Terapias dirigidas a KRAS en cáncer colorrectal: un análisis sistemático de mutaciones, inhibidores y ensayos clínicos.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común y el segundo más letal en humanos, con una incidencia mundial de casi 2 millones de casos y cerca de 1 millón de muertes anualmente^[1]. La mayoría de los CCR surgen a través de un proceso secuencial iniciado por mutaciones en genes que controlan la división celular, lo que conduce a una proliferación descontrolada y al desarrollo de pólipos benignos. Estas lesiones pueden progresar a malignidad mediante la adquisición de alteraciones genómicas adicionales, que incluyen anomalías cromosómicas, mutaciones genéticas y modificaciones epigenéticas en genes que regulan la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y la angiogénesis^[2].

El CCR comprende un grupo heterogéneo de tumores con perfiles mutacionales y características fenotípicas distintos. Tras el descubrimiento del fenotipo mutador a principios de la década de 1990, los CCR se han clasificado clínicamente en dos categorías principales: tumores microsatélites estables (MSS), con sistemas de reparación de errores de emparejamiento (mismatch repair, MMR) funcionales (pMMR), y tumores con inestabilidad de microsatélites (MSI), caracterizados por deficiencias en los sistemas de reparación de errores de emparejamiento (dMMR), lo que conduce a un fenotipo mutador prominente que afecta principalmente a las secuencias de microsatélites^[3]. Esta clasificación ha sido fundamental para comprender la etiología y la biología del CCR, así como para el manejo clínico.

En 2012, el consorcio del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) publicó un análisis molecular exhaustivo de los CCR, clasificando los tumores en dos grupos principales según la tasa de mutación somática: tumores no hipermutados (principalmente MSS) y tumores hipermutados, que comprenden principalmente MSI y tumores con mutaciones en el gen de la ADN polimerasa épsilon, POLE^[4]. El estudio del TCGA resumió décadas de investigación, proporcionando evidencia sólida de la heterogeneidad molecular del CCR y la naturaleza distinta de los cánceres hipermutados (MSI y POLE + ) frente a los no hipermutados. En 2015, se propuso un sistema de clasificación alternativo que comprende cuatro subtipos moleculares, basado en el perfilaje transcriptómico^[5]. Si bien esta clasificación basada en el transcriptoma se correlaciona con las características del tumor y los resultados del paciente, aún no se ha adoptado ampliamente en la práctica clínica.

Las proteínas Ras son pequeñas GTPasas que funcionan como interruptores moleculares que activan vías fundamentales de transducción de señales que regulan el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis. Los humanos poseen tres genes RAS: HRAS, KRAS y NRAS, que codifican cuatro proteínas (KRAS codifica dos variantes de empalme, KRAS4A y KRAS4B) con una alta similitud de secuencia^[6]. A pesar de esto, los isoformas de RAS difieren en la distribución tisular, la localización en la membrana y las preferencias de señalización descendente, lo que contribuye a distintos espectros de mutación y funciones oncogénicas en los diferentes tipos de tumores.

Las proteínas RAS alternan entre un estado activo, unido a GTP, y un estado inactivo, unido a GDP. La activación se produce al ser estimuladas por factores de crecimiento que interactúan con receptores unidos a la membrana, lo que conduce a la transducción de señales a través de GRB2 y SOS (un factor de intercambio de guanina, GEF), que catalizan el intercambio de GDP por GTP y activan Ras. Este cambio conformacional es detectado por los efectores de Ras, que activan vías descendentes, principalmente RAF/MEK/ERK (vía MAPK) y PI3K/AKT/mTOR (vía PI3K), que regulan la supresión de la apoptosis, el crecimiento celular, la transformación, la migración y la diferenciación^[7]. Ras se inactiva mediante la hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la actividad GTPasa intrínseca de Ras y acelerada por las proteínas activadoras de la GTPasa (GAPs). Las GAPs de RAS más prominentes son la neurofibromina 1 (NF1) y RASA1 (también conocida como p120GAP).

La frecuencia y el perfil de las mutaciones varían entre los diferentes tipos de cáncer y los genes RAS, lo que ilustra que no todas las mutaciones de RAS son iguales y que mutaciones específicas exhiben comportamientos biológicos y clínicos únicos^[8]. Las fuerzas que impulsan que mutaciones específicas en los genes RAS dominen sobre otras son el resultado de una compleja interacción de factores, que incluyen aspectos específicos del tejido, como el estrés genotóxico, la selección biológica, la topología genómica, la expresión génica y el contexto celular^[9],^[10]. Las alteraciones relacionadas con el cáncer más comunes en Ras son las mutaciones sin sentido que interrumpen el equilibrio entre las formas inactivas y activas, y que normalmente implican sustituciones de aminoácidos que disminuyen la hidrólisis de GTP o aumentan la carga de GTP^[6]. Las mutaciones en los codones 12, 13, 61 y 146 interrumpen la hidrólisis de GTP mediada por GAP, lo que conduce a una activación constitutiva de Ras y a una señalización descendente persistente, lo que promueve la supervivencia celular y la proliferación descontrolada. El aminoácido mutado determina tanto la actividad bioquímica como la capacidad transformadora de KRAS mutado^[9]. Las células que albergan diferentes mutaciones de KRAS también difieren en la glucólisis, el uso de glutamina y el metabolismo de aminoácidos, colina y hexosamina, lo que podría influir en las respuestas a los tratamientos contra el cáncer^[11].

Los inhibidores que se dirigen a las proteínas aguas arriba y aguas abajo de KRAS en las vías MAPK y PI3K se han aprobado desde hace mucho tiempo para su uso clínico^[12],^[13]. Sin embargo, el desarrollo de inhibidores específicos de KRAS se enfrentó a desafíos importantes debido a la afinidad picomolar de KRAS por GTP/GDP, las altas concentraciones intracelulares de GTP, la falta de sitios reguladores alostéricos y la compleja red de interacciones que involucran a GEF, GAPs y efectores a través de superficies de interacción proteína-proteína extendidas que son inherentemente difíciles de atacar con moléculas pequeñas^[14]. Superar la afinidad picomolar de RAS por GTP requeriría el desarrollo de moléculas pequeñas con propiedades de unión excepcionales, superando en gran medida las de los inhibidores de proteínas de unión a ATP. Además, el bolsillo de unión a GTP varía entre las mutaciones de KRAS, lo que complica el diseño de los inhibidores^[15]. Debido a los repetidos fracasos de los enfoques tanto directos como indirectos, KRAS se consideró durante mucho tiempo "no susceptible de ser atacado con fármacos". El desarrollo de sotorasib y adagrasib, inhibidores específicos de KRAS G12C, redefinió KRAS como un objetivo desafiante pero tratable, lo que condujo a un aumento sin precedentes de las terapias dirigidas a KRAS en los últimos años^[16].

A lo largo de los años, han surgido nuevas estrategias para inhibir la señalización de KRAS, centrándose en: (i) inhibidores que se dirigen a los isoformas mutados oncogénicos de KRAS, (ii) interrupción de las interacciones KRAS-efector para prevenir la señalización descendente, (iii) inhibición de las interacciones KRAS/GEF para prevenir la recarga de GTP^[17]. Además, las vacunas (basadas en péptidos y ARNm) y las terapias con células T de receptores de células T (TCR) modificados se están desarrollando actualmente para los cánceres con mutaciones en KRAS^[18].

Los inhibidores de KRAS G12C, sotorasib y adagrasib, que se unen covalentemente al residuo de cisteína-12 de KRAS mutado, fueron los primeros en obtener la aprobación regulatoria tras un desarrollo clínico avanzado^[19],^[20]. Estos inhibidores bloquean KRAS G12C en su estado inactivo unido a GDP, impidiendo el intercambio de nucleótidos catalizado por SOS y la señalización descendente. Sin embargo, no afectan a las formas de tipo salvaje ni a otras mutaciones frecuentes de KRAS que carecen de cisteína en el sitio activo. Muchos inhibidores de KRAS G12C con mecanismos similares se encuentran actualmente en desarrollo clínico^[15].

Los inhibidores de KRAS G12C han demostrado un éxito notable en los cánceres que albergan la mutación G12C, pero como están diseñados explícitamente para este alelo, no son activos contra las mutaciones de KRAS más prevalentes, como G12D y G12V. En 2021, Wang et al.^[21] informaron sobre el primer inhibidor dirigido a KRAS G12D, MRTX1133, que se une al bolsillo de la "switch II" de KRAS, inhibiendo tanto los estados activos como los inactivos. MRTX1133 es altamente selectivo para KRAS G12D e induce la regresión tumoral en múltiples modelos in vivo, incluido el CCR^[22]. Desde entonces, se han desarrollado numerosas moléculas para atacar las mutaciones de KRAS G12D y G12V más comunes.

Los inhibidores pan-RAS se dirigen tanto a las formas de tipo salvaje como a las mutadas de todas las proteínas RAS, incluidos KRAS, NRAS y HRAS, lo que ofrece una aplicabilidad más amplia y la capacidad de bloquear potencialmente la activación compensatoria o las mutaciones secundarias en KRAS, NRAS o HRAS después de la inhibición inicial de KRAS. Sin embargo, la inhibición simultánea de los tres isoformas de RAS en las células normales conlleva un grave riesgo de toxicidad^[23].

Los inhibidores pan-RAS siguen varias estrategias posibles: (i) inhibición directa de las proteínas Ras, como RMC-6236 (daraxonrasib), un inhibidor multi-RAS(ON) capaz de inhibir múltiples isoformas de Ras, incluidos cualquier mutación en KRAS, NRAS y HRAS, y las isoformas de tipo salvaje^[24]; (ii) direccionamiento indirecto de Ras mediante la inhibición de SOS1, que impulsa el intercambio de GDP/GTP, como BI 1701963. Los inhibidores de SOS1 a menudo se combinan con otros inhibidores de KRAS para suprimir la reactivación por retroalimentación y mejorar la respuesta^[25].

Los inhibidores de KRAS de primera generación, incluidos sotorasib y adagrasib, se dirigen exclusivamente a la forma inactiva unida a GDP (OFF). El tratamiento con estos inhibidores a menudo desencadena una reactivación adaptativa por retroalimentación de RAS-GTP de tipo salvaje o mutaciones secundarias que promueven la persistencia tumoral^[26],^[27]. Los inhibidores RAS(ON), que se dirigen a la forma activa unida a GTP, han demostrado una eficacia superior. Revolution Medicines ha desarrollado una clase de inhibidores RAS(ON) que estabilizan un complejo ternario entre KRAS mutado, una proteína chaperona y el inhibidor, aprovechando los cambios conformacionales asistidos por chaperonas para crear un bolsillo susceptible de ser atacado con fármacos. Este complejo bloquea estéricamente las interacciones KRAS-efector, inhibiendo la señalización descendente. Ejemplos de estos inhibidores incluyen RMC-6291 (elironrasib, KRAS G12C), RMC-4998 (KRAS G12C), RMC-9805 (zoldonrasib, KRAS G12D), RMC-5127 (KRAS G12V), RMC-8839 (KRAS G13C) y RMC-0708 (KRAS Q61H). Además, los inhibidores RAS(ON) como RMC-7977 y RMC-6236 exhiben una actividad más amplia, dirigiéndose a múltiples isoformas RAS mutadas y de tipo salvaje y superando la resistencia que se observa comúnmente con los inhibidores RAS-OFF^[24],^[28]. Los estudios preclínicos muestran una supresión sostenida de la señalización de la vía RAS y una regresión tumoral prolongada, mientras que los inhibidores RAS(OFF) a menudo conducen a la recurrencia debido a la resistencia adaptativa^[29].

Además de la inhibición farmacológica de KRAS, las estrategias inmunoterapéuticas para los cánceres con mutaciones en KRAS, que incluyen vacunas y terapias con células T adoptivas, se están desarrollando actualmente. Las vacunas peptídicas dirigidas a KRAS se probaron hace mucho tiempo^[30],^[31], pero los péptidos individuales a menudo no logran producir suficientes epítopos para una activación suficiente de las células T. También se han explorado las vacunas de ADN dirigidas a KRAS^[32]. Recientemente, se ha utilizado una vacunación basada en ARNm individualizada en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), CCR o adenocarcinoma de páncreas con mutaciones en KRAS^[22],^[33]. Por ejemplo, la vacuna basada en ARNm dirigida a KRAS, V941 (mRNA-5671), se basa en un ARNm formulado en nanopartículas lipídicas (LNP) que se dirige a cuatro de las mutaciones de KRAS más prevalentes (G12D, G12V, G12C y G13D). Actualmente, la mayoría de las estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a KRAS se encuentran en las primeras etapas de desarrollo, y ninguna ha avanzado aún a la aplicación clínica.

Las estrategias terapéuticas para el cáncer colorrectal metastásico (CCRm) con mutaciones en KRAS están evolucionando cada vez más más allá de la inhibición de KRAS con un solo fármaco. La combinación de inhibidores de KRAS con terapia anti-EGFR u otros agentes dirigidos ha surgido como un enfoque prometedor, ya que puede mejorar la eficacia antitumoral en comparación con la inhibición de KRAS por sí sola. Esta estrategia de combinación se basa en el principio del bloqueo de vías vertical u paralelo: al dirigirse simultáneamente a múltiples proteínas dentro de la cascada de señalización MAPK o a vías complementarias, sería posible reducir la señalización compensatoria y retrasar la aparición de mecanismos de resistencia que a menudo limitan la durabilidad de la monoterapia. Los estudios preclínicos y clínicos recientes han demostrado el potencial de estos enfoques combinados para mejorar las tasas de respuesta y la supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer con mutaciones en KRAS^[26],^[34],^[35]. Estas observaciones subrayan la importancia de las estrategias de combinación racionales en el desarrollo de terapias de precisión para este desafiante subgrupo de pacientes.

La utilidad clínica de las terapias dirigidas a KRAS en el CCRC depende de la distribución específica de las mutaciones de KRAS y su coexistencia con otras alteraciones genéticas. Numerosas publicaciones han explorado la incidencia de las mutaciones de KRAS en el CCRC, algunas de ellas analizando un número muy grande de muestras^[36],^[37]. Recursos como el Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer (COSMIC)^[38] proporcionan herramientas valiosas para explorar los perfiles mutacionales en grandes muestras, pero los estudios de agregación pueden introducir sesgos debido a la variabilidad en la selección de muestras y las estrategias de detección de mutaciones (por ejemplo, secuenciación dirigida, secuenciación del exoma completo o secuenciación del genoma completo). Estos recursos tampoco siempre proporcionan información sobre factores críticos que afectan a la incidencia de las mutaciones de KRAS, como las deficiencias en la reparación de errores de emparejamiento o las mutaciones de POLE que conducen a un fenotipo hipermutador.

Dada la diversidad de las mutaciones de KRAS y su relevancia terapéutica emergente, se necesita una comprensión más profunda de su incidencia, patrones de co-mutación y respuesta a las terapias dirigidas en el CCRC. En este estudio, presentamos un análisis detallado del perfil mutacional de KRAS en tres grandes cohortes de CCRC con datos clínicos y mutacionales completos, corrigiendo los factores conocidos que influyen en la incidencia de las mutaciones de KRAS. También examinamos cómo las diferentes mutaciones de KRAS y sus genes co-mutados pueden afectar a las estrategias terapéuticas para los pacientes con CCRC, teniendo en cuenta el estado más actualizado de los ensayos clínicos activos que evalúan las terapias dirigidas a KRAS en el CCRC. Nuestra discusión aborda tanto los tratamientos aprobados como los que se encuentran actualmente en investigación clínica.

Resultados

Incidencia de las mutaciones de RAS en el cáncer colorrectal

Según los datos de COSMIC, KRAS es el oncogén más frecuentemente mutado en el CCRC, con una incidencia del 34% en los adenocarcinomas que se originan en el intestino grueso^[38]. En contraste, las mutaciones en NRAS y HRAS se producen con mucha menor frecuencia, representando el 4% y el 1% de los casos, respectivamente. Sin embargo, la base de datos COSMIC recopila datos de estudios muy heterogéneos, con diferentes criterios de selección de pacientes y metodología de análisis de mutaciones, lo que puede sesgar las frecuencias de mutación observadas. Para obtener una estimación más precisa de la frecuencia de las mutaciones de RAS en el CCRC, realizamos un análisis exhaustivo en las cohortes de cáncer colorrectal más grandes de cBioportal^[39]: DFCI (CCRC primarios del Dana Farber Cancer Institute)^[40], TCGA Pancancer (CCRC primarios del consorcio Cancer Genome Atlas)^[41] y MSKCC (CCRC primarios y metástasis del Memorial Cancer Sloan Kettering Cancer Center)^[42] (ver "Métodos"). Existieron diferencias sustanciales en las características demográficas, clínicas y patológicas de los pacientes de estas tres cohortes, que se tuvieron en cuenta para los análisis posteriores (Tabla 1).

Asociación de las mutaciones de RAS con el estadio tumoral, el estado de MSI y la cohorte

KRAS estaba mutado en el 38% (670/1748) de los CCRC primarios, mientras que NRAS y HRAS presentaban una incidencia de mutación considerablemente menor (4,9%, 85/1748, y 0,9%, 15/1748, respectivamente). Las frecuencias de mutación fueron similares en las metástasis, es decir, KRAS (41%, 216/532), NRAS (3,9%, 21/532) y HRAS (0,4%, 2/532), sin una diferencia estadísticamente significativa en comparación con los tumores primarios (Fig. 1). La incidencia de mutación similar entre los tumores primarios y las metástasis fue consistente con la visión general de que las mutaciones de RAS son eventos tempranos en el CCRC y, lo que es importante, que las mutaciones en estos genes no tienen un efecto sustancial en la progresión metastásica. En contraste, otros genes que se mutan con frecuencia en el CCRC, como los supresores tumorales APC, TP53, FBXW7 y SMAD4, y los oncogenes PIK3CA y BRAF, mostraron diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de mutación al comparar los tumores primarios con las metástasis (Fig. 1 y Fig. S1 suplementaria).

En los tumores primarios, las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en los MSS que en los cánceres MSI/hipermutados (40% frente a 31%, OR = 0,7, IC = ^[0,5-0,9], p = 0,002, prueba exacta de Fisher), mientras que las mutaciones de HRAS se asociaron fuertemente con los cánceres MSI/hipermutados (3,8% frente a 0,2%, OR = 18,7, IC del 95% = ^[5-104], p = 2,7 × 10-7, prueba exacta de Fisher) (Fig. 1). Las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en los tumores avanzados (estadio III/IV, 399/955, 41,8%) que en los tumores de estadio I/II (253/743, 34,1%, p = 0,001, prueba exacta de Fisher). NRAS y HRAS mostraron frecuencias de mutación similares en los tumores de estadio I/II frente a los tumores de estadio III/IV. La regresión logística multivariable, que incluyó el sexo biológico, el estado de MSI, el estadio tumoral y la cohorte, confirmó la asociación de las mutaciones de KRAS con los tumores MSS (OR = 1,4, IC = ^[1,1-1,8], p = 0,014) y HRAS con los tumores MSI (OR = 15,7, IC = ^[5,0-48,8], p = 2 × 10-6) (Fig. 1B). Cabe destacar que la mayoría de las mutaciones de HRAS (88%, 15/17) se encontraron en codones fuera de G12, G13, Q61, K117 y A146, lo que sugiere un potencial oncogénico incierto y un posible papel de gen "pasajero". El análisis de regresión logística multivariable reveló que las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en el TCGA (OR = 1,8, IC = ^[1,4-2,5], p = 4 × 10-6) y en la cohorte MSKCC (OR = 2,2, IC = ^[1,6-3,0], p = 1,6 × 10-8) en comparación con la cohorte DFCI. Esta diferencia no se explicó por las diferencias en el sexo biológico, el MSI o el estadio entre las diferentes cohortes (Fig. 1B). Los análisis multivariables similares sobre los genes más frecuentemente mutados revelaron diferencias significativas en las frecuencias de mutación en APC, TP53, PIK3CA y BRAF entre las cohortes (Fig. S1 suplementaria).

Concordancia de las mutaciones de KRAS en las muestras tumorales del mismo paciente

El conjunto de datos de MSKCC comprendió 31 casos en los que se analizaron más de una muestra tumoral (Fig. S2 suplementaria). En 19 de ellos, se analizaron al menos un tumor primario y una metástasis, lo que reveló una alta concordancia en el estado de mutación de KRAS entre las lesiones primarias y metastásicas (17/19, 89%). Esta observación es consistente con el origen clonal de las mutaciones de KRAS y está en línea con informes anteriores^[43]. Solo dos casos, P-0002463 y P-0012418, mostraron discrepancias entre el estado de mutación del tumor primario y la metástasis asociada. El tumor primario del paciente P-0002463 era KRAS de tipo salvaje, mientras que la metástasis albergaba una mutación G12A. La mutación se detectó solo en el 8,8% (138 de 1570) de las lecturas de secuenciación de nueva generación que interrogaban esa ubicación cromosómica, lo que sugiere que la mutación fue un evento secundario adquirido después de la expansión clonal. Por el contrario, en P-0012418, la mutación KRAS G13C estaba presente en el tumor primario, pero no se informó en la metástasis. La mutación estaba presente solo en el 3,5% de las lecturas (29 de 811), lo que sugiere que la mutación de KRAS no era clonal en el tumor primario y que las células que generaron la metástasis eran KRAS de tipo salvaje, o que el alelo mutado se perdió durante la progresión tumoral.

Perfil de mutación de KRAS en el CCRC

Las mutaciones más comunes de KRAS (es decir, las que se encuentran en los codones G12, G13, Q61, K117 y A146) se agrupan alrededor del bolsillo de unión a GTP/GDP (Fig. 2). Los residuos G12 y G13 se encuentran dentro del bucle P, en estrecha proximidad con la porción de difosfato o trifosfato de GDP/GTP, y participan en la estabilización del nucleótido GTP en el sitio activo. Q61 se encuentra en el extremo N del dominio switch-II, que desempeña un papel fundamental en los cambios conformacionales durante la transición entre los estados ON y OFF de KRAS. K117 se encuentra muy cerca de G13 ( G12V > G13D > G12C > G12A > G12S (Fig. 4). KRAS G12D y G13D mostraron una incidencia similar en los casos MSS y MSI/hipermutados (10,8% frente a 7,8%, OR = 1,4, p = 0,1 para G12D, y 7,2% frente a 7,5%, OR = 0,96, p = 0,8 para G13D, pruebas exactas de Fisher). En contraste, KRAS G12V fue la segunda mutación más frecuente en los cánceres MSS, pero fue mucho menos común en los cánceres MSI/hipermutados (8,3% frente a 1,8%, p = 2,3 × 10-6), y la mutación KRAS G12C representó la cuarta mutación más común en los casos MSS (3,1%), pero no se encontró en ninguno de los 336 casos MSI/hipermutados (p = 7,6 × 10-5) (Fig. 4). Cabe destacar que ninguna de las 19 metástasis MSI/hipermutadas albergó la mutación KRAS G12D, a pesar de que esta mutación estaba presente en el 13% (13/97) de los tumores primarios MSI/hipermutados del mismo estudio (MSKCC). Esta diferencia, sin embargo, no alcanzó la significación estadística (p = 0,12).

Se encontraron mutaciones de menor incidencia en los codones 61 (4,5% de todas las mutaciones de KRAS: Q61H > Q61K > Q61R > Q61L), A146 (7,4% de todas las mutaciones de KRAS, A146T > A146V > A146P) y K117 (K117N > K117R). Estas mutaciones no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los CCRC MSS y los MSI/hipermutados, excepto por KRAS Q61K, que fue más frecuente en los MSI/hipermutados (2,1%) que en los CCRC MSS (0,31%, OR = 6,9, p = 0,001).

Encontramos algunas disparidades en las frecuencias de mutación de KRAS entre los estudios. El análisis de regresión logística multivariable sobre los tumores primarios, que incluyó la edad del paciente, el sexo biológico, el estadio tumoral y el estado de MSI como posibles factores de confusión, reveló diferencias estadísticamente significativas en la incidencia de G12D y G12V entre los estudios, lo que reflejó principalmente una menor incidencia de estas mutaciones en el conjunto de datos DFCI.

Análisis de co-mutación

Las mutaciones oncogénicas en KRAS, NRAS, HRAS y BRAF se consideran generalmente mutuamente excluyentes debido a sus efectos descendentes superpuestos. En consecuencia, tener mutaciones oncogénicas en múltiples genes de la misma vía de señalización no necesariamente proporcionaría una ventaja de crecimiento adicional significativa a las células cancerosas. Las mutaciones atípicas de BRAF (no V600E, como las variantes de clase 2 con actividad reducida de la quinasa y las variantes de clase 3 con actividad de quinasa alterada o ausente) se co-ocurren con frecuencia con mutaciones adicionales de la vía RAS^[46]. Sin embargo, las mutaciones de KRAS pueden co-ocurrir con mutaciones en otros genes del cáncer, lo que puede limitar la eficacia de las terapias dirigidas a KRAS o, por el contrario, explotarse en terapias combinadas para mejorar los resultados de los pacientes.

Analizamos las co-mutaciones de KRAS, NRAS y HRAS con el resto de los 341 genes relacionados con el cáncer incluidos en el panel de secuenciación IMPACT-341, lo que representa el conjunto mínimo de genes analizados en todas las muestras. Para controlar el efecto de confusión del fenotipo MSI/hipermutado sobre la frecuencia de mutación general, y por lo tanto, sobre la probabilidad de co-mutación, se realizaron análisis por separado para los tumores primarios MSS y MSI/hipermutados.

En los tumores primarios MSS, las mutaciones de KRAS se asociaron significativamente con una mayor frecuencia de mutaciones en APC, PIK3CA, FBXW7, AMER1 y SMAD2, y con una menor frecuencia de mutaciones en BRAF, NRAS y TP53. Las mutaciones en NRAS se asociaron con una mayor frecuencia de mutaciones en APC y con una menor frecuencia de mutaciones en KRAS. En los tumores primarios MSI/hipermutados, las mutaciones de KRAS se asociaron con una mayor frecuencia de mutaciones en APC y con una menor frecuencia de mutaciones en BRAF (Fig. 5). A modo de comparación, se proporcionan los análisis de co-mutación de otros genes mutados con frecuencia (es decir, APC, TP53, FBXW7, SMAD4, PIK3CA y BRAF) en la figura suplementaria S3.

Identificamos mutaciones concomitantes de KRAS y BRAF en el 1,2 % (22/1748) de los tumores primarios de CRC y en el 1,5 % (8/532) de las metástasis. La mayoría de estos casos presentaban mutaciones atípicas de BRAF (no V600E, n = 23, 77 %) y seis casos (40 %) presentaban mutaciones atípicas de KRAS (en codones distintos de G12, G13, Q61, K117 o A146). En los tumores MSS, no se observaron co-mutaciones de KRAS y BRAF V600E. Solo cuatro tumores, todos MSI/hipermutados, mostraron una co-ocurrencia de BRAF V600E con mutaciones oncogénicas establecidas de KRAS (dos G12D, una G12A y una G13D); notablemente, ambos casos de KRAS G12D también presentaban mutaciones atípicas de BRAF junto con V600E, lo que podría afectar la funcionalidad de BRAF (figura suplementaria S4).

Análisis de co-mutación específico del codón de KRAS

Investigamos si los tumores que albergan diferentes mutaciones de KRAS presentan perfiles de mutación distintos en otros genes relacionados con el cáncer. Específicamente, evaluamos si las mutaciones en los codones de KRAS más comúnmente alterados (G12, G13, Q61, K117 y A146) estaban relacionadas con diferencias en las frecuencias de mutación de los 340 genes incluidos en el panel IMPACT-341. En los tumores primarios MSS con mutaciones de KRAS, no observamos variaciones estadísticamente significativas en las tasas de mutación de otros genes asociados con el codón mutado de KRAS. En cambio, en los tumores primarios MSI/hipermutados, identificamos 11 genes cuyas frecuencias de mutación diferían según el codón mutado de KRAS (Fig. 6). En particular, cinco de estos genes —DDR2, KDR (VEGFR2), EPHA3, ALK y FLT1 (VEGFR1)— codifican quinasas de proteína receptor transmembrana que funcionan en la señalización celular aguas arriba de la vía MAPK (enriquecimiento = 5,37, p = 9 × 10⁻⁷, valor Q de FDR = 0,04).

Co-mutaciones de KRAS y genes que codifican Ras-GAP

Los mutantes de KRAS G13 exhiben una sensibilidad parcial a la hidrólisis de GTP mediada por NF1 in vitro^[47]. Se ha informado que las líneas celulares de cáncer que albergan mutaciones de KRAS G13 o A146 presentan una mayor frecuencia de co-mutación de NF1 en comparación con las que tienen mutaciones de G12. Por el contrario, las líneas celulares de cáncer con mutaciones en Q61 no mostraron co-mutaciones de NF1. En una gran colección de tumores de diferentes orígenes, aproximadamente el 12 % de las muestras mutadas en KRAS G13 albergaban mutaciones en NF1, mientras que solo el 5,5 % de las muestras con mutaciones en KRAS G12 presentaban mutaciones en NF1^[47].

En nuestro estudio, las mutaciones de NF1 fueron significativamente más frecuentes en los tumores MSI/hipermutados que en los tumores MSS, tanto en los tumores primarios (23,4 % frente a 2,1 %; OR = 12,5, IC del 95 %: 8–20; p < 2 × 10⁻⁷) como en las metástasis (37 % frente a 2,3 %; OR = 24, IC del 95 %: 6,7–81; p = 8,6 × 10⁻⁷). NF1 es un gen muy grande, que abarca más de 287 kb con una secuencia codificante de casi 8,5 kb (percentil 99), y, por lo tanto, es susceptible a adquirir mutaciones, particularmente en tumores con un fenotipo mutador. Sin embargo, la frecuencia de las mutaciones de NF1 no fue mayor que la de otros genes de longitud comparable en los CRC MSS o MSI/hipermutados (figura suplementaria S5), lo que sugiere la ausencia de una fuerte selección positiva para la inactivación de NF1 en el CRC.

No encontramos una asociación estadísticamente significativa entre las mutaciones de KRAS G13 y las mutaciones de NF1 en ninguno de los grupos de CRC estudiados (Fig. 7). En los tumores MSS, las mutaciones de NF1 ocurrieron con frecuencias similares en los mutantes de KRAS G12 (0,8 %) y G13 (0,9 %), ambas inferiores a las de los casos de KRAS de tipo salvaje (3 %). En los CRC MSI/hipermutados, las mutaciones de NF1 fueron menos frecuentes en los mutantes de KRAS G13 (13 %) en comparación con los mutantes de G12 (21 %) y los casos de tipo salvaje (23 %), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. En un modelo de regresión logística multivariable que incluía el grupo, el sexo, la edad, el estado MSI/hipermutado y el codón de KRAS, solo el estado MSI/hipermutado se asoció significativamente con las mutaciones de NF1 (p < 2 × 10⁻⁷).

Ampliamos el análisis de co-mutación de KRAS para incluir RASA1, que codifica otra proteína activadora de GTPasa importante que se muta con frecuencia en los cánceres humanos. Los hallazgos para las mutaciones de RASA1 fueron similares a los observados para NF1. Específicamente, no encontramos evidencia de un aumento de la frecuencia de mutación en los CRC MSS o MSI/hipermutados en comparación con los genes de tamaño similar (figura suplementaria S5), y no hubo asociación entre las mutaciones de RASA1 y el estado mutacional de KRAS (Fig. 7). Estas observaciones se validaron aún más en el conjunto de datos MSK-CHORD^[48], que incluyó más de 5000 muestras de CRC (figuras suplementarias S6 y S7).

Compuestos dirigidos a KRAS

Una búsqueda sistemática del NCI Thesaurus y PubChem, que combinó búsquedas automatizadas y curación manual (ver "Métodos"), recuperó 106 fármacos o tratamientos celulares que se dirigen a SHP2/SOS1/KRAS. La lista contiene 73 inhibidores, 15 TCR, 14 vacunas, 3 degradadores y 1 antisentido. La mayoría de estos compuestos se dirigen directamente a KRAS (n = 89), mientras que el resto se dirige a SOS1 (n = 5) o SHP2 (n = 12). La mayoría de ellos se dirigieron a una mutación única de KRAS (32 para KRAS G12C, 22 para KRAS G12D, 6 para KRAS G12V y uno para KRAS G13N). Diecinueve se dirigieron a múltiples isoformas mutadas de KRAS, y 26 se dirigieron a cualquier tipo de mutación de KRAS, ya sea porque el compuesto inhibía todas las isoformas de KRAS (incluida la de tipo salvaje) o porque se dirigía a SOS1 o SHP2, inhibiendo el intercambio de GDP a GTP y, en consecuencia, la transición de la forma inactiva a la forma activa de KRAS. Ochenta y cinco de estos compuestos se han estudiado o se están estudiando actualmente en ensayos clínicos que involucran a pacientes con CRC (Fig. 8). Se proporciona una lista detallada de estos compuestos, sus objetivos moleculares y los ensayos clínicos asociados en el archivo de tablas suplementarias (supplementary_tables.zip).

Terapias dirigidas a KRAS en ensayos clínicos para CRC

Un examen sistemático de la base de datos de ensayos clínicos (https://clinicaltrials.gov), que combinó la búsqueda automática y la curación manual, recuperó 156 ensayos clínicos que han evaluado o están evaluando actualmente la respuesta a al menos uno de estos compuestos en pacientes con CRC (ver "Métodos"). Un cronograma de estos ensayos, que indica el compuesto probado, el objetivo, la fase y el estado actual de estos ensayos clínicos, se muestra en la Fig. 9. Además, se proporciona una tabla con la información completa de estos 156 ensayos clínicos como material suplementario (supplementary_tables.zip). La tabla incluye los datos proporcionados por la base de datos de ensayos clínicos, los datos del compuesto o tratamiento estudiado (tipo, objetivo), así como referencias de PubMed y PubMed Central que citan esos ensayos clínicos.

De los 156 ensayos clínicos, 52 evaluaron compuestos que se dirigen exclusivamente a KRAS G12C (Fig. 9), a pesar de la muy baja incidencia de esta mutación en el CRC. Esto se debe en gran medida al desarrollo y la aprobación regulatoria tempranos de los inhibidores de G12C, que fueron los pioneros en el interés por KRAS como un objetivo farmacológico. Estos agentes demostraron actividad en modelos preclínicos de CRC y eficacia clínica en NSCLC, lo que llevó a su evaluación en otros tumores con mutación de KRAS G12C, incluido el CRC.

Sin embargo, el panorama terapéutico está evolucionando rápidamente más allá de las estrategias específicas de G12C. Un número creciente de ensayos recientes y en curso están investigando inhibidores que se dirigen a otras mutaciones de KRAS comunes en el CRC, como G12D y G12V, así como enfoques más amplios destinados a la inhibición pan-KRAS (Fig. 10). Varios ensayos también están evaluando terapias de combinación, como la combinación de inhibidores de KRAS con EGFR, SHP2 o bloqueo de puntos de control inmunitarios, para superar la resistencia y mejorar las tasas de respuesta.

Ochenta de estos ensayos están reclutando actualmente pacientes, y 11 reclutarán pacientes en un futuro próximo, lo que refleja un interés clínico activo para ampliar las opciones terapéuticas para tratar a los pacientes con CRC con mutaciones de KRAS, más allá del pequeño subconjunto de casos con mutación de KRAS G12C.

Incidencia de las mutaciones de RAS en el cáncer colorrectal

Según los datos de COSMIC, KRAS es el oncogén más frecuentemente mutado en el CRC, con una incidencia del 34 % en los adenocarcinomas que se originan en el intestino grueso^[38]. En cambio, las mutaciones en NRAS y HRAS ocurren con frecuencias mucho menores, lo que representa el 4 % y el 1 % de los casos, respectivamente. Sin embargo, la base de datos COSMIC recopila datos de estudios muy heterogéneos, con diferentes criterios de selección de pacientes y metodología de análisis de mutaciones, lo que puede sesgar las frecuencias de mutación observadas. Para obtener una estimación más precisa de la frecuencia de las mutaciones de RAS en el CRC, realizamos un análisis exhaustivo en los cohortes de cáncer colorrectal más grandes de cBioportal^[39]: DFCI (CRC primarios del Dana Farber Cancer Institute)^[40], TCGA Pancancer (CRC primarios del consorcio Cancer Genome Atlas)^[41] y MSKCC (CRC primarios y metástasis del Memorial Cancer Sloan Kettering Cancer Center)^[42] (ver "Métodos"). Existieron diferencias sustanciales en las características demográficas, clínicas y patológicas de los pacientes de estos tres grupos, que se tuvieron en cuenta para los análisis posteriores (Tabla 1).

Asociación de las mutaciones de RAS con el estadio tumoral, el estado de MSI y el grupo

KRAS mutó en el 38 % (670/1748) de los CRC primarios, mientras que NRAS y HRAS exhibieron una incidencia de mutación considerablemente menor (4,9 %, 85/1748 y 0,9 %, 15/1748, respectivamente). Las frecuencias de mutación fueron similares en las metástasis, es decir, KRAS (41 %, 216/532), NRAS (3,9 %, 21/532) y HRAS (0,4 %, 2/532), sin una diferencia estadísticamente significativa en comparación con los tumores primarios (Fig. 1). La incidencia de mutación similar entre los tumores primarios y las metástasis fue consistente con la opinión general de que las mutaciones de RAS son eventos tempranos en el CRC y, lo que es importante, que las mutaciones en estos genes no tienen un efecto sustancial en la progresión metastásica. En cambio, otros genes que se mutan con frecuencia en el CRC, como los supresores tumorales APC, TP53, FBXW7 y SMAD4, y los oncogenes PIK3CA y BRAF exhibieron diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de mutación al comparar los tumores primarios con las metástasis (Fig. 1 y figura suplementaria S1).

En los tumores primarios, las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en los MSS que en los cánceres MSI/hipermutados (40% frente a 31%, OR = 0,7, IC = [0,5–0,9], p = 0,002, prueba exacta de Fisher), mientras que las mutaciones de HRAS se asociaron fuertemente con los cánceres MSI/hipermutados (3,8% frente a 0,2%, OR = 18,7, IC del 95% = [5–104], p = 2,7 × 10-7, prueba exacta de Fisher) (Fig. 1). Las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en los tumores avanzados (estadio III/IV, 399/955, 41,8%) que en los tumores de estadio I/II (253/743, 34,1%, p = 0,001, prueba exacta de Fisher). NRAS y HRAS mostraron frecuencias de mutación similares en los tumores primarios de estadio I/II frente a los de estadio III/IV. La regresión logística multivariable, que incluyó el sexo biológico, el estado MSI, el estadio tumoral y la cohorte, confirmó la asociación de las mutaciones de KRAS con los tumores MSS (OR = 1,4, IC = [1,1–1,8], p = 0,014) y de HRAS con los tumores MSI (OR = 15,7, IC = [5,0–48,8], p = 2 × 10-6) (Fig. 1B). Cabe destacar que la mayoría de las mutaciones de HRAS (88%, 15/17) se encontraron en codones fuera de G12, G13, Q61, K117 y A146, lo que sugiere un potencial oncogénico incierto y un posible papel de gen "pasajero". El análisis de regresión logística multivariable reveló que las mutaciones de KRAS fueron más frecuentes en el TCGA (OR = 1,8, IC = [1,4–2,5], p = 4 × 10-6) y en la cohorte MSKCC (OR = 2,2, IC = [1,6–3,0], p = 1,6 × 10-8) en comparación con la cohorte DFCI. Esta diferencia no se explicó por diferencias en el sexo biológico, el MSI o el estadio entre las diferentes cohortes (Fig. 1B). Análisis multivariables similares de los genes más frecuentemente mutados revelaron diferencias significativas en las frecuencias de mutación en APC, TP53, PIK3CA y BRAF entre las cohortes (Fig. S1 suplementaria).

Concordancia de las mutaciones de KRAS en las muestras tumorales del mismo paciente

El conjunto de datos de MSKCC comprendió 31 casos en los que se analizaron más de una muestra tumoral (Fig. S2 suplementaria). En 19 de ellos, se analizaron al menos un tumor primario y una metástasis, lo que reveló una alta concordancia en el estado de mutación de KRAS entre las lesiones primarias y metastásicas (17/19, 89%). Esta observación es consistente con el origen clonal de las mutaciones de KRAS y está en línea con informes previos^[43]. Solo dos casos, P-0002463 y P-0012418, mostraron discrepancias entre el estado de mutación del tumor primario y la metástasis asociada. El tumor primario del paciente P-0002463 era KRAS de tipo salvaje, mientras que la metástasis albergaba una mutación G12A. La mutación se detectó solo en el 8,8% (138 de 1570) de las lecturas de secuenciación de nueva generación que interrogaban esa ubicación cromosómica, lo que sugiere que la mutación fue un evento secundario adquirido después de la expansión clonal. Por el contrario, en P-0012418, la mutación KRAS G13C estaba presente en el tumor primario, pero no se informó en la metástasis. La mutación estaba presente en solo el 3,5% de las lecturas (29 de 811), lo que sugiere que la mutación de KRAS no era clonal en el tumor primario y que las células que generaron la metástasis eran KRAS de tipo salvaje, o que el alelo mutado se perdió durante la progresión tumoral.

Perfil de mutación de KRAS en el CRC

Las mutaciones más comunes de KRAS (es decir, las que se encuentran en los codones G12, G13, Q61, K117 y A146) se agrupan alrededor del bolsillo de unión a GTP/GDP (Fig. 2). Los residuos G12 y G13 se encuentran dentro del bucle P, en estrecha proximidad con la fracción di/tri de GDP/GTP, y participan en la estabilización del nucleótido GTP en el sitio activo. Q61 se encuentra en el extremo N del dominio switch-II, que desempeña un papel fundamental en los cambios conformacionales durante la transición entre los estados ON y OFF de KRAS. K117 se encuentra muy cerca de G13 ( G12V > G13D > G12C > G12A > G12S (Fig. 4). KRAS G12D y G13D exhibieron una incidencia similar en los casos MSS y MSI/hipermutados (10,8% frente a 7,8%, OR = 1,4, p = 0,1 para G12D, y 7,2% frente a 7,5%, OR = 0,96, p = 0,8 para G13D, pruebas exactas de Fisher). En contraste, KRAS G12V fue la segunda mutación más frecuente en los cánceres MSS, pero fue mucho menos común en los cánceres MSI/hipermutados (8,3% frente a 1,8%, p = 2,3 × 10-6), y la mutación KRAS G12C representó la cuarta mutación más común en los casos MSS (3,1%), pero no se encontró en ninguno de los 336 casos MSI/hipermutados (p = 7,6 × 10-5) (Fig. 4). Cabe destacar que ninguna de las 19 metástasis MSI/hipermutadas albergó la mutación KRAS G12D, a pesar de que esta mutación estaba presente en el 13% (13/97) de los tumores primarios MSI/hipermutados del mismo estudio (MSKCC). Esta diferencia, sin embargo, no alcanzó significación estadística (p = 0,12).

Se encontraron mutaciones de menor incidencia en los codones 61 (4,5% de todas las mutaciones de KRAS: Q61H > Q61K > Q61R > Q61L), A146 (7,4% de todas las mutaciones de KRAS, A146T > A146V > A146P) y K117 (K117N > K117R). Estas mutaciones no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los CRC MSS y los MSI/hipermutados, excepto por KRAS Q61K, que fue más frecuente en los MSI/hipermutados (2,1%) que en los CRC MSS (0,31%, OR = 6,9, p = 0,001).

Encontramos algunas disparidades en las frecuencias de mutación de KRAS entre los estudios. El análisis de regresión logística multivariable sobre los tumores primarios, que incluyó la edad del paciente, el sexo biológico, el estadio tumoral y el estado MSI como posibles factores de confusión, reveló diferencias estadísticamente significativas en la incidencia de G12D y G12V entre los estudios, lo que reflejó principalmente una menor incidencia de estas mutaciones en el conjunto de datos DFCI.

Análisis de co-mutación

Las mutaciones oncogénicas en KRAS, NRAS, HRAS y BRAF generalmente se consideran mutuamente excluyentes debido a sus efectos descendentes superpuestos. En consecuencia, tener mutaciones oncogénicas en múltiples genes de la misma vía de señalización no necesariamente proporcionaría una ventaja de crecimiento adicional significativa a las células cancerosas. Las mutaciones atípicas de BRAF (no V600E, como las variantes de clase 2 con actividad reducida de la quinasa y las variantes de clase 3 con actividad de quinasa alterada o ausente) se co-ocurren con frecuencia con mutaciones adicionales de la vía RAS^[46]. Sin embargo, las mutaciones de KRAS pueden co-ocurrir con mutaciones en otros genes cancerosos, lo que puede limitar la eficacia de las terapias dirigidas a KRAS o, por el contrario, explotarse en terapias combinadas para mejorar los resultados de los pacientes.

Analizamos las co-mutaciones de KRAS, NRAS y HRAS con el resto de los 341 genes relacionados con el cáncer incluidos en el panel de secuenciación IMPACT-341, que representa el conjunto mínimo de genes analizados en todas las muestras. Para controlar el efecto de confusión del fenotipo MSI/hipermutado en la frecuencia general de mutación (y, por lo tanto, en la probabilidad de co-mutación), los análisis se realizaron por separado para los tumores primarios MSS y MSI/hipermutados.

En los CRC primarios MSS, las mutaciones de KRAS se asociaron significativamente con una mayor frecuencia de mutaciones en APC, PIK3CA, FBXW7, AMER1 y SMAD2, y con una menor frecuencia de mutaciones en BRAF, NRAS y TP53. Las mutaciones en NRAS se asociaron con una mayor frecuencia de mutaciones en APC y con una menor frecuencia de mutaciones en KRAS. En los CRC MSI/hipermutados, las mutaciones de KRAS se asociaron con una mayor frecuencia de mutaciones en APC y con una menor frecuencia de mutaciones en BRAF (Fig. 5). A modo de comparación, se proporcionan los análisis de co-mutación de otros genes frecuentemente mutados (es decir, APC, TP53, FBXW7, SMAD4, PIK3CA y BRAF) en la Fig. S3 suplementaria.

Identificamos mutaciones concomitantes de KRAS y BRAF en el 1,2% (22/1748) de los CRC primarios y en el 1,5% (8/532) de las metástasis. La mayoría de estos casos albergaban mutaciones atípicas de BRAF (no V600E, n = 23, 77%), y seis casos (40%) presentaban mutaciones atípicas de KRAS (en codones distintos de G12, G13, Q61, K117 o A146). En los tumores MSS, no se observaron co-mutaciones de KRAS y BRAF V600E. Solo cuatro tumores, todos MSI/hipermutados, mostraron co-ocurrencia de BRAF V600E con mutaciones de KRAS establecidas (dos G12D, una G12A y una G13D); notablemente, ambos casos de KRAS G12D también presentaban mutaciones atípicas de BRAF junto con V600E, lo que podría afectar la funcionalidad de BRAF (Fig. S4 suplementaria).

Análisis de co-mutación específico del codón de KRAS

Investigamos si los tumores que albergan diferentes mutaciones de KRAS exhiben perfiles de mutación distintos en otros genes relacionados con el cáncer. Específicamente, evaluamos si las mutaciones en los codones de KRAS más comúnmente alterados (G12, G13, Q61, K117 y A146) estaban relacionadas con diferencias en las frecuencias de mutación de los 340 genes incluidos en el panel IMPACT-341. En los tumores primarios MSS con mutaciones de KRAS, no observamos variaciones estadísticamente significativas en las tasas de mutación de otros genes asociadas con el codón de KRAS mutado. En contraste, en los tumores primarios MSI/hipermutados, identificamos 11 genes cuyas frecuencias de mutación diferían según el codón de KRAS mutado (Fig. 6). En particular, cinco de estos genes ( DDR2, KDR (VEGFR2), EPHA3, ALK y FLT1 (VEGFR1) ) codifican proteínas tirosina quinasas receptoras transmembrana que funcionan en la señalización celular aguas arriba de la vía MAPK (enriquecimiento = 5,37, p = 9 × 10-7, valor Q de FDR = 0,04).

Análisis de co-mutaciones de KRAS y genes que codifican Ras-GAP

Las mutaciones de KRAS G13 exhiben una sensibilidad parcial a la hidrólisis de GTP mediada por NF1 in vitro^[47]. Se ha informado que las líneas celulares cancerosas que albergan mutaciones de KRAS G13 o A146 presentan una mayor frecuencia de co-mutación de NF1 en comparación con las que tienen mutaciones de G12. Por el contrario, las líneas celulares cancerosas con mutaciones en Q61 no mostraron co-mutaciones de NF1. En una gran colección de tumores de diferentes orígenes, aproximadamente el 12% de las muestras mutadas en KRAS G13 albergaban mutaciones en NF1, mientras que solo el 5,5% de las muestras con mutaciones en KRAS G12 presentaban mutaciones en NF1^[47].

En nuestro estudio, las mutaciones de NF1 fueron significativamente más frecuentes en los tumores MSI/hipermutados que en los MSS, tanto en los tumores primarios (23,4% frente a 2,1%; OR = 12,5, IC del 95%: 8–20; p < 2 × 10-7) como en las metástasis (37% frente a 2,3%; OR = 24, IC del 95%: 6,7–81; p = 8,6 × 10-7). NF1 es un gen muy grande, que abarca más de 287 kb con una secuencia codificante de casi 8,5 kb (percentil 99), y, por lo tanto, es susceptible de adquirir mutaciones, particularmente en tumores con un fenotipo mutador. Sin embargo, la frecuencia de las mutaciones de NF1 no fue mayor que la de otros genes de longitud comparable en los CRC MSS o MSI/hipermutados (Fig. S5 suplementaria), lo que sugiere la ausencia de una fuerte selección positiva para la inactivación de NF1 en el CRC.

Encontramos algunas disparidades en las frecuencias de mutación de KRAS entre los estudios. El análisis de regresión logística multivariable sobre los tumores primarios, que incluyó la edad del paciente, el sexo biológico, el estadio tumoral y el estado MSI como posibles factores de confusión, reveló diferencias estadísticamente significativas en la incidencia de G12D y G12V entre los estudios, lo que reflejó principalmente una menor incidencia de estas mutaciones en el conjunto de datos DFCI.

No encontramos ninguna asociación estadísticamente significativa entre las mutaciones de KRAS en el codón G13 y las mutaciones de NF1 en ninguno de los grupos de estudio de CCRC (Figura 7). En los tumores MSS, las mutaciones de NF1 se produjeron con frecuencias similares y bajas en los mutantes de KRAS G12 (0,8%) y G13 (0,9%), ambas inferiores a las observadas en los casos de KRAS de tipo salvaje (3%). En los CCRC con MSI/hipermutados, las mutaciones de NF1 fueron menos frecuentes en los mutantes de KRAS G13 (13%) en comparación con los mutantes de G12 (21%) y los casos de tipo salvaje (23%), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. En un modelo de regresión logística multivariable que incluyó el grupo, el sexo, la edad, el estado de MSI/hipermutación y el codón de KRAS, solo el estado de MSI/hipermutación se asoció significativamente con las mutaciones de NF1 (p < 2 × 10 ¹ ).

Ampliamos el análisis de co-mutaciones de KRAS para incluir RASA1, que codifica otra proteína activadora de GTPasa importante que muta con frecuencia en los cánceres humanos. Los resultados para las mutaciones de RASA1 fueron similares a los observados para NF1. Específicamente, no encontramos evidencia de un aumento en la frecuencia de mutaciones ni en los CCRC MSS ni en los CCRC con MSI/hipermutación en comparación con los genes de tamaño similar (Figura S5 complementaria), ni tampoco encontramos una asociación entre las mutaciones de RASA1 y el estado mutacional de KRAS (Figura 7). Estas observaciones se validaron aún más en el conjunto de datos MSK-CHORD^[48], que incluyó más de 5000 muestras de CCRC (Figuras S6 y S7 complementarias).

Compuestos dirigidos a KRAS

Realizamos una búsqueda sistemática en el NCI Thesaurus y PubChem, combinando búsquedas automatizadas y curación manual (ver "Métodos"), que recuperó 106 fármacos o tratamientos celulares dirigidos a SHP2/SOS1/KRAS. La lista contiene 73 inhibidores, 15 TCR, 14 vacunas, 3 degradadores y 1 oligonucleótido antisentido. La mayoría de estos compuestos se dirigen directamente a KRAS (n = 89), mientras que el resto se dirige a SOS1 (n = 5) o SHP2 (n = 12). La mayoría de ellos se dirigieron a una mutación KRAS única (32 para KRAS G12C, 22 para KRAS G12D, 6 para KRAS G12V y una para KRAS G13N). Diecinueve se dirigieron a múltiples isoformas mutadas de KRAS, y 26 se dirigieron a cualquier tipo de mutación de KRAS, ya sea porque el compuesto inhibía todas las isoformas de KRAS (incluida la de tipo salvaje) o porque se dirigía a SOS1 o SHP2, inhibiendo el intercambio de GDP a GTP y, por lo tanto, la transición de la forma inactiva a la forma activa de KRAS. Ochenta y cinco de estos compuestos se han estudiado o se están estudiando actualmente en ensayos clínicos que involucran a pacientes con CCRC (Figura 8). Se proporciona una lista detallada de estos compuestos, sus dianas moleculares y los ensayos clínicos asociados en el archivo de tablas complementarias (supplementary_tables.zip).

Terapias dirigidas a KRAS en ensayos clínicos para CCRC

Realizamos un examen sistemático de la base de datos de ensayos clínicos (https://clinicaltrials.gov), combinando la búsqueda automática y la curación manual, que recuperó 156 ensayos clínicos que han evaluado o están evaluando actualmente la respuesta a al menos uno de estos compuestos en pacientes con CCRC (ver "Métodos"). Un cronograma de estos ensayos, que indica el compuesto probado, la diana, la fase y el estado actual de estos ensayos clínicos, se muestra en la Figura 9. Además, se proporciona una tabla con la información completa de estos 156 ensayos clínicos como material complementario (supplementary_tables.zip). La tabla incluye los datos proporcionados por la base de datos de ensayos clínicos, los datos del compuesto o tratamiento estudiado (tipo, diana), así como referencias de PubMed y PubMed Central que citan esos ensayos clínicos.

De los 156 ensayos clínicos, 52 evaluaron compuestos dirigidos exclusivamente a KRAS G12C (Figura 9), a pesar de la muy baja incidencia de esta mutación en el CCRC. Esto se debe en gran medida al desarrollo y la aprobación regulatoria más tempranos de los inhibidores de G12C, que fueron los primeros en despertar el interés en KRAS como una diana farmacológica. Estos agentes demostraron actividad en modelos preclínicos de CCRC y eficacia clínica en NSCLC, lo que llevó a su evaluación en otros tumores con mutación KRAS G12C, incluido el CCRC.

Sin embargo, el panorama terapéutico está evolucionando rápidamente más allá de las estrategias específicas de G12C. Un número creciente de ensayos recientes y en curso están investigando inhibidores dirigidos a otras mutaciones de KRAS comunes en el CCRC, como G12D y G12V, así como enfoques más amplios destinados a la inhibición pan-KRAS (Figura 10). Varios ensayos también están evaluando terapias de combinación, como la combinación de inhibidores de KRAS con EGFR, SHP2 o bloqueo de puntos de control inmunitarios, para superar la resistencia y mejorar las tasas de respuesta.

Ochenta de estos ensayos están reclutando actualmente pacientes, y 11 reclutarán pacientes en un futuro próximo, lo que refleja un interés clínico activo para ampliar las opciones terapéuticas para tratar a los pacientes con CCRC con mutación KRAS, más allá del pequeño subconjunto de casos con mutación KRAS G12C.

Discusión

Aunque KRAS es uno de los protooncogenes más antiguos identificados y el oncogén más frecuentemente mutado en el cáncer humano, se consideró no susceptible de ser atacado farmacológicamente durante casi 4 décadas^[20]. Esta percepción ha cambiado en los últimos años con el desarrollo de inhibidores covalentes selectivos dirigidos a KRAS G12C, una mutación que es relativamente poco común en el cáncer colorrectal (CCRC) (Figura 4). Más recientemente, se están probando nuevos fármacos dirigidos a mutaciones de KRAS más comunes, así como fármacos pan-KRAS que inhiben varias o todas las isoformas de KRAS, lo que podría ampliar la población que podría beneficiarse de las terapias dirigidas a KRAS. Para determinar el impacto de estas terapias dirigidas a KRAS de nueva generación para los pacientes con CCRC, es esencial comprender el espectro de mutaciones y co-mutaciones de KRAS, teniendo en cuenta la heterogeneidad genética de esta enfermedad.

Realizamos un análisis exhaustivo de la frecuencia de mutaciones de KRAS utilizando tres de los conjuntos de datos de cáncer colorrectal más grandes disponibles públicamente que contienen información clínica y de mutación. Es importante tener en cuenta que, aunque los pacientes en estos estudios no fueron seleccionados en función de su estado de mutación de KRAS, los conjuntos de datos no son estrictamente de base poblacional. En particular, el estudio de MSKCC incluye una proporción sustancialmente mayor de pacientes diagnosticados con CCRC en estadio IV (~60%, Tabla 1) porque su objetivo principal era comparar los CCRC metastásicos con los no metastásicos^[42]. La frecuencia de tumores primarios con MSI/hipermutación fue del 18,1% (IC del 95%, 16,3%-20%), lo que es consistente con las frecuencias informadas en la población de pacientes con CCRC (15-20%), sin que se observaran diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos (prueba de Chi-cuadrado, p = 0,24). Como se esperaba, las muestras metastásicas de MSKCC comprenden una proporción significativamente menor de tumores con MSI/hipermutación (3,6%, Tabla 1), lo que refleja el menor potencial metastásico de los CCRC con MSI^[49]. Para reducir los posibles sesgos, el estadio tumoral y el estado de MSI/hipermutación se incluyeron como covariables en los análisis estadísticos, o los análisis se realizaron por separado para los tumores MSS y los tumores con MSI/hipermutación.

Proporcionemos una descripción detallada de la incidencia de mutaciones y co-mutaciones específicas de KRAS en los CCRC MSS frente a los CCRC con MSI/hipermutación, e identificamos diferencias sustanciales entre los grupos de estudio que no pudieron explicarse por las diferencias en los datos demográficos (edad, sexo) o el estadio tumoral. Se han descrito previamente las diferencias en la prevalencia de las mutaciones de KRAS en los pacientes con CCRC en diferentes poblaciones^[37]. También se ha informado una mayor incidencia de mutaciones de KRAS en los afroamericanos en comparación con los pacientes con CCRC caucásicos (OR = 1,56, IC del 95%, ^[1,30-1,87], p = 0,0001)^[50]. Sin embargo, los conjuntos de datos analizados en nuestro estudio no incluyeron información completa sobre el origen genético de los pacientes; por lo tanto, no pudimos determinar si las diferencias en las mutaciones de KRAS entre los conjuntos de datos estaban relacionadas con la variación en la composición del origen genético.

La mayoría de los mutantes del codón 12 de KRAS exhiben un deterioro sustancial tanto en la hidrólisis intrínseca de GTP como en la hidrólisis de GTP mediada por GAP, sin alterar la tasa de intercambio de nucleótidos^[9]. Una excepción es la mutación de KRAS G12C, donde aproximadamente el 75% de la proteína mutante está unida a GTP en estado estacionario, pero aún exhibe una actividad GTPasa intrínseca similar a la del KRAS de tipo salvaje, y mucho mayor que el resto de las mutaciones oncogénicas en G12^[9],^[51]. Las mutaciones en las proteínas RAS también pueden afectar su afinidad de unión a los efectores posteriores. Por ejemplo, la mutación de KRAS G12D exhibe una afinidad aproximadamente cinco veces menor por RAF1-RBD (dominio de unión a Ras) en comparación con el KRAS de tipo salvaje^[9].

Estudios previos han sugerido que las mutaciones de KRAS en el codón 12 exhiben un mayor potencial oncogénico al alterar la apoptosis y mejorar el crecimiento independiente del contacto en comparación con las mutaciones en el codón 13^[52],^[53]. Los experimentos in vitro e in vivo han proporcionado evidencia de una mayor capacidad de transformación de las mutaciones en el codón 12 en comparación con el codón 13^[52]. En un estudio retrospectivo centrado en el CCRC avanzado o recurrente, se observó que los pacientes con mutaciones en el codón 12 presentaban una peor supervivencia general en comparación con los pacientes con KRAS de tipo salvaje, mientras que las mutaciones en el codón 13 no exhibieron un impacto estadísticamente significativo en la supervivencia^[54]. Un examen más detallado en pacientes con CCRC avanzado y recurrente reveló que, entre las cinco mutaciones más comunes del codón 12, G12D y G12V se asociaron de forma independiente con una peor supervivencia general después del diagnóstico^[54]. Sin embargo, estudios más recientes no observaron una diferencia pronóstica entre KRAS G12D y otras mutaciones de KRAS^[55],^[56]. En conjunto, estos hallazgos indican que la importancia pronóstica de KRAS G12D sigue siendo incierta y puede depender del contexto, variando con la población de pacientes, el estadio tumoral y las alteraciones moleculares concomitantes.

Nuestro análisis reveló diferencias significativas en la frecuencia de las mutaciones de KRAS G12 en el grupo DFCI que no se explicaron por las diferencias demográficas (sexo o edad) o patológicas (estadio tumoral y estado de MSI) con los otros dos grupos de estudio (Figuras 1 y 3).

Aunque las mutaciones de KRAS generalmente se consideran asociadas con los tumores MSS, nuestro análisis indicó que esto se aplica particularmente a las mutaciones de G12, ya que no encontramos diferencias significativas en la frecuencia de mutaciones en otros codones (G13, Q61, K117 y A146) entre los tumores MSS y los tumores con MSI/hipermutación (Figura 3). Además, un análisis más detallado reveló que la mutación de KRAS más frecuente, es decir, G12D, exhibió una incidencia similar en los CCRC MSS y los CCRC con MSI/hipermutación en dos de los conjuntos de datos (TCGA y MSKCC) (Figura 4). En contraste, G12V se encontró con mucha menor frecuencia, y la mutación G12C nunca se encontró en los cánceres con MSI/hipermutación a pesar de su fenotipo mutador, lo que destaca que el potencial oncogénico de estas dos mutaciones puede verse influenciado por el contexto genético de la célula.

Las mutaciones en el codón 13 de KRAS exhiben características distintivas. Específicamente, los mutantes del codón 13 afectan la hidrólisis e incrementan significativamente el intercambio intrínseco de nucleótidos en aproximadamente 10 veces ^[9]. Cabe destacar que se informó que el supresor tumoral NF1 se co-muta comúnmente en células con mutación en KRAS G13, pero rara vez se muta en cánceres con mutaciones en el codón 12 o 61 de KRAS ^[47]. Interesantemente, la proteína GAP de NF1 es inactiva contra KRAS G12 y KRAS mutado en Q61; sin embargo, estimula la hidrólisis de GTP cuando se une a KRAS G13D. Los resultados sugirieron que las células mutantes de KRAS G13D también pueden responder a los inhibidores de EGFR de manera dependiente de NF1. La observación clínica de que el CRC con KRAS G13D puede responder a la inhibición de EGFR podría explicarse por la mayor sensibilidad a la hidrólisis de GTP estimulada por NF1. En presencia de un NF1 activo y funcional, las células cancerosas de KRAS G13D pueden tener niveles reducidos de GTP de KRAS y depender parcialmente de la señalización ascendente a través de EGFR u otras quinasas receptoras tirosina ^[47]. En nuestro análisis, no observamos un enriquecimiento significativo de las mutaciones de NF1 o RASA1 en asociación con algún codón específico de KRAS, lo que sugiere que la inactivación de NF1 no es un mecanismo recurrente para potenciar la oncogénesis impulsada por KRAS en el CRC. Además, las frecuencias de mutación tanto de NF1 como de RASA1 fueron similares a las de otros genes de longitud similar tanto en tumores MSS como en MSI/hipermutados, lo que sugiere que las mutaciones en estos genes no están sujetas a una fuerte selección para la tumorigénesis o la progresión tumoral. La mayor frecuencia de mutación de NF1 en tumores MSI/hipermutados probablemente refleja el fenotipo hipermutador subyacente en lugar de la selección funcional.

La glutamina-61 (Q61) se encuentra en la región switch-II del dominio de hidrólisis de GTP de KRAS (Fig. 2). Las mutaciones en este residuo perjudican tanto la hidrólisis intrínseca como la mediada por GAP de GTP. Estas mutaciones también aceleran la velocidad del intercambio de GDP-GTP, lo que lleva a una acumulación de la proteína mutante en el estado unido a GTP ^[9]. En particular, se ha demostrado que las mutaciones en Q61H y Q61L resultan en una reducción sustancial, de aproximadamente 40 a 80 veces, en la tasa de hidrólisis intrínseca en comparación con KRAS WT. Además, estas mutaciones exhibieron una disminución significativa en la tasa de hidrólisis estimulada por GAP en comparación con KRAS WT ^[9]. Sin embargo, la tasa estimulada por GAP para Q61L fue aproximadamente 15 veces mayor que su tasa intrínseca, lo que sugiere que una porción del mecanismo catalítico dependiente de GAP aún es parcialmente funcional en el mutante Q61L. En consonancia con estas observaciones, de manera similar a los mutantes G12 y A146, los tumores de CRC que albergan mutaciones en Q61 exhiben resistencia a la terapia anti-EGFR, lo que sugiere que estas mutaciones perjudican la respuesta a la hidrólisis estimulada por GAP in vivo ^[57].

Las mutaciones en el codón 117 de KRAS, aunque menos frecuentes que las de los codones 12, 13 o 61, representan una clase distinta de alteraciones activadoras. La mutación K117N promueve la activación constitutiva de KRAS a través de un intercambio de nucleótidos mejorado y una hidrólisis de GTP reducida, aunque en menor medida que los mutantes G12 o Q61 ^[58]. Bioquímicamente, las mutaciones K117 exhiben un deterioro moderado en la hidrólisis de GTP estimulada por GAP y un aumento en la unión a efectores como RAF, lo que respalda su potencial oncogénico. Funcionalmente, confieren una señalización independiente del factor de crecimiento, aunque a menudo con una menor actividad transformadora que las mutaciones G12 clásicas ^[9]. Clínicamente, el valor predictivo de las mutaciones K117 para la terapia anti-EGFR sigue siendo ambiguo. Algunos análisis retrospectivos han incluido K117 entre las mutaciones RAS no canónicas asociadas con la resistencia al bloqueo de EGFR, aunque la evidencia es limitada debido a la baja incidencia de esta mutación ^[59]. La frecuencia relativamente baja y el fenotipo bioquímico intermedio de las mutaciones K117 resaltan la necesidad de estudios mecanicistas y una estratificación clínica adicionales.

Las mutaciones en el codón A146 de KRAS exhiben características distintas. Un estudio realizado por Poulin et al. reveló que la mutación KRAS A146T mostró una actividad de hidrólisis de GTP intrínseca in vitro similar a la de KRAS G12D, pero considerablemente menor que la de KRAS WT. Sin embargo, la hidrólisis de GTP mediada por GAP se vio significativamente perjudicada para KRAS G12D, pero solo ligeramente perjudicada para KRAS A146T. Además, las mutaciones en KRAS A146 condujeron a un aumento en el intercambio de nucleótidos mediado por GEF sin afectar la actividad de GAP ^[60]. Los datos sobre el efecto del tratamiento anti-EGFR en pacientes con CRC que albergan una mutación KRAS A146 son contradictorios. Algunos estudios han descrito un resultado clínico más favorable en pacientes con CRC que presentan un tumor mutado en KRAS A146 cuando se someten a tratamiento anti-EGFR, en comparación con pacientes con tumores que presentan otras mutaciones de KRAS ^[61]. Por el contrario, otros estudios han demostrado que los tumores con una mutación KRAS A146 están asociados con resistencia a la terapia anti-EGFR ^[59], ^[62].

A partir de junio de 2025, solo adagrasib y sotorasib han sido aprobados por la FDA para tratar a pacientes con CRC. Adagrasib (Krazati) fue aprobado por la FDA para el CRC localmente avanzado o metastásico mutado en KRAS G12C el 21 de junio de 2024. La aprobación se otorgó para su uso en combinación con cetuximab (Erbitux) en pacientes que previamente habían sido tratados con quimioterapia basada en fluoropirimidina, oxaliplatino e irinotecán ^[63]. Sotorasib (Lumakras) en combinación con panitumumab (Vectibix) fue aprobado por la FDA para el CRC el 16 de enero de 2025. Esta aprobación fue específicamente para pacientes adultos con CRC metastásico mutado en KRAS G12C, que han recibido previamente quimioterapia basada en fluoropirimidina, oxaliplatino e irinotecán ^[64]. La Agencia Europea de Medicamentos (EMA) aún no ha aprobado ni sotorasib ni adagrasib para el tratamiento del CRC, aunque estos agentes pueden ser accesibles a través de ensayos clínicos o uso compasivo. A pesar de su aprobación, estos dos inhibidores se dirigen exclusivamente a la rara mutación KRAS G12C, que ocurre en aproximadamente el 3% de los casos de CRC MSS y no se encuentra en los casos de MSI/hipermutados (Fig. 4), lo que limita su aplicabilidad para la gran mayoría de los pacientes con CRC.

De los 156 ensayos clínicos, 52 evaluaron compuestos que se dirigen exclusivamente a KRAS G12C (Fig. 9), a pesar de la muy baja incidencia de esta mutación en el CRC. Esto se debe principalmente al desarrollo y la aprobación regulatoria más tempranos de los inhibidores de G12C, que fueron pioneros en el interés por KRAS como un objetivo farmacológico. Estos agentes demostraron actividad en modelos preclínicos de CRC y eficacia clínica en NSCLC, lo que impulsó su evaluación en otros tumores mutados en KRAS G12C, incluido el CRC.

A pesar de las limitaciones actuales de los inhibidores de G12C, el panorama terapéutico para el cáncer colorrectal mutado en KRAS está evolucionando rápidamente. Un gran y creciente número de ensayos clínicos están actualmente en curso (Fig. 9), investigando nuevos agentes diseñados para dirigirse a otras mutaciones de KRAS más prevalentes, como G12D, G12V y G13D. Estos esfuerzos reflejan un cambio importante en el desarrollo de fármacos, pasando de un enfoque estrecho en G12C para abordar el espectro más amplio de alteraciones de KRAS que representan la mayoría de los casos de CRC mutado en KRAS. En particular, la aparición de inhibidores pan-RAS y RAS(ON) representa un avance significativo. Estos agentes están diseñados para inhibir múltiples isoformas de KRAS mutantes o para dirigirse a KRAS en su estado activo, unido a GTP, superando así las limitaciones específicas de la mutación de los compuestos anteriores. Varios de estos nuevos inhibidores ya se encuentran en ensayos clínicos de fase 1 y 2 (Fig. 9), y los resultados iniciales sugieren que pueden ofrecer beneficios clínicos significativos para una proporción mucho mayor de pacientes con CRC.

Varios ensayos también están evaluando terapias de combinación, como la combinación de inhibidores de KRAS con EGFR, SHP2 o bloqueo de puntos de control inmunitario, para superar la resistencia y mejorar las tasas de respuesta. Además, las estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a KRAS mutante están ganando impulso. Se están investigando activamente enfoques como vacunas peptídicas, vacunas de ARNm y terapias de receptores de células T (TCR) en entornos clínicos. Estas terapias tienen como objetivo aprovechar el sistema inmunitario para reconocer y eliminar específicamente las células tumorales mutadas en KRAS, ofreciendo nuevas esperanzas para respuestas duraderas.

En conjunto, estos esfuerzos en curso pueden marcar una nueva era en el manejo del CRC mutado en KRAS. La diversidad y la escala de los ensayos clínicos actuales reflejan un fuerte compromiso e interés en superar los desafíos históricos de la focalización de KRAS. A medida que estas nuevas terapias avancen en el desarrollo clínico, existe un optimismo creciente de que pronto estarán disponibles opciones de tratamiento efectivas e inclusivas para las mutaciones para una población mucho más amplia de pacientes con CRC.

Nuestro estudio proporciona una descripción general completa y actualizada de las mutaciones de KRAS y las estrategias terapéuticas en el cáncer colorrectal, integrando grandes conjuntos de datos disponibles públicamente con información seleccionada de múltiples bases de datos y registros de ensayos clínicos. Una de las principales fortalezas es el enfoque sistemático para hacer referencia cruzada a los compuestos, los ensayos clínicos y las frecuencias de mutación, con una estratificación cuidadosa de los casos MSS frente a MSI, lo que mejora la precisión y la relevancia clínica. Nuestro trabajo también destaca patrones de co-mutación clínicamente significativos y contextualiza los esfuerzos terapéuticos en curso, ofreciendo valor como un recurso y una referencia para el campo. En conjunto, nuestro análisis integrador destaca la importancia de la caracterización específica del codón y del contexto de las mutaciones de KRAS para guiar la oncología de precisión en el CRC. Sin embargo, reconocemos varias limitaciones. Primero, el estudio se basa en conjuntos de datos disponibles públicamente, que, aunque son grandes y válidos para este tipo de análisis, no son de base poblacional y, por lo tanto, están sujetos a sesgos de selección; las frecuencias de mutación pueden no reflejar completamente las observadas en cohortes derivadas de la población no seleccionada. En segundo lugar, las anotaciones de la base de datos pueden ser incompletas o inconsistentes y, a pesar de la extensa referencia cruzada, es posible que algunos compuestos o ensayos no se hayan incluido debido a las prácticas de indexación o a las normas de presentación variables. Finalmente, las terapias dirigidas a KRAS son un campo en rápida evolución, y es probable que surjan compuestos y ensayos clínicos adicionales en el futuro cercano.

En resumen, nuestro estudio confirma el conocimiento establecido e identifica nuevas perspectivas sobre las mutaciones de KRAS en el CRC. Las mutaciones de KRAS son muy prevalentes en el CRC, y afectan con mayor frecuencia los codones 12 y 13, y con menos frecuencia los codones 61, 117 y 146. Su alta concordancia entre las lesiones primarias y metastásicas refleja un origen clonal temprano. Nuestro análisis muestra que la distribución de las mutaciones difiere drásticamente según el estado de inestabilidad de microsatélites. Los tumores MSS albergan con frecuencia co-mutaciones KRAS–PIK3CA. En los CRC primarios MSS, las mutaciones de KRAS co-ocurren con frecuencia con las mutaciones de PIK3CA. Este patrón de co-mutación podría ser clínicamente significativo, ya que la focalización de KRAS por sí sola puede no ser suficiente para inhibir el crecimiento tumoral. En contraste con los informes anteriores, no encontramos ninguna asociación entre las mutaciones de KRAS G13 y las mutaciones de NF1; las alteraciones de NF1 se vincularon en cambio a los tumores MSI/hipermutados a tasas similares a las de otros genes grandes. Terapéuticamente, los inhibidores aprobados por la FDA actualmente se dirigen solo a KRAS G12C, una variante rara en el CRC MSS y prácticamente ausente en el CRC MSI. Sin embargo, el panorama del tratamiento se está expandiendo rápidamente para incluir inhibidores de alelos de KRAS más comunes (por ejemplo, G12D, G12V, G13D), agentes pan-RAS y RAS(ON) e inmunoterapias como vacunas y terapias basadas en TCR.

Métodos

Conjuntos de datos de cáncer colorrectal

Se obtuvieron datos mutacionales y clínicos de dos fuentes principales: el Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer (COSMIC)^[38] y las cohortes de cáncer colorrectal accesibles desde cBioportal^[65]. Se accedió a tres cohortes: DFCI (619 cánceres colorrectales primarios)^[40], TCGA Pancancer (594 muestras de cáncer colorrectal primario)^[41] y MSKCC (601 muestras de cáncer colorrectal primario y 533 metástasis)^[42]. Durante la preparación de este manuscrito, se puso a disposición un conjunto de datos más amplio del estudio MSK-CHORD^[48]. Este conjunto de datos pancanceroso incluyó 5543 muestras de cáncer colorrectal del MSKCC, algunas de las cuales se superponían con las utilizadas en nuestro análisis. Sin embargo, la información clínica asociada al conjunto de datos carecía de la edad de los pacientes en el momento del diagnóstico (en su lugar, proporcionaba su edad actual, que difería de los conjuntos de datos superpuestos publicados anteriormente), y la información sobre el estadio era menos detallada que la de los conjuntos de datos utilizados en nuestro análisis. Estas limitaciones dificultaron la integración de los datos de MSK-CHORD con los otros conjuntos de datos. Lo que es más importante, el número significativamente mayor de muestras en el conjunto de datos de MSK-CHORD en comparación con los conjuntos de datos de DFCI y TCGA introduciría un sesgo sustancial en los análisis. Por lo tanto, decidimos no incluir el conjunto de datos de MSK-CHORD en este estudio. No obstante, utilizamos este conjunto de datos para validar observaciones como las asociaciones de co-mutación y la falta de asociación entre las mutaciones de KRAS G13 y NF1.

Se excluyeron sesenta y seis casos de la cohorte TCGA y un caso de la cohorte MSKCC que no tenían información mutacional de los análisis posteriores. Los datos no incluían información sobre el sexo biológico de dos pacientes, es decir, TCGA-M5-AAT5 y TCGA-M5-AATA. El sexo biológico de estos pacientes (mujer y hombre, respectivamente) se infirió a partir del perfil de metilación del cromosoma X, obtenido del GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Catorce casos de TCGA y 56 casos de DFCI no incluían información sobre el estadio tumoral. En los casos de TCGA, el estadio tumoral se pudo determinar a partir de la información TNM mediante la revisión individual de sus informes de patología, a los que se accedió desde el GDC Data Portal. Para los 56 casos de DFCI, los informes de patología no estaban disponibles públicamente y, por lo tanto, no se pudo determinar el estadio tumoral. El conjunto de datos combinado contenía 2287 cánceres colorrectales. Los casos se clasificaron como MSS o MSI en función del estado de MSI anotado: DFCI (438 MSS, 91 MSI-alto, 90 no determinados) y MSKCC (701 MSS, 105 MSI y 328 no determinados o inconclusos). Los casos de TCGA con una puntuación MSI MANTIS superior a 0,4 se clasificaron como MSI. Los tumores hipermutados se identificaron en función de su carga de mutación tumoral no sinónima (TMB). Las muestras de DFCI y TCGA con una TMB superior a 14 mutaciones por Mb se consideraron hipermutadas, mientras que para las muestras de MSKCC se aplicó un umbral de TMB de 25 mutaciones por Mb, como se informó anteriormente^[41]. Las diferentes umbrales se justificaron por la diferencia en la TMB entre las cohortes (Figura S8 del material suplementario), lo que resultó del uso de diferentes estrategias de secuenciación. Los conjuntos de datos de TCGA y DFCI se analizaron mediante secuenciación del exoma completo (WES), mientras que las muestras de MSKCC se secuenciaron utilizando paneles dirigidos enriquecidos en genes relacionados con el cáncer (IMPACT-341 para 214 muestras, IMPACT-410 para 910 muestras e IMPACT-468 para nueve muestras). Para todos los análisis, los casos se clasificaron en MSS y MSI/hipermutados, siguiendo la clasificación propuesta por TCGA^[4].

Análisis de co-mutación

Se obtuvieron datos mutacionales de cBioportal^[65]. El estudio se centró en los 341 genes analizados en todas las muestras (los incluidos en el panel de secuenciación IMPACT-341) (supplementarytables.zip). Para cada par de genes (A y B), se calculó la frecuencia de co-mutación condicional (CCMF) como el porcentaje de muestras con mutaciones en el gen A que también tenían mutaciones en el gen B (CCMF = 100 x (NAB/NA), donde NAB es el número de muestras con mutaciones en ambos genes A y B, y NA es el número de muestras mutadas en el gen A). El análisis estadístico de las co-mutaciones se realizó utilizando la prueba exacta de Fisher en tablas de contingencia para los análisis univariados, o mediante regresión logística seguida de la prueba post hoc de diferencias significativas honestas de Tukey (Tukey’s HSD) para los análisis multivariados. Para representar gráficamente las razones de probabilidad (OR) con valores extremos (como cuando son iguales a cero o infinito), utilizamos el coeficiente de asociación de Yule, que es una transformación normalizada de la razón de probabilidad (Q = (OR - 1)/(OR + 1)). Un valor de Q de +1 indica una co-ocurrencia perfecta, -1 indica una exclusión mutua perfecta y 0 indica que no hay asociación. A diferencia de las OR, el Q_ de Yule comprime los tamaños de efecto grandes y evita las singularidades, lo que proporciona comparaciones más interpretables y visualmente estables entre los genes con frecuencias de mutación muy diferentes.

Representación 3D de KRAS

La estructura de KRAS de tipo salvaje unida a GDP se obtuvo de la ref. ^[66] (ID: 5W22), disponible en la base de datos PDB (http://www.rcsb.org)^[67] y se representó utilizando Mol*^[68].

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el lenguaje R para la computación estadística^[69]. La desviación de la normalidad se determinó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las variables distribuidas normalmente se analizaron con pruebas paramétricas (es decir, prueba t, ANOVA). Las variables no distribuidas normalmente se analizaron utilizando pruebas no paramétricas (prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, prueba de Kruskal-Wallis). Las diferencias en las proporciones se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher en tablas de contingencia para los análisis univariados o mediante regresión logística para los análisis multivariados. Las comparaciones por pares entre los niveles de las variables categóricas se evaluaron utilizando la función pairs del paquete emmeans, que aplica pruebas t por pares sobre las medias marginales, ajustadas para las comparaciones múltiples utilizando el método de Tukey. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando la prueba de sobre-representación PANTHER (https://pantherdb.org/tools/). Los valores p nominales inferiores a 2 × 10-16 se resumieron como p-valor < 2 × 10-16. Cuando fue necesario, se realizó la corrección para las pruebas de hipótesis múltiples utilizando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR). Los valores p corregidos por FDR (denominados valores Q) inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Compilación de compuestos dirigidos a KRAS, ensayos clínicos y revisión bibliográfica

Se obtuvo información actualizada sobre las terapias dirigidas a Ras en el cáncer colorrectal consultando PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)^[70], el NCI Thesaurus (https://evsexplore.semantics.cancer.gov/), la base de datos ClinicalTrials (https://clinicaltrials.gov/) y el sitio web de notificaciones de aprobación de oncología (cáncer)/hematología del FDA (https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/oncology-cancer-hematologic-malignancies-approval-notifications), a 25 de marzo de 2025.

De la base de datos NCI Thesaurus, recuperamos 66 compuestos dirigidos a Ras (47 inhibidores, 11 vacunas, 6 TCR y 2 degradadores), 12 compuestos dirigidos a SHP2 y 4 compuestos dirigidos a SOS1. Para reducir la redundancia, no se consideraron las formas salinas de algunos fármacos (por ejemplo, divarasib adipato, rigosertib sódico, sorafenib tosilato, dabrafenib mesilato, lifirafenib maleato y regorafenib anhidro). Cabe destacar que la base de datos NCI Thesaurus enumeró los fármacos Paluratide y Ras Inhibitor LUNA18 bajo dos códigos diferentes (C206963 y C185876, respectivamente), cuando son el mismo compuesto (CID 166509683). Se encontraron veinticuatro compuestos terapéuticos dirigidos a KRAS, SOS1 o SHP2 que no estaban indexados en la base de datos NCI Thesaurus en la base de datos de ensayos clínicos y se añadieron manualmente, lo que aumentó el número de compuestos dirigidos a KRAS/SOS1/SHP2 a 106 (supplementarytables.zip). Cruzamos esta información con los ensayos clínicos que indicaban cáncer colorrectal, colon, recto, CRC o tumores sólidos en el campo de las condiciones, INTERVENCIONAL en el tipo de estudio y TRATAMIENTO en el propósito principal, recuperando 153 estudios en los que al menos uno de los 106 fármacos seleccionados había sido o está siendo probado. Observamos que tres estudios importantes, es decir, NCT06385925, NCT04330664 y NCT03785249, no se recuperaron utilizando esta estrategia porque no indicaban específicamente cáncer colorrectal o tumores sólidos en el campo de las condiciones. Estos estudios se añadieron manualmente a la lista, lo que dio como resultado un total de 156 ensayos clínicos (supplementarytables.zip). Para 11 ensayos clínicos sin información en el campo de la fecha de finalización, utilizamos la fecha de la última actualización publicada. Los artículos científicos que hacen referencia a estos ensayos clínicos se identificaron en PubMed (buscando en todos los campos) y PMC (buscando en el título, resumen o términos clave del cuerpo del texto).

Aprobación ética

No aplicable.

Conjuntos de datos de cáncer colorrectal

Los datos mutacionales y clínicos se obtuvieron de dos fuentes principales: el Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer (COSMIC)^[38] y las cohortes de cáncer colorrectal accesibles desde cBioportal^[65]. Se accedió a tres cohortes: DFCI (619 cánceres colorrectales primarios)^[40], TCGA Pancancer (594 muestras de cáncer colorrectal primario)^[41] y MSKCC (601 muestras de cáncer colorrectal primario y 533 metástasis)^[42]. Durante la preparación de este manuscrito, se puso a disposición un conjunto de datos más amplio del estudio MSK-CHORD^[48]. Este conjunto de datos pancanceroso incluyó 5543 muestras de cáncer colorrectal del MSKCC, algunas de las cuales se superponían con las utilizadas en nuestro análisis. Sin embargo, la información clínica asociada al conjunto de datos carecía de la edad de los pacientes en el momento del diagnóstico (en su lugar, proporcionaba su edad actual, que difería de los conjuntos de datos superpuestos publicados anteriormente), y la información sobre el estadio era menos detallada que la de los conjuntos de datos utilizados en nuestro análisis. Estas limitaciones dificultaron la integración de los datos de MSK-CHORD con los otros conjuntos de datos. Lo que es más importante, el número significativamente mayor de muestras en el conjunto de datos de MSK-CHORD en comparación con los conjuntos de datos de DFCI y TCGA introduciría un sesgo sustancial en los análisis. Por lo tanto, decidimos no incluir el conjunto de datos de MSK-CHORD en este estudio. No obstante, utilizamos este conjunto de datos para validar observaciones como las asociaciones de co-mutación y la falta de asociación entre las mutaciones de KRAS G13 y NF1.

Se excluyeron sesenta y seis casos de la cohorte TCGA y un caso de la cohorte MSKCC que no tenían información mutacional de los análisis posteriores. Los datos no incluían información sobre el sexo biológico de dos pacientes, es decir, TCGA-M5-AAT5 y TCGA-M5-AATA. El sexo biológico de estos pacientes (mujer y hombre, respectivamente) se infirió a partir del perfil de metilación del cromosoma X, obtenido del GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Catorce casos de TCGA y 56 casos de DFCI no incluían información sobre el estadio tumoral. En los casos de TCGA, el estadio tumoral se pudo determinar a partir de la información TNM mediante la revisión individual de sus informes de patología, a los que se accedió desde el GDC Data Portal. Para los 56 casos de DFCI, los informes de patología no estaban disponibles públicamente y, por lo tanto, no se pudo determinar el estadio tumoral. El conjunto de datos combinado contenía 2287 cánceres colorrectales. Los casos se clasificaron como MSS o MSI en función del estado de MSI anotado: DFCI (438 MSS, 91 MSI-alto, 90 no determinados) y MSKCC (701 MSS, 105 MSI y 328 no determinados o inconclusos). Los casos de TCGA con una puntuación MSI MANTIS superior a 0,4 se clasificaron como MSI. Los tumores hipermutados se identificaron en función de su carga de mutación tumoral no sinónima (TMB). Las muestras de DFCI y TCGA con una TMB superior a 14 mutaciones por Mb se consideraron hipermutadas, mientras que para las muestras de MSKCC se aplicó un umbral de TMB de 25 mutaciones por Mb, como se informó anteriormente^[41]. Las diferentes umbrales se justificaron por la diferencia en la TMB entre las cohortes (Figura S8 del material suplementario), lo que resultó del uso de diferentes estrategias de secuenciación. Los conjuntos de datos de TCGA y DFCI se analizaron mediante secuenciación del exoma completo (WES), mientras que las muestras de MSKCC se secuenciaron utilizando paneles dirigidos enriquecidos en genes relacionados con el cáncer (IMPACT-341 para 214 muestras, IMPACT-410 para 910 muestras e IMPACT-468 para nueve muestras). Para todos los análisis, los casos se clasificaron en MSS y MSI/hipermutados, siguiendo la clasificación propuesta por TCGA^[4].

Los datos de mutación se obtuvieron de cBioportal^[65]. El estudio se centró en los 341 genes analizados en todas las muestras (aquellos incluidos en el panel de secuenciación IMPACT-341) (supplementarytables.zip). Para cada par de genes (A y B), se calculó la frecuencia de co-mutación condicional (CCMF) como el porcentaje de muestras con mutaciones en el gen A que también presentaban mutaciones en el gen B (CCMF = 100 x (NAB/NA), donde NAB es el número de muestras con mutaciones en ambos genes A y B, y NA es el número de muestras con mutaciones en el gen A). El análisis estadístico de las co-mutaciones se realizó utilizando la prueba exacta de Fisher sobre tablas de contingencia para análisis univariados, o mediante regresión logística seguida de la prueba post-hoc de diferencias significativas honestas de Tukey (Tukey’s HSD) para análisis multivariados. Para representar gráficamente las razones de probabilidad (OR) con valores extremos (como cuando son iguales a cero o infinito), empleamos el coeficiente de asociación de Yule, que es una transformación normalizada de la razón de probabilidad (Q = (OR 1)/(OR + 1)). Un valor de Q de +1 indica una co-ocurrencia perfecta, -1 indica una exclusión mutua perfecta y 0 indica que no hay asociación. A diferencia de las OR, el Q_ de Yule comprime los tamaños de efecto grandes y evita las singularidades, proporcionando comparaciones más interpretables y visualmente estables entre genes con frecuencias de mutación muy diferentes.

Representación 3D de KRAS

La estructura de KRAS de tipo salvaje unida a GDP se obtuvo de la referencia ^[66] (ID: 5W22), disponible en la base de datos PDB (http://www.rcsb.org)^[67] y se representó utilizando Mol*^[68].

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el lenguaje R para la computación estadística^[69]. La desviación de la normalidad se determinó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las variables distribuidas normalmente se analizaron con pruebas paramétricas (es decir, prueba t, ANOVA). Las variables no distribuidas normalmente se analizaron utilizando pruebas no paramétricas (prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, prueba de Kruskal-Wallis). Las diferencias en las proporciones se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher sobre tablas de contingencia para análisis univariados o mediante regresión logística para análisis multivariados. Las comparaciones por pares entre los niveles de las variables categóricas se evaluaron utilizando la función pairs del paquete emmeans, que aplica pruebas t por pares sobre las medias marginales, ajustadas para comparaciones múltiples utilizando el método de Tukey. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando la prueba de sobre-representación PANTHER (https://pantherdb.org/tools/). Los valores p nominales inferiores a 2 × 10-16 se resumieron como p-valor < 2 × 10-16. Cuando fue necesario, se realizó una corrección para pruebas de hipótesis múltiples utilizando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR). Los valores p corregidos por FDR (denominados valores Q) inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Compilación de compuestos dirigidos a KRAS, ensayos clínicos y revisión bibliográfica

Se obtuvo información actualizada sobre las terapias dirigidas a Ras en el CCRC consultando PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)^[70], el Tesauro NCI (https://evsexplore.semantics.cancer.gov/), la base de datos ClinicalTrials (https://clinicaltrials.gov/) y el sitio web de notificaciones de aprobación de oncología (cáncer)/neoplasias hematológicas de la FDA (https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/oncology-cancer-hematologic-malignancies-approval-notifications), a fecha del 25 de marzo de 2025.

De la base de datos del tesauro NCI, se recuperaron 66 compuestos dirigidos a Ras (47 inhibidores, 11 vacunas, 6 TCR y 2 degradadores), 12 compuestos dirigidos a SHP2 y 4 compuestos dirigidos a SOS1. Para reducir la redundancia, no se consideraron las formas salinas de algunos fármacos (por ejemplo, divarasib adipato, rigosertib sódico, sorafenib tosilato, dabrafenib mesilato, lifirafenib maleato y regorafenib anhidro). Cabe destacar que la base de datos del tesauro NCI enumeró los fármacos Paluratide e Inhibidor de Ras LUNA18 bajo dos códigos diferentes (C206963 y C185876, respectivamente), cuando son el mismo compuesto (CID 166509683). Se encontraron veinticuatro compuestos terapéuticos dirigidos a KRAS, SOS1 o SHP2 que no estaban indexados en la base de datos del tesauro NCI en la base de datos de ensayos clínicos y se añadieron manualmente, lo que aumentó el número de compuestos dirigidos a KRAS/SOS1/SHP2 a 106 (supplementarytables.zip). Cruzamos esta información con los ensayos clínicos que indicaban cáncer colorrectal, colon, recto, CCRC o tumores sólidos en el campo Condiciones, INTERVENCIONAL en Tipo de estudio y TRATAMIENTO en Propósito principal, recuperando 153 estudios en los que al menos uno de los 106 fármacos seleccionados había sido o está siendo probado. Observamos que tres estudios importantes, es decir, NCT06385925, NCT04330664 y NCT03785249, no se recuperaron utilizando esta estrategia porque no indicaban específicamente cáncer colorrectal o tumores sólidos en el campo Condiciones. Estos estudios se añadieron manualmente a la lista, lo que dio como resultado un total de 156 ensayos clínicos (supplementarytables.zip). Para 11 ensayos clínicos sin información en el campo Fecha de finalización, utilizamos la Fecha de la última actualización publicada. Los artículos científicos que hacen referencia a estos ensayos clínicos se identificaron en PubMed (buscando en Todos los campos) y PMC (buscando en Título, Resumen o Términos clave del cuerpo).

Aprobación ética

No aplicable.