Un análisis exhaustivo del perfil espacial e inmunitario del cáncer colorrectal metastásico con deficiencia en la reparación de errores revela la respuesta a la inmunoterapia.

El cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad genéticamente e inmunológicamente heterogénea, donde la deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR) representa el 4-5% de los casos metastásicos [^[1], ^[2]]. La dMMR surge de la inactivación de genes clave de reparación del ADN, como MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6, lo que resulta en inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) y una carga de mutación tumoral elevada (TMB) [^[3], ^[4]]. Estos tumores típicamente generan abundantes neoantígenos y muestran una alta infiltración de células T CD8+ y expresión de PD-L1, lo que a menudo confiere capacidad de respuesta inmune [^[5]]. A pesar de esto, puede ocurrir metástasis y las respuestas clínicas a los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) siguen siendo variables.

Los ICIs dirigidos al eje PD-1/PD-L1, como pembrolizumab y nivolumab, han demostrado una eficacia clínica significativa en el CCR con dMMR, obteniendo la aprobación de la FDA para el tratamiento de primera y segunda línea [^[6], ^[7]]. Los regímenes de combinación, incluyendo nivolumab más ipilimumab como tratamiento neoadyuvante, han demostrado notables tasas de respuesta (95%) [^[8]]. Sin embargo, las tasas de respuesta objetiva siguen siendo subóptimas (31-33%), lo que destaca la necesidad de comprender mejor los mecanismos de resistencia a los ICIs [^[9], ^[10]].

Los macrófagos asociados al tumor (TAM) son componentes clave del microambiente tumoral (TME) que modulan la capacidad de respuesta a los ICIs. Reclutados a través de citocinas como CCL2, CXCL12, VEGF y TGF-β, los TAM exhiben plasticidad y se polarizan en fenotipos M1 proinflamatorios o M2 inmunosupresores, dependiendo de las señales ambientales [^[11], ^[12]]. En el CCR, los TAM adoptan predominantemente un fenotipo M2, lo que favorece la supresión inmune, la progresión tumoral y la metástasis. Los TAM polarizados hacia M2 reclutan células T reguladoras (Tregs), inhiben la función de las células T CD8+ y las células NK, y expresan ligandos de puntos de control como PD-L1 y enzimas como ARG1 y NOS, que perjudican la actividad citotóxica [^[13], ^[14]]. Las altas densidades de TAM M2 se asocian con un mal pronóstico y una respuesta limitada a los ICIs tanto en el CCR en estadio temprano como avanzado [^[15]].

Para investigar los mecanismos de respuesta y resistencia a los ICIs, realizamos análisis proteómicos espaciales y transcriptómicos de células individuales de múltiples lesiones metastásicas de una paciente con CCR dMMR que mostró respuestas heterogéneas a pembrolizumab. Nuestro estudio tuvo como objetivo analizar el contexto inmunitario y la arquitectura funcional de los TAM para comprender la eficacia local de los ICIs, proporcionando información sobre las estrategias terapéuticas para superar la resistencia en el CCR metastásico con dMMR.

Materiales y métodos

Información clínica

Una mujer de 43 años fue diagnosticada con un cáncer de colon ascendente obstructivo con metástasis hepáticas resecables. Este estudio abarca el curso clínico desde el diagnóstico inicial en marzo de 2018 hasta la resección curativa, la quimioterapia paliativa y la inmunoterapia con pembrolizumab administrada entre diciembre de 2020 y mayo de 2021, junto con evaluaciones de TC en intervalos. Posteriormente, permaneció bajo vigilancia activa, con un seguimiento clínico y radiológico regular que se extendió hasta mayo de 2025. Tras la resección inicial, la paciente recibió 12 ciclos de quimioterapia paliativa con FOLFOX. Dos años después, el tumor recurrió en múltiples sitios, incluyendo los ovarios, el peritoneo y el epiplón. Recibió cuatro ciclos de pembrolizumab y mostró respuestas heterogéneas en los diferentes sitios metastásicos: regresión en el peritoneo y el ovario izquierdo, pero resistencia en el epiplón y el ovario derecho. Todas las lesiones metastásicas evaluadas en este estudio se obtuvieron durante una cirugía de debulking en un solo intervalo realizada después de que la paciente completó cuatro ciclos de pembrolizumab. El ovario derecho, el ovario izquierdo, el epiplón y las lesiones peritoneales se resecaron de forma concurrente, lo que indica que todas las muestras representan sitios metastásicos sincrónicos recolectados en un momento terapéutico idéntico. Cinco años después de la recurrencia, la paciente permanece libre de enfermedad, sin evidencia de progresión o recaída, lo que sugiere una remisión completa duradera. El estado dMMR se confirmó mediante inmunohistoquímica para MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Centro Médico Gil de la Universidad Gachon (número de aprobación: GCIRB2024-021). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos del comité de investigación institucional, las Buenas Prácticas Clínicas y la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de la paciente antes de su participación en el estudio.

Recolección de muestras tumorales y secuenciación de ARN

Las muestras tumorales de las reseciones quirúrgicas o biopsias con ≥20% de contenido tumoral se procesaron para la extracción de ARN (QIAamp Mini Kit). Las bibliotecas de ARN-seq se prepararon utilizando los kits Illumina TruSeq y se secuenciaron en la plataforma HiSeq 2500 (2 × 50 pb). Las lecturas se alinearon al genoma GRCh38 utilizando STAR (v2.6.1) y se cuantificaron como TPM utilizando RSEM (v1.3.1), siguiendo los parámetros recomendados por GTEx.

Inmunohistoquímica para deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento y PD-L1

Los tejidos FFPE se cortaron (4 μm), se montaron en portaobjetos Superfrost Plus y se secaron a 60 °C. La inmunohistoquímica para MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6 se realizó como se informó anteriormente [^[16]], con la pérdida de una o más proteínas que indica dMMR. La inmunohistoquímica de PD-L1 se realizó en un Dako Autostainer Link 48 utilizando el kit PD-L1 IHC 22C3 pharmDx y la detección EnVision FLEX. Se calculó el puntaje combinado positivo (CPS) para las células tumorales e inmunitarias; se consideraron células PD-L1 positivas cuando el CPS ≥1. La muestra se consideró PD-L1 positiva cuando el CPS fue ≥1.

Secuenciación y análisis del transcriptoma completo

Las bibliotecas de ARN se prepararon utilizando el kit TruSeq Stranded Total RNA con Ribo-Zero Gold y se secuenciaron en Illumina HiSeq 2500 (2 × 50 pb). Las bibliotecas se normalizaron a 20 pM y se secuenciaron utilizando la química V3. Las lecturas se alinearon al genoma humano GRCh38 con STAR (v2.6.1) [^[17]] y se cuantificaron como TPM utilizando RSEM (v1.3.1) [^[18]], siguiendo la guía GTEx.

Inmunofluorescencia multiplex y análisis de imágenes

Las secciones de FFPE se tiñeron utilizando el kit Opal Polaris de 7 colores (Akoya) en un autoestainer Leica BOND Rx. Los anticuerpos primarios incluyeron panCK/Opal-620, PD-L1/Opal-480, CD8/Opal-780, CD68/Opal-690, CD11C/Opal-520 y CD163/Opal-570. Las láminas se contratiñeron con DAPI y se obtuvieron imágenes con desmezcla espectral. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software inForm (PerkinElmer), con segmentación de tejido en tumor CK+ y regiones estromales CK-. La segmentación celular se realizó en función de los límites nucleares, seguida de la asignación de fenotipo utilizando un clasificador supervisado entrenado en regiones tumorales y estromales representativas para minimizar los umbrales de intensidad arbitrarios. La desmezcla espectral, la sustracción de fondo y la corrección de lotes se realizaron utilizando los parámetros predeterminados optimizados en inForm. Las células que no fueron positivas para ninguno de los seis marcadores se designaron como no asignadas y se informaron. Las métricas de proximidad espacial se cuantificaron utilizando el paquete R phenoptr (v0.3.2). Se calcularon las distancias centroide a centroide del vecino más cercano entre las células tumorales CK+PD-L1+ y los subconjuntos inmunitarios, y el número de células vecinas dentro de un radio fijo de 15 μm se resumió para evaluar las interacciones inmunitarias-tumorales locales. También se proporcionan ejemplos de resultados de segmentación y mapas de vecinos más cercanos.

Secuenciación y análisis de ARN de células individuales

Los tejidos tumorales se disociaron utilizando el sistema gentleMACS y se crioconservaron. Las bibliotecas de células individuales se prepararon utilizando la plataforma 10 × Genomics Chromium 5′ V(D)J y se secuenciaron en NovaSeq 6000 (≥50 000 lecturas/célula). Las lecturas se mapearon a GRCh38 con CellRanger (v5.0). El análisis se realizó en R (v4.1) utilizando Seurat (v4.0) [^[19]]. Se excluyeron las células de baja calidad (40% de contenido mitocondrial). La normalización, el escalado y la agrupación se realizaron con corrección de lotes utilizando Harmony [^[20]]. Los tipos de células se anotaron en función de los marcadores canónicos utilizando la función FindAllMarkers.

Análisis de comunicación célula-célula

La comunicación célula-célula se infirió utilizando el paquete R CellChat (v2.1.2). Los datos de scRNA-seq normalizados de cada lesión metastásica se utilizaron para construir objetos CellChat independientes, y las interacciones ligando-receptor se analizaron utilizando las bases de datos de señalización secretada humana, ECM y contacto célula-célula integradas. Para cada conjunto de datos, se identificaron ligandos, receptores y pares de interacción sobreexpresados, y las probabilidades de comunicación se estimaron utilizando el marco estadístico de permutación de CellChat. Las interacciones significativas (P < 0,05) se retuvieron para el análisis posterior, y la señalización a nivel de vía se infirió agregando pares ligando-receptor en módulos de señalización seleccionados. La fuerza de la comunicación, el flujo de información y los roles de remitente/receptor se calcularon utilizando la canalización predeterminada. Para comparar las lesiones resistentes y sensibles a pembrolizumab, las probabilidades de comunicación se promediaron dentro de cada grupo, y la actividad diferencial de la vía se resumió utilizando el cambio de registro y las funciones de comparación integradas de CellChat.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron en R (v4.1.1). Las variables continuas se compararon utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon o ANOVA de una vía, según corresponda. Los análisis de tendencias se realizaron utilizando pruebas de tendencia basadas en regresión lineal (y evaluación de tendencias basada en ANOVA cuando corresponda). Se consideraron estadísticamente significativos los valores de P bilaterales < 0,05.

Se obtuvieron cortes de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) (4 µm), se montaron en portaobjetos Superfrost Plus y se secaron a 60 °C. Se realizó inmunohistoquímica (IHQ) para MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6, según se informó previamente [^[16]], y la pérdida de una o más proteínas indicó dMMR. La IHQ de PD-L1 se realizó en un Dako Autostainer Link 48 utilizando el kit de IHQ PD-L1 22C3 pharmDx y la detección EnVision FLEX. Se calculó la puntuación combinada positiva (CPS) para las células tumorales e inmunitarias; se consideró que las células PD-L1-positivas tenían una CPS ≥ 1 mediante IHQ. Se consideró que la muestra era PD-L1-positiva cuando la CPS era ≥ 1.

Secuenciación y análisis del transcriptoma completo

Se prepararon las bibliotecas de ARN utilizando el kit TruSeq Stranded Total RNA con Ribo-Zero Gold y se secuenciaron en Illumina HiSeq 2500 (2 × 50 pb). Las bibliotecas se normalizaron a 20 pM y se secuenciaron utilizando la química V3. Los fragmentos de lectura se alinearon al genoma humano GRCh38 con STAR (v2.6.1) [^[17]] y se cuantificaron como TPM utilizando RSEM (v1.3.1) [^[18]], siguiendo las pautas de GTEx.

Inmunofluorescencia multiplex y análisis de imágenes

Los cortes de FFPE se tiñeron utilizando el kit Opal Polaris de 7 colores (Akoya) en un tinte automático Leica BOND Rx. Los anticuerpos primarios incluyeron panCK/Opal-620, PD-L1/Opal-480, CD8/Opal-780, CD68/Opal-690, CD11C/Opal-520 y CD163/Opal-570. Los portaobjetos se contratiñeron con DAPI y se obtuvieron imágenes mediante la separación espectral. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software inForm (PerkinElmer), con segmentación de tejido en regiones tumorales CK+ y regiones estromales CK-. La segmentación celular se realizó en función de los límites nucleares, seguida de la asignación de fenotipo utilizando un clasificador supervisado entrenado en regiones tumorales y estromales representativas para minimizar los umbrales de intensidad arbitrarios. La separación espectral, la sustracción de fondo y la corrección de lotes se realizaron utilizando parámetros predeterminados optimizados en inForm. Las células que no eran positivas para ninguno de los seis marcadores se designaron como no asignadas y se informaron. Se cuantificaron las métricas de proximidad espacial utilizando el paquete R phenoptr (v0.3.2). Se calcularon las distancias del vecino más cercano de centroide a centroide entre las células tumorales CK+PD-L1+ y los subconjuntos inmunitarios, y el número de células vecinas dentro de un radio fijo de 15 µm se resumió para evaluar las interacciones inmunitarias-tumorales locales. También se proporcionan ejemplos representativos de los resultados de la segmentación y los mapas del vecino más cercano.

Secuenciación y análisis de ARN de una sola célula

Los tejidos tumorales se disociaron utilizando el sistema gentleMACS y se crioconservaron. Las bibliotecas de una sola célula se prepararon utilizando la plataforma 10 × Genomics Chromium 5? V(D)J y se secuenciaron en NovaSeq 6000 (50 000 lecturas/célula). Las lecturas se asignaron a GRCh38 con CellRanger (v5.0). El análisis se realizó en R (v4.1) utilizando Seurat (v4.0) [^[19]]. Se excluyeron las células de baja calidad (40 % de contenido mitocondrial). La normalización, el escalado y la agrupación se realizaron con corrección de lotes utilizando Harmony [^[20]]. Los tipos de células se anotaron en función de los marcadores canónicos utilizando la función FindAllMarkers.

Análisis de la comunicación célula-célula

Se infirió la comunicación célula-célula utilizando el paquete R CellChat (v2.1.2). Se utilizaron los datos de secuenciación de ARN de una sola célula normalizados de cada lesión metastásica para construir objetos CellChat independientes, y se analizaron las interacciones ligando-receptor utilizando las bases de datos de señalización secretada humana, ECM y contacto célula-célula integradas. Para cada conjunto de datos, se identificaron los ligandos, receptores y pares de interacción sobreexpresados, y se estimaron las probabilidades de comunicación utilizando el marco estadístico basado en permutaciones de CellChat. Se retuvieron las interacciones significativas (P < 0,05) para el análisis posterior, y se infirió la señalización a nivel de vía agregando los pares ligando-receptor en módulos de señalización seleccionados. La intensidad de la comunicación, el flujo de información y los roles de remitente/receptor se calcularon utilizando la canalización predeterminada. Para comparar las lesiones resistentes y sensibles al pembrolizumab, las probabilidades de comunicación se promediaron dentro de cada grupo, y la actividad diferencial de la vía se resumió utilizando el cambio de pliegue logarítmico y las funciones de comparación integradas de CellChat.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron en R (v4.1.1). Las variables continuas se compararon utilizando la prueba de rango con signo de Wilcoxon o ANOVA de una vía, según corresponda. Se realizaron análisis de tendencias utilizando pruebas de tendencia basadas en regresión lineal (y evaluación de tendencias basada en ANOVA cuando fue aplicable). Se consideraron estadísticamente significativos los valores de P bilaterales < 0,05.

Resultados

Respuesta heterogénea al pembrolizumab en diferentes sitios metastásicos en el cáncer colorrectal deficiente en reparación de errores de emparejamiento

Para investigar la heterogeneidad específica del órgano en la respuesta a los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) en el CRC dMMR, realizamos un análisis espacial y transcriptómico integral en múltiples sitios metastásicos que exhiben respuestas terapéuticas variables al pembrolizumab. Utilizando muestras de tejido obtenidas del colon, hígado, omento, peritoneo y ovarios bilaterales, aplicamos una estrategia multimodal integrativa que comprende la secuenciación de ARN a granel, la secuenciación de ARN de una sola célula y la inmunohistoquímica multiplex (Fig. 1a). Cada lesión se perfiló en paralelo para preservar la resolución espacial y permitir la comparación directa de las características moleculares y celulares en los nichos metastásicos (Fig. 1b).

Aplicamos este enfoque espacial y transcriptómico integrativo a una paciente de 43 años con CRC dMMR que inicialmente recibió quimioterapia FOLFOX para enfermedad limitada en el hígado, pero desarrolló una recurrencia multifocal 2 años después. La imagen pretratamiento reveló metástasis ováricas bilaterales (Fig. 1c). Después de cuatro ciclos de pembrolizumab, se observaron respuestas específicas del sitio: regresión tumoral en el peritoneo y el ovario izquierdo, pero persistencia radiográfica en el omento y el ovario derecho (Fig. 1d). La cirugía de rescate permitió la evaluación sistemática de las lesiones sincrónicas y metacrónicas dentro de un único paisaje inmunitario.

El estado inmunitario y los programas transcripcionales asociados a la respuesta distinguen las lesiones metastásicas en el cáncer colorrectal deficiente en reparación de errores de emparejamiento

Para investigar los correlatos moleculares de las respuestas variables al pembrolizumab en las lesiones metastásicas, realizamos un perfilamiento transcriptómico de cinco sitios tumorales: colon, hígado, ovario derecho, ovario izquierdo y peritoneo (Fig. 2a). Las lesiones sensibles al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) mostraron un amplio enriquecimiento de las firmas de genes inmunitarios antitumorales, incluidas las vías transcripcionales asociadas con la actividad de las células T y NK efectoras, las firmas de migración de células T, los programas asociados a las células B y las firmas de macrófagos tipo M1. En particular, los módulos de genes inmunorreguladores, como los asociados con los programas de Treg, los módulos asociados a las células dendríticas supresoras de macrófagos (MDSC), la polarización Th2 y las vías de los puntos de control inmunitario, también se elevaron en los mismos tumores, lo que sugiere un contexto inmunitario inflamado pero heterogéneo en lugar de un estado uniformemente polarizado. Además de los módulos asociados a la inmunidad, los programas de remodelación del estroma, incluidos los programas asociados a la angiogénesis, las firmas endoteliales y los programas asociados a los fibroblastos, se elevaron en las lesiones responsivas, con un enriquecimiento parcial observado en el ovario derecho. Los módulos asociados a la proliferación fueron más prominentes en el colon y el hígado, mientras que las firmas relacionadas con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) se elevaron en todas las lesiones pélvicas, independientemente de la respuesta clínica.

Para analizar más a fondo estos patrones, las muestras se estratificaron en categorías de alta y baja inmunidad en función de las puntuaciones agregadas de la firma inmunitaria (Fig. 2b). Los genes sobreexpresados en los tumores de alta inmunidad, derivados principalmente de las lesiones sensibles al pembrolizumab, se enriquecieron con programas de migración y activación de linfocitos (por ejemplo, CXCL12, CD28 y TNFRSF8), así como con componentes de inmunoglobulinas y receptores de células T (por ejemplo, IGHA1, IGHV1-46 y TRBV4-1) y moléculas inmunitarias reguladoras adicionales (por ejemplo, VSIR, ICAM2 y CLEC1A). Por el contrario, las lesiones de baja inmunidad mostraron una mayor expresión de genes metabólicos y reguladores de la cromatina (por ejemplo, HELLS, HMGCS1 y NEIL3), lo que es consistente con un estado transcriptómico menos infiltrado por células inmunitarias.

Para evaluar si los perfiles transcripcionales globales se corresponden con la respuesta al tratamiento, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) en las cinco lesiones metastásicas (Fig. 2c). Los tumores del ovario izquierdo y el peritoneo, ambos sensibles al pembrolizumab, se agruparon estrechamente y fueron distintos de los tumores de baja inmunidad y no responsivos, como el ovario derecho, el hígado y el colon, lo que sugiere programas transcripcionales compartidos asociados con la sensibilidad.

Según la respuesta al pembrolizumab, comparamos a continuación los niveles de expresión de los genes de los puntos de control inmunitario, los genes citolíticos, los genes relacionados con el interferón y los genes relacionados con la presentación de antígenos en los tumores no tratados, resistentes y sensibles (Fig. 2d-e). Las moléculas de puntos de control canónicos (CD274, PDCD1LG2, LAG3 y TIGIT) y los reguladores adicionales (VSIR, CD276, LGALS9 e IDO1) se sobreexpresaron de forma constante en el grupo sensible. De manera similar, los efectores citolíticos (GZMA, PRF1 y GNLY), los genes de respuesta al IFN-γ (CXCL9, CXCL10 e IFNG), las moléculas de clase I y II del MHC y los transcritos asociados a las células T (CD3D y CD8A) se elevaron en los tumores sensibles, pero se expresaron mínimamente en las lesiones resistentes y el tumor primario no tratado.

Para evaluar si esta activación transcripcional se corresponde con la infiltración inmunitaria real, realizamos la deconvolución de células del ARN a granel mediante EPIC (Figura S2 complementaria). Las lesiones del colon y el hígado se compusieron en gran medida de transcritos no caracterizados (no inmunitarios) con una mínima proporción inferida de fracciones inmunitarias o del estroma. En contraste, las lesiones sensibles al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) mostraron las proporciones estimadas más altas de células T CD8+/CD4+, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos asociados al cáncer, mientras que el ovario derecho exhibió un perfil intermedio. En conjunto, estos análisis indican que las lesiones sensibles no solo están transcripcionalmente activadas inmunológicamente, sino que también están globalmente más infiltradas por células inmunitarias, mientras que los sitios resistentes siguen siendo relativamente pobres en células inmunitarias a pesar de su origen clonal compartido.

La arquitectura espacial de las interfaces inmunitarias-tumorales difiere según la respuesta al pembrolizumab

Para investigar los determinantes espaciales de la respuesta inmunitaria en el CRC dMMR, realizamos inmunohistoquímica multiplex (mIHC) en lesiones metastásicas de cinco sitios anatómicos (colon, ovario derecho, omento, ovario izquierdo y peritoneo). Los paneles de marcadores incluyeron citoqueratina (CK), PD-L1, CD8, CD68, CD163 y CD11c, lo que permitió la identificación fenotípica de las células epiteliales tumorales (CK+PD-L1+), las células T citotóxicas (CD8+) y los subconjuntos de macrófagos, incluidos los de tipo M1 (CD68+CD11c+) y los de tipo M2 (CD163+) (Fig. 3a; Figuras S3-1 a S3-3 complementarias).

Cuantificamos la infiltración inmunitaria utilizando las densidades celulares derivadas de la mIHC por área tumoral (Figura S4 complementaria). Las lesiones sensibles al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) exhibieron las densidades más altas de células T CD8+ y macrófagos de tipo M1, mientras que las lesiones resistentes (omento y ovario derecho) mostraron abundantes células CK-/PD-L1+ del estroma, pero una menor densidad de efectores. La lesión primaria del colon era densa en tumores pero pobre en células inmunitarias. Estas mediciones de densidad son ampliamente consistentes con las tendencias observadas en la deconvolución del ARN a granel y ofrecen una visión complementaria a nivel de tejido de la infiltración inmunitaria específica de la lesión.

A continuación, se realizó un análisis espacial cuantitativo de la proximidad para evaluar la arquitectura inmune-tumoral en las lesiones metastásicas (Fig. 3b-f). Las líneas blancas que conectan demarcaban las distancias espaciales más cercanas entre las células tumorales CK+PD-L1+ y las poblaciones inmunitarias vecinas, lo que reveló diferencias específicas del sitio en la infiltración inmunitaria. Las lesiones sensibles al pembrolizumab, en particular el peritoneo y el ovario izquierdo, exhibieron distancias significativamente reducidas entre las células tumorales CK+PD-L1+ y los macrófagos de tipo M1 CD68+CD11c+ (Fig. 3c) y entre las células tumorales y las células T CD8+ (Fig. 3d). Estos hallazgos sugieren una mayor captación y colocalización de las células inmunitarias efectoras dentro del microambiente tumoral en las regiones responsivas.

En contraste, el análisis de las relaciones inmuno-estromales reveló patrones distintos de exclusión espacial. En los sitios que respondieron a pembrolizumab, las células T CD8+ se ubicaron más lejos de los macrófagos tipo M2 CD163+ (Fig. 3e) y los macrófagos CD68+CD11c+ (Fig. 3f), lo que indica una menor exposición a las poblaciones mieloides inmunosupresoras dentro del compartimento estromal. Por el contrario, en las lesiones resistentes, como el colon y el ovario derecho, estas distancias fueron más cortas, lo que sugiere una posible interacción inhibitoria. Estas configuraciones espaciales sugieren colectivamente que la inmunidad antitumoral eficaz en los sitios metastásicos que responden puede estar impulsada tanto por una mayor interacción entre las células efectoras y el tumor como por la separación espacial de los macrófagos estromales supresores.

El análisis transcriptómico a nivel de célula única revela una composición inmunitaria diferencial y la polarización de los macrófagos asociadas con la respuesta a pembrolizumab en el cáncer colorrectal metastásico deficiente en reparación de errores de emparejamiento (dMMR).

Para caracterizar de manera integral el panorama inmunitario que subyace a las respuestas variables a pembrolizumab, realizamos un secuenciamiento de ARN a nivel de célula única (scRNA-seq) en poblaciones enriquecidas en células inmunitarias de cuatro lesiones metastásicas (ovario derecho, ovario izquierdo, omento y peritoneo). Se obtuvieron un total de 17 970 transcriptomas de células únicas de alta calidad, y la agrupación no supervisada delimitó siete compartimentos celulares principales: células T, células NK, macrófagos, células B, células plasmáticas, células epiteliales y células estromales, basándose en marcadores de linaje canónicos (Fig. 4a; Figura suplementaria S5). Entre los subconjuntos inmunitarios, los sitios que respondieron a pembrolizumab (ovario izquierdo y peritoneo) exhibieron proporciones significativamente más altas de células NK en comparación con las lesiones resistentes (ovario derecho y omento) (Fig. 4b), lo que sugiere una relación entre la abundancia de células NK y la respuesta terapéutica. Estas diferencias de composición a nivel de célula única coincidieron tanto con la deconvolución basada en EPIC del ARN secuenciado a granel como con las mediciones de densidad celular derivadas de la inmunohistoquímica multiplex (mIHC), que también indicaron un aumento de la infiltración inmunitaria en las lesiones que respondieron a pembrolizumab (Figuras suplementarias S2 y S4).

A continuación, evaluamos los transcritos relacionados con la citotoxicidad en las células T y NK de los diferentes sitios metastásicos (Fig. 4c). Las moléculas efectoras citotóxicas, que incluyen GZMB, PRF1, GNLY, IFNG y CD8A/B, se regularon al alza en las células inmunitarias de las lesiones que respondieron a pembrolizumab, lo que indica un programa citolítico más activo. De manera consistente, la puntuación compuesta de citotoxicidad fue más alta en las lesiones sensibles en comparación con las resistentes (P = 0,007; Fig. 4d).

Para investigar el papel de la polarización de los macrófagos en la modulación de la respuesta a pembrolizumab, nos centramos en el análisis de las poblaciones de macrófagos (Fig. 4e). En particular, se observó que múltiples subgrupos tipo M2 (Figura suplementaria S4) se redujeron significativamente en las lesiones que respondieron a pembrolizumab, como el ovario izquierdo y el peritoneo (Fig. 4f), lo que sugiere un cambio hacia fenotipos menos inmunosupresores en los sitios que respondieron. A continuación, evaluamos los patrones de expresión génica de los principales transcritos asociados a M1 y M2 en los diferentes sitios (Fig. 4g). SPP1 y TREM2, que representan la polarización tipo M2, se expresaron de manera más prominente en las lesiones del omento, mientras que los marcadores relacionados con M1, como C1QC y S100A8, se enriquecieron en las regiones sensibles, incluido el peritoneo y el ovario izquierdo. Finalmente, las puntuaciones de polarización calculadas utilizando las firmas génicas M1 y M2 revelaron tendencias recíprocas: las puntuaciones del módulo M1 se elevaron significativamente en los tumores sensibles (P = 9,35e-36), mientras que las puntuaciones M2 fueron más altas en las lesiones resistentes (P = 6,30e-19) (Fig. 4h). Estos hallazgos demuestran que las metástasis que responden a pembrolizumab están enriquecidas con linfocitos citotóxicos y macrófagos tipo M1, mientras que los tumores resistentes albergan estados de macrófagos inmunosupresores y una función efectora disminuida.

Las redes de señalización intercelular revelan estados inmunosupresores frente a estados inmunopotenciadores en tumores resistentes e inmunorreactivos a los inhibidores de los puntos de control inmunitario.

Para dilucidar cómo la interacción tumoral-inmunitaria contribuye a las diferentes respuestas a pembrolizumab, realizamos un análisis de comunicación entre células utilizando datos de transcriptómica a nivel de célula única de cuatro lesiones metastásicas. Las redes globales de interacción intercelular revelaron diferencias sorprendentes entre los ecosistemas tumorales resistentes e inmunorreactivos a pembrolizumab (Fig. 5a, Figura suplementaria S5). En los tumores resistentes, las células epiteliales exhibieron interacciones densas con diversos compartimentos estromales e inmunitarios, lo que sugiere una arquitectura de señalización dominada por el tumor. Por el contrario, los tumores sensibles se caracterizaron por una comunicación inmune-inmune más extensa, particularmente que involucró a las células T CD4+, las células NK y los macrófagos, lo que indica un microambiente inmunológicamente más coordinado.

La comparación cuantitativa de la intensidad de la interacción entre los tipos de células emisoras y receptoras destacó aún más estas distinciones (Fig. 5b). En los tumores sensibles, la mayoría de las poblaciones de células inmunitarias, como las células T CD8+, las células B y los macrófagos, exhibieron señales salientes y entrantes más fuertes en relación con los sitios resistentes. Las células epiteliales, por el contrario, mostraron una actividad de señalización limitada en el grupo sensible, con la excepción de las interacciones con las células plasmáticas B. Estos hallazgos subrayan un cambio en el dominio de la señalización desde el epitelio tumoral hasta los componentes inmunitarios en los nichos inmunorreactivos a los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI).

Cuando se restringió a las poblaciones inmunitarias (Fig. 5c), los tumores sensibles a pembrolizumab exhibieron una comunicación intercelular mejorada en múltiples subconjuntos inmunitarios, incluidos las células T CD4+, las células NK y los subtipos de macrófagos no SPP1+. Por el contrario, los macrófagos asociados al tumor (TAM) SPP1+ dominaron el panorama de señalización en los tumores resistentes, participando en amplias interacciones con varias poblaciones inmunitarias. En particular, en los tumores sensibles, los TAM SPP1+ estaban relativamente aislados de otros compartimentos inmunitarios, lo que sugiere una influencia inmunosupresora reducida. De manera similar, los macrófagos C1QB+ mostraron una conectividad atenuada en las lesiones sensibles, lo que es consistente con un microambiente caracterizado por una disminución del intercambio inmunosupresor entre macrófagos y una mayor coordinación entre las células inmunitarias efectoras.

El mapeo de emisores y receptores a nivel de subtipo inmunitario reveló interacciones selectivamente mejoradas en el grupo sensible (Fig. 5d). Por ejemplo, la comunicación de los macrófagos MMP9+ a los macrófagos CCL8+ y, secuencialmente, de los macrófagos CCL8+ a los subconjuntos APOC1+ reflejó un eje monocito-monocito fortalecido. Además, las células T CD4+ ingenuas en el grupo sensible señalaron activamente a las células T CD8+ efectoras, lo que sugiere una activación y activación de las células T productivas. Por el contrario, los tumores resistentes demostraron una señalización inmunosupresora impulsada por macrófagos SPP1+ a las células T CD8+ ingenuas y agotadas, así como interacciones mejoradas de las células T reguladoras (Treg) con las células T CD8+ ingenuas, ambas características consistentes con la exclusión inmunitaria y la resistencia a los puntos de control inmunitario.

El análisis a nivel de vía reveló patrones distintos de uso de ligandos y receptores en los tumores resistentes y sensibles (Fig. 5e). En los tumores sensibles, los módulos de señalización inmunopotenciadores, que incluyen la galectina, la midkina (MK), las quimiocinas CCL y CXCL y la anexina, se regularon al alza, lo que es consistente con el reclutamiento de células T y NK y la activación citotóxica. En particular, LIGHT (TNFSF14), una señal de coestimulación de las células T, se elevó en las lesiones sensibles, lo que apoya su papel en el aumento de la eficacia de los ICI. Por el contrario, los tumores resistentes exhibieron una señalización aumentada a través de ejes inmunosupresores o pro-tumorales, como PLAU, TGF-β, VEGF, SPP1 y MIF. Entre estos, MIF surgió como una citocina dominante en los tumores resistentes, en línea con su función conocida en la inducción de la polarización de los macrófagos M2 y la promoción de la evasión inmunitaria. Las señales resistentes adicionales, que incluyen CypA, Semaphorin (SEMA3) y Visfatin, subrayaron aún más la presencia de un nicho de remodelación de la matriz e inmunosupresión.

Finalmente, una evaluación enfocada de las redes de señalización paracrina reveló un uso distinto de los ejes WNT y TGF-β en los diferentes grupos de respuesta (Fig. 5f). Los ligandos TGF-β canónicos y sus receptores cognados (por ejemplo, TGFB1/2/3–TGFBR1/2) se enriquecieron preferentemente en los tumores sensibles, lo que posiblemente refleja una activación impulsada por la retroalimentación en un contexto inflamado. Por el contrario, las señales TGF-β no canónicas, particularmente aquellas que involucran a TGFB2/3–ACVRL1 y socios relacionados, se elevaron en los tumores resistentes. De manera similar, los ligandos WNT no canónicos (WNT5A, WNT5B y WNT11) y sus receptores (por ejemplo, FZD4 y FZD6) estuvieron predominantemente activos en el grupo resistente, lo que es consistente con una mayor interacción tumoral-macrófaga y evidencia previa que relaciona estos ejes con la resistencia mediada por macrófagos.

En conjunto, estos hallazgos indican que la sensibilidad a pembrolizumab se asocia con una comunicación inmune-inmune enriquecida, vías de señalización inmunopotenciadoras y la exclusión espacial y funcional de los TAM inmunosupresores. Por el contrario, los sitios metastásicos resistentes están dominados por circuitos supresores centrados en el epitelio y los macrófagos tipo M2, que se caracterizan por la señalización no canónica de TGF-β y WNT. Estos paisajes de señalización intercelular pueden sustentar las diferentes respuestas terapéuticas observadas en los diferentes nichos metastásicos del CRC dMMR.

Basándose en estas observaciones, la Fig. 6 presenta un modelo espacial-molecular integrado en el que el carcinoma de colon primario siembra cuatro nichos metastásicos: omento, peritoneo y ovarios bilaterales, que se bifurcan en cohortes sensibles (peritoneo y ovario izquierdo) y resistentes (omento y ovario derecho) a pembrolizumab. En los sitios sensibles, las células tumorales CK+PD-L1+ están estrechamente colocalizadas con los macrófagos tipo M1 CD68+ y las células T CD8+, exhiben programas de presentación de antígenos citotóxicos, IFN-γ y MHC-I/II mejorados y excluyen espacialmente los macrófagos tipo M2 CD163+. Por el contrario, las lesiones resistentes exhiben proximidad CK+PD-L1+–CD163+, una infiltración celular efectora alterada y un enriquecimiento de redes de citocinas inmunosupresoras y factores de remodelación de la matriz (por ejemplo, MMP), encapsulando así la eficacia específica del sitio de los ICI en el CRC dMMR.

Heterogeneidad de la respuesta a pembrolizumab en los diferentes sitios metastásicos del cáncer colorrectal deficiente en reparación de errores de emparejamiento.

Para investigar la heterogeneidad específica del órgano de la respuesta a los ICI en el CRC dMMR, realizamos un análisis espacial y transcriptómico integral en múltiples sitios metastásicos que exhiben diferentes respuestas terapéuticas a pembrolizumab. Utilizando muestras de tejido resecadas del colon, el hígado, el omento, el peritoneo y los ovarios bilaterales, aplicamos una estrategia multimodal integrativa que comprende el secuenciamiento de ARN a granel, el secuenciamiento de ARN a nivel de célula única y la inmunohistoquímica multiplex (Fig. 1a). Cada lesión se perfiló en paralelo para preservar la resolución espacial y permitir una comparación directa de las características moleculares y celulares en los diferentes nichos metastásicos (Fig. 1b).

Aplicamos este enfoque espacial y transcriptómico integrativo a una paciente de 43 años con CRC dMMR que inicialmente recibió quimioterapia FOLFOX para la enfermedad limitada en el hígado, pero que desarrolló una recurrencia multifocal 2 años después. La imagen pretratamiento reveló metástasis bilaterales en los ovarios (Fig. 1c). Después de cuatro ciclos de pembrolizumab, se observaron respuestas específicas del sitio: regresión tumoral en el peritoneo y el ovario izquierdo, pero persistencia radiográfica en el omento y el ovario derecho (Fig. 1d). La cirugía de rescate permitió la evaluación sistemática de las lesiones sincrónicas y metacrónicas dentro de un único panorama inmunitario.

El estado inmunitario y los programas de transcripción asociados a la respuesta distinguen las lesiones metastásicas en el cáncer colorrectal deficiente en reparación de errores de emparejamiento.

Para investigar los correlatos moleculares de las respuestas variables al pembrolizumab en las lesiones metastásicas, realizamos un perfilado transcriptómico de cinco sitios tumorales: colon, hígado, ovario derecho, ovario izquierdo y peritoneo (Fig. 2a). Las lesiones sensibles al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) mostraron un enriquecimiento general de las firmas genéticas anti-tumorales inmunitarias, incluidas las unidades transcripcionales asociadas con la actividad de las células T y NK efectoras, las firmas de migración de células T, los programas asociados con las células B y las firmas de macrófagos tipo M1. Cabe destacar que los módulos génicos inmunorreguladores, como los asociados con los programas de células Treg, los módulos asociados con las células dendríticas mieloides supresoras (MDSC), la polarización Th2 y las vías de los puntos de control inmunitarios, también estaban elevados en los mismos tumores, lo que sugiere un contexto inmunitario inflamado pero heterogéneo en lugar de un estado uniformemente polarizado. Además de los módulos asociados con la inmunidad, los programas de remodelación del estroma, incluidos la angiogénesis, las firmas endoteliales y los programas asociados con los fibroblastos, estaban elevados en las lesiones que respondían, con un enriquecimiento parcial observado en el ovario derecho. Los módulos asociados con la proliferación fueron más prominentes en el colon y el hígado, mientras que las firmas relacionadas con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) estaban elevadas en todas las lesiones pélvicas, independientemente de la respuesta clínica.

Para analizar más a fondo estos patrones, las muestras se estratificaron en categorías de alta y baja inmunidad en función de las puntuaciones agregadas de las firmas inmunitarias (Fig. 2b). Los genes expresados en mayor medida en los tumores de alta inmunidad, derivados principalmente de las lesiones que respondían al pembrolizumab, se enriquecieron con programas de migración y activación de linfocitos (por ejemplo, CXCL12, CD28 y TNFRSF8), así como con componentes de inmunoglobulinas y receptores de células T (por ejemplo, IGHA1, IGHV1-46 y TRBV4-1) y moléculas inmunorreguladoras adicionales (por ejemplo, VSIR, ICAM2 y CLEC1A). Por el contrario, las lesiones de baja inmunidad mostraron una mayor expresión de genes que regulan el metabolismo y la cromatina (por ejemplo, HELLS, HMGCS1 y NEIL3), lo que es consistente con un estado transcripcional menos infiltrado por células inmunitarias.

Para evaluar si los perfiles transcripcionales globales se corresponden con la respuesta al tratamiento, realizamos un análisis de componentes principales (ACP) en las cinco lesiones metastásicas (Fig. 2c). Los tumores del ovario izquierdo y el peritoneo, ambos sensibles al pembrolizumab, se agruparon estrechamente y fueron distintos de los tumores de baja inmunidad y no respondedores, como el ovario derecho, el hígado y el colon, lo que sugiere programas transcripcionales compartidos asociados con la sensibilidad.

Según la respuesta al pembrolizumab, comparamos a continuación los niveles de expresión de los genes relacionados con los puntos de control inmunitarios, los genes citolíticos, los genes relacionados con los interferones y los genes relacionados con la presentación de antígenos en los tumores no tratados, resistentes y sensibles (Fig. 2d-e). Las moléculas de los puntos de control canónicos (CD274, PDCD1LG2, LAG3 y TIGIT) y otros reguladores (VSIR, CD276, LGALS9 e IDO1) se expresaron de forma más intensa en el grupo sensible. De manera similar, los efectores citolíticos (GZMA, PRF1 y GNLY), los genes de respuesta al IFN-γ (CXCL9, CXCL10 e IFNG), las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I y II y los transcritos asociados con las células T (CD3D y CD8A) se expresaron de forma más intensa en los tumores sensibles, pero se expresaron mínimamente en las lesiones resistentes y en el tumor primario no tratado.

Para evaluar si esta activación transcripcional se corresponde con la infiltración inmunitaria real, realizamos una deconvolución de tipo celular de la secuenciación de ARN masiva mediante EPIC (Figura S2 del Apéndice). Las lesiones de colon e hígado estaban compuestas en gran medida por transcriptomas no caracterizados (no inmunitarios) con una mínima proporción inferida de fracciones inmunitarias o del estroma. Por el contrario, las lesiones que respondían al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) mostraron las proporciones estimadas más altas de células T CD8+/CD4+, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos asociados con el cáncer, mientras que el ovario derecho exhibió un perfil intermedio. En conjunto, estos análisis indican que las lesiones sensibles no solo están inmunológicamente activadas a nivel transcripcional, sino que también están más inmunoinfiltradas a nivel global, mientras que los sitios resistentes siguen siendo relativamente pobres en células inmunitarias a pesar de su origen clonal compartido.

La arquitectura espacial de las interfaces tumor-inmunitarias difiere según la respuesta al pembrolizumab

Para investigar los determinantes espaciales de la respuesta inmunitaria en el CRC dMMR, realizamos inmunohistoquímica multiplexada (mIHC) en lesiones metastásicas de cinco sitios anatómicos (colon, ovario derecho, omento, ovario izquierdo y peritoneo). Los paneles de marcadores incluyeron citoqueratina (CK), PD-L1, CD8, CD68, CD163 y CD11c, lo que permitió la identificación fenotípica de las células tumorales epiteliales (CK+PD-L1+), las células T citotóxicas (CD8+) y los subconjuntos de macrófagos, incluidos los de tipo M1 (CD68+CD11c+) y los de tipo M2 (CD163+) (Fig. 3a; Figura S3-1 a S3-3 del Apéndice).

Cuantificamos la infiltración inmunitaria utilizando las densidades celulares derivadas de la mIHC por área tumoral (Figura S4 del Apéndice). Las lesiones que respondían al pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) mostraron las densidades más altas de células T CD8+ y macrófagos de tipo M1, mientras que las lesiones resistentes (omento y ovario derecho) mostraron abundantes células del estroma CK+/PD-L1+, pero una menor densidad de efectores. La lesión primaria del colon era densa en tumores, pero pobre en células inmunitarias. Estas mediciones de densidad son, en general, consistentes con las tendencias observadas en la deconvolución de la secuenciación de ARN masiva y ofrecen una visión complementaria a nivel tisular de la infiltración inmunitaria específica de la lesión.

A continuación, se realizó un análisis cuantitativo de la proximidad espacial para evaluar la arquitectura tumor-inmunitaria en las lesiones metastásicas (Fig. 3b-f). Las líneas blancas de conexión delimitaron las distancias espaciales más cercanas entre las células tumorales CK+PD-L1+ y las poblaciones inmunitarias vecinas, lo que reveló diferencias específicas del sitio en la infiltración inmunitaria. Las lesiones sensibles al pembrolizumab, en particular el peritoneo y el ovario izquierdo, mostraron distancias significativamente reducidas entre las células tumorales CK+PD-L1+ y los macrófagos CD68+CD11c+ de tipo M1 (Fig. 3c), así como entre las células tumorales y las células T CD8+ (Fig. 3d). Estos hallazgos sugieren una mayor captación y colocalización de las células inmunitarias efectoras dentro del microambiente tumoral en las regiones que responden.

Por el contrario, el análisis de las relaciones inmunitarias-estromales reveló patrones distintos de exclusión espacial. En los sitios sensibles al pembrolizumab, las células T CD8+ se ubicaron más lejos de los macrófagos de tipo M2 CD163+ (Fig. 3e) y los macrófagos CD68+CD11c+ (Fig. 3f), lo que indica una menor exposición a las poblaciones de mieloides supresoras dentro del compartimento del estroma. Por el contrario, en las lesiones resistentes, como el colon y el ovario derecho, estas distancias fueron más cortas, lo que sugiere una posible interacción inhibitoria. En conjunto, estas configuraciones espaciales sugieren que la inmunidad antitumoral eficaz en los sitios metastásicos que responden puede estar impulsada tanto por una mayor interacción entre las células efectoras y los tumores como por la separación espacial de los macrófagos del estroma supresores.

El análisis transcriptómico de una sola célula revela una composición inmunitaria diferencial y la polarización de los macrófagos asociadas con la respuesta al pembrolizumab en el cáncer colorrectal metastásico deficiente en reparación de errores

Para caracterizar de forma exhaustiva el panorama inmunitario que subyace a las respuestas variables al pembrolizumab, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en poblaciones inmunitarias enriquecidas de cuatro lesiones metastásicas (ovario derecho, ovario izquierdo, omento y peritoneo). Se obtuvieron un total de 17 970 transcriptomas de una sola célula de alta calidad, y la agrupación no supervisada delimitó siete compartimentos celulares principales: células T, células NK, macrófagos, células B, células plasmáticas, células epiteliales y células del estroma, en función de los marcadores de linaje canónicos (Fig. 4a; Figura S5 del Apéndice). Entre los subconjuntos inmunitarios, los sitios sensibles al pembrolizumab (ovario izquierdo y peritoneo) mostraron proporciones marcadamente elevadas de células NK en comparación con las lesiones resistentes (ovario derecho y omento) (Fig. 4b), lo que sugiere una relación entre la abundancia de células NK y la respuesta terapéutica. Estas diferencias de composición de una sola célula fueron concordantes con la deconvolución basada en EPIC de la secuenciación de ARN masiva y las mediciones de la densidad celular derivadas de la mIHC, que también indicaron una mayor infiltración inmunitaria en las lesiones que respondían al pembrolizumab (Figuras S2 y S4 del Apéndice).

A continuación, evaluamos los transcritos relacionados con la citotoxicidad en las células T y NK de los diferentes sitios metastásicos (Fig. 4c). Las moléculas efectoras citotóxicas, incluidas GZMB, PRF1, GNLY, IFNG y CD8A/B, se expresaron en mayor medida en las células inmunitarias de las lesiones sensibles al pembrolizumab, lo que indica un programa citolítico más activo. De forma consistente, la puntuación de citotoxicidad compuesta fue mayor en las lesiones sensibles en comparación con las resistentes (P = 0,007; Fig. 4d).

Para investigar el papel de la polarización de los macrófagos en la modulación de la respuesta al pembrolizumab, nos centramos en el análisis de las poblaciones de macrófagos (Fig. 4e). En particular, varios subgrupos de tipo M2 (Figura S4 del Apéndice) se redujeron notablemente en las lesiones sensibles al pembrolizumab, como el ovario izquierdo y el peritoneo (Fig. 4f), lo que sugiere un cambio hacia fenotipos menos supresores en los sitios que responden. A continuación, evaluamos los patrones de expresión génica de los principales transcritos asociados con M1 y M2 en los diferentes sitios (Fig. 4g). SPP1 y TREM2, que representan la polarización de tipo M2, se expresaron de forma más prominente en las lesiones del omento, mientras que los marcadores relacionados con M1, como C1QC y S100A8, se enriquecieron en las regiones sensibles, incluido el peritoneo y el ovario izquierdo. Por último, las puntuaciones de polarización calculadas utilizando las firmas génicas M1 y M2 revelaron tendencias recíprocas: las puntuaciones del módulo M1 se elevaron significativamente en los tumores sensibles (P = 9,35e-36), mientras que las puntuaciones M2 fueron más altas en las lesiones resistentes (P = 6,30e-19) (Fig. 4h). Estos hallazgos demuestran que las metástasis sensibles al pembrolizumab están enriquecidas con linfocitos citotóxicos y macrófagos de tipo M1, mientras que los tumores resistentes albergan estados de macrófagos supresores y una función efectora disminuida.

Las redes de señalización intercelular revelan estados inmunitarios supresores frente a estados inmunitarios activadores en los tumores resistentes e hipersensibles a los inhibidores de los puntos de control inmunitarios

Para dilucidar cómo la interacción tumor-inmunitaria contribuye a las diferentes respuestas al pembrolizumab, realizamos un análisis de la comunicación intercelular utilizando los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de cuatro lesiones metastásicas. Las redes de interacción intercelular globales revelaron diferencias sorprendentes entre los ecosistemas tumorales resistentes e hipersensibles al pembrolizumab (Fig. 5a, Figura S5 del Apéndice). En los tumores resistentes, las células epiteliales mostraron interacciones densas con diversos compartimentos del estroma y del sistema inmunitario, lo que sugiere una arquitectura de señalización dominada por el tumor. Por el contrario, los tumores sensibles se caracterizaron por una comunicación inmune-inmune más extensa, en particular que involucró a las células T CD4+, las células NK y los macrófagos, lo que indica un microambiente inmunológicamente más coordinado.

La comparación cuantitativa de la intensidad de la interacción entre los tipos de células remitentes y receptoras destacó aún más estas distinciones (Fig. 5b). En los tumores sensibles, la mayoría de las poblaciones de células inmunitarias, como las células T CD8+, las células B y los macrófagos, mostraron señales salientes y entrantes más fuertes en relación con los sitios resistentes. Las células epiteliales, por el contrario, mostraron una actividad de señalización limitada en el grupo sensible, con la excepción de las interacciones con las células plasmáticas B. Estos hallazgos subrayan un cambio en el dominio de la señalización desde el epitelio tumoral hasta los componentes inmunitarios en los nichos de respuesta a los inhibidores de los puntos de control inmunitarios.

Cuando se restringió a las poblaciones inmunitarias (Fig. 5c), los tumores sensibles al pembrolizumab mostraron una comunicación intercelular mejorada en múltiples subconjuntos inmunitarios, incluidos las células T CD4+, las células NK y los subtipos de macrófagos no SPP1+. Por el contrario, los macrófagos SPP1+ (TAM) dominaron el panorama de señalización en los tumores resistentes, participando en amplias interacciones con diversas poblaciones inmunitarias. En particular, en los tumores sensibles, los macrófagos SPP1+ estaban relativamente aislados de otros compartimentos inmunitarios, lo que sugiere una influencia supresora reducida. De manera similar, los macrófagos C1QB+ mostraron una conectividad atenuada en las lesiones sensibles, lo que es consistente con un microambiente caracterizado por una disminución del cruce supresor entre los macrófagos y un aumento de la coordinación entre las células inmunitarias efectoras.

El mapeo de las interacciones entre células inmunitarias a nivel de subtipo reveló interacciones selectivamente mejoradas en el grupo sensible (Fig. 5d). Por ejemplo, la comunicación de macrófagos MMP9+ a macrófagos CCL8+, y secuencialmente de macrófagos CCL8+ a subconjuntos APOC1+, reflejó un eje monocito-monocito fortalecido. Además, las células T CD4+ naïvas en el grupo sensible señalaron activamente a las células T CD8+ efectoras, lo que sugiere una activación productiva de antígenos y de las células T. Por el contrario, los tumores resistentes demostraron una señalización inmunosupresora impulsada por macrófagos SPP1+ hacia las células T CD8+ naïvas y exhaustas, así como interacciones mejoradas de las células T reguladoras (Treg) con las células T CD8+ naïvas; ambas características son consistentes con la exclusión inmune y la resistencia a los puntos de control inmunitario.

El análisis a nivel de vía reveló patrones distintos de uso de ligandos y receptores en tumores resistentes y sensibles (Fig. 5e). En los tumores sensibles, los módulos de activación inmune (incluidos la galectina, la midkina (MK), las quimiocinas CCL y CXCL, y la anexina) estaban regulados al alza, lo que es consistente con el reclutamiento de células T y NK y la activación citotóxica. En particular, LIGHT (TNFSF14), una señal coestimuladora de las células T, estaba elevada en las lesiones sensibles, lo que apoya su papel en el aumento de la eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI). Por el contrario, los tumores resistentes exhibieron una señalización aumentada a través de ejes inmunosupresores o pro-tumorales, como PLAU, TGF-β, VEGF, SPP1 y MIF. Entre estos, MIF surgió como una citocina dominante en los tumores resistentes, lo que se alinea con su conocido papel en la inducción de la polarización de macrófagos M2 y la promoción de la evasión inmune. Señales adicionales asociadas a la resistencia, como CypA, Semaphorin (SEMA3) y Visfatin, subrayaron aún más la presencia de un nicho de remodelación de la matriz e inmunosupresión.

Finalmente, una evaluación enfocada de las redes de señalización paracrina reveló una utilización distinta de los ejes WNT y TGF-β en los grupos de respuesta (Fig. 5f). Los ligandos TGF-β canónicos y sus receptores cognados (por ejemplo, TGFB1/2/3–TGFBR1/2) se enriquecieron preferentemente en los tumores sensibles, lo que posiblemente refleja una activación impulsada por la retroalimentación en un contexto inflamado. Por el contrario, las señales TGF-β no canónicas, particularmente aquellas que involucran TGFB2/3–ACVRL1 y socios relacionados, estaban elevadas en los tumores resistentes. De manera similar, los ligandos WNT no canónicos (WNT5A, WNT5B y WNT11) y sus receptores (por ejemplo, FZD4 y FZD6) estaban predominantemente activos en el grupo resistente, lo que es consistente con una mayor interacción tumor-macrófago y evidencia previa que vincula estos ejes con la resistencia mediada por macrófagos.

En conjunto, estos hallazgos indican que la sensibilidad a pembrolizumab está asociada con una comunicación inmune-inmune enriquecida, vías de señalización de activación inmune y exclusión espacial/funcional de macrófagos supresores inmunitarios (TAM). Por el contrario, los sitios metastásicos resistentes están dominados por circuitos supresores centrados en el epitelio y mediados por macrófagos tipo M2, caracterizados por la señalización TGF-β y WNT no canónica. Estos paisajes de señalización intercelular pueden sustentar la diferente capacidad de respuesta terapéutica observada en los nichos metastásicos del CRC dMMR.

Basándose en estas observaciones, la Fig. 6 presenta un modelo espacial-molecular integrado en el que el carcinoma de colon primario siembra cuatro nichos metastásicos: omento, peritoneo y ovarios bilaterales, que se bifurcan en cohortes sensibles a pembrolizumab (peritoneo y ovario izquierdo) y resistentes (omento y ovario derecho). En los sitios sensibles, las células tumorales CK+PD-L1+ están estrechamente colocalizadas con macrófagos tipo M1 CD68+ y células T CD8+, exhiben programas de presentación de antígenos citolíticos, IFN-γ y MHC-I/II mejorados, y excluyen espacialmente los macrófagos tipo M2 CD163+. Por el contrario, las lesiones resistentes muestran proximidad CK+PD-L1+–CD163+, infiltración celular efectora alterada y enriquecimiento de redes de citocinas inmunosupresoras y factores de remodelación de la matriz (por ejemplo, MMP), encapsulando así la eficacia específica del sitio de los ICI en el CRC dMMR.

Discusión

Los ICI han transformado el panorama del tratamiento del CRC deficiente en reparación de errores de emparejamiento (dMMR), pero las respuestas duraderas se limitan a menos de la mitad de los pacientes (KEYNOTE-177, tasa de respuesta ~44%). Aunque los tumores dMMR, caracterizados por MSI-H y alta carga mutacional tumoral (TMB), están infiltrados por células T [[21–23]], las respuestas terapéuticas, particularmente en entornos metastásicos, siguen siendo impredecibles. Para abordar esto, realizamos análisis proteómicos espaciales y transcriptómicos de células individuales de múltiples lesiones metastásicas de un único paciente con CRC dMMR tratado con pembrolizumab.

A pesar del origen clonal, las lesiones metastásicas divergieron significativamente en su arquitectura inmune y respuesta al tratamiento. Basándose en la infiltración de células T, la expresión de PD-L1 y la proximidad de las células citotóxicas al epitelio tumoral, las lesiones se clasificaron como inmuno-altas (responsivas) o inmuno-bajas (no responsivas), lo que apoya la noción de que la eficacia terapéutica depende no solo de la carga mutacional, sino también del contexto inmune regional. Esta clasificación se respaldó mediante la cuantificación ortogonal de la infiltración inmune utilizando tanto la deconvolución EPIC de ARN-seq a granel como las mediciones de densidad celular basadas en mIHC, que mostraron de manera consistente una mayor infiltración de células T CD8+ y macrófagos en las lesiones sensibles a pembrolizumab. El perfilado de scRNA-seq mostró proporciones ampliamente comparables de las principales líneas celulares inmunes en los sitios metastásicos, pero la distribución de los subconjuntos citotóxicos reveló diferencias claras alineadas con la respuesta terapéutica. Las lesiones sensibles a pembrolizumab (ovario izquierdo y peritoneo) mostraron frecuencias más altas de células NK y células T CD8+ efectoras, mientras que las lesiones resistentes estaban relativamente desprovistas de estas poblaciones citotóxicas. Esto indica que la activación inmune funcional, no la abundancia general de la línea celular, captura mejor la capacidad de respuesta al bloqueo de PD-1. Por el contrario, las lesiones resistentes se enriquecieron con estados de macrófagos CD163-alto, SPP1+, CXCL8+ y CCL8+, consistentes con la remodelación inmunosupresora. En conjunto, estos datos sugieren que la actividad efectora citotóxica y la polarización de los macrófagos, en lugar de la composición inmune general, son determinantes clave de los resultados terapéuticos divergentes.

Aunque el paciente finalmente logró un control a largo plazo de la enfermedad después de la terapia con pembrolizumab, los estados inmunes heterogéneos observados en los sitios metastásicos probablemente reflejen las interacciones específicas de la lesión con el tratamiento al inicio, en lugar de los determinantes del resultado clínico final. Las diferentes arquitecturas inmunes proporcionan, por lo tanto, información sobre las distintas trayectorias microambientales que cada lesión sigue al exponerse al bloqueo de PD-1, ofreciendo un marco mecanicista para comprender por qué algunos sitios pueden responder inicialmente o permanecer refractarios, incluso dentro del mismo paciente [^[24]]. Aunque se basa en un solo caso, la divergencia inmune específica de la lesión que observamos es ampliamente consistente con los patrones informados en el inmunoperfilado multi-sitio en otros tumores sólidos. Esta concordancia sugiere que esta heterogeneidad espacial puede reflejar principios biológicos generalizables, aunque la confirmación en cohortes más grandes será esencial.

Un factor diferenciador clave fue la polarización de los TAM. Las lesiones responsivas (por ejemplo, peritoneo, ovario izquierdo) se enriquecieron en macrófagos tipo M1 que expresan IL-12, TNF-α y efectores citotóxicos, mientras que las lesiones resistentes (por ejemplo, omento, ovario derecho) estaban dominadas por macrófagos tipo M2, particularmente fenotipos SPP1+ y asociados con TGF-β, consistentes con microambientes inmunosupresores [^[25]]. El análisis de células individuales reveló que los TAM SPP1+ en las lesiones resistentes participaron en una fuerte interacción cruzada inmunosupresora con las células T, mientras que en las lesiones sensibles, estaban espacial y funcionalmente excluidos de la comunicación inmune. Los macrófagos C1QB+ mostraron una tendencia similar. En línea con estos patrones transcripcionales, la organización espacial de las células T CD8+ y los macrófagos CD68+CD11c+ también varió en las lesiones metastásicas (Figura S8 complementaria). Coherente con las tendencias observadas en el análisis de proximidad, las lesiones responsivas a pembrolizumab, como el ovario izquierdo y el peritoneo, mostraron una mayor separación CD8-M1 en comparación con el omento y el colon. En particular, sin embargo, el ovario derecho demostró una separación desproporcionadamente grande (>200 µm), superando con creces todas las demás lesiones. Esta disociación extrema indica que el desacoplamiento espacial profundo de las células T efectoras de los macrófagos proinflamatorios puede caracterizar el nicho metastásico más refractario al tratamiento, incluso si la proximidad CD8-M1 por sí sola no explica completamente el patrón de respuesta dicotómico.

Además, los tumores inmuno-altos exhibieron vías inmunoestimulantes enriquecidas, que incluyen la galectina, MK, las quimiocinas CCL/CXCL y las anexinas, que promueven el reclutamiento y la activación de las células T. Por el contrario, las lesiones resistentes regularon al alza las señales supresoras, como TGF-β, VEGF, SPP1, MIF y Visfatin, a menudo asociadas con la exclusión inmune y la remodelación de la matriz. La señalización TGF-β canónica fue más evidente en los tumores sensibles, mientras que las vías no canónicas (por ejemplo, WNT5A/B, SEMA3 y ANGPTL) se enriquecieron en los sitios resistentes.

Estos hallazgos se alinean con la comprensión más amplia de que, si bien los CRC dMMR son generalmente inmunogénicos, las respuestas a los ICI siguen siendo variables. Estudios previos han propuesto varios marcadores predictivos, que incluyen la expresión de PD-L1, las mutaciones KRAS/BRAF, el estado del síndrome de Lynch, la infiltración de células T CD8+ y la TMB [[26–28]], pero ninguno explica suficientemente los resultados específicos de la lesión. Nuestro estudio sugiere que la arquitectura inmune espacial y los patrones de comunicación celular son determinantes críticos de la respuesta a los ICI.

Una limitación clave de nuestro estudio es el alcance de un solo paciente, lo que limita la generalizabilidad. No obstante, el perfilado multi-sitio proporciona información valiosa sobre la heterogeneidad intra-paciente. Los estudios futuros deberían ampliar este enfoque a cohortes más amplias para validar las asociaciones observadas.

Conclusión

En resumen, presentamos un marco resuelto espacialmente que vincula la polarización de los macrófagos, el contexto inmune y la comunicación entre células con la respuesta terapéutica en el CRC dMMR metastásico. Estos hallazgos respaldan la incorporación del perfilado inmune espacial en las estrategias de inmunoterapia de precisión para el CRC dMMR.