Grifolín, neogrifolín y confluéntin del polípodo terrícola Albatrellus flettii suprimen la expresión de KRAS en células cancerosas colón humanas

En nuestra búsqueda de hongos bioactivos nativos de la Columbia Británica, determinamos que los extractos etanólicos de los cuerpos fructíferos del políporo terrestre Albatrellus flettii presentaban una potente actividad anti-viabilidad celular. Mediante la utilización de una técnica de fraccionamiento guiada por bioensayos, espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear, aislamos con éxito tres compuestos conocidos (grifolina, neogrifolina y confluentina). Estos compuestos representan los principales componentes con actividad anti-viabilidad celular presentes en los extractos etanólicos de A. flettii. También identificamos una nueva actividad biológica para estos compuestos, específicamente en la regulación a la baja de la expresión de KRAS en dos líneas celulares de cáncer de colon humano. Se conoce relativamente poco sobre la actividad anti-viabilidad celular y el mecanismo de acción de la confluentina. Por primera vez, demostramos la capacidad de la confluentina para inducir la apoptosis y detener el ciclo celular en la fase G2/M en las células de cáncer de colon humano SW480. Se ha demostrado previamente que la proteína de unión al mRNA del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IMP1), un oncogén, regula la expresión del mRNA de KRAS en las células de cáncer de colon, posiblemente a través de su capacidad para unirse al transcrito de KRAS. Utilizando un ensayo de polarización de fluorescencia, demostramos que la confluentina inhibe de forma dependiente de la dosis la interacción física entre el RNA de KRAS y la IMP1 de cadena completa. La inhibición también se produce con la IMP1 truncada que contiene el dominio KH1 a KH4 (IMP1 KH1 a KH4), pero no con el di-dominio KH3 y KH4 (IMP1 KH3 y KH4). Además, a diferencia del antibiótico de control, la neomicina, la grifolina, la neogrifolina y la confluentina no se unen al RNA de KRAS. Estos resultados sugieren que la confluentina inhibe la interacción entre la IMP1 y el RNA de KRAS al unirse a los di-dominios KH1 y KH2 de la IMP1. Dado que la interacción molecular entre la IMP1 y sus RNAs diana es un requisito previo para la función oncogénica de la IMP1, la confluentina debería ser estudiada más a fondo como un posible inhibidor de la IMP1 in vivo.

Citación: Yaqoob A, Li WM, Liu V, Wang C, Mackedenski S, Tackaberry LE, et al. (2020) Grifolin, neogrifolin and confluentin from the terricolous polypore Albatrellus flettii suppress KRAS expression in human colon cancer cells. PLoS ONE 15(5): e0231948.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231948

Editor: A R M Ruhul Amin, Marshall University, ESTADOS UNIDOS

Recibido: 19 de agosto de 2019; Aceptado: 3 de abril de 2020; Publicado: 5 de mayo de 2020

Derechos de autor: © 2020 Yaqoob et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación del Consejo de Ciencias e Ingeniería Naturales número 227158 (CHL), la beca de la Fundación para la Innovación de Canadá número 34711 (CHL) y el Premio de Investigación de la UNBC (AY).

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

Se han realizado relativamente pocos estudios que exploren el potencial medicinal de los compuestos de los hongos silvestres nativos de la Columbia Británica (BC), Canadá. Por lo tanto, hemos comenzado a estudiar las propiedades medicinales de hongos nativos seleccionados, centrándonos en tres bioensayos relevantes para el cáncer: actividad anti-viabilidad celular, actividad inmunostimulante y actividad antiinflamatoria ^[1,2]. Al analizar más de cien especies de hongos que se encuentran en el centro-norte de la Columbia Británica, hemos documentado que aproximadamente el 25% posee una potente actividad anti-viabilidad celular. Entre los hongos que exhibieron alguna de las actividades anti-viabilidad celular más potentes se encuentra Albatrellus flettii y, específicamente, sus extractos etanólicos.

Albatrellus flettii (familia Albatrellaceae) es un atractivo políporo terrestre, a menudo con un color azul-grisáceo distintivo en el píleo; se encuentra comúnmente en el oeste de América del Norte, desde Alaska hasta California y México, incluyendo toda la Columbia Británica, Alberta, Washington, Oregón, Idaho y Wyoming ^[3]. Aunque existen varios estudios sobre la fitoquímica del género Albatrellus [4–9], solo dos informaron sobre A. flettii ^[10,11]. El primero se centró principalmente en el aislamiento de pigmentos meroterpenoides responsables del color azul de A. flettii ^[10]. En el segundo estudio, se aislaron tres compuestos (grifolina, neogrifolina y confluentina) de A. flettii (recogido en Oregón), y se documentó que tenían actividades antibacterianas contra Bacillus cereus y Enterococcus faecalis ^[11]. No se proporcionaron datos espectroscópicos y no hubo evidencia de la pureza de los compuestos. Hasta la fecha, no se ha estudiado sistemáticamente A. flettii para su actividad anti-viabilidad celular contra células cancerosas humanas ni se han aislado compuestos con dicha actividad.

KRAS es un oncogén frecuentemente mutado en las células cancerosas humanas, con la mayor prevalencia en los adenocarcinomas pancreáticos (90%), los cánceres colorrectales (45%) y los cánceres de pulmón (35%) ^[12]. El gen KRAS codifica una pequeña proteína de membrana que está activa cuando se une a GTP y, en consecuencia, activa varias vías bioquímicas posteriores que conducen al crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. KRAS mutado permanece bloqueado en el estado "activo" unido a GTP y activa continuamente los efectores bioquímicos posteriores que pueden conducir a la tumorigénesis ^[13,14]. Los desarrollos recientes en la búsqueda de inhibidores de RAS incluyen: (i) una lactona diterpenoide bicíclica que bloquea el intercambio de GDP-GTP e inhibe tanto la señalización de KRAS de tipo salvaje como la oncogénica al unirse a las regiones de cambio de RAS ^[15], y (ii) inhibidores que se dirigen irreversiblemente a un tipo de mutante de KRAS mediante la formación de un enlace covalente ^[16,17]. Estudios recientes que utilizan modelos de ratón preclínicos han demostrado la regresión de los tumores impulsados por KRAS utilizando siRNA [18–20] y oligonucleótidos antisentido ^[21] altamente potentes y específicos que se dirigen a la expresión de KRAS. Esto sugiere que la inhibición de la expresión de KRAS es un enfoque eficaz en la terapia anti-KRAS.

En el curso de nuestra búsqueda de metabolitos anti-viabilidad celular, aislamos tres compuestos principales conocidos (grifolina, neogrifolina y confluentina) de los extractos etanólicos de los cuerpos fructíferos de A. flettii utilizando un enfoque de fraccionamiento guiado por bioensayos. Aquí, por primera vez, informamos que la grifolina, la neogrifolina y la confluentina suprimen la expresión de KRAS en las células de cáncer de colon humano. La confluentina también inhibió la asociación física entre el RNA de KRAS y la proteína de unión al mRNA del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IMP1). Esto sugiere su potencial adicional para inhibir estas biomoléculas oncogénicas en líneas celulares y modelos animales.

Los espectros de RMN 1D y 2D se registraron en un espectrómetro de RMN Bruker de 300 MHz con un tubo de RMN Kimble de 5 mm (Rockwood, TN, EE. UU.). Todos los análisis de HPLC se realizaron en sistemas Agilent 1260 Infinity con detector UV, y la espectrometría de masas se realizó utilizando Agilent 6120 Single Quad MS. Para fines analíticos, se utilizó una columna de fase inversa Phenomenex Aqua® C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm). Solvente A: agua, solvente B: acetonitrilo, sistema de gradiente: 90% B aumentando en un 10% cada 5 minutos durante 15 minutos, manteniéndose al 90% B durante 20 minutos, velocidad de flujo = 1,0 mL min-1, detección UV a 279 nm. Para la purificación semipreparativa, se utilizó una columna Agilent Zorbax Eclipse XBD-C18 (9,4 x 250 mm, 5 μm). El solvente A fue agua y el solvente B fue acetonitrilo. Se utilizaron las siguientes condiciones: sistema de gradiente, 90% B durante 20 minutos; velocidad de flujo = 2,0 mL min-1; detección UV a 279 nm. Los solventes de grado HPLC se compraron a BDH (Mississauga, ON, Canadá). El medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se obtuvieron de Lonza (Walkersville, MO, EE. UU.). El suero fetal bovino (SFB) se obtuvo de Life Technologies Inc. (Grand Island, NY, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales de ratón KRAS (1:500 dilución) fueron de EMD Millipore (MABS194 clon 234-4.2; Etobicoke, ON, Canadá) y Abnova (H00003845-M01 clon 3B10-2F2; Taoyuan City, Taiwán), y el anticuerpo monoclonal de ratón GAPDH (G8795; clon GAPDH-71.1) (1:10,000 dilución) fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El anticuerpo Caspasa-3 escindida (Asp175; #9661) (1:1000 dilución) fue de Cell Signaling Technology Inc. (MA, EE. UU.).

Los cuerpos fructíferos de A. flettii se recolectaron cerca de Twin Falls Recreation Site, Smithers, BC, Canadá, el 3 de septiembre de 2016 (CL128) y el 20 de septiembre de 2017 (CL151). Los especímenes de referencia de estas colecciones se depositaron en la Universidad de Columbia Británica del Norte, Canadá. La identidad de A. flettii se confirmó utilizando protocolos genéticos previamente descritos ^[1,2,22]. La secuencia de ADN de las colecciones CL128 y CL151 era idéntica y tenía la mayor similitud de secuencia con una colección de A. flettii GenBank JF899544.1 (99,82% de identidad/100% de cobertura).

Los especímenes de Albatrellus flettii se extrajeron secuencialmente con 80% de etanol, 50% de metanol, agua y 5% de NaOH como se describió previamente ^[1,2]. Los solventes se eliminaron por completo mediante rotovaporación y se obtuvieron extractos en polvo mediante liofilización. El extracto de 5% de NaOH (E4) se neutralizó con pH y se dializó en agua antes de someterlo a liofilización. Los extractos de 80% de etanol (E1) y 50% de metanol (E2) se resuspendieron en metanol, mientras que los extractos de agua (E3) y 5% de NaOH (E4) se resuspendieron en agua.

Para el aislamiento de compuestos, los cuerpos fructíferos de A. flettii secos al horno y en polvo (70 g) se extrajeron con 80% de etanol a temperatura ambiente y se filtraron. El filtrado se evaporó y se liofilizó para obtener un extracto crudo de EtOH (7,1 g) que se resuspendió en CHCl3 y luego se particionó con agua (1:1). La capa inferior que contenía CHCl3 (3,2 g de material sólido recuperado) tenía actividad anti-viabilidad celular; se sometió a cinco ciclos (640 mg/ciclo a 80 mg/mL) de cromatografía en columna de Sephadex LH-20 (1000 x 26 mm i.d., en metanol) para obtener 50 fracciones (10 mL por fracción). Las fracciones 30-36, que exhibían actividad anti-viabilidad celular, se sometieron primero a una columna de HPLC de fase inversa Phenomenex Aqua® C18 para análisis. Basado en la superposición de los espectros de UV, los compuestos que eluyen a 9,7 min, 13,5 min y 23,5 min fueron los más abundantes (Figura S1) y exhibieron actividad anti-viabilidad celular. Las fracciones restantes 30-36 de la columna de Sephadex LH-20 se sometieron a una purificación por HPLC semipreparativa utilizando una columna Agilent Zorbax Eclipse XBD-C18. El compuesto obtenido a tiempo de retención tR = 9,5 min se confirmó posteriormente por MS (Figura S2) y RMN (Figuras S3-S6) como grifolina. El compuesto obtenido a tiempo de retención tR = 13,5 min se confirmó posteriormente por MS (Figura S7) y RMN (Figuras S8-S11) como neogrifolina. El compuesto obtenido a tiempo de retención tR = 23,5 min se confirmó posteriormente por MS (Figura S12) y RMN (Figuras S13-S18) como confluentina. La grifolina, la neogrifolina y la confluentina se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una solución de stock de 50 mM para los ensayos biológicos.

Se utilizaron las siguientes líneas celulares compradas al American Type Culture Collection: HeLa (carcinoma epitelioide del cuello uterino; CCL-2) y SW480 (adenocarcinoma de colon; CCL-228). La línea celular HT29 (adenocarcinoma de colon) se obtuvo del Dr. Ranjana Bird (UNBC, 2014). Se utilizó el ensayo citotóxico MTT como se describió previamente ^[1,2,22]. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 1,5 x 104 células/pozo en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron con varias concentraciones (1, 0,75, 0,5, 0,25 y 0,1 mg/mL) de extractos crudos E1, E2, E3 y E4 durante 48 horas. Se utilizó agua como control para E3 y E4, mientras que se utilizó metanol (5%) como control para E1 y E2. Los datos de absorbancia se expresaron en relación con los controles respectivos, agua o 5% de metanol, tomados como 100% de viabilidad celular. Para los estudios con compuestos, las células se trataron con varias concentraciones (80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 μM) de grifolina, neogrifolina y confluentina o con 0,1% de DMSO durante 48 horas. Todos los datos de absorbancia se expresaron en relación con el control, 0,1% de DMSO, tomado como 100% de viabilidad celular. Previamente, utilizamos 25 μM de cisplatino, un conocido inductor de la apoptosis, como control positivo y demostramos que se logró un 95% de anti-viabilidad celular.

Los espectros de RMN 1D y 2D se registraron en un espectrómetro de RMN Bruker de 300 MHz con un tubo de RMN Kimble de 5 mm (Rockwood, TN, EE. UU.). Todos los análisis de HPLC se realizaron en sistemas Agilent 1260 Infinity con detector UV, y la espectrometría de masas se realizó utilizando Agilent 6120 Single Quad MS. Para fines analíticos, se utilizó una columna de fase inversa Phenomenex Aqua® C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm). Solvente A: agua, solvente B: acetonitrilo, sistema de gradiente: 90% B aumentando en un 10% cada 5 minutos durante 15 minutos, manteniéndose al 90% B durante 20 minutos, velocidad de flujo = 1,0 mL min-1, detección UV a 279 nm. Para la purificación semipreparativa, se utilizó una columna Agilent Zorbax Eclipse XBD-C18 (9,4 x 250 mm, 5 μm). El solvente A fue agua y el solvente B fue acetonitrilo. Se utilizaron las siguientes condiciones: sistema de gradiente, 90% B durante 20 minutos; velocidad de flujo = 2,0 mL min-1; detección UV a 279 nm. Los solventes de grado HPLC se compraron a BDH (Mississauga, ON, Canadá). El medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se obtuvieron de Lonza (Walkersville, MO, EE. UU.). El suero fetal bovino (SFB) se obtuvo de Life Technologies Inc. (Grand Island, NY, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales de ratón KRAS (1:500 dilución) fueron de EMD Millipore (MABS194 clon 234-4.2; Etobicoke, ON, Canadá) y Abnova (H00003845-M01 clon 3B10-2F2; Taoyuan City, Taiwán), y el anticuerpo monoclonal de ratón GAPDH (G8795; clon GAPDH-71.1) (1:10,000 dilución) fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El anticuerpo Caspasa-3 escindida (Asp175; #9661) (1:1000 dilución) fue de Cell Signaling Technology Inc. (MA, EE. UU.).

Los cuerpos fructíferos de A. flettii se recolectaron cerca de Twin Falls Recreation Site, Smithers, BC, Canadá, el 3 de septiembre de 2016 (CL128) y el 20 de septiembre de 2017 (CL151). Los especímenes de referencia de estas colecciones se depositaron en la Universidad de Columbia Británica del Norte, Canadá. La identidad de A. flettii se confirmó utilizando protocolos genéticos previamente descritos ^[1,2,22]. La secuencia de ADN de las colecciones CL128 y CL151 era idéntica y tenía la mayor similitud de secuencia con una colección de A. flettii GenBank JF899544.1 (99,82% de identidad/100% de cobertura).

Los especímenes de Albatrellus flettii se extrajeron secuencialmente con 80% de etanol, 50% de metanol, agua y 5% de NaOH como se describió previamente ^[1,2]. Los solventes se eliminaron por completo mediante rotovaporación y se obtuvieron extractos en polvo mediante liofilización. El extracto de 5% de NaOH (E4) se neutralizó con pH y se dializó en agua antes de someterlo a liofilización. Los extractos de 80% de etanol (E1) y 50% de metanol (E2) se resuspendieron en metanol, mientras que los extractos de agua (E3) y 5% de NaOH (E4) se resuspendieron en agua.

Para el aislamiento de compuestos, los cuerpos fructíferos de A. flettii secos al horno y en polvo (70 g) se extrajeron con 80% de etanol a temperatura ambiente y se filtraron. El filtrado se evaporó y se liofilizó para obtener un extracto crudo de EtOH (7,1 g) que se resuspendió en CHCl3 y luego se particionó con agua (1:1). La capa inferior que contenía CHCl3 (3,2 g de material sólido recuperado) tenía actividad anti-viabilidad celular; se sometió a cinco ciclos (640 mg/ciclo a 80 mg/mL) de cromatografía en columna de Sephadex LH-20 (1000 x 26 mm i.d., en metanol) para obtener 50 fracciones (10 mL por fracción). Las fracciones 30-36, que exhibían actividad anti-viabilidad celular, se sometieron primero a una columna de HPLC de fase inversa Phenomenex Aqua® C18 para análisis. Basado en la superposición de los espectros de UV, los compuestos que eluyen a 9,7 min, 13,5 min y 23,5 min fueron los más abundantes (Figura S1) y exhibieron actividad anti-viabilidad celular

Se sembraron células en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10⁵ células/pocillo y se trataron con grifolina, neogrifolina y confluentina o con 2% de DMSO durante 24 y 48 horas. Se prepararon lisados celulares según lo descrito previamente ^[23]. Las muestras de proteínas se resolvieron en un SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se utilizó una escala de proteínas pre-teñida BLUelf (FroggaBio). Se utilizó IgG-HRP anti-ratón (1:4000, Promega) como anticuerpo secundario. Todas las inmunodetecciones se visualizaron utilizando un sistema de detección quimioluminiscente con el FluorChem Q Imager (ProteinSimple, CA, EE. UU.) y se analizaron utilizando el software AlphaView Q (ProteinSimple).

En este trabajo, se describe por primera vez un método de polarización de fluorescencia para estudiar la interacción física entre IMP1 y el ARN de KRAS. El método utiliza una proteína IMP-1 recombinante y ARN de KRAS de 44 nucleótidos etiquetado con fluorescencia. La preparación de la proteína IMP1 recombinante de tipo salvaje de longitud completa y la proteína IMP1 truncada KH34 (que contiene solo los dominios KH3 y KH4) se ha descrito previamente ^[23]. Se mezclaron los siguientes componentes en una microplaca Thermo Scientific de 384 pocillos: 8 µL de proteína, 3 µL de la sonda KRAS de 44 nucleótidos etiquetada con fluoresceína de Thermo Scientific (5’AUGGAGAAACCUGUCUCUUGGAUAUUCUCGACACAGCAGGUCAU-6-FL-3’) y 4 µL de tampón de unión (50 mM Tris-Cl pH 7,4, 12,5 mM EDTA pH 8, 25% de glicerol, 0,01% de Triton-X y H₂O). La sonda CD44 de 39 nucleótidos etiquetada con fluoresceína fue 5’AAAUUAGGGCCCAAUUAAUAAUCAGCAAGAAUUUGAUCG-6-FL-3’. La concentración final de IMP1 y la sonda KRAS fue de 300 nM y 10 nM, respectivamente. A cada pocillo, se añadieron 4 µL de grifolina, neogrifolina, confluentina o 5% de DMSO para una concentración final de 5, 10, 20, 40, 80 o 100 µM. Las placas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos antes de la lectura a 485/20 nm de excitación y 528/20 nm de emisión utilizando el lector de placas Bio-Tek Synergy 2.

Se sembraron células en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10⁵ células/pocillo y se trataron con grifolina, confluentina o 2% de DMSO durante 24 horas. Se incluyeron células no tratadas como control. Las células se trataron con tripsina, seguido de centrifugación y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Las células viables se tiñeron con PE Annexin V y 7-AAD según las instrucciones del fabricante para el kit de detección de apoptosis I (BD Pharmingen) y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un citómetro celular BD FACSMelody (BD Biosciences) y el software BD FACSChorus (V 1.0). Para los análisis del ciclo celular, se utilizó el kit de reactivo BD cycletest plus DNA.

El ADNc de KRAS humano (número de acceso # NM_033360) comprado a OriGene Technologies Inc. se utilizó como plantilla para la generación de fragmentos de ADN amplificados por PCR. El conjunto de cebadores utilizado para amplificar los nucleótidos 1-185 del ADNc de KRAS fueron: sentido, 5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGACTGAATATAAACTT-3’ y antisentido, 5’-TCATGACCTGCTGTGTCG-3’. Los conjuntos de cebadores para amplificar los ADNc de KRAS truncados en el extremo 5’ y 3’ correspondientes a los nucleótidos 1-185 se han descrito previamente ^[24]. Se utilizó directamente 1 µg de las plantillas de ADN amplificado por PCR para la transcripción in vitro mediante la ARN polimerasa T7, según lo descrito previamente [23–25]. El ARN purificado y radiomarcado se extrajo con fenol/cloroformo seguido de precipitación con etanol. La actividad específica del ARN se determinó mediante conteo de centelleo. El ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) se llevó a cabo esencialmente de la misma manera que se describió previamente [23–26]. Se utilizaron ARN radiomarcados (20.000 cpm) y las concentraciones de IMP1 variaron de 0 a 540 nM. Los ARN libres y unidos se resolvieron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 8% y se visualizaron utilizando el sistema de imagen de fósforo Cyclone Storage (Packard Instrument). Las imágenes se analizaron y se cuantificaron utilizando el software Optiquant versión 4.0.

Los ensayos citotóxicos MTT se realizaron por triplicado (3 pocillos/tratamiento) y la lectura de absorbancia del control respectivo se tomó como 100% de viabilidad celular. Se realizaron dos experimentos adicionales y se obtuvieron los valores medios de IC50 de tres experimentos independientes (n = 3). Para el análisis de Western blot, la intensidad de las bandas de KRAS y Caspasa-3 clivada se normalizó a sus respectivas bandas de GAPDH y luego se expresó en relación con el control de DMSO (tomado como 1,0). Después de realizarse réplicas biológicas adicionales, se realizó un ANOVA de una vía o una prueba t de Student para comparar las muestras tratadas con el fármaco con las muestras tratadas con DMSO (n = 3 o 5). De manera similar, para los experimentos de polarización de fluorescencia y citometría de flujo, se realizaron tres experimentos independientes (n = 3). Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.2 (La Jolla, CA). Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Las muestras de Albatrellus flettii se extrajeron secuencialmente con 80% de etanol, 50% de metanol, agua y 5% de NaOH. Los extractos de agua (E3) y 5% de NaOH (E4) mostraron una débil actividad anti-viabilidad celular, mientras que los extractos de 80% de etanol (E1) y 50% de metanol (E2) mostraron una potente actividad anti-viabilidad celular contra las células de cáncer de cuello uterino HeLa (Fig. 1). A 0,4 mg/mL y superiores, tanto E1 como E2 mostraron un aumento en la viabilidad celular, y esto se debe al hecho de que contienen constituyentes que reaccionan con el medio o con el MTT para producir soluciones coloreadas, lo que produce falsos resultados positivos. Se han observado efectos similares para varios extractos de hongos ^[2]. En consecuencia, nos centramos en el estudio del aislamiento de compuestos anti-viabilidad celular a partir del extracto de 80% de etanol. La extracción con cloroformo:H₂O (1:1), la cromatografía en columna de Sephadex LH-20, la HPLC-MS (Fig. S2, S7 y S12) y los análisis de RMN (Fig. S3–S6, S8–S11 y S13–S18) de los extractos de etanol condujeron al aislamiento e identificación de grifolina, neogrifolina y confluentina (Fig. 2) como los tres principales compuestos anti-viabilidad celular. Basado en los espectros de UV de HPLC (Fig. S1), se estimó que la abundancia de grifolina, neogrifolina y confluentina fue del 32,6%, 52,0% y 8,1%, respectivamente. Un estudio previo citó la actividad antibacteriana de la grifolina, la neogrifolina y la confluentina aisladas de A. flettii, sin embargo, no se informaron los valores de abundancia ^[11].

Las células se trataron durante 48 horas con varias concentraciones de E1 (80% de etanol), E2 (50% de metanol), E3 (agua) y E4 (5% de NaOH) de A. flettii. Las concentraciones de los extractos utilizados fueron: 1, 0,75, 0,5, 0,25 y 0,1 mg/mL. La anti-viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT. Los resultados mostrados representan dos réplicas biológicas. Las barras de error son la desviación estándar (DE).

Evaluamos la grifolina, la neogrifolina y la confluentina para la actividad anti-viabilidad celular contra las células HeLa y dos líneas celulares de cáncer de colon humano, SW480 y HT29. La grifolina tiene valores de IC50 de 27,4 ± 2,2 µM (n = 3), 35,4 ± 2,4 µM (n = 4) y 30,7 ± 1,0 µM (n = 3) contra las células HeLa, SW480 y HT29, respectivamente (Fig. 3). Esto es consistente con un informe previo de valores de IC50 de 34 µM y 27 µM para la grifolina de Albratrellus confluens en las células HeLa y SW480 ^[27]. La neogrifolina tiene valores de IC50 de 24,3 ± 2,5 µM (n = 3), 34,6 ± 5,9 µM (n = 4) y 30,1 ± 4,0 µM (n = 4) contra las células HeLa, SW480 y HT29, respectivamente (Fig. 3). Aunque no hay informes de actividad anti-viabilidad celular de la neogrifolina en las células HeLa, SW480 y HT29, se ha demostrado que tiene valores de IC50 de 25-50 µM contra las células de osteosarcoma humano ^[28]. La confluentina tiene valores de IC50 de 25,9 ± 2,9 µM (n = 3), 33,5 ± 4,0 µM (n = 3) y 25,8 ± 4,1 µM (n = 3) contra las células HeLa, SW480 y HT29, respectivamente (Fig. 3). Antes del presente estudio, la confluentina no se había evaluado en células de cáncer de colon humano. Se informó que la confluentina de A. ovinus tiene valores de IC50 en el rango de 15-23 µM en las siguientes líneas celulares de cáncer humano: HL-60, SMMC 7712, A-549 y MCF-7 ^[5]. En resumen, la grifolina, la neogrifolina y la confluentina aisladas de A. flettii tienen actividad anti-viabilidad celular contra las células de cáncer de cuello uterino humano HeLa y dos líneas celulares de cáncer de colon humano, SW480 y HT29. Los valores de IC50 informados aquí son similares a los informados por otros para estos compuestos derivados de especies de hongos del mismo género, probados contra las mismas o diferentes líneas celulares de cáncer. No hemos evaluado la grifolina, la neogrifolina y la confluentina en células normales inmortalizadas en cultivo. Es muy probable que estos compuestos también sean citotóxicos para las células normales inmortalizadas.

Las células de cáncer de cuello uterino humano HeLa y las células de cáncer de colon humano (SW480 y HT29) se trataron con varias concentraciones de grifolina, neogrifolina y confluentina durante 48 horas. Las concentraciones de los compuestos utilizados fueron: 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 µM. La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo citotóxico MTT. Cada dosis se probó por triplicado en cada experimento y los datos mostrados son una representación de al menos tres experimentos independientes (n = 3).

La grifolina, aislada principalmente de A. confluens, se ha estudiado ampliamente para su mecanismo de anti-viabilidad celular [27, 29-34]. De manera similar, se ha demostrado que la neogrifolina, también aislada de A. confluens, induce la liberación de citocromo c y activa las caspasas 3 y 9, lo que conduce a la apoptosis ^[28]. En contraste, no existe ningún estudio sobre el mecanismo de anti-viabilidad celular de la confluentina. Aquí, utilizamos la citometría de flujo y los análisis de Western blot para evaluar el efecto de la confluentina sobre la apoptosis celular. Después de 24 horas de tratamiento con 50 µM de confluentina, el 30% de las células SW480 sufrieron apoptosis en comparación con el 8,4% de las células tratadas con 2% de DMSO (Fig. 4A) y este efecto se confirmó con experimentos adicionales (Fig. 4B). También encontramos que 50 µM de confluentina aumentaron la expresión de Caspasa-3 clivada 2,5 veces en comparación con las células tratadas con DMSO (Fig. 4C y 4D), lo que confirma aún más la capacidad de la confluentina para inducir la apoptosis.

(A) Las células SW480 se trataron con 2% de DMSO o 50 µM de confluentina durante 24 horas, después de lo cual las células se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la necrosis (Q1), la apoptosis tardía (Q2), la apoptosis temprana (Q3) y las células viables (Q4). Los datos mostrados representan tres experimentos independientes (n = 3). (B) Los porcentajes de células en apoptosis tardía (Q2) tratadas con 2% de DMSO o 50 µM de confluentina de tres experimentos independientes se combinaron y se mostró que eran estadísticamente significativos (p < 0,05). (C) Como en (A), las células SW480 tratadas con 2% de DMSO o 50 µM de confluentina durante 24 horas, seguidas de la extracción de lisados celulares. Se realizaron análisis de Western blot y los datos mostrados son representativos de cinco experimentos independientes (n = 5). (D) El nivel de Caspasa-3 clivada en las células tratadas con confluentina se normalizó con respecto al de GAPDH y se expresó en relación con las células tratadas con DMSO (tomado como 1,0). El gráfico mostrado es de cinco experimentos independientes. Para el análisis estadístico, se realizó una prueba t de Student (p < 0,05). Las barras de error son DE.

Utilizando la citometría de flujo, también evaluamos el efecto de la confluentina sobre el ciclo celular en las células SW480. Determinamos que aproximadamente el 10% de las células se detuvieron en la fase G2/M después de 24 horas de tratamiento con 50 µM de confluentina en comparación con el 4,6% de las células tratadas con el control de 2% de DMSO (Fig. 5A). Dos réplicas biológicas adicionales confirmaron que la confluentina detiene significativamente las células SW480 en la fase G2/M. Nuestro estudio también mostró que la confluentina no tuvo ningún efecto sobre las células en las fases G1 y S (Fig. 5B).

(A) Las células SW480 tratadas con 2% de DMSO o 50 µM de confluentina se analizaron mediante citometría de flujo para la distribución del ciclo celular. (B) Los porcentajes relativos de células en diferentes fases del ciclo celular se combinaron a partir de tres experimentos independientes (n = 3) y se trazaron como se muestra. Se realizó un ANOVA de dos vías y el asterisco indica diferencias significativas (p < 0,001). Las barras de error son DE.

En resumen, informamos aquí por primera vez que la confluentina induce la apoptosis y detiene el ciclo celular en la fase G2/M, ambos mecanismos que podrían contribuir a la actividad anti-viabilidad celular en las células SW480 (Fig. 3).

KRAS es un oncogén difícil de alcanzar y se sigue dedicando mucho esfuerzo a dirigirse a él inhibiendo directamente su función, biogénesis y expresión [14, 35]. Además, se ha relacionado la actividad constitutiva de KRAS con un aumento de la proliferación celular [36–38]. Por lo tanto, investigamos si la grifolina, la neogrifolina y la confluentina tienen algún efecto sobre la expresión de KRAS en células de cáncer de colon humano. Tras un tratamiento de 48 horas a 50 μM, los tres compuestos mostraron una inhibición significativa de la expresión de KRAS en las células SW480, que portan la mutación G12V de KRAS (Fig. 6). Después de 24 horas de tratamiento, solo la grifolina y la confluentina tuvieron un efecto significativo. Aunque no fue estadísticamente significativo, la neogrifolina también mostró un patrón inhibitorio a las 24 horas (Fig. 6). Además, evaluamos los tres compuestos en la expresión de KRAS en la línea celular de cáncer de colon humano HT29, que porta el KRAS de tipo salvaje. A 20 y 50 μM, encontramos una inhibición similar de la expresión de KRAS por la grifolina, la neogrifolina y la confluentina (Fig. S19). También determinamos si la confluentina, el compuesto más eficaz de los tres, tiene algún efecto sobre el nivel de ARNm de KRAS en las células SW480. Nuestros resultados mostraron que la confluentina no tuvo un efecto significativo sobre los niveles de ARNm de KRAS a las 24 y 48 horas después del tratamiento (Fig. 6C). En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la grifolina, la neogrifolina y la confluentina disminuyen la expresión de KRAS a nivel de la traducción en lugar de a nivel de la degradación del ARNm.

Las células SW480 se trataron con 2% de DMSO o 50 μM de grifolina, neogrifolina y confluentina durante 24 y 48 horas. (A) Se muestra un inmunoblot representativo. (B) La intensidad de la banda de KRAS se normalizó a la intensidad respectiva de GAPDH y se expresó en relación con el control de DMSO (considerado como 1,0). Los datos mostrados son la media ± DE obtenidos de tres experimentos independientes (n = 3). * = p < 0,01 frente a DMSO. (C) El ARN total aislado de las células tratadas se sometió a PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de ARNm de KRAS de las células tratadas con confluentina se normalizó al de ARNm de GAPDH y se expresó en relación con el de las células tratadas con DMSO. Los datos mostrados se obtuvieron de tres réplicas biológicas (n = 3). Se realizó una prueba t de Student y las barras de error son la DE.

En resumen, estos resultados son los primeros en demostrar la capacidad de la grifolina, la neogrifolina y la confluentina para suprimir la expresión de KRAS en células de cáncer de colon humano, independientemente de que las células porten una mutación de KRAS o el KRAS de tipo salvaje. Claramente, se requieren más experimentos para dilucidar el mecanismo exacto por el cual estos compuestos suprimen la expresión de KRAS.

Uno de los criterios principales para el uso exitoso de la polarización de fluorescencia (PF) para estudiar la interacción ARN-proteína es el requisito de un sustrato fluorescente de pequeño peso molecular, que en este caso es un ARN ^[39]. Utilizando un ensayo de desplazamiento en gel, mapeamos varios sustratos de ARN para determinar la región más pequeña que aún es capaz de unirse a IMP1 [25, 26], incluyendo CD44 ^[40] y el ARN de KRAS ^[24]. Previamente demostramos que un ARN de CD44 de 35 nt que abarca los nucleótidos 2862-2896 es la región mínima capaz de unirse a IMP1 ^[40]. Basándonos en un informe que indica que IMP1 tiene una alta afinidad por la región codificante y la región 3'UTR del ARNm de KRAS ^[38], procedimos a mapear la región o regiones más pequeñas del ARNm de KRAS que pueden unirse a IMP1. Nuestros resultados muestran que los nucleótidos 1-185 tienen una de las afinidades más altas por IMP1, con una Kd de 171 ± 18 nM ^[24]. En este estudio, los nucleótidos 1-185 del ARNm de KRAS se mapearon aún más mediante la truncación desde los extremos 5' y 3', y los resultados se muestran en la Fig. S20. El análisis de desplazamiento en gel de siete fragmentos truncados muestra que los nucleótidos 93-185 son la región de unión a IMP1. El mapeo adicional de los nucleótidos 93-185 reveló finalmente que el ARN de KRAS de 39 nt que abarca los nucleótidos 147-185 es la región más pequeña que aún tiene afinidad por IMP1 (Fig. S20). Basándonos en estos estudios, diseñamos un ARN de CD44 de 39 nt que abarca los nucleótidos 2862-2900 y un ARN de KRAS de 44 nt que abarca los nucleótidos 142-185 para su uso en el ensayo de PF. Estos ARN se sintetizaron comercialmente y se etiquetaron con fluoresceína en el extremo 3'. Fue importante establecer primero la validez de nuestro ensayo de PF. Utilizando un ensayo de desplazamiento en gel, demostramos previamente que la variante IMP1 KH1-2 con una mutación puntual en el motivo GXXG en los dominios KH1 y KH2 había perdido por completo la capacidad de unirse al ARN de CD44, mientras que la variante KH3-4 tenía una afinidad de unión comparable a la de la WT ^[23]. La variante KH3, una mutación puntual en el motivo GXXG, tenía una afinidad significativamente reducida por el ARN de CD44 ^[23]. Como se muestra en la Fig. 7A, la afinidad relativa de las variantes KH1-2, KH3-4 y KH3 por el ARN de CD44 fluoresceínico de 39 nt en comparación con la IMP1 WT fue notablemente similar a la del ensayo de desplazamiento en gel. La variante KH1-2 no aumentó las unidades de anisotropía de fluorescencia (FA), incluso a 1000 nM, mientras que la variante KH3 mostró unidades de FA significativamente reducidas en comparación con la WT. En el ensayo de PF, encontramos que la variante KH3-4 tenía una afinidad ligeramente reducida por el ARN de CD44 en comparación con la IMP1 WT (Fig. 7A). La pequeña desviación podría atribuirse al hecho de que se utilizó un ARN de CD44 más grande de 194 nt en el ensayo de desplazamiento en gel ^[23]. Para validar aún más nuestro ensayo de PF, utilizamos el ARN de KRAS de 44 nt. En el ensayo de desplazamiento en gel, encontramos que todas las variantes KH, mutaciones puntuales simples o dobles, tenían una afinidad significativamente reducida o perdieron la capacidad de unirse al ARN de KRAS [24, 25]. La Fig. 7B muestra que la variante KH1-2 no tenía afinidad, mientras que las variantes KH3-4 y KH3 tenían una capacidad significativamente reducida para unirse al ARN de KRAS de 44 nt, según lo determinado por PF. Una vez más, esto es consistente con los resultados del ensayo de desplazamiento en gel [24, 25]. En resumen, hemos establecido con éxito un ensayo de PF confiable que reproduce el ensayo de desplazamiento en gel y, por lo tanto, puede utilizarse convenientemente para estudiar la interacción IMP1-ARN.

Análisis de polarización de fluorescencia de la interacción entre la IMP1 de tipo salvaje y sus variantes de mutación puntual (KH1-2, KH3-4 y KH3) con el ARN de CD44 fluoresceínico de 39 nt (A) y el ARN de KRAS de 44 nt (B). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos separados (n = 3).

La expresión de KRAS y la supervivencia celular en las células de cáncer de colon pueden estar reguladas por la unión de la proteína IMP1 al ARNm de KRAS ^[38]. Utilizando el ensayo de PF establecido, demostramos que la IMP1 de longitud completa, la IMP1 truncada que contiene solo los dominios KH1 a KH4 (IMP1 KH1to4) o solo el didominio KH3 y KH4 (IMP1 KH3&4) se unen de forma dependiente de la dosis al ARN de KRAS fluoresceínico de 44 nt (Fig. 8). Luego, evaluamos el efecto dependiente de la dosis de la grifolina, la neogrifolina y la confluentina sobre el ARN de KRAS fluoresceínico unido a las tres formas de IMP1 recombinante. Determinamos que, para la grifolina y la neogrifolina, hasta 100 μM no tuvieron ningún efecto sobre la interacción IMP1-ARN de KRAS (Fig. 9). En contraste, la confluentina inhibió claramente la interacción entre el ARN de KRAS y la IMP1 de longitud completa, comenzando en 40 μM. También inhibió significativamente la interacción entre el ARN de KRAS y la IMP1 KH1to4 a concentraciones superiores a 40 μM (Fig. 9). Sorprendentemente, la confluentina no tuvo ningún efecto sobre la interacción KRAS ARN-IMP1 KH3&4 (Fig. 9), lo que sugiere que la confluentina se une a sitios en la IMP1 que están fuera del didominio KH3&4. Dado que la única diferencia entre la IMP1 KH1to4 y la IMP1 KH3&4 es la presencia de los dominios KH1 y KH2 en la primera, es muy probable que la confluentina se una al didominio KH1&2 para ejercer su efecto inhibidor sobre la interacción IMP1-ARN de KRAS. Se ha demostrado que el didominio KH1 y KH2 es crítico para que la IMP1 se una a los sustratos de ARN [23, 25, 41, 42], incluido el ARN de KRAS [24, 25]. Además, un estudio reciente sugirió que el didominio KH1&KH2 de la IMP1 tiene una alta afinidad de unión al ARN y se une al ARN rápidamente ^[43]. Claramente, se requiere un estudio adicional para probar la hipótesis de que la confluentina se une al didominio KH1 y KH2 para inhibir la función de la IMP1.

Se incubaron cantidades crecientes de IMP1 recombinante de longitud completa o IMP1 truncada (KH1to4 y KH3&4) con ARN de KRAS fluoresceínico de 44 nt a 37 °C durante 30 minutos. Los resultados mostrados representan tres experimentos de réplica (n = 3).

Se incubó proteína IMP1 recombinante (300 nM) con ARN de KRAS fluoresceínico en ausencia o presencia de varias concentraciones de grifolina, neogrifolina o confluentina. Las concentraciones de los compuestos utilizados fueron: 100, 80, 40, 20, 10 y 5 μM. Los tres tipos de proteínas IMP1 recombinantes utilizadas fueron: longitud completa, KH1to4 y KH3&4. Los datos mostrados son la media ± DE obtenidos de tres experimentos independientes (n = 3).

Cuando se incubaron con el ARN de KRAS fluoresceínico de 44 nt solo, la grifolina, la neogrifolina y la confluentina no tuvieron ningún efecto sobre las unidades de anisotropía de fluorescencia (Fig. 10), lo que indica que estos compuestos no tienen afinidad por el ARN de KRAS. Sin embargo, el antibiótico neomicina, conocido por unirse al ARN [44, 45], mejoró significativamente las unidades de anisotropía de fluorescencia cuando se incubó con el ARN de KRAS fluoresceínico (Fig. 10). Este resultado apoya la teoría de que la confluentina inhibe la interacción IMP1-ARN de KRAS al dirigirse a la proteína IMP1. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción de una pequeña molécula que inhibe la interacción IMP1-ARN de KRAS. Se ha informado que una pequeña molécula llamada BTYNB inhibe la interacción IMP1-c-myc ARN ^[46]. El presente estudio plantea la posibilidad de que la confluentina suprima la expresión de KRAS al interrumpir la interacción IMP1-ARNm de KRAS en las células de cáncer de colon. Como tal, sería importante determinar si la confluentina puede inhibir otras interacciones IMP1-ARN, lo que conduciría a la posible inhibición funcional de IMP1 en líneas celulares y en modelos animales.

Se utilizó una columna analítica Agilent Zorbax Eclipse XBD-C18 (4,6 mm x 150 mm).

El espectro ESIMS exhibió un pico [M + H]+ a m/z = 329,3.

El espectro ESIMS exhibió un pico [M + H]+ a m/z = 329,3.

El espectro ESIMS exhibió un pico [M + H]+ a m/z = 327,2.

Las células HT29 se trataron con 20 μM (A) o 50 μM (A y B) de grifolina, neogrifolina y confluentina durante 48 horas. A continuación, se aislaron los lisados celulares y se sometieron a análisis de Western blot.

(A) Resumen de los fragmentos de ARN de KRAS truncados en los extremos 3’ y 5’, correspondientes a los nucleótidos 1-185, y su afinidad de unión relativa a IMP1. (B) Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética de los fragmentos de ARN de KRAS truncados en los extremos 3’ y 5’, correspondientes a los nucleótidos 1-185. (C) Resumen de los fragmentos de ARN de KRAS truncados en los extremos 3’ y 5’, correspondientes a los nucleótidos 93-185, y su afinidad de unión relativa a IMP1. (D) Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética de los fragmentos de ARN de KRAS truncados en los extremos 3’ y 5’, correspondientes a los nucleótidos 93-185.

Agradecemos a Northern Analytical Laboratory Services por permitirnos utilizar su sistema HPLC Agilent 1260 Infinity. Agradecemos al Sr. Noburo Kato por su ayuda en parte de los experimentos de Western blot.