacción.
Se evaluó la proliferación celular utilizando un ensayo de incorporación de EdU. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Luego, se añadió EdU al medio de cultivo a una concentración final de 10 μM, y las células se incubaron durante 2 horas adicionales. Después de la incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron con el cóctel de reacción Click-iT® durante 30 minutos en la oscuridad. Los núcleos se contrateñeron con DAPI (1 μg/mL) durante 10 minutos. Se adquirieron imágenes de fluorescencia y se calculó el porcentaje de células EdU-positivas para evaluar la proliferación celular.
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0 para la producción de gráficos y SPSS 21.0 para el análisis de datos. Inicialmente, los datos se evaluaron para la distribución normal y la homogeneidad de la varianza. Se utilizó ANOVA de una vía para evaluar las diferencias intergrupales en datos con distribución normal y varianza homogénea. Si se identificaron diferencias sustanciales (P < 0,05), se empleó la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Para los datos con varianza no homogénea, se utilizó la prueba de Welch, seguida de la prueba de Dunnett T3 para comparaciones por pares. Los datos con distribución no normal se analizaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis, y si se detectó una diferencia general significativa (P < 0,05), se aplicó la prueba de comparación múltiple de Dunn para comparaciones por pares. Para el análisis de supervivencia, se construyeron curvas de Kaplan-Meier para visualizar las diferencias en la supervivencia general, y se aplicó la prueba de Log-rank (Mantel-Cox) para comparar la supervivencia entre los grupos con alta y baja expresión de BRG1. La razón de riesgos (HR) y su intervalo de confianza del 95% se calcularon además utilizando la regresión de riesgos proporcionales de Cox para cuantificar la asociación entre la expresión de BRG1 y el resultado de la supervivencia. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (media ± DE), con P < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Los niveles de significación en las figuras se indican como *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001.
Para evaluar la eficacia antitumoral de kaempferol en CRC, establecimos un modelo de xenoinjerto subcutáneo utilizando células HCT116 en ratones y administramos dosis variables de kaempferol (Fig. 1A). El tratamiento con kaempferol no causó cambios significativos en el peso corporal (Fig. 1B), lo que sugiere una baja toxicidad sistémica (Fig. S1A). En comparación con el grupo control, todos los grupos tratados con kaempferol mostraron una supresión significativa del crecimiento tumoral después de 12 días de tratamiento. Al final del experimento (día 19), tanto el volumen tumoral como el peso del tumor extirpado se redujeron significativamente en los grupos tratados con kaempferol (Fig. 1C-F). El análisis inmunohistoquímico mostró además que el kaempferol redujo significativamente la expresión de Ki67 en los tejidos tumorales (P < 0,01 frente al control), mientras que no se observó una diferencia significativa en la expresión de PCNA (Fig. 1G-I).
(A) Ilustración esquemática del modelo de xenoinjerto HCT116 y el régimen de tratamiento con kaempferol. (B) Cambios en el peso corporal de los ratones portadores de tumores durante el tratamiento. (C) Imágenes representativas de los tumores extirpados de cada grupo. (D) Volúmenes tumorales finales al final del estudio. (E) Curvas de crecimiento tumoral durante el período de tratamiento. (F) Pesos tumorales finales al final del estudio. (G) Imágenes inmunohistoquímicas representativas de la expresión de Ki67 y PCNA en los tejidos tumorales. (H) Cuantificación de la expresión de Ki67. (I) Cuantificación de la expresión de PCNA. (J) Ensayo SRB que muestra los efectos del kaempferol sobre la viabilidad de las células HCT116 después de 24, 48 y 72 horas de tratamiento. (K) Ensayo SRB que muestra los efectos del kaempferol sobre la viabilidad de las células epiteliales colónicas normales NCM460 después de 24, 48 y 72 horas de tratamiento. (L) Ensayo de formación de colonias que muestra el efecto del kaempferol sobre el crecimiento clonogénico de las células HCT116, con la cuantificación correspondiente. (M) Ensayo de migración transdérmica que muestra el efecto del kaempferol sobre la capacidad de migración de las células HCT116, con la cuantificación correspondiente. (N) Ensayo de curación de heridas que muestra el efecto del kaempferol sobre la migración de las células HCT116, con la cuantificación correspondiente. (O) Análisis citométrico de flujo de Annexin V-FITC/PI de la apoptosis en las células HCT116 tratadas con kaempferol, con la cuantificación correspondiente. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001 frente al grupo de control correspondiente.
El ensayo de sulforodamina B (SRB) mostró que el kaempferol inhibió la proliferación de las células HCT116 de forma dependiente de la concentración y del tiempo (Fig. 1J). Después de 72 horas de tratamiento, 100 μM de kaempferol redujeron la viabilidad celular al 39,34 % ± 2,3 % (P < 0,001). En contraste, no se observó una citotoxicidad evidente en las células epiteliales colónicas normales NCM460 a concentraciones ≤ 100 μM (viabilidad > 92 %; Fig. 1K), lo que indica un cierto grado de selectividad tumoral. La formación de colonias también se redujo notablemente después del tratamiento con kaempferol (Fig. 1L). Los ensayos de transdérmica y curación de heridas mostraron consistentemente que el kaempferol alteró significativamente la capacidad migratoria de las células HCT116 (Fig. 1M-N). Además, el análisis citométrico de flujo de Annexin V-FITC/PI demostró que el kaempferol indujo la apoptosis en las células HCT116 de forma dependiente de la concentración (P < 0,001; Fig. 1O), como se refleja en el aumento de las proporciones de células en fase de apoptosis temprana, apoptosis tardía y apoptosis total. También se observaron efectos antiproliferativos y antimigratorios similares en las células HT-29 y Caco-2 (Fig. S1B-D), lo que respalda la relevancia entre diferentes líneas celulares de la actividad antitumoral del kaempferol. En conjunto, estos hallazgos demuestran que el kaempferol ejerce efectos antitumorales significativos tanto in vivo como in vitro.
Nuestros estudios previos identificaron a UGT1A1 y UGT1A9 como las principales enzimas metabólicas de fase II responsables de la conversión de kaempferol en kaempferol-7-glucurónido (K-7-G) y kaempferol-3-glucurónido (K-3-G), respectivamente [11]. El análisis de QPCR mostró que las células Caco-2, HT-29 y LoVo expresaban niveles relativamente altos de UGT1A1 y UGT1A9 (Fig. 2A). La eficiencia de la inhibición se confirmó mediante análisis de QPCR y Western blot en las células HT-29 y Caco-2 (Fig. 2B-D). Además, el análisis repetido de Western blot realizado en condiciones experimentales coincidentes mostró que la expresión de la proteína UGT1A9 era mayor en las células HT-29 que en las células Caco-2, lo que era consistente con los resultados de QPCR (Fig. S2A). La microscopía confocal láser mostró que la acumulación intracelular de kaempferol aumentó después de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9, y el aumento más pronunciado se observó en las células con inhibición de UGT1A1 (Fig. 2E-F). El análisis de LC-MS/MS mostró además que la exposición intracelular a kaempferol en las células HT-29 y Caco-2 aumentó con el tiempo, alcanzó un máximo a las 12 horas y mostró una mayor acumulación nuclear a las 24 horas, particularmente después de la inhibición de UGT1A1 (Fig. 2G-H). La exposición intracelular total fue mayor en las células Caco-2 que en las células HT-29. Los ensayos SRB mostraron que el kaempferol ejerció una citotoxicidad dependiente del tiempo en las células HT-29 y Caco-2. Sin embargo, este efecto se atenuó después de la inhibición de UGT1A1, mientras que la inhibición de UGT1A9 aumentó la sensibilidad celular al kaempferol (Fig. 2I-J; Fig. S2B-E). Para investigar más a fondo esta diferencia, comparamos las actividades de los principales metabolitos glucuronidados. El kaempferol mostró una citotoxicidad significativa a 50,0706 μM, mientras que K-7-G exhibió una actividad antiproliferativa marcadamente más fuerte, con una concentración efectiva de 47,7986 μM. En contraste, K-3-G mostró poco efecto sobre la viabilidad celular (tratamiento en células HT-29 durante 48 h, Fig. 2K) (los resultados de Caco-2 se muestran en la Fig. 2L).
(A) Niveles de expresión de ARNm basales de UGT1A1 y UGT1A9 en diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal. (B) Verificación de QPCR de la inhibición de UGT1A1 y UGT1A9 en las células HT-29 y Caco-2. (C) Verificación de Western blot de la eficiencia de la inhibición de UGT1A1 en las células HT-29 y Caco-2, con la cuantificación correspondiente. (D) Verificación de Western blot de la eficiencia de la inhibición de UGT1A9 en las células HT-29 y Caco-2, con la cuantificación correspondiente. (E) Análisis de microscopía confocal láser (LSCM) de la exposición intracelular a kaempferol en las células HT-29. (F) Análisis de LSCM de la exposición intracelular a kaempferol en las células Caco-2. (G) Cuantificación de LC-MS/MS de kaempferol en lisados celulares totales, fracciones nucleares y fracciones citoplasmáticas de células HT-29 en diferentes puntos temporales. (H) Cuantificación de LC-MS/MS de kaempferol en lisados celulares totales, fracciones nucleares y fracciones citoplasmáticas de células Caco-2 en diferentes puntos temporales. (I) Ensayo SRB que muestra los efectos de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 sobre la actividad antiproliferativa del kaempferol en las células HT-29. (J) Ensayo SRB que muestra los efectos de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 sobre la actividad antiproliferativa del kaempferol en las células Caco-2. (K) Efectos citotóxicos del kaempferol y sus principales metabolitos K-7-G y K-3-G en las células HT-29. (L) Efectos citotóxicos del kaempferol y sus principales metabolitos K-7-G y K-3-G en las células Caco-2. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001 frente al grupo de control correspondiente.
Para identificar aún más las formas intracelulares activas con relevancia farmacodinámica, analizamos cuantitativamente K-7-G y K-3-G en la fracción nuclear mediante LC-MS/MS. En condiciones experimentales idénticas (tratamiento con 50 μM de kaempferol durante 12 horas), se prepararon lisados nucleares a partir de células Caco-2 y HT-29. En las células Caco-2, la concentración nuclear de K-7-G fue de 5,8530 ± 0,1738 ng/mg de proteína, lo que corresponde aproximadamente a 0,1860 veces la concentración del kaempferol original (38,1767 ± 1,5894 ng/mg de proteína); la concentración nuclear de K-3-G fue de 7,6332 ± 0,4467 ng/mg de proteína, aproximadamente 0,2423 veces la concentración del compuesto original (Figura S2F). Se observaron tendencias similares en las células HT-29. Por lo tanto, tanto K-7-G como K-3-G se acumularon en el núcleo en niveles significativamente más bajos que el kaempferol original. Dado que K-7-G exhibe una actividad anti-CRC in vitro superior, pero, debido a la glucuronidación, tiene una mayor polaridad y una permeabilidad alterada de la membrana nuclear, estos resultados sugieren que la mayor eficacia de K-7-G puede estar mediada principalmente a través de objetivos extranucleares.
Para investigar la contribución de los transportadores de eflujo a la actividad del kaempferol, primero examinamos la expresión basal de ABCG2 (que codifica la proteína de resistencia del cáncer de mama, BCRP) y Mdr1 (que codifica la P-glucoproteína, P-gP) en nueve líneas celulares de cáncer colorrectal. Las células Caco-2 y HT-29 se seleccionaron para un estudio adicional porque ambas líneas celulares mostraron una expresión relativamente alta de estos transportadores (Figura 3A). Luego, se generaron modelos celulares estables con reducción de la expresión de BCRP y P-gP mediante transfección de shRNA. La eficiencia de la reducción de la expresión se confirmó mediante análisis de QPCR y Western blot, que mostraron reducciones marcadas en los niveles de ARNm y proteína de BCRP y P-gP en ambas líneas celulares (Figura 3B-D). La microscopía confocal de barrido láser mostró que la reducción de la expresión de BCRP o P-gP aumentó la exposición intracelular al kaempferol en las células HT-29 y Caco-2, como lo indica el aumento de la intensidad de la fluorescencia. Este efecto fue más pronunciado después de la reducción de la expresión de BCRP (Figura 3E-F). De manera similar, la inhibición farmacológica de los transportadores de eflujo aumentó aún más la retención intracelular de kaempferol, con el efecto más fuerte observado después del tratamiento con el inhibidor de BCRP KO143 (Figura 3G). Los ensayos SRB mostraron que el kaempferol ejerció efectos citotóxicos comparables en las células HT-29 y Caco-2 y que el efecto inhibidor aumentó con la concentración y el tiempo de tratamiento. Después de 72 horas de exposición a 100 μM de kaempferol, ambas líneas celulares mostraron aproximadamente un 70% de inhibición del crecimiento. Cabe destacar que la reducción de la expresión de BCRP mejoró el efecto antiproliferativo del kaempferol, mientras que la reducción de la expresión de P-gP atenuó inesperadamente este efecto (Figura 3H-I). De manera consistente, el cotratamiento con el inhibidor de BCRP KO143 fortaleció aún más el efecto inhibidor del kaempferol sobre la proliferación de las células de CRC (Figura 3J). Para explicar la reducción inesperada de la eficacia después de la reducción de la expresión de P-gP, examinamos más a fondo si el silenciamiento de P-gP afectó la expresión de las enzimas metabolizadoras del kaempferol. El análisis de Western blot mostró que la reducción de la expresión de P-gP aumentó significativamente la expresión de la proteína UGT1A9 en aproximadamente 1,5 a 2,0 veces, al tiempo que disminuyó modestamente la expresión de UGT1A1 en aproximadamente un 25-40% en las células Caco-2 y HT-29 (Figura 3K). Dado que UGT1A1 genera el metabolito altamente activo K-7-G, mientras que UGT1A9 produce principalmente el metabolito poco activo K-3-G, estos resultados sugieren un cambio en el flujo metabólico lejos de la forma activa. De manera consistente, el análisis de LC-MS/MS mostró que, aunque los compuestos kaempferol-relacionados intracelulares totales aumentaron después de la reducción de la expresión de P-gP, la concentración absoluta de K-7-G disminuyó de 1,0155 ± 0,0251 a 0,7036 ± 0,0342 ng/mg, mientras que K-3-G aumentó de 1,3236 ± 0,0376 a 1,6180 ± 0,0659 ng/mg (Figura 3L; se observó la misma tendencia en las células Caco-2, Figura 3M). En conjunto, estos hallazgos demuestran que BCRP y P-gP ejercen efectos divergentes sobre la farmacología del kaempferol. Si bien la reducción de la expresión de BCRP mejora la eficacia del kaempferol principalmente al aumentar la retención intracelular de las especies activas, la reducción de la expresión de P-gP reduce la eficacia a pesar de aumentar la acumulación intracelular total, porque redirige el flujo metabólico hacia el metabolito menos activo.
(A) Niveles basales de expresión de ARNm de ABCG2 y Mdr1 en diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal. (B) Verificación de QPCR de la eficiencia de la reducción de la expresión de ABCG2 y Mdr1 en las células transfectadas. (C) Verificación de Western blot de la eficiencia de la reducción de la expresión de BCRP, con la cuantificación correspondiente. (D) Verificación de Western blot de la eficiencia de la reducción de la expresión de P-gP, con la cuantificación correspondiente. (E) Análisis de microscopía confocal de barrido láser (LSCM) de la exposición intracelular al kaempferol en las células HT-29 después de la reducción de la expresión de BCRP o P-gP. (F) Análisis de LSCM de la exposición intracelular al kaempferol en las células Caco-2 después de la reducción de la expresión de BCRP o P-gP. (G) Análisis de LSCM de los efectos de los inhibidores de los transportadores de eflujo sobre la acumulación intracelular de kaempferol. (H) Ensayo SRB que muestra los efectos de la reducción de la expresión de BCRP o P-gP sobre la actividad antiproliferativa del kaempferol en las células HT-29. (I) Ensayo SRB que muestra los efectos de la reducción de la expresión de BCRP o P-gP sobre la actividad antiproliferativa del kaempferol en las células Caco-2. (J) Ensayo SRB que muestra el efecto del inhibidor de BCRP KO143 sobre la actividad antiproliferativa del kaempferol. (K) La reducción de la expresión de P-gP aumenta la expresión de UGT1A9 y reduce la expresión de UGT1A1 en las células Caco-2 y HT-29. (L) Efecto de la reducción de la expresión de P-gP sobre los niveles nucleares de K-7-G y K-3-G en las células HT-29. (M) Efecto de la reducción de la expresión de P-gP sobre los niveles nucleares de K-7-G y K-3-G en las células Caco-2. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001 en comparación con el grupo de control correspondiente.
La tinción con plata mostró múltiples bandas de proteínas diferenciales en el sobrenadante del grupo tratado con kaempferol en comparación con el grupo de control con DMSO (Figura 4A-B). El análisis proteómico cuantitativo identificó 62 proteínas enriquecidas en el sobrenadante tratado con kaempferol, que por lo tanto se definieron como proteínas candidatas que interactúan con el kaempferol, mientras que 248 proteínas estaban menos enriquecidas en el sobrenadante tratado con kaempferol (Figura 4C; Tabla S2). El análisis de la localización subcelular de las 62 proteínas candidatas mostró que 37 proteínas (55,22%) se localizaban en el núcleo, 12 (17,91%) en el citoplasma, 6 (8,95%) en las mitocondrias y el resto en otros compartimentos, incluido la membrana celular y el retículo endoplásmico (Figura 4D). Los análisis de enriquecimiento GO y KEGG indicaron que estas proteínas candidatas estaban asociadas con múltiples vías relacionadas con el crecimiento y la proliferación celular, incluido la biosíntesis de folato, el metabolismo del ácido araquidónico, las vías de señalización que regulan la pluripotencia de las células madre y la vía de señalización MAPK (Figura 4E). Para priorizar aún más los objetivos candidatos, se realizó el acoplamiento molecular utilizando AutoDock, LeDock y XDock, y las puntuaciones de acoplamiento se integraron después de la normalización lineal. Este análisis produjo las 10 proteínas de mayor rango en el acoplamiento, incluidas AKR1C3, CBR1, BRG1 y otros candidatos con energías de unión predichas favorables (Figura 4F; Tablas S3-5). Con base en los resultados del acoplamiento, se seleccionaron cinco proteínas candidatas representativas para una validación adicional (Figura 4G). La validación SIP confirmó que AKR1C3, FOLR1, AUH, BRG1 y CBR1 se enriquecieron constantemente en el sobrenadante tratado con kaempferol (Figura 4H). Luego, se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) para las 37 proteínas candidatas localizadas en el núcleo, identificando 15 proteínas de nodo central con alta conectividad (Figura 4I). La intersección de estas 15 proteínas centrales de PPI con las 10 proteínas de mayor rango en el acoplamiento condujo a la priorización de BRG1 (SMARCA4) como el principal objetivo candidato (Figura 4J). Finalmente, la interacción entre kaempferol y BRG1 se validó aún más mediante CETSA (Figura 4K).
(A) Resultados de la tinción con plata de las muestras SIP. (B) Análisis de control de calidad de las muestras SIP. (C) Cuantificación de las proteínas diferencialmente enriquecidas en el sobrenadante SIP entre el grupo tratado con kaempferol y el grupo de control con DMSO. (D) Localización subcelular de las 62 proteínas candidatas enriquecidas en el sobrenadante tratado con kaempferol. (E) Enriquecimiento GO y análisis de la vía KEGG de las 62 proteínas candidatas que interactúan con el kaempferol. (F) Clasificación integrada de las puntuaciones de acoplamiento molecular obtenidas de tres programas de acoplamiento. (G) Modelos de acoplamiento molecular representativos de cinco proteínas candidatas objetivo. (H) Validación basada en SIP de las proteínas candidatas enriquecidas en el sobrenadante tratado con kaempferol. (I) Red de interacción proteína-proteína (PPI) de las proteínas candidatas localizadas en el núcleo. (J) Análisis de intersección entre las 10 proteínas de mayor rango en el acoplamiento y las 15 proteínas centrales de PPI. (K) CETSA confirma la interacción directa entre kaempferol y BRG1.
Para explorar el papel de BRG1 en la supresión del CRC mediada por kaempferol, analizamos las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier clínicas y encontramos que una mayor expresión de BRG1 se correlaciona con una menor supervivencia general en pacientes con CRC (HR = 1,92, P < 0,001; Figura 5A). Los análisis de los conjuntos de datos TCGA y CPTAC revelaron que BRG1 se sobreexpresa específicamente en los tumores en comparación con los tejidos normales (Figura 5B-C). Cabe destacar que la expresión de BRG1 aumenta con la progresión del tumor (Figura 5D-E). El análisis de Western blot mostró que el kaempferol redujo la abundancia de la proteína BRG1 de manera dependiente de la dosis en las células de cáncer colorrectal. La cuantificación demostró que el tratamiento con 50 μM de kaempferol durante 24 horas disminuyó los niveles de proteína BRG1 al 52% ± 5% del nivel de control (P < 0,001; Figura 5F). Para determinar si el kaempferol promueve la degradación de BRG1, se realizaron ensayos de persecución con CHX y se ajustaron las curvas de degradación de BRG1 utilizando un modelo de decaimiento exponencial de una fase. En el grupo de control (CHX solo), la vida media de BRG1 fue de 23,03 horas (IC del 95%: 18,98-28,25 horas), mientras que el cotratamiento con kaempferol (CHX + kaempferol) acortó la vida media a 17,07 horas (IC del 95%: 13,61-21,62 horas). Para probar si este efecto dependía del proteasoma, las células se trataron con kaempferol en presencia del inhibidor del proteasoma MG132 (CHX + kaempferol + MG132). En estas condiciones, la vida media de BRG1 se prolongó a 73,47 horas (IC del 95%: 66,80-81,41 horas), lo que fue incluso más largo que el del grupo de control, lo que indica que MG132 bloqueó eficazmente la degradación acelerada por el kaempferol. Los valores de bondad de ajuste (R2) para las tres curvas fueron 0,9460, 0,9385 y 0,9778, respectivamente, lo que indica un ajuste confiable de la cinética de decaimiento (Figura 5G). Estos resultados demuestran que el kaempferol promueve la degradación de BRG1 a través de la vía ubiquitina-proteasoma.
(A) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes con CRC estratificados por expresión de BRG1. (B) Análisis de TCGA de los niveles de expresión de ARNm de BRG1 en los tejidos normales del colon y los tejidos de CRC. (C) Análisis de CPTAC de los niveles de expresión de proteína de BRG1 en los tejidos normales del colon y los tejidos de CRC. (D) Análisis de TCGA de los niveles de expresión de ARNm de BRG1 en diferentes etapas de CRC. (E) Análisis de CPTAC de los niveles de expresión de proteína de BRG1 en diferentes etapas de CRC. (F) Análisis de Western blot del efecto del kaempferol sobre la abundancia de la proteína BRG1, con la cuantificación correspondiente. (G) El kaempferol reduce la estabilidad de la proteína BRG1 a través de la vía del proteasoma, como se muestra en el ensayo de persecución con CHX y el rescate con MG132. (H) Ensayo de ubiquitinación que muestra la ubiquitinación inducida por el kaempferol de BRG1 después de la inmunoprecipitación. (I) Ensayo de co-inmunoprecipitación que muestra la asociación entre BRG1 y TRIM21 después del tratamiento con kaempferol. (J) Ensayo de migración transdérmica que muestra el efecto de la reducción de la expresión de BRG1 sobre la migración de las células de CRC. (K) Ensayo de curación de heridas que muestra el efecto de la reducción de la expresión de BRG1 sobre la migración de las células de CRC. (L) Ensayo de incorporación de EdU que muestra el efecto de la reducción de la expresión de BRG1 sobre la proliferación de las células de CRC. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía. *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001 en comparación con el grupo de control correspondiente.
A continuación, examinamos si la degradación de BRG1 estaba asociada con la ubiquitinación. Las células se pretrataron con MG132 para bloquear la degradación de las proteínas ubiquitinadas y luego se expusieron a kaempferol. La inmunoprecipitación de BRG1 seguida de inmunoblotting con un anticuerpo anti-ubiquitina mostró que el kaempferol aumentaba significativamente la ubiquitinación de BRG1, y este efecto se potenciaba aún más en presencia de MG132, lo que resultaba en la acumulación de especies de BRG1 ubiquitinadas (Fig. 5H). Para explorar el mecanismo upstream, se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-BRG1 y anti-TRIM21. El tratamiento con kaempferol (50 μM, 24 horas) mejoró significativamente la asociación entre BRG1 y la E3 ubiquitina ligasa TRIM21, con un aumento del enriquecimiento de aproximadamente 1,5 veces (P < 0,01; Fig. 5I). En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que el kaempferol promueve la ubiquitinación de BRG1 asociada a TRIM21, lo que conduce a la degradación dependiente del proteasoma. Funcionalmente, la inhibición de BRG1 inhibió notablemente la proliferación y la migración de las células de cáncer colorrectal, como se muestra en los ensayos de EdU y de migración (Fig. 5J-L).
El kaempferol tiene un reconocido potencial anticancerígeno, pero su traslación clínica está limitada por su baja biodisponibilidad y su extenso metabolismo [17, 18]. En este estudio, demostramos que el kaempferol ejerce una actividad antitumoral significativa en el cáncer colorrectal (CCR) in vivo e in vitro, y que su eficacia no se determina simplemente por la acumulación intracelular total, sino por la interacción coordinada entre el metabolismo de fase II, el transporte de eflujo, la disposición del metabolito y la interacción con el objetivo. Un hallazgo central de este estudio son los roles distintos y aparentemente paradójicos de UGT1A1 y UGT1A9 en la regulación de la actividad del kaempferol. La inhibición de UGT1A1 aumentó la acumulación intracelular, incluida la nuclear, de kaempferol, pero inesperadamente redujo la citotoxicidad, mientras que la inhibición de UGT1A9 mejoró la sensibilidad celular. Estas observaciones sugieren que la acumulación intracelular del compuesto original por sí sola no es suficiente para predecir la eficacia antitumoral en el CCR, y que el destino metabólico del kaempferol influye críticamente en su actividad farmacológica. Nuestros datos indican que la glucuronidación mediada por UGT1A1 genera K-7-G, que conserva una actividad antiproliferativa sustancial, mientras que K-3-G, producido predominantemente por UGT1A9, exhibe una actividad considerablemente menor. Por lo tanto, aunque la inhibición de UGT1A1 aumenta la exposición intracelular al compuesto original, simultáneamente reduce la formación del metabolito farmacológicamente activo K-7-G, atenuando así el efecto antitumoral general. Cabe destacar que el análisis LC-MS/MS demostró que las concentraciones nucleares tanto de K-7-G como de K-3-G eran significativamente menores que las del kaempferol original, lo que sugiere una accesibilidad nuclear limitada después de la glucuronidación. Estos hallazgos implican que el kaempferol original probablemente sigue siendo el principal regulador de los objetivos nucleares, como BRG1, mientras que K-7-G puede contribuir a la actividad antitumoral en el CCR a través de mecanismos complementarios o parcialmente distintos.
Se observó una divergencia igualmente importante para los dos transportadores de eflujo examinados en este estudio. La inhibición de BCRP aumentó la acumulación intracelular de kaempferol y mejoró la actividad antitumoral en el CCR, lo que es consistente con el papel canónico de BCRP en la limitación de la exposición intracelular a los fármacos. En contraste, la inhibición de P-gP también aumentó la acumulación intracelular, pero inesperadamente redujo el efecto antitumoral del kaempferol. Nuestros datos sugieren que esta aparente contradicción se debe a la reprogramación metabólica asociada al transportador. Específicamente, la inhibición de P-gP aumentó UGT1A9 y disminuyó modestamente UGT1A1, lo que cambió el metabolismo del kaempferol, alejándolo de K-7-G y hacia K-3-G. Por lo tanto, una mayor acumulación intracelular total no se tradujo en una mejor eficacia porque se alteró la composición de las especies activas frente a las especies poco activas. Estos hallazgos respaldan aún más que la eficacia del kaempferol depende del equilibrio coordinado entre el metabolismo y el transporte, en lugar de la acumulación por sí sola.
La aparente discrepancia entre la dosis efectiva in vivo y la potencia antiproliferativa in vitro también debe interpretarse con cautela. La exposición plasmática al compuesto original por sí sola no refleja completamente la exposición farmacológicamente relevante en los tejidos del cáncer colorrectal. Estudios farmacocinéticos previos, junto con nuestros hallazgos, sugieren que el kaempferol y sus conjugados pueden alcanzar una mayor exposición local en el entorno intestinal y cólico de lo que se predeciría a partir de las concentraciones plasmáticas por sí solas, en parte debido a la acumulación tisular y la recirculación enterohepática [19]. Por lo tanto, la administración diaria repetida probablemente apoyará una exposición local sostenida y la generación persistente de especies de kaempferol activas. En este contexto, el "desafío de la biodisponibilidad" no debe verse simplemente como una incapacidad para alcanzar altas concentraciones plasmáticas, sino más bien como un problema de optimización de la disposición relevante para los tejidos, la conversión metabólica y la retención intracelular de las especies activas. Desde una perspectiva traslacional, la modulación del metabolismo de fase II, la inhibición del eflujo mediado por BCRP y los enfoques basados en la formulación pueden representar estrategias potenciales para mejorar la eficacia del kaempferol: (i) modular el equilibrio de los isoformas UGT para favorecer un perfil de metabolitos enriquecido en K-7-G; (ii) inhibir selectivamente el eflujo mediado por BCRP para mejorar la retención intracelular de las especies de kaempferol farmacológicamente activas; y (iii) estrategias basadas en la formulación, incluidos nanoformulados o sistemas de complejos de fosfolípidos, para mejorar la solubilidad, la exposición local y la administración intracelular. Al mismo tiempo, reconocemos explícitamente que estas estrategias deben considerarse actualmente como direcciones futuras informadas por mecanismos y generadoras de hipótesis, en lugar de recomendaciones clínicas inmediatas. En particular, la coadministración sistémica de inhibidores de enzimas o transportadores puede introducir desafíos relacionados con la seguridad, la selectividad y las interacciones fármaco-fármaco, que requerirán una cuidadosa evaluación farmacocinética y toxicológica en estudios futuros.
Otro aspecto que debe tenerse en cuenta es que los ensayos de eficacia in vitro y los estudios mecanicistas se llevaron a cabo en diferentes líneas celulares de CCR. Este diseño fue intencional: las células HCT116 se utilizaron como un modelo fenotípico, mientras que las células HT-29 y Caco-2 se seleccionaron para los análisis mecanicistas debido a su expresión endógena relativamente alta de UGT1A1, UGT1A9, ABCG2 y Mdr1. Es importante destacar que los experimentos complementarios confirmaron que el kaempferol también inhibió la proliferación y la migración en las células HT-29 y Caco-2, lo que respalda la relevancia entre diferentes líneas celulares de las principales conclusiones. No obstante, estas conclusiones deben interpretarse como respaldadas en múltiples contextos de células de CCR en lugar de como evidencia de una uniformidad completa entre todas las líneas celulares.
Para identificar los objetivos asociados al kaempferol, utilizamos SIP como un enfoque de cribado inicial y luego integramos análisis proteómicos, bioinformáticos y funcionales. Entre las proteínas candidatas identificadas, BRG1 surgió como el objetivo más convincente después de integrar la localización subcelular, la relevancia clínica, el enriquecimiento de SIP, la centralidad de la red, la priorización basada en el acoplamiento y la validación funcional downstream (Fig. S3 A-H). El kaempferol redujo la abundancia de la proteína BRG1, acortó su vida media, y este efecto se revirtió casi por completo con MG132, lo que indica una dependencia del proteasoma. Los ensayos de ubiquitinación mostraron además que el kaempferol aumentó significativamente la ubiquitinación de BRG1, y los análisis de co-inmunoprecipitación identificaron una mayor asociación entre BRG1 y la ligasa E3 TRIM21 después del tratamiento con kaempferol. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que el kaempferol promueve la ubiquitinación asociada a TRIM21 y la degradación proteasómica de BRG1, lo que contribuye a la supresión de la progresión del CCR. Al mismo tiempo, nuestros datos no implican que la focalización nuclear sea una propiedad universal del kaempferol; más bien, dentro del conjunto de datos presente, muchas proteínas candidatas estaban localizadas en el núcleo, y se validó que BRG1 es un objetivo nuclear funcionalmente relevante en las células de CCR. Este hallazgo es particularmente significativo, dada la función establecida de BRG1 como un regulador del punto de control de la autofagia implicado en la patofisiología de afecciones inflamatorias como la colitis [20].
En resumen, este estudio demuestra que el kaempferol ejerce actividad antitumoral en el CCR a través de un mecanismo moldeado por la interacción coordinada entre el metabolismo de fase II, el transporte de eflujo, la disposición del metabolito y la interacción con el objetivo nuclear. UGT1A1, UGT1A9, BCRP y P-gP regulan diferencialmente el equilibrio entre las especies de kaempferol activas y poco activas, mientras que BRG1 representa un objetivo nuclear funcionalmente relevante que se degrada a través de una vía dependiente de la ubiquitina-proteasoma. Estos hallazgos proporcionan un marco mecanicista para comprender la farmacología del kaempferol en el CCR y una base para futuras estrategias de optimización guiadas por el metabolismo, el transportador o la formulación.
Nuestros hallazgos revelan que UGT1A1/1A9 y BCRP/P-gP regulan críticamente la disposición intracelular del kaempferol y su actividad antitumoral en el CCR. La eficacia del kaempferol depende de la interacción del metabolismo, el eflujo, la composición del metabolito y la interacción con el objetivo, no solo de la acumulación total. Se identificó BRG1 como un objetivo nuclear que sufre degradación por ubiquitina-proteasoma después del tratamiento con kaempferol (Fig. S4). Estos hallazgos proporcionan una base mecanicista y una justificación para mejorar la eficacia del kaempferol en el CCR mediante la modulación del metabolismo, la retención y la interacción con el objetivo.
(A) Efecto del kaempferol en el peso de los órganos en ratones. (B) Ensayo SRB para el efecto del kaempferol en la proliferación de las células HT29 y Caco2. (C) Ensayo de transwell para el efecto del kaempferol en la migración de las células HT29. (D) Ensayo de curación de heridas para el efecto del kaempferol en la migración de las células Caco2.
(A) Detección por Western blot de la expresión de la proteína UGT1A9 en las células HT-29 y Caco2. (B) Ensayo SRB que muestra el efecto de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 en la actividad antitumoral del kaempferol de 24 h en las células HT-29. (C) Ensayo SRB que muestra el efecto de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 en la actividad antitumoral del kaempferol de 24 h en las células Caco-2. (D) Ensayo SRB que muestra el efecto de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 en la actividad antitumoral del kaempferol de 24 h en las células HT-29. (E) Ensayo SRB que muestra el efecto de la inhibición de UGT1A1 o UGT1A9 en la actividad antitumoral del kaempferol de 24 h en las células Caco-2. (F) Detección por LC/MS de los contenidos intracelulares de kaempferol-7-O-glucurónido (K-7-G), kaempferol-3-O-glucurónido (K-3-G) y kaempferol en las células HT-29 y Caco2 después de un tratamiento de 24 h con kaempferol.
(A) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la supervivencia general según la expresión de CBR1 en pacientes con cáncer colorrectal. (B) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la supervivencia general según la expresión de FOLR1 en pacientes con cáncer colorrectal. (C) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la supervivencia general según la expresión de AUH en pacientes con cáncer colorrectal. (D) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la supervivencia general según la expresión de AKR1C3 en pacientes con cáncer colorrectal. (E) Expresión de la proteína CBR1 en los tejidos del colon normal frente a los tejidos del cáncer colorrectal primario. (F) Expresión de la proteína AUH en los tejidos del colon normal frente a los tejidos del cáncer colorrectal primario. (G) Expresión de la proteína AKR1C3 en los tejidos del colon normal frente a los tejidos del cáncer colorrectal primario. (H) Expresión de ARNm de FOLR1 en los tejidos del colon normal frente a los tejidos del cáncer colorrectal primario.
Los autores agradecen a BioRender.com (https://app.biorender.com/gallery) por proporcionar las herramientas para crear ilustraciones científicas.
¡Aún no hay comentarios. Sé el primero en comentar!