Consenso sobre las interacciones farmacológicas para la identificación de inhibidores de PLK2 en el tratamiento del cáncer colorrectal.

La quinasa similar a la polo 2 (PLK2), un miembro de la familia de quinasas similares a la polo (PLK1-PLK5), es una serina/treonina quinasa que desempeña un papel crucial en la regulación del ciclo celular y en la respuesta al estrés celular, particularmente fuera de la mitosis.[] La PLK2 ha surgido como un regulador crítico que conecta el control del ciclo celular con la señalización oncogénica.[],[] Predominantemente activa durante las fases G1 y S, la PLK2 participa en la iniciación de la duplicación del centrosoma y facilita la progresión temprana del ciclo celular.[],[] Estudios recientes han demostrado que la PLK2 promueve la progresión tumoral al activar p53 mutante, mejorar la resistencia a la quimioterapia e impulsar la proliferación de las células cancerosas, mientras que su regulación a la baja en ciertos contextos sugiere un posible papel supresor de tumores.[],[] Estos hallazgos destacan a la PLK2 como un regulador clave del mantenimiento genómico y la señalización del estrés, lo que sugiere su posible participación en la tumorigénesis y su potencial como objetivo terapéutico en el tratamiento del cáncer.

Estudios recientes han implicado aún más a la PLK2 como un oncogén dependiente del contexto en varios tumores sólidos, incluidos los cánceres de colon, páncreas y ovario.[],[] Si bien inicialmente se consideró un supresor de tumores debido a su participación en la respuesta al daño del ADN mediada por p53, se ha demostrado que la PLK2 promueve la progresión tumoral en entornos caracterizados por estrés oxidativo o señalización disfuncional de p53.[] En las células cancerosas, la PLK2 favorece la supervivencia al mejorar la resistencia a la quimioterapia y la adaptación redox a través de la fosforilación de efectores clave aguas abajo, como GSK3β y NRF2. Específicamente, la PLK2 fosforila a GSK3β en Ser9, suprimiendo su actividad y facilitando la translocación nuclear de NRF2.[] Además, la PLK2 fosforila a NRF2 en Ser40, fortaleciendo su interacción con p21Cip1 y activando la expresión de genes citoprotectores. Estas modificaciones mejoran la estabilidad mitocondrial y atenúan la necrosis dependiente de p53, lo que permite que las células cancerosas persistan bajo estrés metabólico y oxidativo.[] En el cáncer de colon (CRC), el eje de señalización PLK2/GSK3β/NRF2 desempeña un papel fundamental en la regulación de la homeostasis redox y en la promoción de la resistencia a la quimioterapia.[] Al mejorar la activación de NRF2, la PLK2 favorece la expresión de genes antioxidantes, lo que permite que las células cancerosas sobrevivan bajo estrés oxidativo y terapéutico.[] Clínicamente, se ha relacionado una mayor expresión de PLK2 con una peor respuesta al tratamiento y una reducción de la supervivencia global en pacientes con CRC.[] Estos hallazgos destacan a la PLK2 como un prometedor objetivo molecular para la intervención terapéutica en el CRC y otros cánceres impulsados por PLK2.

En los últimos años se han desarrollado varios inhibidores de PLK2.[],[] En la terapia contra el cáncer, el inhibidor pan-PLK BI-2536 ha completado la evaluación de la fase II y ha demostrado actividad antiproliferativa en varios tumores sólidos.[] Además, los compuestos C2 y C21 suprimen el crecimiento de las células cancerosas[], y el compuesto 7AO (ON1231320) induce el arresto mitótico y la apoptosis, lo que destaca su potencial terapéutico.[],[] Sin embargo, la mayoría de estos compuestos exhiben una selectividad limitada. Por ejemplo, BI-2536 inhibe CAMKIIα, SYK y STK16, lo que puede provocar posibles efectos fuera del objetivo.[] Por lo tanto, el diseño de nuevos inhibidores de PLK2 con alta selectividad es fundamental para futuras aplicaciones terapéuticas.

En este estudio, nuestro objetivo fue identificar nuevos inhibidores de PLK2 mediante el cribado virtual basado en la estructura, seguido de la validación experimental a través de ensayos enzimáticos y basados en células (Figura). Primero, se evaluaron todas las estructuras cristalinas de PLK2 disponibles mediante el redocking de sus ligandos cocristalizados. Se definieron las interacciones de consenso compartidas por múltiples inhibidores como interacciones farmacológicas. Estudios previos han demostrado que la identificación de interacciones esenciales para la unión ligando-quinasa ayuda a mejorar la tasa de éxito del cribado virtual.[] [] Por lo tanto, identificamos las interacciones farmacológicas clave para cada estructura utilizando inhibidores de PLK2 conocidos. Además, establecimos un modelo de consenso que integra las interacciones farmacológicas de múltiples estructuras para mejorar la precisión del cribado. Utilizando este modelo, se realizó el cribado de la biblioteca de compuestos ChemDiv y se seleccionaron los candidatos de mayor rango para su prueba de inhibición de PLK2 utilizando ensayos enzimáticos. El compuesto más activo se utilizó posteriormente para identificar análogos para el análisis de la relación estructura-actividad (SAR) y el perfilado de la selectividad. Finalmente, se evaluó el efecto de los inhibidores validados sobre la viabilidad y la proliferación de las células de cáncer de colon. En resumen, este estudio identificó nuevos inhibidores de PLK2 que sirven como prometedores puntos de partida para el desarrollo de terapias contra el cáncer dirigidas a PLK2.

Materiales y Métodos

Acoplamiento Molecular

El acoplamiento molecular se realizó utilizando Maestro con la configuración predeterminada.[] Las estructuras cristalinas de PLK2 se obtuvieron del Banco de datos de proteínas RCSB (PDB).[] Las estructuras se prepararon utilizando el Asistente de preparación de proteínas agregando átomos de hidrógeno, asignando cargas parciales a los residuos y eliminando las moléculas de agua. Se generó una cuadrícula de acoplamiento para cada estructura utilizando el módulo de generación de cuadrículas de receptor, centrada en el ligando cocristalizado. Los compuestos se prepararon para el acoplamiento utilizando el módulo LigPrep generando estructuras 3D y asignando átomos de hidrógeno y cargas. El acoplamiento se realizó utilizando GLIDE.[] Las interacciones entre los compuestos y los residuos de las proteínas se analizaron utilizando Pipeline Pilot.[]

Establecimiento del Modelo de Consenso

Se recopilaron inhibidores de PLK2 conocidos con valores de concentración inhibitoria media (IC50) inferiores a 10 μM de la base de datos ChEMBL[] para identificar las interacciones farmacológicas clave. De este conjunto, se seleccionaron 60 compuestos estructuralmente diversos para el análisis de acoplamiento. Estos compuestos se acoplaron en los sitios de unión de cada estructura de PLK2 seleccionada. Basándose en las puntuaciones de acoplamiento, los 30 inhibidores principales para cada estructura se utilizaron para identificar las interacciones farmacológicas clave. El análisis de interacción se realizó utilizando Pipeline Pilot. Las interacciones farmacológicas se definieron como interacciones de enlace de hidrógeno observadas en al menos el 50% de los inhibidores acoplados e interacciones hidrofóbicas observadas en al menos el 80% de los inhibidores acoplados. Se calculó una puntuación farmacológica para cada compuesto utilizando la siguiente ecuación: donde S(i) es la puntuación farmacológica del compuesto i, N(i) es el número de interacciones farmacológicas formadas por el compuesto i, y D(i) es la puntuación de acoplamiento del compuesto i. Los compuestos se clasificaron en función de sus puntuaciones farmacológicas. Para generar un modelo de consenso, se integraron las clasificaciones de las estructuras de PLK2 individuales. Para cada compuesto, se sumaron las clasificaciones de dos o más estructuras para calcular una puntuación de consenso. A continuación, los compuestos se reclasificaron en función de esta puntuación de consenso, y la clasificación final se utilizó para priorizar los posibles inhibidores de PLK2.

Preparación de la Biblioteca de Cribado

El cribado virtual se realizó utilizando la biblioteca de compuestos ChemDiv, que contiene aproximadamente 1,6 millones de compuestos. Primero, los compuestos se preprocesaron utilizando Pipeline Pilot. A continuación, se aplicó un filtro de cribado de alto rendimiento para eliminar los compuestos que contienen átomos no orgánicos o subestructuras reactivas. A continuación, se excluyeron los compuestos que violaban la regla de cinco de Lipinski[] o los criterios de Veber[], o que contenían compuestos de interferencia en el ensayo (PAINS). Además, se eliminaron los compuestos con una puntuación de estimación cuantitativa de la similitud con los fármacos (QED) inferior a 0,25. Los compuestos restantes se utilizaron para el cribado virtual de posibles inhibidores de PLK2.

Ensayo de Quinasa

La actividad inhibidora de la quinasa se midió utilizando un ensayo de unión de quinasa basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) LanthaScreen Eu (Thermo Fisher Scientific). En este ensayo, un tinte aceptor fluorescente se une a la quinasa, y se añade un anticuerpo etiquetado con Eu para detectar un sustrato fosforilado y etiquetado con fluorescencia. La quinasa etiquetada con fluorescencia, el anticuerpo y el compuesto de prueba se combinaron en un tampón adecuado y se incubaron. Después de la incubación, la mezcla se colocó en un lector de placas de fluorescencia capaz de detectar las señales de FRET. La eficiencia de FRET se calculó comparando la relación entre la emisión del aceptor y la emisión del donante. Los compuestos seleccionados se evaluaron a concentraciones especificadas, y los valores de IC50 se determinaron utilizando el software GraphPad Prism. Cada ensayo de actividad de la quinasa se realizó por duplicado y siguió las directrices de control de calidad de Thermo Fisher Scientific. El perfilado de la quinasa se realizó utilizando el servicio SelectScreen Kinase de Thermo Fisher, empleando formatos de ensayo complementarios (Adapta y Z LYTE) según sea necesario. La información detallada sobre estos protocolos de ensayo está disponible en el sitio web de Thermo Fisher Scientific (Adapta: www.thermofisher.com/adapta; Z LYTE: www.thermofisher.com/z-lyte). La selectividad del compuesto se evaluó utilizando el servicio de perfilado de quinasa de Eurofins.

Cultivo Celular

La línea celular humana de CRC HT-29 se obtuvo del Banco de cultivos tipo americano (HTB-38, RRID: CVCL0320, ATCC, VA), mientras que HCT-116 se obtuvo del Centro de investigación y colección de recursos biológicos (Cat#60349, RRID: CVCL0291, BCRC, Hsinchu, Taiwán). Ambas líneas celulares se cultivaron en un medio McCoy’s 5A suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.

Análisis de la Viabilidad Celular

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 × 103 células/pocillo. Después de permitir que las células se adhirieran durante la noche, se trataron con concentraciones de compuestos de prueba a 0,3, 1, 3, 10 y 30 μM durante 72 h. Después del tratamiento, se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). El reactivo MTT (0,5 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) se añadió a cada pocillo en una proporción de volumen de 1:10, y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, se añadió 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo para solubilizar los cristales de formazán formados por las células viables. La absorbancia se midió a 550 nm utilizando un lector de microplacas (lector ELISA Synergy HTX, Bioteck, CA). Los valores de IC50 se calcularon en función de la viabilidad celular.

Ensayo de Proliferación Celular BrdU

Para evaluar el efecto de los compuestos de prueba sobre la proliferación celular, se utilizó un kit de ensayo de proliferación celular BrdU (MerckMillipore, Darmstadt, Alemania). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 × 103 células/pocillo. Después de permitir que las células se adhirieran durante la noche, se trataron con concentraciones de compuestos de prueba a 0,3, 1, 3, 10 y 30 μM durante 72 h. Veinte y cuatro horas antes del punto final, se añadió 10 μM de BrdU a cada pocillo y se incubó a 37 °C para etiquetar el ADN recién sintetizado. Después de la incubación, el medio que contenía BrdU se eliminó y las células se fijaron con 200 μL de solución de fijación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido de la adición de 100 μL de anticuerpo monoclonal anti-BrdU. Después de lavar, se añadió 100 μL de anticuerpo secundario anti-IgG de cabra a cada pocillo. Después de lavados adicionales, se añadió 100 μL de sustrato TMB para desarrollar el color. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas. La proliferación celular se cuantificó en función de la incorporación de BrdU, y los valores de concentración inhibitoria media (GI50) se calcularon en consecuencia.

Ensayo de Formación de Colonias

Se sembraron células en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 103 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con las concentraciones indicadas del compuesto de prueba y se incubaron durante 12 días para permitir la formación de colonias. Después del tratamiento, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron suavemente con PBS. A continuación, las colonias se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de tinte lavando con agua corriente y se dejaron secar las placas al aire. A continuación, se contaron las colonias visualmente a simple vista bajo un microscopio óptico, considerando solo como colonias válidas los grupos que contenían más de 50 células.

Western Blotting

Se sembraron células en placas de 6 cm a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, las células se trataron con las concentraciones indicadas del compuesto de prueba durante 2 horas. Tras el tratamiento, se recogieron los lisados proteicos totales utilizando un tampón RIPA suplementado con inhibidores de fosfatasas (2 mM Na3VO4, 1 mM NaF y 20 mM NaP2O4) y un cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C y se determinaron las concentraciones de proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.

Para la preparación de las muestras, los lisados proteicos se mezclaron con un tampón de muestra (312,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol, 0,05% azul de bromofenol y 10% 2-mercaptoetanol) y se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos. Se resolvieron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada en TBST (tampón Tris con 0,1% de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en TBST. Al día siguiente, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: fosfo-GSK3β (Ser9) y GSK3β total (Cell Signaling Technology, MA) y GAPDH (MAB374, Millipore, Bedford, MA). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP, antirrabbit IgG (111-035-003) y antimouse IgG (115-035-003), se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch (PA). Las bandas de proteína se visualizaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se obtuvieron imágenes con un sistema eBLOT. La cuantificación de los niveles de expresión de proteínas se realizó utilizando el software ImageJ.

Matriz de Similitud

Las moléculas se procesaron utilizando RDKit[] en Python. Se utilizó ECFP con un radio de 2 y un tamaño de bits de 2048. Se seleccionaron un total de 30 moléculas estructuralmente diversas de la biblioteca ChEMBL. Al añadir las moléculas "hit", se generó una matriz de similitud de Tanimoto[] entre cada par de moléculas. A continuación, se generó un mapa de clústeres de los resultados utilizando el paquete de trazado de Python Seaborn.[]

Análisis Estadístico

Se aplicaron pruebas estadísticas cuantitativas solo cuando cada grupo experimental consistía en al menos cinco muestras. Los resultados de los grupos con menos de cinco réplicas se presentan con fines descriptivos y se indican como datos cualitativos. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) o como un porcentaje del control, según corresponda para el conjunto de datos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 10 (Graphpad Inc.). Las diferencias entre los grupos experimentales y de control se analizaron utilizando la prueba t de Student (de dos colas cuando corresponde), con un umbral de p < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Para las comparaciones entre más de dos grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor. Cuando el ANOVA indicó una diferencia significativa, se realizó la prueba post hoc de Tukey para determinar qué diferencias específicas entre grupos eran significativas (utilizando p < 0,05 como criterio de significación).

Acoplamiento Molecular

Se realizó el acoplamiento molecular utilizando Maestro con la configuración predeterminada.[] Las estructuras cristalinas de PLK2 se obtuvieron del Banco de Datos de Proteínas RCSB (PDB).[] Las estructuras se prepararon utilizando el Asistente de Preparación de Proteínas, añadiendo átomos de hidrógeno, asignando cargas parciales a los residuos y eliminando las moléculas de agua. Se generó una rejilla de acoplamiento para cada estructura utilizando el módulo de Generación de Rejilla de Receptor, centrada en el ligando cocristalizado. Los compuestos se prepararon para el acoplamiento utilizando el módulo LigPrep, generando estructuras 3D y asignando átomos de hidrógeno y cargas. El acoplamiento se realizó utilizando GLIDE.[] Se analizaron las interacciones entre los compuestos y los residuos de proteína utilizando Pipeline Pilot.[]

Establecimiento de un Modelo de Consenso

Se recogieron inhibidores de PLK2 conocidos con valores de concentración inhibitoria media (IC50) inferiores a 10 µM de la base de datos ChEMBL[] para identificar las interacciones farmacológicas clave. De este conjunto, se seleccionaron 60 compuestos estructuralmente diversos para el análisis de acoplamiento. Estos compuestos se acoplaron a los sitios de unión de cada estructura de PLK2 seleccionada. Basándose en las puntuaciones de acoplamiento, se utilizaron los 30 inhibidores principales para cada estructura para identificar las interacciones farmacológicas clave. El análisis de interacción se realizó utilizando Pipeline Pilot. Las interacciones farmacológicas se definieron como interacciones de enlace de hidrógeno observadas en al menos el 50% de los inhibidores acoplados e interacciones hidrofóbicas observadas en al menos el 80% de los inhibidores acoplados. Se calculó una puntuación farmacológica para cada compuesto utilizando la siguiente ecuación: donde S(i) es la puntuación farmacológica del compuesto i, N(i) es el número de interacciones farmacológicas formadas por el compuesto i y D(i) es la puntuación de acoplamiento del compuesto i. Los compuestos se clasificaron en función de sus puntuaciones farmacológicas. Para generar un modelo de consenso, se integraron las clasificaciones de las estructuras individuales de PLK2. Para cada compuesto, se sumaron las clasificaciones en dos o más estructuras para calcular una puntuación de consenso. A continuación, se reclasificaron los compuestos en función de esta puntuación de consenso y la clasificación final se utilizó para priorizar los posibles inhibidores de PLK2.

Preparación de la Biblioteca de Cribado

Se realizó un cribado virtual utilizando la biblioteca de compuestos ChemDiv, que contiene aproximadamente 1,6 millones de compuestos. Primero, los compuestos se preprocesaron utilizando Pipeline Pilot. A continuación, se aplicó un filtro de cribado de alto rendimiento para eliminar los compuestos que contienen átomos no orgánicos o subestructuras reactivas. A continuación, se excluyeron los compuestos que violaban la regla de los cinco de Lipinski[] o los criterios de Veber[], o que contenían compuestos de interferencia en el ensayo (PAINS). Además, se eliminaron los compuestos con una estimación cuantitativa de la similitud con los fármacos (QED) inferior a 0,25. Los compuestos restantes se utilizaron para el cribado virtual de posibles inhibidores de PLK2.

Ensayo de Quinasa

Se midió la actividad inhibidora de la quinasa utilizando un ensayo de unión de quinasa basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) LanthaScreen (Thermo Fisher Scientific). En este ensayo, un tinte aceptor fluorescente se une a la quinasa y se añade un anticuerpo antitag etiquetado con Eu para detectar un sustrato fosforilado y etiquetado con fluorescencia. La quinasa etiquetada con fluorescencia, el anticuerpo y el compuesto de prueba se combinaron en un tampón adecuado y se incubaron. Después de la incubación, la mezcla se colocó en un lector de placas de fluorescencia capaz de detectar las señales de FRET. La eficiencia de FRET se calculó comparando la relación entre la emisión del aceptor y la emisión del donante. Los compuestos seleccionados se evaluaron a concentraciones especificadas y se determinaron los valores de IC50 utilizando el software GraphPad Prism. Cada ensayo de actividad de la quinasa se realizó por duplicado y siguió las directrices de control de calidad de Thermo Fisher Scientific. El perfil de la quinasa se realizó utilizando el servicio SelectScreen Kinase de Thermo Fisher, empleando formatos de ensayo complementarios (Adapta y Z LYTE) según sea necesario. La información detallada sobre estos protocolos de ensayo está disponible en el sitio web de Thermo Fisher Scientific (Adapta: www.thermofisher.com/adapta; Z LYTE: www.thermofisher.com/z-lyte). La selectividad del compuesto se evaluó utilizando el servicio de perfil de quinasa de Eurofins.

Cultivo Celular

La línea celular de CRC humana HT-29 se obtuvo del Banco de Cultivos de Tipos de Células Americanos (HTB-38, RRID: CVCL0320, ATCC, VA), mientras que HCT-116 se obtuvo del Centro de Colección y Investigación de Bio recursos (Cat#60349, RRID: CVCL0291, BCRC, Hsinchu, Taiwán). Ambas líneas celulares se cultivaron en un medio McCoy's 5A suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (SFB), 100 unidades/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.

Análisis de Viabilidad Celular

Se sembraron células en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 × 103 células/pocillo. Después de dejar que las células se adhirieran durante la noche, se trataron con concentraciones de compuestos de prueba de 0,3, 1, 3, 10 y 30 µM durante 72 horas. Tras el tratamiento, se evaluó la viabilidad celular utilizando el ensayo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT). El reactivo MTT (0,5 mg/mL en tampón fosfato salino (PBS)) se añadió a cada pocillo en una proporción de volumen de 1:10 y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, se añadió 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo para solubilizar los cristales de formazán formados por las células viables. La absorbancia se midió a 550 nm utilizando un lector de microplacas (lector ELISA Synergy HTX, Bioteck, CA). Los valores de IC50 se calcularon en función de la viabilidad celular.

Ensayo de Proliferación Celular BrdU

Para evaluar el efecto de los compuestos de prueba sobre la proliferación celular, se utilizó un kit de ensayo de proliferación celular BrdU (MerckMillipore, Darmstadt, Alemania). Se sembraron células en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 × 103 células/pocillo. Después de dejar que las células se adhirieran durante la noche, se trataron con concentraciones de compuestos de prueba de 0,3, 1, 3, 10 y 30 µM durante 72 horas. Veinticuatro horas antes del punto final, se añadió 10 µM de BrdU a cada pocillo y se incubó a 37 °C para etiquetar el ADN sintetizado recientemente. Después de la incubación, se retiró el medio que contenía BrdU y las células se fijaron con 200 µL de solución de fijación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido de la adición de 100 µL de anticuerpo monoclonal anti-BrdU. Después del lavado, se añadió 100 µL de anticuerpo secundario anti-IgG de cabra a cada pocillo. Tras lavados adicionales, se añadió 100 µL de sustrato TMB para desarrollar el color. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas. La proliferación celular se cuantificó en función de la incorporación de BrdU y se calcularon los valores de concentración inhibitoria media (GI50) en consecuencia.

Ensayo de Formación de Colonias

Se sembraron células en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 103 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con las concentraciones indicadas del compuesto de prueba y se incubaron durante 12 días para permitir la formación de colonias. Después del tratamiento, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron suavemente con PBS. A continuación, las colonias se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de tinte lavando con agua corriente y se dejaron secar las placas al aire. A continuación, se contaron las colonias visualmente a simple vista bajo un microscopio óptico, considerando solo como colonias válidas los grupos que contenían más de 50 células.

Western Blotting

Se sembraron células en placas de 6 cm a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, las células se trataron con las concentraciones indicadas del compuesto de prueba durante 2 horas. Tras el tratamiento, se recogieron los lisados proteicos totales utilizando un tampón RIPA suplementado con inhibidores de fosfatasas (2 mM Na3VO4, 1 mM NaF y 20 mM NaP2O4) y un cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C y se determinaron las concentraciones de proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.

Para la preparación de las muestras, los lisados proteicos se mezclaron con el tampón de muestra (312,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol, 0,05% azul de bromofenol y 10% 2-mercaptoetanol) y se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos. Se resolvieron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada en TBST (tampón salino con Tris al 0,1% de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en TBST. Al día siguiente, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: fosfo-GSK3β (Ser9) y GSK3β total (Cell Signaling Technology, MA) y GAPDH (MAB374, Millipore, Bedford, MA). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP, antirrabbit IgG (111-035-003) y antimouse IgG (115-035-003), se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch (PA). Las bandas de proteína se visualizaron utilizando un kit de detección de quimiluminiscencia mejorada (ECL) y se obtuvieron imágenes con un sistema eBLOT. La cuantificación de los niveles de expresión de la proteína se realizó utilizando el software ImageJ.

Matriz de similitud

Las moléculas se procesaron utilizando RDKit[] en Python. Se utilizó ECFP con un radio de 2 y un tamaño de bits de 2048. Se seleccionaron un total de 30 moléculas estructuralmente diversas de la biblioteca ChEMBL. Al añadir las moléculas "hit", se generó una matriz de similitud de Tanimoto[] entre cada par de moléculas. A continuación, se generó un mapa de clústeres de los resultados utilizando el paquete de trazado de Python, Seaborn[].

Análisis estadístico

Las pruebas estadísticas cuantitativas solo se aplicaron cuando cada grupo experimental constaba de al menos cinco muestras. Los resultados de los grupos con menos de cinco réplicas se presentan con fines descriptivos y se indican como datos cualitativos. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) o como un porcentaje del control, según corresponda para el conjunto de datos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 10 (Graphpad Inc.). Las diferencias entre los grupos experimentales y de control se analizaron utilizando la prueba t de Student (de dos colas cuando corresponde), con un umbral de p < 0,05 considerado estadísticamente significativo. Para las comparaciones entre más de dos grupos, se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Cuando el ANOVA indicó una diferencia significativa, se realizó la prueba post hoc de Tukey para determinar qué diferencias específicas entre los grupos eran significativas (utilizando p < 0,05 como criterio de significación).

Resultados

Evaluación del protocolo de acoplamiento y las estructuras de PLK2

Para identificar las estructuras de proteína PLK2 adecuadas para el cribado virtual, se obtuvieron todas las estructuras disponibles de PLK2 del PDB para el análisis de reacoplamiento. Cada una de estas estructuras contiene un ligando cocristalizado dentro del sitio de unión. Este enfoque se utilizó para evaluar la fiabilidad estructural de cada estructura mediante la evaluación de su capacidad para reproducir la pose de unión cocristalizada utilizando nuestro protocolo de acoplamiento. Las estructuras de PLK2 recuperadas incluyeron cinco entradas del PDB: 4I5M, 4I5P, 4I6B, 4I6F y 4I6H. Los ligandos cocristalizados se extrajeron y se reacoplaron en sus correspondientes sitios de unión, y se calculó la desviación cuadrática media (RMSD) entre las poses reacopladas y las poses cristalinas. Se consideró que una pose reacoplada era exitosa cuando el RMSD era inferior a 2,5 Å, que es un umbral comúnmente utilizado para el reacoplamiento[]. Todas las poses reacopladas alcanzaron valores de RMSD inferiores a 2,5 Å (Tabla S1), y 4I6F exhibió el valor de RMSD más bajo (0,75 Å). Estos resultados confirman la idoneidad de las estructuras para el análisis posterior y la fiabilidad del protocolo de acoplamiento en la predicción de las poses de unión de los compuestos.

Identificación de interacciones farmacológicas

A continuación, identificamos las interacciones farmacológicas dentro del sitio de unión de PLK2 analizando los residuos que interactúan con frecuencia con los inhibidores conocidos, con el objetivo de mejorar las tasas de éxito en el cribado virtual. Se acoplaron un total de 60 inhibidores de PLK2 conocidos estructuralmente diversos en cada estructura, y se seleccionaron los 30 inhibidores principales clasificados por puntuación de acoplamiento para calcular las frecuencias de las interacciones de enlace de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Los enlaces de hidrógeno farmacológicos se definieron como aquellos que se forman con al menos el 50% de los inhibidores acoplados (Figura A), mientras que las interacciones hidrofóbicas farmacológicas se definieron como aquellas que se producen en al menos el 80% de las moléculas (Figura B).

Se observaron patrones de interacción comunes y específicos de la estructura en las estructuras de PLK2. En la mayoría de las estructuras, los inhibidores formaban con frecuencia enlaces de hidrógeno con el residuo C162, acompañados de interacciones hidrofóbicas consistentes que involucraban a L88, A109, R165 y F212 (Figura B). La estructura 4I6F se seleccionó como un ejemplo representativo para ilustrar estas interacciones. La pose de acoplamiento del compuesto CHEMBL2402085 en 4I6F demostró estas interacciones clave (Figura C). En particular, en 4I6B y 4I6F, se formó con frecuencia un enlace de hidrógeno adicional con el residuo L88. Estos hallazgos indican que la mayoría de los patrones de interacción se conservan en las estructuras; sin embargo, se observaron ligeras diferencias en las frecuencias de interacción. Estas variaciones pueden deberse a las diferencias estructurales entre las estructuras, lo que sugiere que la incorporación de múltiples estructuras de proteínas podría ser beneficiosa para el cribado virtual.

Establecimiento de un modelo farmacológico

Para evaluar aún más la eficacia de las interacciones farmacológicas en el cribado virtual, establecimos un modelo farmacológico para cada estructura de PLK2. Se acopló un conjunto de 30 inhibidores de CLK4 conocidos y 990 compuestos seleccionados aleatoriamente del Directorio Químico Disponible (ACD) en los sitios de unión de PLK2[]. Cada compuesto se evaluó utilizando dos enfoques de puntuación: la puntuación de acoplamiento estándar y una puntuación farmacológica, que combinó la puntuación de acoplamiento con el número de interacciones clave formadas por el compuesto. El rendimiento del modelo en la distinción de los verdaderos inhibidores de los compuestos de descarte se evaluó utilizando el área bajo la curva de características operativas del receptor (AUC). Los resultados mostraron que la clasificación de los compuestos mediante las puntuaciones farmacológicas produjo consistentemente valores de AUC más altos que la clasificación mediante las puntuaciones de acoplamiento solas (Tabla S1). Entre las cinco estructuras de PLK2 analizadas, 4I5M, 4I5P y 4I6F demostraron el mejor rendimiento, con valores de AUC de puntuación farmacológica superiores a 0,90. En particular, 4I5P logró el valor de AUC más alto (0,918), lo que indica su capacidad superior para distinguir los verdaderos inhibidores de los compuestos aleatorios. Estos hallazgos confirman que la incorporación de interacciones farmacológicas mejora el rendimiento del cribado virtual.

Tras las evaluaciones individuales del modelo, investigamos si la combinación de las predicciones de múltiples modelos farmacológicos podría mejorar aún más el rendimiento del cribado. Se seleccionaron los tres modelos de mejor rendimiento, concretamente 4I5M, 4I5P y 4I6F, para la evaluación de conjunto. Se construyeron modelos de consenso por pares sumando las clasificaciones farmacológicas individuales de cada compuesto en los modelos (por ejemplo, 4I5M + 4I5P). Para cada compuesto, se sumaron las clasificaciones de estos modelos para generar una puntuación de consenso, que luego se utilizó para la reclasificación. El análisis de AUC basado en estas clasificaciones de consenso mostró un rendimiento mejorado en comparación con el uso de modelos individuales solos (Tabla S2). En particular, la integración de los tres modelos produjo el valor de AUC más alto de 0,930, lo que representa el mejor rendimiento general observado. Estos hallazgos indican que un modelo de consenso que aproveche las características farmacológicas complementarias puede mejorar sustancialmente la precisión del cribado virtual. Con base en estos resultados, se seleccionó el modelo de consenso como el marco final para el cribado posterior.

Identificación de posibles inhibidores

Aplicamos el modelo de consenso para identificar posibles inhibidores de PLK2 de la base de datos ChemDiv. Primero, se filtraron los compuestos eliminando aquellos que contenían motivos estructurales PAINS, una puntuación QED inferior a 0,24 o violaciones de la regla de cinco de Lipinski o los criterios de Veber. Los compuestos restantes se acoplaron en las tres estructuras de cristal de PLK2 seleccionadas. Con base en las puntuaciones de acoplamiento, se seleccionaron inicialmente los 5000 compuestos principales con base en sus puntuaciones de acoplamiento. Para cada uno de estos compuestos, se calcularon las puntuaciones farmacológicas y se clasificaron en las tres estructuras de proteínas. Las clasificaciones se utilizaron para generar una puntuación de consenso para la reclasificación de los compuestos. Los 500 compuestos principales clasificados por consenso se agruparon en función de la similitud estructural. Se seleccionaron catorce compuestos representativos de cada grupo en función de su disponibilidad para las pruebas experimentales.

Los compuestos seleccionados se evaluaron para su actividad inhibidora contra PLK2 utilizando un ensayo de quinasa a una concentración de 3 μM. Entre los compuestos probados, Y207-5465 exhibió la inhibición más potente, alcanzando el 97% (Tabla). Para explorar aún más este andamio, se evaluó una serie de análogos estructuralmente relacionados. En particular, el compuesto 8012-3246 también demostró una fuerte actividad, con un 74% de inhibición (Tabla). En contraste, los análogos restantes mostraron una actividad sustancialmente menor, con tasas de inhibición inferiores al 25%. Para validar aún más su potencia, se determinaron los valores de IC50 para Y207-5465 y 8012-3246. Y207-5465 exhibió un valor de IC50 de 584,3 nM, mientras que 8012-3246 mostró un IC50 de 774,5 nM (Tabla y Figura S1). En conjunto, estos resultados sugieren que nuestra estrategia de cribado es eficaz para identificar nuevos inhibidores de PLK2. En particular, Y207-5465 y 8012-3246 representan inhibidores prometedores para un mayor desarrollo.

Interacciones de los inhibidores identificados

Realizamos un análisis de interacción para investigar las interacciones moleculares de los compuestos Y207-5465 y 8012-3246 (Figura). Cada compuesto se puede dividir en tres regiones estructurales: el núcleo, el sustituyente R1 y el sustituyente R2. Ambos compuestos comparten un núcleo de pirazolopirimidina común, que ancla la molécula en el sitio de unión a ATP formando dos enlaces de hidrógeno con los residuos de la bisagra E160 y C162. El núcleo se estabiliza aún más mediante interacciones hidrofóbicas con los residuos A109 y F212. Los sustituyentes R1 de ambos compuestos son estructuralmente similares y establecen un enlace de hidrógeno y contactos hidrofóbicos con el residuo L88. La principal diferencia estructural radica en el grupo R2. En Y207-5465, el grupo 4-metoxifenilo forma interacciones hidrofóbicas con los residuos Y161, C162 y R165. De manera similar, 8012-3246 contiene un grupo piridilo en R2, que conserva las interacciones con C162 y R165, pero carece de contacto con Y161. Esta reducción en el número de interacciones puede contribuir al valor de IC50 ligeramente más alto de 8012-3246 en comparación con Y207-5465.

Análisis de la relación estructura-actividad (SAR)

Para comprender mejor la relación estructura-actividad (SAR), agrupamos los análogos en cuatro categorías según sus sustituyentes R2 (Figura). Se analizaron los efectos de las modificaciones de R1 y R2 sobre las interacciones moleculares y la actividad inhibitoria para cada grupo (Figura A). En el Grupo A, que incluye análogos con un grupo R2 de 4-metoxifenilo, Y207-5465 exhibió la mayor actividad (97%) debido a interacciones favorables tanto en los sitios R1 como R2, como se describió anteriormente. En comparación, K638-0003 conserva el enlace de hidrógeno L88, pero pierde las interacciones del "bisagra" con Y161 y C162, posiblemente debido a una orientación alterada causada por su sustituyente R1, lo que resulta en una actividad reducida (24%) (Figura B, D). En K638-0019, el sustituyente R1 se modificó de un grupo hidroxilo a un grupo tiofeno-2-carboxilato. Este grupo funcional más grande impide la formación de un enlace de hidrógeno con L88 y se extiende hacia afuera de la superficie de la proteína, interrumpiendo así las interacciones con los residuos del "bisagra" Y161 y C162, lo que resulta en una actividad reducida (13%). K638-0024, que contiene grupos R1 voluminosos, no logra mantener el enlace de hidrógeno L88 y también pierde los contactos hidrofóbicos con Y161 y C162, probablemente debido a impedimento estérico, lo que lleva a una mayor reducción de la actividad (11%) (Figura B, D).

Estos hallazgos resaltan la importancia tanto del enlace de hidrógeno L88 como de las interacciones hidrofóbicas con Y161 y C162 para una alta potencia (Figura C). Los compuestos con una porción fenólica en el sitio R1 exhiben una mayor actividad inhibitoria que aquellos con un sustituyente más voluminoso (Figura D).

En el Grupo B, que contiene análogos con un grupo R2 de piridilo, 8012-3246 mostró una inhibición del 74% debido a la presencia de un grupo R1 de 3,4-dihidroxifenilo que forma un enlace de hidrógeno con L88 e interacciones hidrofóbicas entre su porción R2 y el residuo C162. En contraste, otros análogos en este grupo, como 8011-9801 y 8012-6667, carecen de estas interacciones clave del "bisagra" o exteriores y exhibieron una actividad mucho menor (15% y 13%, respectivamente). Los grupos C y D incluyen compuestos con sustituyentes R1 y R2 que no logran establecer las interacciones clave. Por ejemplo, 8012-5906 y 3394-0352 pierden tanto el enlace de hidrógeno con L88 como las interacciones hidrofóbicas con Y161 y C162, lo que resulta en una actividad reducida. Estos resultados sugieren que una potente inhibición de PLK2 requiere un enlace de hidrógeno en L88, mediado por un grupo R1 de orto- u meta-hidroxifenilo, así como interacciones hidrofóbicas entre el andamio R2 (por ejemplo, metoxifenilo o piridilo) y los residuos Y161 y C162 (Figura C).

Diversidad estructural de los inhibidores de PLK2

Para evaluar la novedad estructural de los compuestos Y207-5465 y 8012-3246, se generó una matriz de similitud utilizando 30 inhibidores de PLK2 estructuralmente diversos. La matriz contenía puntajes de Tanimoto para todos los pares de moléculas (Figura S2). Como análogos, Y207-5465 y 8012-3246 exhibieron la mayor similitud mutua, con un puntaje de Tanimoto de 0.523. En contraste, la comparación de los compuestos con inhibidores de PLK2 conocidos no arrojó una similitud estructural o patrones de agrupamiento significativos. La inspección visual reveló las coincidencias estructurales con la puntuación más alta: CHEMBL3975634 (puntaje de Tanimoto de 0.137 con Y207-5465) y CHEMBL2205426 (puntaje de Tanimoto de 0.123 con 8012-3246). Este análisis sugiere que Y207-5465 y 8012-3246 son estructuralmente distintos de los inhibidores de PLK2 informados previamente.

El inhibidor de PLK2 exhibe una potente actividad antitumoral en células de CRC

Para evaluar la eficacia antitumoral de los inhibidores de PLK2, realizamos ensayos de viabilidad celular utilizando las líneas celulares de CRC HT-29 y HCT-116. Entre los dos compuestos probados, 8012-3246 demostró una potente citotoxicidad, mientras que Y207-5465 mostró solo una actividad limitada (Figura A). El tratamiento con 8012-3246 a concentraciones de 10 y 30 µM resultó en reducciones significativas en la viabilidad celular en ambas líneas celulares, con valores de IC50 calculados de 7.97 µM para HT-29 y 17.67 µM para HCT-116, respectivamente (Figura A, B). Con base en estos resultados, 8012-3246 fue seleccionado para una evaluación adicional. Para explorar más a fondo el mecanismo antitumoral de la inhibición de PLK2, se realizó un ensayo de incorporación de BrdU para evaluar su efecto sobre la proliferación de las células cancerosas. Los resultados demostraron que 8012-3246 inhibió marcadamente la síntesis de ADN de manera dependiente de la dosis, lo que indica un efecto antiproliferativo. Los valores de GI50 para la inhibición del crecimiento se determinaron en 3.28 µM para HT-29 y 6.62 µM para HCT-116 (Figura C). Además, en los ensayos de formación de colonias, el tratamiento con 3 µM de 8012-3246 condujo a una reducción visible en el número de colonias, mientras que concentraciones más altas, 10 y 30 µM, resultaron en una supresión pronunciada de la capacidad de formación de colonias en ambas líneas celulares (Figura D, E). Estos resultados demostraron que 8012-3246 exhibe una fuerte actividad antitumoral al inhibir la viabilidad celular, la proliferación y el crecimiento clonogénico en las células de CRC.

8012-3246 inhibe la actividad de la quinasa PLK2 y la señalización aguas abajo en las células cancerosas

El ensayo basado en enzimas confirmó que 8012-3246 exhibió actividad inhibitoria contra PLK2. Para validar aún más el mecanismo de acción dentro de un contexto celular, examinamos el efecto sobre la señalización mediada por PLK2 en las células de CRC. Dada la especificidad de 8012-3246 para PLK2, analizamos el estado de fosforilación de GSK3, un sustrato aguas abajo bien establecido de PLK2. El análisis de Western blot reveló que 8012-3246 condujo a una reducción significativa y dependiente de la dosis en la fosforilación de GSK3 en Ser9 (Figura). Este resultado confirmó que 8012-3246 inhibió eficazmente la actividad de la quinasa PLK2 y la señalización aguas abajo en las células cancerosas. En conjunto, estos hallazgos respaldan que 8012-3246 suprime la señalización de PLK2 y el crecimiento de las células de CRC, proporcionando así una prometedora estrategia terapéutica para detener la progresión del cáncer.

Perfil de selectividad del compuesto 8012-3246

El desarrollo de inhibidores de quinasas a menudo se ve obstaculizado por los desafíos para lograr la selectividad, ya que la inhibición fuera del objetivo puede conducir a efectos inesperados. Para evaluar la selectividad de 8012-3246, el compuesto se probó contra un panel de 40 quinasas que representan diversas familias dentro del kinoma humano. A una concentración de 10 µM, 8012-3246 mostró una inhibición mínima en todo el panel. Solo unas pocas quinasas, que incluyen MARK2 (26%), STK3 (26%), BRAF (23%) y WEE1 (21%), exhibieron una inhibición modesta, y ninguna superó el 50% (Tabla). En contraste con muchos inhibidores de PLK2 que exhiben una amplia actividad en múltiples objetivos, 8012-3246 demostró un perfil de inhibición más selectivo. Por ejemplo, CHEMBL5181620 inhibe no solo PLK2, sino también DAPK3 y DYRK1A, con valores de IC50 de 125, 578 y 917 nM, respectivamente. De manera similar, BI-2536, que ha completado un ensayo clínico de fase 2, tiene un valor de IC50 de 190 nM para ALK mutado. Estos hallazgos sugieren que PLK2 es el objetivo principal de 8012-3246 y respaldan su potencial uso como una sonda selectiva para investigar las vías de señalización asociadas con PLK2. Además, 8012-3246 representa un punto de partida prometedor para un mayor desarrollo como agente terapéutico.

Evaluación del protocolo de acoplamiento y las estructuras de PLK2

Para identificar las estructuras de proteínas PLK2 adecuadas para el cribado virtual, se obtuvieron todas las estructuras de PLK2 disponibles del PDB para el análisis de reacoplamiento. Cada una de estas estructuras contiene un ligando cocristalizado dentro del sitio de unión. Este enfoque se utilizó para evaluar la confiabilidad estructural de cada estructura al evaluar su capacidad para reproducir la pose de unión cocristalizada utilizando nuestro protocolo de acoplamiento. Las estructuras de PLK2 recuperadas incluyeron cinco entradas del PDB: 4I5M, 4I5P, 4I6B, 4I6F y 4I6H. Los ligandos cocristalizados se extrajeron y se reacoplaron en sus respectivos sitios de unión, y se calculó la desviación cuadrática media (RMSD) entre las poses reacopladas y las poses de cristal. Se consideró que una pose reacoplada fue exitosa cuando el RMSD fue inferior a 2.5 Å, que es un umbral comúnmente utilizado para el reacoplamiento. Todas las poses reacopladas alcanzaron valores de RMSD inferiores a 2.5 Å (Tabla S1), y 4I6F exhibió el valor de RMSD más bajo (0.75 Å). Estos resultados confirman la idoneidad de las estructuras para el análisis posterior y la confiabilidad del protocolo de acoplamiento para predecir las poses de unión de los compuestos.

Identificación de interacciones farmacológicas

A continuación, identificamos las interacciones farmacológicas dentro del sitio de unión de PLK2 analizando los residuos que interactúan con frecuencia con los inhibidores conocidos, con el objetivo de mejorar las tasas de éxito en el cribado virtual. Se acoplaron un total de 60 inhibidores de PLK2 estructuralmente diversos en cada estructura, y se seleccionaron los 30 inhibidores principales clasificados por puntaje de acoplamiento para calcular las frecuencias de los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. Los enlaces de hidrógeno farmacológicos se definieron como aquellos que se forman con al menos el 50% de los inhibidores acoplados (Figura A), mientras que las interacciones hidrofóbicas farmacológicas se definieron como aquellas que ocurren en al menos el 80% de las moléculas (Figura B).

Se observaron patrones de interacción comunes y específicos de la estructura en las estructuras de PLK2. En la mayoría de las estructuras, los inhibidores formaron con frecuencia enlaces de hidrógeno con el residuo C162, acompañados de interacciones hidrofóbicas consistentes que involucran a L88, A109, R165 y F212 (Figura B). La estructura 4I6F se seleccionó como un ejemplo representativo para ilustrar estas interacciones. La pose de acoplamiento del compuesto CHEMBL2402085 en 4I6F demostró estas interacciones clave (Figura C). En particular, en 4I6B y 4I6F, se formó con frecuencia un enlace de hidrógeno adicional con el residuo L88. Estos hallazgos indican que la mayoría de los patrones de interacción se conservan en las estructuras; sin embargo, se observaron ligeras diferencias en las frecuencias de interacción. Estas variaciones pueden deberse a diferencias estructurales entre las estructuras, lo que sugiere que incorporar múltiples estructuras de proteínas podría ser beneficioso para el cribado virtual.

Establecimiento de un modelo farmacológico

Para evaluar aún más la eficacia de las interacciones farmacológicas en el cribado virtual, establecimos un modelo farmacológico para cada estructura de PLK2. Se acoplaron un conjunto de 30 inhibidores de CLK4 conocidos y 990 compuestos seleccionados aleatoriamente del Directorio químico disponible (ACD) en los sitios de unión de PLK2. Cada compuesto se evaluó utilizando dos enfoques de puntuación: el puntaje de acoplamiento estándar y un puntaje farmacológico, que combinó el puntaje de acoplamiento con el número de interacciones clave formadas por el compuesto. El rendimiento del modelo en la distinción de los verdaderos inhibidores de los compuestos de descarte se evaluó utilizando el área bajo la curva de características operativas del receptor (AUC). Los resultados mostraron que clasificar los compuestos por puntajes farmacológicos produjo consistentemente valores de AUC más altos que clasificar solo por puntajes de acoplamiento (Tabla S1). Entre las cinco estructuras de PLK2 analizadas, 4I5M, 4I5P y 4I6F demostraron el mejor rendimiento, con valores de AUC de puntaje farmacológico que superaron los 0.90. En particular, 4I5P logró el valor de AUC más alto (0.918), lo que indica su capacidad superior para distinguir los verdaderos inhibidores de los compuestos aleatorios. Estos hallazgos confirman que incorporar interacciones farmacológicas mejora el rendimiento del cribado virtual.

Tras la evaluación individual de cada modelo, investigamos si la combinación de las predicciones de múltiples modelos farmacológicos podía mejorar aún más el rendimiento del cribado. Los tres modelos con mejor rendimiento, concretamente 4I5M, 4I5P y 4I6F, se seleccionaron para la evaluación de conjunto. Se construyeron modelos de consenso por pares sumando las clasificaciones farmacológicas individuales de cada compuesto entre los modelos (por ejemplo, 4I5M + 4I5P). Para cada compuesto, se sumaron las clasificaciones de estos modelos para generar una puntuación de consenso, que luego se utilizó para volver a clasificar. El análisis del AUC basado en estas clasificaciones de consenso mostró un rendimiento mejorado en comparación con el uso de modelos individuales (Tabla S2). En particular, la integración de los tres modelos produjo el valor de AUC más alto, de 0,930, lo que representa el mejor rendimiento general observado. Estos hallazgos indican que un modelo de consenso que aproveche características farmacológicas complementarias puede mejorar sustancialmente la precisión del cribado virtual. Basándose en estos resultados, se seleccionó el modelo de consenso como el marco final para el cribado posterior.

Identificación de posibles inhibidores

Aplicamos el modelo de consenso para identificar posibles inhibidores de PLK2 a partir de la base de datos ChemDiv. Primero, se filtraron los compuestos eliminando aquellos que contenían motivos estructurales PAINS, una puntuación QED inferior a 0,24 o violaciones de la regla de los cinco de Lipinski o los criterios de Veber. Los compuestos restantes se acoplaron a las tres estructuras cristalinas de PLK2 seleccionadas. Basándose en las puntuaciones de acoplamiento, se seleccionaron inicialmente los 5000 compuestos con mejor puntuación en función de sus puntuaciones de acoplamiento. Para cada uno de estos compuestos, se calcularon las puntuaciones farmacológicas y se clasificaron en las tres estructuras de proteínas. Las clasificaciones se utilizaron para generar una puntuación de consenso para volver a clasificar los compuestos. Los 500 compuestos con mejor clasificación de consenso se agruparon en función de la similitud estructural. Se seleccionaron catorce compuestos representativos de cada grupo en función de su disponibilidad para las pruebas experimentales.

Los compuestos seleccionados se evaluaron para determinar su actividad inhibidora contra PLK2 utilizando un ensayo de quinasa a una concentración de 3 μM. Entre los compuestos probados, Y207-5465 exhibió la inhibición más potente, alcanzando el 97% (Tabla). Para explorar aún más este andamiaje, se evaluó una serie de análogos estructuralmente relacionados. En particular, el compuesto 8012-3246 también demostró una fuerte actividad, con un 74% de inhibición (Tabla). En contraste, los análogos restantes mostraron una actividad sustancialmente menor, con tasas de inhibición inferiores al 25%. Para validar aún más su potencia, se determinaron los valores de IC50 para Y207-5465 y 8012-3246. Y207-5465 exhibió un valor de IC50 de 584,3 nM, mientras que 8012-3246 mostró un IC50 de 774,5 nM (Tabla y Figura S1). En conjunto, estos resultados sugieren que nuestra estrategia de cribado es eficaz para identificar nuevos inhibidores de PLK2. En particular, Y207-5465 y 8012-3246 representan inhibidores prometedores para un mayor desarrollo.

Interacciones de los inhibidores identificados

Realizamos un análisis de interacción para investigar las interacciones moleculares de los compuestos Y207-5465 y 8012-3246 (Figura). Cada compuesto se puede dividir en tres regiones estructurales: el núcleo, el sustituyente R1 y el sustituyente R2. Ambos compuestos comparten un núcleo pirazolopirimidina común, que ancla la molécula en el sitio de unión al ATP formando dos enlaces de hidrógeno con los residuos de la bisagra E160 y C162. El núcleo se estabiliza aún más mediante interacciones hidrofóbicas con los residuos A109 y F212. Los sustituyentes R1 de ambos compuestos son estructuralmente similares y establecen un enlace de hidrógeno y contactos hidrofóbicos con el residuo L88. La principal diferencia estructural radica en el grupo R2. En Y207-5465, el grupo 4-metoxifenilo forma interacciones hidrofóbicas con los residuos Y161, C162 y R165. De manera similar, 8012-3246 contiene un grupo piridilo en R2, que mantiene las interacciones con C162 y R165, pero carece de contacto con Y161. Este menor número de interacciones puede contribuir al valor de IC50 ligeramente más alto de 8012-3246 en comparación con Y207-5465.

Análisis SAR

Para comprender mejor la relación estructura-actividad (SAR), agrupamos los análogos en cuatro categorías en función de sus sustituyentes R2 (Figura). Se analizaron los efectos de las modificaciones de R1 y R2 sobre las interacciones moleculares y la actividad inhibidora para cada grupo (Figura A). En el Grupo A, que incluye análogos con un grupo R2 de 4-metoxifenilo, Y207-5465 exhibió la mayor actividad (97%) debido a las interacciones favorables tanto en los sitios R1 como R2 descritos anteriormente. En comparación, K638-0003 conserva el enlace de hidrógeno L88, pero pierde las interacciones de la bisagra con Y161 y C162, posiblemente debido a una orientación alterada causada por su sustituyente R1, lo que resulta en una actividad reducida (24%) (Figura B, D). En K638-0019, el sustituyente R1 se modificó de un grupo hidroxilo a un grupo tiophene-2-carboxilato. Este grupo funcional más grande impide la formación de un enlace de hidrógeno con L88 y se extiende hacia afuera de la superficie de la proteína, interrumpiendo así las interacciones con los residuos de la bisagra Y161 y C162, lo que resulta en una actividad reducida (13%). K638-0024, que contiene grupos R1 voluminosos, no logra mantener el enlace de hidrógeno L88 y también pierde los contactos hidrofóbicos con Y161 y C162, probablemente debido a la impedimento estérico, lo que lleva a una mayor reducción de la actividad (11%) (Figura B, D). Estos hallazgos resaltan la importancia tanto del enlace de hidrógeno L88 como de las interacciones hidrofóbicas con Y161 y C162 para una alta potencia (Figura C). Los compuestos con un grupo fenol en el sitio R1 exhiben una mayor actividad inhibidora que aquellos con un sustituyente más voluminoso (Figura D).

En el Grupo B, que contiene análogos con un grupo R2 de piridilo, 8012-3246 mostró un 74% de inhibición debido a la presencia de un grupo R1 de 3,4-dihidroxifenilo que forma un enlace de hidrógeno con L88 e interacciones hidrofóbicas entre su grupo R2 y el residuo C162. En contraste, otros análogos en este grupo, como 8011-9801 y 8012-6667, carecen de estas interacciones clave de la bisagra o exteriores y exhibieron una actividad mucho menor (15% y 13%, respectivamente). Los grupos C y D incluyen compuestos con sustituyentes R1 y R2 que no establecen las interacciones clave. Por ejemplo, 8012-5906 y 3394-0352 pierden tanto el enlace de hidrógeno con L88 como las interacciones hidrofóbicas con Y161 y C162, lo que resulta en una actividad reducida. Estos resultados sugieren que la inhibición potente de PLK2 requiere un enlace de hidrógeno en L88, mediado por un grupo R1 de orto- u meta-hidroxifenilo, así como interacciones hidrofóbicas entre el andamiaje R2 (por ejemplo, metoxifenilo o piridilo) y los residuos Y161 y C162 (Figura C).

Diversidad estructural de los inhibidores de PLK2

Para evaluar la novedad estructural de los compuestos Y207-5465 y 8012-3246, se generó una matriz de similitud utilizando 30 inhibidores de PLK2 estructuralmente diversos. La matriz contenía puntuaciones de Tanimoto para todos los pares de moléculas (Figura S2). Como análogos, Y207-5465 y 8012-3246 exhibieron la mayor similitud mutua, con una puntuación de Tanimoto de 0,523. En contraste, la comparación de los compuestos con inhibidores de PLK2 conocidos no arrojó una similitud estructural o patrones de agrupamiento significativos. La inspección visual reveló las coincidencias estructurales con mayor puntuación: CHEMBL3975634 (puntuación de Tanimoto de 0,137 con Y207-5465) y CHEMBL2205426 (puntuación de Tanimoto de 0,123 con 8012-3246). Este análisis sugiere que Y207-5465 y 8012-3246 son estructuralmente distintos de los inhibidores de PLK2 informados previamente.

El inhibidor de PLK2 exhibe una potente actividad antitumoral en células de CRC

Para evaluar la eficacia antitumoral de los inhibidores de PLK2, realizamos ensayos de viabilidad celular utilizando las líneas celulares de CRC HT-29 y HCT-116. Entre los dos compuestos probados, 8012-3246 demostró una potente citotoxicidad, mientras que Y207-5465 mostró solo una actividad limitada (Figura A). El tratamiento con 8012-3246 a concentraciones de 10 y 30 μM resultó en reducciones significativas en la viabilidad celular en ambas líneas celulares, con valores de IC50 calculados de 7,97 μM para HT-29 y 17,67 μM para HCT-116, respectivamente (Figura A, B). Basándose en estos resultados, 8012-3246 se seleccionó para una mayor evaluación. Para explorar aún más el mecanismo antitumoral de la inhibición de PLK2, se realizó un ensayo de incorporación de BrdU para evaluar su efecto sobre la proliferación de las células cancerosas. Los resultados demostraron que 8012-3246 inhibió marcadamente la síntesis de ADN de manera dependiente de la dosis, lo que indica un efecto antiproliferativo. Los valores de GI50 para la inhibición del crecimiento se determinaron en 3,28 μM para HT-29 y 6,62 μM para HCT-116 (Figura C). Además, en los ensayos de formación de colonias, el tratamiento con 3 μM de 8012-3246 condujo a una reducción visible en el número de colonias, mientras que concentraciones más altas, 10 y 30 μM, resultaron en una supresión pronunciada de la capacidad de formación de colonias en ambas líneas celulares (Figura D, E). Estos resultados demostraron que 8012-3246 exhibe una fuerte actividad antitumoral al inhibir la viabilidad celular, la proliferación y el crecimiento clonogénico en las células de CRC.

8012-3246 inhibe la actividad de la quinasa PLK2 y la señalización descendente en las células cancerosas

El ensayo basado en enzimas confirmó que 8012-3246 exhibió actividad inhibidora contra PLK2. Para validar aún más el mecanismo de acción dentro de un contexto celular, examinamos el efecto sobre la señalización mediada por PLK2 en las células de CRC. Dada la especificidad de 8012-3246 para PLK2, analizamos el estado de fosforilación de GSK3, un sustrato descendente bien establecido de PLK2. El análisis de Western blot reveló que 8012-3246 condujo a una reducción significativa y dependiente de la dosis en la fosforilación de GSK3 en Ser9 (Figura). Este resultado confirmó que 8012-3246 inhibió eficazmente la actividad de la quinasa PLK2 y la señalización descendente en las células cancerosas. En conjunto, estos hallazgos respaldan que 8012-3246 suprime la señalización de PLK2 y el crecimiento de las células de CRC, proporcionando así una prometedora estrategia terapéutica para detener la progresión del cáncer.

Perfil de selectividad del compuesto 8012-3246

El desarrollo de inhibidores de quinasas a menudo se ve obstaculizado por los desafíos para lograr la selectividad, ya que la inhibición fuera del objetivo puede conducir a efectos inesperados. Para evaluar la selectividad de 8012-3246, se probó el compuesto contra un panel de 40 quinasas que representan diversas familias dentro del kinoma humano. A una concentración de 10 μM, 8012-3246 mostró una inhibición mínima en todo el panel. Solo unas pocas quinasas, que incluyen MARK2 (26%), STK3 (26%), BRAF (23%) y WEE1 (21%), exhibieron una inhibición modesta, y ninguna superó el 50% (Tabla). En contraste con muchos inhibidores de PLK2 que exhiben una amplia actividad en múltiples objetivos, 8012-3246 demostró un perfil de inhibición más selectivo. Por ejemplo, CHEMBL5181620 inhibe no solo PLK2, sino también DAPK3 y DYRK1A, con valores de IC50 de 125, 578 y 917 nM, respectivamente. De manera similar, BI-2536, que ha completado un ensayo clínico de fase 2, tiene un valor de IC50 de 190 nM para ALK mutado. Estos hallazgos sugieren que PLK2 es el objetivo principal de 8012-3246 y respaldan su potencial uso como una sonda selectiva para investigar las vías de señalización asociadas con PLK2. Además, 8012-3246 representa un punto de partida prometedor para un mayor desarrollo como agente terapéutico.

Discusión

PLK2 ha surgido como un prometedor objetivo terapéutico en el CCRC. En este estudio, desarrollamos un marco de diseño de fármacos que integra el modelado computacional con la validación experimental para identificar nuevos inhibidores de PLK2. Primero se identificaron las interacciones farmacológicas de múltiples estructuras de PLK2 utilizando inhibidores conocidos, y se construyó un modelo de consenso para mejorar las tasas de éxito durante el cribado. Estudios previos han demostrado que la incorporación de múltiples estructuras de proteínas puede mejorar las tasas de éxito en el cribado virtual. Por ejemplo, el acoplamiento en conjunto contra receptores acoplados a proteínas G aminérgicas logró un enriquecimiento de ocho a 17 veces, con mejoras similares observadas para el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2. De manera similar, nuestro modelo de consenso aumentó el AUC de 0,906 a 0,930 y condujo a la identificación de dos nuevos inhibidores de PLK2. En particular, el compuesto principal, Y207-5465, mejoró de posiciones modestas en modelos individuales a la posición 16 en la clasificación de consenso. Este compuesto se validó experimentalmente como un inhibidor de PLK2 submolar con alta selectividad quinasa y actividad antiproliferativa en líneas celulares de CCRC. Estos hallazgos respaldan el marco de incorporación del análisis de interacciones farmacológicas en múltiples estructuras para mejorar la tasa de éxito en el cribado virtual.

En este estudio, observamos una diferencia marcada en la sensibilidad al inhibidor de PLK2 8012-3246 entre dos líneas celulares de CCRC, HT-29 y HCT-116. Las células HT-29 exhibieron una susceptibilidad significativamente mayor, como lo indican los valores de IC50 y GI50 más bajos en los ensayos de viabilidad y proliferación (Figura). Esta respuesta diferencial puede atribuirse a diferencias genéticas y moleculares intrínsecas entre las dos líneas celulares. En particular, HT-29 presenta una mutación truncante en el gen APC, lo que resulta en la activación constitutiva de la vía de señalización Wnt/β-catenina, mientras que HCT-116 conserva el APC de tipo salvaje. Dado que PLK2 regula los efectores posteriores, como GSK3, que está involucrado en la degradación de β-catenina, la inhibición de PLK2 en las células con mutación de APC como HT-29 puede alterar aún más el equilibrio de la señalización de Wnt y aumentar el estrés oncogénico. Además, las células HT-29 albergan p53 mutado, lo que podría afectar su capacidad para iniciar la detención del ciclo celular y la reparación del ADN. Esto puede aumentar la dependencia de las vías de supervivencia mediadas por PLK2. En contraste, las células HCT-116 expresan p53 funcional y pueden compensar la inhibición de PLK2 a través de un control robusto de los puntos de control y mecanismos adaptativos alternativos. Estos hallazgos sugieren que el estado de APC y p53 podría servir como indicadores predictivos de la respuesta celular a las terapias dirigidas a PLK2, lo que destaca la importancia del contexto genético en la sensibilidad terapéutica.

Las interacciones farmacológicas a menudo involucran residuos con funciones clave en la potencia del inhibidor, la función biológica o la conservación evolutiva. Las interacciones farmacológicas identificadas en este estudio incluyen un enlace de hidrógeno con el residuo C162 e interacciones hidrofóbicas con los residuos L88, A109, R165 y F212. Se realizó un análisis de conservación de la secuencia de PLK2 a través de la base de datos ConSurf, que asigna a cada residuo una puntuación de conservación que varía de variable (1) a altamente conservado (9). El análisis reveló que A109, C162 y F212 se encuentran entre los residuos más altamente conservados con puntuaciones de 9, mientras que L88 y R165 también están conservados con puntuaciones de 8, lo que destaca su función esencial en el mantenimiento de la actividad quinasa de PLK2 (Figura S3). Estudios previos han demostrado que estos residuos desempeñan un papel importante en la unión del inhibidor. Por ejemplo, los residuos altamente conservados C162 y F212 estabilizan el andamio del inhibidor dentro del sitio de unión de PLK2. Además, los residuos L88 y R165 anclan los inhibidores al intercalar sus anillos aromáticos a través de interacciones hidrofóbicas. El análisis SAR en este estudio también confirmó que la interacción con los residuos altamente conservados L88 y C162 puede mejorar la potencia (Figura). En resumen, los inhibidores potentes interactúan constantemente con los residuos altamente conservados, que son cruciales para la unión del inhibidor.

Los perfiles de seguridad de los compuestos Y207-5465 y 8012-3246 se evaluaron utilizando ProTox 3.0, una herramienta computacional para la predicción de toxicidad in silico. Ambos compuestos se asignaron a la clase de toxicidad IV por ProTox 3.0, lo que indica una baja toxicidad aguda en modelos animales. También exhibieron bajos riesgos predichos en la mayoría de los puntos finales toxicológicos (Figura S4), incluida la neurotoxicidad, la inmunotoxicidad y la mutagenicidad. Aunque se predijo que varios puntos finales estaban activos, las probabilidades asociadas siguieron siendo bajas y no superaron el umbral de preocupación comúnmente aceptado de 0,7, lo que sugiere una probabilidad relativamente baja de toxicidad. En conjunto, estas predicciones sugieren que Y207-5465 y 8012-3246 demuestran perfiles de seguridad predichos favorables y es poco probable que presenten riesgos de toxicidad significativos. Sin embargo, las predicciones deben validarse mediante estudios toxicológicos in vitro e in vivo para confirmar su idoneidad para el desarrollo terapéutico.

Conclusión

La alta expresión de PLK2 en el CCRC está fuertemente asociada con la resistencia a la quimioterapia, la rápida progresión de la enfermedad y la reducción de la supervivencia, lo que convierte a la inhibición de PLK2 en una estrategia prometedora para mejorar el pronóstico. En este estudio, empleamos un enfoque basado en la estructura para construir un modelo de consenso que integrara las interacciones farmacológicas de múltiples estructuras de cristal de PLK2, mejorando así la precisión del cribado virtual. Este modelo identificó dos inhibidores, entre los cuales 8012-3246 demostró una potente inhibición de PLK2, una marcada citotoxicidad y fuertes efectos antiproliferativos en las células de CCRC. Además, el compuesto exhibió una alta selectividad. El análisis mecanicista reveló que 8012-3246 suprimió la fosforilación de GSK3, inhibiendo eficazmente la señalización de PLK2 posterior. Estos hallazgos validan la utilidad de nuestra estrategia de modelado de consenso para el descubrimiento de inhibidores de quinasas y respaldan la inhibición de PLK2 como un enfoque terapéutico viable para el CCRC.