Reencuadrar computacional de fármacos aprobados que se dirigen a KRAS G12D y EGFR para el tratamiento del cáncer colorrectal.

El oncogén del sarcoma viral de rata de Kirsten (KRAS) desempeña un papel importante en la iniciación y progresión del tumor en un amplio espectro de cánceres humanos. Representa más del 80% de todas las mutaciones RAS y está implicado en el 20% de todas las neoplasias humanas. La incidencia de las mutaciones de KRAS es particularmente alta en el cáncer colorrectal (CCR), y se produce en el 35-40% de los casos de CCR. En particular, la mutación KRAS G12D es una variante más dominante que se encuentra en el 12% de los casos de CCR y está significativamente asociada con un alto riesgo de metástasis y un mal pronóstico [^[1]–^[3]].

KRAS es estimulado por señales de crecimiento extracelulares mediadas por la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Esta señalización de crecimiento permite que KRAS se desplace entre la unión con la guanosina-5-trifosfato (GTP) en un estado "activo" y con la guanosina-5-difosfato (GDP) en un estado "inactivo". Las mutaciones en KRAS alteran la dinámica de este ciclo, lo que resulta en un KRAS hiperactivo, que activa constitutivamente tres vías principales aguas abajo: la vía de la quinasa activada por mitógenos (MAP), la vía PI3K/AKT/mTOR (PAM) y las vías de la proteína inductora de la invasión tumoral y la metástasis 1 (TIAM1-RAC) y la proteína relacionada con RAS (RAL). Esta señalización descontrolada resulta en un aumento de la proliferación, una disminución de la apoptosis y un aumento de la angiogénesis, lo que contribuye a la oncogénesis. Por lo tanto, dirigir directamente a KRAS mutado podría servir como una estrategia terapéutica eficaz [^[1],^[2],^[4],^[5]].

Se ha considerado que dirigir a KRAS es bastante desafiante. Los estudios preliminares de las proteínas KRAS revelaron que carecen de una cavidad de unión hidrofóbica distinta de la bolsa de unión a GTP/GDP. Sin embargo, la GTP es naturalmente abundante dentro de las células y el diseño de inhibidores competitivos de nucleótidos eficaces presenta un desafío significativo. Además, dirigir a los efectores aguas arriba o aguas abajo de KRAS no ha logrado producir los resultados deseados o ha provocado efectos adversos significativos. Se produjo un avance en el campo en 2013 cuando los avances en la comprensión de la biología de KRAS condujeron a la identificación del primer inhibidor de KRAS G12C [^[2]].

La identificación de un nuevo sitio alostérico dentro de KRAS G12C ha llevado al desarrollo de inhibidores covalentes que se dirigen a la cisteína reactiva 12 en el mutante KRASG12C a través de un diseño basado en la estructura. Sin embargo, la mutación G12D es el evento mutacional más común en KRAS, y solo un pequeño porcentaje de los pacientes experimenta resultados positivos con la terapia dirigida a G12C. No obstante, el desarrollo de inhibidores específicos de KRAS G12C reveló que el sitio alostérico en todas las proteínas KRAS es un objetivo válido para diseñar inhibidores selectivos de KRAS G12D. En 2021, se desarrolló un inhibidor no covalente selectivo de KRAS G12D llamado MRTX1133, y los estudios preclínicos indican que tiene el potencial de revolucionar el enfoque para tratar el cáncer impulsado por KRAS G12D, lo que podría remodelar las estrategias terapéuticas actuales [^[3],^[6]–^[9]]. A pesar de que MRTX1133 es un inhibidor eficaz de KRAS G12D y demuestra un efecto citotóxico sobre las células cancerosas mutadas en KRAS G12D, un informe reciente concluyó que las células de cáncer colorrectal mutadas en KRAS G12D exhiben una sensibilidad reducida a MRTX1133, lo que resulta en una respuesta terapéutica más débil. Este estudio reveló que la activación de retroalimentación de la vía EGFR/RAS de tipo salvaje reduce la eficacia de la terapia con inhibidores de KRAS G12D en el CCR. En particular, los isoformas de tipo salvaje de RAS, en lugar de KRAS oncogénico, desencadenan la señalización aguas abajo del EGFR activado, lo que resulta en una reactivación y una reducción de la eficacia de MRTX1133. Afortunadamente, la inhibición de esta vía con inhibidores de la quinasa, como el erlotinib, bloqueó la señalización de EGFR/RAS de tipo salvaje y sensibilizó las células a MRTX1133 [^[10]].

El reposicionamiento de fármacos enfatiza la identificación de nuevos usos terapéuticos para los fármacos existentes, aprobados y comercializados. Se ha demostrado que los fármacos que ya han pasado por ensayos clínicos son seguros y tienen perfiles farmacocinéticos, farmacodinámicos y de toxicidad bien conocidos, lo que permite a los investigadores explorar su potencial terapéutico más amplio. En comparación con los 12 a 13 años y los 2 a 3 mil millones de dólares necesarios para llevar un nuevo fármaco desde el laboratorio hasta el mercado, el reposicionamiento ofrece una alternativa más rápida y asequible, lo que ahorra tanto costes como tiempo en aproximadamente un 30% [^[11]]. Además, la integración de enfoques computacionales durante las etapas iniciales del descubrimiento de fármacos ha demostrado ser invaluable. Estos enfoques se utilizan ahora con frecuencia en diferentes fases del proceso de desarrollo de fármacos, como el reconocimiento de "hits" y la optimización de "leads". El cribado virtual permite reducir una gran variedad de compuestos para las pruebas experimentales y la identificación de prometedores candidatos a fármacos. El acoplamiento molecular se utiliza ampliamente en el cribado virtual, especialmente cuando se conoce la estructura 3D de una proteína. Además, la dinámica molecular (DM) ha surgido como una herramienta computacional para explorar la flexibilidad y la dinámica de las interacciones entre fármacos y objetivos, lo que ha revolucionado el campo del diseño de fármacos asistido por ordenador (CADD) [^[12]–^[14]]. En conjunto, el reposicionamiento de fármacos y los métodos computacionales avanzados aceleran la línea de desarrollo, ofreciendo una vía rentable y que ahorra tiempo para identificar soluciones terapéuticas eficaces [^[15]].

Este estudio utiliza métodos computacionales para explorar el potencial de reposicionamiento de fármacos existentes para dirigirse simultáneamente a KRAS G12D y EGFR. Esta estrategia de codirigimiento tiene como objetivo evitar la resistencia y mejorar la eficacia terapéutica de los tratamientos dirigidos a KRAS G12D.

2. Materiales y métodos

2.1. Recursos computacionales

Se utilizó el Maestro v 12.8 del paquete de Schrödinger en este estudio.

2.2. Preparación de proteínas y ligandos

Las estructuras tridimensionales (3D) de KRAS G12D (ID del PDB: 7RPZ) y la tirosina quinasa de EGFR (ID del PDB: 1M17) se obtuvieron del Banco de datos de proteínas (https://www.rcsb.org/structure). Las dos proteínas se prepararon a continuación mediante la herramienta de preparación de proteínas del Maestro, que refina y optimiza las estructuras de las proteínas. Las proteínas se minimizaron posteriormente mediante el campo de fuerza OPLS3e [^[16],^[17]].

Las cavidades de unión de las proteínas se definieron alrededor de los ligandos co-cristalizados MRTX1133 y Erlotinib unidos a la proteína mediante la herramienta de generación de rejilla de receptores del Maestro. Las coordenadas de los ligandos con la proteína se utilizaron para crear una rejilla 3D con dimensiones precisas, que representa el área activa del receptor [^[18]].

Se obtuvo una biblioteca de 3.591 fármacos aprobados de la biblioteca ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/). Durante este proceso, se utilizó Epik para generar los estados de protonación y tautoméricos más probables a pH fisiológico (7,0 ± 2,0). Posteriormente, todos los compuestos se minimizaron energéticamente utilizando el campo de fuerza OPLS3e para generar conformeros de baja energía y garantizar que las estructuras de los compuestos fueran aceptables para un mayor trabajo computacional [^[19]].

2.3. Acoplamiento molecular y cálculos MM-GBSA

La biblioteca preparada sirvió como entrada para un cribado virtual por etapas para identificar posibles inhibidores duales de KRAS G12D y EGFR. Inicialmente, la biblioteca se cribó contra KRAS G12D, y los ligandos se seleccionaron en función de su fuerza de unión al receptor, representada por la puntuación de Glide (G score). Este proceso implicó pasos de acoplamiento secuenciales mediante el módulo Glide. Se utiliza el cribado virtual de alto rendimiento (HTVS) para un cribado rápido e inicial, seguido de la percepción estándar (SP) y la precisión extra (XP), que proporciona la mayor precisión. Se utilizaron los parámetros predeterminados para el proceso de acoplamiento, y los resultados se analizaron en función de las puntuaciones G [^[20]–^[22]].

Los compuestos que obtuvieron altas puntuaciones de acoplamiento se acoplaron posteriormente en el bolsillo de unión de EGFR, y se calcularon sus puntuaciones de acoplamiento. El protocolo de acoplamiento se validó volviendo a acoplar los inhibidores co-cristalizados nativos en los sitios activos preparados de KRAS G12D y EGFR. En ambos casos, las poses re-acopladas reprodujeron estrechamente las orientaciones de unión observadas en las estructuras co-cristalizadas, con valores de desviación cuadrática media (RMSD) de 2,06 Å y 1,09 Å, respectivamente (Fig. 1).

Las poses de acoplamiento de los compuestos seleccionados se utilizaron a continuación para calcular su energía libre de unión MM-GBSA mediante la herramienta Prime del Maestro. MM-GBSA es un método de revalorización que demuestra una fuerte correlación entre la actividad predicha y la observada [^[23]–^[25]]. La energía libre de unión se calculó mediante la siguiente ecuación [^[24]]:

Donde:

?G bind = energía libre de unión

G complex = energía libre del complejo

G protein = energía libre de la proteína diana

G ligand = energía libre del ligando.

Los cálculos aplicaron el modelo de solvatación implícita VSGB y el campo de fuerza OPLS3e, integrados en el módulo Schrödinger Prime. El modelo VSGB aproxima los efectos de solvatación sin incluir explícitamente las moléculas de disolvente, y los cálculos se realizaron en un entorno de disolvente implícito, no en el vacío. Además, se omitieron las contribuciones entrópicas, lo que es una simplificación común en los flujos de trabajo MM-GBSA para reducir el coste computacional y mantener estimaciones fiables de la energía de unión relativa [^[26]].

2.4. Simulaciones de dinámica molecular (DM)

Los archivos de salida del acoplamiento XP de Glide se utilizaron como entrada para las simulaciones de DM realizadas con el paquete de software GROMACS 2024.4. Las topologías de los ligandos se generaron utilizando el servidor SwissParam, mientras que los parámetros de las proteínas se generaron utilizando el campo de fuerza OPLS-AA/L y el modelo de agua TIP3P dentro de GROMACS [^[27]]. Se creó una caja de simulación triclínica alrededor de los complejos proteína-ligando utilizando el módulo gmx editconf. Para EGFR, la caja se estableció en una forma ortorrómbica, y el complejo proteína-fármaco se posicionó en el centro de la caja de 11,4 x 8,6 x 7,2 nm. El complejo proteína-fármaco KRAS G12D se posicionó en el centro de una caja cúbica con una distancia de 6 nm. Se añadieron moléculas de agua para solvatar completamente los sistemas, junto con iones Na para neutralizar el sistema, y se añadieron pares de iones Na y Cl para alcanzar una concentración salina de 0,1 M. Tras la preparación de la caja, el sistema se sometió a una minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado. Posteriormente, se realizaron simulaciones de equilibrio NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura) durante 100 ps para lograr un sistema estable a la temperatura y presión deseadas. La estabilidad de los complejos se evaluó utilizando la desviación cuadrática media (RMSD), la fluctuación cuadrática media (RMSF) y el radio de giración (Rg).

2.5. Predicción in silico de ADME

Las características fisicoquímicas de los ligandos con la puntuación más alta se analizaron utilizando el servidor web pkCSM, accesible en https://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/. Esta herramienta facilita la predicción de los parámetros ADME para evaluar la similitud de los fármacos de los compuestos.

2.1. Recursos computacionales

Se utilizó el Maestro v 12.8 del paquete de Schrödinger en este estudio.

2.2. Preparación de proteínas y ligandos

Las estructuras tridimensionales (3D) de KRAS G12D (ID del PDB: 7RPZ) y la tirosina quinasa de EGFR (ID del PDB: 1M17) se obtuvieron del Banco de datos de proteínas (https://www.rcsb.org/structure). Las dos proteínas se prepararon a continuación mediante la herramienta de preparación de proteínas del Maestro, que refina y optimiza las estructuras de las proteínas. Las proteínas se minimizaron posteriormente mediante el campo de fuerza OPLS3e [^[16],^[17]].

Las cavidades de unión de las proteínas se definieron alrededor de los ligandos co-cristalizados MRTX1133 y Erlotinib unidos a la proteína mediante la herramienta de generación de rejilla de receptores del Maestro. Las coordenadas de los ligandos con la proteína se utilizaron para crear una rejilla 3D con dimensiones precisas, que representa el área activa del receptor [^[18]].

Se obtuvo una biblioteca de 3.591 fármacos aprobados de la biblioteca ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/). Durante este proceso, se utilizó Epik para generar los estados de protonación y tautoméricos más probables a pH fisiológico (7,0 ± 2,0). Posteriormente, se minimizó la energía de todos los compuestos utilizando el campo de fuerza OPLS3e para generar conformeros de baja energía y garantizar que las estructuras de los compuestos fueran aceptables para trabajos computacionales posteriores [^[19]].

2.3. Acoplamiento molecular y cálculos MM-GBSA

La biblioteca preparada sirvió como entrada para un cribado virtual por etapas con el fin de identificar posibles inhibidores duales para KRAS G12D y EGFR. Inicialmente, se realizó un cribado de la biblioteca contra KRAS G12D, y se seleccionaron los ligandos en función de su fuerza de unión al receptor, representada por la puntuación de Glide (G score). Este proceso implicó pasos de acoplamiento secuenciales a través del módulo Glide. Se utiliza un cribado virtual de alto rendimiento (HTVS) para un cribado rápido e inicial, seguido de percepción estándar (SP) y precisión extra (XP), que proporciona la mayor precisión. Se emplearon los parámetros predeterminados para el proceso de acoplamiento, y los resultados se analizaron en función de las puntuaciones G [^[20]–^[22]].

Los compuestos que obtuvieron puntuaciones de acoplamiento elevadas se acoplaron posteriormente en el sitio de unión de EGFR, y se calcularon sus puntuaciones de acoplamiento. El protocolo de acoplamiento se validó volviendo a acoplar los inhibidores nativos co-cristalizados en los sitios activos preparados de KRAS G12D y EGFR. En ambos casos, las poses re-acopladas reprodujeron estrechamente las orientaciones de unión observadas en las estructuras co-cristalizadas, con valores de desviación cuadrática media (RMSD) de 2,06 Å y 1,09 Å, respectivamente (Fig. 1).

Las poses de acoplamiento de los compuestos seleccionados se utilizaron posteriormente para calcular su energía libre de unión MM-GBSA a través de la herramienta Prime de Maestro. MM-GBSA es un método de re-puntuación que demuestra una fuerte correlación entre la actividad predicha y la observada [^[23]–^[25]]. La energía libre de unión se calculó mediante la siguiente ecuación [^[24]]:

Donde:

?G bind = energía libre de unión

G complex = energía libre del complejo

G protein = energía libre de la proteína diana

G ligand = energía libre del ligando.

Los cálculos aplicaron el modelo de solvatación implícita VSGB y el campo de fuerza OPLS3e, según lo integrado en el módulo Schrödinger Prime. El modelo VSGB aproxima los efectos de la solvatación sin incluir explícitamente las moléculas de disolvente, y los cálculos se realizaron en un entorno de disolvente implícito, no en el vacío. Además, se omitieron las contribuciones entrópicas, lo cual es una simplificación común en los flujos de trabajo MM-GBSA para reducir el coste computacional manteniendo estimaciones relativas de la energía de unión fiables [^[26]].

2.4. Simulaciones de dinámica molecular (DM)

Los archivos de salida del acoplamiento Glide XP se utilizaron como entrada para las simulaciones de DM realizadas con el paquete de software GROMACS 2024.4. Las topologías de los ligandos se generaron utilizando el servidor SwissParam, mientras que los parámetros de las proteínas se generaron utilizando el campo de fuerza OPLS-AA/L y el modelo de agua TIP3P dentro de GROMACS [^[27]]. Se creó una caja de simulación triclínica alrededor de los complejos proteína-ligando utilizando el módulo gmx editconf. Para EGFR, la caja se estableció en una forma ortorrómbica, y el complejo proteína-fármaco se posicionó en el centro de la caja de 11,4 x 8,6 x 7,2 nm. El complejo proteína-fármaco KRAS G12D se posicionó en el centro de una caja cúbica con una distancia de 6 nm. Se añadieron moléculas de agua para solvatar completamente los sistemas, junto con iones Na para neutralizar el sistema, y se añadieron pares de iones Na y Cl para alcanzar una concentración salina de 0,1 M. Tras la preparación de la caja, el sistema se sometió a una minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado. Posteriormente, se realizaron simulaciones de equilibrio NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura) durante 100 ps para lograr un sistema estable a la temperatura y presión deseadas. La estabilidad de los complejos se evaluó utilizando la desviación cuadrática media (RMSD), la fluctuación cuadrática media (RMSF) y el radio de giración (Rg).

2.5. Predicción in silico de ADME

Las características fisicoquímicas de los ligandos con las puntuaciones más altas se analizaron utilizando el servidor web pkCSM, accesible en https://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/. Esta herramienta facilita la predicción de los parámetros ADME para evaluar la similitud farmacológica de los compuestos.

3. Resultados y discusión

La aparición de terapias dirigidas, como el inhibidor selectivo MRTX1133, ha revolucionado el tratamiento de los cánceres con mutación KRAS G12D [^[7]]. Si bien este compuesto ha demostrado efectos citotóxicos sobre las células cancerosas con mutación KRAS G12D, informes recientes revelaron que las células CRC que albergan esta mutación a menudo muestran una respuesta disminuida a MRTX1133 [^[28]]. La eficacia reducida se ha atribuido a la activación de retroalimentación de la vía EGFR/RAS de tipo salvaje. Sin embargo, se ha demostrado que la inhibición de EGFR activado suprime esta señalización compensatoria, aumentando así la sensibilidad a MRTX1133 [^[10]]. Dados estos desafíos, nuestro estudio tiene como objetivo emplear CADD para evaluar el potencial de reutilizar fármacos aprobados para inhibir tanto las proteínas KRAS G12D como EGFR. Al emplear CADD, podemos examinar de manera eficiente una biblioteca de fármacos aprobados para identificar candidatos que puedan atacar simultáneamente tanto KRAS G12D como EGFR. Este enfoque mejora la eficacia terapéutica y supera las limitaciones impuestas por los mecanismos de retroalimentación en el tratamiento del cáncer colorrectal.

Los sitios activos para KRAS y EGFR se determinaron utilizando los ligandos unidos a ambas proteínas. El sitio activo de KRAS (ID de PDB: 7RPZ) unido a MRTX1133 se validó utilizando el SiteMap de la suite de Schrödinger, que mostró que los residuos del sitio 1 eran consistentes con los residuos que interactúan con MRTX1133 unido a KRAS (Tabla S1, archivo complementario).

Como se representa en la Fig. 2, el flujo de trabajo implicó dos rondas de acoplamiento. En la 1ª ronda, se realizó un cribado de una biblioteca de 3.591 fármacos aprobados contra KRAS G12D. Se implementaron pasos de acoplamiento consecutivos que utilizaban el módulo Glide para filtrar el candidato más prometedor de esta biblioteca y analizar la naturaleza de las interacciones entre el objetivo y los ligandos. A pesar de su limitación para tener en cuenta la flexibilidad de los receptores, el acoplamiento sigue siendo una herramienta válida para proporcionar información preliminar. El cribado preliminar a través del modo HTVS de Glide reveló que 634 compuestos presentaban puntuaciones de acoplamiento de ?7 kcal/mol o inferiores. Estos compuestos se sometieron posteriormente a un acoplamiento SP, y se seleccionaron los 100 compuestos principales con puntuaciones SP < 8,2 kcal/mol para un mayor refinamiento. Posteriormente, se realizó un acoplamiento de precisión extra (XP) en este subconjunto. Para priorizar los compuestos con mejores afinidades de unión predichas, aplicamos un criterio de selección basado en superar al ligando de referencia MRTX1133, que tenía una puntuación de acoplamiento XP de ?9,18 kcal/mol. En consecuencia, se seleccionaron los compuestos con puntuaciones XP más bajas. Esto resultó en 25 compuestos principales con puntuaciones XP que oscilan entre ?9,202 y ?10,866 kcal/mol, todos los cuales demostraron una mejor unión predicha que la de referencia. Los compuestos de mayor rango se seleccionaron posteriormente para una segunda ronda de acoplamiento XP contra EGFR. Los resultados del acoplamiento de EGFR indicaron que seis fármacos aprobados, a saber, Reproterol, Macimorelin, Nebivolol, Nadolol, Antrafenine y Carteolol, obtuvieron puntuaciones de acoplamiento que oscilan entre ?7,186 y ?8,864 kcal/mol. En comparación, el ligando de referencia Erlotinib exhibió una puntuación de acoplamiento de ?9,669 kcal/mol.

La fuerza de la afinidad de unión de los seis fármacos principales se evaluó calculando la energía libre de unión. Los valores de dGbind obtenidos oscilaron entre -20,7 y -64,21 kcal/mol para KRAS G12D y entre -40,32 y -55,47 kcal/mol para EGFR (Tabla 1). Los ligandos de referencia MRTX1133 y Erlotinib exhibieron un valor MM-GBSA de -27,15 y -65,58 kcal/mol, respectivamente (Tabla 1). Estos cálculos se realizaron sin incluir las contribuciones entrópicas, lo cual es una simplificación común en los flujos de trabajo MM-GBSA destinados a reducir el coste computacional. Sin embargo, esta omisión representa una limitación notable, especialmente al interpretar las energías de unión absolutas, que pueden carecer de precisión en ausencia de términos entrópicos. A pesar de esto, las comparaciones de energía de unión relativa siguen siendo sólidas y continúan proporcionando información valiosa sobre la clasificación de los ligandos y la fuerza de unión.

Cabe destacar que nuestro objetivo principal no es identificar candidatos con una mejor unión a EGFR en comparación con Erlotinib, sino identificar compuestos que exhiban una fuerte afinidad por KRAS G12D y que también modulen EGFR. Esta estrategia de orientación dual tiene como objetivo abordar los mecanismos de resistencia que a menudo se encuentran en el cáncer colorrectal. Por lo tanto, estos compuestos se utilizaron para un análisis detallado de la estructura y la interacción de unión.

Curiosamente, entre los compuestos seleccionados, se identificaron tres bloqueadores beta-adrenérgicos (Nebivolol, Nadolol y Carteolol) y un agonista de acción corta (Reproterol). Cabe destacar que los seis compuestos seleccionados comparten características estructurales comunes, incluido un grupo amino primario o secundario protonado, un núcleo bicíclico y sustituyentes alquilo. Estos elementos estructurales contribuyen a la formación de una extensa interfaz hidrofóbica, que tiene el potencial de servir como un marco eficaz para el desarrollo de inhibidores de KRAS G12D [^[29]].

Se ha informado que los aminoácidos clave que contribuyen a la estabilidad de KRAS G12D, en orden descendente de importancia, son: Asp69, His95, Met72, Gln99, Arg68, Tyr96, Tyr64, Gly60, Asp12 y Val9 [^[29]]. Como se muestra en la Fig. 2 y la Tabla 2, todos los compuestos seleccionados, excepto Macimorelin y Antrafenine, exhibieron una interacción compartida con Arg68. Sin embargo, Macimorelin formó un enlace de hidrógeno con Tyr96 y una interacción pi-pi con His95, lo que refleja las interacciones observadas en Reproterol. En Reproterol, sin embargo, la interacción con His95 se produjo a través de un enlace de hidrógeno. Antrafenine, Carteolol y Nadolol establecen una red de enlaces de hidrógeno estructurada. Esta red permite que los ligandos conecten eficazmente las regiones lipofílicas y polares del bolsillo de conmutación II. Esta red se establece a través de un puente de agua, que involucra las moléculas de agua conservadas dentro del sitio de unión. En esta interacción, el grupo hidroxilo de Thr58 y el oxígeno carbonílico de Gly10 funcionan como aceptores de enlaces de hidrógeno, mientras que los grupos amino de los ligandos sirven como donantes de enlaces de hidrógeno. Nadolol también forma enlaces de hidrógeno con Asp69 y Arg102. Las investigaciones previas sugieren que los inhibidores que forman tales redes están asociados con un efecto inhibidor más fuerte [^[9]]. Por el contrario, MRTX1133 se estabiliza en el bolsillo de unión a través de enlaces de hidrógeno con Asp12 y Glu62, así como interacciones pi-pi y pi-catión con Tyr96 y His95, respectivamente (Fig. 3 y Tabla 2).

Además, los atributos estructurales de los compuestos seleccionados facilitan la formación de una red de enlaces de hidrógeno robusta dentro del sitio de unión al ATP de EGFR. Se observó un enlace de hidrógeno sostenido con Met769, junto con una interacción iónica entre los grupos amino catiónicos de estos compuestos y la cadena lateral de ácido carboxílico de Asp831. Investigaciones previas han informado que la interacción con Asp831 puede mejorar la inhibición de EGFR en 50 veces [^[30]]. Cabe mencionar que el nebivolol, aunque no interactúa con Met769, sí interactuó con Cys773. Esta interacción fue fundamental en la creación de inhibidores irreversibles de EGFR, que exhibieron una actividad antitumoral significativa, con efectos tanto en investigaciones in vitro como in vivo, manteniendo al mismo tiempo una citotoxicidad mínima [^[9]]. Además, Antrafenina, Carteolol, Nadolol y Nebivolol exhibieron interacciones adicionales con Phe699. Nebivolol y Antrafenina también mostraron interacciones con Lys721. Nadolol y Macimorelin interactuaron con una molécula de agua en el sitio de unión, mientras que Macimorelin y Nebivolol interactuaron con Arg817. Reproterol y Nebivolol interactuaron de forma única con Glu738 y Thr830, respectivamente. Erlotinib formó enlaces de hidrógeno con Met769 y moléculas de agua en el sitio de unión de EGFR (Fig. 4 y Tabla 3).

La flexibilidad del receptor es crucial para predecir de forma fiable la afinidad de unión de los fármacos, las propiedades termodinámicas y el comportamiento cinético. Por lo tanto, la integración de estudios de acoplamiento con simulaciones de dinámica molecular (DM) puede mejorar el proceso de selección y facilitar la identificación de nuevos compuestos principales [^[31]]. Nadolol y Carteolol se identificaron como candidatos prometedores, demostrando las puntuaciones de acoplamiento más altas con KRAS G12D y puntuaciones aceptables con EGFR. Luego, se analizaron los compuestos utilizando simulaciones de dinámica molecular (DM) de 100 ns para evaluar su estabilidad de unión. Los parámetros clave analizados incluyeron la desviación media cuadrática (RMSD), la fluctuación media cuadrática (RMSF) y el radio de gyración del ligando. La RMSD se utiliza para cuantificar el movimiento promedio de una selección de átomos en un marco específico en comparación con un marco de referencia. El análisis de la RMSD proporciona información valiosa sobre la conformación estructural de una proteína a lo largo de la simulación, donde los valores más bajos y menos desviaciones indican una mayor estabilidad. Los valores de RMSD se calcularon y se mostraron en un gráfico, donde el eje x representa el tiempo de simulación que varía de 0 a 100 ns, y el eje y muestra los valores de RMSD en nanómetros (nm). Los datos estadísticos de RMSD se presentaron en las Tablas S2 y S3 en los archivos complementarios. El gráfico de RMSD para la proteína KRAS G12D reveló que los tres ligandos, Nadolol, Carteolol y MRTX1133, mantuvieron una interacción estable con la proteína KRAS G12D a lo largo de la simulación, como lo demuestran los bajos valores de RMSD. Las curvas de Carteolol (azul) y Nadolol (naranja) están estrechamente alineadas, mostrando un patrón estable con fluctuaciones insignificantes, que oscilan entre 0,06 nm y 0,16 nm y una RMSD promedio de 0,124 nm. En contraste, el ligando de referencia (negro) exhibió valores de RMSD ligeramente más altos que oscilaron entre 0,059 nm y 0,21 nm, y una RMSD promedio de 0,156 nm, lo que indica mayores fluctuaciones en comparación con Carteolol y Nadolol, lo que sugiere que MRTX1133 conduce a una conformación menos estable de la proteína KRAS G12D (Fig. 5). Para ilustrar aún más la evolución conformacional del ligando a lo largo de la simulación, se representaron instantáneas en 0 ns, 50 ns y 100 ns para capturar la pose de unión inicial, intermedia y final (Fig. 6). La progresión visual destaca la naturaleza dinámica de las interacciones ligando-receptor dentro del sitio de unión. Inicialmente, el carteolol se estabilizó a través de su interacción con Tyr96. A medida que avanzó la simulación, esta interacción fue reemplazada por nuevos contactos con Gln61 y Glu62, lo que finalmente estabilizó el ligando en su conformación de unión final. De manera similar, el nadolol exhibió un cambio en su perfil de unión: primero se estabilizó mediante Asp69, Glu63 y Arg102, seguido de una transición a Glu62 y, finalmente, se estabilizó en una conformación respaldada por interacciones con Glu62 y Tyr64.

En la Fig. 7, el análisis de RMSD de los complejos EGFR-ligando destaca distintos patrones de estabilidad entre Erlotinib, Carteolol y Nadolol. El EGFR con Erlotinib en negro mostró un patrón estable con fluctuaciones mínimas, manteniendo una RMSD promedio de 0,34 nm. En contraste, el Carteolol en azul exhibió un estado de equilibrio inicial alrededor de 0,2 nm durante los primeros 68 ns, seguido de fluctuaciones que duraron 8 ns, después de lo cual el sistema se reestabilizó a aproximadamente 0,7 nm hasta el final de la simulación. Esto sugiere que el Carteolol experimenta cierta inestabilidad y cambios conformacionales dentro del sitio de unión de EGFR.

Como se muestra en la Fig. 8, el Carteolol, inicialmente estabilizado mediante enlaces de hidrógeno con ASP 831 y LYS 721, mantuvo una RMSD baja durante los primeros 65 ns. Después de esta fase, el ligando experimenta un cambio estructural, aumentando la RMSD. Sin embargo, el ligando establece posteriormente nuevas interacciones con MET 769 y LEU 694, lo que lleva a una reestabilización dentro del sitio de unión. Este comportamiento dinámico indica que el ligando puede adaptarse y optimizar sus interacciones de unión con el tiempo. Por otro lado, el Nadolol (naranja) se estabilizó dentro de los primeros 5 ns, pero mantuvo una RMSD más alta de 1 nm, que es significativamente mayor que la de los otros dos ligandos. Esto sugiere una mayor variabilidad conformacional y posiblemente interacciones de unión más débiles con el sitio de unión de EGFR (Fig. 7). En consonancia con esto, las instantáneas en la Fig. 8 revelan cambios posicionales notables del nadolol dentro del sitio de unión con el tiempo, lo que refleja su compromiso dinámico y menos estable con los residuos clave.

Un análisis adicional de las trayectorias de DM utilizando la herramienta Visual Molecular Dynamics (VMD) verificó que el Erlotinib y el Carteolol permanecieron dentro de la caja de simulación, lo que respalda su interacción continua con la proteína diana (Video S1). En general, el Erlotinib exhibe la estabilidad de unión más favorable, seguido por el Carteolol, que demuestra características de interacción dinámicas, mientras que la RMSD elevada del Nadolol sugiere un comportamiento de unión menos estable.

Para evaluar la estabilidad de los residuos de aminoácidos, realizamos un análisis de RMSF; una herramienta estadística que cuantifica la extensión del movimiento de los residuos a lo largo de una simulación. Este análisis ayuda a identificar las regiones de las proteínas que exhiben fluctuaciones significativas. El gráfico de RMSF para KRAS G12D y EGFR, cada uno unido a Carteolol, Nadolol y ligandos de referencia, indicó que la mayoría de los residuos mostraron solo fluctuaciones leves, con valores de RMSF que permanecieron por debajo de 0,3 nm para KRAS G12D y 0,4 nm para EGFR. Cabe destacar que las regiones que mostraron valores de RMSF más altos estaban alejadas de la cavidad de unión, lo que refleja una estructura bien conservada en KRAS G12D y EGFR cuando se unieron a los tres ligandos (Fig. 9 y 10). A pesar de su RMSD más alta, el RMSF más bajo del Nadolol sugiere que, si bien la estructura general experimenta cambios conformacionales significativos, ciertas regiones de la proteína permanecen estables. Esto indica que el nadolol puede estabilizar áreas específicas de la proteína, incluso cuando el complejo experimenta cambios estructurales más amplios a lo largo de la simulación.

El radio de gyración (Rg) se utilizó como un parámetro adicional para validar la estabilidad de los complejos proteína-ligando, como lo indican los hallazgos de RMSD y RMSF. Rg mide la distancia entre el centro de masa y el eje de rotación del complejo ligando-proteína. Representa una medida de la compacidad y estabilidad de la estructura de la proteína a lo largo de la simulación. Los valores de Rg más bajos indican una mayor estabilidad y compacidad del complejo, mientras que los valores más altos implican una menor estabilidad y compacidad. Como se muestra en la Fig. 11, el gráfico del radio de gyración para la proteína KRAS G12D ilustra que los tres ligandos: Carteolol (azul), Nadolol (naranja) y MRTX1133 (negro), exhiben valores de Rg que oscilan entre 1,53 y 1,58 nm a lo largo de la simulación, lo que indica que todos los complejos mantienen un nivel comparable de compacidad. Este hallazgo se alinea con los resultados obtenidos de los análisis de RMSD y RMSF.

El gráfico del radio de gyración (Rg) para EGFR revela que tanto el Nadolol como el Carteolol inducen una conformación más compacta en comparación con el Erlotinib, como lo reflejan sus valores de Rg más bajos (Fig. 12). Aunque el Erlotinib tiene una RMSD más baja que el Nadolol y el Carteolol, esto no contradice el análisis de Rg. La RMSD más baja indica que el Erlotinib mantiene una interacción de unión estable, pero es posible que no logre el mismo nivel de compacidad que el Nadolol y el Carteolol.

Los resultados de la predicción ADMET del servidor pkCSM proporcionan información importante sobre la farmacocinética y la toxicidad de los compuestos seleccionados (Tabla 4). Los valores de solubilidad en agua (log mol/L) oscilaron entre -2,704 y -3,622, lo que muestra diferentes niveles de solubilidad; el Nadolol y el Carteolol fueron menos solubles que el Erlotinib. Los valores de permeabilidad de la barrera hematoencefálica (log BB) indicaron que la mayoría de los compuestos tienen una capacidad limitada para atravesar la barrera, con valores entre -0,682 y -1,62, excepto el Erlotinib, que tenía un valor positivo (0,427), lo que sugiere que puede penetrar en la barrera más fácilmente. Esto puede afectar su actividad o efectos secundarios en el sistema nervioso central. En términos de distribución, el Nadolol no interactuó significativamente con las enzimas del citocromo P450 CYP2D6 y CYP3A4, mientras que el Carteolol actuó como sustrato e inhibidor de estas enzimas, lo que puede influir en su metabolismo y posibles interacciones farmacológicas. Las predicciones de metabolismo mostraron diferencias entre los compuestos con respecto a las interacciones con las enzimas del citocromo P450. El MRTX1133 no fue un sustrato para CYP2D6 o CYP3A4, pero inhibió ambas enzimas, lo que podría afectar las vías metabólicas. El Erlotinib inhibió CYP1A2, pero no fue ni sustrato ni inhibidor de las otras enzimas probadas. En cuanto a la excreción, ninguno de los compuestos fue sustrato de OCT2 renal, lo que afectó sus vías de eliminación. Las predicciones de toxicidad indicaron que el Nadolol y el Carteolol dieron negativo para la toxicidad AMES. Todos los compuestos mostraron hepatotoxicidad, excepto el Erlotinib.

En general, los hallazgos sugieren que el Carteolol demuestra un notable potencial de doble orientación, logrando puntuaciones de acoplamiento de -9,372 kcal/mol para KRAS G12D y -7,185 kcal/mol para EGFR. Aunque ambas interacciones fueron favorables, mostró una mayor afinidad de unión hacia KRAS G12D. Esto fue respaldado por los valores de energía libre de unión MM-GBSA, con Carteolol exhibiendo -57,95 kcal/mol para KRAS G12D en comparación con -49,26 kcal/mol para EGFR, lo que refuerza su unión preferencial a KRAS. Las simulaciones de dinámica molecular corroboraron estos hallazgos al revelar interacciones estables y compactas con ambas proteínas a lo largo del período de simulación, especialmente en el complejo KRAS G12D, lo que sugiere una robusta estabilidad conformacional. La predicción ADMET mostró propiedades aceptables. Las puntuaciones de similitud media de Tanimoto utilizando el conjunto de herramientas Canvas de Schrodinger indican una similitud estructural muy baja entre el Nadolol y el Carteolol en comparación con los compuestos de referencia MRTX1133 y Erlotinib. Específicamente, el Nadolol mostró una puntuación de similitud de 0,022, mientras que el Carteolol tuvo una puntuación ligeramente más alta de 0,036. Estos valores sugieren que tanto el Nadolol como el Carteolol comparten características químicas mínimas con MRTX1133 y Erlotinib.

En conjunto, estos resultados destacan el potencial de Carteolol como un prometedor agente de molécula pequeña con afinidad preferencial por KRAS G12D y modulación complementaria de EGFR, en línea con el objetivo del estudio de abordar los mecanismos de resistencia en el cáncer colorrectal mediante una estrategia de doble direccionamiento. Carteolol es un antagonista beta-adrenérgico no selectivo de acción prolongada que se utiliza principalmente para el tratamiento de la hipertensión. También es una terapia eficaz para las arritmias, la angina de pecho y el glaucoma. Más allá de sus aplicaciones cardiovasculares, los betabloqueantes están ganando reconocimiento en oncología, y tanto los estudios preclínicos como los clínicos indican posibles beneficios terapéuticos fuera de su uso convencional, lo que demuestra nuevos mecanismos de acción no relacionados con el bloqueo del receptor ?-adrenérgico. Esto apoya la exploración de nuevos mecanismos que van más allá de sus funciones tradicionales. Además, se sugiere que los betabloqueantes funcionan como inmunomoduladores. Los estudios han demostrado que la estimulación adrenérgica puede potenciar las características del cáncer, como la modulación de la apoptosis y el aumento de la angiogénesis, efectos que los betabloqueantes pueden contrarrestar. Sin embargo, los perfiles de seguridad de los betabloqueantes reutilizados dependen de las condiciones específicas y las características del paciente, lo que destaca la necesidad de realizar más investigaciones para optimizar su aplicación en contextos no cardiovasculares. A pesar de estos desafíos, su potencial para tratar enfermedades crónicas como el cáncer posiciona a los betabloqueantes como candidatos prometedores para la innovación terapéutica en una gama más amplia de campos médicos [^[11],^[32],^[33]].

4. Conclusiones

Este estudio ha empleado herramientas de Insilico para identificar posibles agentes de doble direccionamiento para KRAS G12D y EGFR en el cáncer colorrectal. Mediante el cribado de una biblioteca de 3.591 fármacos aprobados mediante el acoplamiento molecular, el cálculo de la energía libre de enlace y las simulaciones de dinámica molecular posteriores, Carteolol surgió como un candidato prometedor, demostrando una fuerte afinidad y estabilidad de unión con ambos objetivos. Si bien estas herramientas computacionales son limitadas en su capacidad para validar completamente la eficacia biológica, ofrecen un valioso punto de partida para la generación de hipótesis y la identificación de compuestos de interés. La validación experimental mediante ensayos in vitro e in vivo es esencial para confirmar estos hallazgos y avanzar en el potencial terapéutico de Carteolol en el cáncer colorrectal.