La combinación del inhibidor de KRAS(G12C) adagrasib con inmunoterapia anti-PD-1 mejora la supervivencia global y previene la recurrencia en modelos preclínicos de metástasis cerebrales.

Cultivo celular: Las células CT26KRASG12C fueron donadas por Mirati Inc. y las células KPARKRASG12C se adquirieron de Cancer Tools.^[18] Las células se marcaron con firefly-luciferasa-mCherry (FmC) mediante transducción lentiviral para generar CT26KRASG12C-FmC y KPARKRASG12C-FmC. Las células se mantuvieron en cultivo según se describe en el Material Suplementario.

Ensayo de respuesta a la dosis: Las líneas celulares CT26 y KPAR se cultivaron en una placa de 96 pocillos y se probaron con diferentes concentraciones de adagrasib para identificar su CI50. Después de 72 horas de incubación con el compuesto, se evaluó la viabilidad celular mediante luminiscencia utilizando el kit CellTiterGlo.

Estudios en animales: Todos los estudios en animales fueron aprobados por el IACUC de Mass General Brigham (MGB) y se realizaron en ratones hembra C57BL/6 y BALB/c de 6 a 8 semanas de edad de Charles River Laboratories. Los ratones se alojaron en el centro de medicina comparada del MGB en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con acceso ilimitado a alimentos y agua.

Modelos inmunotípicos de BM: Evaluamos las respuestas inmunitarias antitumorales utilizando modelos inmunotípicos de BM previamente descritos, en los que se implantaron ratones con tumores subcutáneos e intracraneales dobles.^[19],^[20] Se inyectaron suspensiones celulares de CT26KRASG12C y KPARKRASG12C por vía subcutánea (100.000 y 200.000 células, respectivamente) tres días antes de las inyecciones de tumores intracraneales (50.000 células CT26; 100.000 células KPAR). Las dosis celulares se determinaron experimentalmente para cada línea celular, por lo que la supervivencia general depende del crecimiento del tumor intracraneal. Para el re-desafío tumoral, se inyectaron 200.000 y 400.000 células de CT26 y KPAR, respectivamente, en el hemisferio cerebral izquierdo, contralateral a la primera implantación tumoral. El crecimiento del tumor intracraneal se monitoreó mediante imagen de bioluminiscencia (BLI) en el Centro de Imagen de Biología de Sistemas del MGB, como se describió previamente.^[21]

Administración de fármacos: Los animales recibieron 100 mg/kg de adagrasib o vehículo por vía oral dos veces al día (BID) durante tres semanas, comenzando 5 días después de la inyección del tumor intracraneal. Se administró anticuerpo anti-PD-1 o IgG de control isotípico a 10 mg/kg por vía intraperitoneal cada 3 días.

Expresión génica: Las células KPAR y CT26 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con adagrasib a concentraciones de 500 nM y 1 µM o DMSO durante 24 horas. El ARN purificado de las células se utilizó para evaluar la expresión génica mediante RT-qPCR utilizando las sondas TaqMan descritas en el Material Suplementario.

Aislamiento de células T y análisis posteriores: Las células T se obtuvieron y activaron a partir de los bazo de ratones C57BL/6 o BALB/c, adaptando el protocolo STAR publicado.^[21] Los bazo se disociaron mecánicamente y se filtraron para obtener células individuales. Las células rojas de la sangre se eliminaron utilizando el tampón de lisis Gibco ACK. Las células restantes se contaron y se sembraron en pocillos pre-recubiertos con anticuerpos anti-CD3e y CD28 para la activación de las células T. Después de 24 horas, las células T se expandieron agregando IL-2 y luego se pasaron cada 2 días hasta el día 7, cuando se utilizaron en co-cultivo con células tumorales CT26 o KPAR marcadas con luciferasa a diferentes diluciones (1:1 o 1:100) con adagrasib (500 nM), anti-PD-1 (10 µg/mL) o su combinación. La viabilidad de las células tumorales se evaluó mediante el kit One-Step Luc Assay.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos utilizados para cada experimento se describen en la leyenda de la figura. En general, los experimentos de crecimiento tumoral se analizaron utilizando modelos lineales mixtos con el volumen tumoral transformado en log10 como resultado. Los modelos incluyeron efectos fijos para el tiempo, el grupo de tratamiento y su interacción. Los experimentos de supervivencia se analizaron utilizando el método de Kaplan-Meier. Se ajustaron las comparaciones por pares múltiples utilizando los métodos de Tukey-Kramer o Benjamini-Hochberg. SAS 9.4 y GraphPad Prism v.10.6.1 se utilizaron para los análisis estadísticos.

No hay datos depositados asociados con este manuscrito.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos utilizados para cada experimento se describen en la leyenda de la figura. En general, los experimentos de crecimiento tumoral se analizaron utilizando modelos lineales mixtos con el volumen tumoral transformado en log10 como resultado. Los modelos incluyeron efectos fijos para el tiempo, el grupo de tratamiento y su interacción. Los experimentos de supervivencia se analizaron utilizando el método de Kaplan-Meier. Se ajustaron las comparaciones por pares múltiples utilizando los métodos de Tukey-Kramer o Benjamini-Hochberg. SAS 9.4 y GraphPad Prism v.10.6.1 se utilizaron para los análisis estadísticos.

No hay datos depositados asociados con este manuscrito.

Resultados

Eficacia del inhibidor de KRASG12C adagrasib, en combinación con inmunoterapia anti-PD-1 en un modelo inmunotípico de ratón de metástasis de cáncer colorrectal KRASG12C

Para evaluar la terapia dirigida a KRASG12C en combinación con la inmunoterapia anti-PD-1, identificamos líneas celulares murinas que albergan la mutación KRASG12C, incluidas las células de cáncer colorrectal, CT26-KrasG12C y las células de cáncer de pulmón, KPARKrasG12C (Figura 1A). Primero, probamos su sensibilidad al inhibidor selectivo de KRASG12C, adagrasib, in vitro utilizando el ensayo CellTiterGlo. El ensayo de respuesta a la dosis demostró que ambas líneas celulares tienen una sensibilidad similar a este compuesto, con una CI50 de 311 nM en las células CT26 y 399,8 nM en las células KPAR, respectivamente (Figura 1A-C).

Luego, evaluamos si el adagrasib, a dos concentraciones diferentes (500 nM y 1 µM), alteraba la expresión génica en un conjunto de genes relacionados con la inmunidad en las líneas celulares CT26 y KPAR. Confirmamos la disminución de los objetivos de la vía MAPK dependiente de KRAS después del tratamiento con adagrasib y encontramos una regulación al alza de los genes de la clase I del MHC, así como de las citocinas, incluido Cxcl10, en ambos modelos (Figura S1A y B del Material Suplementario). Detectamos niveles de transcritos aumentados de Cd274, que codifica PD-L1, y de la tirosina quinasa del receptor Axl solo en las células KPAR, lo que sugiere que el tratamiento con adagrasib puede promover un microambiente inmunitario tumoral más supresor en el modelo KPAR (Figura S1B del Material Suplementario).

A continuación, evaluamos la eficacia del adagrasib en combinación con la terapia anti-PD-1 en modelos de ratón sinérgicos que imitan la inmunología de la metástasis (modelos inmunotípicos) utilizando ratones BALB/c o C57BL/6. Generamos modelos de metástasis que implican la implantación tumoral subcutánea (SC) e intracraneal (IC) para recapitular las características inmunológicas en la metástasis.^[19],^[20] Primero, establecimos un modelo dual de metástasis subcutánea e intracraneal de CT26, inyectando células CT26-KrasG12C por vía SC, seguido de la implantación IC de células CT26-KrasG12C-FmC marcadas tres días después. Todos los tratamientos se iniciaron 5 días después de la inyección del tumor intracraneal (Figura 1D). Se administró adagrasib dos veces al día (BID) por vía oral a 100 mg/kg durante tres semanas, y el anticuerpo anti-PD-1 se inyectó por vía intraperitoneal cada tres días (Q3D) a 10 mg/kg durante un total de cinco dosis. Monitoreamos a los ratones para detectar cambios en el peso corporal, que se mantuvo constante durante todo el período de tratamiento, lo que sugiere una buena tolerabilidad de los tratamientos (Figura S2A del Material Suplementario). Además, se evaluó el crecimiento tumoral subcutáneo e intracraneal, cuantificando el volumen tumoral subcutáneo y la bioluminiscencia intracraneal (BLI), respectivamente (Figura 1E y F y Figura S2B del Material Suplementario). Aunque los ratones que recibieron anti-PD-1 presentaron un volumen tumoral SC significativamente menor en comparación con los que recibieron vehículo (grupo de control), el crecimiento tumoral se abolió por completo en los ratones tratados con adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1 (Figura 1E y Figura S2B-E del Material Suplementario). La imagen de bioluminiscencia mostró efectos antitumorales similares a nivel intracraneal, con una tendencia a obtener el mayor beneficio con el tratamiento combinado (Figura 1F y Figura S2F del Material Suplementario).

Realizamos un seguimiento adicional de BLI a las 3 semanas posteriores al tratamiento (Figura S2G del Material Suplementario). Siete de los 10 animales no presentaban tumores intracraneales en los grupos de adagrasib solo y combinación, en comparación con 5 de 10 y 1 de 10 animales en los grupos de anti-PD-1 y vehículo, respectivamente.

Los respondedores al tratamiento rechazaron el re-desafío intracraneal con células tumorales CT26

Debido a la regresión tumoral observada en el SNC, continuamos con el seguimiento a largo plazo de los animales (Figura 2A). Evaluamos la eficacia a largo plazo de los tratamientos con la supervivencia general (Figura 2B y C) y el crecimiento tumoral intracraneal (Figura S3A del Material Suplementario) en el punto temporal de 9 semanas después de la interrupción del tratamiento. Observamos que, en el grupo de vehículo, solo el 10% de los animales seguían vivos, mientras que en el grupo de anti-PD-1, el 50% sobrevivió; en los grupos de adagrasib y combinación, el 60% y el 70% de los animales sobrevivieron, respectivamente (Figura 2B y C).

Para determinar si los tratamientos inducían memoria inmunitaria antitumoral en los respondedores a largo plazo, re-desafiamos a los ratones con tumores eliminados, inyectando las mismas células tumorales en el hemisferio cerebral opuesto a una dosis celular cuatro veces mayor que la implantación original (Figura 2A). Un grupo de 4 ratones que nunca habían sido inyectados con tumores (ratones sin tumor) sirvió como control para el crecimiento tumoral. Monitoreamos el crecimiento tumoral intracraneal utilizando BLI (Figura 2D y Figura S3A del Material Suplementario). Como se esperaba, después de 2 semanas del re-desafío, todos los ratones sin tumor murieron (Figura S3B del Material Suplementario), debido al rápido crecimiento tumoral (Figura S3A del Material Suplementario). En contraste, la mayoría de los ratones re-desafiados que rechazaron la implantación original permanecieron vivos con una regresión tumoral estable durante el período de seguimiento de 12 semanas después del re-desafío (Figura 2B y C). Más específicamente, en los grupos de monoterapia con anti-PD-1 y adagrasib, el 50% de los animales sobrevivieron, en el grupo de terapia combinada, el 60% seguían vivos y en el grupo de control, solo el 10% estaba vivo.

En conjunto, estos datos sugieren que el adagrasib solo o en combinación con inmunoterapia puede proporcionar un beneficio estadísticamente significativo a largo plazo en la supervivencia general y prevenir las recurrencias intracraneales a largo plazo en la metástasis derivada de las células de cáncer colorrectal CT26.

El adagrasib mostró un beneficio intracraneal en combinación con la terapia anti-PD-1 en un modelo de metástasis de cáncer de pulmón KRASG12C resistente a los inhibidores de punto de control inmunitario

Dado que se sabe que las células CT26 son relativamente inmunogénicas, probamos el adagrasib en combinación con la terapia anti-PD-1 en un modelo establecido con una línea celular de cáncer con mutación KRASG12C, KPAR, que se informó que era resistente a los inhibidores de punto de control inmunitario.^[14],^[18] Inyectamos células KPAR-KrasG12C en ratones C57BL/6 para generar un modelo inmunotípico de metástasis y evaluamos las mismas terapias descritas anteriormente (Figura 3). Aquí, utilizamos el mismo protocolo de administración de fármacos y los mismos puntos finales adoptados en el modelo CT26-KrasG12C (Figura 3A), incluido el peso corporal (Figura S4A del Material Suplementario) y el crecimiento tumoral subcutáneo e intracraneal (Figura 3B y C). A pesar de una reducción en los volúmenes tumorales en los ratones que recibieron anti-PD-1, en este modelo, no se alcanzó una significación estadística en comparación con el grupo de vehículo. Coherente con nuestros resultados con las células CT26, nuevamente observamos una remisión completa de los tumores subcutáneos en los animales tratados con adagrasib solo o en combinación con ICI (Figura 3B y Figura S4B-E del Material Suplementario). Intracranealmente, se detectó una tendencia a la reducción del crecimiento tumoral después de 2 semanas de administración de fármacos tanto para los grupos de adagrasib como para el grupo de combinación en comparación con el control, lo que fue estadísticamente significativo a las 5 semanas (Figura 3C y Figura S4F del Material Suplementario). Además, el tratamiento con anti-PD-1 controló significativamente el crecimiento tumoral intracraneal en comparación con el vehículo (Figura 3C y Figura S4F), pero no en la medida observada para el adagrasib y los grupos de combinación.

Realizamos el seguimiento a largo plazo de los animales supervivientes (Figura 4A). En la semana 13, si bien ninguno de los animales en el grupo de vehículo sobrevivió, 3 de 10 animales en el grupo de ICI seguían vivos, mientras que 6 de 9 en el grupo de adagrasib y 9 de 10 en el grupo de combinación estaban vivos (Figura 4B). Sin embargo, observamos un crecimiento tumoral en 2 de los 3 ratones en el grupo de anti-PD-1, lo que indica que en este modelo, las recurrencias tumorales ocurrieron después de la interrupción de la inmunoterapia, lo que resultó en la exclusión de estos animales de los estudios de re-desafío posteriores.

Volvimos a tratar a los animales restantes con una dosis más alta de células de cáncer de pulmón KPAR, como se hizo previamente para el modelo CT26, y monitoreamos el crecimiento tumoral intracraneal y la supervivencia general durante 11 semanas (Figura 4C y D y Figura S5A del material suplementario). Observamos una clara distinción en la supervivencia general entre los diferentes tratamientos, ya que el 10%, el 44% y el 80% de los animales en los grupos de anti-PD-1, adagrasib solo y combinación, respectivamente, lograron una supervivencia a largo plazo (Figura 4B y C). El análisis de la incidencia acumulada de muerte, evaluado mediante la prueba de Gray, mostró que el tratamiento combinado confirió un beneficio significativo en la supervivencia en comparación con los grupos de vehículo y anti-PD-1 solo, así como una tendencia a una mayor supervivencia en comparación con el adagrasib como agente único (Figura 4C y Figura S5B del material suplementario).

En conjunto, estos hallazgos resaltan la eficacia de esta estrategia de combinación en modelos preclínicos a largo plazo de metástasis cerebrales que albergan mutaciones KRASG12C.

Para comprender si el adagrasib y el anti-PD-1 mejoraron la actividad citotóxica de las células T, utilizamos cocultivos de 48 horas de células T activadas y células CT26 o KPAR a dos relaciones diferentes entre células diana y efectoras (1:1 y 1:100) en presencia de adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1, y evaluamos la viabilidad de las células tumorales (Figura S6A-C del material suplementario). Nuestros datos mostraron que, tanto en los modelos CT26 como en los KPAR, observamos una disminución significativa en la viabilidad de las células tumorales en los cocultivos tratados con adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1 (Figura S6B y C del material suplementario). Cabe destacar que, aunque detectamos la mayor citotoxicidad de las células T contra las células CT26 en el tratamiento combinado a la relación de 1:100 entre células tumorales y células T (Figura S6B del material suplementario), no observamos esto con las células KPAR (Figura S6C del material suplementario). Dado que nuestros datos in vivo mostraron el beneficio del tratamiento combinado en ambos modelos, estos datos sugieren diferentes mecanismos de acción entre los modelos que pueden no estar completamente representados y detectados en los cocultivos de células tumorales y células T in vitro.

Eficacia del inhibidor de KRASG12C, adagrasib, en combinación con inmunoterapia anti-PD-1 en un modelo murino inmunotípico de metástasis cerebrales de cáncer colorrectal KRASG12C

Para evaluar la terapia dirigida a KRASG12C en combinación con la inmunoterapia anti-PD-1, identificamos líneas celulares murinas que albergan la mutación KRASG12C, incluidas las células de cáncer colorrectal, CT26-KrasG12C, y las células de cáncer de pulmón, KPAR-KrasG12C (Figura 1A). Primero, probamos su sensibilidad al inhibidor selectivo de KRASG12C, adagrasib, in vitro utilizando el ensayo CellTiterGlo. El ensayo de respuesta a la dosis demostró que ambas líneas celulares tienen una sensibilidad similar a este compuesto, con una CI50 de 311 nM en las células CT26 y 399,8 nM en las células KPAR, respectivamente (Figura 1A-C).

Luego, evaluamos si el adagrasib, a dos concentraciones diferentes (500 nM y 1 µM), alteraba la expresión génica en un conjunto de genes relacionados con el sistema inmunitario en las líneas celulares CT26 y KPAR. Confirmamos la disminución de los genes diana dependientes de KRAS-MAPK después del tratamiento con adagrasib y encontramos una regulación al alza de los genes de la clase I del MHC, así como de las citocinas, incluido Cxcl10, en ambos modelos (Figura S1A y B del material suplementario). Detectamos niveles más altos de transcritos de Cd274, que codifica PD-L1, y de la tirosina quinasa receptora Axl solo en las células KPAR, lo que sugiere que el tratamiento con adagrasib puede promover un microambiente inmunitario tumoral más supresor en el modelo KPAR (Figura S1B del material suplementario).

A continuación, evaluamos la eficacia del adagrasib en combinación con la terapia anti-PD-1 en modelos murinos sinérgicos que imitan la inmunología de las metástasis cerebrales (modelos inmunotípicos) utilizando ratones BALB/c o C57BL/6. Generamos modelos de metástasis cerebrales que involucran la implantación subcutánea (SC) y la implantación intracraneal (IC) de tumores para recapitular las características inmunológicas en las metástasis cerebrales.^[19],^[20] Primero, establecimos un modelo dual de metástasis cerebrales subcutáneas e intracraneales de CT26, inyectando células CT26-KrasG12C SC, seguido de la implantación IC de células CT26-KrasG12C-FmC marcadas tres días después. Todos los tratamientos se iniciaron 5 días después de la inyección tumoral intracraneal (Figura 1D). El adagrasib se administró dos veces al día (BID) por vía oral a 100 mg/kg durante tres semanas, y el anticuerpo anti-PD-1 se inyectó por vía intraperitoneal cada tres días (Q3D) a 10 mg/kg durante un total de cinco dosis. Monitoreamos a los ratones para detectar cambios en el peso corporal, que se mantuvo constante durante todo el período de tratamiento, lo que sugiere una buena tolerabilidad de los tratamientos (Figura S2A del material suplementario). Además, se evaluó el crecimiento tumoral subcutáneo e intracraneal, cuantificando el volumen tumoral subcutáneo y la bioluminiscencia intracraneal (BLI), respectivamente (Figura 1E y F y Figura S2B del material suplementario). Aunque los ratones que recibieron anti-PD-1 presentaron un volumen tumoral SC significativamente menor en comparación con los que recibieron vehículo (grupo de control), el crecimiento tumoral se abolió por completo en los ratones tratados con adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1 (Figura 1E y Figura S2B-E del material suplementario). La imagen de bioluminiscencia mostró efectos antitumorales similares intracranealmente, con una tendencia a un mayor beneficio con el tratamiento combinado (Figura 1F y Figura S2F del material suplementario).

Realizamos un seguimiento adicional de la BLI a las 3 semanas posteriores al tratamiento (Figura S2G del material suplementario). Siete de los diez animales estaban libres de tumores intracraneales en los grupos de adagrasib solo y combinación, en comparación con 5 de 10 y 1 de 10 animales en los grupos de anti-PD-1 y vehículo, respectivamente.

Los animales que respondieron al tratamiento rechazaron la reinyección intracraneal de células tumorales CT26

Debido a la regresión tumoral observada en el SNC, continuamos con el seguimiento a largo plazo de los animales (Figura 2A). Evaluamos la eficacia a largo plazo de los tratamientos con la supervivencia general (Figura 2B y C) y el crecimiento tumoral intracraneal (Figura S3A del material suplementario, semana 0) en el punto temporal de 9 semanas después de la interrupción del tratamiento. Observamos que, en el grupo de vehículo, solo el 10% de los animales seguían vivos, mientras que en el grupo de anti-PD-1, el 50% sobrevivió; en los grupos de adagrasib y combinación, el 60% y el 70% de los animales sobrevivieron, respectivamente (Figura 2B y C).

Para determinar si los tratamientos inducían memoria inmunitaria antitumoral en los animales que respondieron a largo plazo, volvimos a inocular los ratones que habían eliminado el tumor, inyectando las mismas células tumorales en el hemisferio cerebral opuesto a un número de células cuatro veces mayor que la implantación original (Figura 2A). Un grupo de 4 ratones que nunca habían sido inyectados con células tumorales (ratones sin tumor) sirvió como control para el crecimiento tumoral. Monitoreamos el crecimiento tumoral intracraneal utilizando la BLI (Figura 2D y Figura S3A del material suplementario). Como se esperaba, después de 2 semanas de la reinyección, todos los ratones sin tumor murieron (Figura S3B del material suplementario), debido al rápido crecimiento tumoral (Figura S3A del material suplementario). En contraste, la mayoría de los ratones reinoculados que habían rechazado la implantación original permanecieron vivos con una regresión tumoral estable durante el período de seguimiento de 12 semanas después de la reinyección (Figura 2B y C). Más específicamente, en los grupos de monoterapia con anti-PD-1 y adagrasib, el 50% de los animales sobrevivieron, en el grupo de terapia combinada, el 60% seguían vivos y, en el grupo de control, solo el 10% estaban vivos.

En conjunto, estos datos sugieren que el adagrasib solo o en combinación con inmunoterapia puede proporcionar un beneficio estadísticamente significativo a largo plazo en la supervivencia general y prevenir las recurrencias intracraneales a largo plazo en las metástasis cerebrales derivadas de las células de cáncer colorrectal CT26.

El adagrasib mostró un beneficio intracraneal en combinación con la terapia anti-PD-1 en un modelo de metástasis cerebrales de cáncer de pulmón KRASG12C resistente a la inmunoterapia

Dado que se sabe que las células CT26 son relativamente inmunogénicas, probamos el adagrasib en combinación con la terapia anti-PD-1 en un modelo establecido con una línea celular de cáncer con mutación KRASG12C, KPAR, que se informó que era resistente a la inmunoterapia.^[14],^[18] Inyectamos células KPAR-KrasG12C en ratones C57BL/6 para generar un modelo inmunotípico de metástasis cerebrales y evaluamos las mismas terapias descritas anteriormente (Figura 3). Aquí, utilizamos el mismo protocolo de administración de fármacos y los mismos puntos de evaluación adoptados en el modelo CT26-KrasG12C (Figura 3A), incluido el peso corporal (Figura S4A del material suplementario) y el crecimiento tumoral subcutáneo e intracraneal (Figura 3B y C). A pesar de una reducción en los volúmenes tumorales en los ratones que recibieron anti-PD-1, en este modelo, no se alcanzó una significación estadística en comparación con el grupo de vehículo. Coherente con nuestros resultados con las células CT26, nuevamente observamos una remisión completa de los tumores subcutáneos en los animales tratados con adagrasib solo o en combinación con inmunoterapia (Figura 3B y Figura S4B-E del material suplementario). Intracranealmente, se detectó una tendencia a la reducción del crecimiento tumoral después de 2 semanas de administración de fármacos para los grupos de adagrasib y combinación en comparación con el control, lo que fue estadísticamente significativo a las 5 semanas (Figura 3C y Figura S4F del material suplementario). Además, el tratamiento con anti-PD-1 controló significativamente el crecimiento tumoral intracraneal en comparación con el vehículo (Figura 3C y Figura S4F del material suplementario), pero no en la medida observada para el adagrasib y los grupos de combinación.

Realizamos un seguimiento a largo plazo de los animales supervivientes (Figura 4A). En la semana 13, mientras que ninguno de los animales en el grupo de vehículo sobrevivió, 3 de 10 animales en el grupo de inmunoterapia seguían vivos, mientras que 6 de 9 en el grupo de adagrasib y 9 de 10 en el grupo de combinación estaban vivos (Figura 4B). Sin embargo, observamos un crecimiento tumoral en 2 de los 3 ratones en el grupo de anti-PD-1, lo que demuestra que, en este modelo, las recurrencias tumorales ocurrieron después de la interrupción de la inmunoterapia, lo que resultó en la exclusión de estos animales de los estudios de reinyección posteriores.

Volvimos a tratar a los animales restantes con una dosis más alta de células de cáncer de pulmón KPAR, como se hizo previamente para el modelo CT26, y monitoreamos el crecimiento tumoral intracraneal y la supervivencia general durante 11 semanas (Figura 4C y D y Figura S5A del material suplementario). Observamos una clara distinción en la supervivencia general entre los diferentes tratamientos, ya que el 10%, el 44% y el 80% de los animales en los grupos de anti-PD-1, adagrasib solo y combinación, respectivamente, lograron una supervivencia a largo plazo (Figura 4B y C). El análisis de la incidencia acumulada de muerte, evaluado mediante la prueba de Gray, mostró que el tratamiento combinado confirió un beneficio significativo en la supervivencia en comparación con los grupos de vehículo y anti-PD-1 solo, así como una tendencia a una mayor supervivencia en comparación con el adagrasib como agente único (Figura 4C y Figura S5B del material suplementario).

En conjunto, estos hallazgos resaltan la eficacia de esta estrategia de combinación en modelos preclínicos a largo plazo de metástasis cerebrales que albergan mutaciones KRASG12C.

Para comprender si el adagrasib y el anti-PD-1 mejoraron la actividad citotóxica de las células T, utilizamos cocultivos de 48 horas de células T activadas y células CT26 o KPAR a dos relaciones diferentes entre células diana y efectoras (1:1 y 1:100) en presencia de adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1, y evaluamos la viabilidad de las células tumorales (Figura S6A-C del material suplementario). Nuestros datos mostraron que, tanto en los modelos CT26 como en los KPAR, observamos una disminución significativa en la viabilidad de las células tumorales en los cocultivos tratados con adagrasib solo o en combinación con anti-PD-1 (Figura S6B y C del material suplementario). Cabe destacar que, aunque detectamos la mayor citotoxicidad de las células T contra las células CT26 en el tratamiento combinado a la relación de 1:100 entre células tumorales y células T (Figura S6B del material suplementario), no observamos esto con las células KPAR (Figura S6C del material suplementario). Dado que nuestros datos in vivo mostraron el beneficio del tratamiento combinado en ambos modelos, estos datos sugieren diferentes mecanismos de acción entre los modelos que pueden no estar completamente representados y detectados en los cocultivos de células tumorales y células T in vitro.

Discusión

Las metástasis cerebrales (MC) son frecuentes en pacientes con cáncer de pulmón avanzado con mutación de KRAS, y dado que el sistema nervioso central (SNC) presenta desafíos únicos en cuanto a la administración de fármacos y la respuesta inmune, su aparición se asocia con malos resultados clínicos.^[22-24] En la última década, se han aprobado terapias dirigidas a KRAS, como el inhibidor de KRASG12C, adagrasib, para el tratamiento de tumores sólidos, y actualmente se están evaluando para el tratamiento de MC. Sin embargo, la resistencia y la recurrencia tumoral son comunes tras la interrupción del tratamiento, lo que sugiere la necesidad de estrategias combinadas. Dado que se sabe que la mutación oncogénica KRASG12C promueve la evasión inmune tumoral con altos niveles de PD-L1,^[13], se ha explorado la combinación de inmunoterapia con terapia dirigida a KRAS como un enfoque terapéutico prometedor en modelos murinos de enfermedad extracraneal,^[4], mientras que su actividad intracraneal aún no se ha explorado. En este estudio, nuestro objetivo fue llenar este vacío, investigando la eficacia de esta terapia combinada en modelos in vivo de MC.

Aunque los modelos murinos intracraneales de MC han sido fundamentales para comprender el crecimiento de tumores sólidos en el cerebro, estos modelos pueden no reproducir el microambiente inmune de las MC. El panorama inmune de las MC representa un desafío continuo para los estudios in vivo. Durante la progresión del cáncer metastásico en humanos, el sistema inmune del huésped ya ha estado expuesto a los antígenos tumorales primarios, por lo que los modelos intracraneales tradicionales no son ideales para evaluar las inmunoterapias en el contexto de la progresión del cáncer en el SNC. Por lo tanto, creamos modelos de MC inmunotípicos que imitan mejor la exposición secuencial del sistema inmune, en los que primero implantamos tumores subcutáneamente y luego intracranealmente, obteniendo modelos duales de MC.^[19] Además, se ha demostrado que, debido a la complejidad del microambiente de las MC, la respuesta intracraneal a los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) puede estar favorecida por la presencia de enfermedad extracraneal,^[19],^[20],^[25-27], lo que subraya la importancia de utilizar modelos duales de MC para evaluar las terapias combinadas con anti-PD-1. Además, los pacientes con MC tienen más probabilidades de presentar una respuesta parcial a los ICI en comparación con los pacientes con tumores cerebrales primarios. El uso de estos modelos duales permite el estudio de las intervenciones con ICI en un sistema que puede reflejar con mayor precisión el contexto inmunológico y la respuesta clínica de las MC que la implantación intracraneal sola.

En el presente estudio, demostramos, por primera vez, la eficacia intracraneal de la combinación de adagrasib e ICI utilizando dos modelos sinérgicos murinos duales de tumores KRASG12C, mostrando que la combinación de adagrasib con inmunoterapia anti-PD-1 puede prevenir las recurrencias de MC que se originan en tumores sólidos KRASG12C. Si bien en ambos modelos de MC observamos una fuerte actividad antitumoral de la monoterapia con adagrasib, que detuvo eficazmente el crecimiento del tumor subcutáneo, también informamos sobre respuestas específicas del modelo a los tratamientos. Específicamente, en el modelo de MC de cáncer colorrectal, tanto adagrasib como anti-PD-1 redujeron el crecimiento tumoral intracraneal, y adagrasib prolongó significativamente la supervivencia en comparación con el vehículo. Es importante destacar que, en el modelo de MC de cáncer de pulmón establecido con células KPAR, el tratamiento combinado logró una respuesta terapéutica superior en comparación con la monoterapia. Estos datos son consistentes con la literatura previa en el entorno extracraneal,^[5] y validan la penetración en el SNC y el beneficio intracraneal de adagrasib en dos modelos diferentes, lo que respalda la relevancia clínica de nuestros hallazgos.

Otra consideración importante para los pacientes con MC tratados con terapia dirigida es el alto riesgo de recurrencia. En este contexto, utilizamos experimentos de reexposición tumoral para simular las recurrencias tumorales. Demostramos el beneficio de combinar la terapia dirigida a KRAS con anti-PD-1 para prevenir las recurrencias tumorales intracraneales a largo plazo (hasta 5 meses después de la interrupción del tratamiento) en dos modelos de MC. Aunque se observaron constantemente altas tasas de respuesta al tratamiento combinado en ambos modelos, la respuesta a los agentes únicos (anti-PD-1 y adagrasib solamente) fue mayor en el modelo CT26. Esta observación puede deberse a diferencias en la inmunogenicidad tumoral y los microambientes inmunes tumorales (MIT) en los dos modelos.^[14],^[18],^[28] Aunque tanto las células CT26 como las células KPAR se modificaron para que tuvieran KrasG12C, difieren en su origen genético y perfil inmune.^[29] Específicamente, las células CT26 forman tumores con altos niveles de infiltración inmune caracterizados por TIL, como células T CD8+, células T CD4+ Foxp3− y células dendríticas y NK.^[30] Coherente con nuestros datos in vivo, este microambiente tumoral probablemente hace que este modelo sea más sensible a los ICI.^[30],^[31] En contraste, las células KPAR, aunque altamente inmunogénicas,^[32], participan en una respuesta inmune más amplia, caracterizada por un microambiente tumoral inmunosupresor. Esto incluye la presencia de células T reguladoras y células mieloides PD-L1+, que promueven la evasión inmune.^[32] La naturaleza intrínsecamente resistente a los ICI de los tumores KPAR^[18] refleja el perfil inmune-resistente que a menudo se observa en las MC y puede explicar su resistencia parcial al anti-PD-1 como tratamiento único, al tiempo que muestra una respuesta alentadora al tratamiento combinado. Cabe destacar que nuestros datos in vitro mostraron que adagrasib aumentó la expresión de Cd274 (PD-L1) en las células KPAR, lo que puede contribuir a mejorar el MIT supresor y mediar una mejor respuesta al anti-PD-1. La eficacia del tratamiento combinado probablemente se deba a un efecto dual de adagrasib sobre las células inmunes y tumorales. Adagrasib puede bloquear que las células tumorales produzcan citocinas, deteniendo el reclutamiento de poblaciones celulares inmunosupresoras, al tiempo que promueve el reclutamiento de células NK y activa las células T citotóxicas que pueden responder eficazmente al anti-PD-1. Dado que la mutación de KRAS induce una alta expresión de PD-L1^[9] y la sobrecarga de las interacciones PD-1-PD-L1 puede abrumar a los ICI solos, la reducción de los niveles de PD-L1 en las células tumorales mediada por adagrasib puede hacer que los ICI sean eficaces. No obstante, nuestros hallazgos sugieren que puede ser necesaria la modulación farmacológica del sistema inmune de las MC para lograr una remisión tumoral completa y prevenir las recurrencias. Sin embargo, nuestra investigación se limita a centrarse en la prueba de la terapia combinada para la recurrencia de las MC. Los trabajos futuros deberían explorar los mecanismos detallados por los cuales la modulación farmacológica del sistema inmune de las MC influye en la remisión y la recaída tumoral.

El remodelado del MIT inducido por el tratamiento se ha caracterizado recientemente en modelos preclínicos extracraneales de cáncer de pulmón utilizando el análisis multiplex espacial.^[33] Nuestro trabajo representa una sólida base para realizar investigaciones similares intracranealmente. Dichos estudios ayudarían a definir las poblaciones inmunes específicas que median la eliminación tumoral inducida por el tratamiento y aclarar cómo las terapias de agente único o combinadas afectan a estas poblaciones, utilizando enfoques como la citometría de flujo y/o el análisis de células individuales.

En conjunto, nuestros datos describen el beneficio de utilizar adagrasib en combinación con inmunoterapia anti-PD-1 como una estrategia terapéutica para controlar el crecimiento y prevenir las recurrencias de las MC en dos modelos preclínicos de MC. Dada la alta tasa de recurrencia intracraneal en pacientes con MC y las opciones de tratamiento eficaces limitadas, nuestro trabajo tiene un potencial clínico para esta población de pacientes. Nuestros datos respaldan las investigaciones clínicas en curso que evalúan adagrasib en combinación con pembrolizumab en pacientes con MC con mutación de KRAS (KRYSTAL-7),^[34],^[35], lo que ofrece nuevas esperanzas para el uso de terapias dirigidas que penetran en el SNC combinadas con ICI en una población de pacientes que tradicionalmente ha sido excluida de los ensayos clínicos.