Vector nanoferritino activado por el microambiente tumoral permite una entrega mejorada a la tumor de inhibidores y desencadenantes de KRAS(G12C).

Los oncogenes del sarcoma de rata (RAS) (KRAS, HRAS y NRAS) se encuentran entre los genes más frecuentemente mutados en los cánceres humanos. Las mutaciones activadoras de KRAS G12 son impulsores particularmente críticos de la malignidad, fuertemente asociadas con un mal pronóstico y presentes en aproximadamente el 15% de todos los cánceres humanos. Su prevalencia es aún mayor en tipos de cáncer específicos, incluyendo el adenocarcinoma ductal pancreático (ADCP), el cáncer colorrectal (CCR), el adenocarcinoma de pulmón (CAP) y el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) ([Thein et al., 2021]; [Herdeis et al., 2021]; [Mendiratta et al., 2021]; [Sinkala, 2023]).

Las mutaciones más comunes de KRAS son G12D, G12V y G12C. Por ejemplo, las mutaciones de KRAS se encuentran en el 90% de los cánceres de páncreas, con G12D o G12V presentes en dos tercios de los casos de ADCP y la mitad de los casos de CCR. KRASG12C es la mutación predominante de KRAS en CPNM, y también ocurre en CAP (13%), CCR (3%) y en el 1-3% de los cánceres de endometrio, vejiga y ovario ([Thein et al., 2021]).

La proteína KRAS funciona como un interruptor molecular, alternando entre un estado inactivo unido a difosfato de guanosina (GDP) y un estado activo unido a trifosfato de guanosina (GTP). Su actividad está estrictamente regulada por factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) y proteínas activadoras de GTPasa (GAP), que controlan la unión y la hidrólisis de GTP, respectivamente. Tras la señalización del receptor del factor de crecimiento, particularmente a través de EGFR, KRAS en su estado activo unido a GTP interactúa con proteínas efectoras como RAF y PI3K a través de sus elementos de conmutación I y conmutación II. Esta interacción activa las vías de señalización descendentes, incluyendo las vías RAF-MEK-ERK y PI3K-AKT-mTOR, promoviendo en última instancia la proliferación, la supervivencia y el crecimiento celular ([Thein et al., 2021]) (Figura 1A).

Sin embargo, las mutaciones G12 interrumpen la actividad GTPasa intrínseca de KRAS, lo que lleva a una activación constitutiva independiente de las señales de factores de crecimiento externos. Esto bloquea efectivamente a KRAS en su estado unido a GTP, lo que resulta en un crecimiento celular descontrolado y tumorigénesis.

Durante décadas, la alta frecuencia de las mutaciones de KRAS y su papel fundamental en el mantenimiento del fenotipo transformado impulsaron una intensa investigación sobre compuestos dirigidos a KRAS. Sin embargo, KRAS se consideró durante mucho tiempo "no susceptible de ser atacado farmacológicamente" debido a su afinidad picomolar por GTP, la ausencia de bolsillos hidrofóbicos adecuados y la falta de sitios reguladores alostéricos conocidos. Este paradigma cambió drásticamente con el trabajo pionero de Shokat y sus colegas ([Ostrem et al., 2013]), que condujo al desarrollo de inhibidores específicos de mutantes. Estos incluyen inhibidores covalentes dirigidos a KRASG12C (por ejemplo, Sotorasib y Adagrasib, este último comercializado como Krazati® y que recibió la designación de terapia innovadora de la FDA para CPNM en 2021) e inhibidores no covalentes de alta afinidad (nanomolar de un solo dígito) dirigidos a KRASG12D (por ejemplo, MRTX1133 de Mirati). Estos inhibidores se unen a un bolsillo poco profundo situado entre los elementos de conmutación I y conmutación II, atrapando efectivamente a KRAS mutado en su estado inactivo unido a GDP, interrumpiendo tanto la conmutación I como la conmutación II e impidiendo su interacción con RAF ([Fell et al., 2020]; [Wang et al., 2022]). Este avance ha llevado a un aumento de los nuevos inhibidores y degradadores de KRAS en los últimos años ([Wei et al., 2024]; [Ash et al., 2024]).

Sin embargo, a pesar de su prometedor inicio, un desafío importante con los inhibidores de KRAS existentes, como Sotorasib y Adagrasib, es el rápido desarrollo de resistencia en muchos pacientes, a menudo dentro de los meses posteriores al inicio del tratamiento. Esta resistencia surge de diversos mecanismos, que se clasifican como "on-target" u "off-target". Los mecanismos de resistencia "on-target" incluyen mutaciones secundarias de KRAS, sobreexpresión de KRAS y reactivación de KRAS (debido a interacciones con EGFR y/o Aurora quinasa A). Los mecanismos de resistencia "off-target" implican la activación de vías descendentes alternativas, cambios epigenéticos, reprogramación transcripcional, alteraciones en el microambiente tumoral (MET) o transición epitelio-mesenquimal ([Xue et al., 2020]; [Awad et al., 2021]; [Tanaka et al., 2021]; [Ash et al., 2024]; [Dilly et al., 2024]; [Kumarasamy et al., 2024]).

Más allá de la inhibición, la degradación de proteínas ofrece una vía prometedora para superar los mecanismos de resistencia, especialmente aquellos relacionados con la sobreexpresión o reactivación de KRAS. KRAS sufre varias modificaciones postraduccionales, incluyendo la ubiquitinación en sitios como Lys104, Lys117 y Lys147 ([Herdeis et al., 2021]). Estos sitios de ubiquitinación pueden ser explotados por las quimeras de direccionamiento de proteólisis (PROTAC) ([Sakamoto et al., 2001]). Las PROTAC son pequeñas moléculas heterobifuncionales diseñadas para inducir la proteólisis intracelular selectiva. A diferencia de los inhibidores enzimáticos tradicionales, las PROTAC consisten en dos motivos de unión a proteínas unidos covalentemente: un ligando que se une a la ligasa de ubiquitina E3 y un ligando que se une a la proteína diana de interés (POI) (Figura 1B). Al reclutar una ligasa E3 (por ejemplo, la proteína de von Hippel-Lindau (VHL), Cereblona (CRBN) o los inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAP)) a la proteína diana, las PROTAC inducen la poliubiquitinación y la posterior degradación proteasómica de la POI. Este mecanismo es particularmente ventajoso porque las PROTAC solo requieren una unión selectiva a sus dianas, en lugar de inhibir la actividad enzimática, lo que abre oportunidades para reutilizar moléculas inhibidoras que antes eran ineficaces. Además, la degradación química de KRAS podría abordar directamente varios mecanismos clave de resistencia observados con los inhibidores de KRAS, como las mutaciones secundarias, la sobreexpresión de KRAS y la reactivación de KRAS. Por ejemplo, la PROTAC basada en VHL, LC-2, que utiliza Adagrasib como cabeza de lanza de KRASG12C, ha demostrado una degradación rápida y sostenida de KRAS y una señalización descendente de pERK alterada durante un máximo de 72 horas en varias líneas celulares mutadas en KRASG12C, logrando valores máximos de degradación de hasta el 90% ([Bond et al., 2020]). Dados los desafíos de la resistencia adquirida y la urgente necesidad de terapias más eficaces, se requieren nuevas estrategias para mejorar la eficacia de los inhibidores y degradadores de KRAS. Mejorar la selectividad de la administración de fármacos a los tumores es crucial para aumentar la potencia, reducir los efectos fuera de la diana y mitigar el desarrollo de resistencia ([Di Stefano, 2023]).

En este trabajo, presentamos una innovadora plataforma de nanomedicina basada en la proteína ferritina humana, diseñada para abordar estos desafíos. Utilizamos una familia de nanocargadores derivados de la ferritina, estables, no tóxicos y sensibles a estímulos, que son susceptibles de modificaciones de biología molecular, para mejorar significativamente la biodistribución de la carga útil, prolongar la vida media en plasma y minimizar los efectos fuera de la diana. Estos nanocargadores ya han demostrado una eficacia notable contra varios tumores y poseen la capacidad única de encapsular cantidades sustanciales de inhibidores y degradadores de KRAS específicos de mutaciones, administrándolos de forma selectiva y eficiente a las células tumorales.

Específicamente, clonamos y expresamos varias variantes de ferritina humana (HFt), cada una compuesta por 24 monómeros que consisten en un motivo de ferritina y un polipéptido de blindaje inerte rico en residuos de prolina (P), alanina (A), serina (S) y glutamato (E) (PASE), unidos por un enlazador clivable por metaloproteasa (MMP). Empleamos la variante The-05, previamente reportada, para encapsular grandes cantidades del inhibidor específico de KRASG12C, Adagrasib, y el degradador PROTAC LC-2 (Figura 1C). El nanocargador The-05 forma una jaula capaz de incorporar numerosas moléculas de fármaco (hasta 150, dependiendo de la secuencia de la variante) dentro de su cavidad mediante un simple protocolo de cambio de pH. Este nanocargador blindado permanece inactivo durante la circulación, exhibiendo una alta estabilidad, una vida media prolongada en plasma, una mínima fuga de fármaco y una baja unión celular inespecífica (efectos fuera de la diana) hasta que se produce la escisión mediada por MMP exclusivamente dentro del microambiente tumoral (MET), donde las MMP se expresan en gran medida ([Fracasso et al., 2016]; [Falvo et al., 2018]; [Falvo et al., 2020]; [Falvo et al., 2021]; [Fracasso et al., 2023]; [Marrocco et al., 2024]) (Figura 1C). Tras la liberación selectiva del blindaje en el MET, The-05 se internaliza de forma eficaz y rápida en prácticamente todos los tipos de células cancerosas a través del receptor CD71 (receptor de transferrina/ferritina). CD71 se expresa en gran medida en las células tumorales de rápido crecimiento, incluyendo los focos metastásicos, debido a su importante demanda de hierro. Esta captación selectiva garantiza que el HF que contiene el fármaco se administre de forma eficiente a las células tumorales, donde la carga útil se libera rápidamente y puede unirse a su diana. Anteriormente, hemos demostrado la eficacia de estos nanocargadores sensibles a estímulos, en particular la última versión que incorpora antraciclinas o el inhibidor de la topoisomerasa I, Genz-664282, en modelos murinos de xenoinjerto de cáncer de páncreas y cáncer de mama, un modelo tumoral pancreático ortotópico y un modelo PDX pancreático. En todos estos estudios, se observó una administración de fármacos eficiente y específica al tumor, sin toxicidades aparentes fuera de la diana, lo que resultó en fuertes y duraderas reducciones en el crecimiento o el volumen del tumor, y un aumento marcado en la supervivencia postratamiento ([Falvo et al., 2021]; [Conti et al., 2021]; [Fracasso et al., 2023]; [Marrocco et al., 2024]).

En el presente estudio, aprovechamos nuestra innovadora plataforma de nanomedicina derivada de la ferritina, sensible a estímulos, para encapsular grandes cantidades del inhibidor específico de KRASG12C, Adagrasib, y el degradador PROTAC LC-2, y para administrarlos de forma específica y con alta eficiencia a las células tumorales en modelos celulares de CPNM y ADCP mutados en KRAS.

Materiales y métodos

Producción y caracterización de proteínas

La plataforma de nanocargadores utilizada en este estudio pertenece a la familia de las variantes de ferritina humana blindadas con PASE, sensibles a MMP (serie The-05). Estas construcciones incluyen un dominio de blindaje PASE externo, un enlazador clivable por metaloproteasa (MMP-2/9) y un núcleo de ferritina que se dirige a CD71, lo que confiere tanto estabilidad en la circulación como activación condicional dentro del microambiente tumoral. La producción y la caracterización completa de The-05 se informan en [Fracasso et al. (2016)], [Falvo et al. (2018)]; [Falvo et al. (2020)]. Brevemente, se construyó una construcción con la secuencia de expresión de la cadena pesada de la ferritina humana (HFt), donde el residuo de ácido glutámico cargado negativamente (Glu) se introdujo en lugar de cuatro residuos nativos de HFt, a saber, Lys53, Lys71, Thr135 y Lys143, seguido por una secuencia MMP (PLGLAG), que se reconoce como un sitio de escisión proteolítica por las metaloproteínas de la matriz, como MMP-2 y MMP-9, y por una secuencia de blindaje externo PASE (ASPAAPAPASPAEPAPSAPAASPAAPAPASPAEPAPSAPA), que se clonó en un vector de expresión pET-11a. La proteína recombinante The-05 se expresó en E. coli, se purificó y se cuantificó según se describió anteriormente (Falvo et al., 2016; [Falvo et al., 2018]; [Falvo et al., 2020]).

Compuestos

Adagrasib (MRTX849) se obtuvo de Selleck Chem (HPLC: 99,76% de pureza).

El LC-2, un PROTAC reclutador de VHL basado en MRTX849, se preparó siguiendo un procedimiento adaptado del informe original de Crews y colaboradores (ver Figura S1 en el material suplementario) ([Bond et al., 2020]). El 1-terc-butil 4-etil 3-oxopiperidina-1,4-dicarboxilato (2), disponible comercialmente, se hizo reaccionar con 2-metilisotiourea comercial en MeOH anhidro en presencia de NaOMe a temperatura ambiente para obtener el terc-butil 4-hidroxi-2-metiltio-6,8-dihidro-5H-pirido[3,4-d]pirimidina-7-carboxilato (3). Este último se trató con Tf2O en DCM anhidro en presencia de DIPEA para obtener el intermediario terc-butil 2-(metiltio)-4-(((trifluorometil)sulfonil)oxi)-5,8-dihidropirido[3,4-d]pirimidina-7(6H)-carboxilato (4), que luego se calentó a 100 °C en DMF anhidro en presencia de bencilo-(2S)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato1 y DIPEA para obtener el terc-butil (S)-4-(4-((benciloxi)carbonil)-3-(cianometil)piperazin-1-il)-2-(metiltio)-5,8-dihidropirido[3,4-d]pirimidina-7(6H)-carboxilato (5). Después de la desprotección con TFA en DCM anhidro en presencia de TIS a temperatura ambiente, el bencilo (S)-2-(cianometil)-4-(2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato resultante se trató con 1-bromo-8-cloro-naftaleno, disponible comercialmente, en presencia de Pd2(dba)3, RuPhos y Cs2CO3 en tolueno anhidro a 100 °C para obtener el intermediario bencilo (S)-4-(7-(8-cloronaftalen-1-il)-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato (6). Después de la oxidación con m-CPBA en DCM anhidro a 0 °C, el sulfóxido correspondiente (7) se hizo reaccionar con el terc-butil (S)-3-(3-(2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanoato1 recién preparado en tolueno anhidro en presencia de t-BuONa a 0 °C para obtener el intermediario bencilo (S)-4-(2-(((S)-1-(3-(3-(terc-butoxy)-3-oxopropoxi)propil)pirrolidin-2-il)metoxi)-7-(8-cloronaftalen-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato (8). Después de la hidrogenólisis mediante agitación en atmósfera de H2 en presencia de Pd/C en MeOH anhidro a temperatura ambiente, el acoplamiento posterior con el ácido 2-fluoroacrílico, disponible comercialmente, en presencia de HATU y DIPEA en DMF anhidro a temperatura ambiente produjo el intermediario terc-butil 3-(3-((S)-2-(((7-(8-cloronaftalen-1-il)-4-((S)-3-(cianometil)-4-(2-fluoroacroil)piperazin-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-2-il)oxi)metil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanoato (9). Después de la desprotección del éster con TFA en DCM anhidro a temperatura ambiente, el ácido resultante se acopló finalmente con el (1R)-1-[(2S,4R)-4-hidroxi-2-[[4-(4-metiltiazol-5-il)fenil]metilcarbamoil]pirrolidina-1-carbonil]-2,2-dimetil-propilo, disponible comercialmente, en presencia de HATU y DIPEA para obtener el compuesto final deseado (2S,4R)-1-((S)-2-(3-(3-((S)-2-(((7-(8-cloronaftalen-1-il)-4-((S)-3-(cianometil)-4-(2-fluoroacroil)piperazin-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-2-il)oxi)metil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanamido)-3,3-dimetilbutanoil)-4-hidroxi-N-(4-(4-metiltiazol-5-il)bencil)pirrolidina-2-carboxamida (LC-2, 1) (Figura S1 en el material suplementario).

La caracterización de LC-2 mediante espectros de RMN-1H, RMN-13C, espectros de masas de alta resolución (HR-MS) y análisis elemental se informa en la Figura S2 en el material suplementario.

Encapsulación de proteínas del fármaco Adagrasib y el PROTAC LC-2

El inhibidor de KRASG12C Adagrasib y el PROTAC KRASG12C LC-2 se encapsularon en The-05 utilizando el procedimiento de desensamblaje/reasamblaje de ferritina descrito previamente para otros compuestos, con una relación molar fármaco:proteína de 120:1 ([Falvo et al., 2020]). Brevemente, las soluciones de The-05 (2 mg/mL) en H2Odd se incubaron durante 10 minutos a pH 3,1 (pH ajustado con HCl). El desensamblaje/reasamblaje de la proteína se logró mediante la adición gradual de NaOH hasta alcanzar un pH de 7,5. Después de 20 minutos de agitación a temperatura ambiente, el producto se filtró para eliminar las partículas insolubles. El exceso de fármaco/PROTAC no unido se eliminó utilizando dispositivos de centrifugación Amicon Ultra-15 de 100 kDa, en 10 mM de Tris-HCl a pH 7,5. Finalmente, la solución se filtró estérilmente y se almacenó a 2-8 °C en la oscuridad.

Adagrasib y LC-2 se cuantificaron mediante espectroscopía UV-vis, después de extraer el fármaco en 0,1 N de HCl, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado ? = 9.780 M-1 cm-1 a 333 nm. El contenido de proteína también se determinó mediante espectroscopía UV-vis aplicando la siguiente corrección para la absorbancia a 280 nm: A280 nm - (A333 nm x 1,6). El PROTAC LC-2 se cuantificó utilizando el coeficiente de extinción molar calculado ? = 7.700 M-1 cm-1 a 333 nm. El contenido de proteína también se determinó mediante espectroscopía UV-vis aplicando la siguiente corrección para la absorbancia a 280 nm: A280 nm - (A333 nm x 3,2).

Se demostró la encapsulación eficaz y la lenta fuga de fármacos mediante experimentos de diafiltración repetidos (experimentos de intercambio de tampón Tris mediante la concentración repetida de la muestra y su reconstitución con un tampón nuevo), en los que las muestras de The-05-Adagrasib y The-05-LC-2 se microdializaron con un aparato de microfiltración Amicon Ultra MWCO de 10 kDa, y se evaluó la extensión de la fuga de fármacos en el tampón midiendo los espectros UV-vis tanto de la proteína del retentado como de las muestras del filtrado.

Caracterización del complejo

La pureza de todas las preparaciones se evaluó mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 15%, teñidos con GelCode Blue Safe Protein Stain (Thermofisher scientific, Milán, Italia). Los experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizaron utilizando una columna de filtración en gel Superose 6, equilibrada con PBS a pH 7,4. Todas las muestras se prepararon a 1 mg/mL en PBS filtrado. Todos los rastros de los experimentos de SEC se analizaron con QtiPlot (IONDEV SRL, Bucarest, Rumanía).

Los experimentos de fotometría de masas se realizaron utilizando el instrumento Refeyn OneMP. Las muestras (200 nM) se diluyeron a 20 nM en tampón PBS sobre las láminas de vidrio, que previamente se ensamblaron en cámaras de muestra con juntas de silicona para evitar la evaporación. Los datos se adquirieron durante 60 segundos por muestra y se procesaron utilizando el software DiscoverMP para detectar eventos de aterrizaje individuales y generar la distribución de masas. La calibración se realizó utilizando estándares de proteína de peso molecular conocido (MassFerence™ P1 Calibrant) diluidos en tampón PBS.

Líneas celulares y tratamiento

Las líneas celulares humanas de adenocarcinoma de páncreas (PDAC) MiaPaCa-2 y de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) Calu-1, que presentan mutación KRASG12C, se mantuvieron en medio DMEM (Gibco® Thermo Fisher Scientific) suplementado con 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor a 37 °C en un incubador con una atmósfera de 5% de CO2 humidificada.

En todos los experimentos, se sembraron 3,5 × 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y, después de 24 horas, se trataron con Adagrasib o el PROTAC LC-2, ya sea solos o encapsulados en nanopartículas de The-05, o con tampón (NT) o con The-05 vacío a la concentración más alta utilizada para cada experimento (FT), pretratados para simular las condiciones dentro del microentorno tumoral (MET). Específicamente, The-05-Adagrasib y The-05-LC-2 se preincubaron durante 30 minutos a 37 °C con colagenasa IV (Clostridium histolyticum, que contiene MMP-2 y MMP-9; Panbiotech, Leipzig, Alemania) en una relación molar de 1:1.000 para aumentar los niveles de metaloproteasas, lo que mejora la liberación del componente de protección PASE.

Las células Calu-1 y MiaPaCa2 se trataron con Adagrasib a concentraciones finales de 5 nM, 25 nM, 100 nM y 500 nM durante 72 horas, ya sea solo o encapsulado en nanopartículas de The-05.

Las células Calu-1 y MiaPaCa2 se trataron con el PROTAC LC-2 a concentraciones finales de 500 nM, 1 µM y 2 µM durante 72 horas, ya sea solo o encapsulado en nanopartículas de The-05.

Las concentraciones de fármacos encapsulados se calcularon a partir de la concentración de nanopartículas de The-05 y la carga de fármacos por nanopartícula. Los fármacos encapsulados y no encapsulados se probaron a concentraciones molares equivalentes.

Ensayo de proliferación celular y muerte celular

Para el análisis de la proliferación, se sembraron 3,5 × 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y, después de 24 horas, se trataron con Adagrasib o el PROTAC LC-2, ya sea solos o encapsulados en nanopartículas de The-05 durante 72 horas. La proliferación se evaluó utilizando el ensayo de exclusión de azul de trypan. La muerte celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de yoduro de propidio y se analizó mediante citometría de flujo (CyAN ADP DAKO, Beckman Coulter, Brea, CA, Estados Unidos).

Preparación de lisados y análisis de inmunoblotting

Las células se lisaron en un tampón de SDS al 2% (suplementado con 10 µL de PMSF, 10 µL de Na2VO3, 20 µL de PIC, 1 µL de leupeptina, 1 µL de NaF, 25 µL de Na2PO4). Los lisados se sonicaron durante 15 segundos y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos para eliminar los desechos, y se cuantificaron utilizando el ensayo de Bradford (Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. El inmunoblotting se realizó cargando 40 µg de lisados de proteína en geles de SDS-PAGE, seguido del traslado a membranas de nitrocelulosa (Protran). Las membranas se bloquearon con leche al 5% durante 1 hora y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios: anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH (1:2000, #TA802519, OriGene Technologies, Rockville, Estados Unidos), anticuerpo monoclonal de conejo anti-Fosfo-ERK1/ERK2 (P44/P42 MAPK) (T202/Y204 #MAB-94122 Immunological Science, Italia); anticuerpo monoclonal de conejo anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (1:1.000 #4695 Cell Signaling, Danvers, MA, Estados Unidos); anticuerpo policlonal de conejo anti-PanRAS (1:1.000 #3965, Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts, Estados Unidos). Como anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpo anti-ratón (1:10.000) y anticuerpo anti-conejo (1:5.000) conjugados con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, Estados Unidos). Las señales de proteína se desarrollaron utilizando la detección ECL con un instrumento ChemiDoc-It Imaging System (UVP, Upland, CA).

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos). Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Todos los experimentos se realizaron con n = 3 réplicas independientes. Se consideró que un valor de P ≤ 0,05 era estadísticamente significativo.

Producción y caracterización de proteínas

La plataforma de administración de fármacos utilizada en este estudio pertenece a la familia de las variantes de ferritina humana protegidas con PASE y sensibles a las MMP (serie The-05). Estas construcciones incluyen un dominio de protección PASE externo, un enlazador clivable por metaloproteasas (MMP-2/9) y un núcleo de ferritina que se dirige a CD71, lo que confiere tanto estabilidad en la circulación como activación condicional dentro del microentorno tumoral. La producción y la caracterización completa de The-05 se informan en [Fracasso et al. (2016)], [Falvo et al. (2018)]; [Falvo et al. (2020)]. Brevemente, se clonó en un vector de expresión pET-11a una construcción con la secuencia de expresión de la cadena pesada de la ferritina humana (HFt), en la que el residuo de ácido glutámico cargado negativamente (Glu) se introdujo en lugar de cuatro residuos nativos de HFt, a saber, Lys53, Lys71, Thr135 y Lys143, seguido de una secuencia de MMP (PLGLAG), que se reconoce como un sitio de escisión proteolítica por las metaloproteínas de la matriz, como las MMP-2 y MMP-9, y por una secuencia de protección externa PASE (ASPAAPAPASPAEPAPSAPAASPAAPAPASPAEPAPSAPA). La proteína recombinante The-05 se expresó en E. coli, se purificó y se cuantificó según se describió anteriormente (Falvo et al., 2016; [Falvo et al., 2018]; [Falvo et al., 2020]).

Compuestos

Adagrasib (MRTX849) se obtuvo de Selleck Chem (HPLC: 99,76% de pureza).

El LC-2, un PROTAC reclutador de VHL basado en MRTX849, se preparó siguiendo un procedimiento adaptado del informe original de Crews y colaboradores (ver Figura S1 en el material suplementario) ([Bond et al., 2020]). El 1-terc-butil 4-etil 3-oxopiperidina-1,4-dicarboxilato (2), disponible comercialmente, se hizo reaccionar con 2-metilisotiourea comercial en MeOH anhidro en presencia de NaOMe a temperatura ambiente para obtener el terc-butil 4-hidroxi-2-metiltio-6,8-dihidro-5H-pirido[3,4-d]pirimidina-7-carboxilato (3). Este último se trató con Tf2O en DCM anhidro en presencia de DIPEA para obtener el intermedio terc-butil 2-(metiltio)-4-(((trifluorometil)sulfonil)oxi)-5,8-dihidropirido[3,4-d]pirimidina-7(6H)-carboxilato (4), que luego se calentó a 100 °C en DMF anhidro en presencia de bencil-(2S)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato1 y DIPEA para obtener el terc-butil (S)-4-(4-((benciloxi)carbonil)-3-(cianometil)piperazin-1-il)-2-(metiltio)-5,8-dihidropirido[3,4-d]pirimidina-7(6H)-carboxilato (5). Después de la desprotección con TFA en DCM anhidro en presencia de TIS a temperatura ambiente, el bencil (S)-2-(cianometil)-4-(2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)piperazina-1-carboxilato resultante se trató con 1-bromo-8-cloro-naftaleno, disponible comercialmente, en presencia de Pd2(dba)3, RuPhos y Cs2CO3 en tolueno anhidro a 100 °C para obtener el intermedio bencil (S)-4-(7-(8-cloronaftalen-1-il)-2-(metiltio)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato (6). Después de la oxidación con m-CPBA en DCM anhidro a 0 °C, el sulfóxido correspondiente (7) se hizo reaccionar con el terc-butil (S)-3-(3-(2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanoato1 recién preparado en tolueno anhidro en presencia de t-BuONa a 0 °C para obtener el intermedio bencil (S)-4-(2-(((S)-1-(3-(3-(terc-butoxy)-3-oxopropoxi)propil)pirrolidin-2-il)metoxi)-7-(8-cloronaftalen-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-4-il)-2-(cianometil)piperazina-1-carboxilato (8). Después de la hidrogenólisis, agitando bajo atmósfera de H2 en presencia de Pd/C en MeOH anhidro a temperatura ambiente, el acoplamiento posterior con el ácido 2-fluoroacrílico, disponible comercialmente, en presencia de HATU y DIPEA en DMF anhidro a temperatura ambiente produjo el intermedio terc-butil 3-(3-((S)-2-(((7-(8-cloronaftalen-1-il)-4-((S)-3-(cianometil)-4-(2-fluoroacroil)piperazin-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-2-il)oxi)metil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanoato (9). Después de la desprotección del éster con TFA en DCM anhidro a temperatura ambiente, el ácido resultante se acopló finalmente con el (1R)-1-[(2S,4R)-4-hidroxi-2-[[4-(4-metiltiazol-5-il)fenil]metilcarbamoil]pirrolidina-1-carbonil]-2,2-dimetil-propilo comercial en presencia de HATU y DIPEA para obtener el compuesto final deseado (2S,4R)-1-((S)-2-(3-(3-((S)-2-(((7-(8-cloronaftalen-1-il)-4-((S)-3-(cianometil)-4-(2-fluoroacroil)piperazin-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3,4-d]pirimidin-2-il)oxi)metil)pirrolidin-1-il)propoxi)propanamido)-3,3-dimetilbutanoil)-4-hidroxi-N-(4-(4-metiltiazol-5-il)bencil)pirrolidina-2-carboxamida (LC-2, 1) (Figura S1 en el material suplementario).

La caracterización de LC-2 mediante espectros de RMN-1H, RMN-13C, espectros de masas de alta resolución (HR-MS) y análisis elemental se informa en la Figura S2 en el material suplementario.

Encapsulación de proteínas del fármaco Adagrasib y el PROTAC LC-2

El inhibidor de KRASG12C Adagrasib y el PROTAC LC-2 se encapsularon en The-05 utilizando el procedimiento de desensamblaje/reasamblaje de ferritina descrito previamente para otros compuestos, con una relación molar fármaco:proteína de 120:1 ([Falvo et al., 2020]). Brevemente, se incubaron soluciones de The-05 (2 mg/mL) en H2Odd durante 10 minutos a un pH de 3,1 (pH ajustado con HCl). El desensamblaje/reasamblaje de la proteína se logró mediante la adición gradual de NaOH hasta alcanzar un pH de 7,5. Después de 20 minutos de agitación a temperatura ambiente, el producto se filtró para eliminar las partículas insolubles. El exceso de fármaco/PROTAC no unido se eliminó utilizando dispositivos de centrifugación Amicon Ultra-15 de 100 kDa, en 10 mM de Tris-HCl a pH 7,5. Finalmente, la solución se filtró estérilmente y se almacenó a 2-8 °C en la oscuridad.

Adagrasib y LC-2 se cuantificaron mediante espectroscopía UV-vis, después de extraer el fármaco en 0,1 N de HCl, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado ? = 9.780 M-1 cm-1 a 333 nm. El contenido de proteína también se determinó mediante espectroscopía UV-vis aplicando la siguiente corrección para la absorbancia a 280 nm: A280 nm - (A333 nm x 1,6). El PROTAC LC-2 se cuantificó utilizando el coeficiente de extinción molar calculado ? = 7.700 M-1 cm-1 a 333 nm. El contenido de proteína también se determinó mediante espectroscopía UV-vis aplicando la siguiente corrección para la absorbancia a 280 nm: A280 nm - (A333 nm x 3,2).

La encapsulación eficaz y la lenta fuga de fármacos se demostraron mediante experimentos de diafiltración repetidos (experimentos de intercambio de tampón Tris mediante la concentración repetida de la muestra y su reconstitución con un nuevo tampón), en los que las muestras de The-05-Adagrasib y The-05-LC-2 se microdializaron con un aparato de microfiltración Amicon Ultra MWCO de 10 kDa, y se evaluó la extensión de la fuga de fármacos en el medio mediante la medición de los espectros UV-vis tanto de la proteína retenida como de las muestras del filtrado.

Caracterización del complejo

La pureza de todas las preparaciones se evaluó mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 15%, teñidos con tinte de proteína seguro GelCode Blue (Thermofisher scientific, Milán, Italia). Los experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizaron utilizando una columna de filtración en gel Superose 6, equilibrada con PBS a pH 7,4. Todas las muestras se prepararon a 1 mg/mL en PBS filtrado. Todos los rastros de los experimentos de SEC se analizaron con QtiPlot (IONDEV SRL, Bucarest, Rumanía).

Los experimentos de fotometría de masas se realizaron utilizando el instrumento Refeyn OneMP. Las muestras (200 nM) se diluyeron a 20 nM en tampón PBS sobre las cubiertas de vidrio, previamente ensambladas en cámaras de muestra con juntas de silicona para evitar la evaporación. Los datos se adquirieron durante 60 segundos por muestra y se procesaron utilizando el software DiscoverMP para detectar eventos de aterrizaje individuales y generar la distribución de masas. La calibración se realizó utilizando estándares de proteína de peso molecular conocido (Calibrante MassFerence™ P1) diluidos en tampón PBS.

Líneas celulares y tratamiento

Las líneas celulares humanas de adenocarcinoma de páncreas (PDAC) MiaPaCa-2 y de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) Calu-1, que presentan mutación KRASG12C, se mantuvieron en medio DMEM (Gibco® Thermo Fisher Scientific) suplementado con 50 U/mL de penicilina, 50 U/mL de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor a 37 °C en un incubador con una atmósfera de CO2 humidificada al 5%.

En todos los experimentos, se sembraron 3,5 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos y, después de 24 horas, se trataron con Adagrasib o el PROTAC LC-2, ya sea solos o encapsulados en nanopartículas de The-05, o con tampón (NT) o con The-05 vacío a la concentración más alta utilizada para cada experimento (FT), pretratados para simular las condiciones dentro del microambiente tumoral (TME). Específicamente, The-05-Adagrasib y The-05-LC-2 se preincubaron durante 30 minutos a 37 °C con colagenasa IV (Clostridium histolyticum, que contiene MMP-2 y MMP-9; Panbiotech, Leipzig, Alemania) en una relación molar de 1:1.000 para aumentar los niveles de metaloproteasas, lo que mejora la liberación del componente de protección PASE.

Las células Calu-1 y MiaPaCa2 se trataron con Adagrasib a concentraciones finales de 5 nM, 25 nM, 100 nM y 500 nM durante 72 horas, ya sea solo o encapsulado en nanopartículas de The-05.

Las células Calu-1 y MiaPaCa2 se trataron con el PROTAC LC-2 a concentraciones finales de 500 nM, 1 µM y 2 µM durante 72 horas, ya sea solo o encapsulado en nanopartículas de The-05.

Las concentraciones de fármacos encapsulados se calcularon a partir de la concentración de nanopartículas de The-05 y la carga de fármacos por nanopartícula. Los fármacos encapsulados y no encapsulados se probaron a concentraciones molares equivalentes.

Ensayo de proliferación celular y muerte celular

Para el análisis de la proliferación, se sembraron 3,5 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos y, después de 24 horas, se trataron con Adagrasib o el PROTAC LC-2, ya sea solos o encapsulados en nanopartículas de The-05 durante 72 horas. La proliferación se evaluó utilizando el ensayo de exclusión de azul de trypan. La muerte celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de yoduro de propidio y se analizó mediante citometría de flujo (CyAN ADP DAKO, Beckman Coulter, Brea, CA, Estados Unidos).

Preparación de lisados y análisis de inmunoblotting

Las células se lisaron en un tampón de SDS al 2% (suplementado con 10 µL de PMSF, 10 µL de Na2VO3, 20 µL de PIC, 1 µL de leupeptina, 1 µL de NaF, 25 µL de Na2PO4). Los lisados se sonicaron durante 15 segundos y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos para eliminar los residuos, y se cuantificaron utilizando el ensayo de Bradford (Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. El inmunoblotting se realizó cargando 40 µg de lisados de proteína en geles de SDS-PAGE, seguido del traslado a membranas de nitrocelulosa (Protran). Las membranas se bloquearon con leche al 5% durante 1 hora y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios: anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH (1:2000, #TA802519, OriGene Technologies, Rockville, Estados Unidos), anticuerpo monoclonal de conejo anti-Fosfo-ERK1/ERK2 (P44/P42 MAPK) (T202/Y204 #MAB-94122 Immunological Science, Italia); anticuerpo monoclonal de conejo anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (1:1.000 #4695 Cell Signaling, Danvers, MA, Estados Unidos); anticuerpo policlonal de conejo anti-PanRAS (1:1.000 #3965, Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts, Estados Unidos). Como anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpo anti-ratón (1:10.000) y anticuerpo anti-conejo (1:5.000) conjugados con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, Estados Unidos). Las señales de proteína se desarrollaron utilizando la detección ECL con un instrumento ChemiDoc-It Imaging System (UVP, Upland, CA).

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos). Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Todos los experimentos se realizaron con n = 3 réplicas independientes. Se consideró que un valor de P ≤ 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

Encapsulación y caracterización de The-05 cargado con el inhibidor de KRASG12C (Adagrasib) y el degradador (LC-2)

Encapsulamos con éxito el inhibidor de KRASG12C Adagrasib y el PROTAC degradador LC-2 dentro de la cavidad interna de nuestro nanotransportador The-05 utilizando un método de desensamblaje/reasamblaje de proteínas adaptado ([Falvo et al., 2020]; ver Métodos). Este proceso logró una eficiencia de encapsulación de aproximadamente 43 ± 10 (43% ± 23%) moléculas de Adagrasib (correspondiente a aproximadamente el 39-43% de las 100-110 moléculas iniciales) y 90 ± 10 (90% ± 11%) moléculas de LC-2 (correspondiente a aproximadamente el 82-90% de las 100-110 moléculas iniciales) por The-05 de 24 mer. Para ambos compuestos, la recuperación total de proteínas fue de aproximadamente el 70%. La concentración de proteína antes y después de la encapsulación se determinó mediante espectroscopía UV-visible midiendo la absorbancia a 280 nm. La recuperación de proteínas se calculó como el porcentaje de proteína retenida después de la purificación en relación con la cantidad inicial, según la siguiente ecuación:

El valor informado (alrededor del 70%) indica que aproximadamente el 30% de la proteína inicial se perdió durante los pasos de desensamblaje/reasamblaje y filtración.

Los espectros UV representativos confirmaron la formación exitosa del complejo tanto para The-05-Adagrasib (Figura 2A) como para The-05-LC-2 (Figura 2B).

Se realizó una caracterización adicional mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), lo que confirmó la pureza, la monodispersidad y la integridad estructural de los complejos nanotransportador:fármaco. El SDS-PAGE reveló que The-05 migró como una banda única y pura a aproximadamente 35 kDa (Figura 2C). Es importante destacar que no se observaron diferencias significativas en la estructura o el ensamblaje de la proteína después de la encapsulación del fármaco, lo que indica que el proceso de encapsulación no compromete la integridad general del constructo The-05 (Figuras 2D, E). Además, el perfilado por SEC no mostró evidencia de agregación del compuesto o fuga del fármaco después de almacenar los complejos a -20 °C durante 6 meses, lo que sugiere una excelente estabilidad a largo plazo. Actualmente, se están realizando estudios de estabilidad a largo plazo de los constructos The-05 cargados con fármacos. Si bien el presente trabajo incluye una evaluación de estabilidad de 6 meses que demuestra la encapsulación del fármaco, sin agregación o fuga del fármaco detectables (Figura S3 del material suplementario), las evaluaciones de almacenamiento prolongado y pruebas de estrés se abordarán en estudios futuros para respaldar aún más el desarrollo traslacional de este sistema de nanotransportadores.

Para excluir la adsorción superficial inespecífica, realizamos una incubación de control de The-05 con cada fármaco a pH neutro, sin desensamblaje/reasamblaje ácido (datos no mostrados). En estas condiciones, la eficiencia de carga se mantuvo por debajo del 10%, lo que confirma que la incorporación significativa solo se produce después de la apertura de la jaula y que los valores de carga observados reflejan la verdadera encapsulación interna.

Se realizaron experimentos de fotometría de masa utilizando un instrumento Refeyn OneMP para evaluar la susceptibilidad de la secuencia PASE de The-05-Adagrasib a las metaloproteasas del microambiente tumoral (TME). Las muestras de The-05-Adagrasib (20 nM) en tampón PBS, tanto no tratadas como pretratadas para simular las condiciones del microambiente tumoral (TME). Específicamente, The-05-Adagrasib se preincubó durante 30 minutos a 37 °C con colagenasa IV (Clostridium histolyticum, que contiene MMP-2 y MMP-9; Panbiotech, Leipzig, Alemania) en una relación molar de 1:1. Este paso, esencial para desencadenar la liberación del resto de protección PASE, libera eficazmente PASE, preparando el nanovector para una internalización eficaz a través de CD71 (Figura S4 del material suplementario).

Eficacia de los inhibidores de KRAS encapsulados en The-05 en modelos celulares de NSCLC y PDAC con mutación KRASG12C

Investigamos la eficacia tanto de los inhibidores de KRASG12C libres como de los encapsulados en The-05, en las líneas celulares Calu-1 (NSCLC) y MiaPaCa-2 (PDAC), ambas con la mutación KRASG12C. Primero, confirmamos altos niveles de expresión del receptor CD71 (TfR1) en ambas líneas celulares (Figura S5 del material suplementario), lo que indica que The-05 puede internalizarse fácilmente en estas células cancerosas a través de la captación mediada por CD71. En consecuencia, después de 72 horas, el tratamiento con The-05-Adagrasib mostró un efecto dependiente de la dosis similar al de Adagrasib libre en las células Calu-1 (paneles de la izquierda) y MiaPaCa-2 (paneles de la derecha) (Figura 3A). Específicamente, en las células Calu-1, observamos un aumento estadísticamente significativo de la muerte celular después del tratamiento con The-05-Adagrasib a concentraciones de 25 nM, 100 nM y 500 nM, en comparación con las células no tratadas y las células tratadas con Adagrasib solo (Figuras 3A, E). En consecuencia, el ensayo de proliferación mostró que el tratamiento con The-05-Adagrasib a dosis más altas (100 nM y 500 nM) fue ligeramente más eficaz que Adagrasib solo, lo que condujo a una reducción del 74% en la proliferación celular en comparación con el 66% con Adagrasib (Figuras 3B, E). De manera similar, la inhibición de la vía KRAS, evaluada mediante la relación fosfo-ERK/ERK total después de 72 horas de tratamiento (Figuras 3C-E), confirmó la mayor eficacia de Adagrasib cuando se administra a través de The-05 en comparación con la formulación del fármaco libre. En paralelo, el análisis del tratamiento con The-05-Adagrasib sobre la muerte celular, la proliferación celular y la inhibición de la vía KRAS en las líneas celulares MiaPaCa-2 mostró un efecto comparable entre Adagrasib libre y Adagrasib encapsulado en el nanotransportador The-05, lo que sugiere una menor respuesta de las células MiaPaCa-2 al sistema de administración The-05 en comparación con las células Calu-1. Estos hallazgos resaltan la potencia terapéutica de Adagrasib cuando se administra mediante nuestra plataforma de nanotransportadores en las líneas celulares NSCLC y PDAC.

Eficacia y degradación de KRAS con los degradadores de KRAS encapsulados en The-05 en modelos celulares

Se observaron mejoras similares al probar el degradador PROTAC LC-2, tanto libre como encapsulado en The-05, en las líneas celulares Calu-1 y MiaPaCa-2 (Figura 4). Al igual que con Adagrasib, las células Calu-1 mostraron una mayor sensibilidad a la actividad de The-05 LC-2 en comparación con las células MiaPaCa-2. El análisis de la proliferación celular y la inhibición de la vía KRAS en Calu-1 mostró un aumento de la actividad del fármaco para The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM y 1 µM. Específicamente, a 500 nM y 1 µM, la proliferación celular disminuyó en un 38% y un 37% con LC-2, y en un 53% y un 66% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura 4A, panel derecho). En paralelo, la fosforilación de ERK se redujo en un 61% y un 73% con LC-2, y en un 73% y un 83% con The-05-LC-2, respectivamente (Figuras 4B, C, panel derecho). En contraste, aunque The-05-LC-2 también mostró efectos estadísticamente significativos en las células MiaPaCa-2, su actividad fue comparable a la de LC-2 libre (Figuras 4A, B-C, panel izquierdo), lo que sugiere una sensibilidad diferencial de las líneas celulares cancerosas al sistema de administración basado en nanotransportadores. Los valores ajustados de LD50 de la proliferación celular (dosis a la que se observa una reducción del 50% en la proliferación celular) son de 0,5 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,2 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,6 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,0 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa; los valores ajustados de IC50 de KRAS (dosis a la que se observa una inhibición del 50% de la vía KRAS) son de 0,3 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,8 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,4 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,6 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa (Figura 4D).

La degradación de KRAS tras el tratamiento también se midió para The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM, 1 µM y 2 µM en Calu-1. 6 horas después del tratamiento con 500 nM, 1 µM y 2 µM, los niveles de KRAS disminuyeron en un 62%, un 80% y un 84% con LC-2, y en un 71%, un 79% y un 80% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura S6 del material suplementario). El valor ajustado de DC50 (concentración a la que se observa una degradación de KRAS del 50%) es de 0,2 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,4 µM para LC-2 libre.

Encapsulación y caracterización de The-05 cargado con el inhibidor de KRASG12C (Adagrasib) y el degradador (LC-2)

Encapsulamos con éxito el inhibidor de KRASG12C Adagrasib y el degradador PROTAC LC-2 dentro de la cavidad interna de nuestro nanotransportador The-05 utilizando un método adaptado de desensamblaje/reasamblaje de proteínas ([Falvo et al., 2020]; consulte Métodos). Este proceso logró una eficiencia de encapsulación de aproximadamente 43 ± 10 (43% ± 23%) moléculas de Adagrasib (correspondiente a aproximadamente el 39-43% de las 100-110 moléculas iniciales) y 90 ± 10 (90% ± 11%) moléculas de LC-2 (correspondiente a aproximadamente el 82-90% de las 100-110 moléculas iniciales) por The-05 de 24 mer. Para ambos compuestos, la recuperación proteica total fue de aproximadamente el 70%. La concentración de proteína antes y después de la encapsulación se determinó mediante espectroscopía UV-visible midiendo la absorbancia a 280 nm. La recuperación proteica se calculó como el porcentaje de proteína retenida después de la purificación en relación con la cantidad inicial, según la siguiente ecuación:

El valor informado (alrededor del 70%) indica que aproximadamente el 30% de la proteína inicial se perdió durante los pasos de desensamblaje/reasamblaje y filtración.

Los espectros UV representativos confirmaron la formación exitosa del complejo tanto para The-05-Adagrasib (Figura 2A) como para The-05-LC-2 (Figura 2B).

Se realizó una caracterización adicional mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), lo que confirmó la pureza, la monodispersidad y la integridad estructural de los complejos nanotransportador:fármaco. El SDS-PAGE reveló que The-05 migró como una banda única y pura a aproximadamente 35 kDa (Figura 2C). Es importante destacar que no se observaron diferencias significativas en la estructura o el ensamblaje de la proteína después de la encapsulación del fármaco, lo que indica que el proceso de encapsulación no compromete la integridad general del constructo The-05 (Figuras 2D, E). Además, el perfilado por SEC no mostró evidencia de agregación del compuesto o fuga del fármaco después de almacenar los complejos a -20 °C durante 6 meses, lo que sugiere una excelente estabilidad a largo plazo. Actualmente, se están realizando estudios de estabilidad a largo plazo de los constructos The-05 cargados con fármacos. Si bien el presente trabajo incluye una evaluación de estabilidad de 6 meses que demuestra la encapsulación del fármaco, sin agregación o fuga del fármaco detectables (Figura S3 del material suplementario), las evaluaciones de almacenamiento prolongado y pruebas de estrés se abordarán en estudios futuros para respaldar aún más el desarrollo traslacional de este sistema de nanotransportadores.

Para excluir la adsorción superficial inespecífica, realizamos una incubación de control de The-05 con cada fármaco a pH neutro, sin desensamblaje/reasamblaje ácido (datos no mostrados). En estas condiciones, la eficiencia de carga se mantuvo por debajo del 10%, lo que confirma que la incorporación significativa solo se produce después de la apertura de la jaula y que los valores de carga observados reflejan la verdadera encapsulación interna.

Se realizaron experimentos de fotometría de masa utilizando un instrumento Refeyn OneMP para evaluar la susceptibilidad de la secuencia PASE de The-05-Adagrasib a las metaloproteasas del microambiente tumoral (TME). Las muestras de The-05-Adagrasib (20 nM) en tampón PBS, tanto no tratadas como pretratadas para simular las condiciones del microambiente tumoral (TME). Específicamente, The-05-Adagrasib se preincubó durante 30 minutos a 37 °C con colagenasa IV (Clostridium histolyticum, que contiene MMP-2 y MMP-9; Panbiotech, Leipzig, Alemania) en una relación molar de 1:1. Este paso, esencial para desencadenar la liberación del resto de protección PASE, libera eficazmente PASE, preparando el nanovector para una internalización eficaz a través de CD71 (Figura S4 del material suplementario).

Eficacia de los inhibidores de KRAS encapsulados en The-05 en modelos celulares de NSCLC y PDAC con mutación KRASG12C

Investigamos la eficacia tanto de los inhibidores de KRASG12C libres como de los encapsulados en The-05, en las líneas celulares Calu-1 (NSCLC) y MiaPaCa-2 (PDAC), ambas con la mutación KRASG12C. Primero, confirmamos altos niveles de expresión del receptor CD71 (TfR1) en ambas líneas celulares (Figura S5 del material suplementario), lo que indica que The-05 puede internalizarse fácilmente en estas células cancerosas a través de la captación mediada por CD71. En consecuencia, después de 72 horas, el tratamiento con The-05-Adagrasib mostró un efecto dependiente de la dosis similar al de Adagrasib libre en las células Calu-1 (paneles de la izquierda) y MiaPaCa-2 (paneles de la derecha) (Figura 3A). Específicamente, en las células Calu-1, observamos un aumento estadísticamente significativo de la muerte celular después del tratamiento con The-05-Adagrasib a concentraciones de 25 nM, 100 nM y 500 nM, en comparación con las células no tratadas y las células tratadas con Adagrasib solo (Figuras 3A, E). En consecuencia, el ensayo de proliferación mostró que el tratamiento con The-05-Adagrasib a dosis más altas (100 nM y 500 nM) fue ligeramente más eficaz que Adagrasib solo, lo que condujo a una reducción del 74% en la proliferación celular en comparación con el 66% con Adagrasib (Figuras 3B, E). De manera similar, la inhibición de la vía KRAS, evaluada mediante la relación fosfo-ERK/ERK total después de 72 horas de tratamiento (Figuras 3C-E), confirmó la mayor eficacia de Adagrasib cuando se administra a través de The-05 en comparación con la formulación del fármaco libre. En paralelo, el análisis del tratamiento con The-05-Adagrasib sobre la muerte celular, la proliferación celular y la inhibición de la vía KRAS en las líneas celulares MiaPaCa-2 mostró un efecto comparable entre Adagrasib libre y Adagrasib encapsulado en el nanotransportador The-05, lo que sugiere una menor respuesta de las células MiaPaCa-2 al sistema de administración The-05 en comparación con las células Calu-1. Estos hallazgos resaltan la potencia terapéutica de Adagrasib cuando se administra mediante nuestra plataforma de nanotransportadores en las líneas celulares NSCLC y PDAC.

Eficacia y degradación de KRAS con los degradadores de KRAS encapsulados en The-05 en modelos celulares

Se observaron mejoras similares al probar el degradador PROTAC LC-2, tanto libre como encapsulado en The-05, en las líneas celulares Calu-1 y MiaPaCa-2 (Figura 4). Al igual que con Adagrasib, las células Calu-1 mostraron una mayor sensibilidad a la actividad de The-05 LC-2 en comparación con las células MiaPaCa-2. El análisis de la proliferación celular y la inhibición de la vía KRAS en Calu-1 mostró un aumento de la actividad del fármaco para The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM y 1 µM. Específicamente, a 500 nM y 1 µM, la proliferación celular disminuyó en un 38% y un 37% con LC-2, y en un 53% y un 66% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura 4A, panel derecho). En paralelo, la fosforilación de ERK se redujo en un 61% y un 73% con LC-2, y en un 73% y un 83% con The-05-LC-2, respectivamente (Figuras 4B, C, panel derecho). En contraste, aunque The-05-LC-2 también mostró efectos estadísticamente significativos en las células MiaPaCa-2, su actividad fue comparable a la de LC-2 libre (Figuras 4A, B-C, panel izquierdo), lo que sugiere una sensibilidad diferencial de las líneas celulares cancerosas al sistema de administración basado en nanotransportadores. Los valores ajustados de LD50 de la proliferación celular (dosis a la que se observa una reducción del 50% en la proliferación celular) son de 0,5 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,2 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,6 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,0 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa; los valores ajustados de IC50 de KRAS (dosis a la que se observa una inhibición del 50% de la vía KRAS) son de 0,3 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,8 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,4 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,6 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa (Figura 4D).

La degradación de KRAS tras el tratamiento también se midió para The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM, 1 µM y 2 µM en Calu-1. 6 horas después del tratamiento con 500 nM, 1 µM y 2 µM, los niveles de KRAS disminuyeron en un 62%, un 80% y un 84% con LC-2, y en un 71%, un 79% y un 80% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura S6 del material suplementario). El valor ajustado de DC50 (concentración a la que se observa una degradación de KRAS del 50%) es de 0,2 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,4 µM para LC-2 libre.

Se observaron mejoras similares al probar el degradador PROTAC LC-2, tanto en forma libre como encapsulado en The-05, en las líneas celulares Calu-1 y MiaPaCa-2 (Figura 4). En cuanto a Adagrasib, las células Calu-1 mostraron una mayor sensibilidad a la actividad de The-05 LC-2 en comparación con las células MiaPaCa-2. El análisis de la proliferación celular y la inhibición de la vía KRAS en Calu-1 mostró el aumento de la actividad del fármaco para The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM y 1 µM. Específicamente, a 500 nM y 1 µM, la proliferación celular disminuyó en un 38% y un 37% con LC-2, y en un 53% y un 66% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura 4A, panel derecho). En paralelo, la fosforilación de ERK se redujo en un 61% y un 73% con LC-2, y en un 73% y un 83% con The-05-LC-2, respectivamente (Figuras 4B, C, panel derecho). En contraste, aunque The-05-LC-2 también mostró efectos estadísticamente significativos en las células MiaPaCa-2, su actividad fue comparable a la de LC-2 libre (Figuras 4A, B–C, panel izquierdo), lo que sugiere una sensibilidad diferencial de las líneas celulares cancerosas al sistema de administración basado en nanocápsulas. Los valores ajustados de la dosis de proliferación celular LD50 (dosis a la que se observa una reducción del 50% en la proliferación celular) son de 0,5 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,2 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,6 µM para The-05-LC-2, en comparación con 1,0 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa; los valores ajustados de KRAS IC50 (dosis a la que se observa una inhibición del 50% de la vía KRAS) son de 0,3 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,8 µM para LC-2 libre en Calu-1, mientras que es de 0,4 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,6 µM para LC-2 libre en las células MiaPaCa (Figura 4D).

También se midió la degradación de KRAS tras el tratamiento con The-05-LC-2 en comparación con LC-2 libre a dosis de 500 nM, 1 µM y 2 µM en Calu-1. 6 h después del tratamiento con 500 nM, 1 µM y 2 µM, los niveles de KRAS disminuyeron en un 62%, un 80% y un 84% con LC-2, y en un 71%, un 79% y un 80% con The-05-LC-2, respectivamente, en comparación con las células no tratadas (Figura S6 suplementaria). El valor ajustado de DC50 (concentración a la que se observa una degradación del 50% de KRAS) es de 0,2 µM para The-05-LC-2, en comparación con 0,4 µM para LC-2 libre.

Discusión

KRAS desempeña un papel central en la transducción de señales, y las mutaciones de KRAS están fuertemente implicadas en la iniciación y el desarrollo del tumor. A pesar de casi 40 años de investigación, la focalización eficaz de KRAS en los cánceres ha seguido siendo un desafío formidable. Los avances recientes en la focalización de mutaciones específicas de KRAS, como G12C, han abierto nuevas vías para la oncología de precisión. Sin embargo, persisten los desafíos, principalmente en lo que respecta a la eficacia terapéutica y el desarrollo generalizado de resistencia. Como señalaron acertadamente [Herdeis et al. (2021)], lograr una inhibición eficaz de KRAS al tiempo que se supera la resistencia sería como "detener el latido del corazón del cáncer".

En este estudio, empleamos nuestra innovadora plataforma de nanomedicina derivada de ferritina, sensible a estímulos, para encapsular grandes cantidades del inhibidor específico de KRASG12C, Adagrasib, y el degradador PROTAC LC-2. La plataforma de nanocápsulas utilizada en este estudio pertenece a la familia de variantes de ferritina humana sensibles a MMP y protegidas por PASE (serie The-05). Estas construcciones incluyen un dominio PASE de protección externo, un enlazador clivable por metaloproteasas de matriz (MMP-2/9) y un núcleo de ferritina que se dirige a CD71, lo que confiere tanto estabilidad en la circulación como activación condicional dentro del microambiente tumoral. Nuestra caracterización reveló que las nanocápsulas resultantes eran altamente puras, monodispersas y mantenían una excelente estabilidad a lo largo del tiempo.

Cuando se administraron a modelos celulares de CPNP y CPDC con mutaciones de KRAS, estas nanocápsulas facilitaron la administración específica y eficiente del inhibidor de KRASG12C y el PROTAC a las células tumorales. Esta administración dirigida logró resultados comparables o, más a menudo, superiores en comparación con la administración de los fármacos individuales en forma libre. Esta mayor eficacia se demostró de forma constante en diversos ensayos, incluida la proliferación celular, la inhibición de la vía KRAS y, para el PROTAC, la degradación directa de KRAS. Cabe destacar que el efecto del PROTAC LC-2 siempre es menor, a la misma concentración, que el del inhibidor del que se deriva; esto, ya descrito en el trabajo de Bond y colaboradores (2020), probablemente se deriva del mecanismo de acción del PROTAC, que es menos eficiente que el directo del inhibidor.

Nuestra nanocápsula The-05 se diseñó deliberadamente para que permaneciera protegida e inactiva durante la circulación sistémica. Este diseño garantiza una alta estabilidad, un tiempo de semivida plasmática prolongado, una mínima fuga de fármacos y una reducción de los efectos fuera del objetivo. Su activación se controla con precisión mediante metaloproteasas de matriz (MMP), que se expresan abundantemente en el microambiente tumoral (MET), pero a niveles mucho más bajos en los tejidos sanos ([Fracasso et al., 2016]; [Falvo et al., 2018]; [Falvo et al., 2020]; [Falvo et al., 2021]; [Fracasso et al., 2023]; [Marrocco et al., 2024]).

Al interpretar los resultados de este trabajo, es importante distinguir entre el entorno in vitro utilizado aquí y el microambiente tumoral in vivo donde The-05 se activa normalmente. In vitro, se observa la administración funcional debido a la adición de colagenasa (MMP-2 y MMP-9), que imita la actividad del MET. Por lo tanto, si bien estos resultados proporcionan una sólida prueba de concepto, la administración tumoral selectiva de The-05 aún debe validarse en condiciones fisiológicamente relevantes. Estudios in vivo previos con nanocápsulas de ferritina sensibles a estímulos similares han demostrado una internalización eficiente y específica de fármacos a través del receptor CD71 (transferrina/ferritina) ([Falvo et al., 2020]; [Falvo et al., 2021]; [Fracasso et al., 2023]; [Marrocco et al., 2024]). Este receptor se expresa en gran medida en numerosos tipos de tumores, incluidos los sitios metastásicos, lo que refleja la elevada demanda de hierro de las células tumorales que proliferan rápidamente. Este mecanismo garantiza que la ferritina cargada con fármacos se incorpore selectivamente a las células tumorales, donde la carga útil se libera rápidamente y puede unirse a su objetivo. Nuestros extensos estudios previos, que utilizan estas nanocápsulas sensibles a estímulos (incluidas las iteraciones recientes con antraciclinas o el inhibidor de la topoisomerasa I Genz-664282) en modelos murinos de xenoinjerto de CPNP y CPDC, tumores pancreáticos ortotópicos y modelos de CPDC, han demostrado de forma constante una administración eficiente y específica de fármacos, una toxicidad fuera del objetivo insignificante, una reducción significativa y sostenida del crecimiento tumoral y una mejora notable de la supervivencia posterapia ([Falvo et al., 2021]; [Conti et al., 2021]; [Fracasso et al., 2023]; [Marrocco et al., 2024]).

Este estudio tiene como objetivo ser una prueba de concepto in vitro que demuestre que las pequeñas moléculas dirigidas a KRAS pueden encapsularse con éxito dentro de la plataforma The-05, preservando al mismo tiempo la actividad biológica. Se informará por separado sobre las evaluaciones integrales in vivo de la farmacocinética, la biodistribución y la seguridad. Dados estos resultados convincentes, prevemos que The-05 activado por el MET y cargado con inhibidores de KRAS o PROTAC exhibirá un rendimiento aún más pronunciado in vivo en comparación con los resultados in vitro presentados aquí. Esta plataforma de nanomedicina representa una estrategia terapéutica muy prometedora contra los tumores de CPDC y CPNP que albergan la mutación KRASG12C, y ofrece una vía potencial para superar las limitaciones actuales en la eficacia y la resistencia. Reconociendo estas limitaciones, actualmente estamos realizando estudios in vivo adicionales para validar esta hipótesis y explorar el potencial de esta plataforma de nanomedicina sensible al MET para los cánceres con mutación KRASG12C.