Mejora de la actividad de las células NK en el cáncer colorrectal mediante un anticuerpo optimizado para la región Fc que se dirige contra CD276 (B7-H3).

El cáncer colorrectal (CCR) es actualmente el tercer cáncer más frecuente en el mundo, y se observa un aumento de las tasas de diagnóstico, especialmente entre los individuos más jóvenes. Cabe destacar que el CCR ocupa el segundo lugar en términos de mortalidad por cáncer, superado únicamente por el cáncer de pulmón.^[1] La considerable mortalidad del CCR se debe principalmente al mal pronóstico en los casos metastásicos, donde la tasa de supervivencia a 5 años es de aproximadamente el 20%^[2] y casi el 50% de los pacientes son diagnosticados con enfermedad metastásica primaria o secundaria.^[3] En el entorno metastásico, el tratamiento sigue dependiendo principalmente de la quimioterapia, a menudo complementada con anticuerpos monoclonales (AcM) que inhiben las vías del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR);[4–6] sin embargo, estos enfoques siguen sin ser curativos. Los inhibidores del punto de control inmunitario (ICPI) han demostrado ser eficaces en otros cánceres, pero su eficacia en el CCR se limita en gran medida a los tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H).[7–10] El CCR con microsatélites estables (MSS), que representa la mayoría de los casos de CCR, se caracteriza por una baja carga mutacional tumoral y un microambiente tumoral inmunosupresor.[11–13] Estas características limitan la eficacia de las terapias mediadas por células T, como los ICPI.^[14] En cambio, las células asesinas naturales (NK) pueden mediar respuestas citotóxicas independientemente de la carga mutacional tumoral o la presentación de antígenos, lo que las convierte en efectores prometedores para el tratamiento del CCR MSS.^[15],^[16] La ausencia de inmunoterapias igualmente eficaces para la población general de pacientes con CCR, junto con el sombrío pronóstico en la enfermedad metastásica, subraya la urgencia de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento.

Los AcM han sido durante mucho tiempo un componente integral en el manejo del CCR, y los agentes dirigidos al EGFR, como el cetuximab o el panitumumab, se utilizan para impedir la progresión tumoral^[17],^[18] y los anticuerpos dirigidos al VEGFR, como el bevacizumab, se utilizan para suprimir la angiogénesis inducida por el tumor.^[19] Si bien la implementación clínica de estos agentes ha contribuido a los avances terapéuticos, su eficacia general sigue siendo limitada y no son curativos. Los esfuerzos para desarrollar anticuerpos adaptados a objetivos específicos del tumor están en curso^[20] y han mostrado resultados prometedores en etapas tempranas. Sin embargo, estos agentes aún no forman parte de la práctica clínica de rutina y siguen siendo objeto de optimización, por ejemplo, mediante el aumento de su capacidad para desencadenar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

La ADCC representa un mecanismo efector central desencadenado por la terapia con AcM, y las células NK actúan como la principal población efectora implicada.^[21],^[22] Para amplificar las respuestas de ADCC, el dominio Fc del AcM terapéutico puede modificarse estructuralmente, ya sea mediante la glicoingeniería, como se ejemplifica con el AcM dirigido al CD20, obinutuzumab, aprobado por la FDA y utilizado en neoplasias de células B, o mediante la introducción de mutaciones específicas de aminoácidos, como S239D/I332E (SDIE).^[23] Estas modificaciones pueden mejorar la afinidad de unión de Fc a los receptores Fc (FcR), lo que generalmente ejerce un efecto activador más pronunciado sobre el Fc RIIIa/CD16a que sobre el receptor inhibidor Fc RIIb/CD32b.^[24] No obstante, la ampliación de la utilidad clínica de estos anticuerpos modificados a otros tipos de cáncer requiere la identificación de objetivos tumorales adecuados, es decir, antígenos que se expresen abundantemente en las células cancerosas pero que estén mínimamente presentes en los tejidos sanos.

En este contexto, el CD276 (B7-H3), un miembro de la familia de puntos de control inmunitario B7, ha atraído recientemente el interés debido a su expresión predominante en el tejido tumoral y su asociación con la neovasculatura y el microambiente, como se observa en el CCR.^[25],^[26] Si bien también se detecta en niveles más bajos en ciertos subconjuntos de células inmunitarias, como las células presentadoras de antígenos y los monocitos,^[27] su expresión restringida en los tejidos sanos y su sobreexpresión constante en las neoplasias respaldan su candidatura como un objetivo terapéutico prometedor. Se cree que el CD276 contribuye a la evasión inmune tumoral al inhibir tanto las respuestas de las células T como de las células NK, aunque sus funciones inmunomoduladoras aún se están dilucidando. Se ha relacionado una expresión elevada de CD276 con resultados clínicos desfavorables en múltiples tipos de cáncer.[28–31] En consecuencia, el CD276 se reconoce cada vez más como un candidato viable para las intervenciones terapéuticas de nueva generación.^[32],^[33]

Nuestro grupo ha investigado previamente el Ac dirigido al CD276, 8H8_SDIE, con ingeniería en el dominio Fc, en varios modelos tumorales, incluido el mieloma agudo (AML),^[31] el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM),^[34], el sarcoma,^[33] y otros,^[35],^[36], donde mostró una robusta activación de las células NK y la lisis de las células diana. Basándonos en estos hallazgos, ahora investigamos si este enfoque inmunoterapéutico también es aplicable al CCR. Dada la distinta composición inmunitaria y la escasa respuesta a los ICPI del CCR MSS, buscamos explorar el potencial terapéutico del direccionamiento de CD276 mediado por células NK y mejorado por Fc en este contexto.

En consecuencia, caracterizamos la expresión de CD276 en las líneas celulares de CCR y evaluamos la capacidad de 8H8_SDIE, un nuevo Ac dirigido al CD276 con ingeniería en el dominio Fc, para activar las células NK y mejorar su respuesta citotóxica contra el CCR.

Materiales y Métodos

Células mononucleares de sangre periférica y líneas celulares

Las líneas celulares de CCR, incluidas CaCo-2, Colo-205, HCT-116, HT-29 y SW620, se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) y del Banco de Cultivos de Células Americano (Manassas, VA, EE. UU.). Todos los cultivos celulares se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma trimestralmente. La autenticación de las líneas celulares se confirmó mediante inmunofenotipificación por citometría de flujo, siguiendo las directrices proporcionadas por el proveedor.

Las células mononucleares de sangre periférica (CMBP) se recogieron de donantes adultos sanos de diferentes edades y sexos, asignados aleatoriamente a experimentos individuales. El aislamiento se realizó mediante centrifugación de gradiente de densidad basada en Ficoll (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania, Cat#P04-601,000), y las CMBP se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Antes de su uso en ensayos funcionales, las células se descongelaron y se incubaron a 37 °C durante 24 h en medio RPMI 1640 enriquecido con GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat#72400-054), suero fetal bovino inactivado térmicamente al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania, Cat#FBS-HI-12A) y antibióticos (penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 µg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU., Cat#P06-07100). Las muestras de donantes sanos se seleccionaron aleatoriamente sin criterios predefinidos para reflejar la variabilidad biológica y evitar el sesgo de selección. Los experimentos clave se realizaron con ≥3 donantes independientes utilizando protocolos estandarizados en diferentes días para minimizar los efectos de lote.

Se utilizaron CMBP en lugar de células NK purificadas para replicar mejor el contexto celular fisiológico y preservar las interacciones accesorias que influyen en la activación y la citotoxicidad de las células NK. Todos los donantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Tubinga y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Producción y purificación de anticuerpos

Se generó previamente un Ac anti-CD276 de origen murino y se quimerizó fusionando sus regiones variables con los dominios constantes de la inmunoglobulina G1 humana (IgG1) para obtener un formato de anticuerpo compatible con humanos.^[31] Se realizó la optimización de Fc introduciendo las sustituciones de aminoácidos S239D/I332E (SDIE) en la región Fc, que se sabe que aumentan la afinidad de unión a los receptores Fc (FcR) y mejoran la ADCC mediada por células NK. La estrategia de generación e ingeniería se estableció y validó originalmente en el contexto de los anticuerpos dirigidos a FLT3, como se describe en Hofmann et al (2012).^[37] Para la producción de anticuerpos, los plásmidos de cadena pesada y cadena ligera se prepararon utilizando el kit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transfectaron en células ExpiCHO (Gibco, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad con proteína A (GE Healthcare), seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) para garantizar la preparación de anticuerpos monoméricos. La pureza y la integridad se verificaron mediante SEC analítica (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare) y SDS-PAGE al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA), lo que confirmó el peso molecular esperado y la ausencia de productos de degradación. El anticuerpo de control isotípico (MOPCSDIE) se generó de forma análoga utilizando el clon murino MOPC-21 quimerizado con las regiones constantes de IgG1 humana y modificado con las mutaciones SDIE para que coincida con el perfil de Fc de 8H8SDIE.

Citometría de flujo

Antes del análisis por citometría de flujo, las células se preincubaron con IgG humana o murina (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, Cat#I4506; Southern Biontech, Birmingham, AL, EE. UU., Cat#0107-01, respectivamente) para reducir la unión inespecífica de anticuerpos. Posteriormente, las células se tiñeron con anti-CD276-PE/Cy7 murino (clon MIH42, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU., Cat# 351008), 8H8SDIE o controles isotípicos correspondientes (Cat #557872; BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.). La detección secundaria se realizó utilizando anticuerpo anti-ratón PE (DAKO, Glostrup, Dinamarca, Cat# R0480) o anticuerpo anti-humano PE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU., Cat# 109-116-097). Se utilizaron los anticuerpos fluorescentes CD3-APC (clon SK7, BD Pharmingen, Cat# 555335) y CD56-PE/Cy7 (clon HCD56, BioLegend, Cat# 318318) para identificar las células NK. Las citocinas intracelulares IFNγ y TNF se detectaron tras la incubación con los reactivos GolgiStop y GolgiPlug (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania, Cat#554724, 55029, respectivamente). Después de la tinción con CD56, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando un sistema de tampones de permeabilización comercial (Fixation/Permeabilization Solution Kit, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania, Cat#51-2090KZ). La tinción intracelular implicó el uso de anticuerpo anti-IFNγ murino-BV421 (clon B27, Cat# 506538) y anticuerpo anti-TNF murino-BV785 (clon Mab11, Cat#502948; ambos de BioLegend). Para los ensayos de citotoxicidad, las células de CCR se etiquetaron con el colorante de proliferación CellTrace™ Violet (2,5 mM; Thermo Fisher Scientific, Cat# C34557) y se cocultivaron con CMBP de voluntarios sanos, en presencia o ausencia de los anticuerpos (1 µg/mL). Para estandarizar el volumen de adquisición, se añadieron cuentas de silicona (Merck KGaA, Cat#LB30-2ML) a todos los tubos. Las células no viables se excluyeron mediante la tinción con un colorante de viabilidad con 7-AAD (BioLegend, Cat# 420404) o LIVE/DEAD™ Fixable Aqua (Cat# L34966; Thermo Fisher Scientific). La citometría de flujo se realizó utilizando los instrumentos FACS CANTO II o FACS Fortessa (BD Biosciences), y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo v10 (FlowJo LLC, Ashland, OR, EE. UU.). La expresión de los marcadores de superficie se calculó como intensidad media de fluorescencia (IMF) y representa la señal de fluorescencia absoluta de las poblaciones teñidas con antígeno en comparación con las poblaciones teñidas con control isotípico. La expresión de CD276 se validó inicialmente utilizando un anticuerpo comercial (BioLegend) para confirmar la presencia del objetivo en las líneas celulares de CCR. A continuación, se realizó el análisis funcional y de unión utilizando 8H8SDIE. Los resultados de unión se interpretaron cualitativamente y no se utilizaron para comparar directamente las afinidades de unión.

Las estrategias de segmentación de la citometría de flujo para los subconjuntos de células NK y los marcadores de activación (CD107a, CD25, CD69) se proporcionan en la Figura S1 del material suplementario. Para cada muestra, se adquirieron un mínimo de 100 000 eventos después de la segmentación en linfocitos. Se incluyeron controles no teñidos, teñidos individualmente y de fluorescencia menos uno (FMO) para garantizar una segmentación precisa.

Análisis de la función de las células NK: activación, desgranulación y secreción de citocinas

Para evaluar la activación de las células NK, se cultivaron en co-cultivo PBMC derivadas de donantes sanos con células de CCRC en una relación efector:efector (E:E) de 2,5:1, utilizando 500.000 PBMC y 200.000 células tumorales por condición. Los tratamientos se aplicaron a una concentración de 1 µg/mL durante el co-cultivo. Para evaluar la desgranulación de las células NK, se añadieron GolgiPlug y GolgiStop (BD Biosciences) al medio de cultivo, y después de 4 horas, se recogieron las células, se caracterizaron como CD3- CD56+ y se tiñeron con CD107a-PE (clon H4A3, BD Pharmingen, Cat# 555801) y un tinte de viabilidad (Fixable Aqua), seguido de citometría de flujo. La activación de las células NK se evaluó además mediante la tinción con CD69-PE (clon FN50, BD Pharmingen, Cat# 555531) y CD25-PE (clon BC96, BioLegend, Cat# 302606) después de 24 y 72 horas. La producción de citocinas se determinó en sobrenadantes libres de células recogidos después de 24 horas de cultivo. Las concentraciones de granzima A, granzima B, perforina, granulina, TNF, IL-2, IFNγ e IL-10 se cuantificaron utilizando el ensayo multiplex basado en microesferas Legendplex (BioLegend, Cat# 741186) siguiendo el protocolo del fabricante.

Evaluación de la citotoxicidad de las células NK

Se investigó la capacidad de las células NK dentro de las PBMC de individuos sanos para lisar líneas celulares de CCRC mediante el co-cultivo en presencia o ausencia de 8H8SDIE o MOPCSDIE (1 µg/mL), utilizando el ensayo de citotoxicidad celular DELFIA (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU., Cat# C136-100; C135-100). Después de una incubación de 2 horas, la citotoxicidad se cuantificó según las instrucciones del proveedor. La lisis específica se calculó basándose en la siguiente ecuación:

Lisis específica (%) = 100 × (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)

Para monitorizar la citotoxicidad de forma dinámica, se empleó el sistema xCELLigence RTCA (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania). Las líneas celulares de CCRC se sembraron en placas electrónicas de 96 pocillos e incubaron durante 24 horas para permitir la adhesión. Posteriormente, se añadieron PBMC de donantes sanos a los pocillos y se cultivaron en co-cultivo con células tumorales a una relación E:E de 40:1, ya sea en presencia o ausencia de 1 µg/mL de 8H8_SDIE y su anticuerpo de control. Las lecturas de impedancia en tiempo real de la actividad citolítica se recogieron cada 15 minutos durante un máximo de 150 horas, generando una cinética detallada de la citotoxicidad.

Minería de datos transcriptómicos

Los niveles de transcripción de CD276 se evaluaron utilizando datos públicos de secuenciación de ARN (RNA-seq) obtenidos de la plataforma UCSC Xena (conjunto de datos: TCGA TARGET GTEx: expresión génica RNAseq: TOIL RSEM TPM; host: toil.xenahubs.net). Específicamente, se compararon las muestras de TCGA COADREAD (adenocarcinoma de colon y recto) con el tejido normal de colon de GTEx.

Análisis estadístico

A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Se seleccionaron los métodos estadísticos apropiados en función de la distribución y el diseño de cada experimento, incluyendo la prueba t de Student, ANOVA de una vía, la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de rango logarítmico, según corresponda. Todos los análisis se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 10.1.1. Se consideró que un umbral de p < 0,05 era estadísticamente significativo, y los niveles de significación se anotaron como *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001. Los indicadores de significación (p < 0,05) solo se aplicaron a las comparaciones que involucraban tamaños de muestra adecuadamente representativos (n ≥ 3), mientras que los resultados no significativos se informaron sin anotación.

Células mononucleares de sangre periférica y líneas celulares

Las líneas celulares de CCRC, incluyendo CaCo-2, Colo-205, HCT-116, HT-29 y SW620, se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) y del Banco de Cultivos de Células de Tipo Americano (Manassas, VA, EE. UU.). Todos los cultivos celulares se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma trimestralmente. Se confirmó la autenticación de las líneas celulares mediante inmunofenotipado citométrico de flujo, siguiendo las directrices proporcionadas por el proveedor.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se recogieron de donantes adultos sanos de edades y sexos variables, asignados aleatoriamente a experimentos individuales. El aislamiento se realizó mediante centrifugación de gradiente de densidad basada en Ficoll (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania, Cat#P04-601,000), y las PBMC se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Antes de su uso en ensayos funcionales, las células se descongelaron e incubaron a 37 °C durante 24 horas en medio RPMI 1640 enriquecido con GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat#72400-054), suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania, Cat#FBS-HI-12A) y antibióticos (penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 µg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU., Cat#P06-07100). Las muestras de donantes sanos se seleccionaron aleatoriamente sin criterios predefinidos para reflejar la variabilidad biológica y evitar el sesgo de selección. Los experimentos clave se llevaron a cabo con ≥ 3 donantes independientes utilizando protocolos estandarizados en diferentes días para minimizar los efectos de lote.

Se utilizaron PBMC en lugar de células NK purificadas para replicar mejor el contexto celular fisiológico y preservar las interacciones accesorias que influyen en la activación y la citotoxicidad de las células NK. Todos los donantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Tubinga y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Producción y purificación de anticuerpos

Se generó previamente un anticuerpo monoclonal anti-CD276 de origen murino (clon 8H8) y se quimerizó fusionando sus regiones variables con los dominios constantes de la inmunoglobulina G1 humana (IgG1) para obtener un formato de anticuerpo compatible con humanos.^[31] Se realizó la optimización de la región Fc introduciendo las sustituciones de aminoácidos S239D/I332E (SDIE) en la región Fc, que se sabe que aumentan la afinidad de unión a Fc RIIIa/CD16a y mejoran la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por células NK (ADCC). La estrategia de generación e ingeniería se estableció y validó originalmente en el contexto de los anticuerpos dirigidos a FLT3, como se describe en Hofmann et al (2012).^[37] Para la producción de anticuerpos, se prepararon plásmidos de cadena pesada y cadena ligera utilizando el kit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transfectaron en células ExpiCHO (Gibco, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad con proteína A (GE Healthcare), seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) para garantizar la preparación de anticuerpos monoméricos. Se verificó la pureza y la integridad mediante SEC analítico (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare) y SDS-PAGE al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA), confirmando el peso molecular esperado y la ausencia de productos de degradación. El anticuerpo de control isotípico (MOPCSDIE) se generó de forma análoga utilizando el clon murino MOPC-21 quimerizado con las regiones constantes de IgG1 humana y modificado con mutaciones SDIE para que coincida con el perfil de la región Fc de 8H8SDIE.

Citometría de flujo

Antes del análisis por citometría de flujo, las células se preincubaron con IgG humana o murina (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, Cat#I4506; Southern Biontech, Birmingham, AL, EE. UU., Cat#0107-01, respectivamente) para reducir la unión inespecífica de anticuerpos. Posteriormente, las células se tiñeron con anti-CD276-PE/Cy7 murino (clon MIH42, BioLegend, San Diego, CA, EE. UU., Cat# 351008), 8H8SDIE o controles isotípicos correspondientes (Cat# 557872; BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.). La detección secundaria se llevó a cabo utilizando PE anti-ratón (DAKO, Glostrup, Dinamarca, Cat# R0480) o PE anti-humano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU., Cat# 109-116-097). Se utilizaron los anticuerpos fluorescentes CD3-APC (clon SK7, BD Pharmingen, Cat# 555335) y CD56-PE/Cy7 (clon HCD56, BioLegend, Cat# 318318) para identificar las células NK. Las citocinas intracelulares IFNγ y TNF se detectaron tras la incubación con los reactivos GolgiStop y GolgiPlug (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania, Cat#554724, 55029, respectivamente). Después de la tinción con CD56, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando un sistema de permeabilización comercial (Fixation/Permeabilization Solution Kit, BD Biosciences, Heidelberg, Alemania, Cat#51-2090KZ). La tinción intracelular implicó el uso de anti-IFNγ murino-BV421 (clon B27, Cat# 506538) y anti-TNF murino-BV785 (clon Mab11, Cat#502948; ambos de BioLegend). Para los ensayos de citotoxicidad, las células de CCRC se etiquetaron con el tinte de proliferación CellTrace™ Violet (2,5 mM; Thermo Fisher Scientific, Cat# C34557) y se cultivaron en co-cultivo con PBMC de voluntarios sanos, en presencia o ausencia de los anticuerpos (1 µg/mL). Para estandarizar el volumen de adquisición, se añadieron microesferas de silicona (Merck KGaA, Cat#LB30-2ML) a todos los tubos. Las células no viables se excluyeron mediante la tinción con un tinte de viabilidad con 7-AAD (BioLegend, Cat# 420404) o LIVE/DEAD™ Fixable Aqua (Cat# L34966; Thermo Fisher Scientific). La citometría de flujo se realizó utilizando los instrumentos FACS CANTO II o FACS Fortessa (BD Biosciences), y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo v10 (FlowJo LLC, Ashland, OR, EE. UU.). La expresión de los marcadores de superficie se calculó como intensidad media de fluorescencia (MFI) y representa la señal de fluorescencia absoluta de las poblaciones teñidas con antígeno en comparación con las poblaciones teñidas con control isotípico. La expresión de CD276 se validó inicialmente utilizando un anticuerpo comercial (BioLegend) para confirmar la presencia del objetivo en las líneas celulares de CCRC. A continuación, se realizó un análisis funcional y de unión utilizando 8H8SDIE. Los resultados de la unión se interpretaron cualitativamente y no se utilizaron para comparar directamente las afinidades de unión.

Las estrategias de selección de la citometría de flujo para los subconjuntos de células NK y los marcadores de activación (CD107a, CD25, CD69) se proporcionan en la Figura S1 suplementaria. Para cada muestra, se adquirieron un mínimo de 100.000 eventos después de la selección de linfocitos. Se incluyeron controles no teñidos, teñidos con un solo color y con fluorescencia menos uno (FMO) para garantizar una selección precisa.

Análisis de la función de las células NK: activación, desgranulación y secreción de citocinas

Para evaluar la activación de las células NK, se cultivaron en co-cultivo PBMC derivadas de donantes sanos con células de CCRC en una relación efector:efector (E:E) de 2,5:1, utilizando 500.000 PBMC y 200.000 células tumorales por condición. Los tratamientos se aplicaron a una concentración de 1 µg/mL durante el co-cultivo. Para evaluar la desgranulación de las células NK, se añadieron GolgiPlug y GolgiStop (BD Biosciences) al medio de cultivo, y después de 4 horas, se recogieron las células, se caracterizaron como CD3- CD56+ y se tiñeron con CD107a-PE (clon H4A3, BD Pharmingen, Cat# 555801) y un tinte de viabilidad (Fixable Aqua), seguido de citometría de flujo. La activación de las células NK se evaluó además mediante la tinción con CD69-PE (clon FN50, BD Pharmingen, Cat# 555531) y CD25-PE (clon BC96, BioLegend, Cat# 302606) después de 24 y 72 horas. La producción de citocinas se determinó en sobrenadantes libres de células recogidos después de 24 horas de cultivo. Las concentraciones de granzima A, granzima B, perforina, granulina, TNF, IL-2, IFNγ e IL-10 se cuantificaron utilizando el ensayo multiplex basado en microesferas Legendplex (BioLegend, Cat# 741186) siguiendo el protocolo del fabricante.

Evaluación de la citotoxicidad de las células NK

Se investigó la capacidad de las células NK dentro de las PBMC de individuos sanos para lisar líneas celulares de CCRC mediante el co-cultivo en presencia o ausencia de 8H8SDIE o MOPCSDIE (1 µg/mL), utilizando el ensayo de citotoxicidad celular DELFIA (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU., Cat# C136-100; C135-100). Después de una incubación de 2 horas, la citotoxicidad se cuantificó según las instrucciones del proveedor. La lisis específica se calculó basándose en la siguiente ecuación:

Lisis específica (%) = 100 × (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)

Para monitorizar la citotoxicidad de forma dinámica, se empleó el sistema xCELLigence RTCA (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania). Las líneas celulares de CCRC se sembraron en placas electrónicas de 96 pocillos e incubaron durante 24 horas para permitir la adhesión. Posteriormente, se añadieron PBMC de donantes sanos a los pocillos y se cultivaron en co-cultivo con células tumorales a una relación E:E de 40:1, ya sea en presencia o ausencia de 1 µg/mL de 8H8_SDIE y su anticuerpo de control. Las lecturas de impedancia en tiempo real de la actividad citolítica se recogieron cada 15 minutos durante un máximo de 150 horas, generando una cinética detallada de la citotoxicidad.

Minería de datos transcriptómicos

Los niveles de transcripción de CD276 se evaluaron utilizando datos públicos de secuenciación de ARN obtenidos de la plataforma UCSC Xena (conjunto de datos: TCGA TARGET GTEx: expresión génica RNAseq: TOIL RSEM TPM; host: toil.xenahubs.net). Específicamente, se compararon las muestras de TCGA COADREAD (adenocarcinoma de colon y recto) con el tejido normal de colon de GTEx.

Análisis estadístico

A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Se seleccionaron los métodos estadísticos apropiados en función de la distribución y el diseño de cada experimento, incluidos la prueba t de Student, ANOVA de una vía, la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de rango logarítmico, según corresponda. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando GraphPad Prism versión 10.1.1. Se consideró que un umbral de p < 0,05 era estadísticamente significativo, y los niveles de significación se anotaron como *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001. Los indicadores de significación (p < 0,05) solo se aplicaron a las comparaciones que involucraban tamaños de muestra adecuadamente representativos (n ≥ 3), mientras que los resultados no significativos se informaron sin anotación.

Resultados

Expresión superficial de CD276 en líneas celulares de CCRC

Para examinar los niveles de transcripción de CD276, se analizaron los datos obtenidos de las bases de datos TGCA, TARGET y GTEx a través de la plataforma Xena,^[38], comparando los tejidos normales del colon (n = 308) con los especímenes de adenocarcinoma primario (n = 288). Los resultados demostraron niveles significativamente elevados de ARNm de CD276 en el adenocarcinoma en relación con los tejidos normales (Figura 1A). A continuación, se evaluó la expresión superficial de CD276 en varias líneas celulares de CCRC, que incluyeron: CaCo2, Colo-205, HCT-116, HT-29 y SW620. La citometría de flujo indicó altos niveles de proteína CD276 en todas las líneas celulares probadas (Figura 1B).

La Figura 1C proporciona un diagrama del anticuerpo CD276 modificado con la región Fc, 8H8SDIE. Para probar la unión del anticuerpo a su objetivo, se utilizó la citometría de flujo para evaluar la unión de 8H8SDIE a las líneas celulares de CCRC en un rango de concentraciones. La intensidad de unión, medida como MFI, aumentó hasta 1 µg/mL y alcanzó la saturación entre 1 y 10 µg/mL en todas las líneas celulares de CCRC probadas (Figura 1D). Estos resultados destacan tanto la expresión elevada de CD276 en el CCRC como la unión estable de 8H8_SDIE en los modelos de CCRC, y respaldan su uso en ensayos funcionales.

Activación de las células NK por 8H8_SDIE en modelos de cocultivo de CCRC CD276-positivo

Para evaluar si 8H8SDIE puede mejorar la actividad de las células NK contra los objetivos del CCRC, se realizaron ensayos de cocultivo utilizando PBMCs derivadas de cuatro donantes sanos y tres líneas celulares de CCRC (CaCo2, Colo-205 y HT-29). La activación de las células NK se evaluó bajo tratamiento con 8H8SDIE o MOPCSDIE. Después de 24 horas de incubación, los resultados de la citometría de flujo mostraron un aumento marcado en la expresión de CD69, un marcador temprano de la activación de las células NK, en las células tratadas con 8H8SDIE en comparación con MOPCSDIE (Figura 2A y B). El cocultivo prolongado durante 72 horas demostró además una notable regulación al alza de CD25, que está relacionada con la estimulación sostenida de las células NK y la capacidad proliferativa, nuevamente específicamente en las células NK tratadas con 8H8SDIE. MOPCSDIE no produjo tales efectos (Figura 2C y D). En conjunto, estos hallazgos demuestran la capacidad de 8H8SDIE para promover la activación de las células NK a través de su interacción con CD276 en las células de CCRC.

Inducción de la reactividad y la citotoxicidad de las células NK contra las líneas celulares de CCRC CD276-positivo

Para investigar si 8H8SDIE aumenta la reactividad de las células NK hacia las líneas celulares de CCRC, se realizaron ensayos de cocultivo para evaluar la desgranulación de las células NK y la producción de citocinas. La desgranulación de las células NK, un indicador temprano de la actividad citotóxica, se evaluó midiendo la expresión de CD107a después de 4 horas. Las células NK cocultivadas con células de CCRC en presencia de 8H8SDIE exhibieron un aumento sustancial en la expresión de CD107a en relación con las tratadas con el anticuerpo de control (Figura 3A y B).

Para explorar el potencial inmunostimulador más amplio de 8H8SDIE, se evaluaron los niveles intracelulares de IFNγ y TNF mediante citometría de flujo. Se observó una clara mejora de estas citocinas en las células NK expuestas a 8H8SDIE en comparación con las células tratadas con MOPCSDIE (Figura 3C). En línea con estos resultados, los ensayos multiplex realizados en sobrenadantes cosechados después de 24 horas revelaron concentraciones elevadas de IFNγ, TNF y proteínas efectoras citotóxicas como la granulina, la granzima A, la granzima B y la perforina (Figura 3D y E). En resumen, estos datos destacan los efectos inmunopotenciadores de 8H8SDIE, que impulsan tanto la señalización mediada por citocinas como la citotoxicidad directa de las células NK hacia los objetivos del CCRC.

Inducción de la lisis de las células NK contra las células de CCRC CD276-positivo

Para evaluar si el aumento de la reactividad y la función citotóxica de las células NK desencadenadas por 8H8SDIE se traduce en una lisis eficiente de las células de CCRC, se cocultivaron PBMCs de donantes sanos con o sin 8H8SDIE o MOPCSDIE. La citotoxicidad a corto plazo se determinó después de 2 horas de incubación. Se observó una lisis significativa de las células objetivo de CCRC en presencia de 8H8SDIE (Figura 4A). Para verificar estos resultados en un período de tiempo más prolongado, se realizó un análisis de citometría de flujo a las 24 horas posteriores al cocultivo. Se observó una disminución marcada en el número de células de CCRC viables en las muestras tratadas con 8H8SDIE en comparación con las expuestas a MOPCSDIE (Figura 4B y C). El perfilado de citotoxicidad en tiempo real complementario utilizando el sistema xCELLigence basado en la impedancia durante un período de 150 horas corroboró aún más la capacidad citotóxica de 8H8SDIE (Figura 4D). En conjunto, estos datos indican que la lisis de las células de CCRC mediada por las células NK se ve significativamente reforzada por 8H8SDIE tanto en los ensayos a corto como a largo plazo, lo que subraya su potencial como un candidato terapéutico viable para el cáncer colorrectal.

Discusión

En la última década, se han producido mejoras significativas en el tratamiento del CCRC. Al implementar estrategias de detección temprana y tratar con éxito las manifestaciones de la enfermedad en etapas tempranas, ha sido posible reducir la tasa de mortalidad general del CCRC.^[39] Sin embargo, el grupo de individuos diagnosticados con enfermedad metastásica en etapa IV no se ha beneficiado de esta tendencia positiva. Excepto para los pacientes con estado MSI-H o pérdida de la reparación del desajuste del ADN, no se han producido adiciones significativas a los regímenes de tratamiento de décadas de antigüedad que consisten en quimioterapia y anticuerpos dirigidos a EGFR o VEGFR. En consecuencia, la tasa de supervivencia a largo plazo en esta cohorte sigue siendo baja, con solo el 16% alcanzando una supervivencia a 5 años en comparación con el 91% en las etapas tempranas.^[39] Sin embargo, el número cada vez mayor de pacientes más jóvenes^[40] que no son diagnosticados utilizando los esquemas de detección temprana clásicos continúa expandiendo esta cohorte de pacientes en particular,^[41], manteniendo al CCRC en el segundo lugar en mortalidad relacionada con el cáncer. A la luz de esta urgente necesidad clínica, nuestro estudio proporciona una base para dirigir CD276 en el CCRC utilizando el anticuerpo modificado con la región Fc 8H8_SDIE, que activó de manera robusta las células NK y medió la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de CCRC.

Aquí, presentamos un nuevo enfoque que es particularmente adecuado para esta población de pacientes desatendida. Tras demostrar con éxito que las células de CRC y su microambiente tumoral y neovasculatura expresan predominantemente el antígeno diana CD276,^[26],^[42], construimos un anticuerpo monoclonal (mAb) contra este antígeno, que es capaz de activar de forma potente las células NK, que actúan como el principal conjunto de efectores citotóxicos, con una activación y mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) duradera. Esto representa una nueva intervención basada en el sistema inmunitario, que podría beneficiar a una proporción más amplia de pacientes con CRC metastásico. Se han notificado previamente efectos antitumorales similares mediados por las células NK del 8H8_SDIE en varios modelos preclínicos de neoplasias hematológicas y tumores sólidos, incluido el síndrome mielodisplásico agudo y el cáncer de pulmón,^[31],^[34], lo que subraya su relevancia traslacional.

Hasta la fecha, la inmunoterapia se ha limitado al uso de pembrolizumab para el tratamiento del CRC metastásico con inestabilidad MSI-alta, que representa hasta el 15% de todos los casos de CRC.^[43] Esto se basó en datos prometedores de los estudios KEYNOTE y CheckMate, que mostraron mejores resultados con menos efectos secundarios.[44–46] Sin embargo, en este subconjunto particular de CRC, las mutaciones en MLH1 o MSH2 causan una deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR), lo que a su vez conduce a una incapacidad en la detección y corrección celular de las mutaciones espontáneas del ADN, lo que culmina en una carga de mutación tumoral muy alta. El efecto terapéutico de la inhibición del punto de control inmunitario (ICI) se basa en este patrón patogénico específico, como se ha demostrado en estudios previos en varias entidades tumorales con dMMR, incluido el CRC.^[47],^[48] Sin embargo, la gran mayoría de los casos de CRC se desarrollan a través de diferentes mecanismos patogénicos, progresando comúnmente a través de la vía tradicional de adenoma a carcinoma que implica mutaciones en el gen APC, creando tumores con una baja carga mutacional. Si bien no determinamos experimentalmente el estado mutacional de las líneas celulares de CRC en este estudio, los conjuntos de datos genómicos disponibles públicamente y la literatura previa identifican HCT-116 como MSI-alta,^[49],^[50], mientras que HT-29 y SW620 representan fenotipos MSS.^[49],^[51],^[52] La capacidad del 8H8_SDIE para activar las células NK y provocar citotoxicidad en este panel sugiere que su eficacia puede extenderse a los subtipos mutacionales,^[52], aunque se requiere más trabajo para confirmarlo en muestras anotadas clínicamente.

A medida que la inmunoterapia, especialmente la ICI, continúa ganando terreno en otras entidades tumorales gastrointestinales,[53–57], se han realizado mayores esfuerzos para hacer que el CRC con estabilidad de microsatélites sea susceptible a la ICI. La teoría que impulsa estos esfuerzos es que una combinación de más de un agente terapéutico (inmunitario) puede evocar potencialmente una respuesta inmunogénica, lo que permite la eficacia de la ICI.^[58] La quimioterapia combinatoria (NCT03832621, NCT03608046), la radioterapia (NCT03007407, NCT03104439) o incluso el fármaco antidiabético metformina (NCT03800602) se han propuesto como posibles compañeros para la ICI, pero también otros agentes inmunoterapéuticos, como vacunas o regímenes de ICI combinatoria. La mayoría de estos estudios aún están en curso, pero algunos resultados preliminares parecen indicar que los intentos de provocar respuestas inmunitarias no han tenido un éxito total hasta el momento.^[59] Dado que el CD276 se expresa de forma constante en los modelos de CRC y el 8H8SDIE induce eficazmente las respuestas de las células NK in vitro, este enfoque puede ofrecer una vía complementaria o alternativa para superar la resistencia a la ICI en el CRC MSS, donde las inmunoterapias actuales han mostrado un éxito limitado. En particular, en contraste con otros tipos de tumores que hemos estudiado, como el síndrome mielodisplásico agudo, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de ovario o los sarcomas, los modelos de CRC exhibieron un perfil más heterogéneo de liberación de citocinas y moléculas efectoras en respuesta al 8H8SDIE, lo que destaca la relevancia de la modulación inmunitaria específica del tipo de tumor.

Otro enfoque inmunoterapéutico que se está investigando y desarrollando actualmente para el CRC es la terapia celular adoptiva, en particular las células T diseñadas para expresar receptores quiméricos de antígenos (células CAR-T), que se han explorado en múltiples estudios clínicos en fase temprana y se dirigen a varios antígenos tumorales diferentes, incluidos, entre otros, los antígenos carcinoembrionarios (NCT02850536, NCT02416466, etc.), el NKG2DL (NCT05248048, NCT04550663, etc.) y el EGFR (NCT03542799, NCT03152435). Sin embargo, los datos prometedores sobre el potencial terapéutico de las células CAR-T se han visto yuxtapuestos con los varios desafíos que surgen de estos estudios. Por ejemplo, la mayoría de los antígenos de las células CAR-T que se investigan actualmente no son del todo exclusivos del tumor, lo que causa toxicidad y limita el uso terapéutico. En segundo lugar, existe una expansión y persistencia insuficientes de las células CAR-T en la circulación o dentro del tumor, y la invasión del tejido tumoral por las células CAR-T es baja.^[60] Debido a que los anticuerpos monoclonales no dependen de la proliferación de un producto celular fabricado, sino que emplean las propias células inmunitarias del cuerpo, evitan el problema particular de la proliferación continua. Dado que el antígeno diana del 8H8SDIE está sobreexpresado en el tumor y en el microambiente tumoral, incluida la neovasculatura, las toxicidades y los efectos secundarios fuera del tumor son raros, y el acceso al tumor debería mejorar considerablemente. Si bien los problemas de toxicidad aún deben abordarse en los ensayos clínicos de fase I, en una comparación de diferentes enfoques inmunoterapéuticos, los anticuerpos monoclonales, especialmente el 8H8SDIE, parecen evitar muchos de los problemas asociados con los enfoques de células CAR-T que se están explorando actualmente. En particular, en los estudios in vivo que utilizan 8H8_SDIE en modelos de síndrome mielodisplásico agudo, se ha demostrado previamente un perfil de seguridad favorable, sin evidencia de toxicidades fuera del tumor o activación inmunitaria sistémica.^[31] Estos hallazgos respaldan el potencial traslacional de este anticuerpo diseñado con la región Fc y justifican una mayor investigación en tumores sólidos como el CRC.

En particular, el 8H8SDIE se encuentra todavía en una etapa muy temprana de desarrollo. Aunque utilizamos deliberadamente PBMC de donantes sanos para preservar el contexto inmunitario fisiológico y las interacciones accesorias relevantes para la ADCC,^[61], los futuros estudios mecanicistas pueden beneficiarse del uso de subconjuntos de células NK purificadas para diseccionar la señalización intrínseca del efector con mayor detalle. Si bien estos ensayos basados en líneas celulares y ex vivo proporcionan información valiosa, no representan completamente la complejidad del microambiente tumoral en el CRC, que se caracteriza por interacciones multifacéticas entre las células epiteliales malignas, las células del estroma de soporte y los componentes de la matriz extracelular.^[62],^[63] Los modelos in vivo avanzados, como los xenoinjertos derivados del paciente y los ratones humanizados, son esenciales para replicar la dinámica tumoral humana y evaluar la eficacia terapéutica en entornos más clínicamente relevantes. Además, son necesarios análisis detallados de la biodistribución para establecer las características de seguridad del 8H8SDIE antes de su avance a los ensayos clínicos de fase I. Para respaldar aún más el desarrollo traslacional del 8H8_SDIE específicamente en el contexto del cáncer colorrectal, los estudios futuros podrían incorporar modelos epiteliales no transformados u organoides de colon derivados del paciente para evaluar los posibles efectos fuera del tumor en condiciones más fisiológicas.

Con la evidencia que respalda la expresión enriquecida de CD276 en el tumor y nuestros resultados que establecen la mejora de la lisis de las células de CRC mediada por las células NK y desencadenada por el 8H8_SDIE tanto en los ensayos funcionales a corto como a largo plazo, se justifican más estudios y ensayos dada su posible eficacia como una estrategia terapéutica para una población de pacientes hasta ahora desatendida.

Conclusiones

Estos resultados respaldan el mayor desarrollo del 8H8SDIE como una estrategia inmunoterapéutica dirigida para el cáncer colorrectal. Al mejorar la activación de las células NK a través de la ingeniería de la región Fc, el 8H8SDIE mejora la ADCC, que es el mecanismo central que subyace a su actividad antitumoral. Este anticuerpo puede proporcionar una alternativa de tratamiento muy necesaria para los pacientes con CRC con estabilidad de microsatélites (MSS), un subgrupo que comprende la mayoría de los casos de CRC y que actualmente carece de opciones inmunoterapéuticas eficaces. Si bien los estudios in vivo previos en modelos de síndrome mielodisplásico agudo demostraron un perfil de seguridad favorable, la investigación futura debería incluir evaluaciones in vivo exhaustivas en entornos de tumores sólidos para confirmar el perfil de seguridad y biodistribución del 8H8_SDIE antes de su traslación clínica.