Antecedentes: Debido a la heterogeneidad del cáncer colorrectal (CRC), se necesitan modelos que puedan predecir la respuesta a la quimioterapia para facilitar el tratamiento personalizado. Objetivo: Construir modelos de conglomerados celulares tumorales derivados de pacientes (PTC) in vitro para la prueba de sensibilidad a los fármacos en el CRC y la quimioterapia personalizada. Métodos: Recopilamos 140 tejidos de CRC mediante resección quirúrgica en tres hospitales chinos y establecimos modelos PTC que son altamente similares al tejido tumoral original. Se evaluó la sensibilidad a diversos fármacos antineoplásicos en estos modelos PTC.
Registramos el proceso de cultivo del modelo PTC y los datos clínicos de los pacientes, y evaluamos la concordancia entre la sensibilidad in vitro a los fármacos y los resultados clínicos. Resultados: Se establecieron con éxito modelos PTC en 124 especímenes, con una tasa de éxito del 88,6 %. El tiempo promedio de cultivo fue de 3,02 ± 1,56 días, y el tiempo mediano para obtener los resultados de sensibilidad a los fármacos fue de 11 días (10-13 días). La prueba de sensibilidad a los fármacos reveló que los modelos PTC tuvieron respuestas variables a diferentes regímenes de quimioterapia, con algunos pacientes mostrando una sensibilidad inesperada a regímenes no considerados como tratamientos de primera línea.
El tiempo mediano de seguimiento para todos los pacientes fue de 19 meses, y no hubo diferencia significativa en la supervivencia libre de enfermedad (DFS) entre los pacientes cuyas respuestas reales al tratamiento clínico fueron consistentes o inconsistentes con las predicciones del modelo PTC. Conclusión: El modelo PTC para pruebas de sensibilidad a los fármacos tiene ventajas como una tasa de éxito alta y un tiempo rápido de prueba de fármacos.
Este estudio proporciona una herramienta prometedora para la prueba de sensibilidad personalizada a la quimioterapia en pacientes con CRC, y después de ensayos clínicos adicionales, puede guiar las decisiones de tratamiento clínico.
El cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia gastrointestinal prevalente que representa una seria amenaza para la salud humana. Según las estadísticas de cáncer 2022, el CCR ocupa el tercer lugar tanto en morbilidad como en mortalidad [[1]], lo que implica una carga significativa sobre el sistema médico. Aproximadamente un 25 % de los casos de etapa II de CCR y entre un 50 % y un 60 % de los casos de etapa III recurren y metastatizan dentro de cinco años después de la cirugía [[2]]. Varios estudios clínicos internacionales han demostrado que combinar la cirugía con quimioterapia adyuvante puede lograr una tasa general de supervivencia a 5 años (OS) del 60 % al 70 % y una tasa de supervivencia libre de enfermedad (DFS) a 5 años del 55 % al 65 % para pacientes de etapas II y III [[[2]], [[3]], [[4]]]. En la última década, la quimioterapia adyuvante, como tratamiento principal posquirúrgico para el CCR, ha experimentado avances significativos. Numerosos estudios han confirmado su eficacia en el manejo postoperatorio del CCR [[[5]], [[6]], [[7]]].
Sin embargo, el CCR es una neoplasia heterogénea, con variaciones individuales significativas en la sensibilidad a los medicamentos entre los pacientes. Incluso pacientes con el mismo tipo patológico y etapa clínica que reciben el mismo tratamiento pueden tener pronósticos y resultados diferentes. Los avances recientes en el tratamiento sistémico del CCR han ido más allá de la base tradicional de 5-FU, oxaliplatino e irinotecán. La evidencia emergente ha destacado los roles crecientes de los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) en el cáncer temprano dMMR/MSI-H y metastásico [[8]], nuevos agentes antiangiogénicos como fruquintinib y regorafenib en entornos posteriores a la línea [[9]], y secuencias optimizadas de quimioterapia tripleta más terapias dirigidas para tumores mutados RAS/BRAF [[10]]. Hay un debate en curso sobre los esquemas de quimioterapia óptimos para diferentes subgrupos de pacientes. Por lo tanto, el desarrollo de un modelo in vitro que pueda predecir con precisión la eficacia de los medicamentos y guiar el tratamiento individualizado es crucial para lograr una terapia efectiva del CCR.
Yin et al. introdujeron un modelo in vitro innovador llamado "agrupaciones celulares tumorales derivadas del paciente (PTCs)" a partir de células tumorales primarias, junto con una nueva tecnología para la detección de sensibilidad a los medicamentos in vitro. El modelo PTC consta de microesferas tridimensionales formadas por el autoensamblaje de células tumorales y celulares del estroma a partir de muestras de pacientes después de someterlas a deshecho, digestión y proliferación. Tiene una alta similitud con el tejido tumoral original [[11]]. Además, la prueba de sensibilidad a los medicamentos en PTC ha demostrado ventajas significativas de este modelo sobre las líneas celulares, organoides derivados del paciente (PDOs) y xenograftos tumorales derivados del paciente (PDXs) [[[11]], [[12]], [[13]]].
Por lo tanto, diseñamos un estudio prospectivo multicéntrico que involucra la construcción de modelos PTC de CRC y la criba de sensibilidad a los medicamentos quimioterapéuticos. Nuestro objetivo fue demostrar la factibilidad del uso de PTCs en el CRC y su potencial para identificar regímenes quimioterapéuticos sensibles.
Materiales y métodos
Recolección de muestras
Recopilamos muestras de 140 pacientes con CRC que se sometieron a resección radical entre septiembre de 2021 y abril de 2023 en tres hospitales de China (Hospital Peking Union Medical College, Primer Centro Médico del Hospital General del Ejército del Pueblo Libre de China, Hospital Unión, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong). Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) diagnóstico de CRC confirmado mediante colonoscopia y biopsia patológica; (2) solo un lesión de CRC; (3) completar cirugía radical para el CRC; (4) estadio clínico T ? T2, con o sin metástasis linfática; (5) edad del paciente entre 18 y 75 años; (6) estadio American Society of Anesthesiologists (ASA) ? 3; y (7) no tener historia de otros tumores malignos. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (1) CRC multifocal, incluyendo pero no limitándose a múltiples CRC primarios, poliposis adenomatosa familiar y CRC hereditario sin poliposis; y (2) contraindicaciones para el uso de quimioterapia.
Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética del Hospital Peking Union Medical College, Academia China de Ciencias Médicas (HS-3174B). Todos los pacientes involucrados firmaron formularios de consentimiento informado.
Muestreo
Después de la resección radical del CRC, el canal intestinal fue abierto longitudinalmente. Se recolectó tejido tumoral fresco y bien vascularizado dentro de 30 minutos, evitando áreas necróticas, fibrosas, adiposas o cauterizadas para optimizar la viabilidad celular. Al elegir el tejido canceroso, se evitaron las áreas necróticas, fibrosas, los tejidos adiposos y aquellos quemados con el bisturí eléctrico. Para maximizar la viabilidad celular, no se recolectó menos de 50 mg (aproximadamente 5 mm × 5 mm) de tejido tumoral. Los tejidos fueron lavados con PBS al menos cinco veces para eliminar las áreas necróticas y adiposas lo más completamente posible. Finalmente, las muestras se colocaron en PBS a 4 °C.
Cultivo
El cultivo se realizó siguiendo el protocolo descrito en un artículo publicado previamente [[11]]. El tejido tumoral fue cortado en pequeñas piezas y digerido durante una hora a 37 °C. La suspensión celular luego pasó por un filtro y se recogió. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a 300 × g a 4 °C durante 10 minutos, y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de cultivo PTC. Se sembraron células individuales a una densidad de 105/cm² en un plato de baja adhesión y se cultivaron en un incubador celular (37 °C, 5 % CO2).
Después de 2-7 días de cultivo, se observaron clones PTC que se habían formado bajo un microscopio de campo brillante. Si no se formaron colonias PTC dentro de los 7 días, el cultivo se consideró insatisfactorio y el paciente fue retirado del estudio. Si se formaron clones PTC, se tomaron imágenes de campo brillante para verificar la contaminación bacteriana, fúngica y por micoplasma. Las muestras que dieron negativo para la contaminación pasaron la inspección de calidad y fueron evaluadas más adelante.
La morfología de la TCPT fue analizada mediante tinción HE. La especificidad del tejido y las características patológicas de las TCPT se caracterizaron según la tinción inmunohistoquímica de proteínas específicas del tejido y marcadores patológicos. El tejido tumoral original correspondiente también se caracterizó como se describió anteriormente para evaluar el grado de similitud entre los tejidos tumorales y los modelos de TCPT.
Se realizó la prueba de sensibilidad a los medicamentos según el protocolo descrito en un artículo publicado previamente [[11]]. Se recogieron microesferas de TCPT con un diámetro superior a 40 µm utilizando una pantalla de filtro. Las microesferas se lavaron con PBS y se centrifugaron a 300 × g a 4 °C durante 10 minutos para su recolección. Para cada pozo, se añadieron 100 µL de suspensión celular que contenía entre 30-50 microesferas de TCPT en una placa modificada con Teflón. Los detalles de los medicamentos probados se proporcionan en la tabla 1. A continuación, se añadieron 50 µL de medio de cultivo de TCPT que contenía diferentes medicamentos a cada pozo de prueba. Se capturaron imágenes de las microesferas de TCPT en cada pozo utilizando un sistema de microscopio Nikon Ti-U. La placa de cultivo se colocó entonces en una incubadora celular (37 °C, 5 % CO2) para su cultivo adicional. Después de 7 días de tratamiento con medicamentos, se capturaron nuevamente imágenes de las microesferas de TCPT en cada pozo utilizando un sistema de microscopio Nikon Ti-U. Todos los casos pasaron por tres regímenes de quimioterapia fundamentales: 5-Fluorouracilo (5-FU), XELOX (oxaliplatina + 5-FU) y FOLFIRI (irinotecano + 5-FU). Cuando se dispuso de tejido adecuado, se realizaron pruebas adicionales con regímenes alternativos. Para ciertos medicamentos quimioterapéuticos que requieren activación metabólica en el cuerpo para ejercer su actividad antitumoral (como capecitabina), se debe utilizar el metabolito activo en las pruebas de sensibilidad a los medicamentos de TCPT. Por ejemplo, se utiliza 5-FU en lugar de capecitabina. Se registró el tiempo desde la toma de muestra hasta el informe final de sensibilidad a los medicamentos para cada caso.
Evaluamos el efecto del medicamento midiendo el área de todos los microesferas de PTC en un pozo. Las microesferas fueron fotografiadas en días 0 y 7. La viabilidad celular después de aplicar el medicamento A se calculó mediante la siguiente fórmula: , fórmula [[14]]. (Fig. 1A)
Determinamos el umbral del PTC según los criterios RECIST. Para fines de análisis, redujimos los criterios RECIST en dos grupos utilizando 0,7 como valor umbral y definimos respuesta completa (RC) o respuesta parcial (RP) como efectiva y enfermedad estable (EE) o progresión de la enfermedad (PE) como lo contrario. En consecuencia, la viabilidad celular se dividió en las siguientes dos categorías: El medicamento no fue efectivo si pa >0,7, y el medicamento fue efectivo si pa0,7, y el medicamento fue efectivo si pa
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