Desarrollo y evaluación in vivo de marcadores de PET marcados con (18)F que se unen de forma covalente al KRAS-G12C para el diagnóstico no invasivo del cáncer y el seguimiento del tratamiento.

Las mutaciones en el gen KRAS (sarcoma de rata de Kirsten) se encuentran en hasta el 23% de todos los tumores humanos ^[1], lo que convierte a KRAS en uno de los impulsores oncogénicos más comunes en el cáncer. Estas mutaciones puntuales, que alteran un solo par de bases, se observan con mayor frecuencia en el codón 12 (G12), el codón 13 (G13) o el codón 61 (Q61) ^[2] y son especialmente prevalentes en el adenocarcinoma pancreático (PDAC), el adenocarcinoma colorrectal (CRC) y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ^[3]. Entre estas, la mutación KRAS-G12C es la dominante en NSCLC (aproximadamente el 12%) y ocurre en menor medida en CRC (3%) y PDAC (1%) ^[4].

KRAS funciona como un interruptor molecular entre un estado activo (unido a trifosfato de guanosina (GTP)) y un estado inactivo (unido a difosfato de guanosina (GDP)), regulado por la señalización ascendente y las proteínas activadoras de la GTPasa (GAPs). Las mutaciones como G12C perjudican la hidrólisis de GTP mediada por GAPs, desplazando el equilibrio hacia el estado activo e impulsando la activación de cascadas de señalización descendente persistentes, como RAF-MEK-ERK. Esta señalización sostenida promueve la proliferación y la supervivencia, contribuyendo a la oncogénesis 5-7.

El desarrollo de inhibidores covalentes de KRAS-G12C, como sotorasib y adagrasib, ha supuesto un hito importante en la terapia dirigida contra el cáncer. Estos inhibidores se unen selectivamente al residuo de cisteína G12C en la conformación unida a GDP de KRAS, manteniéndolo en su estado inactivo e inhibiendo, por lo tanto, la señalización oncogénica descendente. Tanto sotorasib como adagrasib han recibido la aprobación para el tratamiento del NSCLC metastásico, KRAS-G12C positivo 2.

A pesar de este progreso clínico, identificar a los pacientes que puedan beneficiarse de las terapias dirigidas a KRAS-G12C sigue siendo un desafío. La práctica clínica actual se basa en la genotipificación de biopsias tumorales mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la secuenciación de nueva generación (NGS) 8, lo que se ve limitado por la disponibilidad de biopsias, la heterogeneidad tumoral y la correcta localización. Un enfoque de imagenología no invasiva de todo el cuerpo proporcionaría un valor clínico sustancial para la selección de pacientes y el seguimiento dinámico de la respuesta al tratamiento y la progresión tumoral.

Para abordar esta necesidad insatisfecha, diseñamos una serie de inhibidores de KRAS-G12C marcados con flúor-18 para la imagenología por tomografía por emisión de positrones (PET). Basándonos en el farmacóforo central de adagrasib, modificamos el anillo de pirrolidina para incorporar enlazadores de etileno y glicol de oligoetileno marcados con 18F. Este diseño tuvo como objetivo preservar la unión al objetivo al tiempo que permitía el marcado con 18F para la imagenología in vivo. Aquí, presentamos la (radio)síntesis, la caracterización in vitro y la evaluación preclínica por PET de tres nuevos trazadores dirigidos a KRAS-G12C.

Métodos

Química

Los compuestos de referencia se compraron o se sintetizaron según los procedimientos descritos en la bibliografía. Todos los precursores y los compuestos de referencia en frío mencionados se sintetizaron para el trabajo presentado aquí. Una descripción detallada de las síntesis se puede encontrar en los materiales suplementarios.

Animales

Se obtuvieron ratones macho NOD.CB17-Prkdcscid, de 8 a 10 semanas de edad, de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se alojaron en grupos en un ciclo de 14 horas de luz/10 horas de oscuridad, con material de anidación, dieta estándar de laboratorio y acceso ad libitum a agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la autoridad estatal local (Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES); ID: 33.12-42502-04-19/3264) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas e internacionales.

Inoculación tumoral

Las células MiaPaCa-2 (ATCC No. CRL-1420) se cultivaron a 37 °C (incubadora humidificada con 5% de CO2) en medio Dulbecco modificado (DMEM) que contenía suero fetal bovino (SFB) en una concentración final del 10% y suero de caballo en una concentración final del 2,5%. Las células se cosecharon para la inoculación tumoral cuando alcanzaron una confluencia del 70-80%. Las células se suspendieron en 1,0 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una concentración de 67 millones de células por mililitro. Se inyectó un volumen de 75 µL, que contenía 5 millones de células, por vía subcutánea en ambos flancos del animal. Se controlaron los ratones a intervalos de 2 días para evaluar el crecimiento tumoral y el estado de salud. Se permitió que los tumores crecieran hasta que alcanzaran un diámetro medio de 2 a 5 mm.

Imagenología en animales pequeños

Los ratones se sometieron a imagenología PET utilizando una cámara de imagenología de roedores (Minerve) en un sistema PET/TC dedicado para animales pequeños (Inveon, Siemens) bajo anestesia con isoflurano (1,5-2,0% en 0,6 L/min de oxígeno). Se monitorizaron continuamente las frecuencias respiratorias. Las imágenes se reconstruyeron utilizando el algoritmo de máxima a posteriori (MAP) con 18 iteraciones, generando una matriz de 128 × 128 × 159. La reconstrucción se basó en la expectativa de subconjunto ordenado tridimensional (OSEM3D) con 2 iteraciones. Para proporcionar una correlación anatómica, se adquirió una tomografía computarizada (TC) de baja dosis (50 kV, 500 µA, 300 ms, 360 proyecciones) después del escaneo PET.

Para los escaneos PET de [18F]KRAS, se administraron sondas radiactivas (10,9 ± 1,4 MBq) como un bolo de 100 µL a través de un catéter insertado en una vena de la cola lateral y se enjuagó con 50 µL de solución salina heparinizada. Para los estudios de bloqueo, se administró adagrasib o 1-((2R,5S)-4-((R)-6-cloro-2-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)-8-fluoro-7-(6-metil-1H-indazol-7-il)quinazolin-4-il)-2,5-dimetilpiperazin-1-il)prop-2-en-1-ona (KRAS3223, patente: WO17087528) (0,5 µmol en 75 µL), según se indique, 15 minutos antes del escaneo del trazador [18F]KRAS respectivo, seguido de un enjuague de 50 µL de solución salina heparinizada. Para la localización tumoral, se realizó posteriormente un escaneo PET de [18F]FDG. Se administró [18F]FDG (11,2 ± 2,5 MBq) como un bolo de 100 µL a través de un catéter insertado por vía intraperitoneal, seguido de un enjuague de 50 µL de solución salina heparinizada. Después de 20 minutos de captación de [18F]FDG bajo anestesia, se realizó una adquisición estática de 10 minutos. Los animales permanecieron bajo anestesia y se les practicó la eutanasia por dislocación cervical sin recuperar la conciencia.

Para el análisis, se evaluó un fotograma de 10 minutos (50-60 minutos después de la inyección del trazador, [18F]KRAS3776, [18F]KRAS8125, [18F]KRAS490) o un escaneo de 10 minutos ([18F]FDG) utilizando PMOD 4.3 (PMOD Technologies LLC, Bruker Preclinical Imaging Division). Además, se visualizaron curvas de actividad a lo largo del tiempo de 60 minutos. Los resultados se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g). Se colocó un volumen de interés (VOI) estandarizado en el tumor o el órgano de interés utilizando el escaneo de TC como guía anatómica.

Marcado con radioisótopos

El [18F]fluoruro se generó mediante la irradiación de protones de [18O]H2O enriquecida (11 MeV) utilizando un ciclotrón Eclipse HP (Siemens AG) a través de la reacción nuclear 18O(p,n)18F. La síntesis posterior de [18F]FDG se realizó en un módulo automatizado FASTlab™ (GE Healthcare, Reino Unido) utilizando un sistema de casetes de un solo uso compatible con las GMP. El producto final se formuló para su uso clínico de rutina.

[18F]KRAS8125 y [18F]KRAS490: El [18F]fluoruro (50-80 GBq) se eluyó de un cartucho de carbonato QMA (Waters™, Alemania) con una solución de Et4NHCO3 (2,6 mg) en MeOH (1,3 mL). El disolvente se eliminó a 100 °C en vacío bajo una corriente de argón y se enfrió antes de añadir una solución del precursor respectivo que contiene un grupo saliente de tosilato (4,0 µmol) en 1,0 mL de acetonitrilo (MeCN) seco y la mezcla de reacción se calentó posteriormente a 70 °C durante 20 minutos. La solución se diluyó con 1 mL de MeCN y se pasó a través de un cartucho de sílice Sep-Pak preacondicionado (MeCN) (Waters™, Alemania) para eliminar el [18F]fluoruro no reaccionado. Los productos se aislaron mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/65:35 (v/v); caudal: 3 mL/min; tR = 14 min). La fracción recogida se diluyó 1:2 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho Sep-Pak C18 Plus Light preacondicionado (3 mL MeCN, 5 mL agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se eluyó con 1 mL de etanol. Para aplicaciones in vitro e in vivo, el disolvente se eliminó bajo presión reducida a 80 °C y el trazador se reconstituyó posteriormente en una solución de polisorbato 80 al 0,1%.

[18F]FEtTOs: El [18F]fluoruro (30-50 GBq) se eluyó de un cartucho de carbonato QMA con una solución de KHCO3 (2,8 mg) en 0,23 mL de H2O y K222 (8,4 mg) en 1,1 mL de MeCN. El disolvente se eliminó azeotrópicamente bajo presión reducida a 100 °C con la ayuda de una corriente de argón. Después de enfriar, se añadió ditosilato de etileno (10 mg, 27 µmol) en 1,0 mL de MeCN seco y la mezcla de reacción se calentó durante 10 minutos a 100 °C. El producto se aisló mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/50:50 (v/v); caudal: 3 mL/min; tR = 16 min) y la fracción recogida se diluyó 1:1 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho Oasis HLB Plus Light preacondicionado (3 mL MeCN, 5 mL agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se utilizó en el siguiente paso para la síntesis de [18F]KRAS3776.

[18F]KRAS3776: El [18F]FEtTOs se eluyó del cartucho HLB en un vial que contenía el precursor KRAS4862 (2,0 mg, 4,3 µmol) utilizando una solución acuosa de KHCO3 (1,7 mg en 0,14 mL de H2O), K222 (5,0 mg) en 0,36 mL de MeCN y 100 µL de DMSO. La mezcla de reacción se calentó durante 10 minutos a 100 °C, reduciendo la presión a 400-500 mbar para permitir la eliminación azeotrópica de agua y acetonitrilo. Después de enfriar, se añadió 3 mL de MeCN y el producto se aisló mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Gemini C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/40:60 (v/v); caudal: 3 mL/min; tR = 15 min). La fracción recogida se diluyó 1:1 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho Sep-Pak C18 Plus Light preacondicionado (3 mL MeCN, 5 mL agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se eluyó con 1 mL de etanol. Para aplicaciones in vitro e in vivo, el disolvente se eliminó bajo presión reducida a 80 °C y el trazador se reconstituyó posteriormente en una solución de polisorbato 80 al 0,1%.

Ensayo de unión de proteínas KRAS

El ensayo de unión de proteínas se llevó a cabo siguiendo protocolos previamente establecidos ^[9],^[10]. Las sondas se disolvieron en un tampón compuesto por 10% de DMSO, 5 mM de cloruro de magnesio (MgCl2) y 5 mM de GDP con una actividad de 37 MBq/mL. La proteína KRAS (ya sea G12C, G12D o Q61H, según se especifique) se incubó a una concentración final de 2 µM con 3,7 MBq de las sondas en un tampón que contenía 20 mM de HEPES a pH 7,5, 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), 1 mM de MgCl2 y 1 mM de ditiotreitol (DTT) durante 1 hora. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido fórmico hasta una concentración final del 0,2%. El porcentaje de sondas unidas a la proteína se determinó como la tasa de unión a la proteína (%) basándose en los resultados de la cromatografía en capa fina radiactiva (radio-TLC).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. Para los experimentos con n = 2, se informan los valores individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 8 o 10. Se evaluó la normalidad de la distribución de los datos antes de realizar análisis adicionales. Para los datos de las mediciones dinámicas de PET/TC, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Cuando fue aplicable, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas. Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo.

Química

Los compuestos de referencia se compraron o sintetizaron según los procedimientos descritos en la bibliografía. Todos los precursores y los compuestos de referencia no radiactivos mencionados se sintetizaron para el trabajo presentado aquí. Una descripción detallada de las síntesis se puede encontrar en los materiales suplementarios.

Animales

Se obtuvieron ratones macho NOD.CB17-Prkdcscid, de entre 8 y 10 semanas de edad, de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se alojaron en grupos en un ciclo de 14 horas de luz/10 horas de oscuridad, con material de anidación, dieta estándar de laboratorio y acceso libre a agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la autoridad estatal local (Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES); ID: 33.12-42502-04-19/3264) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas e internacionales.

Inoculación de tumores

Las células MiaPaCa-2 (ATCC No. CRL-1420) se cultivaron a 37 °C (incubadora humidificada con 5% de CO2) en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) en una concentración final del 10% y suero de caballo en una concentración final del 2,5%. Las células se recolectaron para la inoculación de tumores cuando alcanzaron una confluencia del 70-80%. Las células se suspendieron en 1,0 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 67 millones de células por mililitro. Se inyectó un volumen de 75 µL, que contenía 5 millones de células, por vía subcutánea en ambos flancos del animal. Se controlaron los ratones a intervalos de 2 días para evaluar el crecimiento del tumor y el estado de salud. Se permitió que los tumores crecieran hasta que alcanzaran un diámetro promedio de 2 a 5 mm.

Imagenología de animales pequeños

Los ratones se sometieron a imagenología PET utilizando una cámara de imagenología para roedores (Minerve) en un sistema PET/TC dedicado para animales pequeños (Inveon, Siemens) bajo anestesia con isoflurano (1,5-2,0% en 0,6 L/min de oxígeno). Las frecuencias respiratorias se controlaron continuamente. Las imágenes se reconstruyeron utilizando el algoritmo de máxima a posteriori (MAP) con 18 iteraciones, generando una matriz de 128 × 128 × 159. La reconstrucción se basó en la maximización de expectativas ordenada de subconjuntos tridimensionales (OSEM3D) con 2 iteraciones. Para proporcionar una correlación anatómica, se adquirió una tomografía computarizada (TC) de baja dosis (50 kV, 500 µA, 300 ms, 360 proyecciones) después del escaneo PET.

Para los escaneos PET con [18F]KRAS, se administraron sondas radiactivas (10,9 ± 1,4 MBq) como un bolo de 100 µL a través de un catéter insertado en una vena de la cola lateral y se enjuagó con 50 µL de solución salina heparinizada. Para los estudios de bloqueo, se administró adagrasib o 1-((2R,5S)-4-((R)-6-cloro-2-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)-8-fluoro-7-(6-metil-1H-indazol-7-il)quinazolin-4-il)-2,5-dimetilpiperazin-1-il)prop-2-en-1-ona (KRAS3223, patente: WO17087528) (0,5 µmol en 75 µL), según corresponda, 15 minutos antes del trazador [18F]KRAS respectivo, seguido de un enjuague de 50 µL de solución salina heparinizada. Para la localización del tumor, se realizó posteriormente un escaneo PET con [18F]FDG. Se administró [18F]FDG (11,2 ± 2,5 MBq) como un bolo de 100 µL a través de un catéter insertado por vía intraperitoneal, seguido de un enjuague de 50 µL de solución salina heparinizada. Después de 20 minutos de captación de [18F]FDG bajo anestesia, se realizó una adquisición estática de 10 minutos. Los animales permanecieron bajo anestesia y se les aplicó la eutanasia por dislocación cervical sin recuperar la conciencia.

Para el análisis, se evaluó un marco de 10 minutos (50-60 minutos después de la inyección del trazador, [18F]KRAS3776, [18F]KRAS8125, [18F]KRAS490) o un escaneo de 10 minutos ([18F]FDG) utilizando PMOD 4.3 (PMOD Technologies LLC, Bruker Preclinical Imaging Division). Además, se visualizaron curvas de actividad a 60 minutos. Los resultados se expresaron como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g). Se colocó un volumen de interés (VOI) estandarizado en el tumor u órgano de interés utilizando la TC para la guía anatómica.

Marcaje radioquímico

El flúor-18 se generó mediante la irradiación con protones de [18O]H2O enriquecida (11 MeV) utilizando un ciclotrón Eclipse HP (Siemens AG) a través de la reacción nuclear 18O(p,n)18F. La síntesis posterior de [18F]FDG se realizó en un módulo automatizado FASTlab™ (GE Healthcare, Reino Unido) utilizando un sistema de casetes de un solo uso compatible con las GMP. El producto final se formuló para su uso clínico de rutina en el laboratorio.

[18F]KRAS8125 y [18F]KRAS490: El flúor-18 (50-80 GBq) se eluyó de un cartucho de carbonato QMA (Waters™, Alemania) con una solución de Et4NHCO3 (2,6 mg) en MeOH (1,3 mL). El disolvente se eliminó a 100 °C en vacío bajo una corriente de argón y se enfrió antes de agregar una solución del precursor respectivo que contiene un grupo saliente de tosilato (4,0 µmol) en 1,0 mL de acetonitrilo seco (MeCN) y la mezcla de reacción se calentó posteriormente a 70 °C durante 20 minutos. La solución se diluyó con 1 mL de MeCN y se pasó a través de un cartucho de Sep-Pak Silica Plus light preacondicionado (MeCN) (Waters™, Alemania) para eliminar el flúor-18 no reaccionado. Los productos se aislaron mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/65:35 (v/v); velocidad de flujo: 3 mL/min; tR = 14 min). La fracción recolectada se diluyó 1:2 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho de Sep-Pak C18 Plus Light preacondicionado (3 mL de MeCN, 5 mL de agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se eluyó con 1 mL de etanol. Para aplicaciones in vitro e in vivo, el disolvente se eliminó bajo presión reducida a 80 °C y el trazador se reconstituyó posteriormente en una solución de polisorbato 80 al 0,1%.

[18F]FEtTOs: El flúor-18 (30-50 GBq) se eluyó de un cartucho de carbonato QMA con una solución de KHCO3 (2,8 mg) en 0,23 mL de H2O y K222 (8,4 mg) en 1,1 mL de MeCN. El disolvente se eliminó azeotrópicamente bajo presión reducida a 100 °C con la ayuda de una corriente de argón. Después de enfriar, se agregó etil ditosilato (10 mg, 27 µmol) en 1,0 mL de MeCN seco y la mezcla de reacción se calentó durante 10 minutos a 100 °C. El producto se aisló mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/50:50 (v/v); velocidad de flujo: 3 mL/min; tR = 16 min) y la fracción recolectada se diluyó 1:1 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho Oasis HLB Plus Light preacondicionado (3 mL de MeCN, 5 mL de agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se utilizó en el siguiente paso para la síntesis de [18F]KRAS3776.

[18F]KRAS3776: El [18F]FEtTOs se eluyó del cartucho HLB en un vial que contenía el precursor KRAS4862 (2,0 mg, 4,3 µmol) utilizando una solución acuosa de KHCO3 (1,7 mg en 0,14 mL de H2O), K222 (5,0 mg) en 0,36 mL de MeCN y 100 µL de DMSO. La mezcla de reacción se calentó durante 10 minutos a 100 °C mientras que la presión se redujo a 400-500 mbar para permitir la eliminación azeotrópica de agua y acetonitrilo. Después de enfriar, se agregaron 3 mL de MeCN y el producto se aisló mediante HPLC semi-preparativa (Phenomenex Gemini C18, 250 × 10 mm; eluyente: agua/MeCN/40:60 (v/v); velocidad de flujo: 3 mL/min; tR = 15 min). La fracción recolectada se diluyó 1:1 (v/v) con agua antes de pasarla a través de un cartucho de Sep-Pak C18 Plus Light preacondicionado (3 mL de MeCN, 5 mL de agua) (Waters™, Alemania). El cartucho se lavó con agua (3 mL) y se eluyó con 1 mL de etanol. Para aplicaciones in vitro e in vivo, el disolvente se eliminó bajo presión reducida a 80 °C y el trazador se reconstituyó posteriormente en una solución de polisorbato 80 al 0,1%.

Ensayo de pERK1/2 celular

Las células NCI-H358 (ATCC No. CRL-5807) se sembraron en un medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de FBS, 1 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio en placas de 96 pocillos con 2,5 x 104 células por pocillo. Al día siguiente, las células alcanzaron aproximadamente el 90% de confluencia y se trataron con diluciones seriadas 1:5 de los compuestos de prueba que oscilaron entre 10 µM y 0,65 nM o DMSO en triplicado durante 6 horas. Las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se lisaron con 50 µL de tampón de lisis frío (tampón de lisis RIPA-C de US Biological (Cat. #R2031-75) suplementado con 1 mM de ortovanadato de sodio (BioLabs, Cat. #P0758S), 1% de cóctel de inhibidores de fosfatasas II (Calbiochem, Cat. #524625), 0,2% de cóctel de inhibidores de proteasas III (Calbiochem, Cat. #539134) y 0,1% de benzonasa (Novagen, Cat. #70664)). Los niveles celulares de fosforilación de ERK1/2 se detectaron utilizando el kit de detección de biomarcadores MULTISPOT MSD (fosfo (T202/Y204; T185/Y187) / ERK1/2 total) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MSD, #K15107A-3). Los recuentos de las células control tratadas con DMSO se definieron como la señal máxima (100%) y los valores de las muestras tratadas con el compuesto se calcularon como un porcentaje del control. El ajuste de las curvas de respuesta a la dosis y el cálculo de los valores de IC50 se realizaron con análisis de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism (versión 8).

Ensayo de unión de proteínas KRAS

El ensayo de unión de proteínas se llevó a cabo siguiendo protocolos previamente establecidos ^[9],^[10]. Las sondas se disolvieron en un tampón compuesto por 10% de DMSO, 5 mM de cloruro de magnesio (MgCl₂) y 5 mM de GDP con una actividad de 37 MBq/mL. La proteína KRAS (ya sea G12C, G12D o Q61H, según se especifique) se incubó a una concentración final de 2 µM con 3,7 MBq de las sondas en un tampón que contenía 20 mM de HEPES a pH 7,5, 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de ditiotreitol (DTT) durante 1 hora. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido fórmico hasta una concentración final del 0,2%. El porcentaje de sondas unidas a la proteína se determinó como la tasa de unión a la proteína (%) basada en los resultados de la cromatografía en capa fina radioactiva (radio-TLC).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. Para los experimentos con n = 2, se informan los valores individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 8 o 10. Se evaluó la normalidad de la distribución de los datos antes de realizar análisis adicionales. Para los datos de las mediciones dinámicas de PET/TC, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Cuando fue aplicable, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas. Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

Radioquímica

[18F]KRAS8125 y [18F]KRAS490 se sintetizaron mediante radiofluoración tardía, en la que el grupo saliente de tosilato de los respectivos precursores se sustituyó por flúor-18. Los primeros intentos de etiquetar [18F]KRAS490 utilizando el complejo de criptofix 2.2.2-potasio (K.2.2.2./K⁺) fracasaron. Los enfoques alternativos que utilizaban bicarbonato de tetrabutilo o tetraetilamonio como bases y contraparte del fluoruro-18 radiactivo solo dieron como resultado pequeñas cantidades de [18F]KRAS490 y varios subproductos radiactivos, lo que indica un proceso de degradación dependiente de la temperatura del producto etiquetado o del precursor de tosilato. Anticipando la inestabilidad termodinámica de los compuestos involucrados, las condiciones de reacción optimizadas mediante la reducción de la temperatura de reacción a 70 °C condujeron a rendimientos radiquímicos analíticos moderados del 15-17% (Tabla 1). La identidad química del producto radiactivo se confirmó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) mediante la coinyectación con el compuesto de referencia no radiactivo.

Posteriormente, las condiciones de reacción optimizadas (Tabla 1, entrada 6) se transfirieron a un módulo de síntesis automatizado para la producción de [18F]KRAS8125 y [18F]KRAS490, utilizando actividades iniciales más elevadas (53 ± 12 GBq). La síntesis automatizada, que incluía el procesamiento de fluoruro [18F] acuoso, seguida de la reacción y el posterior aislamiento mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) semi-preparativa, dio como resultado rendimientos radioquímicos (RCY) de 2,3 ± 1,3% y 2,5 ± 1,7% para [18F]KRAS490 y [18F]KRAS8125, respectivamente. Los productos finales exhibieron excelentes purezas radioquímicas (RCP) superiores al 99%, con un tiempo total de síntesis de 92 ± 16 min. Debido a que los niveles de portador estaban por debajo del límite de detección, se determinó que la actividad molar era superior a 500 GBq/µmol.

Además, se adoptó una estrategia de dos pasos para la radiosíntesis de [18F]KRAS3776. Este método utiliza 2-[18F]fluoroetiltosilato ([18F]FEtOTs) como grupo protector para el etiquetado indirecto del grupo hidroxilo aromático en el anillo de pirimidina del precursor KRAS4862. [18F]FEtOTs se sintetizó en una síntesis automatizada según la bibliografía ^[11] y se obtuvo con un rendimiento radioquímico de 46 ± 7% y una alta pureza radioquímica de >99% en 84 ± 7 min.

Se optimizaron sistemáticamente diferentes parámetros de reacción para la reacción de (radio)fluoroalquilación, como se resume en la Tabla 2. Se probaron varias combinaciones de base-disolvente variando la temperatura y el tiempo de reacción. Los intentos iniciales utilizando NaOH, TEAHC o KHCO3 solos en dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) o MeCN dieron como resultado bajos rendimientos radioquímicos (RCY analítico 99% en 152 ± 10 min. El contenido de portador estaba por debajo del límite de detección, lo que resultó en una actividad molar superior a 500 GBq/µmol. Se verificó la identidad química del producto radiomarcado mediante HPLC mediante co-inyección con el compuesto de referencia no radiactivo.

Ensayo celular de pERK

Se investigó la actividad celular de las tres sondas de referencia no radiactivas KRAS490, KRAS8125 y KRAS3776 en un ensayo de señalización celular en comparación con adagrasib y KRAS3223, que se utilizaron para experimentos de bloqueo. La detección de la inhibición de P-ERK1/2 en células NCI-H358 que portan una mutación heterocigota G12C es un marcador descendente validado para los inhibidores de KRAS-G12C ^[12].

Ensayo de unión de proteínas KRAS

Se probó la unión irreversible de las sondas a la proteína KRAS-G12C para verificar la especificidad de los trazadores. La cromatografía en capa fina (TLC) permite una separación eficiente del trazador unido a la proteína y del trazador no unido, y se puede cuantificar mediante cromatografía en capa fina radioactiva (radio-TLC). Se evaluaron las afinidades de unión de [18F]KRAS8125, [18F]KRAS490 y [18F]KRAS3776 hacia diferentes variantes de KRAS (G12C, G12D y Q61H) utilizando ensayos de unión a proteínas, y los resultados se muestran en la Figura 1. [18F]KRAS3776 incubado durante 60 min mostró la mayor afinidad de unión a KRAS-G12C, con una tasa de unión del 72 ± 21%, mientras que su unión a KRAS-G12D y KRAS-Q61H fue significativamente menor (12,5 ± 1,8% y 11,0 ± 3,7%, respectivamente). La pre-incubación con adagrasib (0,1 mM) como agente bloqueador redujo notablemente la unión de KRAS-G12C a 15 ± 2%. En contraste, [18F]KRAS490 y [18F]KRAS8125 mostraron un porcentaje de unión más bajo a la proteína KRAS-G12C del 58 ± 23% y 23 ± 5%, respectivamente. Sin embargo, ambos trazadores mostraron incluso una unión insignificante a las otras mutaciones de KRAS, KRAS-G12D, KRAS-Q61H, así como un bloqueo completo de la señal de la incubación de KRAS-G12C (99% en 84 ± 7 min.

Se optimizaron sistemáticamente diferentes parámetros de reacción para la reacción de (radio)fluoroalquilación, como se resume en la Tabla 2. Se probaron varias combinaciones de base-disolvente variando la temperatura y el tiempo de reacción. Los intentos iniciales utilizando NaOH, TEAHC o KHCO3 solos en dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) o MeCN dieron como resultado bajos rendimientos radioquímicos (RCY analítico 99% en 152 ± 10 min. El contenido de portador estaba por debajo del límite de detección, lo que resultó en una actividad molar superior a 500 GBq/µmol. Se verificó la identidad química del producto radiomarcado mediante HPLC mediante co-inyección con el compuesto de referencia no radiactivo.

Ensayo celular de pERK

Se investigó la actividad celular de las tres sondas de referencia no radioactivas KRAS490, KRAS8125 y KRAS3776 en un ensayo de señalización celular, en comparación con adagrasib y KRAS3223, que se utilizaron para experimentos de bloqueo. La detección de la inhibición de P-ERK1/2 en células NCI-H358 que portan una mutación G12C heterocigota es un marcador validado aguas abajo para los inhibidores de KRAS-G12C ^[12].

Ensayo de unión de proteínas KRAS

Se probó la unión irreversible de las sondas a la proteína KRAS-G12C para verificar la especificidad de los trazadores. La cromatografía en capa fina (TLC) permite una separación eficiente del trazador unido a la proteína y del trazador no unido, y se puede cuantificar mediante cromatografía en capa fina radioactiva (radio-TLC). Se evaluaron las afinidades de unión de [18F]KRAS8125, [18F]KRAS490 y [18F]KRAS3776 hacia diferentes variantes de KRAS (G12C, G12D y Q61H) utilizando ensayos de unión a proteínas, y los resultados se muestran en la Figura 1. [18F]KRAS3776, incubado durante 60 minutos, mostró la mayor afinidad de unión a KRAS-G12C, con una tasa de unión del 72 ± 21%, mientras que su unión a KRAS-G12D y KRAS-Q61H fue significativamente menor (12,5 ± 1,8% y 11,0 ± 3,7%, respectivamente). La preincubación con adagrasib (0,1 mM) como agente bloqueador redujo notablemente la unión de KRAS-G12C a 15 ± 2%. En contraste, [18F]KRAS490 y [18F]KRAS8125 mostraron un porcentaje de unión más bajo a la proteína KRAS-G12C, del 58 ± 23% y 23 ± 5%, respectivamente. Sin embargo, ambos trazadores mostraron incluso una unión insignificante a las otras mutaciones de KRAS, KRAS-G12D, KRAS-Q61H, así como un bloqueo completo de la señal de la incubación de KRAS-G12C (